▶ ＨＯＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｓｕｒｇｉｃａｌ株式会社の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-10
(45)【発行日】2022-06-20
(54)【発明の名称】アパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/02 20060101AFI20220613BHJP
【ＦＩ】
C12N7/02
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021009952
(22)【出願日】2021-01-26
(62)【分割の表示】P 2020549831の分割
【原出願日】2020-06-16
(65)【公開番号】P2021193997
(43)【公開日】2021-12-27
【審査請求日】2021-01-26
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ＰＲＯＳ ＯＮＥ １４（９）：ｅ０２２２１９９に掲載（掲載日２０１９年９月１９日）
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】501046420
【氏名又は名称】ＨＯＹＡ Ｔｅｃｈｎｏｓｕｒｇｉｃａｌ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100166637
【弁理士】
【氏名又は名称】木内 圭
(72)【発明者】
【氏名】黒澤 八重
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－１９５６００（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－１１０９０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１３６７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１９７５３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／１２３２４２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１１－０９７９１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０１０５４５６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００７－２３８４７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０３－２５４８３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】KUROSAWA,Yae et al.，Sequential two-step chromatographic purification of infectious poliovirus using ceramic fluoroapatit，PLOS ONE，2019年09月19日，14(9)，e0222199,p.1-13
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ７／００－７／０８
Ｇ０１Ｎ ３０／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
ｐＨ値を第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘って直線的に変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るｐＨ勾配溶出工程を含み、
前記第１のｐＨ値が６．０以下であり、前記第２のｐＨ値が７．５以上であり、
前記リン酸カルシウム系化合物は、フルオロアパタイトを主成分とし、酸性条件下でも使用可能なものであり、
前記ウイルス粒子は、前記第１のｐＨ値から前記第２のｐＨ値に亘るｐＨ値の変化に応じて前記吸着剤に対する吸着性が低下するものである精製方法。
【請求項2】
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
ｐＨ値を第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘って変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るｐＨ勾配溶出工程を含み、
前記第１のｐＨ値が６．０以下であり、前記第２のｐＨ値が７．５以上であり、
前記リン酸カルシウム系化合物は、酸性条件下でも使用可能なものであり、
前記ウイルス粒子は、前記第１のｐＨ値から前記第２のｐＨ値に亘るｐＨ値の変化に応じて前記吸着剤に対する吸着性が低下するものである精製方法。
【請求項3】
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、請求項１または２に記載の精製方法によって該組成物中の不純物を除去するステップとを含む、ウイルス粒子の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、セラミックアパタイトカラムを使用したウイルスの精製方法に関する。
【0002】
より詳しくは、本発明は、セラミックフルオロアパタイトカラムおよびセラミックハイドロキシアパタイトカラムを使用した感染性ポリオウイルスの連続した2段階クロマトグラフィー精製に関する。
【0003】
本発明の精製方法の背景及び概要は以下の通りである。感染性ウイルスの精製技術は、ワクチン開発と遺伝子治療の用途にとって重要である。しかし、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）を使用した標準化された１段階精製技術は、ポリオウイルスには適さないことがわかっている。したがって、我々は、細胞培養上清から、ポリオウイルスの感染性セービン２型ワクチン株を精製するための連続した２段階クロマトグラフィー法を設計した。第１のステップにおいて、我々は、セラミックフルオロアパタイトカラムにおけるｐＨ勾配溶出によって、セービン２型ウイルス画分からタンパク不純物を除去した。第２のステップにおいて、我々は、そのウイルス画分を希釈し、ＣＨＡｐカラムに直接それをロードし、１Ｍ塩化ナトリウム存在下でリン酸塩勾配を使用して精製することにより、宿主細胞に由来する２本鎖ＤＮＡを除去した。このプロセスは、タンパクと２本鎖ＤＮＡに対して、それぞれ、９９．９５％、９９．９９％以上の除去率を達成することができ、また、このプロセスは、高度に再現可能であり、スケールアップが容易であった。更に、これは他のウイルス種にも適用可能である。
【背景技術】
【0004】
より安全なワクチンの開発は、副作用が少なくなることを要求する。そのため、食品医薬品局（FDA）のような監督機関は、生産工程および精製工程を改善することを開発業者と製造業者の双方に要求する。超遠心分離、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、電気泳動、沈殿および分子篩を含む様々な手順が、ワクチン精製のために開発されてきた。特に、塩化セシウム勾配、スクロース勾配又はイオジキサノール勾配を使用した超遠心分離は、製薬用途のいくつかのウイルス製剤を処理するために使用されてきた。しかし、これらの手順は、ウイルスの感染力を低下させ、宿主細胞ＤＮＡ等のウイルス粒子に似た物理的特性を有する粒子混入物をウイルス画分から分離することができない。さらに、密度勾配分離は、時間がかかり、スケールアップ性と経済効率が低い。
【0005】
最近の１つの傾向は、液体クロマトグラフィーをウイルス製剤の精製に使用することである。従来の遠心分離と異なり、初期の捕捉ステージから最終の精製段階までにおいて使用するのが簡単であり、直接的なスケールアップを提供するからである。更に、最近は、イオン交換、サイズ排除、疎水的相互作用、金属固定化アフィニティおよびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィを含むいくつかのアプローチを用いて、大規模精製（＞１０１３個のウィルス粒子）に液体クロマトグラフィーが使用されている。
【0006】
生物学的安全性の理由により、ハイドロキシアパタイトは、バイオマテリアルエンジニアリング及び再生医療のみならず、医薬品の精製においても一般的に使用されている。最近、我々のチームは、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの手順を標準化し、ウイルスに感染したＣ６／３６細胞の培養上清とマウス脳ホモジェネートから、１段階ハイドロキシアパタイト液体クロマトグラフィーを使用してデングウィルス２型および日本脳炎ウイルスをそれぞれ精製することに成功した。走査電子顕微鏡分析は、クロマトグラフィーのプロセスによって、ウイルス粒子がハイドロキシアパタイトの表面に吸着し、表面から放出されたことを確認し、ハイドロキシアパタイトのリン酸塩依存的な吸着／脱着メカニズムを明確に示した。したがって、我々は、アパタイトをベースとした材料が、疾病用のワクチンや遺伝子治療用のベクターの精製に適しており、アパタイトをベースとした材料の有効性を高め、コストを低減させると考えた。
【0007】
