特許 7089240 高い収集能力で哺乳動物細胞を操作（マニピュレーション）する装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-14

(45)【発行日】2022-06-22

(54)【発明の名称】高い収集能力で哺乳動物細胞を操作（マニピュレーション）する装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/32 20060101AFI20220615BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220615BHJP

【ＦＩ】

C12M1/32

C12M1/00 C

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2017532009

(86)(22)【出願日】2014-12-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-02-15

(86)【国際出願番号】 IB2014067242

(87)【国際公開番号】W WO2016103002

(87)【国際公開日】2016-06-30

【審査請求日】2017-12-21

【審判番号】

【審判請求日】2021-01-04

(73)【特許権者】

【識別番号】512022631

【氏名又は名称】エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ （ウ・ペ・エフ・エル）

【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥ ＦＥＤＥＲＡＬＥ ＤＥ ＬＡＵＳＡＮＮＥ （ＥＰＦＬ）

(74)【代理人】

【識別番号】100180781

【弁理士】

【氏名又は名称】安達 友和

(74)【代理人】

【識別番号】100182903

【弁理士】

【氏名又は名称】福田 武慶

(74)【代理人】

【識別番号】100180482

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 将隆

(72)【発明者】

【氏名】ヘーネル，ジルケ

(72)【発明者】

【氏名】ブランデンベルク，ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ルトルフ，マティアス

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】上條 肇

【審判官】宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－０７９２２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０４２３６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１２年，Ｖｏｌ．８１１，ｐ．１０１－１１１

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12M 1/00 - 3/10

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

開孔を具備してなる細胞を収集するための装置であって、
前記開孔は少なくとも１つの細胞を受取るための複数のマイクロウェルを備え、
前記マイクロウェルはそれぞれ垂直な側壁と曲底部を有しており、
前記マイクロウェルがヒドロゲル層において作製されてなり、
前記マイクロウェルのそれぞれは２００μｍ乃至３ｍｍの高さを有し、
前記マイクロウェルのそれぞれは、開口径と、あるマイクロウェルおよび別のマイクロウェルの間の距離とをさらに含み、
前記開口径に対する前記間の距離の割合は、１／１０以下であり、
前記マイクロウェルのそれぞれの前記開口径は１μｍ乃至３ｍｍである、装置。

【請求項2】

前記複数のマイクロウェルの間に落下する細胞が前記複数のマイクロウェルのうちの１つへと落ちて集合体の形成に関与するように、前記複数のマイクロウェルの前記間の距離は、最小となっている、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記間の距離は、１μｍ乃至１００μｍである、請求項１に記載の装置。

【請求項4】

チャネルの微小流体ネットワークをさらに備え、
前記チャネルのネットワークが前記複数のマイクロウェルの平面よりも低いところにある、請求項１に記載の装置。

【請求項5】

チャネルの微小流体ネットワークをさらに備え、
前記チャネルのネットワークが前記複数のマイクロウェルと一直線に整列されている、請求項４に記載の装置。

【請求項6】

チャネルの微小流体ネットワークをさらに備え、
前記チャネルのネットワークと複数のマイクロウェル底部の間の距離が５００μｍ未満である、請求項５に記載の装置。

【請求項7】

前記ヒドロゲル層は、合成親水性ポリマ、ないしは天然由来成分、または合成ポリマと天然由来成分の混成物を基にする、請求項１に記載の装置。

【請求項8】

前記合成親水性ポリマは、ポリ(エチレングリコール)、脂肪族多価ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレン共重合体、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ(エチレンオキシド)、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ(ヒドロキシエチルアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、またはこれらの混合物である、請求項７に記載の装置。

【請求項9】

前記ヒドロゲル層は、化学反応を用いる少なくとも２つの前駆体コンポーネントの混合と架橋により調合されるものであり、
前記少なくとも２つの前駆体コンポーネントは、ｎ個の求核性の官能基を有する第１の前駆体コンポーネントと、ｍ個の求電子性の官能基を有する第２の前駆体コンポーネントを含み、ｎおよびｍは少なくとも２であり且つ「ｎ＋ｍ」の合計が少なくとも５であり、
前記架橋は、
第１の多腕ＰＥＧマクロマー（求核性の官能基（チオール基）を終端に持つもの）と、
第２の多腕ＰＥＧマクロマー（求電子性の官能基（０．１乃至１００ｋＰａの剛性率を示すように前記ヒドロゲル層と架橋する適度な濃度と条件のビニルスルホン基）を終端に持つもの）と、により行われる、請求項１に記載の装置。

【請求項10】

前記ヒドロゲル層は、
求核性の基または求電子性を含む基を有する自由な官能基の過剰分を有する、請求項９に記載の装置。

【請求項11】

前記複数のマイクロウェルは１つまたはそれ以上の生体分子とともに機能化される、請求項１０に記載の装置。

【請求項12】

前記生体分子が、蛋白質類、オリゴペプチド類、オリゴヌクレオチド類、もしくは糖類である、請求項１１に記載の装置。

【請求項13】

前記蛋白質類またはペプチド類は、
ＥＣＭ由来またはＥＣＭ模倣のものであり、且つヘテロ二機能性リンカーを使用することにより前記求核性の基、前記求電子性の基、または前記第１の多腕ＰＥＧマクロマーの前記チオール基に結合されたものであり、
前記ヘテロ二機能性リンカーの第１の官能基は、前記親水性ポリマーの終端に結合された前記官能基および前記ヘテロ二機能性リンカーの第２の官能基に反応し、
前記ヘテロ二機能性リンカーは、アミン基を介して所望の１つまたはそれ以上の前記生体分子に非特異的に係留することができるサクシニミジル活性エステルを有する、請求項１２に記載の装置。

【請求項14】

前記生体分子は、親和力によって前記ヒドロゲル層に係留されようにタグ付けされる、請求項１１に記載の装置。

【請求項15】

前記生体分子は、ターゲットと結合可能なタグを有し、
前記ターゲットは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＮＴＡ、抗体、ＲＮａｓｅＡのＳフラグメント、セルロース、キチン質、グルタチオン、アミロース、または前記ヒドロゲル層の前記官能基と反応可能である前記求核性の官能基もしくは前記求電子性の官能基を有する機能化されたオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の装置。

【請求項16】

前記天然由来成分は、
多糖類、ゼラチン様蛋白質、および、アガロース、アルギン酸塩、キトサン、デキストラン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、もしくはこれらの混合物を有するＥＣＭコンポーネント、またはマトリゲル（登録商標）、ミョーゲル（Ｍｙｏｇｅｌ）（登録商標）およびカルチゲル（Ｃａｒｔｉｇｅｌ）（商標）を有する複組織由来のマトリックスを含む、請求項７に記載の装置。

【請求項17】

前記高さは、前記開口径と等しいまたはそれ以上である、請求項１に記載の装置。

【請求項18】

複数の開孔を具備してなる細胞を収集するための装置であって、
前記複数の開孔のそれぞれは少なくとも１つの細胞を受取るための複数のマイクロウェルを備え、
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは垂直な側壁と曲底部を有しており、
前記複数のマイクロウェルのそれぞれはヒドロゲルから作製され、
前記複数のマイクロウェルのそれぞれは、開口径と、あるマイクロウェルおよび別のマイクロウェルの間の距離とを含み、
前記開口径に対する前記間の距離の割合は、１／１０以下であり、
前記マイクロウェルのそれぞれの前記開口径は１μｍ乃至３ｍｍである、装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、装置内で操作（マニピュレーション）するだけでなく、細胞を高い処理能力で収集するとともに長期培養する装置に関する。
そのような細胞集合体は基礎生物学、とりわけ発生生物学や癌生物学、再生医療や調剤スクリーニングにおいて使用される。
また本発明は、そのような装置の製作方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

組織は、継続的に機能を維持し確保するために、特殊化された細胞・隣接支持細胞・細胞外マトリクス要素・他の構造的かつ次元的要素を相互干渉する複雑な３次元の実体として自ら作成する（リ等２００５年）。
この多要素ミクロ環境は適所（niche）と呼ばれ、所望の細胞の種類の分化を調べる発達生物学から腫瘍化細胞などの薬学スクリーニングに渡る基礎研究のための標準化されたプラットフォームとしての礎をなす古典的な２次元細胞培養システムにおいては最小限に単純化されてきた。
しかしながら、そのような２次元分析による結果は３次元生体内環境（グリフィス等２００６年）に対する技術移転が致命的に欠如している。
その結果として実験計画は過去１０年の間に、細胞集合体培養（アボット２００３年、ザン２００４年、パンパローニ等２００７年）のようにより適切な３次元モデルの実施へと強く移行している。

