特許 7089000 シードトレイン法およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-13

(45)【発行日】2022-06-21

(54)【発明の名称】シードトレイン法およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20220614BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20220614BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20220614BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20220614BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12M3/00 Z

C12N5/071

C12P21/00 C

【請求項の数】 21

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020177043

(22)【出願日】2020-10-22

(62)【分割の表示】P 2016572251の分割

【原出願日】2015-06-08

(65)【公開番号】P2021019621

(43)【公開日】2021-02-18

【審査請求日】2020-10-29

(31)【優先権主張番号】62/009,553

(32)【優先日】2014-06-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・ブリュニングハウス

(72)【発明者】

【氏名】コンスタンティン・コンスタンティノフ

(72)【発明者】

【氏名】ベンジャミン・ライト

(72)【発明者】

【氏名】ウェイチャン・チョウ

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５３１９３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Biotechnol. Prog., 2013, Vol.29, No.1, p.222-229

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｍ ３／００

Ｃ１２Ｎ ５／０７１

Ｃ１２Ｐ ２１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

シードトレイン法であって、
（ａ）槽内に含まれている第１の培養培地に複数の哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程；
（ｂ）第１の細胞培養物を１．０×１０⁶細胞／ｍＬ～５．０×１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程；
（ｃ）潅流バイオリアクター内に含まれている第２の培養培地に、ある体積の工程（ｂ）の第１の細胞培養物を加えて、０．２５×１０⁶細胞／ｍＬ～０．５×１０⁶細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する第２の細胞培養物を得る工程；
（ｄ）第２の細胞培養物を５０×１０⁶細胞／ｍＬ～１２０×１０⁶細胞／ｍＬの間の細胞密度範囲まで潅流培養する工程；
（ｅ）生産用バイオリアクター内に含まれている第３の培養培地に、ある体積の工程（ｄ）の第２の細胞培養物を加えて、５×１０⁶細胞／ｍＬ～１０×１０⁶細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する生産細胞培養物を得る工程；
（ｆ）組換え哺乳動物細胞が組換えタンパク質を分泌することが可能となる条件下で、生産細胞培養物を潅流培養する工程；および
（ｇ）生産細胞培養物から組換えタンパク質を収穫する工程
を含む前記シードトレイン法。

【請求項2】

工程（ａ）における複数の哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程は：
凍結細胞バンクを解凍する工程；および
第１の培養培地に、ある体積の解凍細胞バンクを加える工程
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

凍結細胞バンクは、１０×１０⁷細胞／ｍＬ～５０×１０⁷細胞／ｍＬの細胞密度を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

解凍細胞バンクは、少なくとも６０％の生存細胞の割合を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

解凍細胞バンクは、少なくとも９０％の生存細胞の割合を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程（ａ）における複数の哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程は、第１の培養培地に複数の哺乳動物細胞を含むある体積の第３の細胞培養物を加える工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

（１）槽内に含まれている第４の培養培地に複数の哺乳動物細胞を加えて、第３の細胞培養物を得る工程；
（２）工程（１）の第３の細胞培養物を１．０×１０⁶細胞／ｍＬ～５．０×１０⁶細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程
をさらに含み、
ある体積の工程（２）における第３の細胞培養物が工程（ａ）において第１の培養培地に加えられる、
請求項６に記載の方法。

【請求項8】

工程（１）における複数の哺乳動物細胞を加える工程は：
凍結細胞バンクを解凍する工程；および
第４の培養培地に、ある体積の解凍細胞バンクを加える工程
を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

工程（ａ）における一方または両方の槽もしくは工程（１）における槽は、使い捨て単回使用向けバイオリアクターである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

使い捨て単回使用向けバイオリアクターは、プラスティック製滅菌バッグを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

工程（ａ）における第１の細胞培養物は、１．０Ｌ～５０Ｌの体積範囲を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

工程（ｃ）における第２の細胞培養物は、５Ｌ～６００Ｌの体積範囲を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項13】

工程（ｅ）における生産細胞培養物は、５０Ｌ～２０，０００Ｌの体積範囲を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

工程（ａ）における槽は、１．５Ｌ～１００Ｌの内部容積範囲を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

工程（ｃ）における潅流バイオリアクターは、７．５Ｌ～１，０００Ｌの内部容積範囲を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

工程（ｅ）における生産用バイオリアクターは、１５０Ｌ～２５，０００Ｌの内部容積範囲を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｃ）における潅流培養は、交互タンジェンシャルフローろ過装置を装備した潅流バイオリアクターを使用して行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

工程（ｅ）における初期細胞密度は、定常状態の生産細胞密度の少なくとも１０％である、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

工程（ｅ）における初期細胞密度は、定常状態の生産細胞密度の少なくとも２０％である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

工程（ｆ）における生産細胞培養物の潅流培養により、生産細胞培養物は、１日間～１０日間の間の期間で定常状態の生産細胞密度に到達する、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

工程（ｆ）における生産細胞培養物の潅流培養により、生産細胞培養物は、２日間～５日間で定常状態の生産細胞密度に到達する、請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる、２０１４年６月９日出願の米国仮特許出願第６２／００９，５５３号への優先権を主張する。

【0002】

本発明は、組換えタンパク質の生物工学および生物生産の方法に関する。

【背景技術】

【0003】

組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞は、治療的にまたは商業的に重要なタンパク質を生産するために使用されることが多い。多様性のある製品パイプラインという現在の環境では、バイオテクノロジー企業は、高度に柔軟性があり、コスト効率の高い治療剤の製造に対する革新的な解決策の開発を強いられている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

組換えタンパク質をコードする核酸を含む哺乳動物細胞は、大型の生産用バイオリアクター中で培養されて、対象とする治療用タンパク質が生産されることが多い。シードトレイン法は、大型生産用バイオリアクターに接種するのに十分な数のこうした哺乳動物細胞を産生するために使用される。慣用的なシードトレイン法は、凍結保存されている細胞バンクのバイアルの解凍から開始し、次いで、漸次、大型の培養槽中で複数の培養工程（例えば、５回以上）を行う。慣用的なシードトレイン法は、各工程中に複数の手作業による操作を必要とすることを含め、いくつかの欠点を有しており、これにより、方法全体が汚染物資の混入および操作エラーの影響が起こりやすくなっている。さらに、慣用的なシードトレイン法は、培養工程の数のため、およびＮ－１工程（生産用バイオリアクターの接種の直前の細胞培養）において到達される細胞密度が低いため、時間がかかる。この細胞密度では、大規模生産用バイオリアクター中、０．５×１０^６細胞／ｍＬ未満の細胞密度からしか開始することができず、定常状態の生産細胞密度に到達するために、５～１０日間の成長期を必要とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、例えば、それほど複雑ではないこと、培養工程数の削減、細胞培養の開始（例えば、解凍細胞バンク）から生産用バイオリアクターの接種までの時間量の削減、手作業量の低減、汚染物質混入のリスク低下、生産用バイオリアクターにおいて生存細胞密度がより高い細胞から開始すること、および生産用バイオリアクターにおける成長期の短縮（例えば、定常状態の生産細胞密度に到達するのに必要な期間が短い）を含めた、いくつかの利点をもたらすシードトレイン法の開発に少なくとも一部、基づいたものである。本提供のシードトレイン法は、（ａ）槽内に含まれている第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程；（ｂ）第１の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程；（ｃ）潅流バイオリアクター内に含まれている第２の培養培地に、ある体積の（ｂ）の第１の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約０．５０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する第２の細胞培養物を得る工程；（ｄ）第２の細胞培養物を約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞密度範囲まで潅流培養する工程；および（ｅ）生産用バイオリアクター内に含まれている第３の培養培地に、ある体積の（ｄ）の第２の細胞培養物を加えて、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する生産細胞培養物を得る工程を含む。本明細書に記載されているシードトレイン法の１つの使用を含む、組換えタンパク質
（例えば、組換え治療用タンパク質）を生産する方法も、本明細書において提供される。

【0006】

本明細書において：（ａ）槽内に含まれている第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程；（ｂ）第１の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程；（ｃ）潅流バイオリアクター内に含まれている第２の培養培地に、ある体積の工程（ｂ）の第１の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約０．５×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する第２の細胞培養物を得る工程；（ｄ）第２の細胞培養物を約５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞密度範囲まで潅流培養する工程；および（ｅ）生産用バイオリアクター内に含まれている第３の培養培地に、ある体積の工程（ｄ）の第２の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する生産細胞培養物を得る工程を含むシードトレイン法が提供される。これらの方法の一部の実施形態では、（ａ）における複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は：凍結細胞バンクを解凍する工程；および第１の培養培地に、ある体積の該解凍細胞バンクを加える工程を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、凍結細胞バンクは、約１０×１０^７細胞／ｍＬ～約５０×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度範囲を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、解凍細胞バンクは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも９０％）の割合の生存細胞を含む。

【0007】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は、第１の培養培地に、複数の組換え哺乳動物細胞を含むある体積の第３の細胞培養物を加える工程を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態は、（１）槽に含まれる第４の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて、第３の細胞培養物を得る工程；（２）（１）の第３の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程をさらに含み、この場合、ある体積の（２）における第３の細胞培養物が、（ａ）において第１の培養培地に加えられる。本明細書において提供されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における槽と（１）における槽の一方または両方が、使い捨て単回使用向けバイオリアクター（例えば、プラスチック製滅菌バッグを含む使い捨て単回使用向けバイオリアクター）である。

【0008】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（１）における複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は、凍結細胞バンクを解凍する工程、およびある体積の解凍細胞バンクを第４の培養培地に加える工程を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、凍結細胞バンクは、約１０×１０^７細胞／ｍＬ～約５０×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度範囲を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、解凍細胞バンクは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも９０％）の割合の生存細胞を含む。

【0009】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における第１の細胞培養物は、約１．０Ｌ～約５０Ｌ（例えば、約５．０Ｌ～約１０．０Ｌ）の体積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｃ）における第２の細胞培養物は、約５Ｌ～約６００Ｌ（例えば、約１０Ｌ～約３００Ｌ）の体積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における生産細胞培養物は、約５０Ｌ～約２０，０００Ｌ（例えば、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌ）の体積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（１）における第４の培養培地は、約５００ｍＬ～約２０Ｌ（例えば、約５００ｍＬ～約１０Ｌ）の体積範囲を有する。

【0010】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における槽は、約１．５Ｌ～約１００Ｌ（例えば、約１．５Ｌ～約５０Ｌ）の内部容積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｃ）における潅流バイオリアクターは、約７．５Ｌ～約１，０００Ｌ（例えば、約５０Ｌ～約１０００Ｌ）の内部容積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における生産用バイオリアクターは、約１５０Ｌ～約２５，０００Ｌ（例えば、約１５０Ｌ～約１０，０００Ｌ）の内部容積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（１）における槽は、約１Ｌ～約４０Ｌ（例えば、約１Ｌ～約２０Ｌ）の内部容積範囲を有する。

【0011】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｃ）における潅流培養は、交互タンジェンシャルフローろ過装置を装備した潅流バイオリアクターを使用して行われる。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における初期細胞密度は、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８×１０^６細胞／ｍＬの範囲にある。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における初期細胞密度は、定常状態の生産細胞密度の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％）である。

【0012】

（ａ）槽内に含まれている第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程；（ｂ）第１の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程；（ｃ）潅流バイオリアクター内に含まれている第２の培養培地に、ある体積の（ｂ）の第１の細胞培養培地を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約０．５×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する第２の細胞培養物を得る工程；（ｄ）第２の細胞培養物を約５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞密度範囲まで潅流培養する工程；（ｅ）生産用バイオリアクター内に含まれている第３の培養培地に、ある体積の（ｄ）の第２の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約８×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する生産細胞培養物を得る工程；（ｆ）組換え哺乳動物細胞が組換えタンパク質を分泌することが可能となる条件下で、生産細胞培養物を潅流培養する工程；および（ｇ）該生産細胞培養物から組換えタンパク質を収穫する工程を含む、組換えタンパク質を生産する方法も提供される。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は：凍結細胞バンクを解凍する工程；および第１の培養培地に、ある体積の解凍細胞バンクを加える工程を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、凍結細胞バンクは、約１０×１０^７細胞／ｍＬ～約５０×１０^７細胞／ｍＬの細胞密度範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、解凍細胞バンクは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも９０％）の割合の生存細胞を含む。

【0013】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は、第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を含むある体積の第３の細胞培養物を加える工程を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態は：（１）槽内に含まれる第４の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて、第３の細胞培養物を得る工程；および（２）（１）における第３の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程をさらに含み、この場合、ある体積の（２）における第３の細胞培養物が、（ａ）において第１の培養培地に加えられる。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における槽と（１）における槽の一方または両方が、使い捨て単回使用向けバイオリアクター（例えば、プラスチック製滅菌バッグを含む使い捨て単回使用向けバイオリアクター）である。

【0014】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（１）における複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は、凍結細胞バンクを解凍する工程；およびある体積の解凍細胞バンクを第４の培養培地に加える工程を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、凍結細胞バンクは、約１．０×１０^７細胞／ｍＬ～約５０×１０^７細胞／ｍＬ（例えば、約１０×１０^７細胞／ｍＬ～約５０×１０^７細胞／ｍＬの間）の細胞密度範囲を含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、解凍細胞バンクは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも９０％）の割合の生存細胞を含む。

【0015】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における第１の細胞培養物は、約１．０Ｌ～約５０Ｌ（例えば、約５．０Ｌ～約１０．０Ｌの間）の体積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｃ）における第２の細胞培養物は、約５Ｌ～約６００Ｌ（例えば、約１０Ｌ～約３００Ｌ）の体積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における生産細胞培養物は、約５０Ｌ～約２０，０００Ｌ（例えば、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌ）の体積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（１）における第４の培養培地は、約５００ｍＬ～約２０Ｌ（例えば、約５００ｍＬ～約１０Ｌ）の体積範囲を有する。

【0016】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ａ）における槽は、約１．５Ｌ～約１００Ｌ（例えば、約１．５Ｌ～約５０Ｌ）の内部容積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｃ）における潅流バイオリアクターは、約７．５Ｌ～約１，０００Ｌ（例えば、約５０Ｌ～約１０００Ｌ）の内部容積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における生産用バイオリアクターは、約１５０Ｌ～約２５，０００Ｌ（例えば、１５０Ｌ～約１０，０００Ｌ）の内部容積範囲を有する。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（１）における槽は、約１Ｌ～約４０Ｌ（例えば、約１Ｌ～約２０Ｌ）の内部容積範囲を有する。

【0017】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｃ）における潅流培養は、交互タンジェンシャルフローろ過装置を装備した潅流バイオリアクターを使用して行われる。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における初期細胞密度は、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８×１０^６細胞／ｍＬの範囲にある。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｅ）における初期細胞密度は、定常状態の生産細胞密度の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％）である。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、定常状態の生産細胞密度は、５×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間（例えば、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間）である。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｆ）における潅流培養により、約１日間～約１０日間の間（例えば、約２日間～約５日間の間）の期間で、生産細胞培養物が定常状態の生産細胞密度に到達する。

【0018】

本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、（ｇ）における収穫は、生産用バイオリアクターから培養培地を抜き取る工程（例えば、連続的な除去）を含む。本明細書に記載されている方法のいずれかの一部の実施形態は、抜き取られた培養培地から組換えタンパク質を単離する工程をさらに含む。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態では、上記の単離は、統合された連続法を使用して行われる。本明細書に記載されているいずれかの方法の一部の実施形態は、単離組換えタンパク質を医薬剤に製剤化する工程をさらに含む。

【0019】

本明細書で使用する場合、名詞の前の単語「ａ」は、特定の名詞が１つまたはそれ以上であることを表す。例えば、句「組換え哺乳動物細胞」は、「１つまたはそれ以上の複数の組換え哺乳動物細胞」を表す。

【0020】

用語「哺乳動物細胞」は、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリサル、ラット、ブタ、ウシまたはウサギ）に由来する、またはこれらから誘導された、いかなる細胞も意味する。例えば、哺乳動物細胞は、不死化細胞とすることができる。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は分化細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物細胞は非分化細胞である。哺乳動物細胞の非限定例は、本明細書に記載されている。哺乳動物細胞の追加例は、当分野で公知である。

【0021】

用語「シードトレイン法」は公知技術であり、第１の細胞培養物における（例えば、組換え哺乳動物細胞の）開始細胞数が、０．２５×１０^６細胞／ｍＬを超える初期細胞密度で典型的な生産用バイオリアクターに接種するのに十分な数の細胞を含むＮ－１細胞培養物に拡大される多段法を意味する。

【0022】

用語「実質的に不含である」は、指定した物質（例えば、哺乳動物細胞）が少なくとも、または約９０％不含（例えば、少なくとも、もしくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとももしくは約９９％不含である、または約１００％不含である）である組成物（例えば、液体培養培地）を意味する。

【0023】

用語「０．５ｘ体積」は、体積の約５０％を意味する。用語「０．６ｘ体積」は、体積の約６０％を意味する。同様に、０．７ｘ、０．８ｘ、０．９ｘおよび１．０ｘは、それぞれ、体積の約７０％、８０％、９０％または１００％を意味する。

【0024】

用語「培養する」または「細胞培養する」は、一連の制御されている物理的条件下、哺乳動物細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）の維持または増殖を意味する。

【0025】

用語「哺乳動物細胞の培養物」または「細胞培養物」は、一連の制御されている物理的条件下で、維持されているかまたは増殖された複数の哺乳動物細胞を含む液体培養培地を意味する。

【0026】

用語「液体培養培地」または「培養培地」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）がインビトロで成長または増殖することが可能な、十分な栄養素を含む流体を意味する。例えば、液体培養培地は、アミノ酸（例えば、２０種のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛および炭酸水素ナトリウム：の１つまたはそれ以上を含むことができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物に由来する血清を含むことができる。一部の実施形態では、液体培養培地は、哺乳動物に由来する血清または別の抽出物を含まない（規定されている液体培養培地）。一部の実施形態では、液体培養培地は、微量金属、哺乳動物の成長ホルモンおよび／または哺乳動物の成長因子を含むことができる。液体培養培地の別の例は、最少培地（例えば、無機塩、炭素源および水しか含まない培地）である。液体培養培地の非限定例は、本明細書に記載されている。液体培養培地の追加例は、当分野で公知であり、市販されている。液体培養培地は、任意の密度の哺乳動物細胞を含むことができる。例えば、本明細書で使用する場合、生産用バイオリアクターから抜き取られたある体積の液体培養培地は、実質的に哺乳動物細胞を不含とすることができる。

【0027】

用語「動物から誘導された構成成分が不含の液体培養培地」は、哺乳動物から誘導され
た、いかなる構成成分（例えば、タンパク質または血清）も含まない、液体培養培地を意味する。

【0028】

用語「血清が不含の液体培養培地」は、哺乳動物の血清を含まない、液体培養培地を意味する。

【0029】

用語「血清を含む液体培養培地」は、哺乳動物の血清を含む液体培養培地を意味する。

【0030】

用語「化学的に規定されている液体培養培地」は、技術用語であり、化学構成成分のすべてが既知である、液体培養培地を意味する。例えば、化学的に規定されている液体培養培地は、これらの調製物が、アルブミンおよび脂質の複雑な混合物を、通常、含むので、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含まない。

【0031】

用語「タンパク質が不含の液体培養培地」は、任意のタンパク質（例えば、検知可能な任意のタンパク質）を含まない、液体培養培地を意味する。

【0032】

用語「撹拌」は、かき混ぜること、またはそうでなければ、槽（例えば、バイオリアクター）中の液体培養培地の一部を移動させることを意味する。これは、例えば、槽（例えば、バイオリアクター）中の液体培養培地中に溶解しているＯ_２濃度を増加させるために行われる。撹拌は、任意の公知技術方法、例えば、機器またはプロペラを使用して行うことができる。例えば、撹拌は、傾けるおよび／または回転するプラットフォーム上に槽を置くことにより行うことができる。槽（例えば、バイオリアクター）中の液体培養培地の一部の撹拌を行うために使用することができる例示的な装置および方法は、当分野で公知である。

【0033】

用語「統合法」は、特定の結果（例えば、液体培養培地からの単離組換えタンパク質の産生）を達成するために、協同して機能する構造的要素を使用して行われる方法を意味する。