現在のところ、ソーク（Ｓａｌｋ）ワクチンとセービン（Ｓａｂｉｎ）ワクチンの２種類のポリオワクチンが利用可能である。ソークワクチンは、ホルマリンで不活性化されたポリオウイルス強毒株で注射可能なワクチンであり、セービンワクチンは、経口弱毒生ワクチンである。セ―ビン経口ワクチンは、ワクチンに由来するポリオウイルスが影響することによって、ワクチンに関連した麻痺性急性灰白髄炎を発症させることがある。従って、無感染性の予防接種方法を開発することが優先事項になっている。そのため、最近は、より安全な株から、注射可能なセービンワクチンが開発されており、最近は小さな会社がより小さい設備投資によってこのワクチンを製造することができようになっている。これは、セービン株が、他の野生株より感染性は低く、高いバイオセーフティレベルを要求しないからである。ポリオウイルスは、酸に安定なピコルナウイルス科に属し、ｐＨ３以下でも感染力を保持する。球状ウイルス粒子は、脂質エンベロープを含んでおらず、直径が約３０ｎｍであり、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４の４つの構造タンパクからなる。
【0008】
ポリオウイルスに特化した精製方法としては、例えば、特許文献１に、陽イオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーを用いた方法が開示されている。しかし、この技術は、イオン交換クロマトグラフィーを使用することに起因して、ウイルスを変性させてしまうおそれがあった。また、この精製方法は、サイズ排除クロマトグラフィによってサンプルが希釈されてしまい、希釈されたサンプルを濃縮する工程が必要になるため、生産効率が低いという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】国際公開第２０１６／０１２４４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
そこで、本発明は、不純物タンパク質をより効果的に除去することができるウイルスの精製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
このような目的は、下記に記載の本発明により達成することができる。
［Ａ］
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
ｐＨ値を第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘って直線的に変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るｐＨ勾配溶出工程を含む、精製方法。
［Ｂ］
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
ｐＨ値を第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘って変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るｐＨ勾配溶出工程を含み、
前記第１のｐＨ値が６．０以下であり、前記第２のｐＨ値が７．５以上である精製方法。
［Ｃ］
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
請求項１に記載の精製方法によって該組成物中の不純物を除去するステップとを含む、ウイルス粒子の生産方法。
［Ａ］
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
ｐＨ値を第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘って直線的に変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るｐＨ勾配溶出工程を含む、精製方法。
［Ｂ］
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物から該不純物を除去する精製方法であって、前記精製方法は、
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
リン酸カルシウム系化合物で構成された吸着剤に前記組成物を接触させることにより、該吸着剤に前記ウイルス粒子を吸着させる吸着ステップと、
ｐＨ値を第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘って変化させた溶液を前記吸着剤に注入することによって前記吸着剤から前記ウイルス粒子を溶出させて溶出液を得るｐＨ勾配溶出工程を含み、
前記第１のｐＨ値が６．０以下であり、前記第２のｐＨ値が７．５以上である精製方法。
［Ｃ］
ウイルス粒子と不純物とを含む組成物を準備するステップと、
請求項１に記載の精製方法によって該組成物中の不純物を除去するステップとを含む、ウイルス粒子の生産方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明の精製方法によれば、不純物タンパク質をより効果的に除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】標準化された２段階精製手順を示す。
【図2A】セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）カラムにおけるｐＨ勾配溶出によるセービン２型ウイルスの精製を示す。
【図2B】ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した画分の分析を示す。
【図3A】１．０Ｍ ＮａＣｌの存在下でセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清を精製した際のクロマトグラムを示す。
【図3B】１．５Ｍ ＮａＣｌの存在下でセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清を精製した際のクロマトグラムを示す。
【図4A】ｐＨ勾配溶出によるセービン２型ウイルス精製（ステップ１）を示す。
【図4B】塩濃度勾配溶出によるセービン２型ウイルス精製（ステップ２）を示す。
【図4C】ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用した２段階精製により得た画分の分析を示す。
【図5】本発明の一実施形態における精製方法を適用したタンデムカラムシステムを示す。
【図6A】ｐＨ６．４においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムで分離したセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図6B】ｐＨ７．２においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムで分離したセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図6C】ｐＨ８．２においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムで分離したセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図7A】ｐＨ６．４においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離されたデングウイルス１型を含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図7B】ｐＨ６．４においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離されたデングウイルス１型を含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図8A】ｐＨ６．５においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離したインフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図8B】ｐＨ６．８においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離したインフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図8C】ｐＨ７．５においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離したインフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【図9A】ＮａＣｌの非存在下（０M）での、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の一実施形態における好ましい態様について以下に説明する。
【0015】
上記ｐＨ勾配溶出において用いられる吸着剤は、酸性条件下でも使用可能なものであることが好ましい。酸性条件下でも使用可能であるとは、カラムにロードされる溶液のｐＨ値が７．０より小さくても、当該吸着剤が実質的に溶解又は分解されず、当該吸着剤が有する分離機能を発揮することを意味する。
【0016】
上記ｐＨ勾配溶出において用いられる吸着剤は、式：（ＣＡ）１０（ＰＯ４）６（Ｆ）２で表されるフルオロアパタイトを主成分とすることが好ましい。フルオロアパタイトは、球状粒子であることが好ましい。球状粒子であるフルオロアパタイトとしては、例えば、Biorad社のCFT（セラミックフルオロアパタイト）を用いることができる。
【0017】
上記ｐＨ勾配は、第１のｐＨ値から第２のｐＨ値に亘ってｐＨ値を変化させるものであり、第１のｐＨ値が酸性であり、前記第２のｐＨ値が中性又はアルカリ性である。