【0003】

球状体の形成については、非常に制御されたやり方で高い信頼性をもって細胞クラスタを生成できる懸滴システムが確立されている（ケラー１９９５年）。
すなわち細胞は、重力により細胞収集を誘導するために培養プレートの蓋から媒体の液滴中に浮遊している。
この手法は非常に重労働であって時間を消費するものであり、一般的には大規模培養には容易に適用できるものではない。
発生した球状体の全表面に対する栄養物の受渡は保証される一方で、この方式では集合体の長期培養を可能にする媒体交換をすることはできない。
さらにこの方式では、ある特定範囲のサイズの細胞クラスタだけが実現されるのみである（リン等２００８年）。

【0004】

既存の丸底ポリスチレンの９６個のウェルプレートは、簡素な細胞収集用に標準的な生物学的細胞の培養に導入されている。
この培養フォーマットは自然に近い形態（すなわち球状底面の開孔）を許容するものの、様々なサイズ範囲の細胞クラスタ生成用としては、形成された球状体を妨害せずに媒体交換することは困難であり今なおスループットが不足しているという欠点がある。
それにも関わらず９６個の曲面底ウェルプレートは、生体外の器官形成分析用に最も広く使用されている培養フォーマットである（エイラク等２０１１年、スガ等２０１１年、ナス等２０１２年、ランカスター等２０１３年）。

【0005】

初期の発展生物学の分野（胚性幹細胞をしばしば培養して細胞集合体において分化する研究領域）におけるこのような課題を解決するために、近年では胚性幹細胞クラスタを大規模生成するための装置が提案されている（ユングリン等２００８年）。
ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）として販売されている装置（ステムセルテクノロジーズ社、カナダ、ＰＣＴ／ＣＡ０８／００３９７）は、均一でサイズ制御された胚性組織（ＥＢ）の再生産可能な大規模製造に対する簡便かつ標準化されたアプローチであるものと広告されている。
同ＥＢは、２４時間以内の細胞収集を開始するためのピラミッド底面の直径が４００または８００ミクロンの大きさのピラミッド型マイクロウェルの高密度アレイのなかで決められた濃度の細胞懸濁液を遠心分離することによって生成される。
実際にＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）８００システムは平底プレーンを持つマイクロウェル（最終的なピラミッド型の円錐構造を代表する）をかくまうものであり、充分でない場合、重力の足し合わされる中心点に全細胞を集める細胞収集装置の提供という当初の発明目的が部分的に損なわれる。
さらに同システムは一般的に、細胞球状体の長期培養に対する応用を困難なものとするいくつかの制限を示す。
高い初期細胞播種密度もしくは２４時間よりも長い球状体成長による細胞収集のいずれかによりＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレート内で形成されたサイズのより大きなＥＢは、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）マイクロウェル構造を反映する円錐様の構造を形成しやすい。
非天然構造の抑制細胞は生物学的機能において未知の効果を有し、現在では培養基板の形状が非制御かつ非特定の分化系列決定を誘発しうるものと提唱されている（シク等２０１３年）。
さらにＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレートは、バルク媒体にさらされる面が大きく開いていることによりピペット操作のような操作ステップがマイクロウェル中の球状体の抑制を妨げてしまうので、培養の最中における最適な媒体交換に制限がある。

【0006】

ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレートはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）中で成形されたマイクロウェルアレイとして販売されており、栄養を拡散させないシリコンエラストマーはＰＤＭＳ表面側にさらされた細胞の成長や生存に影響を与える（リー等２００４年）。
そのうえＰＤＭＳはその表面において生体分子の吸収が起こりやすいこと（細胞シグナリングと薬物スクリーニング実験の最終結果に偏りを生じさせるリスク要因）がよく知られている（テプケ等２００６年）。

【0007】

天然由来もしくは合成のヒドロゲルのような生体適合性スキャフォールドの応用を介して生物学ならびに材料科学を混ぜ合わせた近年の技術では、適切な細胞培養基板の不足に取組んでいる（ローリー等１９９９年、ルトルフ等２００５年、チビット等 ２００９年）。
近年の技術は、２次元の平底マイクロウェル（ゴバー等２０１１年）や３次元スキャフォールド（ランガ等２０１４年）を介して適所のマイクロアレイによる生体活性分子の分配に対する生体材料の使用を探求し始めている。

【0008】

高機能生体材料と、単一もしくは複数の所定の細胞種の細胞球状体を生成するための再生可能な細胞収集技術をインターフェースで接続する方法に対する技術が必要とされている。
形成された球状体の幾何学的仕様を模倣するような細密な開孔（所定の生物学的システムの個々の要件を充足するように充分カスタマイズされた幾何学的配置のもの）中でこれらの細胞集合体を発生させる技術が必要とされている。
臨床的に妥当な数を提供するために、細胞球状体の大規模生産に対して上述した全要件を適用できる技術が必要とされている。
また、生成された細胞集合体の実験ならびにマニピュレーションを同一装置上で行うことのできる技術が必要とされている。

【0009】

他の従来技術文献には、類似のミクロ構造が開示されている。
例えば韓国公開特許第２０１３－００１３５３７号公報は、ミクロ構造の製造方法ならびに同ミクロ構造を使用した細胞収集方法に関連するものである。

【0010】

しかしながら韓国公開特許第２０１３－００１３５３７号公報では、開示された過程にいくつかの制約と問題点がある。
ウェルの形状が、半球型ないしは楕円面であること
ウェル開口部における接触角が、最低限２０°であること。
サイズの小さなウェルを実現することができないこと。
ピッチ（ウェルの距離）は、ウェルの開口径と同一であること。
使用する材料が、ＰＤＭＳに限定されてしまうこと。
ウェルの距離（ピッチ）によりスループットが制限されてしまうこと。
長期培養ができないこと。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、既存の細胞収集システムを改良することを目的とする。

【0012】

さらに本発明は、生体内における操作（マニピュレーション）技術を用いるインターフェースならびにスループットサイズと幾何学的配置に関して使用者のニーズをより良く調製できるシステムを提案することを目的とする。

【0013】

さらには、ユーザフレンドリで再生可能で信頼できるシステムを提案することを目的とする。

【0014】

同一培養フォーマットにおける形成された多細胞球状体の長期培養を可能とする本発明により、細胞収集システムの新しいグループが提案される。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明によれば３次元培養システムは、ＰＤＭＳやプラスチックのような他の重合体材料だけに限らずさらに重要なことに合成親水性ポリマー（好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ないしはマトリゲル・アガロース・ゼラチン・コラーゲンのような天然由来成分）を基にしたヒドロゲルといった様々な材料中で再生可能なピッチサイズが低く且つ高い側壁部を有するＵ字型底面に形作られたマイクロウェルだけでなく、アスペクト比が高い丸底のアレイから構成される。

【0016】

これらのアレイを製造するために本発明は、Ｕ字型構造だけでなく丸形を生成するための希釈ポリマー溶液の溶媒を蒸発させるという利点もある。
丸底型は、Ｕ底型に包含される。
丸底のマイクロウェルは、マイクロウェルの高さが球状底の半径と等しいＵ字型底のマイクロウェルを参照するものである。
以下では、Ｕ底またはＵ字型なる用語を用いる。

