特許 7089470 抗体およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-14

(45)【発行日】2022-06-22

(54)【発明の名称】抗体およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220615BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220615BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220615BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220615BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220615BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20220615BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P31/00

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2018528585

(86)(22)【出願日】2016-12-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-01-24

(86)【国際出願番号】 US2016064642

(87)【国際公開番号】W WO2017096179

(87)【国際公開日】2017-06-08

【審査請求日】2019-12-02

(31)【優先権主張番号】62/262,369

(32)【優先日】2015-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/419,911

(32)【優先日】2016-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515124598

【氏名又は名称】アジェナス インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(73)【特許権者】

【識別番号】516029470

【氏名又は名称】ルドウイグ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ エルティーディー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ウィルソン， ニコラス エス．

(72)【発明者】

【氏名】ワイト， ジェレミー ディー．

(72)【発明者】

【氏名】リッター， ゲルト

(72)【発明者】

【氏名】スカエル， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ヒルシュホルン－サイマーマン， ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】メルゴウブ， タハ

(72)【発明者】

【氏名】ブレオス－ニストロム， エカテリーナ ブイ．

(72)【発明者】

【氏名】シーベルト， フォルカー

(72)【発明者】

【氏名】辻 武正

(72)【発明者】

【氏名】レジェ， オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】アンダーウッド， デニス ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ファン ダイク， マルク

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２７８１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１５３５１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００７／１３３８２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００８－２７８８１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５３３９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／１６５７７１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１０－５１８８７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５２３２４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３８０５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第０３／１０６４９８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１１－５０５８３６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合領域であって、前記第１の抗原結合領域は、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３のＣＤＲを含む第１のＶＨと、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３のＣＤＲを含む第１のＶＬとを含み、前記第１のＶＨが、配列番号５４のＶＨアミノ酸配列のＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記第１のＶＬが、配列番号５５のＶＬアミノ酸配列のＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合領域；ならびに
（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合領域であって、前記第２の抗原結合領域は、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３のＣＤＲを含む第２のＶＨと、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３のＣＤＲを含む第２のＶＬとを含み、前記第２のＶＨが、配列番号１８のＶＨアミノ酸配列のＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２およびＶＨ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記第２のＶＬが、配列番号１９のＶＬアミノ酸配列のＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合領域
を含む、単離された多特異性抗体。

【請求項2】

（ａ）前記第１の抗原結合領域のＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号４７、４８、４９、５０、５１および５２のアミノ酸配列を含み；かつ
（ｂ）前記第２の抗原結合領域のＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２およびＶＬ－ＣＤＲ３がそれぞれ、配列番号７、１０、３、１４、５および１６のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の多特異性抗体。

【請求項3】

前記第１のＶＨが、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、前記第１のＶＬが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多特異性抗体。

【請求項4】

前記第２のＶＨが、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記第２のＶＬが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の多特異性抗体。

【請求項5】

前記第１のＶＨが、配列番号５４のアミノ酸配列を含み、前記第１のＶＬが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の多特異性抗体。

【請求項6】

前記第１の抗原結合領域および／または前記第２の抗原結合領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域またはヒトラムダ軽鎖定常領域からなる群より選択される軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の多特異性抗体。

【請求項7】

前記第１の抗原結合領域および／または前記第２の抗原結合領域が、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２からなる群より選択される重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の多特異性抗体。

【請求項8】

前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域である、請求項７に記載の多特異性抗体。

【請求項9】

前記第２の抗原結合領域が、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、 前記第１の抗原結合領域が、配列番号６７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の多特異性抗体。

【請求項10】

前記第２の抗原結合領域が、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、ならびに
前記第１の抗原結合領域が、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、
請求項５に記載の多特異性抗体。

【請求項11】

前記多特異性抗体が、カッパ－ラムダボディ、二重親和性再ターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ノブ・イン・ホール抗体、または鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多特異性抗体。

【請求項12】

Ｔ３６６Ｗ変異が一方の重鎖のアミノ酸配列に導入されており、
Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異が前記多特異性抗体の他方の重鎖に導入されており、ここで、アミノ酸位置は、ＥＵ番号制に従い番号付けられる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多特異性抗体。

【請求項13】

前記多特異性抗体が、一方の重鎖にＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ変異を含み、ここで、アミノ酸位置は、ＥＵ番号制に従い番号付けられる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の多特異性抗体。

【請求項14】

（ｉ）請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体の前記第１の抗原結合領域の前記軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）または軽鎖をコードする核酸分子、（ｉｉ）請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体の前記第１の抗原結合領域の前記重鎖可変ドメイン（ＶＨ）または重鎖をコードする核酸分子、（ｉｉｉ）請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体の前記第２の抗原結合領域の前記ＶＬまたは軽鎖をコードする核酸分子、および（ｉｖ）請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体の前記第２の抗原結合領域の前記ＶＨまたは重鎖をコードする核酸分子を含む、組成物。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体、および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項16】

対象における癌の処置のための方法において使用するための請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体または請求項１５に記載の医薬組成物であって、前記方法は、前記対象に、有効量の前記多特異性抗体または前記医薬組成物を投与することを含む、多特異性抗体または医薬組成物。

【請求項17】

前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、結腸癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の多特異性抗体または医薬組成物。

【請求項18】

対象における感染性疾患の処置のための方法において使用するための請求項１～１３のいずれか１項に記載の多特異性抗体または請求項１５に記載の医薬組成物であって、前記方法は、前記対象に、有効量の前記多特異性抗体または前記医薬組成物を投与することを含む、多特異性抗体または医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．関連出願
本出願は、２０１５年１２月２日に提出した米国仮出願第６２／２６２，３６９号、および２０１６年１１月９日に提出した第６２／４１９，９１１号の優先権を主張し、その開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出し、参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む（２０１６年１２月１日に作製した、当該ＡＳＣＩＩコピーは、３６１７＿０１６ＰＣ０２＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴと命名し、サイズ２７４，６７５バイトである）。

【0003】

３．技術分野
本開示は、ヒトグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連受容体（ＧＩＴＲ）および／またはヒトＯＸ４０受容体（「ＯＸ４０」）に特異的に結合する多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、かかる抗体を含む組成物、ならびにそれらの抗体を製造および使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

４．背景技術
ヒト腫瘍成長の制御における自然および適応免疫応答の寄与は、十分に特徴付けられている（Ｖｅｓｅｌｙ ＭＤ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２３５－２７１）。結果として、Ｔ細胞により発現される刺激性受容体のアゴニスト抗体での、または抑制性受容体の機能的アンタゴニストでのターゲティングのような、癌治療の目的でＴ細胞応答を増強することを目指す、抗体ベースのストラテジーが登場した（Ｍｅｌｌｍａｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４８０：４８０－４８９）。抗体により仲介されるアゴニストおよびアンタゴニストアプローチは、前臨床を示し、さらに最近では臨床的な活動を明らかにした。

【0005】

免疫応答の２つの重要な刺激因子は、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）およびＯＸ４０受容体（「ＯＸ４０」）である。ＧＩＴＲおよびＯＸ４０両方が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである。