【0034】

用語「連続法」は、少なくともシステムの一部により、連続的に流体を供給する方法を意味する。

【0035】

用語「免疫グロブリン」は、少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸）の免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、骨格配列、または定常ドメイン配列）からなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。この免疫グロブリンは、少なくとも１５個のアミノ酸の軽鎖免疫グロブリン、例えば、少なくとも１５個のアミノ酸の重鎖免疫グロブリンを含むことができる。免疫グロブリンは、単離抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）であってもよい。免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のサブクラスであってもよい。免疫グロブリンは、抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片またはｓｃＦｖ断片であってもよい。免疫グロブリンはまた、二重特異的抗体もしくは三重特異的抗体、または二量体、三量体もしくは多量体抗体、またはダイアボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。免疫グロブリンはまた、少なくとも１つの免疫グロブリンドメイン（例えば、融合タンパク質）を含む、操作されたタンパク質とすることができる。免疫グロブリンの非限定例は本明細書に記載されており、免疫グロブリンの追加例は当分野で公知である。

【0036】

用語「タンパク質断片」または「ポリペプチド断片」は、長さが、少なくとももしくは約４個のアミノ酸、少なくとももしくは約５個のアミノ酸、少なくとももしくは約６個の
アミノ酸、少なくとももしくは約７個のアミノ酸、少なくとももしくは約８個のアミノ酸、少なくとももしくは約９個のアミノ酸、少なくとももしくは約１０個のアミノ酸、少なくとももしくは約１１個のアミノ酸、少なくとももしくは約１２個のアミノ酸、少なくとももしくは約１３個のアミノ酸、少なくとももしくは約１４個のアミノ酸、少なくとももしくは約１５個のアミノ酸、少なくとももしくは約１６個のアミノ酸、少なくとももしくは約１７個のアミノ酸、少なくとももしくは約１８個のアミノ酸、少なくとももしくは約１９個のアミノ酸、もしくは少なくとももしくは約２０個のアミノ酸、または長さが２０個のアミノ酸を超える、ポリペプチド配列の部分を意味する。組換えタンパク質断片は、本明細書に記載されている方法のずれかを使用して生産することができる。

【0037】

用語「操作されたタンパク質」は、生物（例えば、哺乳動物）内に存在している内因性核酸によって天然でコードされないポリペプチドを意味する。操作されたタンパク質の例は、酵素（例えば、操作された酵素の安定性および／または触媒活性の増加をもたらす、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または追加）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体またはダイアボディ）、および少なくとも１つの組換え足場配列を含む抗原－結合タンパク質を含む。

【0038】

用語「マルチカラムクロマトグラフィーシステム」または「ＭＣＣＳ」は、合計で２本またはそれ以上を相互接続した、または切り替え式クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの非限定例は、合計で２本またはそれ以上を相互接続した、または切り替え式クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含む、周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣ）である。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの追加例は、本明細書に記載されており、当分野で公知である。

【0039】

用語「捕捉する」は、液体培養培地または希釈液体培養培地（例えば、培養培地タンパク質、または哺乳動物細胞に存在しているかもしくはそれから分泌される、１つもしくはそれ以上の他の構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質）中に存在している、１つまたはそれ以上の他の構成成分から、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を部分的に精製するまたは単離する（例えば、少なくとももしくは約５％、例えば、少なくとももしくは約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとももしくは約９５％の重量純度）、濃縮するおよび安定化させるために行われた工程を意味する。通常、捕捉は、組換えタンパク質を結合させる樹脂（例えば、アフィニティークロマトグラフィーの使用による）を使用して行われる。液体培養培地または希釈液体培養培地から組換えタンパク質を捕捉する非限定法は本明細書に記載されており、他のものは、当分野において公知である。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載されているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のいずれか）を使用して、液体培養培地から捕捉することができる。

【0040】

用語「精製」は、１つもしくは複数の他の不純物（例えば、バルク不純物）または組換えタンパク質を含む流体中に存在している構成成分（例えば、哺乳動物細胞中に存在しているかまたはそれから分泌される、液体培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の構成成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質、内毒素、ウイルスなど））から組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を単離するために行われる工程を意味する。例えば、精製は、初期捕捉工程中またはその後に行うことができる。精製は、（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィーまたはモレキュラーシーブクロマトグラフィーの使用により）組換えタンパク質または汚染物質のどちらかに結合する、樹脂
、膜または他の任意の固体担体を使用して行うことができる。組換えタンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書に記載されているクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜のいずれか）を使用して、組換えタンパク質を含む流体から精製することができる。

【0041】

用語「ポリッシング」は技術用語であり、所望の最終的な純度に近い、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む流体から、残留している微量もしくは少量の汚染物質または不純物を除去するために行う工程を意味する。例えば、ポリッシングは、標的組換えタンパク質、または組換えタンパク質を含む流体中に存在している少量の汚染物質もしくは不純物のどちらかに選択的に結合する、クロマトグラフィーカラムまたは膜吸収剤に、組換えタンパク質を含む流体を流すことにより行うことができる。こうした例では、クロマトグラフィーカラムまたは膜吸収剤の溶離液／ろ液は、組換えタンパク質を含む。

【0042】

用語「溶離液／ろ液」は技術用語であり、検出可能な量の組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含むクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から送り出された流体を意味する。

【0043】

用語「ろ過」は、液体（例えば、本明細書に記載されているシステムまたは方法のいずれかにおいて存在している液体培養培地または流体）から、望ましくない生物学的汚染物質（例えば、哺乳動物細胞、細菌、酵母細胞、ウイルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子物質（例えば、沈殿タンパク質）の少なくとも一部（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を除去することを意味する。

【0044】

用語「分泌されたタンパク質」または「分泌された組換えタンパク質」は、哺乳動物細胞において、それが哺乳動物細胞内で翻訳された際、および少なくとも一部が、分泌シグナル配列の酵素的切断により、少なくとも１つの分泌シグナル配列を元々含んでいるタンパク質（例えば、組換えタンパク質）が、少なくとも部分的に細胞外空間（例えば、液体培養培地）に分泌されることを意味する。熟練専門家であれば、「分泌された」タンパク質は、分泌されたタンパク質と見なされる細胞から、完全に解離している必要がないことを理解するであろう。

【0045】

用語「潅流培養」は、技術用語であり、槽（例えば、バイオリアクター）中で細胞培養物を培養することを意味し、この場合、該槽中の細胞培養物の培養は、槽中に存在している液体培養培地（例えば、細胞を実質的に含まない液体培養培地）の定期的または連続的な抜き取り、および同時にまたはその直後に、該槽に実質的に同じ体積の交換用液体培養培地を添加することを含む。いくつかの例において、培養期間中に、抜き取られた液体培養培地の体積、および漸増期間（例えば、約２４時間、約１分間～約２４時間の間の期間、または２４時間を超える期間）にわたり添加された交換用培養培地の体積の増分変化（例えば、増加または減少）が存在する（例えば、毎日の培養培地の再供給速度）。毎日、抜き取られた置き換えられた培地の画分は、培養される特定の細胞、初期播種密度、および特定の時間における細胞密度に応じて、様々となり得る。「ＲＶ」または「リアクター体積」は、培養プロセスの開始時に存在している培養培地の体積（例えば、播種後に存在している培養培地の全体積）を意味する。

【0046】

用語「槽」は公知技術であり、一連の制御されている物理的条件下で、細胞の維持または増殖を可能にする、液体培養培地中の複数の細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）を培養するのに適した内容積を有する装置を意味する。槽の非限定例は、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載されているか、または当分野で公知の例示的なバイオリアクター
のいずれか）である。

【0047】

用語「潅流バイオリアクター」は公知技術であり、液体培養培地中の複数の細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）を培養する内容積を有するバイオリアクターであって、該バイオリアクター中の液体培養培地を周期的にまたは連続的に抜き取るための手段（例えば、出口、入り口、ポンプまたは他のこうした装置）および該バイオリアクターに実質的に同じ体積の交換用液体培養培地を添加するための手段（例えば、出口、入り口、ポンプまたは他のこうした装置）を有する、バイオリアクターを意味する。交換用液体培養培地の添加は、バイオリアクターからの液体培養培地の抜き取りと実質的に同時に、またはその直後に行うことができる。バイオリアクターから液体培養培地を抜き取るための手段、および交換用液体培養培地を添加するための手段は、単一装置またはシステムとすることができる。

【0048】

用語「生産用バイオリアクター」は、技術用語であり、大規模バイオリアクター（例えば、５００Ｌ、１，０００Ｌ、５，０００Ｌ、１０，０００Ｌ、２０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ、または１００，０００Ｌを超える内部容積を有する）を意味する。例えば、生産用バイオリアクターは、潅流バイオリアクターとすることができる。

【0049】

用語「定常状態での生産細胞密度」は、技術用語であり、経時的な潅流培養中に維持されている培養培地中の生存細胞（例えば、生存組換え哺乳動物細胞）の目標濃度を意味する。

【0050】

用語「回分培養する」は技術用語であり、槽（例えば、バイオリアクター）が液体培養培地中に複数の細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含んでいることを意味し、この場合、槽（例えば、バイオリアクター）中に存在している細胞の培養が細胞培養物に十分な量または有意な量の新しい液体培養培地を添加することを含まず、かつ培養中に細胞培養物から十分な量または有意な量の液体培養培地を抜き取ることを含まない。

【0051】

用語「流加培養する」は技術用語であり、槽（例えば、生産用バイオリアクター）が液体培養培地中に複数の細胞（例えば、哺乳動物細胞）を含んでいることを意味し、この場合、槽（例えば、生産用バイオリアクター）中に存在している細胞の培養が、培養中に該槽から十分な量または有意な量の液体培養培地の抜き取りなしに、該槽への新しい液体培養培地の周期的または連続的な添加を含む。新しい液体培養培地は、培養の開始時に槽中に存在している液体培養培地と同一とすることができる。流加培養の一部の例では、新しい液体培養培地は、培養の開始時に槽中に存在している、濃縮形態の液体培養培地である。流加培養物の一部の例では、新しい培養培地は乾燥粉末として添加される。

【0052】

用語「単位操作」は、技術用語であり、液体培養培地から組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を単離する方法において行うことができる機能的工程を意味する。例えば、操作の単位は、ろ過（例えば、組換えタンパク質を含む流体からの汚染物質である細菌、酵母ウイルスもしくはマイコバクテリア、および／または粒子物質の除去）、捕捉、エピトープタブの除去、精製、保管または貯蔵、ポリッシング、ウイルスの不活性化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節、ならびに望ましくない塩の除去とすることができる。

【0053】

「比生産性速度」または「ＳＰＲ」は技術用語であり、本明細書で使用する場合、１日あたりの哺乳動物細胞あたりに生産される、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）の質量または酵素活性を指す。組換え抗体のＳＰＲは、質量／細胞／日として通常、測定される。組換え酵素のＳＰＲは、単位／細胞／日または（単位／質量）／細胞／日として通常、測定される。

【0054】

「体積生産性速度」または「ＶＰＲ」は技術用語であり、本明細書で使用する場合、１日あたりの培養物の体積あたり（例えば、バイオリアクター、槽または管の体積１Ｌあたり）生産される、組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）の質量または酵素活性を指す。組換え抗体のＶＰＲは、質量／Ｌ／日として通常、測定される。組換え酵素のＶＰＲは、単位／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として通常、測定される。

【0055】

「スキッド（Ｓｋｉｄ）」は、技術用語であり、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されているシステムのためのプラットフォームまたは支持体として働くことができる三次元の中実構造を指す。ｓｋｉｄは、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造体（例えば、輪またはローラーなど）を含む場合、システムまたはその一部に可動性を付与することができる。スキッドの非限定例は、本明細書に記載されている。スキッドの追加例は、当分野で公知である。

【0056】

特に定義されない限り、本明細書において使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法および物質は、本発明において使用するために本明細書に記載されている；当分野において公知の他の適切な方法および物質も使用することができる。これらの物質、方法および例は、単なる例示に過ぎず、限定を意図するものではない。本明細書において言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参照物は、それらの全体が参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含め、本明細書に従う。

【0057】

本発明の他の特徴および利点は、以下に詳述されている説明および図から、ならび特許請求の範囲から明白になろう。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】５００Ｌの生産用潅流バイオリアクターへの接種で終わる慣用的なシードトレイン法を示す模式図（上部）であり、５００Ｌの生産用潅流バイオリアクターへの接種で終わる、本明細書において提供されている例示的なシードトレイン法の模式図（下部）である。

【図2】１０，０００Ｌの生産用回分または流加バイオリアクターへの接種で終わる慣用的なシードトレイン法を示す模式図（上部）であり、１０，０００Ｌの生産用回分または流加バイオリアクターへの接種で終わる、本明細書において提供されている例示的なシードトレイン法の模式図（下部）である。

【図3】本明細書に記載されている、例示的なシードトレイン法の工程全体：２Ｌの使い捨て単回使用向けバイオリアクター中で１Ｌの第３の細胞培養物を回分培養する工程、２０Ｌの使い捨て単回使用向けバイオリアクター中で７．５Ｌの第１の細胞培養物を回分培養する工程、および１５Ｌの潅流バイオリアクター中で１０Ｌの第２の細胞培養物を潅流培養する工程の生存細胞密度を示すグラフである。

【図4】本明細書に記載されている例示的なシードトレイン法における、Ｎ－１潅流細胞培養物の静電容量の関数としての生存細胞密度のグラフである。

【図5】スピンチューブ（生産用バイオリアクターを表す）中で、２５×１０^６細胞／ｍＬ（青線）、５０×１０^６細胞／ｍＬ（緑線）または１００×１０^６細胞／ｍＬ（赤線）の生存細胞密度を有するある体積のＮ－１細胞培養物を用いて接種し、０．５×１０^６細胞／ｍＬの開始生存細胞密度が生じる、スピンチューブの場合の経時的な生存細胞密度（実線）およびパーセント細胞生存率（点線）のグラフである。実線および点線は、データ（ｎ＝３）の平均を表す。影付き領域は±２の標準偏差を表す。

【図6】スピンチューブ（生産用バイオリアクターを表す）中で、２５×１０^６細胞／ｍＬ（青線）、５０×１０^６細胞／ｍＬ（緑線）または１００×１０^６細胞／ｍＬ（赤線）の生存細胞密度を有するある体積のＮ－１細胞培養物を用いて接種し、２．５×１０^６細胞／ｍＬの開始生存細胞密度が生じる、スピンチューブの場合の経時的な生存細胞密度（実線）およびパーセント細胞生存率（点線）のグラフである。実線および点線は、データ（ｎ＝３）の平均を表す。影付き領域は±２の標準偏差を表す。

【図7】スピンチューブ（生産用バイオリアクターを表す）中で、２５×１０^６細胞／ｍＬ（青線）、５０×１０^６細胞／ｍＬ（緑線）または１００×１０^６細胞／ｍＬ（赤線）の生存細胞密度を有するある体積のＮ－１細胞培養物を用いて接種し、５．０×１０^６細胞／ｍＬの開始生存細胞密度が生じる、スピンチューブの場合の経時的な生存細胞密度（実線）およびパーセント細胞生存率（点線）のグラフである。実線および点線は、データ（ｎ＝３）の平均を表す。影付き領域は±２の標準偏差を表す。

【図8】５０×１０^６生存細胞／ｍＬ（ｎ＝２）（緑線）のＮ－１潅流バイオリアクターから５．０×１０^６生存細胞／ｍＬで接種した１０Ｌの生産用バイオリアクターと比べた、２．５×１０^６生存細胞／ｍＬ（ｎ＝２）（赤線）のＮ－１潅流バイオリアクターから０．５×１０^６細胞／ｍＬで接種した１０Ｌの生産用バイオリアクターの場合の経時的な生存細胞密度のグラフである。点線は、生産用バイオリアクターの定常状態の操作の場合の目標生存細胞密度を表す。実線はデータ（ｎ＝２）の平均を表す。影付き領域は±２の標準偏差を表す。

【図9】５０×１０^６細胞／ｍＬ（緑点）のＮ－１バイオリアクターから５．０×１０^６生存細胞／ｍＬで接種した１０Ｌの生産用バイオリアクターと比べた、２．５×１０^６生存細胞／ｍＬ（赤点）のＮ－１潅流バイオリアクターから０．５×１０^６生存細胞／ｍＬで接種した１０Ｌの生産用バイオリアクターの場合の全生存細胞濃度の関数としての累積生産活性（単位／Ｌ）を示すグラフである。これらのポイントは、データ（ｎ＝２）の平均を表し、エラーバーは±２の標準偏差を表す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

本明細書において：（ａ）槽内に含まれている第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて第１の細胞培養物を得る工程；（ｂ）第１の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度範囲まで回分培養する工程；（ｃ）潅流バイオリアクター内に含まれている第２の培養培地に、ある体積の工程（ｂ）の第１の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約０．５０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する第２の細胞培養物を得る工程；（ｄ）第２の細胞培養物を約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞密度範囲まで潅流培養する工程；および（ｅ）生産用バイオリアクター内に含まれている第３の培養培地に、ある体積の工程（ｄ）の第２の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度を有する生産細胞培養物を得る工程を含むシードトレイン法が提供される。

【0060】

本明細書に記載されているシードトレイン法は、多くの利点をもたらす。第１の態様では、本シードトレイン法は、慣用的なシードトレイン法と比較して、生産細胞培養物の供給前の培養工程（１～２つの異なる培養工程の削減）をそれほど必要とせず（例えば、小規模な拡大期の数を低減する）、ひいては、細胞培養物の手作業による操作が少なくなり、生産細胞培養物を汚染するリスクの低下を実現する。本明細書に記載されているシードトレイン法は、生産細胞培養物における培養物の成長特性を損なうことなく、例えば、１２日間で最大１００×１０^６生存細胞／ｍＬという、高い生存細胞密度を有する、Ｎ－１細胞培養物（生産細胞培養物に接種するために使用される第２の細胞培養物）を実現することができる。本明細書に記載されているシードトレイン法を使用して、Ｎ－１培養物（第２の細胞培養物）において達成された生存細胞密度の高さにより、生産用バイオリアクター中の生産細胞培養物において、より高い初期細胞密度が可能になる。例えば、本シードトレイン法は、約０．５０×１０^６生存細胞／ｍＬと１０×１０^６生存細胞／ｍＬとの間の初期細胞密度を実現するために使用することができ、ひいては、生産細胞培養物に必
要な時間量を低下（例えば、４～６日間の短縮）させて、定常状態の生産細胞密度に到達させる。定常状態の生産細胞密度に到達するための生産細胞培養物に必要な時間量のこの低下により、５０日間の生産培養の実施の総合的な生産性の１０％増加をもたらすことができる。本明細書において提供されているシードトレイン法は、他のシードトレイン法に起因する、生産細胞培養よりも高い容量生産性速度および比生産性速度を有する、生産細胞培養をもたらす。

【0061】

シードトレイン法
他のシードトレイン法よりもいくつかの利点を実現する、シードトレイン法が本明細書において提供される。これらのシードトレイン法の非限定的な態様は、本明細書に記載されており、任意に組み合わせて使用することができる。

【0062】

第１の細胞培養物の取得
本明細書に記載されているシードトレイン法は、（ａ）槽に含まれている第１の培養培地に、複数の組換え哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野において公知の組換え哺乳動物細胞のいずれか）を加えて、第１の細胞培養物を得る工程を含む。いくつかの例において、第１の培養培地に加えられた複数の組換え哺乳動物細胞は、約４．５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間（例えば、約９．０×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約１１２．５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約１３５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約１５７．５×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約１８０×１０^７細胞と約４５０×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約１１２．５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約１３５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約１５７．５×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約１８０×１０^７細胞と約４０５×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約１１２．５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約１３５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約１５７．５×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約１８０×１０^７細胞と約３６０×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約１１２．５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約１３５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約１５７．５×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約１８０×１０^７細胞と約３１５×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約１１２．５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約１３５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約１５７．５×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約１８０×１０^７細胞と約２７０×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約２２５×１０^７細
胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、約１１２．５×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、１３５×１０^７細胞と約２２５×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約１８０×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約１８０×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約１８０×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約１８０×１０^７細胞との間、約６７．５×１０^７細胞と約１８０×１０^７細胞との間、約９０×１０^７細胞と約１８０×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約１３５×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約１３５×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約１３５×１０^７細胞との間、約４５×１０^７細胞と約１３５×１０^７細胞との間、約４．５×１０^７細胞と約９０×１０^７細胞との間、約９．０×１０^７細胞と約９０×１０^７細胞との間、約２２．５×１０^７細胞と約９０×１０^７細胞との間、または約４５×１０^７細胞と約９０×１０^７細胞との間）とすることができ、槽内に含まれる第１の培養培地の体積に応じて変わり得る。例えば、第１の液体培養培地に加えられている複数の細胞は、第１の細胞培養物において、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．８０×１０^６細胞／ｍＬとの間（例えば、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．７５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．７０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．６５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．６０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．５５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．５０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．４５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．４０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．３５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．３０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．８０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．７５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．７０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．６５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．６０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．５５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．５０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．４５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．４０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．１５×１０^６細胞／ｍＬと約０．３５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．８０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．７５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．７０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．６５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．６０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．５５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．５０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．４５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２０×１０^６細胞／ｍＬと約０．４０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．７５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．７０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．６５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．６０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．５５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．５０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．４５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．４０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬと約０．３５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．８０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．７５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．７０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．６５×１０^６細胞／ｍ
Ｌとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．６０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．５５×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．５０×１０^６細胞／ｍＬとの間、約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．４５×１０^６細胞／ｍＬとの間、または約０．３０×１０^６細胞／ｍＬと約０．４０×１０^６細胞／ｍＬとの間）の初期細胞密度をもたらすのに十分とすることができる。