【0017】

その後、形成されたＵ底マイクロウェル構造は、所望の基盤内に成型される。
ＰＥＧを基礎とするヒドロゲルを基板材料として特別に使用する利点は、栄養の高い浸透性、生物学的不活性を確保している間の最適かつ要求に適合した生物活性にある（ルトルフ等２００５年）。
そのうえＰＥＧを基礎とする基板は、細胞の振舞における不溶性因子ならびに集合体内における成長の研究を実現しつつ、図示されたマイクロウェルの底部に所望の生体分子を選択的に配合できる。
Ｕ底部マイクロウェルの構造（とりわけ開口径に対するウェルの深さのアスペクト比）を仕掛けることにより、移動と媒体交換のような操作手順を介して妨害を最小限に抑制して、培養基板の表面平板の下に球状体を埋込むことができる。
ウェル同士の間の細胞径の範囲における最小のピッチサイズは単一細胞の端が広がること（各ウェルにおける均一な細胞の分配を阻止できる過程、ならびに非制御のサインを示す過程）を充分に抑制する。
さらには所望の分子を局所的かつ定期的に配送するためにマイクロウェル平面に近接する微小流体ネットワークの統合は、長期培養のさなかに形成された集合体の選択的な操作（マニピュレーション）を実現する。
加えて当該のプラットフォームは、形成された球状体の頂上に第２層目の基板をサンドイッチ鋳込することによって形成された集合体の完全なカプセル封入（平面的な局所化および培養のさなかにおける自動撮影を劇的に容易化するもの）に適用できる。

【0018】

そこで本発明は
（１）単一もしくは複数の細胞腫を同時に重力沈殿もしくは遠心沈降させること
（２）続いて、先に収集したあとの任意の時間における重力沈殿を介して他の細胞腫を追加することにより単一の細胞腫を重力沈殿もしくは遠心沈降させること
を通じて、単一もしくは複数の細胞腫を有する細胞集合体を生成する方法を提供する。

【0019】

つまり本発明は、培養フォーマットを取替える必要なしに長期培養を実現し、また機能研究のための所望の生体活性分子の局所的配送により形成された集合体の操作（マニピュレーション）を可能としつつ、細胞球状体を高スループットで形成する全てを１つにまとめた新規の２次元および３次元の細胞培養プラットフォームを提案する。

［発明の詳細な説明］

【0020】

ある実施形態において本発明は細胞を収集する装置に関連するものであり、当該の装置は少なくとも１つの開孔を具備しており、同開孔は少なくとも１つの細胞を受取るための複数のマイクロウェルを備え、各マイクロウェルはそれぞれ垂直な側壁と曲底部を有している。

【0021】

同装置は複数の開孔を備え、各開孔はそれぞれ複数のマイクロウェルを備えることが好ましい。

【0022】

ある実施形態においては、開口径（ｄ）、高さ（ｈ）ならびにマイクロウェル間の距離（ピッチｐ）は対になっておらず、互いに独立して変更が可能である。

【0023】

ある実施形態においては、同マイクロウェルは１μｍ乃至３ｍｍの開口径を有する。

【0024】

ある実施形態においては、同マイクロウェルは１μｍ乃至３ｍｍの高さ（ｈ）を有する。

【0025】

ある実施形態においては、マイクロウェルは異なるサイズないしは異なる形状の開孔を有する。

【0026】

ある実施形態においては、マイクロウェルの領域内に落下する細胞がマイクロウェル内へと落ちて集合体の形成に関与するように、マイクロウェル間の間隔（ピッチサイズ）が最小となっている。

【0027】

ある実施形態においては、マイクロウェル同士の間隔が１μｍ乃至１００μｍの範囲内にある。

【0028】

ある実施形態において本装置は、チャネルを有する微小流体ネットワークを備える。

【0029】

ある実施形態においては、チャネルのネットワークがマイクロウェルの平面よりも低いところにある。

【0030】

ある実施形態においては、チャネルのネットワークがマイクロウェルと一直線に整列されている。

【0031】

ある実施形態においては、チャネルのネットワークとマイクロウェル底部の間の距離が５００μｍ未満である。

【0032】

ある実施形態においては、マイクロウェルがヒドロゲル層において作製される。

【0033】

ある実施形態においては、上記ヒドロゲル層は、合成親水性ポリマ、ないしは天然由来成分、または合成ポリマと天然由来成分の混成物を基にするものである。

【0034】

ある実施形態においては、合成親水性ポリマは、ポリ（エチレングリコール）、脂肪族多価ポリウレタン、ポリエーテルポリウレタン、ポリエステルポリウレタン、ポリエチレン共重合体、ポリアミド、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレンオキシド）、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリテトラメチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、もしくは、これらの混合物からなるグループから選択される。

【0035】

ある実施形態においては、ヒドロゲルは、化学反応を用いる少なくとも２つの前駆体コンポーネントの混合と架橋により調合されるものであり、
第１の前駆体コンポーネントはｎ個の求核性の官能基を有するとともに第２の前駆体コンポーネントはｍ個の求電子性の官能基を有しており、ｎならびにｍは少なくとも２であり且つ「ｎ＋ｍ」の合計が少なくとも５であって、
さらに架橋は、多腕ＰＥＧマクロマー（好ましくは４腕ＰＥＧマクロマーであって、求核性の官能基（好ましくはチオール基）を終端に持つもの）と、多腕ＰＥＧマクロマー（好ましくは８腕ＰＥＧマクロマーであって、求電子性の官能基（好ましくは０．１乃至１００ｋＰａの剛性率を示すようにヒドロゲル層と架橋する適度な濃度と条件のビニルスルホン基）を終端に持つもの）と、により行われることが好ましい。

【0036】

ある実施形態においてヒドロゲルは、自由な官能基（好ましくは求核性の基、さらに好ましくはアミンとチオールを有するグループから選択されたもの）、ならびに、追加的または代替的に求電子性の基（好ましくは、アクリル酸塩、メタクリル酸塩、アシルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、キノン、ビニルスルホン、マレイミド、および、それらの由来物、を有する基から選択されたもの）の過剰分を有する。

【0037】

ある実施形態においては、マイクロウェルは１つ又はそれ以上の生体分子とともに機能化される。

【0038】

ある実施形態においては生体分子が、蛋白質類、オリゴペプチド類、オリゴヌクレオチド類、もしくは糖類である。

【0039】

ある実施形態において蛋白質類ないしはペプチド類は、ＥＣＭ由来もしくはＥＣＭ模倣のものであって、かつヘテロ２機能性リンカーを使用することにより求核性もしくは求電子性の基（好ましくはＰＥＧを基礎とする層のチオール基）に結合されたものであり、
同リンカーの１つの官能基は、ポリマー鎖の終端に結合された官能基に反応し、
同リンカーの他の官能基は、サクシニミジル活性エステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スクシンイミジル α－メチルブタノエート、スクシンイミジル プロピオン酸塩、アルデヒド、チオール、アクリル酸塩・マレイミドないしはビニルスルホンを有するチオール選択基、ピリジルチオエステルおよびピリジルジスルフィド）を有するグループから選択されたものであり、アミン基を介して所望の生体分子を非特異的に係留することができる。

【0040】

ある実施形態において生体分子は、親和力によってヒドロゲル表面に係留されようにタグ付けされる。

【0041】

ある実施形態においてタグ付けされた生体分子は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＮＴＡ、抗体、リボヌクレアーゼＡ（RNaseA）のＳフラグメント、カルモデュリン、セルロース、キチン質、グルタチオン、アミロース、またはヒドロゲル組織の官能基と反応可能である求核性もしくは求電子性の官能基を有する機能化されたオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド、を備えるグループから選択されたターゲットと結合可能なタグを有している。

【0042】

ある実施形態において天然由来成分は、多糖類、ゼラチン様蛋白質、および、ＥＣＭコンポーネント（アガロース、アルギン酸塩、キトサン、デキストラン、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ヒアルロン酸、フィブリン、もしくは、これらの混合物）を有するグループから選択されるか、もしくは、マトリゲル、ミョーゲルおよびカルチゲルを有する複組織由来のマトリックスのグループから選択される。

【0043】

本発明によれば、細胞集合体の再生可能な形成およびそれらの長期培養をするための高密度のμｍ規模のＵ底が形成されたマイクロウェルで作られた新規の培養プラットフォームが示される。
このようなプラットフォームは、これらの集合体がより強化された細胞機能の表れる自己組織構造を形成することが観察されるためにとても興味深いものであり、したがって既存の培養システムと比較してさらに妥当なものである。