【0006】

ＧＩＴＲ（活性化誘導可能なＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ）、ＧＩＴＲ－Ｄ、ＣＤ３５７、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）としても公知）は、自然および適応免疫システムの多くの成分において発現され、獲得および自然免疫両方を刺激する（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ９４：６２１６－６２２１；Ｈａｎａｂｕｃｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３６１７－３６２３；Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ＆ Ｒｉｃｃａｒｄｉ Ｃ（２００５）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５：１０１６－１０２２；Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：１１６５－１１６９）。それは、Ｔ、Ｂ、樹状（ＤＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、幾つかの細胞ならびに組織において発現され、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上、内皮細胞上、およびまた腫瘍細胞において主に発現される、そのリガンド、ＧＩＴＲＬにより活性化される。ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬシステムは、自己免疫／炎症応答の発生に関与し、炎症および腫瘍への応答を強化する。例えば、動物のＧＩＴＲ－Ｆｃ融合タンパク質での処置は、自己免疫／炎症性疾患を改善し、一方、ＧＩＴＲトリガーは、ウイルス、細菌、および寄生虫感染を処置する際、その上、腫瘍に対する免疫応答をブースとする際に有効である（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １６５：２０８９－９９）。これらの効果は、エフェクターＴ細胞の同時活性化、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の阻害、ＮＫ細胞同時活性化、マクロファージの活性化、樹状細胞機能の調整、および血管外漏出過程の調節を含む幾つかの同時メカニズムによる。ＧＩＴＲの膜発現は、Ｔ細胞活性化の後に増大する（上記Ｈａｎａｂｕｃｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）；上記Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ＆ Ｒｉｃｃａｒｄｉ Ｃ）。そのトリガーは、エフェクターＴリンパ球を同時活性化する（ＭｃＨｕｇｈ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：３１１－３２３；Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：１３５－１４２；Ｒｏｎｃｈｅｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：６１３－６２２；Ｔｏｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００３）ＰＮＡＳ １００：１５０５９－１５０６４）。ＧＩＴＲ活性化は、腫瘍およびウイルス感染に対する抵抗性を増大し、自己免疫／炎症過程に関与し、白血球血管外漏出を調節する（上記Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ＆ Ｒｉｃｃａｒｄｉ Ｃ（２００５）；Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ７６：９３３－９４０；Ｓｈｅｖａｃｈ ＥＭ ＆ Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ＧＬ（２００６）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：６１３－６１８；Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７：６３１－６４１；Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＦＡＳＥＢ Ｊ ２１：１１７－１２９）。

【0007】

ヒトＧＩＴＲは、抹消（活性化されていない）Ｔ細胞において非常に低いレベルで発現される。Ｔ細胞活性化後、ＧＩＴＲは、数日間、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞両方において強く上方調節され（Ｋｗｏｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４：６０５６－６０６１；Ｇｕｒｎｅｙ ＡＬ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ９：２１５－２１８；上記Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）；上記Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００２）；上記Ｊｉ ＨＢ ｅｔ ａｌ．，（２００４）；Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００：３５０－３５２；Ｌｉ Ｚ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ ２１：８３－９２）、ＣＤ４^＋細胞はＣＤ８^＋細胞より高いＧＩＴＲ発現を有する（Ｋｏｂｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８（１０）：２６７８－８８；Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４１（８）：２２６９－７８）。

【0008】

ＯＸ４０（ＣＤ１３４、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＴＸＧＰ１Ｌ、ＡＣＴ３５、およびＡＣＴ－４としても公知）は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、およびＮＫ細胞機能を調整する（Ｓｕｇａｍｕｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：４２０－４３１）。ＯＸ４０は、同族ペプチドを負荷されたＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子を提示する専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後に、抗原特異的Ｔ細胞により上方調節され得る（Ｓｕｇａｍｕｒａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：４２０－４３１）。成熟の際、樹状細胞（ＤＣ）のようなＡＰＣは、刺激性Ｂ７ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６）、並びにＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）を含むアクセサリー同時刺激性分子を上方調節し、Ｔ細胞免疫応答の動態および規模、並びに有効なメモリー細胞分化を形作ることを助ける。特に、Ｂ細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、およびある場合では活性化されたＴ細胞のような、他の細胞タイプはまた、ＯＸ４０Ｌの恒常的および／または誘導可能なレベルも発現し得る（Ｓｏｒｏｏｓｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：５９７５－５９８７）。ＯＸ４０：ＯＸ４０Ｌ同時会合は、受容体３量体の高次クラスター形成、続くシグナル伝達をもたらすと考えられている（Ｃｏｍｐａａｎ ＤＭ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １４：１３２１－１３３０）。

【0009】

腫瘍微小環境内でのＴ細胞によるＯＸ４０発現が、マウスおよびヒト腫瘍組織において観察された（Ｂｕｌｌｉａｒｄ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９２：４７５－４８０およびＰｉｃｏｎｅｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６０：１４９４－１５０７）。ＯＸ４０は、従来のＴ細胞集団と比べ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の腫瘍内集団により高発現され、それらの増殖状態に起因する特性である（Ｗａｉｇｈｔ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９４：８７８－８８２およびＢｕｌｌｉａｒｄ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９２：４７５－４８０）。初期の研究は、ＯＸ４０アゴニスト抗体が、マウスモデルにおいて腫瘍拒絶を誘発することができたことを示した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＡＤ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０－２１６９およびＰｉｃｏｎｅｓｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０５：８２５－８３９）。ヒトＯＸ４０シグナル伝達を刺激するマウス抗体はまた、癌患者において免疫機能を増強することが示された（Ｃｕｒｔｉ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７３：７１８９－７１９８）。

【0010】

ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの相互作用はまた、喘息／アトピー、脳脊髄炎、関節リウマチ、大腸炎／炎症性腸疾患、移植片対宿主疾患（例えば、移植片拒絶）、非肥満糖尿病マウスにおける糖尿病、およびアテローム性動脈硬化症のマウスモデルを含む、炎症ならびに自己免疫疾患ならびに障害における免疫応答と関連付けられた（Ｃｒｏｆｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２２９（１）：１７３－１９１、およびそこで引用される参考文献）。疾患および障害と関連する総体症状の低減は、ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌ欠損マウスにおいて、細胞分裂阻害薬を負荷された抗ＯＸ４０リポソームを受けたマウスにおいて、およびＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの相互作用が、抗ＯＸ４０Ｌブロッキング抗体またはヒト免疫グロブリンのＦｃ部分に融合された組換えＯＸ４０で阻害されたマウスにおいて報告された（Ｃｒｏｆｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．；Ｂｏｏｔ ＥＰＪ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ７：Ｒ６０４－６１５；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＡＤ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２：１８１８－１８２６）。ブロッキング抗ＯＸ４０Ｌ抗体での処置はまた、喘息のアカゲザルモデルにおいてＴｈ２炎症を阻害することが示された（Ｃｒｏｆｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｓｈａｓａｙｅｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１７：３８６８－３８７８）。加えて、ＯＸ４０Ｌにおける多型は、ループスと関連付けられた（Ｃｒｏｆｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．）。
免疫応答の調整におけるヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０の役割を考えると、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に特異的に結合する抗体、ならびにＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０活性を調整するためのこれらの抗体の使用が、本明細書において提供される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【文献】Ｖｅｓｅｌｙ ＭＤ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２３５－２７１

【文献】Ｍｅｌｌｍａｎ Ｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４８０：４８０－４８９

【文献】Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ９４：６２１６－６２２１

【文献】Ｈａｎａｂｕｃｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｌｏｏｄ １０７：３６１７－３６２３

【文献】Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ＆ Ｒｉｃｃａｒｄｉ Ｃ（２００５）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５：１０１６－１０２２

【文献】Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：１１６５－１１６９

【文献】Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １６５：２０８９－９９

【文献】ＭｃＨｕｇｈ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １６：３１１－３２３

【文献】Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：１３５－１４２

【文献】Ｒｏｎｃｈｅｔｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：６１３－６２２

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【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

５．概要
１つの態様において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体が、本明細書において提供される。一例において、単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0013】

一例において、抗体は、ヒトＯＸ４０およびＴＮＦスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインを含む。一例において、抗体は、ＴＮＦスーパーファミリータンパク質、およびヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。ＴＮＦスーパーファミリータンパク質は、本明細書において提供される任意の多特異性（例えば、二重特異性）抗体において第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインを置換し得る。

【0014】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）（ｉ）ＧＳＡＭＨ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）－相補性決定領域（ＣＤＲ）１；（ｉｉ）ＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）ＧＩＹＤＳＳＧＹＤＹ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；（ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）－ＣＤＲ１；（ｖ）ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および（ｖｉ）ＭＱＧＳＫＷＰＬＴ（配列番号５２）またはＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）第２の抗原結合ドメインを含む。

【0015】

一例では、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＯＸ４０の同じエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）第２の抗原結合ドメインを含む。

【0016】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合し、配列番号７２のヒトＯＸ４０配列への結合と比較して、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｐ１１５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異の存在を除き配列番号７２と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）第２の抗原結合ドメインを含む。

【0017】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）ＶＨおよびＶＬを含むヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、ここで、ＶＨは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；ならびに（ｂ）第２の抗原結合ドメインを含む。