【0018】
上記第１のｐＨは、ウイルスの保持容量を増加させる観点等から、３．０ないし７．０であることが好ましく、３．５ないし６．５であることがより好ましく、４．０ないし６．０であることがさらに好ましく、４．５ないし５．５であることが最も好ましい。
【0019】
上記第２のｐＨは、７．４ないし９．０であることが好ましく、７．６ないし８．８であることがより好ましく、７．８ないし８．６であることがさらに好ましく、８．０ないし８．４であることが最も好ましい。
【0020】
上記塩濃度勾配による溶出に用いられる吸着剤は、式：Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で表されるハイドロキシアパタイト、を主成分とすることが好ましい。ハイドロキシアパタイトは、球状粒子であることが好ましい。球状粒子であるハイドロキシアパタイトとしては、例えば、Biorad社のCHT TYPE1およびCHT TYPE2を用いることができる。
【0021】
上記塩濃度勾配において、ウイルスを溶出させるために濃度を勾配させて用いられる塩は、リン酸緩衝剤であることが好ましい。つまり、ウイルスを溶出するための溶出液として、リン酸系緩衝液を用いることが好ましい。このリン酸系緩衝液としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸リチウムおよびリン酸アンモニウム等のリン酸塩を含む水溶液が挙げられる。また、緩衝液は、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、硫酸ナトリウム等の硫酸塩であってもよい。
【0022】
上記塩濃度勾配は、溶出のために用いられる溶液中の塩濃度を第１の濃度から第２の濃度に亘って増大させるものであることが好ましい。
【0023】
上記第１の濃度は、１ｍＭないし５０ｍＭであることが好ましい。
【0024】
上記第２の濃度は、８０ｍＭないし２７０ｍＭであることが好ましい。
【0025】
リン酸系緩衝液を用いる場合、このリン酸系緩衝液には、さらに、リン酸塩とは異なる他の塩が含まれていてもよい。上記他の塩は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩であってもよい。上記他の塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ４Ｃｌ、ＭｇＣｌ２であってもよい。上記他の塩はＮａＣｌであることが好ましい。
【0026】
上記他の塩の濃度は、０．１Ｍ以上４．０Ｍ以下であってもよい。上記他の塩の濃度は、０．２Ｍ以上２．５Ｍ以下であるのが好ましい。上記他の塩の濃度は、０．５Ｍ以上２．０Ｍ以下であるのがより好ましく、０．７５Ｍ以上１．７５Ｍ以下であるのがより好ましく、１．０Ｍ以上１．５Ｍ以下であるのが最も好ましい。かかる濃度で他の塩を含有するリン酸系緩衝液を用いることにより、ウイルスをより高純度に分離することができる。
【0027】
上記塩濃度勾配において用いられる溶出液のｐＨは、ハイドロキシアパタイトを溶解させない観点で、７．０ないし９．０であることが好ましい。より好ましくは７．０５ないし８．０であり、さらに好ましくは７．１ないし７．５である。
【0028】
本発明の精製方法によって除去されるdsDNA（２本鎖ＤＮＡ）の除去率は、これらのステップを行う前のサンプルに含まれるdsDNAの全質量を１００質量％としたとき、９７％以上であることが好ましい。この除去率は、９８％以上であることがより好ましく、９９％以上であることがさらに好ましく、９９．９％以上であることが最も好ましい。
【0029】
上記ステップ１およびステップ２における溶出工程におけるバッファーの流速は、分離操作に要する時間を短くし、目的物をより確実に分離する観点から、０．１ｍＬ／分以上１０ｍＬ／分以下程度であるのが好ましく、０．２ｍＬ／分以上５ｍＬ／分以下であるのがより好ましい。
【0030】
上記ｐＨ勾配溶出と上記塩濃度勾配溶出は、どちらを先に実施してもよい。これらの両方を行うことによって、タンパク質の不純物とＤＮＡ不純物の両方を除去することができる。ｐＨ勾配溶出を行い、その後に上記塩濃度勾配溶出を行うことが好ましい。塩濃度勾配において用いられる塩化ナトリウム等の上記他の塩の存在下では、サンプル中の不純物ＤＮＡが吸着剤により多く吸着してしまうため、ｐＨ溶出を経て不純物ＤＮＡの濃度が低められたサンプルを塩濃度勾配に供することにより、塩濃度勾配において吸着剤に吸着してウイルスと分離することが難しくなる不純物ＤＮＡの量を少なくし、結果として得られるウイルスの純度を高めることができるためである。また、先に行った溶出で得た溶出液を希釈して次の溶出に供してもよい。
【0031】
本発明の精製方法は、正又は負に帯電した部分を有する化合物に好ましく使用される。本発明の精製方法は、正又は負に帯電したタンパク質を対象とすることが好ましい。ポリオウイルス、カリシウイルス、インフルエンザウイルス等のRNAウイルス又はアデノウイルス等のDNAウイルスを対象とすることがより好ましく、ポリオウイルス等の酸性条件下でも実質的に失活しないウイルスを対象とすることがさらに好ましい。
【0032】
本明細書において、「実質的に失活しない」とは、あるウイルスを含む試料の感染価が、酸性条件下等の条件におかれても実質的に低下しないことを意味する。一実施形態において、この「実質的に失活」していない感染価は、元の試料が有する感染価の７０％以上あることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。
【0033】
本明細書において、組成物Ａが化合物Ｂを「主成分とする」とは、組成物Ａの全質量を１００質量％としたとき、化合物Ｂの質量が５０％以上であることを意味する。一実施形態において、この割合は、７０％以上あることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。
【0034】
実施例
ここで、我々は、ポリオウイルスのセービン２型株を精製するための、セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）とＣＨＡｐを用いた連続した液体クロマトグラフィー手順の設計および試験バリデーションについて報告する。
ここで、我々は、ポリオウイルスのセービン２型株を精製するための、セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）とＣＨＡｐを用いた連続した液体クロマトグラフィー手順の設計および試験バリデーションについて報告する。
【0035】
材料と方法
セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清の調製
Vero細胞（the American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア、アメリカ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）およびＬ－グルタミン（２ｍＭ、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）を含むミニマム・エッセンシャル・メディウム（ＭＥＭ、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、アメリカ）で、２２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社、東京、日本）において、５％ＣＯ２、３７℃で３日間培養した。その後、この培地を２％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含むＭＥＭに変更し、その細胞をさらに１日間培養した。その培地をＦＢＳを含まないＭＥＭ（６３ｍＬ）に変更した後、セービン２型ウイルスをMOI０．０１で細胞単層上に接種し、３７℃で２日間培養した。その後、細胞培養上清を回収し、細胞デブリを除去するために０．４５μｍフィルター（ポリエーテルスルフォン細胞膜、サーモフィッシャサイエンティフィック社）を通し、使用時まで-８０℃で安定化剤なしで保管した。このウイルスは、この条件下で高度に安定しており、４か月の保管期間に亘ってＴＣＩＤ５０値の変化を示さなかった（データ省略）。
セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清の調製
Vero細胞（the American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア、アメリカ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）およびＬ－グルタミン（２ｍＭ、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）を含むミニマム・エッセンシャル・メディウム（ＭＥＭ、サーモフィッシャ・サイエンティフィック社、ウォルサム、マサチューセッツ、アメリカ）で、２２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社、東京、日本）において、５％ＣＯ２、３７℃で３日間培養した。その後、この培地を２％ＦＢＳおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含むＭＥＭに変更し、その細胞をさらに１日間培養した。その培地をＦＢＳを含まないＭＥＭ（６３ｍＬ）に変更した後、セービン２型ウイルスをMOI０．０１で細胞単層上に接種し、３７℃で２日間培養した。その後、細胞培養上清を回収し、細胞デブリを除去するために０．４５μｍフィルター（ポリエーテルスルフォン細胞膜、サーモフィッシャサイエンティフィック社）を通し、使用時まで-８０℃で安定化剤なしで保管した。このウイルスは、この条件下で高度に安定しており、４か月の保管期間に亘ってＴＣＩＤ５０値の変化を示さなかった（データ省略）。