【0044】

たとえ他の細胞収集プラットフォーム（上述したＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）（ユングリン等２００８年）および、その他（ジゼルブレヒト等２００６年、チェン等２００８年、チョイ等２０１０年、リウ等２０１４年））が過去１０年以上にわたり開示されていても、それらはいずれも充分な細胞収集の行われるミクロ構造を製造することはできなかった。
実際に、標準的な過程のほとんどが角を持つ構造を形成してしまうため、球状のμｍ規模のパターン生成はミクロ技術における主だった障害である。

【0045】

最近の研究では、アイスリソグラフィとその後のＰＤＭＳ複製（リウ等２０１４年）を使用することにより準球状のマイクロウェルの形成が実証されている。
一般的に利用できるツールにより簡素で容易に生産されるものの、この技術は今なお形成されたマイクロウェルの高さ・開口径・ピッチサイズの相互依存によって制限されている。
さらにプラットフォームの拡張性が疑わしい。なぜなら、１アレイあたりの球状体数が少ない数（２５以下）で実証なされているからである。

【0046】

対照的に、希釈ポリマー溶液（例えばエポキシを基礎とするネガ型フォトレジストＳＵ－８）から溶媒蒸発する利点により、高度の幾何学的再生能力によって密集して封入された球状ミクロ構造を形成する能力を与えつつ、強固な表面上の濃縮溶液の境界面において蒸発メニスカスが形成される。

【0047】

本発明の主な強みは、アレイの幾何学的配置に総合的な自由を与えるマイクロウェルの開口径・高さ・ウェル間の距離の分離性である。
これらの３つの変数を独立的に変更できること（上述した既存の先行技術プラットフォームでは実現されないこと）は、研究応用におけるプラットフォームよりもむしろ生物学的応用を基礎とするプラットフォームを発展させる必要がある。

【0048】

また提案されるＵ字型マイクロウェルアレイは、できるだけ細胞の生理学的環境にできる限り近づけて真似るためにＰＤＭＳのような弾性体よりもむしろヒドロゲルのような軟質性で高度に水和された基板で形成されることが望ましい。

【0049】

提案された基板上における単一細胞の生存はＰＤＭＳを基礎とするプラットフォーム（例えば、先に引用された韓国の先行技術出願に開示されたもの）よりも著しく高いこと、ならびに、提案された基板上において細胞集合体の成長に触媒作用が及ぶことが実証された。

【0050】

一方においてこれらの結果は、非水和基板と比べて、細胞培養を支えるヒドロゲルの有効性の近年の実証とともに確証を強める。

【0051】

他方、３次元細胞培養システムは２次元システムの妥当性の欠如に対する主流の解決策であることが明らかになりつつある。

【0052】

本願のヒドロゲルを基礎とするマイクロウェルアレイプラットフォームを用いることで、高スループットの細胞収集能力と、ヒドロゲルのより上位層においてそれらをカプセル封入することによりこれらの細胞に３次元環境を供給する潜在能力とを結びつけることが実証された。
さらにプラットフォームがヒドロゲルから作られているため、プラットフォームの中へと微小流体ネットワークを統合できる可能性も示すことができる。

【0053】

そしてヒドロゲルを使うことのさらなる利点としては、培養された集合体上に係留された刺激の影響の評価を可能にするマイクロウェル表面上に、生体機能的な結合基を化学的に架橋結合する可能性を実証できる。
３次元培養と、微小流体ネットワークと、マイクロウェルパターン形成ならびに生体機能化との同一プラットフォーム内における統合は、３次元ミクロ組織の高解像度スクリーニングに対して物理化学的かつ時空間的な総合的に新しい領域を開く。

【0054】

最終的に、プラットフォームは任意の細胞種（より具体的には、２～３日間後に集合体を形成して少なくとも５日間にわたってしっかりと集合状態を維持した人間の乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ２３１のような非球状体を形成する細胞種）に使用できることを示す。

【0055】

本願発明は「制御可能な」細胞の同時培養をできる独自の機会を与える。
同時培養は、最初に複数の細胞種を同時に播種するか、ないしは球状体培養に他の細胞種を加えることのいずれか一方により可能である。
さらに２つ以上の細胞種は、自己組織・統合・細胞の再分配のシステム研究のための培養を行っている間にいつでも加えることができる。

【0056】

本願の技術は空間と時間における高解像度スクリーニングのための、高度に多目的に使用できる先進的な複数次元のスクリーニングプラットフォームである。
本願のアプローチは多くの上述したプラットフォームとは異なり、生物学的な応用特有のものを基礎とするプラットフォーム展開から成る。
これらの種類の完全な統合された技術は、臨床のための伝統的な研究に強く触媒作用を及ぼすだけでなく、基礎的な生物学の進展を支えるものと信じられている。

【図面の簡単な説明】

【0057】

本発明は、以下に記載の図によってより良く理解される。

【0058】

【図1】図１Ａ～図１Ｄは、本発明の原理を示す図である。

【0059】

【図2】図２は、本発明に従った３次元幾何学的マイクロウェルアレイ（反転したもの）を示す図である。

【0060】

【図3】図３は、マイクロウェルアレイの幾何学的平面図である。

【0061】

【図4】図４は、Ｕ底マイクロウェルアレイの全体図である。

【0062】

【図5】図５は、Ｕ底ウェルの製造過程の概念図である。

【0063】

【図6】図６Ａ～図６Ｃは、Ｕ底マイクロウェルの幾何学的配置の理論的および実際の図である。

【0064】

【図7】図７は、ヒドロゲル注型の概念図である。

【0065】

【図8】図８Ａ～図８Ｄは、サイズの異なるＵ字型マイクロウェルを示す図である。

【0066】

【図9】図９Ａ～図９Ｄは、剛性の異なる材料中で再生されるＵ字型マイクロウェルを示す図である。

【0067】

【図10】図１０は、様々な材料中で製造されるＵ字型マイクロウェルを例示する図である。

【0068】

【図11】図１１は、サイズの小さなマイクロウェルを例示する図である。

【0069】

【図12】図１２Ａ～図１２Ｎは、標準的なＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プラットフォームの制限を示す図である。

【0070】

【図13】図１３Ａ～図１３Ｇは、細胞密度を変更した例を示す図である。

【0071】

【図14】図１４Ａ～図１４Ｇは、集合体の成長、サイズ配分、多分化能の維持の例を示す図である。

【0072】

【図15】図１５は、細胞の種類を変更する潜在的な収集能力を例示する図である。

【0073】

【図16】図１６は、非球状に形成された細胞種の潜在的な収集能力を例示する図である。

【0074】

【図17】図１７Ａ～図１７Ｃは、３次元培養フォーマットを例示する図である。

【0075】

【図18】図１８Ａ～図１８Ｆならびに拡大図１８Ｇは、微小流体統合がされたＵ底マイクロウェルを例示する図である。

【0076】

【図19】図１９は、マイクロウェル底部の生体機能化を例示した図である。

【0077】

【図20】図２０は、異なった形状のマイクロウェル（平面図および断面図）を例示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0078】

図１Ａ～図１Ｄは、本発明の原理を示す図である。
この原理によれば、プレート１には一連のウェル２が設けられている。
商業的利用が可能なウェル２の代表的なサイズは、開口径がおよそ６．４～３４．８ｍｍであり、実用的容量０．１～０．２ｍＬ乃至１．９～２．９ｍＬに対応する総液体容量が０．３６～１６．８ｍＬを保持する深さが１．７６ｃｍである。
これはあくまで一例であり、商業利用可能なプレートや特殊に作成されたプレートのいずれか一方のサイズが異なる他のプレート１を使用してもよい。

【0079】

図１Ｂは、ウェル２を備える図１Ａのプレート１の側方断面図である。
同図１Ｂにおいては、本発明の１つの特徴を構成する各ウェル２の底に設置された一連のマイクロウェル３が看取される。

【0080】

同マイクロウェル３は、図１Ｂのウェル２の拡大図である図１Ｃにおいて詳細に図示される。

【0081】

したがって実施形態における本発明は、プレート１のより大きな１組のウェル２内に一連のマイクロウェル３を設けることを提案する。

【0082】

図２は、３次元幾何学的配置（反転したもの）を有するマイクロウェル３・アレイ４を示したものである。図解した意図は、マイクロウェルアレイ４の３次元幾何学的配置を反転して示す。
これは、Ｕ底マイクロウェルアレイの成型に用いられるネガ型ＰＤＭＳスタンプ（例）の斜視図におけるＵ底マイクロウェル３の一般的な構造を示す図である。