【0018】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）ＶＨおよびＶＬを含むヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、ここで、ＶＬは、配列番号５５または配列番号５６のアミノ酸配列を含む；（ｂ）第２の抗原結合ドメインを含む。

【0019】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）Ｘ_１ＹＸ_２ＭＸ_３（配列番号８７）（式中、Ｘ_１は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ_２は、ＡまたはＶであり；_３は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；（ｉｉ）Ｘ_１ＩＸ_２ＴＸ_３ＳＧＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＹＮＱＫＦＸ_７Ｘ_８（配列番号８８）（式中、Ｘ_１１は、ＶまたはＬであり；Ｘ_２は、Ｒ、ＫまたはＱであり；Ｘ_３は、ＹまたはＦであり；Ｘ_４は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ_５は、ＶまたはＬであり；Ｘ_６は、ＴまたはＳであり；Ｘ_７は、Ｋ、ＲまたはＱであり；Ｘ_８は、Ｄ、ＥまたはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；（ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ_１ＮＱＫＮＹＬＸ_２（配列番号９０）（式中、Ｘ_１は、ＧまたはＳであり；Ｘ_２は、ＴまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；（ｖ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および（ｖｉ）ＱＮＸ_１ＹＳＸ_２ＰＹＴ（配列番号９２）（式中、Ｘ_１は、ＤまたはＥであり；Ｘ_２は、Ｙ、ＦまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含むヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0020】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＧＩＴＲの同じエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0021】

一例では、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；および（ｂ）配列番号４１の残基６０～６３における少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＧＩＴＲのエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0022】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）ｉ）配列番号４１の残基２６～２４１を含むヒトＧＩＴＲ、およびｉｉ）配列番号４６の残基２６～２３４を含む、カニクイザルＧＩＴＲのバリアントのいずれかに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号４４の残基２６～２３４を含むカニクイザルＧＩＴＲに特異的に結合しない。

【0023】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；および（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡまたはＧ６３Ａアミノ酸置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１に同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する第２の抗原結合ドメインを含む。

【0024】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し、ＶＨおよびＶＬを含む第２の抗原結合ドメインを含み、ここで、ＶＨは、配列番号１８、２０、２２、２４、および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0025】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し、ＶＨおよびＶＬを含む第２の抗原結合ドメインを含み、ここで、ＶＬは、配列番号１９、２１、２３、および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、第２の抗原結合ドメインを含む。一例において、第２の抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する。一例において、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０（例えば、ここで、第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと異なるＯＸ４０エピトープに結合する）、ＣＤ１３７、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ２７、およびＨＶＥＭからなる群から選択される。

【0027】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、第１の抗原結合ドメインを含む。一例において、第１の抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する。一例において、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、ＧＩＴＲ（例えば、ここで、第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと異なるＧＩＴＲエピトープに結合する）、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ２７、およびＨＶＥＭからなる群から選択される。

【0028】

一例において、第２の抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する。一例において、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、（ｉ）Ｘ_１ＹＸ_２ＭＸ_３（配列番号８７）（式中、Ｘ_１は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ_２は、ＡまたはＶであり；Ｘ_３は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；（ｉｉ）Ｘ_１ＩＸ_２ＴＸ_３ＳＧＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＹＮＱＫＦＸ_７Ｘ_８（配列番号８８）（式中、Ｘ_１は、ＶまたはＬであり；Ｘ_２は、Ｒ、ＫまたはＱであり；Ｘ_３は、ＹまたはＦであり；_４は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ_５は、ＶまたはＬであり；Ｘ_６は、ＴまたはＳであり；Ｘ_７は、Ｋ、ＲまたはＱであり；Ｘ_８は、Ｄ、ＥまたはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；（ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ_１ＮＱＫＮＹＬＸ_２（配列番号９０）（式中、Ｘ_１は、ＧまたはＳであり；Ｘ_２は、ＴまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；（ｖ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および（ｖｉ）ＱＮＸ_１ＹＳＸ_２ＰＹＴ（配列番号９２）（式中、Ｘ_１は、ＤまたはＥであり；Ｘ_２は、Ｙ、ＦまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＧＩＴＲの同じエピトープに結合する。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基６０～６３における少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＧＩＴＲのエピトープに結合する。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ｉ）配列番号４１の残基２６～２４１を含むヒトＧＩＴＲ、およびｉｉ）配列番号４６の残基２６～２３４を含む、カニクイザルＧＩＴＲのバリアントのいずれかに結合し、ここで、第２の抗原結合ドメインは、配列番号４４の残基２６～２３４を含むカニクイザルＧＩＴＲに特異的に結合しない。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡまたはＧ６３Ａアミノ酸置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＶＨおよびＶＬを含み、ここで、ＶＨは、配列番号１８、２０、２２、２４、および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ＶＨおよびＶＬを含み、ここで、ＶＬは、配列番号１９、２１、２３、および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0029】

一例において、第１の抗原結合ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質ヒトＯＸ４０に特異的に結合する。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、（ｉ）ＧＳＡＭＨ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；（ｉｉ）ＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）ＧＩＹＤＳＳＧＹＤＹ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；（ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；（ｖ）ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および（ｖｉ）ＭＱＧＳＫＷＰＬＴ（配列番号５２）またはＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＯＸ４０の同じエピトープに結合する。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号７２のヒトＯＸ４０配列への結合と比較して、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｐ１１５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異の存在を除き配列番号７２と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、ＶＨおよびＶＬを含み、ＶＨは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、ＶＨおよびＶＬを含み、ＶＬは、配列番号５５または配列番号５６のアミノ酸配列を含む。

【0030】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、（ｉ）Ｘ_１ＹＡＭＸ_２（配列番号１）（式中、Ｘ_１は、Ｄ、Ｇ、またはＥであり；Ｘ_２は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；（ｉｉ）Ｘ_１ＩＲＴＹＳＧＸ_２ＶＸ_３ＹＮＱＫＦＸ_４Ｘ_５（配列番号２）（式中、Ｘ_１は、ＶまたはＬであり；Ｘ_２は、ＤまたはＧであり；Ｘ_３は、ＴまたはＳであり；Ｘ_４は、Ｋ、Ｒ、またはＱであり；Ｘ_５は、Ｄ、Ｅ、またはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；（ｉｉｉ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；（ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ_１ＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号４）（式中、Ｘ_１は、ＧまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；（ｖ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および（ｖｉ）ＱＮＸ_１ＹＳＸ_２ＰＹＴ（配列番号６）（式中、Ｘ_１は、ＤまたはＥであり；Ｘ_２は、ＹまたはＦである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。

【0031】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４または１５のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１６または１７のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。

【0032】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、それぞれ、配列番号７、１０、および３；配列番号８、１１、および３；配列番号９、１２、および３；もしくは配列番号９、１３、および３において記載されるＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ならびにＶＨ－ＣＤＲ３配列；ならびに／またはそれぞれ、配列番号１４、５、および１６；もしくは配列番号１５、５、および１７において記載されるＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ならびにＶＬ－ＣＤＲ３配列を含む。

【0033】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、それぞれ、配列番号７、１０、３、１４、５、および１６において記載されるＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ならびにＶＬ－ＣＤＲ３配列を含む。

【0034】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８、２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８、２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0035】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２９～３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７４～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0036】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0037】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１９、２１、および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１９、２１、および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0038】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0039】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0040】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、それぞれ、配列番号１８および１９、配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、または配列番号２４および２３において記載されるＶＨならびにＶＬ配列を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８において記載される配列を含むＶＨ、および配列番号１９において記載される配列を含むＶＬを含む。

【0041】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0042】

一例において、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0043】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0044】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５９～６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１１８～１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0045】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＨを含む。

【0046】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５５もしくは配列番号５６のアミノ酸配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0047】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0048】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0049】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、それぞれ、配列番号５４および５５、または配列番号５４および５６において記載されるＶＨならびにＶＬ配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0050】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＨ、およびヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。