【0036】
ＣＨＡｐとＣＦＡｐのカラム
ＣＨＴ、セラミック・ハイドロキシアパタイト、タイプＩＩ（ＣＨＡｐ；粒径４０μｍ）およびＣＦＴ、セラミック・フルオロアパタイト・タイプＩＩ（ＣＦＡｐ；粒径４０μｍ）をバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（ヘルクレス、カリフォルニア、アメリカ）から購入した。これらは、厳密な仕様を有するセラミック・タイプの材料であり、その粒子を、自社で乾燥法を用いて、空のステンレス鋼カラム（４．６ｍｍｉ．ｄ×３５ｍｍ、杉山商事、神奈川、日本）に詰めた。
ＣＨＴ、セラミック・ハイドロキシアパタイト、タイプＩＩ（ＣＨＡｐ；粒径４０μｍ）およびＣＦＴ、セラミック・フルオロアパタイト・タイプＩＩ（ＣＦＡｐ；粒径４０μｍ）をバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（ヘルクレス、カリフォルニア、アメリカ）から購入した。これらは、厳密な仕様を有するセラミック・タイプの材料であり、その粒子を、自社で乾燥法を用いて、空のステンレス鋼カラム（４．６ｍｍｉ．ｄ×３５ｍｍ、杉山商事、神奈川、日本）に詰めた。
【0037】
クロマトグラフィー手順
クロマトグラフィーは、１０ｍＬ又は２０ｍＬの試料ループを用いて、１．０ｍＬ／分の流速で、ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗ（商標）システム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）を使用して行った。このサンプルを、ＣＨＡｐ／ＣＦＡｐカラムにロードし、１０ｍＭから６００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ）の直線的濃度勾配を使用して溶出させた。２６０ｎｍ、２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収度および電気伝導度について、得られた溶出液を測定した。回収した画分を４℃に維持し、直ちに下記の評価のために使用した。使用前にバッファーをフィルター（０．２２μｍ）に通した。フラクションコレクターを生物学的安全キャビネットの中に設置し、チューブをオートクレーブ滅菌した。さらに、使用前にポンプ、カラム及びラインの内部を消毒用エタノール（甘糟化学産業株式会社、東京、日本）で滅菌し、オートクレーブ滅菌された超純水と、その後の６００ｍＭ ＮａＰＢで洗浄し、１０ｍＭ ＮａＰＢで平衡化した。試験後、このカラムとシステムを、１０カラム容積の０．５Ｍ ＮａＯＨで殺菌し、アルカリ性溶液を除去するためにオートクレーブ滅菌した超純水で洗浄した。
クロマトグラフィーは、１０ｍＬ又は２０ｍＬの試料ループを用いて、１．０ｍＬ／分の流速で、ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗ（商標）システム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）を使用して行った。このサンプルを、ＣＨＡｐ／ＣＦＡｐカラムにロードし、１０ｍＭから６００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ）の直線的濃度勾配を使用して溶出させた。２６０ｎｍ、２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収度および電気伝導度について、得られた溶出液を測定した。回収した画分を４℃に維持し、直ちに下記の評価のために使用した。使用前にバッファーをフィルター（０．２２μｍ）に通した。フラクションコレクターを生物学的安全キャビネットの中に設置し、チューブをオートクレーブ滅菌した。さらに、使用前にポンプ、カラム及びラインの内部を消毒用エタノール（甘糟化学産業株式会社、東京、日本）で滅菌し、オートクレーブ滅菌された超純水と、その後の６００ｍＭ ＮａＰＢで洗浄し、１０ｍＭ ＮａＰＢで平衡化した。試験後、このカラムとシステムを、１０カラム容積の０．５Ｍ ＮａＯＨで殺菌し、アルカリ性溶液を除去するためにオートクレーブ滅菌した超純水で洗浄した。
【0038】
ウイルス画分の感染価の測定
セービン２型ウイルスの力価は、９６ウェルマイクロプレートの中のVero細胞のコンフルエント単層を使用して５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）により得られた。コンフルエント単層を準備するために、Vero細胞（１００μＬ、１×１０５細胞／ｍＬ）を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭの中で３７℃で１日培養した。液体クロマトグラフィー分離によって得られた画分を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭでそれぞれ１０倍に階段希釈した。得られた希釈液（５０μＬ）を、各ウェル（ｎ＝３）の中に接種し、１週間培養した。その後、細胞変性が生じたかどうか判定するために、そのマイクロプレートの各ウェルを、光学顕微鏡ＣＫＸ３１（オリンパス株式会社、東京、日本）で観察した。力価はＲｅｅｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を使用して計算した。
セービン２型ウイルスの力価は、９６ウェルマイクロプレートの中のVero細胞のコンフルエント単層を使用して５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）により得られた。コンフルエント単層を準備するために、Vero細胞（１００μＬ、１×１０５細胞／ｍＬ）を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭの中で３７℃で１日培養した。液体クロマトグラフィー分離によって得られた画分を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭでそれぞれ１０倍に階段希釈した。得られた希釈液（５０μＬ）を、各ウェル（ｎ＝３）の中に接種し、１週間培養した。その後、細胞変性が生じたかどうか判定するために、そのマイクロプレートの各ウェルを、光学顕微鏡ＣＫＸ３１（オリンパス株式会社、東京、日本）で観察した。力価はＲｅｅｄ Ｍｕｅｎｃｈ方法を使用して計算した。
【0039】
その他の評価
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）及びＭｉｃｒｏ ＢＣＡ; Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）を使用して、キット付属の手順書に従い二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）およびタンパクの濃度を測定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）のために、液体クロマトグラフィー画分を、限外ろ過（Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－１０、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビルリカ、マサチューセッツ、アメリカ）で濃縮し、１５％ポリアクリルアミドゲル（ｃ－ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社、東京、日本）にアプライした。各タンパクバンドは銀染色法によって視覚化した。分子量は、Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺ Ｉｍａｇｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）によって算出した。
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）及びＭｉｃｒｏ ＢＣＡ; Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（サーモフィッシャ・サイエンティフィック社）を使用して、キット付属の手順書に従い二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）およびタンパクの濃度を測定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）のために、液体クロマトグラフィー画分を、限外ろ過（Ｕｌｔｒａｃｅｌ ＹＭ－１０、 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビルリカ、マサチューセッツ、アメリカ）で濃縮し、１５％ポリアクリルアミドゲル（ｃ－ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社、東京、日本）にアプライした。各タンパクバンドは銀染色法によって視覚化した。分子量は、Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺ Ｉｍａｇｅｒ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社）によって算出した。
【0040】
結果
セービン２型ウイルスの精製のための２ステップ手順