【0083】

図３は、マイクロウェルアレイ４の平面的幾何学的配置の一例を示す図である。
ここでは、これらのアレイ４の理論的平面図を示す。
マイクロウェル３は、アレイ４の所定領域に対するウェルの密度を最大化するために組織される。
また、マイクロウェル３のこの組織化によりウェル間の距離を最小化することが実現され、したがって細胞がマイクロウェル３の間で成長することを阻止する。

【0084】

本出願中に記載の形成技術によれば、図１Ｃ中に定義した距離ｄ、ｈおよびＰを独立的に選択することができる。
例としては、ｄとｈのサイズは１μｍ～３０００μｍ（３ｍｍ）の範囲にでき、ｐのサイズ範囲は自由に選択できる。
デバイスの適切な使用のために、ｈは常にｄよりも大きいか若しくは等しく、ｐはできる限り小さく（ｄよりもずっと小さく（ｐ<<ｄ）かつ典型的には１μｍ～１００μｍの範囲に）すべきである。
もし必要であれば、制約されることなくｐを１００μｍよりも大きくすることもできる。

【0085】

図１Ｄは、ウェル開口径に対するピッチサイズの比の機能としての、細胞捕捉領域（マイクロウェルが占める領域）のパーセンテージを示す図である。
１０：１の比においては、マイクロウェルはすでに全領域の７４．９５％を占めている。このパーセンテージは、ピッチサイズをさらに減少させても著しく増やすことはできない。

【0086】

図４は、Ｕ底マイクロウェル３アレイの全体図である。
直径８ｍｍの底を持つアレイは、１２ウェルプレート１のウェル２（図１Ａ参照）の中に注型される。
Ｏｃｔ４：：ＧＦＰ ＥＳＣのクラスタを含む７２個のマイクロウェル３（小さく挿入。左）を有するアレイ４の領域の明視野と蛍光性の表現を示す。
集合体のサイズは単分散であり、多能性マーカＯｃｔ４が各細胞クラスタ中に表示されている。
この集合体の均一性は、Ｕ底マイクロウェル３プラットフォームの強い再現性を示す。

【0087】

以下の表１は、プレートあたりのウェル２の数（６・１２・２４・４８・９６）・ウェル底部の面積・ウェル２あたりのマイクロウェル３の数に依存したマイクロウェル３の開口径が異なるウェルプレート１（図１Ａ参照）の例を与える。

【0088】

【表1】

【0089】

本願発明の１つの利点は、マイクロウェル３における媒体を容易に補充できることにある。
実際に、各マイクロウェル３を個々に補充するよりもむしろ、所定のマイクロウェルのサイズ以下にすることは不可能である。
本願発明を用いれば、マイクロウェル３よりも大きなウェル２のレベルで作用させることができ、ひいては補充がもっと容易になる。

【0090】

図５は、本願発明によるＵ底マイクロウェル３の形成過程の概念図である。
Ｕ底マイクロウェル３は、溶媒蒸発を介して球状形の底を形成するために、希釈溶液材料（例えば、エポキシを基礎とするフォトレジストＳＵ－８のようなポリマー）の定められた体積の沈殿物を介して形成される。
表面張力を介してウェルの底部に反転された半球型底５を形成するために、溶媒蒸発の間、沈積した材料は濃縮してマイクロウェル３の壁を濡らしている。
沈積した材料が凝固した後、その構造はマイクロウェル３アレイ４を形成するための複製した鋳型に用いられる。

【0091】

図６Ａは、図５に関連して先に検討したように、蒸発した後のマイクロウェルの最終的な幾何学的配置を理論的に記した図である。
ウェル底部の反転されたＳＵ－８キャップ５を有する単一のシリコン（Si）ウェル３の斜視図は、中心に沿った断面図を含めて図示される。ｒは反転されたキャップの半径（あらかじめエッチングされたウェルの半径に等しい）を表し、ｈ１はウェルの深さ（あらかじめエッチングされたシリコン（Si）の深さと等しい）に関連があり、ｈ２は溶媒蒸発前のＳＵ－８の統合した高さ（ウェル（図６Ｂ）の半径と概ね等しい）に関連がある。
Ｕ字型ウェル底部（底左）を形成するためにＳＵ－８が沈積したマイクロウェル３、ないしはＳＵ－８が沈積していない（底右）ＰＥＧヒドロゲル中に成型された複製の一例を図６Ｃの画像中に示す。

【0092】

図７は、本願発明によるプレート１のＰＤＭＳおよびヒドロゲルの成型の概念図の一例を示す図である。
疎水性の表面を下塗りするためのテンプレートシリコンスタンプのシリコン処理の後、Ｕ底構造はＰＤＭＳの中へと成型された複製である。
形成されたＰＤＭＳ Ｕ底マイクロウェルネガ型は、その後、カバーガラス上に若しくは組織培養プレート１のウェル２の底部に直接的に、任意の所望の材料を注型するために使用される。
カバーガラスは使用された箇所に、任意の適切な手法により（例えば生体適合性のある粘着性の薄膜（例えばＰＥＧヒドロゲルの薄層）を介して）ウェル２内に固定される。

【0093】

図８Ａ～図８Ｄは、サイズの異なるＵ型マイクロウェルの例を示す図である。
ＰＥＧヒドロゲルを用いることで（Ｇ’～１２．５ｋＰａ）、距離ｄ・高さｈ・ピッチｐのパラメータを変えた異なる組合せが実現される。
開口径が１００μｍ、２５０μｍ、４００μｍおよび１．２５ｍｍのマイクロウェル３の共焦点の画像（直交する観点）が示される（図８Ａ～図８Ｄ）。
これら３つのサンプルの異なる正確な設計は、以下の通りである。
図８Ａ：マイクロウェル３は、開口径１００μｍ、高さ２００μｍおよびウェル間の距離４０μｍである。
図８Ｂ：マイクロウェル３は、開口径２５０μｍ、高さ４００μｍおよびウェル間の距離４０μｍである。
図８Ｃ：マイクロウェル３は、開口径４００μｍ、高さ４００μｍおよびウェル間の距離４０μｍである。
図８Ｄ：マイクロウェル３は、開口径１．２５ｍｍ、高さ１ｍｍおよびウェル間の距離４０μｍである。

【0094】

これは、本願発明によるマイクロウェルプラットフォームの強い多用途性を示す。

【0095】

図９Ａ～図９Ｄは、剛性の異なるＵ底マイクロウェルを示す図である。
ポリマー含有量（図示したように、ｗ／ｖ １．２５％、２．５％、５％、１０％）を変えて絶対的な剛性が異なるＰＥＧヒドロゲルを用いることで、Ｕ底マイクロウェルアレイとして成形できることを実証する。
本願発明のＵ底マイクロウェル構造は、図９Ａの１５０Ｐａ（Ｇ’）から図９Ｄのおよそ３０ｋＰａ（Ｇ’）までの剛性を持つヒドロゲル中で容易に型押しされる。
この広く網羅する範囲は、剛性を変えた基板により細胞集合体の相互作用に関する生物学上の疑問を扱うために重要である。

【0096】

図１０は、図に示されたように用いられた様々な材料を示す図である。
ＰＤＭＳネガ型成形から、由来材料は上記のパターンで型押しされる。ＰＤＭＳは、ＰＤＭＳ内でＵ底マイクロウェルから上昇した複製成形できる。
好ましくはＵ底マイクロウェルアレイは、軟性の生体適合性のポリマー中で再生される。
天然ヒドロゲル（例えばアガロース、アルギン酸塩、ゼラチン、マトリゲルおよびコラーゲン）のみならず、標準的な合成ヒドロゲル（例えば、成型可能なことが実証されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を使用すればよい。
もちろん他の同質の材料を使用することもできる。

【0097】

図１１は、小さなサイズのウェルの実施形態を示す図である。
１０μｍ～５０μｍの間のサイズのウェルを備えるマイクロウェル３は、単細胞培養プラットフォームを作成するために１２．５ｋＰａのＰＥＧヒドロゲル中で成形される。
単細胞は、別々のウェルにおいてうまく播種される。

