特許 7084881 ＩＬ－１０の免疫刺激特性および抗炎症特性を調節するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-07

(45)【発行日】2022-06-15

(54)【発明の名称】ＩＬ－１０の免疫刺激特性および抗炎症特性を調節するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/20 20060101AFI20220608BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220608BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20220608BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220608BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20220608BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220608BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220608BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20220608BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220608BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20220608BHJP

【ＦＩ】

A61K38/20 ZNA

C07K19/00

C07K14/54

C07K16/00

A61K47/65

A61P37/04

A61P29/00

A61K47/55

A61K47/68

C12N15/24

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2018566552

(86)(22)【出願日】2017-06-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-09-26

(86)【国際出願番号】 US2017038747

(87)【国際公開番号】W WO2018005226

(87)【国際公開日】2018-01-04

【審査請求日】2020-06-16

(31)【優先権主張番号】62/353,478

(32)【優先日】2016-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510185033

【氏名又は名称】アルカームス インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ムスターカス、ディミトリ、ティー．

(72)【発明者】

【氏名】ナムチュク、マーク、エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】ロージー、ヘザー、シー．

(72)【発明者】

【氏名】アルバレス、ファン、シー．

【審査官】辰己 雅夫

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３１６４０４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】J Biol Chem，2006年，Vol.281, No.46，pp.35088-35096

【文献】J Exp Med，2000年，Vol.191, No. 2，pp.213-223

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式１：
（第１単量体サブユニット）－ＬＩＮＫＥＲ－（第２単量体サブユニット）
に従うＮ末端からＣ末端までのアミノ酸配列配置を含むｓｃＩＬ－１０ポリペプチドであって、
式中、前記第１単量体サブユニットおよび前記第２単量体サブユニットは、独立して、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列に２２位、４１位、８７位及びこれらを組み合わせた位置から選択される位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列から選択され、但し、前記第１単量体サブユニットまたは前記第２単量体サブユニットの少なくとも１つは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含み；
前記ＬＩＮＫＥＲは、５～１５アミノ酸長のアミノ酸リンカーであり；
前記アミノ酸置換は、ＩＬ－１０Ｒ１又はＩＬ－１０Ｒ２と接するｓｃＩＬ－１０のアミノ酸またはＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２の両方と接するアミノ酸の置換を含み；
４１位のアスパラギン酸が、前記第１単量体サブユニットまたは前記第２単量体サブユニット上で置換されるが、両方の単量体サブユニット上では置換されない、ｓｃＩＬ－１０ポリペプチド。

【請求項2】

前記アミノ酸置換が、２２位のメチオニンおよび４１位のアスパラギン酸並びにそれらの任意の組み合わせから選択されるアミノ酸の置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

２２位のメチオニンが、４１位のアスパラギン酸の置換を含む単量体サブユニットと同じではない１つの単量体サブユニット上のみで置換される、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記アミノ酸置換が８７位のイソロイシンを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記アミノ酸置換が、２２位のメチオニンからアラニンへ（Ｍ２２Ａ）；４１位のアスパラギン酸からアスパラギンへ（Ｄ４１Ｎ）；４１位のアスパラギン酸からアラニンへ（Ｄ４１Ａ）；及び４１位のアスパラギン酸からフェニルアラニンへ（Ｄ４１Ｆ）の置換から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記ｓｃＩＬ－１０がヒンジ領域ＩｇＧ１に融合されている融合パートナーを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記ｓｃＩＬ－１０がＩｇＧ１の修飾されたヒンジ領域に融合されており、前記ヒンジ領域の修飾が前記ＩｇＧ１のヒンジ領域からの１～１０個のアミノ酸の欠失である、融合パートナーを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記ｓｃＩＬ－１０がムチンリンカーを介してＩｇＧ１の前記ヒンジ領域に融合されている融合パートナーを含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記ムチンリンカーが、ＭＵＣ２０のタンデムリピートであるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のポリペプチド。

【請求項10】

配列番号２０～２１および配列番号３７～４４からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項11】

配列番号１７、１８および１９からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記ｓｃＩＬ－１０が、融合パートナーに共有結合している、請求項１に記載のポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ＩＬ－１０は、炎症性メディエータの産生を強く阻害する強力な抗炎症性サイトカインであると考えられている。しかしながら、最近の試験は、ＩＬ－１０がＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞への免疫刺激特性も有しており、ＩＦＮ－γ産生の増加をもたらし、これが次に、ヒトにおいて関連する炎症反応を引き起こし得ることを示唆している。

【0002】

このサイトカインが治療的に価値のある生物学的物質であることを示唆する有望な前臨床データにもかかわらず、慢性炎症におけるＩＬ－１０投与の利点を評価する臨床試験の結果は、圧倒的に期待外れなものであった。ＩＬ－１０またはＩＬ－１０受容体欠損を有する患者の前臨床データおよび分析の大部分は、内因性に産生されたＩＬ－１０を強力で有意な抗炎症決定因子として明確に指摘する。しかしながら、徹底的な分析は、ＩＬ－１０がインビボでの炎症環境において全く対照的な特性を獲得する可能性を有することをさらに示唆する。近年、特にその抗炎症能を考慮して、ＩＬ－１０投与後のヒトの応答を確認するためにいくつかの試験が実施されている。これらの臨床的に重要な試験は、ＩＬ－１０の複雑な前炎症機能を開示した。しかし、ＩＬ－１０の免疫刺激作用の基礎は依然として不明である。

【0003】

他方で、ＩＬ－１０は、増殖性障害、例えば癌、腫瘍等の治療における使用が検討されている。ＩＬ－１０は、ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性、Ｂ細胞の抗体産生を誘導し、マクロファージ活性および腫瘍促進性炎症を抑制する。ＩＬ－１０は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を増加させるだけでなく、腫瘍免疫において役割を果たす炎症性サイトカインの発現を増加させると考えられる。ＩＬ－１０での処置は、腫瘍治療のための有意な改善を提供し得る。

【0004】

ＩＬ－１０を使用すること、特に治療において何らかの形態の組換えＩＬ－１０を使用することの１つの難点は、その短い血清半減期である。ＩＬ－１０などの治療用タンパク質の血清半減期を増加させるための１つの戦略は、タンパク質を抗体のＦｃ（結晶化可能なフラグメント）ドメインに結合させることである。そのような融合タンパク質の多くは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し、それにより、抗体様の融合タンパク質分子を形成することができる。

【0005】

治療用途に応じて、ＩＬ－１０の抗炎症活性または免疫刺激活性のいずれかを選択的に増強できることが望ましい。また、組換えＩＬ－１０の半減期を増加させることも望ましい。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ＩＬ－１０の免疫刺激特性および／または抗炎症特性を調節するための組成物および方法を提供する。本発明は、式１のｓｃＩＬ－１０ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、融合パートナーに連結されていてもよい。

【0007】

本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、添付の図面に示されるように、本発明の好ましい実施形態についての以下のより詳細な説明から明らかになり、図面中の同様の参照符号は、異なる図面を通して同じ部分を指す。図面は、必ずしも縮尺を重視するものではなく、その代わりに、本発明の基本的原理を示すことに重点を置いている。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、２つのポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の略図であり、各ポリペプチド鎖はＸとしてｓｃＩＬ－１０を含み、ｓｃＩＬ－１０は、その後、ｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。

【図2】図２は、２つのポリペプチド鎖のＦｃ融合タンパク質ホモ二量体の略図であり、各ポリペプチド鎖はｓｃＩＬ－１０を含み、ｓｃＩＬ－１０は、その後、新規ｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合される。

【図3】図３は、還元および非還元条件下で、新規ｓｃＣＬＣＨ１リンカー（左）または新規ｓｃＣＨ１ＣＬリンカー（右）を介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されたｓｃＩＬ－１０を含むＦｃ融合タンパク質の発現を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥである。

【図4】図４は、分析ゲルろ過による、新規ｓｃＣＬＣＨ１リンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されたＩＬ－１０の特性付けを示すクロマトグラムである。

【図5】図５は、分析ゲルろ過による、新規ｓｃＣＨ１ＣＬリンカーを介してＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に融合されたＩＬ－１０の特性付けを示すクロマトグラムである。

【図6】図６は、対照として使用したｓｃＩＬ－１０直接Ｆｃ融合タンパク質と比較した、本発明のＩＬ－１０一本鎖融合タンパク質によるマウス肥満細胞株ＭＣ／９の刺激を示すグラフである。

【図7】図７は、２つのＩＬ－１０Ｒ１界面の一方または両方を破壊するアミノ酸置換の影響の概略図である（配列番号２０、２１および２２）。

【図8】図８は、２つのＩＬ－１０Ｒ２界面の一方または両方を破壊するアミノ酸置換の影響の概略図である（配列番号２３、２４および２５）。

【図9】図９は、ＩＬ－１０Ｒ１界面の１つおよびＩＬ－１０Ｒ２界面の１つを同時に破壊するアミノ酸置換の影響の概略図である（配列番号２６～２９）。

【発明を実施するための形態】

【0009】

定義
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では交換可能に使用される。ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学的方法のいずれかで修飾することができる（例えば、アミノ酸を保護基で修飾することができ、カルボキシ末端アミノ酸を末端アミド基にすることができ、アミノ末端残基を、例えば親油性を増強するための基で修飾することができ、またはポリペプチドを、安定性もしくはインビボ半減期を増加させるために化学的にグリコシル化するかさもなければ修飾することができる）。ポリペプチド修飾は、環状化合物または他の分子などの別の構造のポリペプチドへの結合を含むことができ、また、１つ以上のアミノ酸を変化した立体配置（すなわちＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）で含むポリペプチドも含み得る。

【0010】

本明細書で使用される場合、「抗体」および「免疫グロブリン」は交換可能に使用され、抗原に特異的に結合して認識する、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたは免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントを指す。同定された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに数え切れないほどの免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらはそれぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。抗体技術分野の当業者によって理解される用語は、本明細書において異なる定義が明白に示されない限り、それぞれ当技術分野で獲得された意味を有する。抗体は、可変領域、ヒンジ領域および定常ドメインを有することが公知である。免疫グロブリンの構造および機能は、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８）に総説されている。

【0011】

本明細書中の「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさずに、選択配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の技術範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

【0012】

「ｍｇ／ｋｇ」または「ｋｇ当たりのｍｇ」という表記は、ミリグラム／キログラムを意味する。全ての表記は、本開示を通じて交換可能に使用される。

【0013】

ポリペプチドの「半減期」は、一般に、ポリペプチドの血清濃度が、例えばポリペプチドの分解および／または天然の機構によるポリペプチドのクリアランスもしくは隔離のために、インビボで５０％減少するのに要する時間として定義することができる。半減期は、薬物動態解析などのそれ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は、当業者には明らかであり、例えば、一般に、適切な用量のポリペプチドをげっ歯動物または霊長動物に投与する工程；げっ歯動物または霊長動物から定期的な間隔で血液試料または他の試料を採取する工程；前記血液試料中のポリペプチドのレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、ポリペプチドのレベルまたは濃度が投与後の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する工程を含み得る。半減期を測定する方法は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ（１９８６）；Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）；および“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”，Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ＆Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，２ｎｄ Ｒｅｖ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８２）に見出され得る。