【0051】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５４において記載されるＶＨ配列、および配列番号５５または５６において記載されるＶＬ配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１８において記載されるＶＨ配列、および配列番号１９において記載されるＶＬ配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号５９において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号２９において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１１８において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７４において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６１において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３１において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２０において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ここで、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７６において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６２において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３２において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２１において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ここで、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７７において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６４において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３４において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２３において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ここで、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号７９において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６５において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号３５において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号１２４において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ここで、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号８０において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６７において記載される軽鎖配列を含む。一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、配列番号６９において記載される軽鎖配列を含む。

【0052】

一例において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列に由来するＶＨ、およびヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列に由来するＶＬを含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列に由来するＶＨ、およびヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列に由来するＶＬを含む。

【0053】

一例において、抗体は、カッパ－ラムダボディ、二重親和性再ターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ノブ・イン・ホール抗体、鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）抗体（ジェンマブ）である。

【0054】

一例において、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＩｇＧ_１、ヒトＩｇＧ_２、ヒトＩｇＧ_３、ヒトＩｇＧ_４、ヒトＩｇＡ_１、およびヒトＩｇＡ_２からなる群から選択される重鎖定常領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、ヒトＩｇＧ_１、ヒトＩｇＧ_２、ヒトＩｇＧ_３、ヒトＩｇＧ_４、ヒトＩｇＡ_１、およびヒトＩｇＡ_２からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。一例において、第１の抗原結合ドメインの重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ_１であり、第２の抗原結合ドメインの重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ_１である。

【0055】

一例において、（ａ）第１の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌアミノ酸変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、（ｂ）第２の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒアミノ酸変異を含む第２の重鎖定常領域を含む。一例において、（ａ）第１の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒアミノ酸変異を含む第１の重鎖定常領域を含み、（ｂ）第２の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌアミノ酸変異を含む重鎖定常領域を含む。一例において、第１の抗原結合ドメインの重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１である。一例において、第２の抗原結合ドメインの重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１である。

【0056】

一例において、第１の抗原結合ドメインは、ヒトＩｇＧ_κおよびＩｇＧ_λからなる群から選択される軽鎖定常領域を含み、第２の抗原結合ドメインは、ヒトＩｇＧ_κおよびＩｇＧ_λからなる群から選択される軽鎖定常領域を含む。

【0057】

一例において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番４１に従い番号付けられた、Ｄ６０Ａ置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する。一例において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｇ６３Ａ置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する。一例において、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基６０、６２、および６３からなる群から選択される少なくとも１つの残基に結合する。一例において、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基６２および６３からなる群から選択される少なくとも１つの残基に結合する。一例において、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基６０および６３からなる群から選択される少なくとも１つの残基に結合する。一例において、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基６０～６３を含むエピトープに結合する。

【0058】

一例において、抗体は、（ｉ）ヒトＧＩＴＲに結合し、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０を発現する細胞への増大した結合を示し、ならびに／または（ｉｉ）ヒトＯＸ４０に結合し、ヒトＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０を発現する細胞への増大した結合を示す。

【0059】

一例において、抗体は、（ｉ）ヒトＧＩＴＲに結合し、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ＧＩＴＲ陽性、ＯＸ４０陰性細胞への低下した結合を示し、ならびに／または（ｉｉ）ヒトＯＸ４０に結合し、ヒトＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ＧＩＴＲ陰性、ＯＸ４０陽性細胞への低下した結合を示す。

【0060】

一例において、抗体は、（ｉ）ヒトＧＩＴＲに結合し、ヒトＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、制御性Ｔ細胞に対してより強いナチュラルキラー細胞介在性細胞毒性を誘導し、ならびに／または（ｉｉ）ヒトＯＸ４０に結合し、ヒトＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、制御性Ｔ細胞に対してより強いナチュラルキラー細胞介在性細胞毒性を誘導する。

【0061】

一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲリガンドのヒトＧＩＴＲへの結合を阻害する。一例において、抗体は、ヒトＯＸ４０リガンドのヒトＯＸ４０への結合を阻害する。

【0062】

一例において、抗体は、活性化された制御性Ｔ細胞に結合したとき、抗体が、活性化されたエフェクターＴ細胞に結合したとき、ＣＤ１６、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ６４からなる群から選択される活性化しているＦｃガンマ受容体に結合するより高い程度まで、ＣＤ１６、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ６４からなる群から選択される活性化しているＦｃガンマ受容体に結合する。一例において、活性化しているＦｃガンマ受容体は、骨髄由来エフェクター細胞およびリンパ球由来エフェクター細胞からなる群から選択される細胞上で発現される。

【0063】

一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲおよび／またはヒトＯＸ４０に対してアゴニストである。一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲの活性を誘導するか、活性化するか、または増強する。一例において、抗体は、ヒトＯＸ４０の活性を誘導するか、活性化するか、または増強する。

【0064】

一例において、第１の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａ変異もしくはＮ２９７Ｑ変異を含むヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域を含み、および／または第２の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａ変異もしくはＮ２９７Ｑ変異を含むヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域を含む。

【0065】

一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲおよび／またはヒトＯＸ４０に対してアンタゴニストである。一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲの活性を不活性化するか、低減するか、または阻害する。一例において、抗体は、ヒトＯＸ４０の活性を不活性化するか、低減するか、または阻害する。一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲシグナル伝達を阻害するか、または低減する。一例において、抗体は、ヒトＯＸ４０シグナル伝達を阻害するか、または低減する。一例において、抗体は、ヒトＧＩＴＲリガンドにより誘導されるヒトＧＩＴＲシグナル伝達を阻害するか、または低減する。一例において、抗体は、ヒトＯＸ４０リガンドにより誘導されるヒトＯＸ４０シグナル伝達を阻害するか、または低減する。

【0066】

一例において、抗体は、関節リウマチ患者由来の滑液により誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を低下させる。一例において、抗体は、ヒトＰＢＭＣを移植されたＮＯＧマウスの生存を増大する。一例において、抗体は、ＧＶＨＤモデルにおいて制御性Ｔ細胞の増殖を増大する。

【0067】

一例において、抗体は、検出可能な標識をさらに含む。

【0068】

組成物もまた、本明細書において提供される。一例において、組成物は、（ｉ）本明細書において提供される抗体の第１の抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、（ｉｉ）本明細書において提供される抗体の第１の抗原結合フラグメントの重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子、（ｉｉｉ）本明細書において提供される抗体の第２の抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、および（ｉｖ）本明細書において提供される抗体の第２の抗原結合フラグメントの重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を含む。

【0069】

宿主細胞もまた、本明細書において提供される。一例において、宿主細胞は、（ｉ）本明細書において提供される抗体の第１の抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、（ｉｉ）本明細書において提供される抗体の第１の抗原結合フラグメントの重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子、（ｉｉｉ）本明細書において提供される抗体の第２の抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、および（ｉｖ）本明細書において提供される抗体の第２の抗原結合フラグメントの重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を含む。一例において、宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳ０、ＰＥＲ－Ｃ６、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養中のヒト細胞からなる群から選択される。ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体を作製する方法もまた、本明細書において提供される。一例において、方法は、核酸分子が発現され、抗体が産生されるように、本明細書において提供される宿主細胞を培養することを含む。

【0070】

ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体を使用する方法もまた、本明細書において提供される。一例において、試料においてＧＩＴＲおよびＯＸ４０を発現する細胞を検出する方法は、試料を本明細書において提供される抗体と接触させることを含む。

【0071】

医薬組成物もまた、本明細書において提供される。一例において、医薬組成物は、本明細書において提供される抗体、および医薬的に許容し得る賦形剤を含む。

【0072】

キットもまた、本明細書において提供される。一例において、キットは、本明細書において提供される抗体または医薬組成物、ならびにａ）検出試薬、ｂ）ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０抗原、ｃ）ヒト投与のための使用もしくは販売についての許可を示す注意書き、またはｄ）その組み合わせを含む。

【0073】

本明細書において提供される抗体および医薬組成物を使用する方法もまた、提供される。一例において、対象において免疫応答を調整する方法は、対象に、有効量の本明細書において提供される抗体または医薬組成物を投与することを含む。一例において、対象において免疫応答を増強するか、または誘導する方法は、対象に、有効量の本明細書において提供される抗体または医薬組成物を投与することを含む。