最初に、我々は、弱毒化セービン２型ウイルスを精製するために、ワンステップのＣＨＡｐクロマトグラフィー法を使用した。しかし、この方法を使用してウイルス画分からタンパクおよびＤＮＡ不純物の双方を分離することはできなかった。そのため、我々は、ＣＨＡｐクロマトグラフィーを実行する前の第１のステップとして、ＣＦＡｐクロマトグラフィーによる分離を導入することを試みた。この２段階クロマトグラフィー手順の概要を図１に示す。ステップ１において、ｐＨ勾配溶出を使用したＣＦＡｐクロマトグラフィーによって、感染細胞の様々なタンパク混合物を含む細胞培養上清から、ウイルス粒子を直接分離した。ステップ２において、高濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＮａＰＢ濃度勾配溶出法を使用したＣＨＡｐクロマトグラフィーによって、得られたウイルス画分を分離して、その画分から混入ｄｓＤＮＡを除去した。我々は、ウイルスを分離するために、以下に述べられるように各ステップを最適化した。
セービン２型ウイルスの精製のための２ステップ手順
最初に、我々は、弱毒化セービン２型ウイルスを精製するために、ワンステップのＣＨＡｐクロマトグラフィー法を使用した。しかし、この方法を使用してウイルス画分からタンパクおよびＤＮＡ不純物の双方を分離することはできなかった。そのため、我々は、ＣＨＡｐクロマトグラフィーを実行する前の第１のステップとして、ＣＦＡｐクロマトグラフィーによる分離を導入することを試みた。この２段階クロマトグラフィー手順の概要を図１に示す。ステップ１において、ｐＨ勾配溶出を使用したＣＦＡｐクロマトグラフィーによって、感染細胞の様々なタンパク混合物を含む細胞培養上清から、ウイルス粒子を直接分離した。ステップ２において、高濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＮａＰＢ濃度勾配溶出法を使用したＣＨＡｐクロマトグラフィーによって、得られたウイルス画分を分離して、その画分から混入ｄｓＤＮＡを除去した。我々は、ウイルスを分離するために、以下に述べられるように各ステップを最適化した。
【0041】
【0042】
ステップ１：ＣＦＡｐカラムからのセービン２型ウイルスのｐＨ勾配溶出
我々は、異なるｐＨ値で、ＮａＰＢの同様の濃度勾配を用いた溶出により、ＣＨＡｐカラムで、３種のウイルス［ポリオウイルスセービン２型；デングウイルス タイプ１(Hawaii) (ウイルス学分野, 熱帯医学研究所、長崎大学、日本）；及び、インフルエンザウイルス ＮＹＭＣ Ｘ－１８１（National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, 英国）］を分離した（図６Ａないし図８Ｃ）。我々は、ウイルスの物理化学的性質に拘わらず、バッファーのｐＨが低下するにつれて、これらのウイルスの保持容量が増加することを発見した。しかし、ｐＨ６．４において、セービン２型ウイルス画分は、タンパク不純物を含んでいた（図６Ａ～図６Ｃ）が、デングウイルス画分は、タンパク画分から分離されたと考えられた（図７Ａ～図７Ｃ）。そのため、我々は、ＣＦＡｐクロマトグラフィーを適用することを試みた。ＣＦＡｐクロマトグラフィーは、ＣＨＡｐと同様の分離を示すが、ＣＨＡｐ（適用可能なｐＨ領域は６．５ないし１４）と比較して、酸性に高い耐性（適用可能なｐＨ領域は５～１４）がありバッファーのｐＨを下げることが出来る。我々は、ｐＨ勾配の使用によって、低いｐＨとウイルスとの間の接触時間を減少させ、３００ｍＭ ＮａＰＢ ｐＨ５．０から８．２までの直線的なｐＨ勾配を使用したＣＦＡｐカラムにより、細胞培養上清からセービン２型ウイルスを分離した（図２Ａ）。ウイルスの平均保持容量は、９．６±０．４４ｍＬ（１１回の独立した測定値、平均±標準偏差）であるとわかった。このことは分離の高い再現性を示している。得られた画分（図２Ａの「Ｆｒ．Ａ」）は、ＴＣＩＤ５０において９４．１％±４２．２％の平均回収率（１１回の独立した測定値）と、９１．８７％の平均タンパク質除去率（２回の独立した測定値）を示した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥを使用した画分の分析では、約３７、３２および３０ｋＤａの３本のバンド（図２Ｂ）が示された。これは、セービン２型ウイルスのカプシドタンパクＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の以前に報告されている分離パターンに適合していた。このことは、ウイルスがタンパク夾雑物から分離されたことを示している。しかし、この画分は、除去する必要がある宿主細胞に由来するｄｓＤＮＡを依然として含んでいた（平均除去率８８．１５％、２回の独立した測定値）。
我々は、異なるｐＨ値で、ＮａＰＢの同様の濃度勾配を用いた溶出により、ＣＨＡｐカラムで、３種のウイルス［ポリオウイルスセービン２型；デングウイルス タイプ１(Hawaii) (ウイルス学分野, 熱帯医学研究所、長崎大学、日本）；及び、インフルエンザウイルス ＮＹＭＣ Ｘ－１８１（National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, 英国）］を分離した（図６Ａないし図８Ｃ）。我々は、ウイルスの物理化学的性質に拘わらず、バッファーのｐＨが低下するにつれて、これらのウイルスの保持容量が増加することを発見した。しかし、ｐＨ６．４において、セービン２型ウイルス画分は、タンパク不純物を含んでいた（図６Ａ～図６Ｃ）が、デングウイルス画分は、タンパク画分から分離されたと考えられた（図７Ａ～図７Ｃ）。そのため、我々は、ＣＦＡｐクロマトグラフィーを適用することを試みた。ＣＦＡｐクロマトグラフィーは、ＣＨＡｐと同様の分離を示すが、ＣＨＡｐ（適用可能なｐＨ領域は６．５ないし１４）と比較して、酸性に高い耐性（適用可能なｐＨ領域は５～１４）がありバッファーのｐＨを下げることが出来る。我々は、ｐＨ勾配の使用によって、低いｐＨとウイルスとの間の接触時間を減少させ、３００ｍＭ ＮａＰＢ ｐＨ５．０から８．２までの直線的なｐＨ勾配を使用したＣＦＡｐカラムにより、細胞培養上清からセービン２型ウイルスを分離した（図２Ａ）。ウイルスの平均保持容量は、９．６±０．４４ｍＬ（１１回の独立した測定値、平均±標準偏差）であるとわかった。このことは分離の高い再現性を示している。得られた画分（図２Ａの「Ｆｒ．Ａ」）は、ＴＣＩＤ５０において９４．１％±４２．２％の平均回収率（１１回の独立した測定値）と、９１．８７％の平均タンパク質除去率（２回の独立した測定値）を示した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥを使用した画分の分析では、約３７、３２および３０ｋＤａの３本のバンド（図２Ｂ）が示された。これは、セービン２型ウイルスのカプシドタンパクＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の以前に報告されている分離パターンに適合していた。このことは、ウイルスがタンパク夾雑物から分離されたことを示している。しかし、この画分は、除去する必要がある宿主細胞に由来するｄｓＤＮＡを依然として含んでいた（平均除去率８８．１５％、２回の独立した測定値）。
【0043】
図２における試験の内容を下記に説明する。
図２ セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）カラムにおけるｐＨ勾配溶出によるセービン２型ウイルスの精製
（Ａ）以下の条件下で得られたクロマトグラム：
カラム、ＣＦＡｐ；
サンプル（量）、セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
カラム洗浄、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ＮａＰＢ；ｐＨ６．４、１０ｍＬ）および３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ６．４、２０ｍＬ）；
平衡化（３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ５、１５ ｍＬ））；
溶出、１０ｍＬに対してｐＨ５からｐＨ８．２までの３００ｍＭ ＮａＰＢの直線的pH勾配）；
分離後の洗浄、３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、５ｍＬ）および６００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、１０ｍＬ）；
青線、２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収度；
黒破線、電気伝導度；
赤線（５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）における感染力）；
紫線、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の量。
「Ｆｒ．Ａ」を評価のためにプールした。
（Ｂ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）分析
分子量分画１００００の限外濾過によって、細胞培養上清及びプールされたFr. Aをそれぞれ１０倍、３０倍に濃縮した。マーカータンパクの分子量はｋＤａで与えられる。
図２ セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）カラムにおけるｐＨ勾配溶出によるセービン２型ウイルスの精製
（Ａ）以下の条件下で得られたクロマトグラム：
カラム、ＣＦＡｐ；