【0014】

生物学的マトリックス（血液、血清、血漿、組織）中の存在が、インビボで、適切な対照と比較してより長期間持続する場合、融合ポリペプチドの半減期は増加している。半減期は、適切な対照と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上増加させ得る。

【0015】

半減期は、ｔ_{１／２－α}、ｔ_{１／２－β}およびＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ＿ｚなどのパラメータを使用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増加」とは、これらのパラメータのいずれか１つ、これらのパラメータのいずれか２つ、またはこれらのパラメータの３つ全ての増加を指す。「半減期の増加」とは、特に、ｔ_１／２－αの増加を伴うかまたは伴わないｔ_１／２－βおよび／またはＨＬ＿Ｌａｍｂｄａ＿ｚの増加を指す。評価することができる他のＰＫパラメータには、分布容積（ＶＤ）、クリアランス（ＣＬ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）および曲線下面積（ＡＵＣ）が含まれる。本明細書において、「薬物動態の変化」とは、上記に列挙した半減期パラメータの変化の存在下または不在下での、これらのパラメータのいずれか１つ、これらのパラメータのいずれか２つ、これらのパラメータのいずれか３つ、またはこれらのパラメータの４つ全ての変化を指す。

【0016】

本明細書の目的のための「活性」は、対応する天然の活性タンパク質の成分と一致するが必ずしも同一ではない融合タンパク質の成分の活動または作用を指し、「生物学的活性」または「生物活性」は、受容体結合、アンタゴニスト活性、アゴニスト活性または細胞応答もしくは生理学的応答を含むがこれらに限定されない、インビトロまたはインビボの生物学的機能または作用を指す。

【0017】

本明細書で使用される場合、「二量体複合体」は、ｓｃ－ＩＬ－１０または、例えば本発明のｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質などの適切な融合パートナーに融合したｓｃ－ＩＬ－１０の２つの一本鎖を含み、２つの一本鎖ポリペプチドは、非共有結合または共有結合のいずれかを介して、例えばジスルフィド架橋によって、適切な条件下で共に結合される。本明細書で交換可能に使用される「ヘテロ二量体タンパク質」、「ヘテロ二量体複合体」または「ヘテロ二量体」とは、二量体複合体を形成する２つの一本鎖ｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃポリペプチドから作られるタンパク質を指し、前記２つの一本鎖ポリペプチドは異なるアミノ酸配列を有する。例えば、ヘテロ二量体の１つの一本鎖ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する式Ｉに基づくｓｃＩＬ－１０を有し、ヘテロ二量体の他の一本鎖ペプチドは、アミノ酸置換のない式１に基づくｓｃＩＬ－１０配列を有する。本明細書で交換可能に使用される「ホモ二量体タンパク質」、「ホモ二量体複合体」または「ホモ二量体」とは、二量体複合体を形成する２つの同一または実質的に同一のポリペプチドから作られるタンパク質を指し、前記２つの一本鎖ポリペプチドは、好ましくは１００％の同一性を共有する。ホモ二量体が、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％の同一性を有する２つの実質的に同一のポリペプチドを含み、２つのポリペプチド鎖の間の任意のアミノ酸の相違が、例えば保存的アミノ酸置換などの、ホモ二量体のそのパートナーポリペプチドと比較してポリペプチドの機能的および物理的特性に影響を及ぼさないアミノ酸の置換、付加または欠失を含む状況が、特により大きなポリペプチドに関して存在する。

【0018】

本明細書で使用される場合、タンパク質は、そのようなポリペプチドを発現する細胞の膜にポリペプチドを固定するまたは組み込む膜貫通ドメインまたはタンパク質ドメインを欠く場合、「可溶性」である。

【0019】

本明細書で使用される場合、本発明のｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質を表すために本明細書中で交換可能に使用され得るような「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ部分」は、定常領域のフラグメント、類似体、変異体、突然変異体または誘導体を含む、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリンの定常領域に由来するドメインを包含する。適切な免疫グロブリンには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭなどの他のクラスが含まれる。免疫グロブリンの定常領域は、免疫グロブリンＣ末端領域に相同な天然に存在するまたは合成的に作製されたポリペプチドとして定義され、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ４ドメインを別々にまたは組み合わせて含むことができる。

【0020】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」または「緩和する」または「改善する」は、本明細書では交換可能に使用される。これらの用語は、治療的利益および／または予防的利益を含むがこれらに限定されない有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療される基礎疾患の根絶または改善を意味する。また、治療的利益は、基礎疾患に関連する生理学的症状の１つ以上の根絶または改善によって達成され、その結果、被験体が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、被験体において改善が認められる。

【0021】

予防的利益のために、組成物は、特定の疾患の診断がなされていない場合でも、この特定の疾患を発症する危険性のある被験体に、または疾患の生理学的症状の１つ以上を報告している被験体に投与され得る。

【0022】

本明細書で使用される「治療効果」は、本発明の融合タンパク質によってもたらされる、ヒトもしくは他の動物における疾患の治癒、緩和、改善もしくは予防を含むがこれらに限定されない生理学的効果、またはさもなければヒトもしくは動物の肉体的または精神的健康を高めることを指す。

【0023】

本明細書で使用される「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、単独または融合タンパク質組成物の一部としての活性タンパク質の量であって、被験体に単回または反復投与で投与された場合に疾患状態または状況の任意の症状、態様、測定されたパラメータまたは特性に何らかの検出可能な有益作用を及ぼすことができる量を指す。そのような効果は、有益であるために絶対的である必要はない。

【0024】

本明細書で使用される「治療有効用量レジメン」という用語は、単独でまたは融合タンパク質組成物の一部としての活性タンパク質の連続的に投与される用量のスケジュールを指し、ここで、用量は、疾患状態または状況の任意の症状、態様、測定されたパラメータまたは特性に持続的な有益効果をもたらす治療有効量で投与される。

【0025】

本明細書で使用される場合、「抗炎症ウィンドウ」は、（ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞等への）免疫刺激作用を誘導せずに、ＰＢＭＣ／マクロファージへの抗炎症作用を生じるｓｃＩＬ－１０濃度の範囲として定義される。例えば、例では、２つのアッセイを用いてこれらの２つの生物活性の効力を定義する：
１）ＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイ：ＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦα）の放出の阻害によって測定される抗炎症作用が起こる濃度のＩＣ５０値（通常は低ピコモル濃度範囲）を生じる；および
２）ＭＣ／９増殖アッセイ：免疫刺激作用が起こる濃度のＥＣ５０値（通常は高ピコモルからナノモル範囲）を生じる。

【0026】

表１１および１２の比率は、（ＭＣ／９ ＥＣ５０）／（ＰＢＭＣ ＩＣ５０）値の比である。これらの２つのアッセイは、２つのタイプの活性の近似を示す。ＩＬ－１０は、ＬＰＳ刺激時の前炎症性サイトカインの放出を抑制するためにＰＢＭＣ内の細胞集団を標的とし、およびＩＬ－１０は、その免疫刺激作用に関連する濃度でＭＣ／９細胞の増殖を駆動する。本発明の分子の抗炎症ウィンドウサイズに対処するために使用し得る多くの他の潜在的アッセイが存在する。しかし、ｓｃＩＬ－１０の免疫刺激作用および抗炎症作用の両方が、より多くの細胞型において生じることが理解される。

【0027】

ｓｃＩＬ－１０
ヒト野生型ＩＬ－１０（ｗｔＩＬ－１０）は、２つの同一の単量体サブユニットを含む非共有結合した二量体タンパク質である。ヒト野生型ＩＬ－１０（ｗｔＩＬ－１０）の各々の同一の単量体サブユニットは、以下のアミノ酸配列を有する（リーダー配列は存在しない）：
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号１）（ＩＬ １０のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２２３０１［鎖１９～１７８］、インターロイキン１０、ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ））。配列番号１は、本明細書では「非置換ＩＬ－１０単量体サブユニット」とも称される。少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、配列番号１に基づくアミノ酸配列は、本明細書では「置換ＩＬ－１０単量体サブユニット」と称される。

【0028】

式１のポリペプチドは、本明細書では「ｓｃＩＬ－１０」ポリペプチドと称され、式１に従うＮ末端からＣ末端までのアミノ酸配列配置を含む：
（第１単量体サブユニット）－ＬＩＮＫＥＲ－（第２単量体サブユニット）
式１
［式中、第１単量体サブユニット、第２単量体サブユニットまたは第１および第２の両方の単量体サブユニットは、独立して、非置換ＩＬ－１０単量体サブユニット、または少なくとも１つのアミノ酸置換を含む置換ＩＬ－１０単量体サブユニットから選択され得；ならびに
ＬＩＮＫＥＲは、少なくとも１～１００アミノ酸長の任意のアミノ酸リンカーである］。

【0029】

好ましくは、ＬＩＮＫＥＲは、少なくとも２個のアミノ酸と１００個未満のアミノ酸の間、例えば少なくとも２個のアミノ酸と７５個未満のアミノ酸の間、より好ましくは少なくとも３個のアミノ酸と５０個未満のアミノ酸の間、例えば少なくとも４個のアミノ酸と２５個未満のアミノ酸の間、例えば少なくとも５個のアミノ酸と２０個未満のアミノ酸の間、さらにより好ましくは少なくとも６個のアミノ酸と１５個未満のアミノ酸の間の長さを有する。より好ましくは、リンカーは、少なくとも３個のアミノ酸と１０個未満のアミノ酸の間の長さを有する。最も好ましくは、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸の長さを有する。好ましくは、リンカーは、可撓性リンカーである。好ましくは、可撓性リンカーは、アミノ酸のグリシン、アスパラギンおよび／またはセリンを含むかまたはこれらからなる。より好ましくは、可撓性リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンを含むかまたはこれらからなる。

【0030】

好ましくは、式１の第１単量体サブユニットおよび第２単量体サブユニットは、両方とも非置換ＩＬ－１０単量体サブユニットであり、各々が配列番号１のアミノ酸配列を有する。これらのペプチドは、本明細書では「非置換ｓｃＩｌ－１０」とも称される。

【0031】

好ましくは、式１のｓｃＩＬ－１０ペプチドは、式１の第１単量体サブユニット、式１の第２単量体サブユニットのいずれか、または式１の第１および第２の両方の単量体サブユニットに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。配列番号１のヒトｗｔｓｃＩＬ－１０と比較して置換単量体サブユニットを含むこれらのｓｃＩＬ－１０タンパク質は、本明細書では「ｓｃＩＬ－１０変異体」とも称される。