【0063】

本技術において理解される通り、工程（ａ）における槽は、様々な異なる体積を有することができる。例えば、第１の培養培地を含む工程（ａ）における槽は、約０．５０Ｌと約２００Ｌとの間（例えば、約０．５０Ｌと約１８０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１６０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１４０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１２０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１００Ｌとの間、約０．５０Ｌと約９０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約８０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約７０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約６０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約５０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約４０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約３０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約２０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約１０Ｌとの間、約０．５０Ｌと約５．０Ｌとの間、約１．０Ｌと約２００Ｌとの間、約１．０Ｌと約１８０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１６０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１４０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１２０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１００Ｌとの間、約１．０Ｌと約９０Ｌとの間、約１．０Ｌと約８０Ｌとの間、約１．０Ｌと約７０Ｌとの間、約１．０Ｌと約６０Ｌとの間、約１．０Ｌと約５０Ｌとの間、約１．０Ｌと約４０Ｌとの間、約１．０Ｌと約３０Ｌとの間、約１．０Ｌと約２０Ｌとの間、約１．０Ｌと約１０Ｌとの間、約１．０Ｌと約５．０Ｌとの間、約１．５Ｌと約２００Ｌとの間、約１．５Ｌと約１８０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１６０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１４０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１２０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１００Ｌとの間、約１．５Ｌと約９０Ｌとの間、約１．５Ｌと約８０Ｌとの間、約１．５Ｌと約７０Ｌとの間、約１．５Ｌと約６０Ｌとの間、約１．５Ｌと約５０Ｌとの間、約１．５Ｌと約４０Ｌとの間、約１．５Ｌと約３０Ｌとの間、約１．５Ｌと約２０Ｌとの間、約１．５Ｌと約１０Ｌとの間、約１．５Ｌと約５．０Ｌとの間、約２．０Ｌと約２００Ｌとの間、約２．０Ｌと約１８０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１６０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１４０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１２０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１００Ｌとの間、約２．０Ｌと約９０Ｌとの間、約２．０Ｌと約８０Ｌとの間、約２．０Ｌと約７０Ｌとの間、約２．０Ｌと約６０Ｌとの間、約２．０Ｌと約５０Ｌとの間、約２．０Ｌと約４０Ｌとの間、約２．０Ｌと約３０Ｌとの間、約２．０Ｌと約２０Ｌとの間、約２．０Ｌと約１０Ｌとの間、約２．０Ｌと約５．０Ｌとの間、約２．５Ｌと約２００Ｌとの間、約２．５Ｌと約１８０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１６０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１４０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１２０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１００Ｌとの間、約２．５Ｌと約９０Ｌとの間、約２．５Ｌと約８０Ｌとの間、約２．５Ｌと約７０Ｌとの間、約２．５Ｌと約６０Ｌとの間、約２．５Ｌと約５０Ｌとの間、約２．５Ｌと約５０Ｌとの間、約２．５Ｌと約４０Ｌとの間、約２．５Ｌと約３０Ｌとの間、約２．５Ｌと約２０Ｌとの間、約２．５Ｌと約１０Ｌとの間、約２．５Ｌと約５．０Ｌとの間、約５．０Ｌと約２００Ｌとの間、約５．０Ｌと約１８０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１６０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１４０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１２０Ｌとの間、約５．０Ｌと約１００Ｌとの間、約５．０Ｌと約９０Ｌとの間、約５．０Ｌと約８０Ｌとの間、約５．０Ｌと約７０Ｌとの間、約５．０Ｌと約６０Ｌとの間、約５．０Ｌと約５０Ｌとの間、約５．０Ｌと約４０Ｌとの間、約５．０Ｌと約３０Ｌとの間、約５．０Ｌと約２０Ｌとの間、または約５．０Ｌと約１０Ｌとの間）の内部容積を有することができる。

【0064】

本技術において理解される通り、第１の細胞培養物を含む槽は、哺乳動物細胞を培養するために当分野において使用される任意の器具（例えば、フラスコ（例えば、スピンフラスコ）、回転管またはバイオリアクター）とすることができる。この槽は、撹拌するための内部手段（例えば、インペラ）を含むことができるか、またはこの槽は、外から撹拌（例えば、回転プラットフォームおよび／または傾斜プラットフォームの使用により）する
ことができる。槽は、ステンレス鋼またはプラスチック製（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）から作製することができる。一部の実施形態では、この槽は、使い捨て単回使用向けバイオリアクター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）Ｍｏｂｉｕｓ（登録商標）Ｃｅｌｌｒｅａｄｙという３Ｌの使い捨てバイオリアクター、Ｐｉｅｒｒｅ Ｇｕｅｒｉｎ ＡＴＭ１ Ｎｕｃｌｅｏ（商標）という２０Ｌの使い捨てバイオリアクター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＳＴＲＴＭ５０Ｌの使い捨てバイオリアクター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭＴＭ ２０Ｌという使い捨てバイオリアクター、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｕｌｔｉｂａｇ Ｏｒｂｉｔａｌ（商標）５０Ｌ、ＧＥウェーブバイオリアクター２／１０システム５Ｌ、ＧＥウェーブバイオリアクター２０／５０システム２５Ｌ、ＧＥウェーブバイオリアクター２００システム２００ＬまたはＧＥウェーブバイオリアクター５００／１０００システム５００Ｌ）とすることができる。槽の内表面は、少なくとも１種のコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンの少なくとも１種のコーティング）、および当分野で公知の通り、第１の液体培養培地にＯ_２、ＣＯ_２およびＮ_２を吹き込むための１つまたはそれ以上の導入口を有することができる。槽は、１つまたはそれ以上のセンサープローブを装備することができる。槽が非剛性プラスチック製材料からなる（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）場合、該槽を、槽を囲繞して支持する外部支持体に接続することができる。

【0065】

第１の細胞培養物は、様々な異なる体積を有することができ、例えば第１の細胞培養物は、約０．３０Ｌ～約１００Ｌの間（例えば、約０．３０Ｌ～約９０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約８０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約７０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約６０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約５０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約４０Ｌの間、約０．３０Ｌ～３０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約５．０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約１００Ｌの間、約０．５０Ｌ～約９０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約８０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約７０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約６０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約５０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約４０Ｌの間、約０．５０Ｌ～３０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約５．０Ｌの間、約１．０Ｌ～約１００Ｌの間、約１．０Ｌ～約９０Ｌの間、約１．０Ｌ～約８０Ｌの間、約１．０Ｌ～約７０Ｌの間、約１．０Ｌ～約６０Ｌの間、約１．０Ｌ～約５０Ｌの間、約１．０Ｌ～約４０Ｌの間、約１．０Ｌ～３０Ｌの間、約１．０Ｌ～約２０Ｌの間、約１．０Ｌ～約１０Ｌの間、約１．０Ｌ～約５．０Ｌの間、約１．５Ｌ～約１００Ｌの間、約１．５Ｌ～約９０Ｌの間、約１．５Ｌ～約８０Ｌの間、約１．５Ｌ～約７０Ｌの間、約１．５Ｌ～約６０Ｌの間、約１．５Ｌ～約５０Ｌの間、約１．５Ｌ～約４０Ｌの間、約１．５Ｌ～３０Ｌの間、約１．５Ｌ～約２０Ｌの間、約１．５Ｌ～約１０Ｌの間、約１．５Ｌ～約５．０Ｌの間、約２．０Ｌ～約１００Ｌの間、約２．０Ｌ～約９０Ｌの間、約２．０Ｌ～約８０Ｌの間、約２．０Ｌ～約７０Ｌの間、約２．０Ｌ～約６０Ｌの間、約２．０Ｌ～約５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約４０Ｌの間、約２．０Ｌ～３０Ｌの間、約２．０Ｌ～約２０Ｌの間、約２．０Ｌ～約１０Ｌの間、約２．０Ｌ～約５．０Ｌの間、約２．５Ｌ～約１００Ｌの間、約２．５Ｌ～約９０Ｌの間、約２．５Ｌ～約８０Ｌの間、約２．５Ｌ～約７０Ｌの間、約２．５Ｌ～約６０Ｌの間、約２．５Ｌ～約５０Ｌの間、約２．５Ｌ～約４０Ｌの間、約２．５Ｌ～３０Ｌの間、約２．５Ｌ～約２０Ｌの間、約２．５Ｌ～約１０Ｌの間、約２．５Ｌ～約５．０Ｌの間、約５．０Ｌ～約１００Ｌの間、約５．０Ｌ～約９０Ｌの間、約５．０Ｌ～約８０Ｌの間、約５．０Ｌ～約７０Ｌの間、約５．０Ｌ～約６０Ｌの間、約５．０Ｌ～約５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約４０Ｌの間、約５．０Ｌ～約３０Ｌの間、約５．０Ｌ～約２０Ｌの間、または約５．０Ｌ～約１０Ｌの間）の体積を有することができる。

【0066】

本技術において理解されている通り、複数の細胞を槽に含まれている第１の培養培地に加えることができる多くの方法が存在する。例えば、複数の組換え哺乳動物細胞を加える工程は、凍結細胞バンクを解凍する工程（例えば、本明細書に記載されているかまたは当
分野において公知の、例示的な凍結細胞バンクのいずれか）、および第１の培養培地に、ある体積の解凍細胞バンクを加える工程（例えば、滅菌ピペット操作）を含むことができる。凍結細胞バンクは、例えば、約１．０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間（例えば、約２．０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約５．０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１５×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２５×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３５×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約４０×１０^７細胞／ｍＬと約１００×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約５．０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１５×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２５×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３５×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約４０×１０^７細胞／ｍＬと約９０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約５．０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１５×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２５×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３５×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約４０×１０^７細胞／ｍＬと約８０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約５．０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１５×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２５×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３５×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約４０×１０^７細胞／ｍＬと約７０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約５．０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１５×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２５×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約３５×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約４０×１０^７細胞／ｍＬと約６０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１．０×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２．０×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約５．０×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１０×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約１５×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２０×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、約２５×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間、または約３０×１０^７細胞／ｍＬと約５０×１０^７細胞／ｍＬとの間）の細胞密度範囲を有することができる。こうした凍結細胞バンクを産生する方法は、当分野において公知である（例えば、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７９３，０２１号；２０１４年３月１４日出願の米国特許出願第１４／２１２，６０７号；および２０１４年３月１４日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７７５７を参照されたい）。当分野において周知の通り、凍結細胞バンク
の解凍は、例えば、該凍結細胞バンクを加熱要素（室温への曝露以外）、例えば、水浴またはブロックヒーター（例えば、３０℃または３７℃に設定）に曝露することにより行うことができる。一部の例において、解凍は、１秒～１分の間、１秒～５５秒の間、１秒～５０秒の間、１秒～４５秒の間、１秒～４０秒の間、１秒～３５秒の間、１秒～３０秒の間、１秒～２５秒の間、または１秒～２０秒の間の時間をかけて行うことができる。凍結細胞バンクはまた、該凍結細胞バンクを室温（例えば、約２５℃）に曝露することにより解凍することもできる。この解凍細胞バンクは、例えば、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）の割合の生存細胞を含むことができる。例えば、解凍細胞バンクは、６０％と約９８％との間（例えば、約６０％と約９５％との間、約６０％と約９０％との間、約６０％と約８５％との間、約６０％と約８０％との間、約６０％と約７５％との間、約６０％と約７０％との間、約６５％と約９８％との間、約６５％と約９５％との間、約６５％と約９０％との間、約６５％と約８５％との間、約６５％と約８０％との間、約６５％と約７５％との間、約７０％と約９８％との間、約７０％と約９５％との間、約７０％と約９０％との間、約７０％と約８５％との間、約７０％と約８０％との間、約８０％と約９８％との間、約８０％と約９５％との間、約８０％と約９０％との間、約８５％と約９８％との間、約８５％と約９５％との間、約９０％と約９８％との間、または約９０％と約９５％との間）の割合の生存細胞を含むことができる。

【0067】

一部の実施例において、第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて、第１の細胞培養物を産生する工程は、第１の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を含むある体積の第３の細胞培養物を加える工程を含むことができる。例えば、第１の培養培地に加えられる第３の培養物の体積は、例えば０．１０ｍＬ～約１０Ｌの間（例えば、約０．１０ｍＬ～約８．０Ｌの間、約０．１０ｍＬ～約６．０Ｌの間、約０．１０ｍＬ～約４．０Ｌの間、約０．１０ｍＬ～約２．０Ｌの間、約０．１０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約０．１０ｍＬ～約８００ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約６００ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約４００ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約２００ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約１００ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約５０ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約２５ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約１０ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約１０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約８．０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約６．０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約４．０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約２．０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約０．５０ｍＬ～約８００ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約６００ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約４００ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約２００ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約１００ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約５０ｍＬの間、約０．５０ｍＬ～約２５ｍＬの間、約１．０ｍＬ～約１０Ｌの間、約１．０ｍＬ～約８．０Ｌの間、約１．０ｍＬ～約６．０Ｌの間、約１．０ｍＬ～約４．０Ｌの間、約１．０ｍＬ～約２．０Ｌの間、約１．０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約１．０ｍＬ～約８００ｍＬの間、約１．０ｍＬ～約６００ｍＬの間、約１．０ｍＬ～約４００ｍＬの間、約１．０ｍＬ～約２００ｍＬの間、約０．１０ｍＬ～約１００ｍＬの間、約１．０ｍＬ～約５０ｍＬの間、約１．０ｍＬ～約２５ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約１０Ｌの間、約２．０ｍＬ～約８．０Ｌの間、約２．０ｍＬ～約６．０Ｌの間、約２．０ｍＬ～約４．０Ｌの間、約２．０ｍＬ～約２．０Ｌの間、約２．０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約２．０ｍＬ～約８００ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約６００ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約４００ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約２００ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約１００ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約５０ｍＬの間、約２．０ｍＬ～約２５ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約１０Ｌの間、約５．０ｍＬ～約８．０Ｌの間、約５．０ｍＬ～約６．０Ｌの間、約５．０ｍＬ～約４．０Ｌの間、約５．０ｍＬ～約２．０Ｌの間、約５．０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約５．０ｍＬ～約８００ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約６００ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約４００ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約２００ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約１００ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約５０ｍＬの間、約５．０ｍＬ～約２５．０ｍＬの間、約１０．
０ｍＬ～約１０Ｌの間、約１０．０ｍＬ～約８．０Ｌの間、約１０．０ｍＬ～約６．０Ｌの間、約１０．０ｍＬ～約４．０Ｌの間、約１０．０ｍＬ～約２．０Ｌの間、約１０．０ｍＬ～約１．０Ｌの間、約１０．０ｍＬ～約８００ｍＬの間、約１０．０ｍＬ～約６００ｍＬの間、約１０．０ｍＬ～約４００ｍＬの間、約１０．０ｍＬ～約２００ｍＬの間、約１０．０ｍＬ～約１００ｍＬの間、約１０．０ｍＬ～約５０ｍＬの間、または約１０．０ｍＬ～約２５．０ｍＬの間）とすることができる。第１の培養培地に加えられる第３の細胞培養物の細胞密度は、本明細書に記載されている例示的な細胞密度または細胞密度範囲のいずれかとすることができる。当業者により理解される通り、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬと約０．８０×１０^６細胞／ｍＬとの間（または、上記の第１の細胞培養物について列挙されている初期細胞密度の他の例示的な範囲のいずれか）の初期細胞密度を有する第１の細胞培養物を産生するのに十分な第３の細胞培養物の体積は、槽内に存在している、第３の細胞培養物の細胞密度および第１の液体培養培地の体積（第１の培養培地に第３の細胞培養物を加える前）から決定することができる。

【0068】

第３の細胞培養物を使用する一部の実施形態は、（１）槽に含まれる第４の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて、第３の細胞培養物を得る工程；および（２）（１）の第３の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間（例えば、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．５×１０^６細胞／ｍＬ～約２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１５×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５×１０^６細胞／ｍＬの間、または約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間）の細胞密度範囲まで回分培養する工程を含むことができ、ある体積の（２）における第３の細胞培養物が、次に、第１の培養培地に加えられて、第１の細胞培養物が産生される。第４の培養培地に加えられた複数の細胞は、例えば、約０．１０×１０^７細胞～約２０×１０^７細胞の間（例えば、約０．１０×１０^７細胞～約１５×１０^７細胞の間、約０．１０×１０^７細胞～約１０×１０^７細胞の間、約０．１０×１０^７細胞～約５．０×１０^７細胞の間、約０．１０×１０^７細胞～約２．０×１０^７細胞の間、約０．１０×１０^７細胞～約１．０×１０^７細胞の間、約０．１０×１０^７細胞～約０．５０×１０^７細胞の間、約０．２０×１０^７細胞～約２０×１０^７細胞の間、約０．２０×１０^７細胞～約１５×１０^７細胞の間、約０．２０×１０^７細胞～約１０×１０^７細胞の間、約０．２０×１０^７細胞～約５．０×１０^７細胞の間、約０．２０×１
０^７細胞～約２．０×１０^７細胞の間、約０．２０×１０^７細胞～約１．０×１０^７細胞の間、約０．２０×１０^７細胞～約０．５０×１０^７細胞の間、約０．４０×１０^７細胞～約２０×１０^７細胞の間、約０．４０×１０^７細胞～約１５×１０^７細胞の間、約０．４０×１０^７細胞～約１０×１０^７細胞の間、約０．４０×１０^７細胞～約５．０×１０^７細胞の間、約０．４０×１０^７細胞～約２．０×１０^７細胞の間、約０．４０×１０^７細胞～約１．０×１０^７細胞の間、約０．６０×１０^７細胞～約２０×１０^７細胞の間、約０．６０×１０^７細胞～約１５×１０^７細胞の間、約０．６０×１０^７細胞～約１０×１０^７細胞の間、約０．６０×１０^７細胞～約５×１０^７細胞の間、約０．６０×１０^７細胞～約２×１０^７細胞の間、約０．６０×１０^７細胞～約１×１０^７細胞の間、約０．８０×１０^７細胞～約１．０×１０^７細胞の間、約１．０×１０^７細胞～約２０×１０^７細胞の間、約１．０×１０^７細胞～約１５×１０^７細胞の間、約１．０×１０^７細胞～約１０×１０^７細胞の間、約１．０×１０^７細胞～約５．０×１０^７細胞の間、約１．０×１０^７細胞～約２．０×１０^７細胞の間、約５．０×１０^７細胞～約２０×１０^７細胞の間、約５．０×１０^７細胞～約１５×１０^７細胞の間、または約５．０×１０^７細胞～約１０×１０^７細胞の間）とすることができ、槽内に含まれる第４の培養培地の体積に応じて変わり得る。例えば、第３の液体培養培地に加えられている複数の細胞は、第３の細胞培養物において、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬ～約０．８０×１０^６細胞／ｍＬの間（例えば、第１の細胞培養物について上で列挙されている例示的な初期細胞密度または初期細胞密度の範囲のいずれか）の初期細胞密度をもたらすのに十分とすることができる。

【0069】

一部の実施形態では、第４の培養培地に複数の組換え哺乳動物細胞を加えて第３の細胞培養物を産生する工程は、凍結細胞バンクを解凍する工程、および第４の培養培地に、ある体積の解凍細胞バンクを加える工程を含むことができる。こうした実施形態では、凍結細胞バンクは、本明細書に記載されている凍結細胞バンクについて、任意の細胞密度または細胞密度の範囲のを有することができる。凍結細胞バンクは、本明細書に記載されている方法または当分野で公知の方法のいずれかを使用して解凍することができる。得られた解凍細胞バンクは、本明細書に記載されている解凍細胞バンクに関し、任意の割合の生存細胞または任意の割合の範囲の生存細胞を有することができる。