【0098】

図１２Ａ～図１２Ｎは、標準的なＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プラットフォームの制約を示す。
採取されたＯｃｔ４：：ＧＦＰ ＥＳＣの明視野画像は、４００μｍ次元のＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（図１２Ｅ～図１２Ｈ）のみならず、開口径４００μｍのＵ底マイクロウェル（図１２Ａ～図１２Ｄ）中で２４時間培養した後に集合する（すなわちマイクロウェルあたりの細胞が５００個、１０００個、２０００個および３０００個）。
ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プラットフォームには、いくつかの制約が見られる。
すでに提案されているように（シク等２０１３年）、ピラミッド型のマイクロウェルにおいて収集した細胞はピラミッド型の形をとる。
これは、マイクロウェルあたり５００、１０００、２０００および３０００個の細胞といった様々な異なる細胞播種密度（矢印）において看取される。
しかしながら、Ｕ底マイクロウェル中で形成された細胞集合体はさらにもっと著しく丸い。
実際、球状体の偏心度（図１２Ｉ）、形成因子（図１２Ｊ）、緻密性（図１２Ｋ）は、ほとんどの細胞密度に対してＵ底マイクロウェルとＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）の間で著しく異なることが分かった。
この緻密性の欠如は２つのプラットフォーム（図１２Ｌ）間で採取した後の浮遊細胞の数を評価することにより確認され、採取後においては本願発明のＵ底マイクロウェルと比較してＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）の上澄みにはより多くの単細胞が浮いていることが看取された。
最終的にタイムラプス撮影を用いて、細胞集合体（ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）表面（ＰＤＭＳ表面）上に播種されたＯｃｔ４：：ＧＦＰ ＥＳＣ（図１２Ｍ）およびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞集合体（図１２Ｎ）は、マイクロウェルの壁に沿って這うことが観察された。
これらの観察は、新しい培養プラットフォーム（例えば、より不活性の培養基板ならびにＰＤＭＳよりもずっと大きな生体適合性を示す培養基板を使用する本願発明）に対する必要性を実証する。

【0099】

図１３Ａ～図１３Ｇは、細胞密度を変化させて測定した例を示す図である。
マウスＯｃｔ４：：ＧＦＰ ＥＳＣを使って、３つの異なる細胞密度
図１３Ａ マイクロウェルあたり１個の細胞
図１３Ｂ マイクロウェルあたり１００個の細胞
図１３Ｃ マイクロウェルあたり５００個の細胞
が、開口径４００μｍおよび高さ４００μｍのＵ底マイクロウェルの中に播種した。
各密度のサイズの分布は、２４時間後に評価した。
この期間を超えると集合体はそれぞれ、マイクロウェルあたり１個の細胞に対しては約２５μｍに成長し、マイクロウェルあたり１００個の細胞に対しては約１１０μｍに成長し、マイクロウェルあたり１４０個の細胞に対しては１４０μｍに成長した。

【0100】

図１３Ｄ ５日間以上の単細胞の成長の明視野画像
異なる単細胞について、成長潜在能力の違いが看取された。
したがって本願発明によるマイクロウェルアレイは、単細胞レベルにおける幹細胞総数の均一性（例えば、クローン増殖潜在能力の変更）を評価する有力なツールである。

【0101】

図１３Ｅ 単一胚性幹細胞の生存能力は、標準的なＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）アレイ（ＡＷ ＰＤＭＳ）と比較して、本願発明によるＵ底マイクロウェルアレイ（ＲＢＷ ＰＥＧ）において評価される。
本願発明によるアレイは、単細胞生存を著しく支えている。
＊＊＊は、ｐ＜０．００１に対応する。

【0102】

図１３Ｆ 単細胞からクローン的にコロニーを増殖するサイズ分布は、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）において５日後に評価した。

【0103】

図１３Ｇ 本願発明によるＵ底マイクロウェルにおいて

【0104】

ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プラットフォームと比較して、本発明によるＵ底マイクロウェル中で形成され培養された集合体の方がよりサイズが均一である。

【0105】

図１４Ａ～図１４Ｇは、集合体の成長、サイズ分布および多能性維持を示す図である。
マウスＯｃｔ４：：ＧＦＰ ＥＳＣの集合体の成長は、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プラットフォーム（ＡＷ ＰＤＭＳ）と比較して、本願発明によるＵ底マイクロウェルプラットフォーム（ＲＢＷ ＰＥＧ）において５日間の間に評価する（図１４Ａ）。
細胞の緊密化の後、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プラットフォームと比較すると（図１４Ｂ、図１４Ｃ）、本願発明によるＵ底マイクロウェルプラットフォームではクラスタの成長が著しく改善された。
集合体のサイズ分布は、５日目に評価した。
本願発明によるＵ底マイクロウェルプラットフォームは（図１４Ｃ）、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）（図１４Ｂ）と比較して集合体のサイズのより高度な単分散性を示す。
図１４Ｄ マイクロウェルあたり５００個の細胞の成長の明視野表示は、Ｕ底マイクロウェルにおいて５日間以上。
集合体の成長は、アレイを超えてほぼ同一である。
したがって本願発明によるマイクロウェルのプラットフォームは、単分散性の集合体を高スループットで生成するための強い潜在能力を示す。
図１４Ｅ 加えて、媒体交換における集合体損失は２つのプラットフォームに対して評価した。大きな違いは見られなかった。
平均すると、媒体交換により７％未満の集合体が失われた。
図１４Ｆ プラットフォームからの集合体の再生についても評価した。大きな違いは看取されなかった。１００％に近い集合体を回復できた。
最後に、主としてＥＳＣ多能性マーカＯｃｔ４の維持をＦＡＣＳにより毎日分析した（データは図示略）。
５日目においても（図１４Ｇ）、標準的な維持培養と同等に、まだ９９．０％の細胞がマーカを示している。

【0106】

図１５は、図中に示した細胞腫を変化する潜在的な収集能力の一例を示す図である。
様々な細胞腫を、本願発明によるＵ底マイクロウェルアレイ上に播種した。
Ｃ２Ｃ１２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、ＮＭｕＭＧ／Ｅ９および人間のＭＳＣｓ ＰＴ－２５０１の明視野表示を示す。
異なる細胞腫はうまく集合体を形成し、５日間にわたって維持できた。
また、それらは全てうまく採取されてクラスタを維持した（代表的な例として、ｈＭＳＣｓ ＰＴ－２５０１に対するデータを示す）。
この高度な多用途性は、本願発明によるマイクロウェルプラットフォームの強い潜在能力を実証する。

【0107】

図１６は、図中に示された非球状形を形成する細胞腫の潜在的な収集能力の一例を示す。
非球状形を形成する細胞腫は、本願発明によるＵ底マイクロウェルアレイの上に播種される。
対応する５日目に採取された集合体のみならず、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ２３１およびＯＰ９の培養時間の異なる明視野表示を示す。
異なる細胞腫はうまく集合体を形成し、５日間にわたって維持できた。
また、３つの全細胞腫はうまく採取でき、クラスタを維持した。

【0108】

図１７Ａ～図１７Ｃは、３次元培養フォーマットの一例を示す図である。
図１７Ａ 基板の第２層６のサンドイッチ注型によりカプセル封入された３次元の集合体の透視図は、カプセル封入された３次元培養を可能にする１つの単一のｚ平面における集合体の局在化を組合わせる本願発明による技術の潜在力を示す。
図１７Ｂ サンドイッチ注型の概念を証明する図である。
Ｕ底マイクロウェル３の第１層（開口径４００μｍ、高さ４００μｍ、ピッチ４０μｍ）が作り上げられる。
ＰＥＧミクロビーズ（直径およそ２００μｍ、Ｇ’ １０～４０ｋＰａ）は、細胞クラスタを模倣するための重力沈降によりマイクロウェルの当該の第１層において捕捉される。
ＰＥＧヒドロゲルの第２層は、ＰＥＧミクロビーズを完全にカプセル封入しつつ、３次元培養を形成するためのアレイの頂上に成型される。
図１７Ｃ サンドイッチ成型法の共焦点の表示。
これは、高スループットの平面上の３次元培養を作り上げるための本願発明によるプラットフォームの潜在力を実証する。