【0032】

本発明の好ましいｓｃＩＬ－１０ペプチドは、本明細書では「非置換ｓｃＩＬ－１０（１０ａａリンカー）」と称され、以下のアミノ酸配列を有する：
ＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＰＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（配列番号２９ ３５０１）または（配列番号２）に５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列。アミノ酸１７９～１８８の２つのＩＬ－１０サブユニットの間の１０アミノ酸のリンカーを下線で示している。他の共有結合したＩＬ－１０二量体タンパク質は、任意の適切な可撓性ペプチドリンカーを含んでいてもよく、また、配列番号２の下線を引いた配列よりも長くても短くてもよいことが理解される。

【0033】

配列番号２によって表されるｓｃＩＬ－１０（１０ａａリンカー）は、各々が配列番号１のアミノ酸配列を含む２つの非置換ｓｃＩＬ－１０単量体サブユニットおよび式１のようにＬＩＮＫＥＲを含み、ここで、ＬＩＮＫＥＲは、配列：ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号３）を有する１０アミノ酸長である。好ましくは、ｓｃＩＬ－１０のＬＩＮＫＥＲは、配列番号３ではない。

【0034】

式１の他の好ましい非置換ｓｃＩＬ－１０ペプチドには、ＬＩＮＫＥＲが、本明細書では「非置換ｓｃ－ＩＬ１０（５ａａリンカー）」とも称される５アミノ酸リンカーであるペプチドが含まれる。１つの好ましい５アミノ酸リンカーは、配列：ＧＧＳＧＧ（配列番号４）である。

【0035】

式１の他の好ましい非置換ｓｃＩＬ－１０ペプチドには、ＬＩＮＫＥＲが、本明細書では「非置換ｓｃ－ＩＬ１０（３ａａリンカー）」とも称される３アミノ酸リンカーであるペプチドが含まれる。１つの好ましい３アミノ酸リンカーは、配列ＧＧＧである。

【0036】

本発明は、一部には、式１によって表される非置換ｓｃＩＬ－１０および同じく式１によって表される少なくとも１つのアミノ酸置換を含むｓｃＩＬ－１０（「ｓｃＩＬ－１０変異体」）を含む融合タンパク質が、広い抗炎症ウィンドウを有するという発見に基づく。本発明はまた、一部には、非置換ｓｃＩＬ－１０の特定のアミノ酸置換が免疫刺激ＥＣ_５０をさらに増加させるという発見に基づく。低い抗炎症ＩＣ_５０を維持しながら免疫刺激ＥＣ_５０を増加させる能力は、例えば野生型ＩＬ－１０または本発明に従って修飾されていないＩＬ－１０を含む他の融合タンパク質と比較して、抗炎症ウィンドウサイズの桁違いの増加を提供する。

【0037】

いかなる理論にも限定されるものではないが、ｓｃＩＬ－１０とＩＬ－１０Ｒ１および／またはＩＬ－１０Ｒ２受容体との界面におけるアミノ酸置換は、ＩＬ－１０の免疫刺激特性、抗炎症特性またはその両方の調節をもたらしたと考えられる。

【0038】

式１のｓｃＩＬ－１０の第１単量体サブユニットの４１位（配列番号１に基づく）のアスパラギン酸または第２単量体サブユニットの４１位（配列番号１に基づく）のアスパラギン酸におけるアミノ酸置換は、ｓｃＩＬ－１０とそのＩＬ－１０Ｒ１受容体との界面の少なくとも１つを破壊し、それによって抗炎症ウィンドウの増加をもたらすｓｃＩＬ－１０の免疫刺激効力を有意に弱めながら、抗炎症効力をわずかに減弱させることが見出された。第１または第２単量体サブユニットのいずれか一方のＩＬ－１０Ｒ１との１つの界面でｓｃＩＬ－１０を破壊し、またＩＬ－１０Ｒ１界面を破壊する突然変異と同じではない第１または第２単量体サブユニットのいずれかのＩＬ－１０Ｒ２との１つの界面でｓｃＩＬ－１０を破壊する突然変異（例えば配列番号１の２２位のメチオニンにおける）は、極めて大きな抗炎症ウィンドウを提供することも見出された。

【0039】

また、８７位（配列番号１に基づく）の、ＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２の両方への結合に影響を及ぼすと考えられているイソロイシンのアミノ酸置換は、ｓｃＩＬ－１０を、一方のサブユニットにおいてＩＬ－１０Ｒ１を破壊し、他方のサブユニットにおいてＩＬ－１０Ｒ２を破壊するように設計した場合、同様の作用を及ぼすと考えられることが発見された。いかなる理論にも限定されるものではないが、ヒトｗｔＩＬ－１０の８７位のイソロイシンは両方のＩＬ－１０受容体との相互作用を調節すると考えられるが、そのような相互作用がどのようにして起こるかは明らかではない。

【0040】

好ましくは、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸置換（配列番号１のヒト野生型ＩＬ－１０と比較して）が式１の第１および／または第２単量体サブユニットに導入されたｓｃＩＬ－１０変異体を提供する。好ましくは、ｓｃＩＬ－１０は、式１の第１または第２単量体サブユニットの１つのみのＩＬ－１０Ｒ１界面の界面に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、式１の第１または第２単量体サブユニットの両方に含むことはない。さらにより好ましくは、ｓｃＩＬ－１０は、式１の第１または第２単量体サブユニットの１つのみのＩＬ－１０Ｒ１界面の界面に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、ＩＬ－１－Ｒ１界面におけるアミノ酸置換と同じ単量体サブユニットではない、式の第１または第２単量体サブユニットの１つのみのＩＬ－１０Ｒ２界面に少なくとも１つのアミノ酸置換も含む。

【0041】

ｓｃＩＬ－１０変異体の好ましいアミノ酸置換は、配列番号１のアミノ酸の番号付けに基づいており、以下の突然変異を含む：２２位のメチオニンおよび４１位のアスパラギン酸。

【0042】

好ましくは、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸が式１の第１または第２単量体サブユニットの４１位で置換されており、および少なくとも１つのアミノ酸が、４１位のアミノ酸置換を含む同じサブユニットではない第１または第２単量体サブユニットの２２位で置換されているｓｃＩＬ－１０変異体を提供する。

【0043】

好ましくは、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸が、両方の単量体サブユニットではなく、式１の第１単量体サブユニットまたは第２単量体サブユニットのみの８７位のイソロイシンで置換されているｓｃＩＬ－１０変異体を提供する。

【0044】

２２位のメチオニン、４１位のアスパラギン酸および８７位のイソロイシンのアミノ酸置換は、任意の他のアミノ酸による置換を含み得る。保存的または非保存的アミノ酸置換は、１つ以上のアミノ酸残基で行うことができる。保存的置換および非保存的置換の両方を行うことができる。保存的置換は、側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、４つのファミリーに分けることができる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性（疎水性）＝システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、チロシン；および（４）非荷電極性＝アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン。非極性は、強疎水性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、および中等度に疎水性＝グリシン、プロリン、システイン、チロシン、トリプトファンに細分し得る。別の方法では、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、セリンおよびトレオニンは脂肪族－ヒドロキシルとして別途に分類してもよい；（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；ならびに（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニンに分類することができる。

【0045】

式１に従う第１単量体サブユニットおよび／または第２単量体サブユニットの好ましいアミノ酸置換には、以下の置換が含まれる：２２位のメチオニンからアラニンへ（Ｍ２２Ａ）；４１位のアスパラギン酸からアスパラギンへ（Ｄ４１Ｎ）；４１位のアスパラギン酸からアラニンへ（Ｄ４１Ａ）；４１位のアスパラギン酸からフェニルアラニンへ（Ｄ４１Ｆ）；８７位のイソロイシンからアラニンへ（Ｉ８７Ａ）の置換。

【0046】

本発明はまた、一部には、ｓｃＩＬ－１０およびｓｃＩＬ－１０変異体の免疫刺激または抗炎症活性が、ｓｃＩＬ－１０またはｓｃＩＬ－１０変異体を、Ｆｃポリペプチドおよび修飾Ｆｃポリペプチド、例えば一本鎖Ｆｃ融合タンパク質、ムチンリンカーＦｃ融合物、切断されたヒンジ領域を有するＦｃポリペプチドを含むがこれらに限定されない、融合パートナーに融合させることによってさらに調節され得るという発見に基づく。他の融合パートナーには、ムチンドメインポリペプチド、アルブミン融合タンパク質、トランスフェリンタンパク質およびＦｃドメインを含まない他の融合パートナーが含まれるが、これらに限定されない。

【0047】

ｓｃ－ＩＬ１０の一本鎖Ｆｃ融合タンパク質
本発明の一本鎖Ｆｃ融合タンパク質は、式２に示すようにアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）まで以下の配置を有する：
（ｓｃＩＬ－１０）－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ：Ｆｃ
（式２）
［式中、ｓｃＩＬ－１０は、式１のアミノ酸配列を有し；
Ｌ１は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の配置を有するリンカーであり：
Ｌ２－ＣＬ－Ｌ３－ＣＨ１－Ｌ４（式３）またはＬ２－ＣＨ１－Ｌ３－ＣＬ－Ｌ４（式４）
（ここで、
Ｌ２およびＬ４は、独立して、ポリペプチドリンカーであるかまたは独立して存在せず；
Ｌ３はポリペプチドリンカーであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチドであり；および
ＣＨ１は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１ドメイン由来の定常領域ポリペプチドである）；
ＨＩＮＧＥは、免疫グロブリンのヒンジ配列であるかまたは存在せず、但し、ＨＩＮＧＥが存在しない場合は、Ｌ４が存在し；ならびに
Ｆｃは、免疫グロブリンのカルボキシ末端またはその任意の活性フラグメントもしくは誘導体である］。

【0048】

本発明に従って、式１のｓｃＩＬ－１０は、本明細書では「ｓｃＣＬＣＨ１リンカー」（式３）とも称される一本鎖（ｓｃ）として配置された免疫グロブリンのＣＬおよびＣＨ１ドメインに由来する新規なリンカー（Ｌ１）を介して免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端領域に融合される。

【0049】

ＣＬ領域のＣ末端は、ポリペプチドリンカーＬ３を介してＣＨＩ領域のＮ末端領域に連結され得る。ＣＬ領域のＮ末端は、任意選択のポリペプチドリンカーＬ２を介して式１のｓｃＩＬ－１０のＣ末端に融合され得る。ＣＨ１ドメインのＣ末端は、免疫グロブリンヒンジ領域（ＨＩＮＧＥ）またはポリペプチドリンカー（Ｌ４）またはヒンジ（ＨＩＮＧＥ）とポリペプチドリンカー（Ｌ４）の両方を介してＦｃドメインに連結される。