【0070】

第３の細胞培養物を含む槽の内部容積は、例えば、約０．２０Ｌ～約３０Ｌの間（例えば、約０．２０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．２０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．２０Ｌ～約５．０Ｌの間、約０．２０Ｌ～約２．５Ｌの間、約０．５０Ｌ～約３０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約５．０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約２．５Ｌの間、約１．０Ｌ～約３０Ｌの間、約１．０Ｌ～約２０Ｌの間、約１．０Ｌ～約１０Ｌの間、約１．０Ｌ～約５．０Ｌの間、約１．０Ｌ～約２．５Ｌの間、約２．０Ｌ～約３０Ｌの間、約２．０Ｌ～約２０Ｌの間、約２．０Ｌ～約１０Ｌの間、約２．０Ｌ～約５．０Ｌの間、約５．０Ｌ～約３０Ｌの間、約５．０Ｌ～約２０Ｌの間、約５．０Ｌ～約１０Ｌの間、約１０Ｌ～約３０Ｌの間、または約１０Ｌ～約２０Ｌの間）とすることができる。第４の培養培地は、例えば、約０．１０Ｌ～約２０Ｌの間（例えば、約０．１０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．１０Ｌ～約１５Ｌの間、約０．１０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．１０Ｌ～約５．０Ｌの間、約０．２０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．２０Ｌ～約１５Ｌの間、約０．２０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．２０Ｌ～約５．０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約１５Ｌの間、約０．５０Ｌ～約１０Ｌの間、約０．５０Ｌ～約５．０Ｌの間、約１．０Ｌ～約２０Ｌの間、約１．０Ｌ～約１５Ｌの間、約１．０Ｌ～約１０Ｌの間、約１．０Ｌ～約５．０Ｌの間、約１．５Ｌ～約２０Ｌの間、約１．５Ｌ～約１５Ｌの間、約１．５Ｌ～約１０Ｌの間、約１．５Ｌ～約５．０Ｌの間、約２．０Ｌ～約２５Ｌの間、約２．０Ｌ～約２０Ｌの間、約２．０Ｌ～約１５Ｌの間、約２．０Ｌ～約１０Ｌの間、約２．０Ｌ～約５．０Ｌの間、約５．０Ｌ～約２０Ｌの間、約５．０Ｌ～約１５Ｌの間、約５．０Ｌ～約１０Ｌの間、約１０Ｌ～約２０Ｌの間、または約１０Ｌ～約１５Ｌの間）の体積を有することができる。

【0071】

本技術において理解される通り、第３の細胞培養物を含む槽は、哺乳動物細胞を培養するために当分野において使用される任意の器具（例えば、フラスコ（例えば、スピンフラスコ）、回転管またはバイオリアクター）とすることができる。この槽は、撹拌するための内部手段（例えば、インペラ）を含むことができるか、またはこの槽は、外から撹拌（例えば、回転プラットフォームおよび／または傾斜プラットフォームの使用により）することができる。この槽は、ステンレス鋼またはプラスチック製（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）から作製することができる。一部の実施形態では、槽は使い捨て単回使用向けバイオリアクター（例えば、本明細書に記載されている使い捨て単回使用向けバイオリアクターのいずれか）とすることができる。潅流バイオリアクターの内表面は、少なくとも１種のコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンの少なくとも１種のコーティング）、および当分野で公知の通り、第３の培養培地にＯ_２、ＣＯ_２およびＮ_２を吹き込むための１つまたはそれ以上の導入口を有することができる。槽は、１つまたはそれ以上のセンサープローブを装備することができる。槽が非剛性プラスチック製材料からなる（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）場合、この槽を外部構造体により囲繞して支持することができる。

【0072】

本明細書に記載されている加える工程はそれぞれ、滅菌ピペット（例えば、組織培養物フード中での滅菌ピペット操作）を使用して行うことができる。

【0073】

第１の細胞培養物の回分培養
工程（ａ）における第１の細胞培養物の取得後、本明細書に記載されているシードトレイン法は、（ｂ）第１の細胞培養物を約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間（例えば、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２．５×１０^６細胞／ｍＬの間、約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１７．５×１０^６細胞／ｍＬの間、または約１２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１５．０×１０^６細胞／ｍＬの間）の細胞密度範囲まで回分培養する工程を含む。細胞密度を決定するための様々な異なる方法が、当分野で公知である（例えば、光学顕微鏡および血球計算盤の使
用、または例えば、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動細胞カウンター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｕｎａ（商標）自動細胞カウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような自動細胞カウンター、またはＶｉ－Ｃｅｌｌ（登録商標）細胞生存率分析器の使用）。

【0074】

第１の細胞培養物の回分培養は、培養の間、第１の細胞培養物へのかなりの量または有意な量の液体培養培地の添加を含まず、かつかなりの量または有意な量の第１の細胞培養培地の抜き取りを含まない。回分培養は、本明細書に記載されている例示的な温度のいずれか、および／またはＣＯ_２ガスの曝露を使用して行うことができる。回分培養は、当分野で公知のＯ_２および／またはＮ_２ガスの曝露のいずれかを使用して行うことができる。回分培養はまた、本明細書に記載されているタイプの撹拌のいずれかを含むことができる。当業者であれば理解する通り、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０．０×１０^６細胞／ｍＬの間（または、本明細書に記載されている他の細胞密度または細胞密度の範囲のいずれか）を目標とする細胞密度に到達するまで第１の細胞培養物を回分培養する時間の長さは、組換え哺乳動物細胞の成長速度および第１の細胞培養物の初期細胞密度に依存するであろう。例えば、第１の細胞培養物は、約１日間～約９日間の間（例えば、約１日間～約８日間の間、約１日間～約７日間の間、約１日間～約６日間の間、約１日間～約５日間の間、約１日間～約４日間の間、約１日間～約３日間の間、約２日間～約９日間の間、約２日間～約８日間の間、約２日間～約７日間の間、約２日間～約６日間の間、約２日間～約５日間の間、約２日間～約４日間の間、約３日間～約９日間の間、約３日間～約８日間の間、約３日間～約７日間の間、約３日間～約６日間の間、約３日間～約５日間の間、約４日間～約９日間の間、約４日間～約８日間の間、約４日間～約７日間の間、約４日間～約６日間の間、約５日間～約９日間の間、約５日間～約８日間の間、約５日間～約７日間の間、約６日間～約９日間の間、約６日間～約８日間の間、または約７日間～約９日間の間）培養することができる。本方法において使用することができる回分培養の他の例示的なパラメータは、本明細書に記載されている。

【0075】

第２の細胞培養物の取得
本明細書に記載されているシードトレイン法は、（ｃ）潅流バイオリアクター中に含まれる第２の培養培地に、ある体積の工程（ｂ）の第１の細胞培養物を加えて、約０．１０×１０^６細胞／ｍＬ～約０．８×１０^６細胞／ｍＬ（例えば、上記の第１の細胞培養物に関して記載されている初期細胞密度または初期細胞密度の範囲のいずれか）の間の範囲の初期細胞密度を有する第２の細胞培養物を得る工程をさらに含む。当業者が理解することができる通り、第２の細胞培養物に関して約０．１０×１０^６細胞／ｍＬ～約０．８０×１０^６細胞／ｍＬの間の範囲の初期細胞密度に到達させるために、第２の培養培地に加える適切な体積の第１の細胞培養物は、第１の細胞培養物の細胞密度および第２の培養培地の体積から決定することができる。第２の培養培地に加えられる第１の細胞培養物の体積は、例えば、０．３０Ｌ～約１００Ｌの間（例えば、約０．３０Ｌ～約９０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約８０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約７０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約６０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約５０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約４０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約３０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約２０Ｌの間、約０．３０Ｌ～約１０Ｌの間、約１．０Ｌ～約１００Ｌの間、約１．０Ｌ～約９０Ｌの間、約１．０Ｌ～約８０Ｌの間、約１．０Ｌ～約７０Ｌの間、約１．０Ｌ～約６０Ｌの間、約１．０Ｌ～約５０Ｌの間、約１．０Ｌ～約４０Ｌの間、約１．０Ｌ～約３０Ｌの間、約１．０Ｌ～約２０Ｌの間、約１．０Ｌ～約１０Ｌの間、約２．５Ｌ～約１００Ｌの間、約２．５Ｌ～約９０Ｌの間、約２．５Ｌ～約８０Ｌの間、約２．５Ｌ～約７０Ｌの間、約２．５Ｌ～約６０Ｌの間、約２．５Ｌ～約５０Ｌの間、約２．５Ｌ～約４０Ｌの間、約２．５Ｌ～約３０Ｌの間、約２．５Ｌ～約２０Ｌの間、約２．５Ｌ～約１０Ｌの間、約５．０Ｌ～約１００Ｌの間、約５．０Ｌ～約９０Ｌの間、約５．０Ｌ～約８０Ｌの間、約５．０Ｌ～約７０Ｌの間、約５．０Ｌ～約６０Ｌの間、約５
．０Ｌ～約５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約４０Ｌの間、約５．０Ｌ～約３０Ｌの間、約５．０Ｌ～約２０Ｌの間、約５．０Ｌ～約１０Ｌの間、約１５Ｌ～約１００Ｌの間、約１５Ｌ～約９０Ｌの間、約１５Ｌ～約８０Ｌの間、約１５Ｌ～約７０Ｌの間、約１５Ｌ～約７０Ｌの間、約１５Ｌ～約６０Ｌの間、約１５Ｌ～約５０Ｌの間、約１５Ｌ～約４０Ｌの間、約１５Ｌ～約３０Ｌの間、約１５Ｌ～約２０Ｌの間、約２０Ｌ～約１００Ｌの間、約２０Ｌ～約９０Ｌの間、約２０Ｌ～約８０Ｌの間、約２０Ｌ～約７０Ｌの間、約２０Ｌ～約６０Ｌの間、約２０Ｌ～約５０Ｌの間、約２０Ｌ～約４０Ｌの間、約３０Ｌ～約１００Ｌの間、約３０Ｌ～約９０Ｌの間、約３０Ｌ～約８０Ｌの間、約３０Ｌ～約７０Ｌの間、約３０Ｌ～約６０Ｌの間、約３０Ｌ～約５０Ｌの間、約４０Ｌ～約１００Ｌの間、約４０Ｌ～約９０Ｌの間、約４０Ｌ～約８０Ｌの間、約４０Ｌ～約７０Ｌの間、約４０Ｌ～約６０Ｌの間、約５０Ｌ～約１００Ｌの間、約５０Ｌ～約９０Ｌの間、約５０Ｌ～約８０Ｌの間、約５０Ｌ～約７０Ｌの間、約６０Ｌ～約１００Ｌの間、約６０Ｌ～約９０Ｌの間、約６０Ｌ～約８０Ｌの間、約７０Ｌ～約１００Ｌの間、約７０Ｌ～約９０Ｌの間、または約８０Ｌ～約１００Ｌの間）とすることができる。

【0076】

第２の細胞培養物の体積は、例えば、２．０Ｌ～８００Ｌの間（例えば、約２．０Ｌ～約７５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約７００Ｌの間、約２．０Ｌ～約６５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約６００Ｌの間、約２．０Ｌ～約５５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約５００Ｌの間、約２．０Ｌ～約４５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約４００Ｌの間、約２．０Ｌ～約３５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約３００Ｌの間、約２．０Ｌ～約２５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約２００Ｌの間、約２．０Ｌ～約１５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約１００Ｌの間、約２．０Ｌ～約５０Ｌの間、約２．０Ｌ～約２５Ｌの間、約５．０Ｌ～約８００Ｌの間、約５．０Ｌ～約７５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約７００Ｌの間、約５．０Ｌ～約６５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約６００Ｌの間、約５．０Ｌ～約５５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約５００Ｌの間、約５．０Ｌ～約４５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約４００Ｌの間、約５．０Ｌ～約３５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約３００Ｌの間、約５．０Ｌ～約２５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約２００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約１００Ｌの間、約５．０Ｌ～約５０Ｌの間、約５．０Ｌ～約２５Ｌの間、約１０Ｌ～約８００Ｌの間、約１０Ｌ～約７５０Ｌの間、約１０Ｌ～約７００Ｌの間、約１０Ｌ～約６５０Ｌの間、約１０Ｌ～約６００Ｌの間、約１０Ｌ～約５５０Ｌの間、約１０Ｌ～約５００Ｌの間、約１０Ｌ～約４５０Ｌの間、約１０Ｌ～約４００Ｌの間、約１０Ｌ～約３５０Ｌの間、約１０Ｌ～約３００Ｌの間、約１０Ｌ～約２５０Ｌの間、約１０Ｌ～約２００Ｌの間、約１０Ｌ～約１５０Ｌの間、約１０Ｌ～約１００Ｌの間、約１０Ｌ～約５０Ｌの間、約１０Ｌ～約２５Ｌの間、約１５Ｌ～約８００Ｌの間、約１５Ｌ～約７５０Ｌの間、約１５Ｌ～約７００Ｌの間、約１５Ｌ～約６００Ｌの間、約１５Ｌ～約５５０Ｌの間、約１５Ｌ～約５００Ｌの間、約１５Ｌ～約４５０Ｌの間、約１５Ｌ～約４００Ｌの間、約１５Ｌ～約３５０Ｌの間、約１５Ｌ～約３００Ｌの間、約１５Ｌ～約２５０Ｌの間、約１５Ｌ～約２００Ｌの間、約１５Ｌ～約１５０Ｌの間、約１５Ｌ～約１００Ｌの間、約１５Ｌ～約５０Ｌの間、約１５Ｌ～約２５Ｌの間、約２０Ｌ～約８００Ｌの間、約２０Ｌ～約７５０Ｌの間、約２０Ｌ～約７００Ｌの間、約２０Ｌ～約６５０Ｌの間、約２０Ｌ～約６００Ｌの間、約２０Ｌ～約５５０Ｌの間、約２０Ｌ～約５００Ｌの間、約２０Ｌ～約４５０Ｌの間、約２０Ｌ～約４００Ｌの間、約２０Ｌ～約３５０Ｌの間、約２０Ｌ～約３００Ｌの間、約２０Ｌ～約２５０Ｌの間、約２０Ｌ～約２００Ｌの間、約２０Ｌ～約１５０Ｌの間、約２０Ｌ～約１００Ｌの間、約２０Ｌ～約５０Ｌの間、約２５Ｌ～約８００Ｌの間、約２５Ｌ～約７５０Ｌの間、約２５Ｌ～約７００Ｌの間、約２５Ｌ～約６５０Ｌの間、約２５Ｌ～約６００Ｌの間、約２５Ｌ～約５５０Ｌの間、約２５Ｌ～約５００Ｌの間、約２５Ｌ～約４５０Ｌの間、約２５Ｌ～約４００Ｌの間、約２５Ｌ～約３５０Ｌの間、約２５Ｌ～約３００Ｌの間、約２５Ｌ～約２５０Ｌの間、約２５Ｌ～約２００Ｌの間、約２５Ｌ～約１５０Ｌの間、約２５Ｌ～約１００Ｌの間、約２５Ｌ～約５０Ｌの間、約５０Ｌ～約８００Ｌの間、約５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約５０Ｌ～約７００Ｌの間、約５０Ｌ～約６５０Ｌの間、約５０Ｌ～約６００Ｌの間、約５０Ｌ
～約５５０Ｌの間、約５０Ｌ～約５００Ｌの間、約５０Ｌ～約４５０Ｌの間、約５０Ｌ～約４００Ｌの間、約５０Ｌ～約３５０Ｌの間、約５０Ｌ～約３００Ｌの間、約５０Ｌ～約２５０Ｌの間、約５０Ｌ～約２００Ｌの間、約５０Ｌ～約１５０Ｌの間、約５０Ｌ～約１００Ｌの間、約７５Ｌ～約８００Ｌの間、約７５Ｌ～約７５０Ｌの間、約７５Ｌ～約７００Ｌの間、約７５Ｌ～約６５０Ｌの間、約７５Ｌ～約６００Ｌの間、約７５Ｌ～約５５０Ｌの間、約７５Ｌ～約５００Ｌの間、約７５Ｌ～約４５０Ｌの間、約７５Ｌ～約４００Ｌの間、約７５Ｌ～約３５０Ｌの間、約７５Ｌ～約３００Ｌの間、約７５Ｌ～約２５０Ｌの間、約７５Ｌ～約２００Ｌの間、約７５Ｌ～約１５０Ｌの間、約７５Ｌ～約１００Ｌの間、約１００Ｌ～約８００Ｌの間、約１００Ｌ～約７５０Ｌの間、約１００Ｌ～約７００Ｌの間、約１００Ｌ～約６５０Ｌの間、約１００Ｌ～約６００Ｌの間、約１００Ｌ～約５５０Ｌの間、約１００Ｌ～約５００Ｌの間、約１００Ｌ～約４５０Ｌの間、約１００Ｌ～約４００Ｌの間、約１００Ｌ～約３５０Ｌの間、約１００Ｌ～約３００Ｌの間、約１００Ｌ～約２５０Ｌの間、約１００Ｌ～約２００Ｌの間、約１００Ｌ～約１５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約８００Ｌの間、約１５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約７００Ｌの間、約１５０Ｌ～約６５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約６００Ｌの間、約１５０Ｌ～約５５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約５００Ｌの間、約１５０Ｌ～約４５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約４００Ｌの間、約１５０Ｌ～約３５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約３００Ｌの間、約１５０Ｌ～約２５０Ｌの間、約１５０Ｌ～約２００Ｌの間、約２００Ｌ～約８００Ｌの間、約２００Ｌ～約７５０Ｌの間、約２００Ｌ～約７００Ｌの間、約２００Ｌ～約６５０Ｌの間、約２００Ｌ～約６００Ｌの間、約２００Ｌ～約５５０Ｌの間、約２００Ｌ～約５００Ｌの間、約２００Ｌ～約４５０Ｌの間、約２００Ｌ～約４００Ｌの間、約２００Ｌ～約３５０Ｌの間、約２００Ｌ～約３００Ｌの間、約２００Ｌ～約２５０Ｌの間、約２５０Ｌ～約８００Ｌの間、約２５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約２５０Ｌ～約７００Ｌの間、約２５０Ｌ～約６５０Ｌの間、約２５０Ｌ～約６００Ｌの間、約２５０Ｌ～約５５０Ｌの間、約２５０Ｌ～約５００Ｌの間、約２５０Ｌ～約４５０Ｌの間、約２５０Ｌ～約４００Ｌの間、約２５０Ｌ～約３５０Ｌの間、約２５０Ｌ～約３００Ｌの間、約３００Ｌ～約８００Ｌの間、約３００Ｌ～約７５０Ｌの間、約３００Ｌ～約７００Ｌの間、約３００Ｌ～約６５０Ｌの間、約３００Ｌ～約６００Ｌの間、約３００Ｌ～約５５０Ｌの間、約３００Ｌ～約５００Ｌの間、約３００Ｌ～約４５０Ｌの間、約３００Ｌ～約４００Ｌの間、約３００Ｌ～約３５０Ｌの間、約３５０Ｌ～約８００Ｌの間、約３５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約３５０Ｌ～約７００Ｌの間、約３５０Ｌ～約６５０Ｌの間、約３５０Ｌ～約６００Ｌの間、約３５０Ｌ～約５５０Ｌの間、約３５０Ｌ～約５００Ｌの間、約３５０Ｌ～約４５０Ｌの間、約３５０Ｌ～約４００Ｌの間、約４００Ｌ～約８００Ｌの間、約４００Ｌ～約７５０Ｌの間、約４００Ｌ～約７００Ｌの間、約４００Ｌ～約６５０Ｌの間、約４００Ｌ～約６００Ｌの間、約４００Ｌ～約５５０Ｌの間、約４００Ｌ～約５００Ｌの間、約４００Ｌ～約４５０Ｌの間、約４５０Ｌ～約８００Ｌの間、約４５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約４５０Ｌ～約７００Ｌの間、約４５０Ｌ～約６５０Ｌの間、約４５０Ｌ～約６００Ｌの間、約４５０Ｌ～約５５０Ｌの間、約４５０Ｌ～約５００Ｌの間、約５００Ｌ～約８００Ｌの間、約５００Ｌ～約７５０Ｌの間、約５００Ｌ～約７００Ｌの間、約５００Ｌ～約６５０Ｌの間、約５００Ｌ～約６００Ｌの間、約５００Ｌ～約６５０Ｌの間、約５５０Ｌ～約８００Ｌの間、約５５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約５５０Ｌ～約７００Ｌの間、約５５０Ｌ～約６５０Ｌの間、約５５０Ｌ～約６００Ｌの間、約６００Ｌ～約８００Ｌの間、約６００Ｌ～約７５０Ｌの間、約６００Ｌ～約７００Ｌの間、約６００Ｌ～約６５０Ｌの間、約６５０Ｌ～約８００Ｌの間、約６５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約６５０Ｌ～約７００Ｌの間、約７００Ｌ～約８００Ｌの間、約７００Ｌ～約７５０Ｌの間、または約７５０Ｌ～約８００Ｌの間）とすることができる。