【0074】

一例において、対象において癌を処置する方法は、対象に、有効量の本明細書において提供される抗体または医薬組成物を投与することを含む。一例において、癌は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、結腸癌、および肺癌からなる群から選択される。一例において、方法は、対象に、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤を投与することをさらに含む。一例において、阻害剤はエパカドスタットである。一例において、阻害剤はＦ００１２８７である。一例において、阻害剤はインドキシモドである。一例において、阻害剤はＮＬＧ９１９である。一例において、方法は、対象にワクチンを投与することをさらに含む。一例において、ワクチンは、抗原ペプチドと複合体を形成した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。一例において、熱ショックタンパク質は、ｈｓｐ７０またはｈｓｃ７０であり、腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成する。一例において、熱ショックタンパク質は、ｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成し、ここで、ＨＳＰＰＣは、対象から得られた腫瘍に由来する。一例において、方法は、対象にチェックポイント標的薬剤を投与することをさらに含む。一例において、チェックポイント標的薬剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ－３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ－３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、およびアゴニスト抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される。

【0075】

一例において、感染性疾患を処置する方法は、対象に、有効量の本明細書において提供される抗体または医薬組成物を投与することを含む。

【0076】

一例において、対象において免疫応答を低減するか、または阻害する方法は、対象に、有効量の本明細書において提供される抗体または医薬組成物を投与することを含む。

【0077】

一例において、対象において自己免疫または炎症性疾患もしくは障害を処置する方法は、対象に、有効量の本明細書において提供される抗体または医薬組成物を投与することを含む。一例において、自己免疫または炎症性疾患もしくは障害は、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、脈管炎、喘息、関節リウマチ、皮膚炎、炎症性腸疾患、ぶどう膜炎、ループス、大腸炎、糖尿病、多発性硬化症、および気道炎症からなる群から選択される。

【0078】

一例において、対象はヒトである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
（ａ）（ｉ）ＧＳＡＭＨ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）－相補性決定領域（ＣＤＲ）１；
（ｉｉ）ＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）ＧＩＹＤＳＳＧＹＤＹ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；
（ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）－ＣＤＲ１；
（ｖ）ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）ＭＱＧＳＫＷＰＬＴ（配列番号５２）またはＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３
を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目２）
（ａ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＯＸ４０の同じエピトープに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目３）
（ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合し、配列番号７２のヒトＯＸ４０配列への結合と比較して、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｐ１１５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異の存在を除き配列番号７２と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する第１の抗原結合ドメイン；
（ｂ）第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目４）
（ａ）ＶＨおよびＶＬを含むヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、ここで、前記ＶＨは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む；ならびに
（ｂ）第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目５）
（ａ）ＶＨおよびＶＬを含むヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、ここで、前記ＶＬは、配列番号５５または配列番号５６のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目６）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）（ｉ）Ｘ _１ ＹＸ _２ ＭＸ _３ （配列番号８７）（式中、Ｘ _１ は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ _２ は、ＡまたはＶであり；Ｘ _３ は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；
（ｉｉ）Ｘ _１ ＩＸ _２ ＴＸ _３ ＳＧＸ _４ Ｘ _５ Ｘ _６ ＹＮＱＫＦＸ _７ Ｘ _８ （配列番号８８）（式中、Ｘ _１ は、ＶまたはＬであり；Ｘ _２ は、Ｒ、ＫまたはＱであり；Ｘ _３ は、ＹまたはＦであり；Ｘ _４ はＤ、ＥまたはＧであり；Ｘ _５ は、ＶまたはＬであり；Ｘ _６ は、ＴまたはＳであり；Ｘ _７ は、Ｋ、ＲまたはＱであり；Ｘ _８ は、Ｄ、ＥまたはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；
（ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ _１ ＮＱＫＮＹＬＸ _２ （配列番号９０）（式中、Ｘ _１ は、ＧまたはＳであり；Ｘ _２ は、ＴまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；
（ｖ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）ＱＮＸ _１ ＹＳＸ _２ ＰＹＴ（配列番号９２）（式中、Ｘ _１ は、ＤまたはＥであり；Ｘ _２ は、Ｙ、ＦまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３
を含むヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目７）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＧＩＴＲの同じエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目８）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；および
（ｂ）配列番号４１の残基６０～６３における少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＧＩＴＲのエピトープに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目９）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）ｉ）配列番号４１の残基２６～２４１を含むヒトＧＩＴＲ、およびｉｉ）配列番号４６の残基２６～２３４を含む、カニクイザルＧＩＴＲのバリアントのそれぞれに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン
を含み、配列番号４４の残基２６～２３４を含むカニクイザルＧＩＴＲに特異的に結合しない、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目１０）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；および
（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡまたはＧ６３Ａアミノ酸置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する、第２の抗原結合ドメイン
を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目１１）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し、ＶＨおよびＶＬを含む、第２の抗原結合ドメイン、ここで、前記ＶＨは、配列番号１８、２０、２２、２４、および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目１２）
（ａ）第１の抗原結合ドメイン；ならびに
（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合し、ＶＨおよびＶＬを含む、第２の抗原結合ドメイン、ここで、前記ＶＬは、配列番号１９、２１、２３、および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、
を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された多特異性抗体。
（項目１３）
（ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン；および（ｂ）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリータンパク質を含む、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する単離された抗体。
（項目１４）
前記第２の抗原結合ドメインが、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリータンパク質に特異的に結合する、項目１～５のいずれか１項の抗体。
（項目１５）
前記ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質が、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ２７、およびＨＶＥＭからなる群から選択される、項目１４の抗体。
（項目１６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体であって、（ａ）ＴＮＦスーパーファミリータンパク質、および（ｂ）ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、抗体。
（項目１７）
前記第１の抗原結合ドメインが、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する、項目６～１２のいずれか１項の抗体。
（項目１８）
前記ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質が、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ２７、およびＨＶＥＭからなる群から選択される、項目１７の単離された抗体。
（項目１９）
前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する、項目１～５、１４、または１５のいずれか１項の抗体。
（項目２０）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）Ｘ _１ ＹＸ _２ ＭＸ _３ （配列番号８７）（式中、Ｘ _１ は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ _２ は、ＡまたはＶであり；Ｘ _３ は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；
（ｉｉ）Ｘ _１ ＩＸ _２ ＴＸ _３ ＳＧＸ _４ Ｘ _５ Ｘ _６ ＹＮＱＫＦＸ _７ Ｘ _８ （配列番号８８）（式中、Ｘ _１ は、ＶまたはＬであり；Ｘ _２ は、Ｒ、ＫまたはＱであり；Ｘ _３ は、ＹまたはＦであり；Ｘ _４ は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ _５ は、ＶまたはＬであり；Ｘ _６ は、ＴまたはＳであり；Ｘ _７ は、Ｋ、ＲまたはＱであり；Ｘ _８ は、Ｄ、ＥまたはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；
（ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ _１ ＮＱＫＮＹＬＸ _２ （配列番号９０）（式中、Ｘ _１ は、ＧまたはＳであり；Ｘ _２ は、ＴまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；
（ｖ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）ＱＮＸ _１ ＹＳＸ _２ ＰＹＴ（配列番号９２）（式中、Ｘ _１ は、ＤまたはＥであり；Ｘ _２ は、Ｙ、ＦまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３
を含む、項目１６または１９の抗体。
（項目２１）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＧＩＴＲの同じエピトープに結合する、項目１６、１９、または２０の抗体。
（項目２２）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基６０～６３における少なくとも１つのアミノ酸を含むヒトＧＩＴＲのエピトープに結合する、項目１６または１９～２１のいずれか１項の抗体。
（項目２３）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ｉ）配列番号４１の残基２６～２４１を含むヒトＧＩＴＲ、およびｉｉ）配列番号４６の残基２６～２３４を含む、カニクイザルＧＩＴＲのバリアントのそれぞれに結合し、配列番号４４の残基２６～２３４を含むカニクイザルＧＩＴＲに特異的に結合しない、項目１６または１９～２
２のいずれか１項の抗体。
（項目２４）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡもしくはＧ６３Ａアミノ酸置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する、項目１６または１９～２３のいずれか１項の抗体。
（項目２５）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＨが、配列番号１８、２０、２２、２４、および２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６または１９～２４のいずれか１項の抗体。
（項目２６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＬが、配列番号１９、２１、２３、および２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６または１９～２５のいずれか１項の抗体。
（項目２７）
前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する、項目６～１２、１７、または１８のいずれか１項の抗体。
（項目２８）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）ＧＳＡＭＨ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；
（ｉｉ）ＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）ＧＩＹＤＳＳＧＹＤＹ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；
（ｉｖ）ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；
（ｖ）ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および