【0050】

ＣＨＩドメインのＣ末端はまた、ポリペプチドリンカーＬ３を介してＣＬ領域のＮ末端に連結され得る。ＣＨＩ領域のＮ末端は、任意選択のポリペプチドリンカーＬ２を介して式１のｓｃＩＬ－１０のＣ末端に融合され得る。ＣＬ領域のＣ末端は、免疫グロブリンヒンジ領域（ＨＩＮＧＥ）またはポリペプチドリンカー（Ｌ４）またはヒンジ（ＨＩＮＧＥ）とポリペプチドリンカー（Ｌ４）の両方を介してＦｃ領域に連結される。

【0051】

好ましくは、Ｌ３は、Ｇｌｙ（Ｇ）および／またはＳｅｒ（Ｓ）から選択されるアミノ酸を含む人工可撓性ドメインから選択される。好ましくは、リンカーは、一般式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号５））ｎまたは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号６））ｎのポリペプチドからなり、ここで、ｎは１～１０の整数である。好ましくは、各リンカーは、約１～約１００個のアミノ酸、好ましくは約１～５０個のアミノ酸、好ましくは約１～２５個のアミノ酸、好ましくは約１～１５個のアミノ酸、好ましくは約１～１０個のアミノ酸、好ましくは約４～２４個のアミノ酸、好ましくは約５～２０個のアミノ酸、好ましくは約５～１５個のアミノ酸、および好ましくは約５～１０個のアミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号６））ｎであり、ここで、ｎは２または４である。

【0052】

Ｌ２およびＬ４は、独立して、例えばＧｌｙ（Ｇ）およびＳｅｒ（Ｓ）から選択されるアミノ酸を含む人工可撓性ドメインから選択される。好ましくは、リンカーは、一般式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号５））ｎまたは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号６））ｎのポリペプチドからなり、ここで、ｎは１～１０の整数である。好ましくは、各リンカーは、約１～約１００個のアミノ酸、好ましくは約１～５０個のアミノ酸、好ましくは約１～２５個のアミノ酸、好ましくは約１～１５個のアミノ酸、好ましくは約１～１０個のアミノ酸、好ましくは約４～２４個のアミノ酸、好ましくは約５～２０個のアミノ酸、好ましくは約５～１５個のアミノ酸、および好ましくは約５～１０個のアミノ酸を含むポリペプチドである。好ましくは、リンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号６））ｎであり、ここで、ｎは２または４である。

【0053】

Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、例えばＬｙｓ（Ｋ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）などのアミノ酸をさらに含み得る。

【0054】

新規ｓｃＣＬＣＨ１リンカー（Ｌ１）のＣＬ領域は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するＣＬ領域と実質的に同一であり得る。ＣＬ領域（Ｌ１）は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するＣＬ領域と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。ＬＩのＣＬ領域が天然のＣＬ領域の修飾された誘導体または変異体である場合、そのような修飾には、アミノ酸の挿入、欠失、置換および再構成が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明に従うＣＬ領域のアミノ酸配列は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するＣＬ領域と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である。

【0055】

新規ｓｃＣＬＣＨ１リンカー（Ｌ１）のＣＨ１領域は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するＣＨ１領域と実質的に同一であり得る。Ｌ１のＣＬ領域は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するＣＨ１領域と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。Ｌ１リンカーのＣＬ領域が天然のＣＨ１免疫グロブリン領域の修飾された誘導体または変異体である場合、そのような修飾には、アミノ酸の挿入、欠失、置換および再構成が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ＣＨ１領域のアミノ酸配列は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するＣＨ１領域と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である。

【0056】

Ｌ１のＣＨ１領域およびＣＬ領域は、同じ免疫グロブリンクラスの対応する領域と同一であるかまたはその変異体である必要はない。例えば、ＣＬ領域はＩｇＥの対応する領域に由来してもよく、ＣＨ１領域はＩｇＧの対応する領域に由来してもよい。

【0057】

好ましくは、ｓｃＣＬＣＨ１リンカーのＣＬおよびＣＨ１は、ＩｇＧ１、好ましくはヒトＩｇＧ１の対応するＣＬおよびＣＨ１領域に由来する。

【0058】

ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）のＣＬ領域に対応する例示的なＣＬ領域は：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＳ（配列番号７）
を含む。

【0059】

ｈＩｇＧ１のＣＨ１領域に対応する例示的なＣＨＩ領域は：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬ ＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ（配列番号８）
を含む。

【0060】

本明細書に開示される一本鎖Ｆｃ融合タンパク質は、免疫グロブリン重鎖のカルボキシ末端の少なくとも一部を含有するＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ部分は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２－ＣＨ４ドメイン、ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４ドメイン、ヒンジ－ＣＨ２ドメイン、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ４ドメイン、またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４ドメインを含み得る。

【0061】

Ｆｃドメインは、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する抗体に由来し得る。好ましくは、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。Ｆｃドメインは、天然の対立遺伝子変異体またはスプライス変異体を含む、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する、天然に存在するＦｃ配列であり得る。あるいは、Ｆｃドメインは、２つ以上の異なるＩｇアイソタイプ由来のＦｃドメインの一部、例えばＩｇＧ２／ＩｇＧ４ハイブリッドＦｃドメインを含むハイブリッドドメインであってもよい。好ましくは、Ｆｃドメインは、ヒト免疫グロブリン分子に由来する。あるいは、Ｆｃドメインは、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれらに限定されない非ヒト動物由来のＦｃドメインのヒト化または脱免疫化（ヘルパーＴ細胞を活性化することができるＴ細胞エピトープの除去）バージョンであってもよい。

【0062】

Ｆｃドメインは、変異体Ｆｃ配列、例えば、望ましい構造特徴および／または生物学的活性を提供するために、親Ｆｃ配列（例えば、その後変異体を生じるように修飾される、非修飾Ｆｃポリペプチド）と比較して修飾されている（例えばアミノ酸の置換、欠失および／または挿入によって）Ｆｃ配列であり得る。例えば、（ａ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加もしくは減少、（ｂ）補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）の増加もしくは減少、（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性の増加もしくは減少、および／または（ｄ）親Ｆｃと比較してＦｃ受容体に対する親和性の増加または減少を有するＦｃ変異体を作製するために、Ｆｃ領域内で修飾を行い得る。そのようなＦｃ領域変異体は、一般に、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることは特に望ましいと考えられる。例えば、変異体Ｆｃ領域は、その中に、例えば、本明細書で同定された特定のＦｃ領域位置の２つ、３つ、４つ、５つ等の置換を含み得る。

【0063】

本発明のＦｃ融合タンパク質のヒンジ領域は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭのいずれかに属する抗体に由来し得る。ヒンジ領域は、ＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに由来し得る。ヒンジ領域は、天然にシステイン残基を含んでいてもよく、または１つ以上のシステイン残基を含むように操作されていてもよい。

【0064】

好ましくは、ヒンジ領域は、免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭのいずれかまたはＩｇＧ抗体サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のいずれかに属する天然免疫グロブリンの対応するヒンジ領域と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、ヒンジ領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１の対応するヒンジ領域と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である。

【0065】

ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン定常領域の配列を以下に示しており、ヒンジ領域の相対位置を実線の下線によって示す：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＪＦＰＬＡＳＳＴＳＯＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９）。ＣＨ１領域を点線の下線で示し、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を太字で示す。ＩｇＧ配列のＣ末端リシンは、Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期をさらに増加させるために、除去し得るかまたはアラニンなどの非リシンアミノ酸で置換し得る。

【0066】

ヒンジ配列は、望ましい薬物動態、生物物理学的および／または生物学的特性を付与する置換を含み得る。本発明の例示的なヒンジ領域は、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号５１）と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0067】

Ｆｃドメインおよびヒンジ領域は、１つの抗体クラスまたはサブクラスに由来し得る。例えば、ヒンジ領域およびＦｃドメインは、ＩｇＧ１に由来し得る。Ｆｃドメインおよびヒンジ領域は、異なる抗体クラスまたはサブクラスに対応し得る。例えば、ＦｃドメインはＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃ領域に対応してもよく、ヒンジ領域はＩｇＧ１に対応してもよい。

【0068】

好ましくは、本発明のＦｃ融合タンパク質の全ての免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１、好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。好ましくは、本発明の融合タンパク質のヒンジ領域とＦｃ領域の組み合わせは、
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬ Ｐ ＡＰＩＥＫＴＩ ＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰ ＱＶ ＹＴＬＰＰ ＳＲＥＥＭＴＫＮＱ Ｖ Ｓ ＬＴＣＬ ＶＫＧＦＹＰ Ｓ ＤＩ ＡＶＥＷＥＳＮＧＱ ＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳ ＬＳＰＧＫ（配列番号１０）と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の融合タンパク質のヒンジ領域とＦｃ領域の組み合わせは、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＱＶＪＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＮＷＬＤＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＦＩＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１１）と少なくとも５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0069】

ヒンジ領域および／またはＦｃ領域の間のジスルフィド結合の形成を可能にし、それによって本発明のＦｃ融合タンパク質の二量体を形成するために、遊離システイン残基を含む本発明の一本鎖融合タンパク質のヒンジ配列および／またはＦｃ領域を有することが望ましい場合がある。ヒンジおよび／またはＦｃ領域配列を改変して、例えばリンカー中の１つ以上のシステイン残基をセリン、アラニンまたはグリシンなどの別の残基に変異させることによって、遊離システイン残基を除去することが望ましい場合がある。本発明の一本鎖融合タンパク質のヒンジ領域は、本発明の第２の一本鎖融合タンパク質と１つ以上のジスルフィド結合を形成して二量体複合体を形成することができる１つ以上の遊離システイン残基を含み得る。

【0070】

好ましくは、本発明の（ｓｃＩＬ－１０）－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質は、ジスルフィド結合を介して他の単量体のヒンジ領域またはＦｃ領域に連結された本発明の２つの単量体一本鎖（ｓｃＩＬ－１０）－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質を含む二量体複合体である。二量体複合体は、ホモ二量体（例えば単量体融合タンパク質の両方が同一である）またはヘテロ二量体（例えばｓｃＩＬ－１０が各々の単量体融合タンパク質について異なり得る）であり得る。好ましくは、二量体複合体はホモ二量体であり、それにより、天然抗体のものと類似する抗体立体配置を提供するホモ二量体複合体を形成する。