【0077】

潅流バイオリアクターは、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示的な潅流バイオリアクターのいずれかとすることができる。例えば、潅流バイオリアクターは、ステンレス鋼またはプラスチック製（例えば、プラスチック製滅菌バッグ）から作製す
ることができる。潅流バイオリアクターの内表面は、少なくとも１種のコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンの少なくとも１種のコーティング）、ならびに当分野で公知の通り、液体培養培地にＯ_２、ＣＯ_２およびＮ_２を吹き込むための１つまたはそれ以上の導入口、ならびに該液体培養培地を撹拌するためのかき混ぜ装置を有することができる。潅流バイオリアクターはまた、バイオリアクターからある体積の第２の液体培養培地を抜き取ることができる機械装置、および場合によりバイオリアクターから第２の液体培養培地を移すプロセス中に、第２の液体培養培地から細胞を抜き取る機械装置内にフィルター（例えば、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム、または米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に記載されているろ過システム）を備えることもできる。バイオリアクターはまた、１つまたはそれ以上のポンプ、ならびに抜き取られた第２の培養培地および潅流バイオリアクターに潅流される新しい培養培地を保管するための１つまたはそれ以上の貯蔵器を装備することもできる。

【0078】

潅流バイオリアクターは、例えば、約５．０Ｌ～約２，０００Ｌの間（例えば、約５．０Ｌ～約１，９００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，８００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，７００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，６００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，５００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，４００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，３００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，２００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，１００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１，０００Ｌの間、約５．０Ｌ～約９００Ｌの間、約５．０Ｌ～約８００Ｌの間、約５．０Ｌ～約７００Ｌの間、約５．０Ｌ～約６００Ｌの間、約５．０Ｌ～約５００Ｌの間、約５．０Ｌ～約４００Ｌの間、約５．０Ｌ～約３００Ｌの間、約５．０Ｌ～約２００Ｌの間、約５．０Ｌ～約１００Ｌの間、約５．０Ｌ～約５０Ｌの間、約１００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約９００Ｌの間、約１００Ｌ～約８００Ｌの間、約１００Ｌ～約７００Ｌの間、約１００Ｌ～約６００Ｌの間、約１００Ｌ～約５００Ｌの間、約１００Ｌ～約４００Ｌの間、約１００Ｌ～約３００Ｌの間、約１００Ｌ～約２００Ｌの間、約１５０Ｌ～約２，０００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，９００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，８００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，７００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，６００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，５００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，４００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，３００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，２００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，１００Ｌの間、約１５０Ｌ～約１，０００Ｌの間、約１５０Ｌ～約９００Ｌの間、約１５０Ｌ～約８００Ｌの間、約１５０Ｌ～約７００Ｌの間、約１５０Ｌ～約６００Ｌの間、約１５０Ｌ～約５００Ｌの間、約１５０Ｌ～約４００Ｌの間、約１５０Ｌ～約３００Ｌの間、約１５０Ｌ～約２００Ｌの間、約２００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約９００Ｌの間、約２００Ｌ～約８００Ｌの間、約２００Ｌ～約７００Ｌの間、約２００Ｌ～約６００Ｌの間、約２００Ｌ～約５００Ｌの間、約２００Ｌ～約４００Ｌの間、約２００Ｌ～約３００Ｌの間、約３００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約３００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約３００Ｌ～約９００Ｌの間、約３００Ｌ～約８００Ｌの間、約３００Ｌ～約７００Ｌの間、約３００Ｌ～約６００Ｌの間、約３００Ｌ～約５００Ｌの間、約３００Ｌ～約４
００Ｌの間、約４００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約４００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約４００Ｌ～約９００Ｌの間、約４００Ｌ～約８００Ｌの間、約４００Ｌ～約７００Ｌの間、約４００Ｌ～約６００Ｌの間、約４００Ｌ～約５００Ｌの間、約５００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約９００Ｌの間、約５００Ｌ～約８００Ｌの間、約５００Ｌ～約７００Ｌの間、約５００Ｌ～約６００Ｌの間、約６００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約６００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約６００Ｌ～約９００Ｌの間、約６００Ｌ～約８００Ｌの間、約６００Ｌ～約７００Ｌの間、約７００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約７００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約７００Ｌ～約９００Ｌの間、約７００Ｌ～約８００Ｌの間、約８００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，９００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，８００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，７００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，６００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，４００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，３００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，２００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，１００Ｌの間、約８００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約８００Ｌ～約９００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１，７５０Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１，２５０Ｌの間、約１，２５０Ｌ～約２，０００Ｌの間、約１，２５０Ｌ～約１，７５０Ｌの間、約１，２５０Ｌ～約１，５００Ｌの間、約１，５００Ｌ～約２，０００Ｌの間、約１，５００Ｌ～約１，７５０Ｌの間、または約１，７５０Ｌ～約２，０００Ｌの間）の内部容積を有することができる。

【0079】

第２の細胞培養物の潅流培養
本明細書に記載されているシードトレイン法は、（ｄ）第２の細胞培養物を約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間（例えば、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１
０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１０×１０^６細胞／ｍＬ～約２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１５×１０^６細胞／ｍＬ～約２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２０×１０^６細胞／ｍＬ～約３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２５×１０^６細胞／ｍＬ～約３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３０×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４０×１０^６細胞／ｍＬ～約５０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０
０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５０×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６０×１０^６細胞／ｍＬ～約７０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７０×１０^６細胞／ｍＬ～約８０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約８０×１０^６細胞／ｍＬ～約９０×１０^６細胞／ｍＬの間、約９０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約９０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約９０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約９０×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約９０×１０^６細胞／ｍＬ～約１００×１０^６細胞／ｍＬの間、約１００×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１００×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１００×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１００×１０^６細胞／ｍＬ～約１１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１１０×１０^６細胞／ｍＬ～約１２０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間、
約１２０×１０^６細胞／ｍＬ～約１３０×１０^６細胞／ｍＬの間、または約１３０×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間）の細胞密度まで潅流培養する工程をさらに含む。

【0080】

潅流培養は当分野で周知であり、この工程では、潅流バイオリアクターからある体積の液体培養培地（例えば、実質的に細胞不含の潅流バイオリアクター中の、ある体積の第２の液体培養培地）を抜き取る工程（例えば、連続的または周期的な抜き取り）、およびある体積の交換用培養培地をほぼ同時に、または実質的に同時に、該潅流バイオリアクターに添加する工程を含む。抜き取りおよび添加は、同時にもしくは逐次に、またはこれらの２つを組み合わせて行うことができる。さらに、抜き取りおよび添加は、連続的（例えば、任意の所与の時間をかけて（例えば、２４時間をかけて、約１時間～約２４時間の増分期間をかけて、または２４時間超の増分期間をかけて）、潅流バイオリアクターの容積または培養の開始時における液体培養培地の初期体積（例えば、第２の液体培養培地の体積）の０．１％～８００％の間（例えば、１％～７００％の間、１％～６００％の間、１％～５００％の間、１％～４００％の間、１％～３５０％の間、１％～３００％の間、１％～２５０％の間、１％～１００％の間、１００％～２００％の間、５％～１５０％の間、１０％～５０％の間、１５％～４０％の間、８％～８０％の間および４％～３０％の間）の体積を抜き取って置き換わる速度で）、または周期的に（例えば、３日毎に１回、２日毎に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、または１日５回）、またはそれらの任意の組合せで行うことができる。周期的に行われる場合、抜き取られるかまたは置き換えられる（例えば、約２４時間以内、約１時間～約２４時間の増分期間以内、または２４時間超の増分期間以内）体積は、例えば、潅流バイオリアクターの体積、または培養の
開始時におけるバイオリアクター内の培養培地の体積（例えば、第２の液体培養培地の体積）の０．１％～８００％の間（例えば、１％～７００％の間、１％～６００％の間、１％～５００％の間、１％～４００％の間、１％～３００％の間、１％～２００％の間、１％～１００％の間、１００％～２００％の間、５％～１５０％の間、１０％～５０％の間、１５％～４０％の間、８％～８０％の間、および４％～３０％の間）とすることができる。抜き取られた液体培養培地の体積および添加された交換用液体培養培地（例えば、新しい液体培養培地）の体積は、一部の場合、培養期間の全体または一部にわたり、２４時間毎（または、代替として、約１時間から約２４時間の増分期間、または２４時間を超える増分期間）にほぼ同じに維持される。当分野で公知の通り、液体培養培地の体積が抜き取られる速度（体積／時間の単位）、および交換用液体培養培地（例えば、新しい第２の液体培養培地）の体積が添加される速度（体積／時間の単位）は様々となり得る。液体培養培地の体積が抜き取られる速度（体積／時間の単位）、および交換用液体培養培地（例えば、新しい液体培養培地）の体積が添加される速度（体積／時間の単位）は、ほぼ同じとすることができるか、または異なることができる。

【0081】

あるいは、抜き取られるおよび添加される体積は、培養期間中、各２４時間にわたり（または、代替として、１時間～約２４時間の間の増分期間、または２４時間超の増分期間）変わり得る（例えば、徐々に増加する）。例えば、培養期間にわたり、各２４時間以内（または、代替として、約１時間から２４時間超の間の増分期間、もしくは２４時間超の増分期間）に抜き取られた液体培養培地の体積、および添加される交換用液体培養培地（例えば、添加される新しい液体培養培地）の体積は、培養期間にわたり、バイオリアクターの体積または培養開始時に存在している液体培養培地（例えば、第２の培養培地の体積）の体積の０．５％～約２０％の間である体積から、バイオリアクターの体積または培養開始時に存在している液体培養培地の体積（例えば、第２の液体培養培地の体積）の約２５％～約３００％まで増加させることができる（例えば、増分を徐々に、または時間をずらして）。

【0082】

熟練専門家は、抜き取られた液体培養培地および添加された交換用液体培養培地（例えば、添加された新しい液体培養培地）は、同じタイプの培地（例えば、血清不含の化学的に規定されている培地、または血清不含でタンパク質不含の化学的に規定されている培地）とすることができることを理解するであろう。他の場合、抜き取られる液体培養培地および添加される交換用液体培養培地（例えば、添加される新しい液体培養培地）は異なることができる。

【0083】

液体培養培地の体積は、例えば、該体積中に存在している哺乳動物細胞を排除する分子量のカットオフを備えた滅菌膜に該体積を通して、機械システムを使用する、および／または浸透させるかまたは重力流によって抜き取ることができる。

【0084】

交換用液体培養培地（例えば、新しい第２の液体培養培地）の体積は、例えば、潅流ポンプにより自動的にバイオリアクターに添加することができる。一部の例では、液体培養培地の体積（例えば、哺乳動物細胞が実質的に不含のある体積の第２の液体培養培地）の抜き取りおよび交換用液体培養培地（例えば、新しい液体培養培地）の体積の添加は、潅流バイオリアクターに哺乳動物細胞を供給する少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）に行われない。

【0085】

当業者であれば理解する通り、約５×１０^６細胞／ｍＬ～約１４０×１０^６細胞／ｍＬの間（または、本明細書に記載されている他の細胞密度もしくは細胞密度の範囲のいずれ
か）を目標とする細胞密度に到達するまで第２の細胞培養物を潅流培養する時間の長さは、組換え哺乳動物細胞の成長速度および第２の細胞培養物の初期細胞密度に依存するであろう。例えば、第２の培養物は、約１日間～約９日間の間（例えば、上記の回分培養について列挙されている期間の例示的な範囲のいずれか）の期間、潅流培養することができる。本方法において使用することができる潅流培養の他の例示的なパラメータは、本明細書に記載されている。

【0086】

生産細胞培養物の取得
本明細書に記載されているシードトレイン法は、（ｅ）生産用バイオリアクター中に含まれる第３の培養培地に工程（ｄ）のある体積の第２の細胞培養物を加えて、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの範囲（例えば、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約３．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約２．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約０．７５×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約３．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約２．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．５０×１０^６細胞／ｍＬ～約１．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約３．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約２．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約０．７５×１０^６細胞／ｍＬ～約１．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約３．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約１．０×１０^６細胞／ｍＬ～約２．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．０×１０^６細胞／ｍＬ～約３．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約６
．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約２．５×１０^６細胞／ｍＬ～約３．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約３．０×１０^６細胞／ｍＬ～約４．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約４．０×１０^６細胞／ｍＬ～約５．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約５．０×１０^６細胞／ｍＬ～約６．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約６．０×１０^６細胞／ｍＬ～約７．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約７．０×１０^６細胞／ｍＬ～約８．０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間、約８．０×１０^６細胞／ｍＬ～約９．０×１０^６細胞／ｍＬの間、または約９．０×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの間）の初期細胞密度を有する生産細胞培養物を得る工程をさらに含む。一部の実施形態では、生産細胞培養物の初期細胞密度は、定常状態の生産細胞密度の少なくとも約８％（例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１２％、少なくとも約１４％、少なくとも約１６％、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、少なくとも約２６％、少なくとも約２８％、少なくとも約３０％、少なくとも約３２％、少なくとも約３４％、少なくとも約３６％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％）である。例えば、生産細胞培養物の初期細胞密度は、定常状態の生産細胞密度の約４．０％～約３０％の間（例えば、約４．０％～約２８％の間、約４．０％～約２６％の間、約４．０％～約２４％の間、約４．０％～約２２％の間、約４．０％～約２０％の間、約４．０％～約１８％の間、約４．０％～約１６％の間、約４．０％～約１４％の間、約４．０％～約１２％の間、約４．０％～約１０％の間、約４．０％～約８．０％の間、約４．０％～約６．０％の間、約５．０％～約３０％の間、約５．０％～約２８％の間、約５．０％～約２６％の間、約５．０％～約２４％の間、約５．０％～約２２％の間、約５．０％～約２０％の間、約５．０％～約１８％の間、約５．０％～約１６％の間、約５．０％～約１４％の間、約５．０％～約１２％の間、約５．０％～約１０％の間、約５．０％～約８．０％の間、約１０％～約３０％の間、約１０％～約２８％の間、約１０％～約２６％の間、約１０％～約２４％の間、約１０％～約２２％の間、約１０％～約２０％の間、約１０％～約１８％の間、約１０％～約１６％の間、約１０％～約１４％の間、約１０％～約１２％の間、約１５％～約３０％の間、約１５％～約２８％の間、約１５％～約２６％の間、約１５％～約２４％の間、約１５％～約２２％の間、約１５％～約２０％の間、約１５％～約１８％の間、約２０％～約３０％の間、約２０％～約２８％の間、約２０％～約２６％の間、約２０％～約２４％の間、約２０％～約２２％の間、約２５％～約３０％の間、または約２５％～約２８％の間）とすることができる。当業者が理解することができる通り、生産細胞培養物の場合、約０．２５×１０^６細胞／ｍＬ～約１０×１０^６細胞／ｍＬの範囲の初期細胞密度に到達させるために、第３の培養培地に加える適切な体積の第２の細胞培養物は、生産用バイオリアクター中の第２の細胞培養物の細胞密度および第３の培養培
地の体積から決定することができる。例えば、第３の細胞培養培地に加えられる第２の細胞培養物の体積は、例えば、２．０Ｌ～８００Ｌの間（例えば、本明細書に記載されている第２の細胞培養物の体積の例示的な範囲のいずれか）とすることができる。

【0087】

第３の細胞培養物は、ある体積、例えば、約５０Ｌ～約２０，０００Ｌ（例えば、約５０Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約５０Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約５０Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約５０Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約５０Ｌ～約７，５００Ｌの間、約５０Ｌ～約５，０００Ｌの間、約５０Ｌ～約２，５００Ｌの間、約５０Ｌ～約１，０００Ｌの間、約５０Ｌ～約７５０Ｌの間、約５０Ｌ～約５００Ｌの間、約５０Ｌ～約２００Ｌの間、約５０Ｌ～約１００Ｌの間、約１００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約７５０Ｌの間、約１００Ｌ～約５００Ｌの間、約１００Ｌ～約２５０Ｌの間、約２００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約７５０Ｌの間、約２００Ｌ～約５００Ｌの間、約２００Ｌ～約２５０Ｌの間、約５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約７５０Ｌの間、約７５０Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約７５０Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約７５０Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約７５０Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約７５０Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約７５０Ｌ～約７，５００Ｌの間、約７５０Ｌ～約５，０００Ｌの間、約７５０Ｌ～約２，５００Ｌの間、約７５０Ｌ～約１，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約２，５００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１５，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１５，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、または約１７，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間）の間を有することができる。

【0088】

これらの方法において使用される生産用バイオリアクターは、例えば、１００Ｌ～約２５，０００Ｌの間（例えば、約１００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約１００Ｌ
～約７，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約１００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約１００Ｌ～約５００Ｌの間、約１００Ｌ～約２５０Ｌの間、約２００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約２００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約２００Ｌ～約７５０Ｌの間、約２００Ｌ～約５００Ｌの間、約２００Ｌ～約２５０Ｌの間、約５００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約５００Ｌ～約１，０００Ｌの間、約５００Ｌ～約７５０Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約５，０００Ｌの間、約１，０００Ｌ～約２，５００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約５，０００Ｌ～約７，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約７，５００Ｌ～約１０，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１０，０００Ｌ～約１２，５００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１２，５００Ｌ～約１５，０００Ｌの間、約１５，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約１５，０００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約１５，０００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約１５，０００Ｌ～約１７，５００Ｌの間、約１７，５００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約１７，５００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、約１７，５００Ｌ～約２０，０００Ｌの間、約２０，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの間、約２０，０００Ｌ～約２２，５００Ｌの間、または約２２，５００Ｌ～約２５，０００Ｌの間）の内部容積を有することができる。

【0089】

生産用バイオリアクターは、当分野で公知の任意の適切なバイオリアクター（例えば、大規模潅流バイオリアクター、回分バイオリアクターまたは流加バイオリアクター）とすることができる。例えば、適切な生産用バイオリアクターは、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、およびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手することができる。例えば、大規模生産用バイオリアクター（例えば、潅流、回分、または流加バイオリアクター）は、Ｈｏｌｌｏｗａｙ Ａｍｅｒｉｃａｎ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＭＯ）により製造されており、Ｃｏｔｔｅｒ Ｂｒｏｔｈｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）においてバイオリアクター向けスキッド上に組み立てられている。

【0090】

哺乳動物細胞
組換え哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ハムスターまたはサルの細胞とすることができる。例えば、組換え哺乳動物細胞は、細胞株、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ｓ細胞、Ｃ０２．３１クロー
ナル細胞、Ａ１４．１３クローナル細胞、Ｃ０２．５７クローナル細胞、およびＦ０５．４３クローナル細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ－細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ－細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３ＥおよびＨＥＫ２９３Ｆ）、アフリカミドリサルの腎臓上皮細胞（Ｖｅｒｏ）またはメイディン－ダービーイヌ（コッカースパニエル）腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）とすることができる。

【0091】

組換えタンパク質をコードする核酸は、分子生物学および分子遺伝学において公知の幅広い方法を使用して、組換え哺乳動物細胞を生産するために哺乳動物細胞に導入することができる。非限定例は、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスまたはレトロウイルス感染）および電気穿孔法を含む。一部の例では、組換えタンパク質をコードする核酸は、組換え哺乳動物細胞（一過性トランスフェクション）の染色体に安定的に一体化されない一方、他の組換え哺乳動物細胞では、核酸が一体化される。代替として、または追加的に、組換えタンパク質をコードする核酸は、プラスミドにおいて、および／または哺乳動物の人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）において存在することができる。代替として、または追加的に、核酸はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）を使用して、哺乳動物細胞に導入することができる。核酸は、促進剤の配列（例えば、β－アクチン促進剤およびＣＭＶ促進剤のような強力な促進剤、または誘発性促進剤）に連結させて操作可能となる。核酸を含むベクターはまた、所望の場合、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはネオマイシンに、哺乳動物細胞に対する耐性を付与する遺伝子）も含むことができる。