（ｖｉ）ＭＱＧＳＫＷＰＬＴ（配列番号５２）またはＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３
を含む、項目１３または２７の抗体。
（項目２９）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体と、ヒトＯＸ４０の同じエピトープに結合する、項目１３、２７、または２８の抗体。
（項目３０）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号７２のヒトＯＸ４０配列への結合と比較して、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｐ１１５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異の存在を除き配列番号７２と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する、項目１３、または２７～２９のいずれか１項の抗体。
（項目３１）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬを含み、前記ＶＨが、配列番号５４のアミノ酸配列を含む、項目１３、または２７～３０のいずれか１項の抗体。
（項目３２）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、ＶＨおよびＶＬを含
み、前記ＶＬが、配列番号５５または配列番号５６のアミノ酸配列を含む、項目１３または２７～３１のいずれか１項の抗体。
（項目３３）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）Ｘ _１ ＹＡＭＸ _２ （配列番号１）（式中、Ｘ _１ は、Ｄ、Ｇ、またはＥであり；Ｘ _２ は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；
（ｉｉ）Ｘ _１ ＩＲＴＹＳＧＸ _２ ＶＸ _３ ＹＮＱＫＦＸ _４ Ｘ _５ （配列番号２）（式中、Ｘ _１ は、ＶまたはＬであり；Ｘ _２ は、ＤまたはＧであり；Ｘ _３ は、ＴまたはＳであり；Ｘ _４ は、Ｋ、Ｒ、またはＱであり；Ｘ _５ は、Ｄ、Ｅ、またはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｉｉｉ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３；
（ｉｖ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ _１ ＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号４）（式中、Ｘ _１ は、ＧまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；
（ｖ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および
（ｖｉ）ＱＮＸ _１ ＹＳＸ _２ ＰＹＴ（配列番号６）（式中、Ｘ _１ は、ＤまたはＥであり；Ｘ _２ は、ＹまたはＦである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３
を含む、項目６～１２、１６、または１９～３２のいずれか１項の抗体。
（項目３４）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１を含む、項目６～１２、１６、または１９～３３のいずれか１項の抗体。
（項目３５）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１０～１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２を含む、項目６～１２、１６、または１９～３４のいずれか１項の抗体。
（項目３６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４または１５のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１を含む、項目６～１２、１６、または１９～３５のいずれか１項の抗体。
（項目３７）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１６または１７のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、項目６～１２、１６、または１９～３６のいずれか１項の抗体。
（項目３８）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、
配列番号７、１０、および３；配列番号８、１１、および３；配列番号９、１２、および３；もしくは配列番号９、１３、および３にそれぞれ記載されるＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ならびにＶＨ－ＣＤＲ３配列；ならびに／または
配列番号１４、５、および１６；もしくは配列番号１５、５、および１７にそれぞれ記載されるＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ならびにＶＬ－ＣＤＲ３配列を含む、項目６～１２、１６、または１９～３７のいずれか１項の抗体。
（項目３９）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７、１０、３、１４、５、および１６にそれぞれ記載されるＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、ならびにＶＬ－ＣＤＲ３配列を含む、項目６～１２、１６、または１９～３８のいずれか１項の抗体。
（項目４０）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２５において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目６～１２、１６、または１９～３９のいずれか１項の抗体。
（項目４１）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８、２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目６～１２、１６、または１９～４０のいずれか１項の抗体。
（項目４２）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８、２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目４１の抗体。
（項目４３）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目４２の抗体。
（項目４４）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２９～３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目４５）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７４～８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目４６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目４７）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目４８）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目４９）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目５０）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目５１）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目５２）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目５３）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目４３の抗体。
（項目５４）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目６～１０、１２、１６～２４、または２６～３７のいずれか１項の抗体。
（項目５５）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目６～１２、または１６～５４のいずれか１項の抗体。
（項目５６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１９、２１、および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目６～１２、または１６～５５のいずれか１項の抗体。
（項目５７）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１９、２１、および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目５６の抗体。
（項目５８）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目５６の抗体。
（項目５９）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目５８の抗体。
（項目６０）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目５８の抗体。
（項目６１）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目６～１１、１４～２５、または２７～５４のいずれか１項の抗体。
（項目６２）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８および１９、配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、または配列番号２４および２３にそれぞれ記載されるＶＨおよびＶＬ配列を含む、項目６～１２、１６～５３、または５５～６０のいずれか１項の抗体。
（項目６３）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８において記載される配列を含むＶＨ、および配列番号１９において記載される配列を含むＶＬを含む、項目６２の抗体。
（項目６４）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目６５）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７６のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目６６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目６７）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７７のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目６８）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目６９）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７０）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７１）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号８０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７２）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７３）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７４）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７５）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目６３の抗体。
（項目７６）
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、項目５４または６１の抗体。
（項目７７）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目１～５、１３～１５、または１９～７６のいずれか１項の抗体。
（項目７８）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目７７の抗体。
（項目７９）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５９～６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７８の抗体。
（項目８０）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１１８～１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７８の抗体。
（項目８１）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８２）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８３）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８４）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８５）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８６）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８７）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８８）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目７９または８０の抗体。
（項目８９）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＨを含む、項目１～３、５、１３～１５、１９～３０、または３２～７６のいずれか１項の抗体。
（項目９０）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５５または配列番号５６のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目１～５、１３～１５、または１９～８９のいずれか１項の抗体。
（項目９１）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、項目１～５、１３～１５、または１９～９０のいずれか１項の抗体。
（項目９２）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目１～５、１３～１５、または１９～９１のいずれか１項の抗体。
（項目９３）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目９２の抗体。
（項目９４）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目９２の抗体。
（項目９５）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む、項目１～５、１３～１５、または１９～９０のいずれか１項の抗体。
（項目９６）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５６のアミ
ノ酸配列を含むＶＬを含む、項目１～５、１３～１５、１９～９０、または９５のいずれか１項の抗体。
（項目９７）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目９６の抗体。
（項目９８）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目９６の抗体。
（項目９９）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目１～４、１３～１５、１９～３１、または３３～８９のいずれか１項の抗体。
（項目１００）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５４および５５、または配列番号５４および５６にそれぞれ記載されるＶＨおよびＶＬ配列を含む、項目１～５、１３～１５、１９～８８、または９０～９８のいずれか１項の抗体。
（項目１０１）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０２）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０３）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０４）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０５）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０６）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０７）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０８）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１０９）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２のアミ
ノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１１０）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１００の抗体。
（項目１１１）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＨ、およびヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列に由来するアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目８９または９９の抗体。
（項目１１２）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５４において記載されるＶＨ配列、および配列番号５５または５６において記載されるＶＬ配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号１８において記載されるＶＨ配列、および配列番号１９において記載されるＶＬ配列を含む、項目１００～１１０のいずれか１項の抗体。
（項目１１３）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号５９において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号２９において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１１４）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１１８において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７４において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１１５）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６１において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３１において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１１６）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２０において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７６において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１１７）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６２において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３２において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１１８）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２１において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７７に