【0071】

いかなる理論にも限定されるものではないが、本発明のホモ二量体融合タンパク質は、従来のＦｃ融合タンパク質と比較して天然の抗体構造により密接に類似する二量体Ｆｃ領域の存在により、半減期を増加させると考えられる。これは、融合タンパク質が式３の立体配置を有する場合に特に当てはまる。より天然のＦｃドメイン抗体立体配置は、ＦｃＲｎ受容体へのより良好な結合を可能にし、したがってｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ二量体複合体の循環半減期を増加させると考えられる。

【0072】

ｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ二量体複合体に関連する別の改善された特性は、ヒンジ領域におけるＦｃを介した二量体化によって生じる立体障害を軽減する柔軟性を与えるｓｃＣＬＣＨ１リンカーの使用に基づき、従来のＦｃ融合タンパク質と比較して生物活性が増加することである。

【0073】

好ましくは、本発明は、式１のｓｃＩＬ－１０が非置換ｓｃＩＬ－１０（１０ａａリンカー）である（ｓｃＩＬ－１０）－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合を提供する。好ましくは、本発明は、式１のｓｃＩＬ－１０が、２２位のメチオニン、４１位のアスパラギン酸および８７位のイソロイシンまたはそれらの任意の組み合わせから選択される式１のような第１単量体サブユニットまたは第２単量体サブユニットに少なくとも１つのアミノ酸置換を含むｓｃ－ＩＬ－１０変異体である（ｓｃＩＬ－１０）－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合を提供する。好ましくは、式１の第１または第２単量体サブユニットの４１位に少なくとも１つのアミノ酸置換が存在し、少なくとも１つのアミノ酸は、４１位にアミノ酸置換を含む同じサブユニットではない第１または第２単量体サブユニットの２２位で置換されている。

【0074】

本発明の好ましいｓｃＩＬ１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号１２と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、ｓｃＩＬ－１０は非置換ｓｃＩＬ－１０（１０ａａリンカー）である。

【0075】

本発明の好ましいｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質は、全て表４に示す配列番号２０～２１および３７～４４と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0076】

本発明の好ましいｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質は、表４に示す配列番号１７～１９と５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、ｓｃＩＬ－１０はｓｃＩＬ－１０変異体である。

【0077】

本発明はまた、本明細書に開示される様々な融合タンパク質のいずれかをコードする核酸を提供する。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するように選択され得る。そのようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞のために、特殊なコドン使用頻度パターンが開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００（２）：４３８－４４２（Ｊａｎ．２１，２００３）；Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２６（Ｉ）：９６－１０５（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００２）；Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｎ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２（５）：４４６－４４９（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００１）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，６０（３）：５１２－５３８（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９６）；およびＳｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，７（７）：６５７－６７８（Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９１）参照。

【0078】

核酸操作のための一般的な技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）および定期的な更新に記載されている。一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。そのような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。通常、複製起点によって与えられる宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれる。

【0079】

本明細書中に記載される融合タンパク質は、直接組換え生産され得るだけでなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え生産され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識され、処理される（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物系におけるポリペプチドの産生のための例示的なＮ末端リーダー配列は、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４８）であり、これは、発現後に宿主細胞によって除去される。

【0080】

天然のシグナル配列を認識せず、処理しない原核宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。

【0081】

酵母分泌のためには、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されているシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレーム内でそのタンパク質をコードするＤＮＡに連結され得る。

【0082】

発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にする配列であり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は大部分のグラム陰性細菌に適しており、２ミクロンプラスミドの起点は酵母に適しており、様々なウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むという理由だけで典型的に使用され得る）。

【0083】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求欠損を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地からは入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）にとってのＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。

【0084】

発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本明細書に開示されるタンパク質、例えばフィブロネクチンに基づく足場タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に適するプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、β－ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系ならびにｔａｎプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。しかし、他の公知の細菌プロモーターが適切である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、本明細書に開示されるタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。プロモーター配列は真核生物に関して公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始部位から７０～８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ（配列番号４９）領域であり、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。大部分の真核生物遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加するためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ（配列番号５０）配列が存在する。これらの配列は全て、真核生物発現ベクターに適切に挿入される。

【0085】

酵母宿主での使用に適したプロモーター配列の例には、３－ホスホグリセラートキナーゼまたは他の解糖酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのためのプロモーターが含まれる。

【0086】

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーターから得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であれば、制御され得る。

【0087】

高等真核生物による、本明細書に開示されるタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加される。現在、多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテインおよびインスリン）から公知である。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ，２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、ペプチドをコードする配列の５’側または３’側の位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’側に位置する。

【0088】

真核宿主細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、本明細書に開示されるタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号およびその中に開示されている発現ベクター参照。

【0089】

組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用であり得る任意のタイプのタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例には、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが含まれるが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用のための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））に見出すことができ、その関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0090】

発現構築物は、当業者には明らかなように、宿主細胞に適切な方法を用いて宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための様々な方法が当技術分野において公知であり、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性因子である場合）を含むが、これらに限定されない。

【0091】

適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞が含まれる。適切な細菌には、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば大腸菌またはバチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）が含まれる。好ましくはサッカロミセス属種、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の酵母も、ポリペプチドの産生のために使用し得る。様々な哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７（１９８８））によって総説されている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞、ＣＶ－１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が含まれる。精製ポリペプチドは、適切な宿主／ベクター系を培養して組換えタンパク質を発現させることによって調製される。多くの適用について、本明細書に開示されるポリペプチドの多くが小さなサイズであるため、発現のための好ましい方法として大腸菌での発現が行われる。次いで、培養培地または細胞抽出物からタンパク質が精製される。

【0092】

他の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするベクターを含む宿主細胞、および本明細書に記載の融合タンパク質を生産するための方法を提供する。宿主細胞を、タンパク質産生のための本明細書に記載の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択するまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜に改変した従来の栄養培地で培養し得る。ハイスループットタンパク質生産（ＨＴＰＰ）および中規模生産のために有用な宿主細胞には、ＨＭＳ １７４細菌株が含まれる。本明細書に開示されるタンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養し得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、様々な科学文献に記載されている培地の多くが、宿主細胞の培養培地として使用し得る。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源で補充され得る。任意の他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。

【0093】

本明細書で提供される融合タンパク質はまた、細胞翻訳系を用いて生産することができる。そのような目的のために、融合タンパク質をコードする核酸は、ｍＲＮＡを生成するインビトロ転写を可能にし、利用される特定の無細胞系（哺乳動物もしくは酵母無細胞翻訳系などの真核生物または細菌無細胞翻訳系などの原核生物）においてｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。

【0094】

本明細書に開示される融合タンパク質は、化学合成によって（例えばＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）に記載の方法によって）生産することもできる。融合タンパク質に対する修飾は、化学合成によって行うこともできる。

【0095】

本明細書に開示される融合タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般的に公知のタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。非限定的な例には、抽出、再結晶、塩析（例えば硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムを用いて）、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、順相クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ゲルろ過、ゲル浸透クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。精製後、ポリペプチドを、ろ過および透析を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって種々の緩衝液中に交換および／または濃縮し得る。

【0096】

精製された融合タンパク質は、好ましくは少なくとも純度８５％、または好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９８％である。純度の正確な数値にかかわらず、融合タンパク質は医薬品として使用するのに十分な純度である。

【0097】

他の融合パートナー。
本発明のｓｃＩＬ－１０タンパク質の他の適切な融合パートナーには、他の全てのタイプのＦｃ領域を含むタンパク質が含まれるが、これに限定されない。

【0098】

例えば、ｓｃＩＬ－１０タンパク質は、Ｆｃ領域、例えばＩｇＧ１を含有する天然免疫グロブリンのヒンジ領域に直接融合し得る。配列番号１３は、ＩｇＧ１分子のヒンジ領域に融合した非置換ｓｃＩＬ－１０（５ａａリンカー）の一例である。ＩｇＧ１分子は、例えばＩｇＧ１のヒンジ領域を短縮することによって修飾し得る。配列番号１４は、ＩｇＧ１のヒンジ領域に融合されたｓｃＩＬ－１０（５ａａリンカー）の一例であり、ここで、天然ＩｇＧ１のヒンジ領域は４アミノ酸短縮されている。配列番号１５は、ＩｇＧ１のヒンジ領域に融合したｓｃＩＬ－１０の一例であり、ここで、天然ＩｇＧ１のヒンジ領域は７アミノ酸短縮されている。配列番号１６は、ＩｇＧ１のヒンジ領域に融合したｓｃＩＬ－１０の一例であり、ここで、天然ＩｇＧ１のヒンジ領域は１０アミノ酸短縮されている。

【0099】

好ましい融合パートナーは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／１８４９３８号に記載されているようなムチンドメインポリペプチドリンカーをさらに含有するＦｃ領域を含む。「ムチンドメインポリペプチドリンカー」は、本明細書では、１つ以上の融合ポリペプチドパートナーに連結することができる「ムチンドメイン」を含む任意のタンパク質として定義される。ムチンドメインは、潜在的なグリコシル化部位が豊富であり、ムチンドメイン内のアミノ酸の４０％を超えて存在し得る、セリンおよび／またはトレオニンおよびプロリンの高い含量を有する。ムチンドメインは、主にＯ－結合型グリカンで高度にグリコシル化されている。ムチンドメインポリペプチドは、グリカンによってその質量の少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を有する。ムチンドメインは、各タンデムリピート単位当たり約８アミノ酸から１５０アミノ酸の長さで変化し得るタンデムアミノ酸反復単位（本明細書ではＴＲとも称される）を含み得る。タンデムリピート単位の数は、本発明のムチンドメインポリペプチドにおいて１～２５の間で変化し得る。

【0100】

本発明のムチンドメインポリペプチドリンカーには、ムチンタンパク質の全部または一部が含まれるが、これに限定されない。「その一部」とは、ムチンポリペプチドリンカーがムチンタンパク質の少なくとも１つのムチンドメインを含むことを意味する。ムチンタンパク質には、ＭＵＣ遺伝子（例えばＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３Ａ、ＭＵＣ３Ｂ、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、ＭＵＣ９、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１５、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１７、ＭＵＣ１９、ＭＵＣ２０、ＭＵＣ２１）によってコードされる任意のタンパク質が含まれる。ムチンタンパク質のムチンドメインは、典型的には両側で非反復アミノ酸領域によって隣接されている。ムチンドメインポリペプチドは、ムチンタンパク質（例えばＭＵＣ２０）の全部または一部を含み得る。ムチンドメインポリペプチドは、可溶性ムチンタンパク質のムチンタンパク質の全部または一部を含み得る。好ましくは、ムチンドメインポリペプチドは、ムチンタンパク質の細胞外部分を含む。

【0101】

好ましくは、式１のｓｃＩＬ－１０タンパク質は、ムチンドメインポリペプチドリンカーを介してＦｃ領域を含む分子に共有結合される。配列番号５２は、ムチンリンカーに融合した非置換ｓｃＩＬ－１０の一例であり、このムチンリンカーは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃ領域のヒンジに融合している。