【0092】

液体培養培地
液体培養培地（培養培地）は、当分野において公知である。液体培養培地は、哺乳動物の血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンまたは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンおよび上皮成長因子）を補給することができる。本明細書に記載されている液体培養培地のいずれも、動物に由来する構成成分を含まない液体培養培地、血清不含の液体培養培地、血清を含む液体培養培地、化学的に規定されている液体培養培地、およびタンパク質不含の液体培養培地：からなる群から選択することができる。化学的に規定されている液体培養培地、動物に由来する構成成分を含まない液体培養培地、血清不含の液体培養培地、および血清を含む液体培養培地の非限定例は、市販されている。

【0093】

液体培養培地は、通常、エネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、基礎となる一式の２０種のアミノ酸およびシステイン）、ビタミンおよび／または低濃度で必要とされる他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を含む。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は、所望の場合、例えば、哺乳動物のホルモンまたは成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩および緩衝剤（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩の塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジンおよびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、ならびに／またはこれらの添加物の任意の組合せを補給することができる。

【0094】

本明細書に記載されているいずれの方法のいずれの工程においても、細胞（例えば、哺乳動物細胞）を培養するために使用することができる、幅広い様々な液体培養培地が当分野で公知である。本方法においてやはり有用とすることができる培地の構成成分は、以下に限定されないが、化学的に規定されている（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２種またはそれ以上のアミノ酸）およびＣＤ成長因子を含む。液体組織培養培地および培地の構成成分の追加例は、当分野で公知である。

【0095】

組換え哺乳動物細胞の培養物から得られる液体培養培地は、細胞および／またはウイルスが実質的に不含の液体培養培地を得るためにろ過または浄化することができる。細胞を除去するために液体培養培地をろ過または浄化する方法は、当分野で公知である（例えば、０．２μｍのろ過、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ（商標））システム、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システム、または米国仮特許出願第６１／８７８，５０２号に記載されているシステムのいずれかを使用するろ過）。組換え細胞はまた、遠心分離を使用して、実質的に細胞不含である液体培養培地である上澄み液を除去して、または液体培養培地を含む容器（例えば、槽）の重力底部に沈殿させて、沈殿した組換え哺乳動物細胞から離れた液体培養培地（実質的に細胞不含である液体培養培地）を除去することにより液体培養培地から抜き取ることもできる。一部の実施形態では、第１の培養培地、第２の培養培地、第３の培養培地および第４の培養培地の１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つまたはすべて）が同一である。

【0096】

本明細書に記載されている方法のいずれかにおける工程のいずれかにおいて使用される液体培養培地は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の液体培養培地のタイプのいずれかとすることができる。本明細書に記載されている組換えタンパク質を単離するための例示的な方法のいずれにおいても、生産細胞培養物から得られた液体培養培地は、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に供給される前に、第２の流体（例えば、緩衝液）を添加することによって希釈することができる。

【0097】

実質的に細胞不含である組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む液体培養培地は、組換えタンパク質を単離する前に（例えば、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に液体培養培地を供給する前に）、少なくとも１日間（例えば、少なくとも約２日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、または少なくとも約３０日間）、貯蔵することができる（例えば、約１５℃未満の温度（例えば、約１０℃未満、約４℃未満、約０℃未満、約－２０℃未満、約－５０℃未満、約－７０℃未満、または約－８０℃未満）で）。あるいは、一部の例において、実質的に細胞不含である組換えタンパク質を含む液体培養培地が、生産用バイオリアクターから直接、組換えタンパク質を単離するために使用されるシステムに供給される（例えば、ろ過または浄化工程の後に、生産用バイオリアクターから直接、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に供給される）（例えば、生産用バイオリアクターから直接、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に供給される））。

【0098】

組換えタンパク質
組換えタンパク質は、組換え治療用タンパク質とすることができる。本明細書において提供される方法によって生産することができる組換え治療用タンパク質の非限定例は、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含む）、抗体または抗体断片（例えば、本明細書に記載されている抗体断片のいずれか）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ－ガラクトシダーゼ）、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）、またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターフェロンアルファまたはベータ）、または免疫原性または抗原性タンパク質またはタンパク質断片（例えば、ワクチンで使用するためのタンパク質）を含む。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つの多機能組換えタンパク質の足場を含む、操作された抗原結合性ポリペプチドとすることができる（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３巻：２４５～２５５頁、２００９年に記載されている組換え抗原－結合タンパク質；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（それらの全体が参照により組み入れられている）を参照されたい）。抗体である組換え治療用タンパク質の非限定例は、以下を含む：パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムバブ、アデカツムマブ、
アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アルイロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ、トシリズマブ、バシリジマブ、ベクツモマブ、ベリムバブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、カナキヌバム、セルトリズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴモマブ、イムガツムマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、ツコツズマブ、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブおよびザツキシマブ。本明細書に記載されている方法によって生産することができる組換え治療用抗体の追加例は、当分野で公知である。本方法によって生産することができる組換え治療用タンパク質のさらなる非限定例は、以下を含む：アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアルファ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ－１ａ、ダルベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固因子ＩＸ、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ－１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類似体、メカセルミン、因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩａ、抗トロンビンＩＩＩ、タンパク質Ｃ、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン－１１、イデュルスルファーゼ、ガルスルファーゼ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、チロトロピンアルファ（例えば、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））およびアルテプラーゼ。本方法によって生産することができる組換えタンパク質の追加例は、酸α－グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼアルファ（例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））、α－Ｌ－イズロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、ガラクトース－６－スルファターゼ、酸β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－ホスホトランスフェラーゼ、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、酸リパーゼ、リソソーム酸セラミダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、β－グルコシダーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＣｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））、ガラクトシルセラミダーゼ、α－ガラクトシダーゼ－Ａ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、酸β－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、およびヘキソサミニダーゼＢを含む。

【0099】

分泌され可溶性組換えタンパク質は、細胞（例えば、哺乳動物細胞）から液体培養培地を除去する、または他には物理的に分離することにより、液体培養培地から回収することができる。細胞（例えば、哺乳動物細胞）から液体培養培地を除去するための様々な異なる方法が、例えば、遠心分離、ろ過、ピペット操作および／または吸引を含めて、当分野で公知である。次に、分泌された組換え治療用タンパク質は、様々なタイプのクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、または陰イオン交換クロマトグラフィー）および／またはろ過（例えば、分子量カットオフろ過）を含めた、様々な生化学的技法を使用して、液体培養培地から回収および単離することができる。

【0100】

培養パラメータ
本明細書に記載されている回分または潅流培養工程のいずれも、約３１℃～約４０℃の温度で行うことができる。熟練専門家は、この温度は、培養工程の間の指定時間点に、例
えば、１時間毎または毎日の基準で変えることができることを理解するであろう。例えば、この温度は、細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）を含む槽（例えば、バイオリアクター）の初期播種後、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、または約２０日間もしくはそれ以上で変えることができるか、またはシフトする（例えば、向上させるかまたは低下させる）ことができる。例えば、温度は、上方（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）にシフトすることができる。例えば、温度は、下方（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）にシフトすることができる。

【0101】

本明細書に記載されている潅流および回分培養工程は、槽、潅流バイオリアクターまたは生産用バイオリアクター中の液体培養培地をせいぜいまたは約１５％のＣＯ_２（例えば、せいぜいもしくは約１４％ＣＯ_２、１２％ＣＯ_２、１０％ＣＯ_２、８％ＣＯ_２、６％ＣＯ_２、５％ＣＯ_２、４％ＣＯ_２、３％ＣＯ_２、２％ＣＯ_２、またはせいぜいもしくは約１％ＣＯ_２）を含む大気に曝露させる工程をさらに含むことができる。槽、潅流バイオリアクターまたは生産用バイオリアクターは、制御されている加湿雰囲気（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を超える湿度で、または１００％の湿度で）中で細胞培養物をインキュベートすることができる。潅流バイオリアクターおよび生産用バイオリアクターはまた、バイオリアクターからある体積の液体培養培地を抜き取ることができる機械装置、および場合によりバイオリアクターから液体培養培地を移すプロセス中に、液体培養培地から細胞を抜き取る機械装置内にフィルター（例えば、ＡＴＦシステム）を備えることもできる。

【0102】

本明細書に記載されている槽、潅流バイオリアクターまたは生産用バイオリアクターのいずれかの内表面は、少なくとも１種のコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリスチレンおよびラミニンからなる少なくとも１種のコーティング）、ならびに当分野で公知の通り、液体培養培地にＯ_２、ＣＯ_２およびＮ_２を吹き込むための１つまたはそれ以上の導入口、該液体培養培地を撹拌するためのかき混ぜ装置、および１つまたはそれ以上のセンサー（例えば、溶解Ｏ_２および溶解ＣＯ_２のセンサー）を有することできる。

【0103】

組換えタンパク質の作製方法
上記の例示的なシードトレイン法のいずれか、および（ｆ）組換え哺乳動物細胞が組換えタンパク質を分泌することが可能となる条件下で生産細胞培養物を潅流培養して、生産細胞培養物から組換えタンパク質を収穫する追加の工程を含む、組換えタンパク質を生産する方法も提供される。

【0104】

組換えタンパク質を生産する他の方法は、本明細書において提供されている例示的なシードトレイン法のいずれか、および（ｆ）組換え細胞が組換えタンパク質を分泌するのを可能にする条件下で、生産細胞培養物を回分培養または流加培養して、生産細胞培養物から組換えタンパク質を収穫する追加の工程を含む。

【0105】

生産細胞培養物の潅流培養は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の例示
的な潅流培養法のいずれかを使用して行うことができる。例えば、生産細胞培養物（第３の培養培地に第２の細胞培養物を加えた後）の産生と生産細胞培養物が定常状態の生産細胞密度に達する時間との間の期間は、約１．５日間～約５．０日間の間（例えば、約１．５日間～約４．０日間の間、約１．５日間～約３．５日間の間、約１．５日間～約３．０日間の間、約１．５日間～約２．５日間の間、約１．５日間～約２．０日間の間、約２．０日間～約５．０日間の間、約２．０日間～約４．５日間の間、約２．０日間～約４．０日間の間、約２．０日間～約３．５日間の間、約２．０日間～約３．０日間の間、約２．０日間～約２．５日間の間、約２．５日間～約５日間の間、約２．５日間～約４．５日間の間、約２．５日間～約４．０日間の間、約２．５日間～約３．５日間の間、約２．５日間～約３．０日間の間、約３．０日間～約５．０日間の間、約３．０日間～約４．５日間の間、約３．０日間～約４．０日間の間、約３．０日間～約３．５日間の間、約３．５日間～約５．０日間の間、約３．５日間～約４．５日間の間、約３．５日間～約４．０日間の間、約４．０日間～約５．０日間の間、約４．０日間～約４．５日間の間、または約４．５日間～約５．０日間の間）である。生産細胞培養物の潅流培養は、例えば、５．０日間～２００日間の間（例えば、５．０日間～１９０日間の間、５．０日間～１８０日間の間、５．０日間～１７０日間の間、５．０日間～１６０日間の間、５．０日間～１５０日間の間、５．０日間～１４０日間の間、５．０日間～１３０日間の間、５．０日間～１２０日間の間、５．０日間～１１０日間の間、５．０日間～１００日間の間、５．０日間～９０日間の間、５．０日間～８０日間の間、５．０日間～７０日間の間、５．０日間～６０日間の間、５．０日間～５０日間の間、５．０日間～４０日間の間、５．０日間～３０日間の間、５．０日間～２０日間の間、５．０日間～１０日間の間、１０日間～２００日間の間、１０日間～１９０日間の間、１０日間～１８０日間の間、１０日間～１７０日間の間、１０日間～１６０日間の間、１０日間～１５０日間の間、１０日間～１４０日間の間、１０日間～１３０日間の間、１０日間～１２０日間の間、１０日間～１１０日間の間、１０日間～１００日間の間、１０日間～９０日間の間、１０日間～８０日間の間、１０日間～７０日間の間、１０日間～６０日間の間、１０日間～５０日間の間、１０日間～４０日間の間、１０日間～３０日間の間、１０日間～２０日間の間、２０日間～２００日間の間、２０日間～１９０日間の間、２０日間～１８０日間の間、２０日間～１７０日間の間、２０日間～１６０日間の間、２０日間～１５０日間の間、２０日間～１４０日間の間、２０日間～１３０日間の間、２０日間～１２０日間の間、２０日間～１１０日間の間、２０日間～１００日間の間、２０日間～９０日間の間、２０日間～８０日間の間、２０日間～７０日間の間、２０日間～６０日間の間、２０日間～５０日間の間、２０日間～４０日間の間、３０日間～２００日間の間、３０日間～１９０日間の間、３０日間～１８０日間の間、３０日間～１７０日間の間、３０日間～１６０日間の間、３０日間～１５０日間の間、３０日間～１４０日間の間、３０日間～１３０日間の間、３０日間～１２０日間の間、３０日間～１１０日間の間、３０日間～１００日間の間、３０日間～９０日間の間、３０日間～８０日間の間、３０日間～７０日間の間、３０日間～６０日間の間、３０日間～５０日間の間、３０日間～４０日間の間、４０日間～２００日間の間、４０日間～１９０日間の間、４０日間～１８０日間の間、４０日間～１７０日間の間、４０日間～１６０日間の間、４０日間～１５０日間の間、４０日間～１４０日間の間、４０日間～１３０日間の間、４０日間～１２０日間の間、４０日間～１１０日間の間、４０日間～１００日間の間、４０日間～９０日間の間、４０日間～８０日間の間、４０日間～７０日間の間、４０日間～６０日間の間、４０日間～５０日間の間、５０日間～２００日間の間、５０日間～１９０日間の間、５０日間～１８０日間の間、５０日間～１７０日間の間、５０日間～１６０日間の間、５０日間～１５０日間の間、５０日間～１４０日間の間、５０日間～１３０日間の間、５０日間～１２０日間の間、５０日間～１１０日間の間、５０日間～１００日間の間、５０日間～９０日間の間、５０日間～８０日間の間、５０日間～７０日間の間、５０日間～６０日間の間、７５日間～２００日間の間、７５日間～１７５日間の間、７５日間～１５０日間の間、５０日間～１２５日間の間、５０日間～１００日間の間、５０日間～７５日間の間、７５日間～２００日間の間、７５日間～１７５日間の間、７５日
間～１５０日間の間、７５日間～１２５日間の間、７５日間～１００日間の間、１００日間～２００日間の間、１００日間～１７５日間の間、１００日間～１５０日間の間、１００日間～１２５日間の間、１２５日間～２００日間の間、１２５日間～１７５日間の間、１２５日間～１５０日間の間、１５０日間～２００日間の間、１５０日間～１７５日間の間、または１７５日間～２００日間の間）の期間、継続することができる。

【0106】

培養培地は、連続的または周期的な除去によって生産用バイオリアクターから除去（例えば、潅流培養中、同時にまたは様々な頻度で）することができる。培養培地は、手作業により（例えば、ピペット操作により）、またはポンプシステム（例えば、交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）ろ過システムまたはタンジェンシャル流体ろ過）により除去することができる。

【0107】

組換えタンパク質の単離
本明細書に記載されている組換えタンパク質を生産する方法は、（潅流培養中）、生産用バイオリアクターから除去される培養培地から組換えタンパク質を単離する工程をさらに含むことができる。生産用バイオリアクターから除去された培養培地から組換えタンパク質を単離する工程は、捕捉、精製、ポリッシング、ウイルスの不活性化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節、ならびにろ過：からなる群から選択される、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つ）の単位操作の実施を含むことができる。例えば、組換えタンパク質を単離するための１つまたはそれ以上の単位操作は、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に組換えタンパク質を含む流体を流すことにより行うことができる。培養培地から組換えタンパク質を単離する工程は、統合された連続法（例えば、例示的な方法は、以下の出願の各々の全内容が参照により本明細書に組み入れられている、米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号、米国仮特許出願第６１／８５６，３９０号、米国特許出願第１４／１９５，４８１号、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１９９０９および米国仮特許出願第６１／９２８，９０６号に記載されている）を使用して行うことができる。例示的な方法は、実質的に細胞不含である組換えタンパク質（例えば、組換え治療用タンパク質）を含む液体培養培地（例えば、生産用バイオリアクターから除去して、ＡＴＦシステムによりろ過した液体培養培地）を得る工程を含むことができる。いくつかの工程は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを含むマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）に、液体培養培地（例えば、生産用バイオリアクターから除去して、ＡＴＦシステムによりろ過した液体培養培地）を連続的に供給する工程を含み、この場合、これらの工程を統合して、液体培養培地から単離組換えタンパク質であるＭＣＣＳ由来の溶離液に連続的に流す。いくつかの工程は、液体培養培地（例えば、生産用バイオリアクターから除去してＡＴＦシステムによりろ過した液体培養培地）を第１のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ１）に連続的に供給する工程、ＭＣＣＳ１を使用して、液体培養培地から組換えタンパク質を捕捉する工程、組換えタンパク質を含むＭＣＣＳ１からの溶離液を生産して第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ２）に該溶離液を連続的に供給する工程、および続いて、組換えタンパク質（ＭＣＣＳ２から）を溶出させて、これにより単離組換えタンパク質を生産する工程を含み、この場合、これらの方法を統合して、液体培養培地から単離組換えタンパク質へと連続的に流す。一部の実施形態は、単離組換えタンパク質を医薬剤に製剤化する工程をさらに含む。

【0108】

これらの方法（ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）のいずれかに使用することができるＭＣＣＳの非限定的な態様は、米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号、米国仮特許出願第６１／８５６，３９０号、米国特許出願第１４／１９５，４８１号、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１９９０９および米国仮特許出願第６１／９２８，９０６号に記載されている（各々が、参照により本明細書に組み入れられている）。これらの例示的な方法の様々な追加の態様は以下に記載されており、本明細書において
提供されている方法の任意の組合せにおいて非限定的に使用することができる。提供されている方法の例示的な態様は以下に記載されている；しかし、当業者は、追加の工程を本明細書に記載されている方法に追加することができること、および他の材料を使用して、本明細書に記載されている方法の工程のいずれかを行うことができることを理解するであろう。

【0109】

本明細書に記載されている例示的な方法は、ＭＣＣＳ、または２つもしくはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２）の使用を含むことができる。ＭＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラム、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜との組合せを含むことができる。非限定例では、ＭＣＣＳ（例えば、本明細書における方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）は、４つのクロマトグラフィーカラム、３つのクロマトグラフィーカラムと１つのクロマトグラフィー膜、３つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィー膜、および２つのクロマトグラフィーカラムと１つのクロマトグラフィー膜を含むことができる。クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の組合せの追加例は、非限定的に、当業者によりＭＣＣＳ（例えば、本明細書に記載されている方法のいずれかにおける、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）において使用する場合に考えることができる。ＭＣＣＳに存在している個々のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一（例えば、同じ形状、体積、樹脂、捕捉機構および単位操作を有する）とすることができるか、または異なる（例えば、異なる形状、体積、樹脂、捕捉機構および／または単位操作の１つまたはそれ以上を有する）ことができる。ＭＣＣＳ（例えば、本明細書に記載されている方法のいずれかにおける、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）に存在している個々のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一の単位操作（例えば、捕捉、精製またはポリッシングという単位操作）、または異なる単位操作（例えば、捕捉、精製、ポリッシング、ウイルスの不活性化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節、ならびにろ過から例えばなる群から選択される異なる単位操作）を行うことができる。例えば、本明細書に記載されている方法の例では、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１における少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質を捕捉する単位操作を行う。

【0110】

本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて使用されている、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）における１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムは、実質的に同じ樹脂体積を有することができるか、または異なる樹脂体積を有することができる。本明細書に記載されている方法のいずれかにおける、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用の間に、１つまたはそれ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４）の異なるタイプの緩衝液を使用することができる。当分野で公知の通り、本明細書に記載されている方法におけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２に使用される１つまたはそれ以上のタイプの緩衝液は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／もしくはＭＣＣＳ２のクロマトグラフィーカラムならびに／またはクロマトグラフィー膜中に存在している趣旨、組換えタンパク質の生物物理学性質、ならびにＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／もしくはＭＣＣＳ２のうちの特定のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜によって行われる単位操作（例えば、本明細書に記載されている例示的な単位操作のいずれか）に依存するであろう。本明細書に記載されている方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に使用される緩衝液の体積およびタイプは、当業者により決定することもできる（例えば、以下に詳細に論じられている）。例えば、本明細書に
記載されている方法のいずれかにおけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２の使用中に使用される緩衝液の体積およびタイプは、単離組換えタンパク質において、以下：組換えタンパク質の総収率、組換えタンパク質の活性、組換えタンパク質の純度レベル、および組換えタンパク質を含む流体（例えば、液体培養培地）に由来する生物学的汚染物質の除去（例えば、活性なウイルス、マイコバクテリア、酵母、細菌または哺乳動物細胞が存在しない）の１つまたはそれ以上を最適化するために選択することができる。