おいて記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１１９）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６４において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３４において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１２０）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２３において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号７９において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１２１）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６５において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号３５において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１２２）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号１２４において記載される重鎖配列、および配列番号６７または６９において記載される軽鎖配列を含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号８０において記載される重鎖配列、および配列番号３７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２の抗体。
（項目１２３）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６７において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２～１２２のいずれか１項の抗体。
（項目１２４）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、配列番号６９において記載される軽鎖配列を含む、項目１１２～１２２のいずれか１項の抗体。
（項目１２５）
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列に由来するＶＨ、およびヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列に由来するＶＬを含み、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列に由来するＶＨ、およびヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列に由来するＶＬを含む、項目１１１の抗体。
（項目１２６）
前記抗体が、カッパ－ラムダボディ、二重親和性再ターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、ノブ・イン・ホール抗体、鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）、またはＤｕｏＢｏｄｙである、項目１～４３、５４～５８、６１～６３、７６～７８、８９～９２、９５、９６、９９、１００、１１１、１１２、または１２５のいずれか１項の抗体。
（項目１２７）
前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩｇＧ _１ 、ヒトＩｇＧ _２ 、ヒトＩｇＧ _３ 、ヒトＩｇＧ _４ 、ヒトＩｇＡ _１ 、およびヒトＩｇＡ _２ からなる群から選択される重鎖定常領域を含み、前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩｇＧ _１ 、ヒトＩｇＧ _２ 、ヒトＩｇＧ _３ 、ヒトＩｇＧ _４ 、ヒトＩｇＡ _１ 、およびヒトＩｇＡ _２ からなる群から選択される重鎖定常領域を含む、項目１～４３、５４～５８、６１～６３、７６～７８、８９～９２、９５、９６、９９、１００、１１１、１１２、１２５、または１２６のいずれか１項の抗体。
（項目１２８）
前記第１の抗原結合ドメインの前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ _１ であり、前記第２の抗原結合ドメインの前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ _１ である、項目１２７の抗体。
（項目１２９）
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインが、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌアミノ酸変異を含む第１の重鎖定常領域を含み；
（ｂ）前記第２の抗原結合ドメインが、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒアミノ酸変異を含む第２の重鎖定常領域を含む、項目１～１２、１４、１５、１７～４３、５４～５８、６１～６３、７６～７８、８９～９２、９５、９６、９９、１００、１１１、１１２、１２５、または１２６のいずれか１項の抗体。
（項目１３０）
（ａ）前記第１の抗原結合ドメインが、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒアミノ酸変異を含む第１の重鎖定常領域を含み；
（ｂ）前記第２の抗原結合ドメインが、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌアミノ酸変異を含む重鎖定常領域を含む、項目１～１２、１４、１５、１７～４３、５４～５８、６１～６３、７６～７８、８９～９２、９５、９６、９９、１００、１１１、１１２、１２５、または１２６のいずれか１項の抗体。
（項目１３１）
前記第１の抗原結合ドメインの前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ _１ である、項目１２８～１３０のいずれか１項の抗体。
（項目１３２）
前記第２の抗原結合ドメインの前記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ _１ である、項目１２８～１３０のいずれか１項の抗体。
（項目１３３）
前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩｇＧ _κ およびＩｇＧ _λ からなる群から選択される軽鎖定常領域を含み、前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩｇＧ _κ およびＩｇＧ _λ からなる群から選択される軽鎖定常領域を含む、項目１～１２、１４、１５、および１７～４３、５４～５８、６１～６３、７６～７８、８９～９２、９５、９６、９９、１００、１１１、１１２、または１２５～１３２のいずれか１項の抗体。
（項目１３４）
前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０Ａ置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する、項目１０、または２４～１３３のいずれか１項の抗体。
（項目１３５）
前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｇ６３Ａ置換の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する、項目１０、または２４～１３３のいずれか１項の抗体。
（項目１３６）
ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基６０、６２、および６３からなる群から選択される少なくとも１つの残基に結合する、項目８、または２２～１３５のいずれか１項の抗体。
（項目１３７）
ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基６２および６３からなる群から選択される少なくとも１つの残基に結合する、項目８、または２２～１３５のいずれか１項の抗体。
（項目１３８）
ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基６０および６３からなる群から選択される少なくとも１つの残基に結合する、項目８、または２
２～１３５のいずれか１項の抗体。
（項目１３９）
ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインが、配列番号４１の残基６０～６３を含むエピトープに結合する、項目８または２２～１３５のいずれか１項の抗体。
（項目１４０）
前記抗体が、（ｉ）ヒトＧＩＴＲに結合し、ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０を発現する細胞への増大した結合を示し、ならびに／または（ｉｉ）ヒトＯＸ４０に結合し、ヒトＯＸ４０に結合する前記第１の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０を発現する細胞への増大した結合を示す、項目１９～１３９のいずれか１項の抗体。
（項目１４１）
前記抗体が、（ｉ）ヒトＧＩＴＲに結合し、ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ＧＩＴＲ陽性、ＯＸ４０陰性細胞への低下した結合を示し、ならびに／または（ｉｉ）ヒトＯＸ４０に結合し、ヒトＯＸ４０に結合する前記第１の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ＧＩＴＲ陰性、ＯＸ４０陽性細胞への低下した結合を示す、項目１９～１４０のいずれか１項の抗体。
（項目１４２）
前記抗体が、（ｉ）ヒトＧＩＴＲに結合し、ヒトＧＩＴＲに結合する前記第２の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、制御性Ｔ細胞に対してより強いナチュラルキラー細胞介在性細胞毒性を誘導し、ならびに／または（ｉｉ）ヒトＯＸ４０に結合し、ヒトＯＸ４０に結合する前記第１の抗原結合ドメインと同じＶＨおよびＶＬを含有する単一特異性二価抗体と比較して、制御性Ｔ細胞に対してより強いナチュラルキラー細胞介在性細胞毒性を誘導する、項目１９～１４１のいずれか１項の抗体。
（項目１４３）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲリガンドのヒトＧＩＴＲへの結合を阻害する、項目６～１２、または１６～１４２のいずれか１項の抗体。
（項目１４４）
前記抗体が、ヒトＯＸ４０リガンドのヒトＯＸ４０への結合を阻害する、項目１～５、１３～１５、または１９～１４３のいずれか１項の抗体。
（項目１４５）
前記抗体が、活性化されたエフェクターＴ細胞に結合したときに、ＣＤ１６、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ６４からなる群から選択される活性化しているＦｃガンマ受容体に結合するより高い程度まで、前記抗体が、活性化された制御性Ｔ細胞に結合したときに、ＣＤ１６、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ６４からなる群から選択される活性化しているＦｃガンマ受容体に結合する、項目１～１４４のいずれか１項の抗体。
（項目１４６）
前記活性化しているＦｃガンマ受容体が、骨髄由来エフェクター細胞およびリンパ球由来エフェクター細胞からなる群から選択される細胞上で発現される、項目１４５の抗体。
（項目１４７）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲおよび／またはヒトＯＸ４０に対してアゴニスト性である、項目１～４７、５０、５１、５４～６５、６８、６９、７２、７３、７６～８１、８９～１０４、１０７、１０８、１１１～１１６、１１９、１２０、または１２３～１４６のいずれか１項の抗体。
（項目１４８）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲの活性を誘導するか、活性化するか、または増強する、項目１４７の抗体。
（項目１４９）
前記抗体が、ヒトＯＸ４０の活性を誘導するか、活性化するか、または増強する、項目１４７または１４８の抗体。
（項目１５０）
前記第１の抗原結合ドメインが、ヒトＩｇＧ _１ 重鎖を含み、前記第２の抗原結合ドメインが、ヒトＩｇＧ _１ 重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域が、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択される同一の変異を含む、項目１～１２、１４～４３、５４～５８、６１～６３、７６～７８、８９～９２、９５、９６、９９、１００、１１１、１１２、または１２５～１４６のいずれか１項の抗体。
（項目１５１）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲおよび／またはヒトＯＸ４０に対してアンタゴニスト性である、項目１～４５、４８、４９、５２～６３、６６、６７、７０、７１、７４～８０、８３、８４、８７～１００、１０５、１０６、１０９～１１２、１１７、１１８、または１２１～１４６のいずれか１項の抗体。
（項目１５２）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲの活性を不活性化するか、低減するか、または阻害する、項目１５１の抗体。
（項目１５３）
前記抗体が、ヒトＯＸ４０の活性を不活性化するか、低減するか、または阻害する、項目１５１または１５２の抗体。
（項目１５４）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲシグナル伝達を阻害するか、または低減する、項目１５１～１５３のいずれか１項の抗体。
（項目１５５）
前記抗体が、ヒトＯＸ４０シグナル伝達を阻害するか、または低減する、項目１５１～１５４のいずれか１項の抗体。
（項目１５６）
前記抗体が、ヒトＧＩＴＲリガンドにより誘導されるヒトＧＩＴＲシグナル伝達を阻害するか、または低減する、項目１５１～１５５のいずれか１項の抗体。
（項目１５７）
前記抗体が、ヒトＯＸ４０リガンドにより誘導されるヒトＯＸ４０シグナル伝達を阻害するか、または低減する、項目１５１～１５６のいずれか１項の抗体。
（項目１５８）
前記抗体が、関節リウマチ患者由来の滑液により誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を低下させる、項目１５１～１５７のいずれか１項の抗体。
（項目１５９）
前記抗体が、ヒトＰＢＭＣを移植されたＮＯＧマウスの生存を増大する、項目１５１～１５８のいずれか１項の抗体。
（項目１６０）
前記抗体が、ＧＶＨＤモデルにおいて制御性Ｔ細胞の増殖を増大する、項目１５１～１５９のいずれか１項の抗体。
（項目１６１）
検出可能な標識をさらに含む、項目１～１６０のいずれか１項の抗体。
（項目１６２）
（ｉ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第１の抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、（ｉｉ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第１の抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子、（ｉｉｉ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第２の抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、および（ｉｖ）項目
１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第２の抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を含む、組成物。
（項目１６３）
（ｉ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第１の抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、（ｉｉ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第１の抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子、（ｉｉｉ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第２の抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域または軽鎖をコードする核酸分子、および（ｉｖ）項目１～１６０のいずれか１項の抗体の前記第２の抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域または重鎖をコードする核酸分子を含む、宿主細胞。
（項目１６４）
エシェリキア・コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、酵母、ＣＨＯ、ＹＢ／２０、ＮＳ０、ＰＥＲ－Ｃ６、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＰ２／０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０細胞、植物細胞、昆虫細胞、および組織培養中のヒト細胞からなる群から選択される、項目１６３の宿主細胞。
（項目１６５）
前記核酸分子が発現され、前記抗体が産生されるように、項目１６３または１６４の前記宿主細胞を培養することを含む、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体を製造する方法。
（項目１６６）
試料を項目１～１６１のいずれか１項の抗体と接触させることを含む、前記試料においてＧＩＴＲおよびＯＸ４０を発現する細胞を検出する方法。
（項目１６７）
項目１～１６１のいずれか１項の抗体、および医薬的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目１６８）
項目１～１６１のいずれか１項の抗体または項目１６７の医薬組成物、ならびにａ）検出試薬、ｂ）ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０抗原、ｃ）ヒト投与のための使用もしくは販売についての許可を示す注意書き、またはｄ）その組み合わせを含む、キット。
（項目１６９）
対象に、有効量の項目１～１６０のいずれか１項の抗体または項目１６７の医薬組成物を投与することを含む、前記対象において免疫応答を調整する方法。
（項目１７０）
対象に、有効量の項目１～４７、５０、５１、５４～６５、６８、６９、７２、７３、７６～８２、８５、８６、８９～１０４、１０７、１０８、１１１～１１６、１１９、１２０、もしくは１２３～１４９のいずれか１項の抗体、または項目１６７の医薬組成物を投与することを含む、前記対象において免疫応答を増強するか、または誘導する方法。
（項目１７１）
対象に、有効量の項目１～４７、５０、５１、５４～６５、６８、６９、７２、７３、７６～８２、８５、８６、８９～１０４、１０７、１０８、１１１～１１６、１１９、１２０、もしくは１２３～１４９のいずれか１項の抗体、または項目１６７の医薬組成物を投与することを含む、前記対象において癌を処置する方法。
（項目１７２）
前記癌が、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、結腸癌、および肺癌からなる群から選択される、項目１７１の方法。
（項目１７３）
前記対象に、インドールアミン－２、３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤を投与することをさらに含む、項目１７１または１７２の方法。
（項目１７４）
前記阻害剤が、エパカドスタットである、項目１７３の方法。
（項目１７５）
前記阻害剤が、Ｆ００１２８７である、項目１７３の方法。
（項目１７６）
前記阻害剤が、インドキシモドである、項目１７３の方法。
（項目１７７）
前記阻害剤が、ＮＬＧ９１９である、項目１７３の方法。
（項目１７８）
前記対象にワクチンを投与することをさらに含む、項目１７１または１７２の方法。
（項目１７９）
前記ワクチンが、抗原ペプチドと複合体を形成する熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む、項目１７８の方法。
（項目１８０）
前記熱ショックタンパク質が、ｈｓｐ７０またはｈｓｃ７０であり、腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成する、項目１７９の方法。
（項目１８１）
前記熱ショックタンパク質が、ｇｐ９６であり、腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成し、前記ＨＳＰＰＣが、前記対象から得られた腫瘍に由来する、項目１８０の方法。
（項目１８２）
前記対象にチェックポイント標的薬剤を投与することをさらに含む、項目１７１または１７２の方法。
（項目１８３）
前記チェックポイント標的薬剤が、アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ－Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ－４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ－３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ－３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、およびアゴニスト抗ＯＸ４０抗体からなる群から選択される、項目１８２の方法。
（項目１８４）
対象に、有効量の項目１～１６０のいずれか１項の抗体または項目１６７の前記医薬組成物を投与することを含む、前記対象において感染性疾患を処置する方法。
（項目１８５）
対象に、有効量の項目１～１６０のいずれか１項の抗体または項目１６７の前記医薬組成物を投与することを含む、前記対象において免疫応答を低減するか、または阻害する方法。
（項目１８６）
対象に、有効量の項目１～１６０のいずれか１項の抗体または項目１６７の前記医薬組成物を投与することを含む、前記対象において自己免疫または炎症性疾患もしくは障害を処置する方法。
（項目１８７）
前記自己免疫または炎症性疾患もしくは障害が、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、脈管炎、喘息、関節リウマチ、皮膚炎、炎症性腸疾患、ぶどう膜炎、ループス、大腸炎、糖尿病、多発性硬化症、および気道炎症からなる群から選択される、項目１８６の方法。
（項目１８８）
前記対象がヒトである、項目１６９～１８７のいずれか１項の方法。