【0102】

好ましい融合パートナーは、国際公開第２０１３／１８４９３９号に記載されているムチンドメインポリペプチド（Ｆｃ領域を含まない）である。

【0103】

好ましい融合パートナーは、血清アルブミンまたは血清アルブミンのドメインを含む。本発明の融合タンパク質を、ヒトを治療するために使用する場合は、ヒト血清アルブミンが好ましい。別の実施形態では、融合パートナーはヒトトランスフェリンを含む。

【0104】

ｓｃＩＬ－１０タンパク質の使用
一態様では、本発明は、診断薬または治療薬として有用なｓｃＩＬ－１０（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）を提供する。一態様では、本発明は、障害の治療において有用なタンパク質を提供する。

【0105】

本発明はまた、治療有効量または予防有効量の本発明のｓｃＩＬ－１０（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）を被験体に投与する工程を含む、被験体において有益な作用を達成するための方法も提供する。有効量は、疾患または障害を治療するのを助ける有益な作用をもたらすことができる。場合によっては、有益な作用を達成するための方法は、治療用タンパク質またはペプチドが存在しない疾患および疾患カテゴリーに関して被験体を治療するために治療有効量の融合タンパク質組成物を投与することを含み得る。

【0106】

好ましくは、ｓｃＩＬ－１０はいかなる融合パートナーにも連結されていない。

【0107】

好ましくは、ｓｃＩＬ－１０は、ｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃなどの適切な融合パートナーに共有結合されている。好ましくは、本発明は、適切な融合パートナーに融合したｓｃＩＬ－１０の二量体複合体を提供する。

【0108】

好ましくは、ｓｃＩＬ－１０（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）は、例えば自己免疫障害、線維症性疾患、炎症性疾患、虚血性疾患、神経変性疾患、神経障害性疾患、疼痛性障害、聴覚障害、精神障害、癌ならびに外傷および損傷に罹患している患者を治療するために使用される。

【0109】

自己免疫障害の例には、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性じんま疹、軸索性および神経性ニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、線維筋痛、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎病、ランバート－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（全身性エリテマトーデス）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ－ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性連鎖球菌関連性精神神経障害）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ－ターナー症候群、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、不穏下肢症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ（ＲＡ）、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病、トロサ－ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑ならびにウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。

【0110】

本発明のｓｃＩＬ－１０およびｓｃＩＬ－１０変異体ペプチド（適切な融合パートナーへのそれぞれの融合物を含む）によって治療され得る線維症性疾患の例には、癒着性関節包炎、関節線維症、心房線維症、慢性腎臓病、肝硬変、嚢胞性線維症（ＣＦ）、デュピュイトラン拘縮、心内膜心筋線維症、グリア瘢痕、特発性肺線維症、ケロイド、黄斑変性、縦隔線維症、骨髄線維症、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、腎性全身性線維症、ペロニー病、進行性塊状線維症（肺）、増殖性硝子体網膜症、肺線維症、後腹膜線維症、卒中に起因する瘢痕組織形成、強皮症、全身性硬化症、組織癒着が含まれるが、これらに限定されない。

【0111】

炎症性疾患の例には、アレルギー性腸炎、α１－アンチトリプシン欠損症、強直性脊椎炎、喘息、バレット食道、ベーチェット病、慢性疲労症候群（ＣＦＳ／ＣＦＩＤＳ／ＭＥ）、慢性ライム病（ボレリア症）、コカイン関連脈管炎、クローン病、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、うつ病、糖尿病、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、線維筋痛症（ＦＭ）、胃食道逆流性疾患（ＧＥＲＤ）、糸球体腎炎、移植片対宿主病、肉芽腫性血管炎、橋本甲状腺炎、高血圧症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性ミオパシー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、虚血性大腸炎、腎結石、ロフグレン症候群、紅斑性狼瘡、メタンフェタミン関連血管炎、片頭痛、モルジェロンズ病、多種化学物質過敏症（ＭＣＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、新生児期発症多臓器性炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、視神経炎、変形性関節炎、尋常性天疱瘡、リウマチ性多発性筋痛、前立腺炎、乾癬、乾癬性関節炎、放射線大腸炎、レイノー症候群／現象、反応性関節炎（ライター症候群）、反射性交感神経性ジストロフィ（ＲＳＤ）、不穏下肢症候群、関節リウマチ（ＲＡ）、サルコイドーシス、強皮症、季節性感情障害（ＳＡＤ）、敗血症性ショック、副鼻腔炎、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎およびめまいが含まれるが、これらに限定されない。

【0112】

虚血性疾患の例には、急性冠動脈症候群、狭心症、生命苦悶、コペプチン、冠動脈疾患、冠虚血、冬眠心筋、虚血性脳卒中、急性冠動脈症候群の管理、メルドニウム、心筋梗塞、心筋梗塞合併症、心筋梗塞診断、筋細胞融解、無酸素後脳症、プリンツメタル狭心症、スガルボッサ基準、脳卒中、ＴＩＭＩ、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）および不安定狭心症が含まれるが、これらに限定されない。

【0113】

神経変性疾患の例には、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳性運動失調症、バッジョ・ヨシナリ症候群、バッテン病、エストロゲン神経変性疾患、近位筋優位遺伝性運動感覚ニューロパチー、乳児レフスム病、ＪＵＮＱおよびＩＰＯＤ、歩行性運動失調症、ライム病、マシャド・ジョセフ病、脳橋および小脳形成不全を伴う精神遅滞および小頭症、多系統萎縮症、神経有棘赤血球症、神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、橋小脳形成不全、タンパク質凝集、ピルビン酸脱水素酵素欠損症、放射線ミエロパシー、レフサム病、網膜色素変性症、サンドホフ病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症、脊髄の亜急性連合変性症、亜急性硬化性全脳炎、脊髄癆、テイ・サックス病、中毒性脳症、中毒性白質脳症ならびにウォブリー・ヘッジホッグ症候群が含まれるが、これらに限定されない。

【0114】

神経障害性疾患の例には、ベル麻痺、カンピロバクター関連運動軸索障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症裂離（ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ ａｖｕｌｓｉｏｎ）、糖尿病性ニューロパチー、ギラン・バレー症候群および脈管炎が含まれるが、これらに限定されない。

【0115】

疼痛性障害の例には、増幅筋骨格痛症候群（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前皮神経絞扼症候群、中枢痛症候群、慢性機能性腹痛、慢性疼痛、慢性前立腺炎／慢性骨盤痛症候群、慢性創傷疼痛、変性椎間板疾患、歯下顎感覚運動機能不全、脊椎手術後疼痛症候群、線維筋痛症、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、筋筋膜疼痛症候群、骨盤痛、精管切除後疼痛症候群、反射性神経血管性ジストロフィ、鎌状赤血球症、テラミンおよび外陰痛が含まれるが、これらに限定されない。

【0116】

聴覚障害の例には、伝音難聴、感音難聴（ＳＮＨＬ）、混合性難聴が含まれるが、これらに限定されない。

【0117】

精神障害の例には、大うつ病性障害、難治性うつ病、治療抵抗性うつ病が含まれるが、これらに限定されない。

【0118】

外傷および損傷の例には、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、外傷性脳損傷、脊髄損傷、圧挫傷害、ショック、腱損傷、角膜への創傷、眼への創傷、皮膚創傷が含まれるが、これらに限定されない。

【0119】

好ましくは、本発明のｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）は、例えば、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、川崎病、狼瘡（全身性エリテマトーデス）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎を含む自己免疫障害；慢性腎疾患、肝硬変、黄斑変性、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、増殖性硝子体網膜症、肺線維症、脳卒中から生じる瘢痕組織形成、組織接着を含む線維症性疾患；アレルギー性腸炎、α１－アンチトリプシン欠損症、喘息、ベーチェット病、コカイン関連血管炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病、肉芽腫性血管炎、炎症性腸疾患、炎症性ミオパシー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、虚血性大腸炎、メタンフェタミン関連脈管炎、視神経炎、尋常性天疱瘡、放射線大腸炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、側頭動脈炎、脈管炎を含む炎症性疾患；心筋梗塞、無酸素後脳症、脳卒中を含む虚血性疾患；神経セロイドリポフスチン症、放射線ミエロパシー、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症を含む神経変性疾患；カンピロバクター関連運動軸索障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症裂離、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー症候群を含む神経障害疾患；伝音難聴、感音難聴（ＳＮＨＬ）、混合性難聴を含む聴覚障害；大うつ病性障害、難治性うつ病、治療抵抗性うつ病を含む精神障害；中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、外傷性脳損傷、脊髄損傷、圧挫損傷、ショック、腱損傷、角膜への創傷、眼への創傷、皮膚創傷を含む外傷および損傷に罹患している患者を治療するために使用し得る。

【0120】

最も好ましくは、本発明に従うｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）は、例えば、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、川崎病、狼瘡（全身性エリテマトーデス）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、乾癬、関節リウマチ、シェーグレン症候群、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎を含む自己免疫障害；慢性腎疾患、肝硬変、黄斑変性、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ、増殖性硝子体網膜症、肺線維症、脳卒中から生じる瘢痕組織形成、組織接着を含む線維症性疾患；アレルギー性腸炎、α１－アンチトリプシン欠損症、喘息、ベーチェット病、コカイン関連脈管炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病、肉芽腫性血管炎、炎症性腸疾患、炎症性ミオパシー（多発性筋炎、封入体筋炎、皮膚筋炎）、虚血性大腸炎、メタンフェタミン関連血管炎、視神経炎、尋常性天疱瘡、放射線大腸炎、サルコイドーシス、敗血症性ショック、側頭動脈炎、脈管炎を含む炎症性疾患；心筋梗塞、無酸素後脳症、脳卒中を含む虚血性疾患；神経セロイドリポフスチン症、放射線ミエロパシー、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症を含む神経変性疾患；カンピロバクター関連運動軸索障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、糖尿病性筋萎縮症裂離、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー症候群を含む神経障害疾患；伝音難聴、感音難聴（ＳＮＨＬ）、混合性難聴を含む聴覚障害；大うつ病性障害、難治性うつ病、治療抵抗性うつ病を含む精神障害；中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、外傷性脳損傷、脊髄損傷、圧挫損傷、ショック、腱損傷、角膜への創傷、眼への創傷、皮膚創傷を含む外傷および損傷に罹患している患者を治療するために使用し得る。

【0121】

好ましくは、本発明のｓｃＩｌ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）は、例えば、子宮、子宮頸部、乳房、卵巣、前立腺、精巣、陰茎、胃腸管、食道、中咽頭、胃、小腸または大腸、結腸または直腸、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭部または頸部、皮膚、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳、神経膠腫、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の癌、ならびに免疫系の癌、脾臓または胸腺の癌、パピローマウイルス誘発性癌、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌腫、黒色腫、肉腫、奇形癌、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、リンパ腫、白血病、骨髄腫、化学的に誘発された癌、転移および血管新生、ならびに結節硬化症に罹患している患者を治療するのに使用し得る。