【0111】

ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）とすることができる。ＰＣＣＳは、例えば、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムから組換えタンパク質の連続的な溶出を可能にするため、切り替えられる２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（例えば、３つまたは４つのカラム）を含むことができる。ＰＣＣＳは、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を含むことができる。カラム操作（周期）は、一般に、ロード、洗浄、溶出および再生工程からなる。ＰＣＣＳでは、複数のカラムが使用されて、同一工程を別々で、および周期的に連続して実施される。カラムを直列で操作するので、１つのカラムを通る流れおよびそれからの洗浄液は、別のカラムにより捕捉される。ＰＣＣＳのこの特異な特徴により、回分式クロマトグラフィー中に典型的な、動的結合能力の代わりに、静電的結合能力に近い樹脂の搭載が可能になる。連続的な周期および溶出の結果として、ＰＣＣＳに入る流体は、連続的に処理され、組換えタンパク質を含む溶離液は連続的に生産される。

【0112】

カラム切り替え戦略は、ＰＣＣＳ周期における１つの工程から別の工程に進めるために使用される。ＰＣＣＳにおいて使用することができるカラムの切り替えの例は、米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号、米国仮特許出願第６１／８５６，３９０号、米国特許出願第１４／１９５，４８１号、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１９９０９および米国仮特許出願第６１／９２８，９０６号に記載されている。ＰＣＣＳにおいて、ＰＣＣＳ中に存在しているそれぞれのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜上の組換えタンパク質の滞留時間（ＲＴ）は、第１のカラム／膜からすり抜けたもの（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）がＰＣＣＳ中の別のカラム／膜上に捕捉されるので、カラム／膜のサイズを向上させることなく、低下させることができる。連続法のシステムは、以下の式：Ｖ＝Ｄ^＊ＲＴを使用して、カラム／膜体積（Ｖ）およびＲＴを変えることにより、任意の潅流速度（Ｄ）における液体培養培地を処理するよう設計することができる。

【0113】

本明細書に記載されている方法において使用されるＭＣＣＳまたはＭＣＣ１および／もしくはＭＣＣＳ２によって行うことができる１つまたはそれ以上の単位操作は、例えば、組換えタンパク質の捕捉、組換えタンパク質を含む流体中に存在しているウイルスの不活性化、組換えタンパク質の精製、組換えタンパク質のポリッシング、組換えタンパク質を含む流体の保管（例えば、本明細書に記載されている例示的な休止タンクのいずれかを使用する）、組換えタンパク質を含む流体からの粒子物質および／もしくは細胞のろ過または除去、ならびに組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節を含む。一部の実施形態では、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、組換えタンパク質を捕捉する単位操作を行う、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含む。捕捉の単位操作は、例えば、捕捉機構を利用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂を使用して行うことができる。捕捉機構の非限定例には、タンパク質Ａ結合捕捉機構、抗体または抗体断片結合捕捉機構、基質－結合捕捉機構、アプタマー－結合捕捉機構、タグ－結合捕捉機構（例えば、ポリ－Ｈｉｓタグをベースとする捕捉機構）、および補因子－結合捕捉機構が含まれる。捕捉はまた、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブク
ロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うために使用することができる樹脂を使用して行うこともできる。組換えタンパク質を捕捉するために使用することができる非限定的な樹脂は、本明細書に記載されている。組換えタンパク質を捕捉するために使用することができる樹脂の追加例は、当分野で公知である。

【0114】

組換えタンパク質を含む流体中に存在しているウイルスを不活性化する単位操作は、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２（例えば、これらは、例えば、クロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー膜、または少なくとも、３０分間（例えば、約３０分間～１．５時間の間の時間、約３０分間～１．２５時間の間の時間、約０．７５時間～１．２５時間の間の時間、または約１時間の時間）の期間、約３．０～５．０の間のｐＨ（例えば、約３．５～約４．５の間、約３．５～約４．２５の間、約３．５～約４．０の間、約３．５～約３．８の間、または約３．７５）で、組換えタンパク質を含む流体をインキュベートすることが可能な保管タンクを含む）を使用して行うことができる。

【0115】

組換えタンパク質を精製する単位操作は、例えば、捕捉システムを利用する樹脂を含む、例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を使用して行うことができる。捕捉機構の非限定例には、タンパク質Ａ結合捕捉機構、抗体または抗体断片結合捕捉機構、基質－結合捕捉機構、アプタマー－結合捕捉機構、タグ－結合捕捉機構（例えば、ポリ－Ｈｉｓタグをベースとする捕捉機構）、および補因子－結合捕捉機構が含まれる。精製はまた、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うために使用することができる樹脂を使用して行うこともできる。組換えタンパク質を精製するために使用することができる非限定的な樹脂は、本明細書に記載されている。組換えタンパク質を精製するために使用することができる樹脂の追加例は、当分野で公知である。

【0116】

組換えタンパク質をポリッシングする単位操作は、例えば、陽イオン交換、陰イオン交換、モレキュラーシーブクロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うために使用することができる樹脂を含む、例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を使用して行うことができる。組換えタンパク質をポリッシングするために使用することができる非限定的な樹脂は、本明細書に記載されている。組換えタンパク質をポリッシングするために使用することができる樹脂の追加例は、当分野で公知である。

【0117】

組換えタンパク質を含む流体をろ過する単位操作は、例えば、モレキュラーシーブ樹脂を含む、フィルターまたはクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜を含む、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を使用して行うことができる。当分野で公知の通り、沈殿した任意の物質および／または細胞（例えば、沈殿物した変性（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）タンパク質；沈殿物した望ましくない宿主細胞タンパク質；沈殿物した脂質；細菌；酵母細胞；真菌細胞；マイコバクテリア；および／または哺乳動物細胞）を除去することが可能な、広範囲のサブミクロンフィルター（例えば、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ、約０．２μｍ、０．２μｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満または１０ｎｍ未満の孔径を有するフィルター）が当分野で利用可能である。約０．２μｍまたは０．２μｍ未満の孔径を有するフィルターは、組換えタンパク質を含む流体から細菌を効果的に除去することが知られている。当分野で公知の通り、モレキュラーシーブ樹脂を含むクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質を含む流体をろ過する単位操作を行うために、ＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）において使用することもできる。

【0118】

組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節する単位操作は、組換えタンパク質を含む流体に新しい緩衝溶液を添加する緩衝液調整貯蔵器（例えば、インライン型緩衝液調整貯蔵器）を含みそれを利用するＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２）を使用して行うことができる（例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２内のカラム間、または最後から２番目のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ１）における最後のカラムの後、および組換えタンパク質を含む流体が、次のＭＣＣＳ（例えば、ＭＣＣＳ２）の最初のカラムに供給される前）。

【0119】

本明細書に記載されている例示的な方法では、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、２つまたはそれ以上の単位操作を行うことができる。例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも以下の単位操作：組換えタンパク質の捕捉および組換えタンパク質を含む流体中に存在しているウイルスの不活性化；組換えタンパク質の捕捉；組換えタンパク質を含む流体中に存在しているウイルスの不活性化および組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨの調節；組換えタンパク質の精製および組換えタンパク質のポリッシング；組換えタンパク質の精製、組換えタンパク質のポリッシングおよび組換えタンパク質を含む流体のろ過または組換えタンパク質を含む流体に由来する沈殿物および／または粒子物質の除去、および組換えタンパク質の精製、組換えタンパク質のポリッシング、組換えタンパク質を含む流体のろ過または組換えタンパク質を含む流体に由来する沈殿物および／または粒子物質の除去、および組換えタンパク質を含む液体のイオン濃度および／またはｐＨの調節をそれぞれ行うことができる。

【0120】

本明細書に記載されている例示的な方法では、液体培養培地からの組換えタンパク質の捕捉は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を使用して行われる。当分野で理解される通り、組換えタンパク質の捕捉を達成するために、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１における少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜は、捕捉機構（例えば、本明細書に記載されている例示的な捕捉機構のいずれか）を利用する樹脂を含まなければならないか、または陽イオン交換、陰イオン交換、モレキュラーシーブまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うことが可能な樹脂を含む。例えば、組換えタンパク質が抗体または抗体断片である場合、捕捉システムは、タンパク質Ａ結合捕捉機構または抗原結合捕捉機構（この場合、捕捉抗原は組換え抗体または抗体断片によって特異的に認識される）とすることができる。組換えタンパク質が酵素である場合、捕捉機構は、組換え酵素、組換え酵素を捕捉する酵素の基質、組換え酵素を捕捉する酵素の補因子を捕捉する酵素に特異的に結合する抗体または抗体断片を使用することができるか、または組換え酵素がタグを含む場合、組換え酵素に存在しているタグに特異的に結合するタンパク質、金属キレートまたは抗体（または、抗体断片）を使用することができる。組換えタンパク質を捕捉するために使用することができる、非限定的な樹脂は、本明細書に記載されており、組換えタンパク質を捕捉するために使用することができるさらなる樹脂は、当分野で公知である。タンパク質Ａ結合捕捉機構を利用する樹脂の非限定例の１つは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＪＳＲ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ Ａｍｓｐｈｅｒｅ ＰｒｏＡ ＪＷＴ２０３（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、およびＫａｎｅｋａ ＫａｎＣａｐ Ａ（大阪、日本）である。

【0121】

本明細書に記載されている例示的な方法の一部では、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、低いｐＨ（例えば、ｐＨが、４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満または３．０未満）で例えば約１分間から１．５時間（例えば、約１時間）、組換えタンパク質を含む流体を保管する貯蔵器を含むことができ、組換えタンパク質を含む流体に存在しているウイルスを不活性化する。当業者に
より理解される通り、様々な他の手段を使用し、ウイルスを不活性化する単位操作を行うことができる。例えば、組換えタンパク質を含む流体の紫外線照射も、ウイルスを不活性化する単位操作を行うために使用することができる。

【0122】

ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、４つのクロマトグラフィーカラムを含むＰＣＣＳを含むことができ、この場合、４つのクロマトグラフィーカラムの少なくとも３つは、液体培養培地からの組換えタンパク質を捕捉する単位操作を行う（例えば、捕捉の単位操作（例えば、本明細書に記載されているもののいずれか）を行うことが可能な樹脂を含む少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムのいずれかを含むＭＣＣＳを使用する）。これらの例では、ＰＣＣの第４のカラムは、組換えタンパク質を含む流体中のウイルスを不活性化する単位操作（例えば、組換えタンパク質を含む流体のウイルスの不活性化を実現するために使用することができる、本明細書に記載されている例示的なカラムのいずれか）を行うことができる。

【0123】

本明細書に記載されている例示的な方法におけるＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、組換えタンパク質の精製およびポリッシングの単位操作を行うために使用することができる。例えば、ＭＣＣＳ２は、組換えタンパク質の精製およびポリッシングの操作を行うために使用することができ、ＭＣＣＳ２からの溶離液は単離組換えタンパク質である。ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、組換えタンパク質を精製する単位操作を行うために使用することができる、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つまたは４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜、および組換えタンパク質をポリッシングする単位操作を行うために使用することができる、少なくとも１つ（例えば、２つ、３つまたは４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含むことができる。

【0124】

組換えタンパク質を精製する単位操作を行うために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、捕捉機構（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の捕捉機構のいずれか）を利用する樹脂、または陰イオン交換、陽イオン交換、モレキュラーシーブもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うために使用することができる樹脂を含むことができる。組換えタンパク質をポリッシングする操作の単位を行うために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、陰イオン交換、陽イオン交換、モレキュラーシーブもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の、陰イオン交換、陽イオン交換、モレキュラーシーブもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うための例示的な樹脂のいずれか）を行うために使用することができる樹脂を含むことができる。ポリッシングする単位操作を行うために使用することができる１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質を含む流体中に存在している不純物に選択的に結合するかまたは保持する樹脂を含むことができる。

【0125】

本明細書に記載されている例示的な方法のいくつかの例では、ＭＣＣＳ２は、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含むＰＣＣＳを含み、例えばこの場合、ＰＣＣＳにおける３つのクロマトグラフィーカラムは、組換えタンパク質を精製する（例えば、タンパク質を精製する操作の単位を行うために使用することができる、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを使用して）単位操作を行い、ＰＣＣＳにおけるクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質をポリッシングする単位操作を行う。これらの例において、組換えタンパク質をポリッシングする単位操作を行うために使用することができるＰＣＣＳにおけるクロマトグラフィー膜は、組換えタンパク質をポリッシングする単位操作を行うために使用することができる、本明細書に記載されている例示的なクロマトグラフィー膜のいずれかとすることができる。本明細書に記載されているカラ
ムの切り替え方法のいずれかを使用して、この例におけるＰＣＣＳの最初の３つのクロマトグラフィーカラムおよびクロマトグラフィー膜を切り替えることができる時期を決定することができる。

【0126】

例示的な組換えタンパク質単離システム
本明細書に記載されている方法を行うのに有用で、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２を含む生物学的製造システムの例は、米国仮特許出願番号、米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号、米国仮特許出願第６１／８５６，３９０号、米国特許出願第１４／１９５，４８１号、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１９９０９および米国仮特許出願第６１／９２８，９０６号に記載されている（参照により組み入れられている）。全体のシステムは、例えば、合計４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のクロマトグラフィーカラムを含むことができる。例えば、ＭＣＣＳ、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０のクロマトグラフィーカラムを含むことができる（または、それぞれが、含むことができる）。

【0127】

例えば、有用なシステムは、入り口を含むＭＣＣＳ１、ならびに出口を含むＭＣＣＳ２、または入り口および出口を含むＭＣＣＳを含むことができる。一部の実施形態では、ＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２は、互いに流体連通している。これらのシステムはまた、流体がＭＣＣＳ１およびＭＣＣＳ２から入り口に入って通過することができるよう構成されており、出口から製造システムを出て行く。

【0128】

これらの例示的なシステムでは、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、流体（例えば、実質的に細胞不含である生産用バイオリアクターからの液体培養培地）が、そこからそれぞれＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に入って通過することができる、入り口を含むことができる。この入り口は、こうした目的のため、当分野で公知の任意の構造とすることができる。この構造は、例えば、流体用導管の入り口への挿入後、流体が、入り口から流体がかなり漏出することなく入り口からＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に入るよう、流体用導管を挿入することを可能にする、ねじ山、リブ（ｒｉｂｂｉｎｇ）または封止を含むことができる。本システムにおいて使用することができる非限定的な入り口は、公知であり、当業者により理解されよう。

【0129】

ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜、および入り口を含むことができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、本明細書に記載されている例示的なＭＣＣＳのいずれかとすることができるか、または本明細書に記載されているＭＣＣＳ（任意の組合せ）の例示的な特徴のいずれかの１つまたはそれ以上を有する。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の、例示的な形状、サイズ、体積（ベッドボリューム）および／または単位操作のいずれかの１つまたはそれ以上を有することができる。

【0130】

ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の、例示的な樹脂のいずれかの１つまたはそれ以上を含むことができる。例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の１つまたはそれ以上に含まれている樹脂は、捕捉機構（例えば、タンパク質Ａ結合捕捉機構、タンパク質Ｇ結合捕捉機構、抗体または抗体断片結合捕捉機構、基質結合捕捉機構、補因子結合捕捉機構、アプタマー結合捕捉機構、および／またはタグ結合捕捉機構）を利用する樹脂とすることができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１のクロマトグラフィーカラムお
よび／またはクロマトグラフィー膜の１つまたはそれ以上に含まれている樹脂は、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、モレキュラーシーブ樹脂、もしくは疎水性相互作用樹脂、またはそれらの任意の組合せとすることができる。組換えタンパク質を精製するために使用することができる樹脂の追加例は当分野で公知であり、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の１つまたはそれ以上に含まれる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一および／または異なる樹脂（例えば、組換えタンパク質の精製に使用するために、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の樹脂のいずれか）を含むことができる。

【0131】

ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在している２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂は、１つまたはそれ以上の単位操作（例えば、組換えタンパク質の捕捉、組換えタンパク質の精製、組換えタンパク質のポリッシング、ウイルスの不活性化、組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節または組換えタンパク質を含む流体のろ過）を行うことができる。非限定例では、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、流体（例えば、液体培養培地）からの組換えタンパク質の捕捉、および組換えタンパク質を含む流体中に存在しているウイルスの不活性化の単位操作を行うことができる。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知のさらなる数の単位操作のうちの２つの任意の組合せを行うことができる。

【0132】

ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は接続されるか、または切り替え機構（例えば、カラムの切り替え機構）により、互いに移動される。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１はまた、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のポンプ（例えば、自動ポンプ、例えば自動ペリスタポンプ）も含むことができる。カラムの切り替え行為（ｅｖｅｎｔ）は、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１を通過する流体（例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１におけるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の１つまたはそれ以上への流入物および／または溶離液）における組換えタンパク質のある種のレベルに対応するＵＶ吸光度によって検出される組換えタンパク質のレベルの検出、液体（例えば、緩衝液）の比体積、または特定の経過時間を契機とすることができる。カラムの切り替えは、一般に、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１における、少なくとも２つの異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、ＭＣＣＳ１またはＭＣＣＳ２に存在している、２つもしくはそれ以上の異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜）が、この工程の少なくとも一部の間の実質的に同じ時間に、様々な工程（例えば、平衡、搭載、溶出または洗浄）を通過することが可能となる機構を意味する。

【0133】

ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１は、周期的な向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）とすることができる。例えば、ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１（すなわち、それぞれＰＣＣＳまたはＰＣＣＳ１）であるＰＣＣＳは、４つのクロマトグラフィーカラムを含むことができ、この場合、最初の３つのカラムは、流体（例えば、液体培養培地）からの組換えタンパク質を捕捉する単位操作を行い、ＰＣＣＳの４番目のカラムは、組換えタンパク質を含む流体中のウイルスを不活性化する単位操作を行う。ＭＣＣＳまたはＭＣＣＳ１であるＰＣＣＳは、カラム切り替え機構を利用することができる。ＰＣＣシステムは、最大で例えば４つ、５つ、６つ、７つもしくは８つまたはそれ超のカラムを操作することが可能な、改変ＡＫＴＡシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用することができる。

【0134】

本明細書に記載されている例示的なシステムにおける、第２のＭＣＣＳ（ＭＣＣＳ２）は、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー
膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜、および出口を含むことができる。ＭＣＣＳ２は、本明細書に記載されている例示的なＭＣＣＳのいずれかとすることができるか、または本明細書に記載されているＭＣＣＳ（任意の組合せ）の例示的な特徴のいずれか１つまたはそれ以上を有することができる。ＭＣＣＳ２に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、本明細書に記載されている、形状、サイズ、体積（ベッドボリューム）および／または単位操作のいずれか：の１つまたはそれ以上を有することができる。クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の、例示的な樹脂のいずれかを含むことができる。例えば、ＭＣＣＳ２に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の１つまたはそれ以上に含まれている樹脂は、捕捉機構（例えば、タンパク質Ａ結合捕捉機構、タンパク質Ｇ結合捕捉機構、抗体または抗体断片結合捕捉機構、基質結合捕捉機構、補因子結合捕捉機構、タグ結合捕捉機構および／またはアプタマー結合捕捉機構）を利用する樹脂とすることができる。有用な樹脂は、例えば、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、モレキュラーシーブ樹脂および疎水性相互作用樹脂を含む。樹脂の追加例は、当分野で公知である。ＭＣＣＳ２に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一のおよび／または異なる樹脂（例えば、組換えタンパク質精製に使用するために、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知の樹脂のいずれか）を含むことができる。