サンプル（量）、セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
カラム洗浄、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ＮａＰＢ；ｐＨ６．４、１０ｍＬ）および３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ６．４、２０ｍＬ）；
平衡化（３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ５、１５ ｍＬ））；
溶出、１０ｍＬに対してｐＨ５からｐＨ８．２までの３００ｍＭ ＮａＰＢの直線的pH勾配）；
分離後の洗浄、３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、５ｍＬ）および６００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、１０ｍＬ）；
青線、２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収度；
黒破線、電気伝導度；
赤線（５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）における感染力）；
紫線、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の量。
「Ｆｒ．Ａ」を評価のためにプールした。
（Ｂ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）分析
分子量分画１００００の限外濾過によって、細胞培養上清及びプールされたFr. Aをそれぞれ１０倍、３０倍に濃縮した。マーカータンパクの分子量はｋＤａで与えられる。
【0044】
ステップ２：２本鎖ＤＮＡからのＣＨＡｐによるセービン２型ウイルスの分離
移動相へのＮａＣｌ添加の影響
ハイドロキシアパタイトのリン酸サイト表面の過剰なナトリウムイオンがリン酸サイトとＤＮＡとの間のクーロン反発力を減少させて、その結果として、ＤＮＡに対するカルシウムサイトの相対的親和性を高めるという知識に基づいて、次に、我々は、ステップ２の移動相中の高濃度のＮａＣｌによってウイルス画分から２本鎖ＤＮＡを除去することが可能になるかどうかを調べた。これを評価するために、我々は、０ないし１．５Ｍ ＮａＣｌ存在下で、２種のウイルス（インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１及びネコカリシウイルス）を分離した。我々は、バッファー中のＮａＣｌ濃度が増加するにつれて２本鎖ＤＮＡの保持容量が増加し、ウイルス粒子の保持容量が減少したことを発見した（図９）。したがって、移動相中の高濃度のＮａＣｌは、ウイルス画分から２本鎖ＤＮＡを除去するのに有効であることがわかった。我々は、細胞培養上清中の２本鎖ＤＮＡからセービン２型ウイルスを分離するために、移動相の中で１Ｍおよび１．５ＭのＮａＣｌを使用した（図３）。両方の分離において、ウイルス粒子と比較して２本鎖ＤＮＡの保持量が増加し、１Ｍ ＮａＣｌの添加がウイルスピークから２本鎖ＤＮＡを除去するのに充分であったことを示していた（除去率９７．３２％）。更に、この分離の再現性は高く、濃度勾配溶出開始後のウイルス保持容量は、５．０±０．５ｍＬであった（３回の独立した測定値）。
移動相へのＮａＣｌ添加の影響
ハイドロキシアパタイトのリン酸サイト表面の過剰なナトリウムイオンがリン酸サイトとＤＮＡとの間のクーロン反発力を減少させて、その結果として、ＤＮＡに対するカルシウムサイトの相対的親和性を高めるという知識に基づいて、次に、我々は、ステップ２の移動相中の高濃度のＮａＣｌによってウイルス画分から２本鎖ＤＮＡを除去することが可能になるかどうかを調べた。これを評価するために、我々は、０ないし１．５Ｍ ＮａＣｌ存在下で、２種のウイルス（インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１及びネコカリシウイルス）を分離した。我々は、バッファー中のＮａＣｌ濃度が増加するにつれて２本鎖ＤＮＡの保持容量が増加し、ウイルス粒子の保持容量が減少したことを発見した（図９）。したがって、移動相中の高濃度のＮａＣｌは、ウイルス画分から２本鎖ＤＮＡを除去するのに有効であることがわかった。我々は、細胞培養上清中の２本鎖ＤＮＡからセービン２型ウイルスを分離するために、移動相の中で１Ｍおよび１．５ＭのＮａＣｌを使用した（図３）。両方の分離において、ウイルス粒子と比較して２本鎖ＤＮＡの保持量が増加し、１Ｍ ＮａＣｌの添加がウイルスピークから２本鎖ＤＮＡを除去するのに充分であったことを示していた（除去率９７．３２％）。更に、この分離の再現性は高く、濃度勾配溶出開始後のウイルス保持容量は、５．０±０．５ｍＬであった（３回の独立した測定値）。
【0045】
図３における試験の内容を下記に説明する。
図３ ＮａＣｌの存在下におけるセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、以下に記載の条件下で、（Ａ）１Ｍ ＮａＣｌ、（Ｂ）１．５Ｍ ＮａＣｌが存在する状態で行った。条件：
カラム、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）；
サンプル（量）、セービン２型ウイルス（５ｍＬ）を含む細胞培養上清；
バッファーｐＨ、７．２；
カラム洗浄、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ；９ｍＬ）；
平衡化、ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＮａＰＢ（１４ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対してＮａＣｌを含む１０ｍＭから６００ｍＭのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
分離後の洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（１０ｍＬ）。
線は図２と同様である。
ＴＣＩＤ５０、５０％組織培養感染量
図３ ＮａＣｌの存在下におけるセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、以下に記載の条件下で、（Ａ）１Ｍ ＮａＣｌ、（Ｂ）１．５Ｍ ＮａＣｌが存在する状態で行った。条件：
カラム、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）；
サンプル（量）、セービン２型ウイルス（５ｍＬ）を含む細胞培養上清；
バッファーｐＨ、７．２；
カラム洗浄、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ；９ｍＬ）；
平衡化、ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＮａＰＢ（１４ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対してＮａＣｌを含む１０ｍＭから６００ｍＭのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
分離後の洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（１０ｍＬ）。
線は図２と同様である。
ＴＣＩＤ５０、５０％組織培養感染量
【0046】
セービン２型ウイルスの連続した２段階クロマトグラフィー精製
我々は、細胞培養上清からセービン２型ウイルスを分離するために、２ステップの連続した手順（上述されているステップ１および２）を行った。代表的なケースを、図４に示す。
我々は、細胞培養上清からセービン２型ウイルスを分離するために、２ステップの連続した手順（上述されているステップ１および２）を行った。代表的なケースを、図４に示す。
【0047】
ＣＦＡｐカラムにおけるｐＨ勾配溶出によってウイルス粒子を分離した（図４Ａ）。前述で得られた平均保持容量に基づいて、得られたウイルス画分「Ｆｒ．Ｂ」をプールした。その後、０．９％ＮａＣｌでＦｒ．Ｂを６．７倍に希釈し、ＣＨＡｐカラムにロードし、１Ｍ ＮａＣｌを含むＮａＰＢ（ｐＨ ７．２）の直線的濃度勾配によって溶出させた（図４Ｂ）。ピークＴＣＩＤ５０は、３ないし７ ｍＬ（Ｆｒ．Ｃ）の保持容量で検出され、高度に精製されたカプシドタンパクを含んでいた（図４Ｂ及び図４Ｃ）。
【0048】
図４における試験の内容を下記に説明する。
図４ セービン２型ウイルスの連続した―２段階精製
（Ａ）セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）カラムにおけるｐＨ勾配溶出によるセービン２型ウイルスの精製（ステップ１）。
カラム、ＣＦＡｐ；
サンプル（量）、セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清（１０ｍＬ）；
洗浄、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ）（ｐＨ６．４、９ｍＬ）及び３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ６．４、２０ｍＬ）；
平衡化、３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ５、１５ｍＬ）；
溶出、１０ｍＬに対して３００ｍＭ ＮａＰＢのｐＨ５からｐＨ８．２までの直線的pH勾配；