【0122】

好ましくは、本発明に従うｓｃＩＬ－１０融合タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）は、聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患している患者を治療するために使用し得る。

【0123】

好ましくは、本発明に従うｓｃＩＬ－１０融合タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）はまた、上記に示すような疾患、聴覚障害、聴覚障害、腎細胞癌、黒色腫、乾癬、線維症、うつ病および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対して患者を治療するための薬剤の製造においても使用し得る。

【0124】

本出願はさらに、本明細書に記載されるｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）を含有する薬学的に許容される組成物を提供する。ｓｃＩＬ－１０タンパク質を含有する治療用製剤は、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、所望の程度の純度を有する記載されたタンパク質を混合することによって、水溶液、凍結乾燥製剤または他の乾燥製剤の形態で保存用に調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤を含む。

【0125】

本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要に応じて１つより多い活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する化合物も含み得る。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。

【0126】

好ましくは、本発明に従うｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ－（メチルメタクリラート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0127】

インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成される。

【0128】

徐放性調製物を調製し得る。徐放性調製物の適切な例としては、本明細書に記載のフィブロネクチンベースの足場タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド、ラクチドとグリコリドのコポリマー、Ｌ－グルタミン酸とγ－エチル－Ｌ－グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマーが含まれる。エチレン－酢酸ビニルおよび乳酸－グリコール酸などのポリマーは徐放を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化されたタンパク質が長時間体内にとどまる場合、３７℃で水分に暴露された結果として変性または凝集することがあり、生物学的活性の喪失および免疫原性の変化の可能性をもたらす。関与する機構に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ－ジスルフィド相互交換を介した分子間Ｓ－Ｓ結合形成であることが判明した場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾する、酸性溶液から凍結乾燥する、含水量を制御する、適切な添加剤を使用する、および特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。

【0129】

当業者は、本発明に従う各ｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）の投与量が患者の特定の状況に依存することを理解するであろう。投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ宿主体重、より一般的には０．０１～５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１～３０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療レジメンは、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回または３～６ヶ月ごとに１回の投与を伴う。投与レジメンは、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内投与を含み、タンパク質は、以下の投与スケジュール：６回にわたって４週間ごと、次いで３ヶ月ごと；３週間ごと；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、続いて３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重の１つを用いて与えられる。好ましくは、本発明に従うｓｃＩＬ－１０融合タンパク質（適切な融合パートナーへのそれぞれの融合物およびその二量体複合体を含む）は、通常、複数回投与される。単回投与間の間隔は、例えば毎週、毎月、３ヶ月ごとまたは毎年であり得る。間隔は、患者の可溶性タンパク質の血中濃度を測定することによって示されるように、不規則であってもよい。いくつかの方法では、投与量は、約０．１～１０００ｐｇ／ｍｌおよびいくつかの方法では約５～３００ｍｇ／ｍｌの可溶性タンパク質の血漿濃度を達成するように調整される。

【0130】

治療適用では、本発明に従うｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）を、薬学的に許容される剤形で被験体に投与する。それらは、ボーラスとしてもしくは一定期間にわたる持続注入によって静脈内に、筋肉内、皮下、眼内、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所または吸入経路によって投与することができる。タンパク質はまた、局所的および全身的治療効果を発揮するために、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病巣周囲経路によっても投与し得る。適切な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状況が許す場合は当業者によって決定され得る。適切な担体、希釈剤および／または賦形剤の例には、（１）約１ｍｇ／ｍｌ～２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するｐＨ約７．４のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれる。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで実施することができる。

【0131】

ｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）および１つ以上のさらなる治療薬の投与は、同時投与または逐次投与のいずれの場合も、治療適用に関して上述したように実施し得る。同時投与のための適切な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、同時投与される特定の治療薬の固有性に依存することが当業者に理解されるであろう。

【0132】

凍結乾燥されるのではなく、水性剤形中に存在する場合、ｓｃＩＬ－１０（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）は、典型的には約０．１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されるが、これらの範囲外の広い変動が許容される。疾患の治療のために、ｓｃＩＬ－１０（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）の適切な投与量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、ｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）が予防目的または治療目的のどちらで投与されるのか、以前の治療の経過、患者の臨床歴およびｓｃＩＬ－１０タンパク質（適切な融合パートナーへのｓｃＩＬ－１０の融合物およびその二量体複合体を含む）に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。ｓｃＩＬ－１０タンパク質は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。

【0133】

例
例１：非置換ｓｃＩＬ－１０
ｓｃＩＬ－１０の設計：Ｃ _Ｌ ：Ｃ _Ｈ １：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｈ１ ：Ｃ _Ｌ ：Ｆｃ
ｓｃＩＬ－１０一本鎖融合体分子は、ＩｇＧ１重鎖のＣＬ－ＣＨ１－Ｆｃ（式３）ドメインまたはＣＨ１－ＣＬ－Ｆｃに連結された、共有結合したＩＬ－１０ホモ二量体融合タンパク質を含む（図１および２）。合成した各分子のアミノ酸配列を表１に示す。

【0134】

【表1】

【0135】

ｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｌ ：Ｃ _Ｈ １：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｈ１ ：Ｃ _Ｌ ：Ｆｃの発現
遺伝子を合成的に合成し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ）に供給し、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させた。プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて低ｐＨでの溶出でタンパク質を精製し、１Ｘ ＰＢＳ ２Ｌに対して２回透析した。

【0136】

還元および非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥゲルによって分子を分析した（図３）。還元および非還元条件のために、タンパク質２．５μｇをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ～２５０ｋＤ）と共にＡｎｙ ｋＤゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷した。分子を、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å、３．５μｍ、７．８ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ））での分析ゲルろ過によって特徴付けた。カラムを平衡化し、全ての分析のためのランニング緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を用いて０．９ｍｌ／分で流した。精製した試料（０．５ｍｇ／ｍｌ）を注入し（１５μｌ）、１５分間の実行時間で溶出させた（図４および５）。

【0137】

ｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｌ ：Ｃ _Ｈ １：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｈ１ ：Ｃ _Ｌ ：Ｆｃの生物活性
マウス肥満細胞株ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８３０６）の増殖を刺激するｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｈ１：Ｃ_Ｌ：Ｆｃの能力を評価することによってインビトロ生物活性を評価した。ｓｃＩＬ－１０直接Ｆｃ融合タンパク質（ｓｃＩＬ－１０：Ｆｃ）を対照として使用した。アッセイのために、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ培地にＭＣ／９細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、様々な濃度のヒトＩＬ－１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１：Ｆｃ、ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｈ１：Ｃ_Ｌ：ＦｃまたはｓｃＩＬ－１０：Ｆｃと共に３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間、製造者のプロトコルに従って染色した。５６０／５９０ｎｍで蛍光測定を行った。ＩＬ－１０（ＥＣ_５０＝７５ｐＭ）、ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１：Ｆｃ（ＥＣ_５０＝７９ｐＭ）、ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｈ１：Ｃ_Ｌ：Ｆｃ（ＥＣ_５０＝９３ｐＭ）およびｓｃＩＬ－１０：Ｆｃ（ＥＣ_５０＝４９３ｐＭ）は用量依存的に活性であった（図６）。

【0138】

ｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｌ ：Ｃ _Ｈ １：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｃ _Ｈ１ ：Ｃ _Ｌ ：ＦｃのマウスＰＫ
マウスにおけるｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１：Ｆｃ、ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｈ１：Ｃ_Ｌ：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｆｃの薬物動態を、尾静脈に投与した０．５ｍｇ／ｋｇの単回静脈内用量および肩甲骨間領域に投与した２．５ｍｇ／ｋｇの単回皮下用量で評価した。ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｌ：Ｃ_Ｈ１：Ｆｃ、ｓｃＩＬ－１０：Ｃ_Ｈ１：Ｃ_Ｌ：ＦｃおよびｓｃＩＬ－１０：Ｆｃの投与の０．０８３、０．５、１、４、６、２４、４８、９６、１６８、１９２および２１６時間後に血液試料（ｎ＝３試料／時点／融合タンパク質）を収集した。各々の時点／融合タンパク質／投与経路について、血清をプールし、標準的なＭＳＤ技術を用いて濃度を測定した。生物分析データを、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．４ソフトウェアを用いた非コンパートメント薬物動態分析に供した。標準的な薬物動態パラメータである最大濃度（Ｃ _ｍａｘ ）、最大濃度までの時間（Ｔ _ｍａｘ ）、時間対濃度曲線下面積（ＡＵＣ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、排出半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態での分布容積（Ｖ_ｓｓ）およびバイオアベイラビリティ（％Ｆ）を含む薬物動態パラメータを測定し、表２および表３に報告した。

【0139】

【表2】

【0140】

【表3】

【0141】

例２：（ｓｃＩＬ－１０）－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合タンパク質
ｓｃＩＬ－１０変異体融合タンパク質の設計
式１のｓｃＩＬ－１０を、式３のようにＬ１がＣＬ－ＣＨ１－Ｆｃである式２の一本鎖Ｆｃリンカーに融合する。合成した各々の完全長ｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合変異体タンパク質のアミノ酸配列を表４に示す。表４の説明欄は、融合パートナーとの構築物に使用したｓｃＩＬ－１０を示す。例えばｗｔＩＬ－１０：リンカー：Ｄ４１Ｆは、式１に従って、第１単量体サブユニットが配列番号１のｗｔＩＬ－１０であり、したがって第２単量体サブユニットに連結されたリンカーに連結された非置換であり、配列番号１のｗｔＩＬ－１０が、アミノ酸４１のイソロイシンがフェニルアラニンで置換される（Ｄ４１Ｆ）ようにアミノ酸４１で置換されていることを示す。

【0142】

哺乳動物細胞における発現のために、配列番号４８のＮ末端リーダー配列を、表４に示すタンパク質配列の各々に付加した。

【0143】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【表4-7】

【表4-8】

【表4-9】

【0144】

ｓｃ－ＩＬ－１０変異体融合タンパク質の発現
遺伝子を合成的に合成し、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ）に供給し、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させた。プロテインＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて低ｐＨでの溶出でタンパク質を精製し、１Ｘ ＰＢＳ ２Ｌに対して２回透析した。