【0109】

図１８Ａ～図１８Ｆおよび図１８Ｇは、灌流可能なμｍ規模のチャネルを介して微小流体の統合を有する本願発明によるＵ底マイクロウェルアレイを示す図である。

【0110】

微小流体ネットワーク（例えば、注入口１５’・１６’および排出口１５”、１６”に個々に接続されたチャネル１５・１６。図１８Ｇ中の透視図参照）を備える本願発明によるＵ底マイクロウェル３アレイの平面図（図１８Ａ）および側断面図（１８Ｂ）の概観図。
ネットワーク５・６はマイクロウェル３の平面の下に置いたり、それと一列に整列してもよく、せずともよい。

【0111】

異なるものでは、互いに隣合う若しくは相互に接続された複数の独立したネットワークがあってもよい。

【0112】

図１９は、マイクロウェル底部の機能化の一例を示す図である。
Ｕ字型底マイクロウェル３（開口径２７０μｍ、高さ４００μｍ、ピッチ４０μｍ）の共焦点の画像。
マイクロウェルの底部は、典型的な蛋白質（ここではＢＳＡ）により機能化される。

【0113】

図２０は、形状の異なる本願発明によるマイクロウェル３の例を示す図である。
複数の幾何学的形状を有するマイクロウェル３の概要を表す。
任意の形状（例えば、三角形・四角形・環状体および全くの不規則構造）は、先に検討した技術とともにＵ底マイクロウェルを作製するために使用できる。
これらは多重の応用に使用できる。とりわけ細胞機能上の培養基板の幾何学的配置の影響を評価するための強力なツールになり得る。
図２０は、平面図ならびにＡ－ＡおよびＢ－Ｂに沿った断面図を図解する。

【0114】

製作／材料および手法

【0115】

［Ｕ底マイクロウェルアレイの製作］
Ｓｉ Ｂｏｓｃｈ過程を用いると、所望の次元の平底マイクロウェル（ここでは円筒形）がシリコン基板の中にエッチングされる。
その後、希釈液体材料（例えば、ポジ型フォトレジストＳＵ－８のようなポリマー）の正確な液量がインクジェット印刷を使用することによりこれらのウェル内に追加される。
他の沈着技術は、ロボット液体操作作業ステーションのような自動液体調合、ピペット操作のような手動調合、もしくは任意の他の沈着手法を含みうる。
蒸発した後、材料は蒸発メニスカスを形成し、Ｕ字型構造を形成するための球状底を形づくる（図５・図６参照）。
材料は最終的に凝固して、その後に最終的な基板（例えばヒドロゲル）のための成型パターンとして使用されるＰＤＭＳ複製成形するためのパターンとして使用される。
この複製成型過程は、所望の最終的な基板（図７参照）の中におけるシリコン基板幾何学的配置の複製を実現する。

【0116】

上述した手法と数値を用いた各サイズ範囲内の本願発明によるＵ底ウェル３の微細作製は、図１１および図１３～図１６に示したような単細胞培養ならびに集合体培養に対する超高密度マイクロウェルアレイ（図４）を作るために将来有望である。

【0117】

［成形性材料］
任意の種類のヒドロゲル（例えば、天然由来ヒドロゲルのみならず合成ヒドロゲル）、例えばＰＥＧ・アガロース・アルギン酸塩・ゼラチン・コラーゲン・マトリゲル、ＰＤＭＳ・ＳＵ－８等のようなポリマー、ＰＭＭＡ・ＰＬＡ・ＰＰＡ・ＰＰ・ＰＥ等のようなプラスチック、セラミック・金属・合金・鉱物・非金属鉱物およびガラス。

【0118】

［細胞培養］
オースティン・スミス（ケンブリッジ大学）から提供されたＯｃｔ４：：ＧＦＰマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣｓ）は、白血病阻止因子（ＬＩＦ）・ＥＳＣスクリーンされたウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）（１５％）媒体・非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）ナトリウムピルビン酸（１０ｍＭ）・ｂ－メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）が追加されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（以下ではＥＳ細胞媒体という（スミス１９９１年））において供給機なしで常時増殖した。

【0119】

人間の間充織幹細胞（ｈＭＳＣｓ、ＰＴ２５０１、ロンザ）ならびにＯＰ９マウス間質細胞は、１０％ＦＣＳ（ハイクローン社、ＡＵＡ３３９８４の一群）および１ｎｇ／ｍＬの人間のＦＧＦ－２（ペプロテック社）が追加されたα－ＭＥＭにおいて常時維持された。

【0120】

線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、人間の乳癌細胞ＭＣＦ－７、人間の乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、マウス乳癌細胞ＮＭｕＭＧ Ｅ９および人間の胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）およびナトリウムピルビン酸（１ｍＭ）が追加されたＤＭＥＭにおいて常時維持された。

【0121】

［集合体形成］
細胞をトリプシンから引き離す。
細胞腫特定媒体において所望の密度で（例えば各々、１マイクロウェルあたり５００個の細胞については１ｍＬあたり３×１０^５個の細胞、１マイクロウェルあたり１００個の細胞については１ｍＬあたり６×１０^４個の細胞、１マイクロウェルあたり１個の細胞については１ｍＬあたり１０００個の細胞）、細胞懸濁液を準備する。
Ｕ字型底マイクロウェルアレイは２４個のウェルプレートのウェル底部に注型され、２ｍＬの準備された細胞溶液がウェルに加えられる。
細胞は重力沈降により安定する。
細胞は５日間培養され、個々の媒体は毎日交換される。

【0122】

結果・応用および例

【0123】

［様々な基板および様々なサイズにおけるＵ底マイクロウェル］
サイズの異なるＵ底マイクロウェル３アレイ４（図８）は、ＰＤＭＳ・ＰＥＧ・アガロース・ゼラチン・アルギン酸塩・マトリゲルを含む様々な細胞培養に適合した基板の中で注型される。
剛性を変えた基板中で再現可能性を試験するために、Ｕ底マイクロウェル３アレイ４はポリマー含有量（ｗ／ｖ）２．５％～１０％の範囲でＰＥＧ中に注型される（図９）。
最も低いＰＥＧ剛性キャスタブルは、２．５％ＰＥＧポリマー含有量（流動学により決定される）と等価な１５０Ｐａに定まり、マイクロウェル３構造の構成はもはや完全には保証されない。
Ｕ底マイクロウェル３は、維持された構造（図１０参照）によって実証された上述の材料中において効率的に再生できる。

【0124】

［単細胞の増殖と生存能力］
ウェル３内における単細胞分布を最大化するために、より少ない数の低い細胞密度で置かれる。
ＰＥＧ（ＲＢＭ ＰＥＧ）中の開口径４００μｍを有するＵ底マイクロウェルとＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００（ＡＷ ＰＤＭＳ）の間に、２４時間ごとに５日間の時間枠を超えて単細胞の増殖と生存能力を定量化する（図１７Ｄ参照）。
培養された単一のＯｃｔ４：：ｅＧＦＰ ＥＳ細胞の生存率は、ＡＷ ＰＤＭＳにおける４８．３６％±３１．７４％からＲＢＷ ＰＥＧにおける８５．０５％±８．５１％へと著しく（ｐ＜０．０００１）増加する（図１７Ｅ参照）。
さらにＲＢＭ ＰＥＧ上で培養された単細胞はＡＷ ＰＤＭＳと比較すると、増殖から５日後により大きく且つさらに単分散の集合体の数へと成長する（図１７Ｆ～図１７Ｇ）。