洗浄後の分離、３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、５ｍＬ）及び６００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、１０ ｍＬ）。
線は図２と同様である。Ｆｒ．Ｂをプールし、ステップ２でさらに精製した。
（Ｂ）セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにおける１Ｍ ＮａＣｌを含むＮａＰＢ溶出による、Ｆｒ．Ｂからの２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の除去（ステップ２）
カラム、ＣＨＡｐ；
サンプル（量）、（Ａ）において得られたＦｒ．Ｂを、０．９％ＮａＣｌで６．７倍に希釈したもの（１７ｍＬ）；
バッファー、ｐＨ７．２；
カラム洗浄、１０ｍＭ ＮａＰＢ（１３ｍＬ）；
平衡化、１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＮａＰＢ（１４ｍＬ）；
溶出、１０ｍＬに対して、１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭから１８７ｍＭまでのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
洗浄、６００ ｍＭ ＮａＰＢ（１０ｍＬ）。
さらなる評価のために、Ｆｒ．Ｃをプールした。
（Ｃ）２ステップ精製により得られたプール画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）分析
上記（Ｂ）でプールしたFr.Ｃ及び細胞培養上清を、分子量分画１００００の限外濾過により、それぞれ１００倍、１０倍に濃縮した。サイズは左側のｋＤａで与えられる。矢印は、画分Ｃの中の主なタンパクを示している。ＴＣＩＤ５０５０％組織培養感染量
図４ セービン２型ウイルスの連続した―２段階精製
（Ａ）セラミックフルオロアパタイト（ＣＦＡｐ）カラムにおけるｐＨ勾配溶出によるセービン２型ウイルスの精製（ステップ１）。
カラム、ＣＦＡｐ；
サンプル（量）、セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清（１０ｍＬ）；
洗浄、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ）（ｐＨ６．４、９ｍＬ）及び３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ６．４、２０ｍＬ）；
平衡化、３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ５、１５ｍＬ）；
溶出、１０ｍＬに対して３００ｍＭ ＮａＰＢのｐＨ５からｐＨ８．２までの直線的pH勾配；
洗浄後の分離、３００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、５ｍＬ）及び６００ｍＭ ＮａＰＢ（ｐＨ８．２、１０ ｍＬ）。
線は図２と同様である。Ｆｒ．Ｂをプールし、ステップ２でさらに精製した。
（Ｂ）セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにおける１Ｍ ＮａＣｌを含むＮａＰＢ溶出による、Ｆｒ．Ｂからの２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の除去（ステップ２）
カラム、ＣＨＡｐ；
サンプル（量）、（Ａ）において得られたＦｒ．Ｂを、０．９％ＮａＣｌで６．７倍に希釈したもの（１７ｍＬ）；
バッファー、ｐＨ７．２；
カラム洗浄、１０ｍＭ ＮａＰＢ（１３ｍＬ）；
平衡化、１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＮａＰＢ（１４ｍＬ）；
溶出、１０ｍＬに対して、１Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭから１８７ｍＭまでのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
洗浄、６００ ｍＭ ＮａＰＢ（１０ｍＬ）。
さらなる評価のために、Ｆｒ．Ｃをプールした。
（Ｃ）２ステップ精製により得られたプール画分のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）分析
上記（Ｂ）でプールしたFr.Ｃ及び細胞培養上清を、分子量分画１００００の限外濾過により、それぞれ１００倍、１０倍に濃縮した。サイズは左側のｋＤａで与えられる。矢印は、画分Ｃの中の主なタンパクを示している。ＴＣＩＤ５０５０％組織培養感染量
【0049】
ディスカッション
臨床試験、前臨床試験、又は、商業的製剤において使用されるワクチンを製造する場合、その目標は、精製時に、不純物を最小化し、ワクチンの回収率を最大化することである。不純物は、典型的には、宿主細胞に由来するＤＮＡとタンパク、細胞培養培地の成分、及び／又は、精製工程で放出されるいくつかのリガンドである。この研究において、我々は、濃縮やバッファー交換をせずに、細胞培養上清から直接、セービン２型ウイルスの精製に成功した。ＴＣＩＤ５０における５８．７％±３０．０％の平均回収率を達成し、タンパク、２本鎖ＤＮＡの平均除去率は、それぞれ、９９．９５±０．００６％、９９．９９％±０．００３％を達成した（３回の独立した試験）。
臨床試験、前臨床試験、又は、商業的製剤において使用されるワクチンを製造する場合、その目標は、精製時に、不純物を最小化し、ワクチンの回収率を最大化することである。不純物は、典型的には、宿主細胞に由来するＤＮＡとタンパク、細胞培養培地の成分、及び／又は、精製工程で放出されるいくつかのリガンドである。この研究において、我々は、濃縮やバッファー交換をせずに、細胞培養上清から直接、セービン２型ウイルスの精製に成功した。ＴＣＩＤ５０における５８．７％±３０．０％の平均回収率を達成し、タンパク、２本鎖ＤＮＡの平均除去率は、それぞれ、９９．９５±０．００６％、９９．９９％±０．００３％を達成した（３回の独立した試験）。
【0050】
ステップ１において、細胞培養上清を、ＣＦＡｐカラムに直接ロードし、ｐＨ勾配で溶出させた。ステップ２において、得られたウイルス画分を０．９％ＮａＣｌで希釈し、ＣＨＡｐカラムにロードし、高濃度のＮａＣｌの存在下でＮａＰＢ勾配により溶出させた。
ステップ１および２のいずれもが再現性が高いので、検出工程の必要もなくウイルス画分を得ることができた。この保持容量に依存した分離は、ワクチンを作るのに必要な時間およびコストを低減するはずである。更に、この手順は、現在のところ多段階精製工程およびオフライン精製工程を含んでいるが、今後すべての精製ステップを自動化することは可能となるだろう。さらに、この２ステップのクロマトグラフィーの精製は、スケールアップ可能なプロセスを使用して構築されているので、他の現行の方法よりもスケールアップがより簡単である（図５）。
ステップ１および２のいずれもが再現性が高いので、検出工程の必要もなくウイルス画分を得ることができた。この保持容量に依存した分離は、ワクチンを作るのに必要な時間およびコストを低減するはずである。更に、この手順は、現在のところ多段階精製工程およびオフライン精製工程を含んでいるが、今後すべての精製ステップを自動化することは可能となるだろう。さらに、この２ステップのクロマトグラフィーの精製は、スケールアップ可能なプロセスを使用して構築されているので、他の現行の方法よりもスケールアップがより簡単である（図５）。
【0051】
図５の略語は下記を示す。
図５ タンデムカラムシステム
ＣＦＡｐ、セラミックフルオロアパタイト；
ＣＨＡｐ、セラミックハイドロキシアパタイト；
ＮａＰＢ、リン酸ナトリウムバッファー；
ＰＶ、ポリオウイルス。
図５ タンデムカラムシステム
ＣＦＡｐ、セラミックフルオロアパタイト；
ＣＨＡｐ、セラミックハイドロキシアパタイト；
ＮａＰＢ、リン酸ナトリウムバッファー；
ＰＶ、ポリオウイルス。
【0052】
２ステップのクロマトグラフィー精製は、ソーク、セービン１型および３型のような他のポリオウイルスのみならず、Ａ型肝炎ウイルス、ノロウイルス及びネコカリシウイルスを含む、他の非エンベロープウイルスを精製するのにも役立つであろう。しかし、ステップ１がいくつかのウイルスを破壊する低ｐＨを使用するので、このプロセスは、いくつかの方法論の限定をしている。従って、このプロセスは、酸性ｐＨ値において不安定なフラビウイルスの精製には適用可能ではないかもしれない。ワクチン生産におけるそれらの役割に加えて、感染性ウイルス精製技術は、遺伝子治療の分野においても重要な役割を果たす。特に、アデノウイルスが遺伝子形質導入に最もふさわしいプラットフォームの１つと考えられるので、アデノウイルスの大規模精製には緊急の臨床的必要性がある。また、他のいくつかの遺伝子治療は、臨床的に適切な遺伝子を発現するウイルスベクターで良好な結果が出ている。例えば、腫瘍溶解性アデノウイルスは、抗腫瘍薬剤として最近注目を集めており、そのウイルスを使用した多数の研究が、世界中で行われている臨床試験データベースであるＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．Ｇｏｖ（https://clinicaltrials.gov/）に登録されている。この新しい精製方法は、酸性の精製条件に耐性があるアデノウイルスに適しているに違いない。
【0053】
サポート情報
図６Ａ～図６Ｃ
異なるｐＨ値でのセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムで分離したセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、（Ａ）pH６．４、（Ｂ）pH７．２、及び、（Ｃ）pH８．２のバッファーｐＨで行った。