【0145】

還元および非還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥゲルによって分子を分析した。還元および非還元条件のために、タンパク質２．５μｇをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＭＷ範囲１０ｋＤ～２５０ｋＤ）と共にＡｎｙ ｋＤゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷した。分子を、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å、３．５μｍ、７．８ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ））での分析ゲルろ過によって特徴付けた。カラムを平衡化し、全ての分析のためのランニング緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を用いて０．９ｍｌ／分で流した。精製した試料（０．５ｍｇ／ｍｌ）を注入し（１５ｕｌ）、１５分間の実行時間で溶出させた。

【0146】

マウスＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイ
ＬＰＳ刺激したＣ５７ＢＬ／６マウスＰＢＭＣ（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）においてＴＮＦαの産生を阻害するｓｃＩＬ－１０構築物の能力を評価することによってインビトロ生物活性を評価した。アッセイのために、ＰＢＭＣ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地に５０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳおよび様々な濃度のｓｃＩＬ－１０構築物（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間インキュベートした。１８時間後、Ｖ－ＰｌｅｘマウスＴＮＦα ＭＳＤ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてＴＮＦα産生を測定した。ＩＣ５０値については以下の表５および表６参照。

【0147】

ＭＣ／９アッセイ
本発明者らのｓｃＩＬ－１０構築物の、マウス肥満細胞株ＭＣ／９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８３０６）の増殖を刺激する能力を評価することによってインビトロ生物活性を評価した。アッセイのために、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよび０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノールを含有するＤＭＥＭ培地にＭＣ／９細胞を１０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、様々な濃度のヒトＩＬ－１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＲＤＢ３５１５、ＲＤＢ３５１６またはＲＤＢ３５０９と共に３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートした。７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で４時間、製造者のプロトコルに従って染色した。５６０／５９０ｎｍで蛍光測定を行った。ＥＣ５０値については以下の表５および表６参照。

【0148】

【表5】

【0149】

【表6】

【0150】

表５に示すように、ＷＴ ＩＬ－１０の比率は約１１であった。配列番号１２の比率は１０００であり、ｓｃＩＬ－１０配列をＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ足場上に構築するだけで抗炎症ウィンドウが増加することを示した。以下の実験は、ＣＬ：ＣＨ１：Ｆｃ足場上の非置換ｓｃＩＬ－１０、ｓｃＩＬ－１０変異体および様々なサイズのＬＩＮＫＥＲ長を含む式１のｓｃＩＬ－１０分子の様々な立体配置で実施した。

【0151】

実験は、ｓｃＩＬ－１０ヘテロ五量体シグナル伝達複合体からの２つのＩＬ－１０Ｒ１受容体鎖および２つのＩＬ－１０Ｒ２受容体鎖の種々の組み合わせでｓｃＩＬ－１０界面を破壊する非置換ｓｃＩＬ－１０およびｓｃＩＬ－１０変異体の作用を調べるために、表５および表６の構築物を用いて実施した。図７に示すように２つのＩＬ－１０Ｒ１界面のいずれか一方を破壊する突然変異である配列番号２０、２１、３７および４１は、抗炎症効力をわずかに弱めるが、免疫刺激効力を有意に弱め、抗炎症ウィンドウサイズの増加をもたらす。

【0152】

両方のＩＬ－１０Ｒ１界面を同時に破壊する二重突然変異の導入（配列番号２２）は、測定可能な抗炎症活性または免疫刺激活性を有さない構築物をもたらす。これは、ｓｃＩＬ－１０がＩＬ－１０受容体を介してシグナル伝達するためには、少なくとも１つのＩＬ－１０Ｒ１受容体鎖を動員できなければならないことを実証する。ＩＬ－１０Ｒ１受容体鎖は「高親和性」受容体鎖（ＩＬ－１０Ｒ２よりもＩＬ－１０により密接に結合する）であることが公知であるので、両方のＩＬ－１０Ｒ１結合界面を同時に破壊する突然変異は、ｓｃＩＬ－１０がＩＬ－１０受容体に結合する能力を排除するかまたは有意に弱め、シグナル伝達を全くもたらさない可能性が高い。

【0153】

図８に示すように、２つのＩＬ－１０Ｒ２界面のいずれか一方を破壊する突然変異（配列番号２３および２４）は、抗炎症効力の変化を示さないが、免疫刺激効力のわずかな増加を示し、抗炎症ウィンドウサイズをわずかに減少させる。両方のＩＬ－１０Ｒ２界面を同時に破壊する二重突然変異体の導入（配列番号２９）は、抗炎症活性および免疫刺激活性の両方の効力の損失をもたらし、天然のｓｃＩＬ－１０構築物と比較するとわずかに低い、ＩＬ－１０Ｒ２界面の単一突然変異体のものと同様の抗炎症ウィンドウサイズを有する構築物を生じる。この結果は、ＩＬ－１０Ｒ２界面を破壊する突然変異は、単独ではｓｃＩＬ－１０の抗炎症ウィンドウを拡大する潜在能を有さないことを明らかにする。

【0154】

図８に示すように、ＩＬ－１０Ｒ１界面の１つとＩＬ－１０Ｒ２界面の１つを同時に破壊する突然変異を調べた。ｓｃＩＬ－１０融合二量体の同じ側からＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２部位に位置する突然変異（配列番号２６および２７）は、抗炎症活性および免疫刺激活性の両方について減弱した効力を示す；それらの組み合わせのうちの１つ（配列番号２７）は、有意に増加した抗炎症ウィンドウサイズを示す。ｓｃＩＬ－１０融合二量体の反対側からＩＬ－１０Ｒ１界面およびＩＬ－１０Ｒ２界面に位置する突然変異（配列番号２８および２９）は、減弱した抗炎症効力を示し、試験した濃度では測定可能な免疫刺激活性を示さない。したがって、それらは非常に大きな抗炎症ウィンドウを示す。ＩＬ－１０受容体シグナル伝達は、ＩＬ－１０結合後にＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２がクラスター化されることを必要とするので、これらのデータは、免疫刺激活性を減弱させる（およびそれによって抗炎症ウィンドウを増加させる）ための最適な戦略は、ＩＬ－１０Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒ２受容体鎖の対の両方を標的とすることであることを示す。ＩＬ－１０Ｒ１界面スキャンは、シグナル伝達が、少なくとも１つのＩＬ－１０Ｒ１界面が結合に適格であることを必要とすることを明らかにしたので、ｓｃＩＬ－１０結合時にクラスターを形成するＩＬ－１０Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒ２受容体鎖の両方の対を有効に破壊するためにｓｃＩＬ－１０融合二量体の反対側のＩＬ－１０Ｒ２界面を標的とする必要がある。この突然変異のパターンは、免疫刺激を媒介する細胞へのｓｃＩＬ－１０生物活性をより劇的に調節するが、抗炎症作用を媒介する細胞はｓｃＩＬ－１０シグナル伝達に対して極めて感受性のままである。

【0155】

例３：ｓｃＩＬ－１０の様々なリンカー長
ＬＩＮＫＥＲの長さが変化する式１のｓｃＩＬ－１０を、Ｌ１が式３のようにＣＬ－ＣＨ１－Ｆｃである式２の一本鎖Ｆｃリンカーに融合する。合成した各々の完全長ｓｃＩＬ－１０－Ｌ１－ＨＩＮＧＥ－Ｆｃ融合変異体タンパク質のアミノ酸配列を表７に示す。

【0156】

哺乳動物細胞における発現のために、配列番号４８のＮ末端リーダー配列を表７に示すタンパク質配列の各々に付加した。

【0157】

各融合タンパク質のアミノ酸配列を表７に示す。ペプチドの発現は例２に記載されている通りである。例２に記載のマウスＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイおよびＭＣ／９アッセイにおいて生物活性を試験した。結果を例２の表５に示している。結果は、リンカーのサイズを減少させると抗炎症ウィンドウのサイズが減少することを示し、リンカーの長さが、免疫刺激抗力に比べて抗炎症効力の選択性を低下させるように、ＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２界面の強さに影響を及ぼすことを示唆する。

【0158】

【表7】

【0159】

例４：立体的混み合いを介したｓｃＩＬ－１０の抗炎症ウィンドウの調節
この実験で用いた各ｓｃＩＬ－１０融合タンパク質のアミノ酸配列を表８に示す。ペプチドの発現は例２に記載されている通りである。例２に記載のマウスＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイおよびＭＣ／９アッセイにおいてペプチドの生物活性を試験した。結果を例２の表５に示している。結果は、ヒンジが短くなるにつれて、抗炎症ウィンドウのサイズが増加することを示す。いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、これは、ヒンジ切断が２つのｓｃＩＬ－１０部分間の立体的混み合いを増加させ、ＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２界面の調節をもたらし、抗炎症効力および免疫刺激抗力の変化につながることを示唆する。

【0160】

【表8】

【0161】

例５：ｓｃＩＬ－１０
実験は、ＬＩＮＫＥＲの長さが様々である式１のｓｃＩＬ－１０を用いて実施した。これらの実験のために合成したアミノ酸配列を表９に示す。配列番号４５および４６の発現は例２に記載されている通りである。配列番号４５の生物活性を、例２に記載のＭＣ／９アッセイで試験した。このデータは、ＭＣ／９における配列番号４５の値が５．６ｐＭであることを示した。

【0162】

配列番号４５および４６の生物活性を、例２に記載のマウスＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイおよびＭＣ／９アッセイにおいてさらに試験する。結果は、ｓｃＩＬ－１０ Ｆｃ融合タンパク質について観察された傾向と一致して、いかなる融合パートナーも存在しないｓｃＩＬ－１０部分が極めて強力な生物活性を示すことを示すであろう。

【0163】

【表9】

【0164】

例６
式１のｓｃＩＬ－１０を、ＭＵＣ２０のタンデムリピートを含むムチンドメインリンカーに融合し、次にこれをＦｃドメインに融合した。（ｓｃＩＬ－１０（５ａａリンカー））－（ムチンリンカー）－Ｆｃのアミノ酸配列を表１０に示す。哺乳動物細胞における発現のために、配列番号４８のＮ末端リーダー配列を表１１に示すタンパク質に付加した。

【0165】

各融合タンパク質のアミノ酸配列を表１０に示す。ペプチドの発現は例２に記載されている通りである。例２に記載のマウスＰＢＭＣサイトカイン放出アッセイおよびＭＣ／９アッセイにおいて生物活性を試験した。結果を表１１に示す。結果は、ｓｃＩＬ－１０ Ｆｃ融合タンパク質の生物活性が、ｓｃＩＬ－１０ドメインとＦｃドメインとを連結するリンカードメインの組成にかかわらず一貫していることを示す。

【0166】

【表10】

【0167】

【表11】

【0168】

本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用される全ての米国特許および公開または非公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書で引用される全ての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用される全ての他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0169】

本発明を、その好ましい特徴に関して具体的に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更がなされ得ることは当業者に理解されるであろう。また、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は互いに排他的ではなく、特徴は本発明に従って全体的または部分的に組み合わされ得ることも理解されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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