【0135】

ＭＣＣＳ２に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、１つまたはそれ以上の単位操作（例えば、本明細書に記載されている単位操作のいずれか、または本明細書に記載されている単位操作の任意の組合せ）を行うことができる。非限定例では、ＭＣＣＳ２は、流体からの組換えタンパク質の精製、および組換えタンパク質を含む流体中に存在している組換えタンパク質のポリッシングからなる単位操作を行うことができる。別の非限定例では、ＭＣＣＳ２は、流体中に存在している組換えタンパク質の精製、流体中に存在している組換えタンパク質のポリッシング、および組換えタンパク質を含む流体のろ過からなる単位操作を行うことができる。別の例では、ＭＣＣＳ２は、流体中に存在している組換えタンパク質の精製、流体中に存在している組換えタンパク質のポリッシング、組換えタンパク質を含む流体のろ過、および組換えタンパク質を含む流体のイオン濃度および／またはｐＨの調節からなる単位操作を行うことができる。ＭＣＣＳ２は、本明細書に記載されているかまたは当分野で公知のさらなる数の単位操作のうちの２つの任意の組合せを行うことができる。

【0136】

ＭＣＣＳ２に存在しているクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は接続されるか、または切り替え機構（例えば、カラムの切り替え機構）により、互いに移動される。ＭＣＣＳ２はまた、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つ）のポンプ（例えば、自動ポンプ、例えば自動ペリスタポンプ）を含むことができる。カラムの切り替え行為は、ＭＣＣＳ２を通過する流体（例えば、ＭＣＣＳ２におけるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の１つまたはそれ以上への流入物および／または溶離液）における組換えタンパク質のある種のレベルに対応するＵＶ吸光度によって検出される組換えタンパク質のレベルの検出、液体（例えば、緩衝液）の比体積、または特定の経過時間を契機とすることができる。

【0137】

ＭＣＣＳ２は、周期的な向流クロマトグラフィーシステム（すなわち、ＰＣＣＳ２）とすることができる。例えば、ＰＣＣＳ２は、流体からの組換えタンパク質を精製する単位操作を行う３つのカラム、および流体中に存在している組換えタンパク質をポリッシングする単位操作を行うクロマトグラフィー膜を含むことができる。例えば、流体からの組換えタンパク質を精製する単位操作を行う３つのカラムは、例えば陽イオン交換樹脂を含むことができ、ポリッシングする単位操作を行うクロマトグラフィー膜は、陽イオン交換樹
脂を含むことができる。ＰＣＣＳ２は、カラム切り替え機構を利用することができる。ＰＣＣＳ２は、最大で例えば４つ、５つ、６つ、７つまたは８つまたはそれ超のカラムを操作することが可能な、改変ＡＫＴＡシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用することができる。

【0138】

ＭＣＣＳ２は、単離された組換えタンパク質がそこからシステムを出ることができる、出口を含むことができる。出口は、例えば、流体用導管を挿入するのを可能にする、ねじ山、リブもしくは封止、または単離組換えタンパク質を保管もしくは貯蔵するよう設計されているバイアルを含むことができる。出口は、単離組換えタンパク質がバイオバーデンの低いバイアルまたは貯蔵容器に直接流入することを可能にするため、出口にバイオバーデンの低いバイアルまたは他のこうした貯蔵容器を封止するために使用することができる表面を含むことができる。本システムにおいて使用することができる非限定的な出口は公知であり、当業者により理解されよう。

【0139】

単離組換えタンパク質の製剤化
単離組換えタンパク質は、当分野で公知の方法を使用して医薬剤にさらに製剤化することができる。医薬剤は、それらの所期の投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内）と適合するよう製剤化される。医薬剤は、滅菌賦形剤（例えば、滅菌水または生理食塩水）、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどのような抗細菌剤もしくは抗真菌剤、アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩のような緩衝液、および糖（例えば、デキストロース）のような等張剤、ポリアルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、または塩（例えば、塩化ナトリウム）、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用することができる（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号を参照されたい）。医薬剤の製造は、アンプル、使い捨てシリンジまたは多回用量バイアル中で製剤化して封入することができる。必要な場合（例えば、注射可能な製剤と同様に）、例えば、レシチンのようなコーティングまたは界面活性剤の使用により適切な流動性を維持することができる。単離組換えタンパク質の吸収は、吸収を遅延させる作用剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませることにより延長することができる。あるいは、制御放出は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムにより実現することができ、このシステムは、生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸；Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）を含むことができる。

【0140】

単離組換えタンパク質のいずれかの１つまたはそれ以上を含む医薬剤は、投与量単位形態（すなわち、投与および投与量の均質性を容易にするための、所定量の活性タンパク質を含む物理的に個別の単位）で、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内）投与向けに製剤化することができる。

【0141】

医薬剤の毒性および治療効能は、細胞培養物または実験動物（例えば、サル）における標準薬学的手順によって決定することができる。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効となる用量）：ＬＤ５０：ＥＤ５０の比である治療指数を決定することができる。高い治療指数を示す医薬剤が好ましい。医薬剤が望ましくない副作用を示す場合、潜在的な損傷を最小化するための注意を払うべきである（すなわち、望ましくない副作用の低減）。毒性および治療効能は、他の標準薬学的手順によって決定することができる。

【0142】

細胞培養アッセイおよび動物検討から得られたデータは、対象（例えば、ヒト）において使用するための、適切な投与量の任意の所与の単離組換えタンパク質を製剤化する際に使用することができる。本明細書に記載されている医薬剤のいずれの有効性および投与も、当分野で公知の方法を使用して、ヘルスケア専門家または獣医専門家によって決定することができる。ある種の要因は、対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼすことがある（例えば、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の一般的健康状態および／または年齢、ならびに他の疾患の存在）。

【0143】

本発明は、以下の実施例においてさらに記載され、この実施例は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0144】

〔実施例１〕
２工程の例示的なシードトレイン法
実験は、改善されたシードトレイン法を開発するために行った。本明細書において提供されている例示的なシードトレイン法が図１および図２に示されている。慣用的なシードトレイン法と比べて、本明細書において提供されている例示的なシードトレイン法により、２つの中間的なスピナー培養工程がなくなる。図１および２に示されている例示的なシードトレイン法により、スピナー培養（例えば、図１および２における１２５ｍＬから１０Ｌのスピナー培養）が図１および２のウェーブバイオリアクター（２Ｌおよび２０Ｌ）に置き換えられる。図１および２における多回スピナー培養をウェーブバイオリアクターに置き換えることにより、ラミナーフローフードにおける必要な操作数が減り、こうして、密閉システム下での操作が可能となることにより、操作の成功が改善される。Ｎ－１潅流培養工程における潅流培養の使用（例えば、図１および２における、ＡＴＦろ過装置を備えた５０Ｌ潅流バイオリアクター）により、５０×１０^６生存細胞／ｍＬ以上の培養細胞密度の到達がやはり可能となる。Ｎ－１潅流培養工程において到達する生存細胞密度が高いことにより、５００Ｌの生産用バイオリアクターにおいて５×１０^６生存細胞／ｍＬという接種密度が可能になり、これにより、慣用的なシードトレイン法により達成される生産用バイオリアクターにおける初期細胞密度よりもかなり高くなる（図１）。本シードトレイン法によって提供される生産用バイオリアクターでの播種密度の高さは、生産用バイオリアクターでの成長期を約５日間、削減する一助となり、５０日間の生産用バイオリアクター操作にとって、製造プラント時間の節約となる。図１および２に示されている例示的なシードトレイン法の生産性を試験するために使用される材料および方法は、以下に記載されている。

【0145】

材料および方法
細胞株および培地
実験はすべて、４ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補給した、市販の化学的に規定されている細胞培養培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＣＨＯ細胞株を使用して行い、組換えヒト酵素を生産した。

【0146】

２Ｌおよび２０Ｌのウェーブバイオリアクターにおける回分シードトレイン培養
高密度（ＨＤ）細胞バンクバイアル（１０×１０^７生存細胞／ｍＬ、４．５ｍＬ／バイアル）を１Ｌの作業体積のある２Ｌウェーブ細胞バッグ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に解凍した。２Ｌのウェーブ細胞バッグ中の生存細胞密度が３．０×１０^６生存細胞／ｍＬに到達すると、培養物を７．５Ｌの作業体積のある２０Ｌウェーブ細胞バックに拡大した。２Ｌと２０Ｌのウェーブ細胞バッグの両方に対する振動プラットフォームとして、ウェーブバイオリアクターシステム（モデル２０／５０ＥＨ
ＴＤ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。培養物を３７℃の温度、１６ＲＰＭの振動速度、および７°の振動角に維持した。２０％のＯ_２と５％のＣＯ_２とのガス混合物を０．２５ｓｌｐｍの流速でヘッドスペースに加えた。

【0147】

シードトレインＮ１潅流培養
ＡＴＦ４潅流装置（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｎｅ Ｂｒｏｏｋ、ＮＪ）を装備した１５Ｌのグラス製潅流バイオリアクター（Ｂｒｏａｄｌｅｙ－Ｊａｍｅｓ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して、シードトレインＮ１の段階を模倣した（図１において示されている５０Ｌのバイオリアクター）。酸素を２０μｍの焼成スパージャーにより加えて、酸素の溶解を４０％に制御し、窒素を１ｍｍのドリル穴のスパージャーにより加え、溶解ＣＯ_２レベルを１２０ｍｍＨｇ未満に制御した。０．５Ｍ炭酸ナトリウムを添加することにより、バイオリアクター培養物のｐＨを６．８５超に維持した。１０％の消泡剤溶液（ＦｏａｍＡｗａｙ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加し、必要に応じて、発泡レベルを制御した。

【0148】

１０Ｌの作業体積のある１５Ｌのバイオリアクターに０．５×１０^６生存細胞／ｍＬで播種し、潅流が開始すると、この培養を２日目まで回分形式で操作した。潅流速度は、最初に、オンラインの静電容量センサー（Ａｂｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｂｅｒｙｓｔｗｙｔｈ、ＵＫ）およびプログラマブルロジックコントローラ（ＤｅｌｔａＶ）を使用して、０．２ｎＬ／細胞／日の細胞特異的潅流速度（ＣＳＰＲ）で制御した。生存細胞密度が２０×１０^６細胞／ｍＬに達した後、潅流速度を１日あたり４バイオリアクター体積（ＲＶ／日）を上限に定めた。

【0149】

接種密度評価に関する、５０ｍＬスピンチューブの回分再供給モデル
培養物の細胞密度が２５×１０^６生存細胞／ｍＬ、５０×１０^６生存細胞／ｍＬおよび１００×１０^６生存細胞／ｍＬに到達すると、その一定分量をシードトレインＮ－１バイオリアクターから抜き出し、続いて、３つの異なる接種密度：０．５×１０^６生存細胞／ｍＬ、２．５×１０^６生存細胞／ｍＬまたは５．０×１０^６生存細胞／ｍＬで、１０ｍＬの作業体積の５０ｍＬスピンチューブ（ＴＰＰ Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス）に三連で接種した。連続的な潅流はこの規模では行うことができないので、１日１回、再供給を行った。再供給は、１日目に開始し、インキュベータからスピンチューブを取り出し、細胞の回転を５分間、１１００ＲＰＭに下げ、上澄み液を除去して、次に新しい培地を添加して、細胞を再懸濁することにより行った。再供給戦略は、異なる接種密度条件で同じＣＳＰＲが得られるよう設計した。スピンチューブのすべてを３７℃の温度、振動速度１６０ＲＰＭ、振動角度を卓上に対して４５度、相対湿度８０％およびＣＯ_２濃度５％で、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ ＩＩ震とうインキュベータ（ＨＴ Ｉｎｆｏｒｓ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、スイス）中に維持した。

【0150】

生産用バイオリアクター
図１に示されている５００Ｌの生産用バイオリアクターを模倣するため、作業体積１０Ｌを有する、１５Ｌバイオリアクター（Ｂｒｏａｄｌｅｙ－Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を、２０μｍの焼成スパージャーにより溶解酸素を４０％に制御した、ＡＴＦ４潅流装置（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｎｅ Ｂｒｏｏｋ、ＮＪ）を使用する潅流形式で操作し、１ｍｍのドリル穴のスパージャーにより窒素を加え、溶解ＣＯ_２レベルを１２０ｍｍＨｇ未満に維持した。０．５Ｍ炭酸ナトリウムを添加することにより、ｐＨを６．８５超に維持した。ペリスタポンプにより、１０％の消泡剤溶液（ＦｏａｍＡｗａｙ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加して発泡レベルを制御した。

【0151】

一式の生産用バイオリアクターに、回分形式で操作した播種用槽から低密度（０．５×１０^６生存細胞／ｍＬ）で接種した。潅流は、１日目に０．５ＲＶ／日で開始し、２ＲＶ／日の潅流速度に到達するまで、毎日０．５ＲＶ／日ずつ向上させた。この密度が５０×１０^６生存細胞／ｍＬに到達すると、別の一式の生産用リアクターに、Ｎ－１ １５Ｌの潅流播種用槽から、高密度（５．０×１０^６生存細胞／ｍＬ）で接種した。接種密度が高いので、潅流は、接種直後に２ＲＶ／日で開始した。生産用バイオリアクターのすべての場合に、生存細胞密度をオンライン静電容量センサーおよびブリードポンプを使用して４０×１０^６生存細胞／ｍＬに制御した。生産用バイオリアクターはすべて、５０日間、操作した。

【0152】

分析方法
生存細胞密度は、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ細胞生存率分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して決定した。ＲＡＰＩＤＬａｂ血流ガス分析器（Ｓｉｅｍａｎｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を使用して、オフラインでｐＨおよびｐＣＯ_２を測定した。タンパク質の生産性は、特許権のある光度酵素活性アッセイにより測定した。

【0153】

結果および考察
図３は、ウェーブ回分培養およびＮ－１潅流培養を含めた、これらの実施例において記載されている例示的なシードトレイン法の生存細胞密度の成長プロファイルを示している。２Ｌおよび２０Ｌのウェーブ回分培養の期間は、それぞれ８日間および５日間であった。Ｎ－１潅流バイオリアクターを１２日間、操作し、最終生存細胞密度は１１０×１０^６生存細胞／ｍＬおよび細胞生存率は＞９８％に到達した。生存細胞密度は、９日目に５０×１０^６細胞／ｍＬに到達し、これは、（５０Ｌ Ｎ－１のバイオリアクターから）５×１０^６生存細胞／ｍＬで５００Ｌのバイオリアクターに接種するのに必要な細胞密度である。

【0154】

Ｎ－１バイオリアクターの場合、潅流を２日目に開始し、細胞密度が向上するにつれて、自動的に供給速度が向上するオンライン静電容量プローブを使用して、０．２ｎＬ／細胞／日のＣＳＰＲを維持するよう制御した。この潅流速度の制御戦略の成功は、静電容量プローブが生存細胞密度を正確に見積もることができるかに依存している。潅流速度が４ＲＶ／日を上限に定められているので、この戦略は７日目までしか使用されないが、このプローブは、１１０×１０^６生存細胞／ｍＬに到達した１２日目までの実施に、密度を正確に見積もることが可能であった（図４）。

【0155】

小規模スピンチューブモデルを使用して、生産用バイオリアクターにおける細胞成長に対するＮ－１細胞密度の影響を評価した。細胞密度がそれぞれ、２５×１０^６生存細胞／ｍＬ、５０×１０^６生存細胞／ｍＬまたは１００×１０^６生存細胞／ｍＬになると、培養物の試料をＮ－１バイオリアクターから抜き取った。これらの試料を３つの一定分量に分け、新しい培地を使用して、０．５×１０^６生存細胞／ｍＬ、２．５×１０^６生存細胞／ｍＬまたは５×１０^６生存細胞／ｍＬまで希釈し、次に、スピンチューブに三連で接種した（潅流生産用バイオリアクターのモデル化）。培養物をそれぞれの接種密度にまで分けた際に到達させた希釈度のため、毎日の再供給を１日目まで行わなかった。再供給速度をスピンチューブの接種密度に基づいて調節し、これにより、対応する細胞密度において、各接種密度の条件が同じＣＳＰＲとなった。

【0156】

細胞数および生存率のプロファイルが、図５～７に示されており、各接種密度におけるＮ－１密度条件間の比較を行えるようプロットした。スピンチューブモデルにおける最大潅流速度が１ＲＶ／日であるので、培養物は、ＣＳＰＲが潅流バイオリアクターモデルと
一致する２０×１０^６生存細胞／ｍＬまでしか成長しなかった。試験した３つの接種密度すべてについて、異なるＮ－１密度条件間に観察可能な成長の差異はなかった。

【0157】

生産用バイオリアクターの細胞成長および生産性に対する、Ｎ－１密度および接種密度に及ぼす影響を検討するため、５０×１０^６生存細胞／ｍＬのＮ－１バイオリアクターから５．０×１０^６生存細胞／ｍＬでバイオリアクターに接種し、２．５×１０^６生存細胞／ｍＬのＮ－１バイオリアクターから０．５×１０^６生存細胞／ｍＬで接種したバイオリアクターと比較した。図８に示されている通り、両方の条件の場合の細胞成長は同等であった。この細胞生存率は、両方の接種条件について、５０日間の実施全体にわたり９０％を超えて維持された。図９は、累積的生産性対一体化した生存細胞密度を示しており、条件間で、類似した比生産速度を示している。最も留意すべきことに、４０×１０^６生存細胞／ｍＬの定常状態の細胞密度（図８）、および精製のために必要な力価は、高接種密度条件の場合、４～５日間、早く到達した。

【0158】

本明細書に記載されている例示的なシードトレイン法は、経済性と操作上の利点の両方を有する。例えば、５．０×１０^６細胞／ｍＬで５００Ｌの潅流生産用バイオリアクターに接種すると、成長期の期間が４～５日間、減少し、５０日間の実施の場合、生産性が１０％向上する。さらに、Ｎ－１潅流バイオリアクターは、１００×１０^６生存細胞／ｍＬに到達することが可能であり、１０×１０^６生存細胞／ｍＬで５００Ｌのバイオリアクターに接種することが理論的に可能であり、成長期の期間がさらに低下する（例えば、合計で５～６日間）。

【0159】

本明細書に記載されている例示的なシードトレイン法はまた、回分または流加形式で操作される生産用バイオリアクターに接種するために使用することもできる。５００Ｌのバイオリアクターを使用する、２１日間の流加細胞培養法の場合、５．０×１０^６生存細胞／ｍＬの接種密度により、生産用バイオリアクターの期間を２５％短縮することができる。全体として、これは、１年あたりさらに５～６回分の回分が可能になり、製造生産性が２５％～３０％向上する。

【0160】

ほとんどの場合、回分および流加法は、通常、潅流法に使用されるものよりもはるかに大きな生産用バイオリアクターを使用し、これにより、大規模なステンレス鋼製バイオリアクターにおいて、いくつかのシードトレイン段階が必要となる。図２は、ＡＴＦ潅流装置を備えた５０ＬのＮ－１バイオリアクターを使用したシードトレイン法と比較した、１０，０００Ｌのバイオリアクターに接種するために使用した、慣用的なシードトレイン法の一例を示している。本明細書に記載されている例示的なシードトレイン法を使用すると、５０～１００×１０^６生存細胞／ｍＬの５０Ｌ Ｎ－１バイオリアクターは、１０，０００Ｌバイオリアクターに０．２５×１０^６生存細胞／ｍＬ～０．５０×１０^６生存細胞／ｍＬで接種することが可能であり、これにより、２つの中間のシードトレイン細胞培養段階がなくなる。

【0161】

この実施例において記載されているデータは、ＨＤ細胞バンク登録、使い捨て単回使用向けバイオリアクター技法、およびＮ－１バイオリアクター段階における潅流培養を含む例示的なシードトレイン法はを実証している。本明細書において提供されているシードトレイン法は、小規模培養段階の数を削減することにより、慣用的なシードトレイン法の複雑さが低減される。本実施例において記載されているデータは、Ｎ－１段階に潅流培養を使用することより、さらなる拡大工程後の培養物の成長特性を損なうことなく、１２日間で最大１００×１０^６生存細胞／ｍＬの生存細胞密度を達成することができることを示している。これらのデータに基づくと、本明細書に記載されている例示的なシードトレイン法を使用して、５００Ｌの生産用バイオリアクターに５×１０^６生存細胞／ｍＬの細胞密度で接種すると、定常状態の細胞密度となるまでの時間を４～５日間、削減することがで
き、５０日間の実施の総合的な生産性が１０％向上する。１０，０００Ｌのようなより大型の生産用バイオリアクターを必要とする回分または回分法の場合、本明細書において提供されているシードトレイン法により、Ｎ－１段階における単一の５０Ｌ潅流バイオリアクターを使用することにより、拡大プロセスから１～２段階をなくすことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】