カラム、ＣＨＡｐ（４０μｍ）；
サンプル（量）、セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
カラム洗浄および平衡化、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ；１１ｍＬ）；
溶出、２０ｍＬに対して１０ｍＭから３００ｍＭまでのＮａＰＢ直線的濃度勾配；
分離後の洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（８ｍＬ）。
青線、２８０ｎｍ紫外線（ＵＶ）吸収度；
黒破線、電気伝導度；
赤線、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）における感染価；
紫線、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）量。
図６Ａ～図６Ｃ
異なるｐＨ値でのセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムで分離したセービン２型ウイルスを含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、（Ａ）pH６．４、（Ｂ）pH７．２、及び、（Ｃ）pH８．２のバッファーｐＨで行った。
カラム、ＣＨＡｐ（４０μｍ）；
サンプル（量）、セービン２型ウイルスを含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
カラム洗浄および平衡化、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ；１１ｍＬ）；
溶出、２０ｍＬに対して１０ｍＭから３００ｍＭまでのＮａＰＢ直線的濃度勾配；
分離後の洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（８ｍＬ）。
青線、２８０ｎｍ紫外線（ＵＶ）吸収度；
黒破線、電気伝導度；
赤線、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）における感染価；
紫線、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）量。
【0054】
図７Ａ～図７Ｃ
異なるｐＨ値においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離されたデングウイルス１型を含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、（Ａ）pH６．４、（Ｂ）pH７．２および（Ｃ）pH８．２のバッファーｐＨで行った。
カラム、ＣＨＡｐ（４０μｍ）；
サンプル（量）、デングウイルス１型を含む細胞培養上清（１０ｍＬ）；
カラム洗浄および平衡化、１０ｍＭリン酸ナトリウム・バッファー（ＮａＰＢ；１０ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対して１０ｍＭから３００ｍＭまでのＮａＰＢ、及び、８ｍＬに対して３００ｍＭから６００ｍＭまでの直線的濃度勾配；
洗浄後の分離、６００ｍＭ ＮａＰＢ（５ｍＬ）。
線は、赤線を除いて図６Ａ～図６Ｃと同様である。赤線は、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイにおけるウイルス活性を示す。
異なるｐＨ値においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムにより分離されたデングウイルス１型を含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、（Ａ）pH６．４、（Ｂ）pH７．２および（Ｃ）pH８．２のバッファーｐＨで行った。
カラム、ＣＨＡｐ（４０μｍ）；
サンプル（量）、デングウイルス１型を含む細胞培養上清（１０ｍＬ）；
カラム洗浄および平衡化、１０ｍＭリン酸ナトリウム・バッファー（ＮａＰＢ；１０ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対して１０ｍＭから３００ｍＭまでのＮａＰＢ、及び、８ｍＬに対して３００ｍＭから６００ｍＭまでの直線的濃度勾配；
洗浄後の分離、６００ｍＭ ＮａＰＢ（５ｍＬ）。
線は、赤線を除いて図６Ａ～図６Ｃと同様である。赤線は、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイにおけるウイルス活性を示す。
【0055】
図８Ａ～図８Ｃ
異なるｐＨ値においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムによって分離したインフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、（Ａ）６．５、（Ｂ）６．８および（Ｃ）７．５のバッファーｐＨ値で行った。
カラム、ＣＨＡｐ（４０μｍ）；
サンプル（量）、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
カラム洗浄および平衡化、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ；１５ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対して１０ｍＭから６００ｍＭまでのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（５ｍＬ）。
線は、赤線を除いて図６Ａ～図６Ｃと同様である。赤線は、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイにおけるウイルス活性を示す。
異なるｐＨ値においてセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）カラムによって分離したインフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラム
分離は、（Ａ）６．５、（Ｂ）６．８および（Ｃ）７．５のバッファーｐＨ値で行った。
カラム、ＣＨＡｐ（４０μｍ）；
サンプル（量）、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
カラム洗浄および平衡化、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ；１５ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対して１０ｍＭから６００ｍＭまでのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（５ｍＬ）。
線は、赤線を除いて図６Ａ～図６Ｃと同様である。赤線は、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイにおけるウイルス活性を示す。
【0056】
図９Ａ～図９Ｄ
ＮａＣｌの存在下での、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラム
バッファーは、（Ａ）０Ｍ、（Ｂ）０．１４Ｍ、（Ｃ）０．５Ｍ、及び、（Ｄ）１ＭのＮａＣｌを含んでいた。
カラム、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）；
サンプル（量）、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
バッファーｐＨ、７．５；
カラム洗浄および平衡、ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ（１５ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対して、ＮａＣｌを含む５ｍＭから６００のｍＭまでのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
分離後の洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（５ｍＬ）。
線は、赤線を除いて図６Ａ～図６Ｃと同様である。赤線は、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイにおけるウイルス活性を示す。
ＮａＣｌの存在下での、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清のクロマトグラム
バッファーは、（Ａ）０Ｍ、（Ｂ）０．１４Ｍ、（Ｃ）０．５Ｍ、及び、（Ｄ）１ＭのＮａＣｌを含んでいた。
カラム、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＡｐ）；
サンプル（量）、インフルエンザウイルスＮＹＭＣ Ｘ－１８１を含む細胞培養上清（５ｍＬ）；
バッファーｐＨ、７．５；
カラム洗浄および平衡、ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰＢ（１５ｍＬ）；
溶出、３０ｍＬに対して、ＮａＣｌを含む５ｍＭから６００のｍＭまでのＮａＰＢの直線的濃度勾配；
分離後の洗浄、６００ｍＭ ＮａＰＢ（５ｍＬ）。
線は、赤線を除いて図６Ａ～図６Ｃと同様である。赤線は、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイにおけるウイルス活性を示す。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】