【0125】

［最先端の商用プラットフォームの制約］
播種から２４時間後の集合体のサイズを、最新式のＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００（図１２Ｅ～図１２Ｈ）で発生したＥＢと、開口径４００μｍのＵ底マイクロウェル（図１２Ａ～図１２Ｄ）内で発生したＥＢの間で比較した。
Ｕ底マイクロウェルに反して、ピラミッド形状のＡｇｒｅＷｅｌｌ（商標）開孔は、ウェルの形状に適合した集合体に起因する型崩れしたＥＢを発生させることが看守された（図３、図４、Ａ－Ｃ、黒矢印）。
また上澄み中に浮遊する細胞がより少ないことが論証されたように（図１２Ｌ）、より高い播種密度（ＥＢあたり２０００個および３０００個の細胞）ではＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標「）に比較してＵ底マイクロウェルについてより強固な球状体を形成することが看取された（図１２Ｃ～図１２Ｄ対図１２Ｇ～図１２Ｈ）。
一般的にＵ底マイクロウェル内で形成されたＥＢは、偏心度（図１２Ｉ）・形成因子・緻密性（図１２Ｉ～図１２Ｋ）についてより良い兆候を示す。
これらの結果は、球状体の形成が一般的にＵ底マイクロウェルにおいて高められることを示している。
さらにＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）において収集され培養されたＥＳ細胞は、２４時間に満たないうちにＰＤＭＳ表面にしばしば付着し始めること（図１２Ｍ、図１２Ｎ）が観察された。
付着した集合体は端に沿って這うために、傾斜したピラミッド型のマイクロウェルのへりを利用する。
このことは集合体の統合ならびにより多くの分散した球状体の数の形成を導く。

【0126】

［集合体のサイズ］
５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧヒドロゲル中のＵ底マイクロウェル３アレイ４は、Ｏｃｔ４：；ｅＧＦＰ遺伝子組換マウスＥＳ細胞を収集し培養するために用いられる。
初期の集合体のサイズは、細胞を播種する密度を調整することにより制御しうる。
ＥＢあたり１個・１００個・５００個の細胞密度を、ターゲットにした。
播種から２４時間後の集合体のサイズを測定して比較した（図１３Ａ～図１３Ｃ参照）。
１個の細胞、１００個の細胞、５００個の細胞は、直径が１０～４０μｍ、９０～１３０μｍおよび１１０～１７０μｍのＥＢを導いた。

【0127】

［集合体の成長］
ＰＥＧ中における直径４００μｍのＵ底マイクロウェルとＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００（ＡＷ ＰＤＭＳ）の間で、５００個の細胞のＥＢの開始密度（図１４Ｄ参照）から５日間以上経過した集合体の成長を定量化した。
成長率は、ＲＢＷ ＰＥＧについて４８時間後に著しく（ｐ＜０．０００１）増加した（図１４Ａ）。
さらにマイクロウェルあたり５００個のＯｃｔ４：：ｅＧＦＰ細胞の培養は、ＡＷ ＰＤＭＳと比較して（図１４Ｃ～図１４Ｄ）、ＲＢＷ ＰＥＧの方がより大きく且つより単分散である最終的な集合体数を導く。

【0128】

［媒体交換と集合体の回復］
媒体は、古い媒体の全量を吸引するとともに培養プレートの側壁に丁寧なピペット操作を介して同量を交換することにより、連続する５日間の各々について２４時間ごとにＡＷ ＰＤＭＳならびにＲＢＷ ＰＥＧの両方について交換した。
媒体交換後にアレイ表面全体を毎回写真撮影し、集合体の損失を定量化した。
集合体の損失は、ＡＥＰＤＭＳおよびＲＢＷＰＥＧともに１０％を下回っており良好だった（図１４Ｅ参照）。

【0129】

集合体は、毎回の全溶液交換をウェルの中心においてピペット操作により３回行ったあと、新しい培養プレートに上澄みを移すことにより回復した。
この手順ののち、集合体回復を定量化するためにアレイ全体を撮影した。
ＡＷ ＰＤＭＳならびにＲＢＷ ＰＥＧの両方ともに、集合体は１００％ちかく回復した（図１４Ｆ）。
回復した集合体は、他の生物学的分析に使用できる。
流動細胞計測法によりＲＢＷ ＰＥＧ上で５日間にわたって培養したＥＢから分離された細胞により、Ｏｃｔ４の発現を測定した。
９９％の細胞は、培養した後もＯｃｔ４の発現を保った（図１４Ｇ）。

【0130】

［様々な細胞腫の集合体］
Ｕ底マイクロウェルアレイは、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧヒドロゲル中で成形される。
様々な細胞腫の集合体は、所定の開始密度でこれらのマイクロウェルアレイ中に形成された。
Ｃ２Ｃ１２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞、ＮＭｕＭＧクローンＥ９および人間の間充織幹細胞は、２４時間以内にＵ底マイクロウェル上に効率的にクラスタを形成する。
クラスタは安定しており、人間のＭＳＣで論証したように（図１５）、培養後においても効率的に採取できる。

【0131】

Ｕ底マイクロウェル３は、非球状形に形成された癌細胞線ＭＤＡ ＭＢ２３１により実証されたように、集合体に先天的に耐性のある細胞を分析するために使用できる。
１２０時間後にはマイクロウェル３アレイ４から安定的なクラスタすらも回収されるように（図１６）、２４時間以内に、細胞は緩やかに封入されたクラスタ（その後の培養中にさらに密集する）を形成する。

【0132】

マウスＯＰ９細胞は、２４時間以内に安定的なクラスタを形成する。
この形態において培養を保ったままにすることで細胞は、また外因性の脂肪生成の分化する要因（デキサメタゾン、ＩＢＭＸおよびインシュリン）なしに３日以内に脂肪細胞へと効率的に分化する。
脂肪細胞クラスタは、この時点に合わせてマイクロウェルアレイから採取される（図１６参照）。

【0133】

［平面的な３次元カプセル封入］
Ｕ底マイクロウェルアレイは撮影品質ならびに時間消費を改善するため、細胞ならびに球状体の平面的な３次元カプセル封入用に使用できる。
概念の証明として、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ－Ａｌｅｘａ５４６ Ｕ底マイクロウェルアレイを形成した。
重合した後、２００μｍ １０％のＰＥＧ－Ａｌｅｘａ４８８ビーズは、マイクロウェルアレイの上部に分配されるとともに開孔の中に置いたまま放置される。
ビーズで充たしたアレイはその後に５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ－Ａｌｅｘａ６４７の第２層により密封され、３次元ＰＥＧ環境における単焦点平面内のビーズを完全にカプセル封入する（図１７参照）。

【0134】

［微小流体の収集］
新しい培養プレートを移すことなく形成後の細胞球状体を局所的かつ一時的な生化学的操作を実現することを目的として、２４時間以内に所望の分子の拡散を確保するために近接（距離およそ５００μｍ未満）したマイクロウェル３平面下でのミクロ成形により微小流体チャネルを発生させる。
原理の証明として、ＦＩＴＣで標識化された高分子重量（２０００ｋＤａ）デキストランはＵ底マイクロウェルアレイ下方のチャネルを通じて灌流する。
同デキストランはヒドロゲルネットワークを介しては灌流できず、微小流体チャネルの内部だけを効率的に且つ選択的に区別される（図１８参照）。

【0135】

［マイクロウェルの機能化］
Ｕ底マイクロウェル３は、以前に開示された手法（コベル等２０１２年）により異なる蛋白質を用いて機能化しうる。
つまり蛋白質の薄膜は、ＰＤＭＳ表面上の蛋白質の吸収を実現するために、ＰＤＭＳスタンプが置かれる親水性のスライドガラス上に形成される。
その後におけるＰＥＧの成形処置の間に、蛋白質は、静的相互作用ないしは共有結合形成のどちらか一方を介してヒドロゲル網状組織の中に組入れられるヒドロゲル表面へと移される。
原理の証明として、５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ－Ａｌｅｘａ４８８ヒドロゲルを機能化するために、本願発明者らはＢＳＡを標識化するＡｌｅｘａ６４７を使用した（図１９参照）。

【0136】

［異なる形状のマイクロウェル］
本願の技術によれば、どんな形のＵ底マイクロウェル３も特定の応用に対して作り上げることができる（図２０参照）。
細胞ないしは細胞集合体の機能は、それらの培養基板の幾何学的配置によって強い影響を受けることが実際に示された。
したがって本願のマイクロウェル３アレイ４は、どの機能が幾何学的配置と関連しているかを解き明かす高度な潜在的能力を有している。

【0137】

本願中に記載されている例、実施形態および過程処置はあくまで例であり、限定的に解釈されるべきではない。

【0138】

本発明の範囲内において、実質同一の装置・材料および過程ないしは処置による他の応用が可能である。
また、ここで記載された実施形態は事情に応じて任意に組合せればよい。

【0139】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】