【図面の簡単な説明】

【0079】

６．図面の簡単な説明

【図1】図１Ａおよび１Ｂ：図１Ａは、子宮内膜癌腫瘍組織、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）腫瘍組織、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍組織由来の腫瘍内エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ：ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５＋／－ＦＯＸＰ３－）ならびに制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ＣＤ４＋ＣＤ１２７－ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）上でのＧＩＴＲならびにＯＸ４０上での発現を示すヒストグラムのセットである。図１Ｂは、卵巣癌腫瘍組織、結腸直腸癌（ＣＲＣ）腫瘍組織、子宮内膜癌腫瘍組織、ＲＣＣ腫瘍組織、およびＮＳＣＬＣ腫瘍組織由来のＴｒｅｇならびにＴｅｆｆ細胞の表面上でのＧＩＴＲならびにＯＸ４０受容体の予想数を示す棒グラフのセットである。

【0080】

【図2-1】図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現した活性化Ｈｕｔ１０２細胞（図２Ａ）、ＧＩＴＲを発現するジャーカット細胞（図２Ｂ）、ならびにＯＸ４０を発現するジャーカット細胞（図２Ｃ）への試験抗体の結合を示すグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、広範囲の抗体濃度に対してプロットされる。使用された試験抗体は、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９（図２Ａ～２Ｃ）、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６（図２Ａおよび２Ｂ）、二価単一特異性抗体ｐａｂ２０４９（図２Ａおよび２Ｃ）、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×アイソタイプ（図２Ａ）、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ２０４９×アイソタイプ（図２Ａ）、ならびにアイソタイプ対照抗体（図２Ａ～２Ｃ）であった。

【図2-2】同上。

【0081】

【図3-1】図３Ａは、活性化天然制御性Ｔ（ｎＴｒｅｇ）細胞上でのＧＩＴＲおよびＯＸ４０の発現を示すヒストグラムのセットである。図３Ｂは、抗体が活性化ｎＴｒｅｇに結合したとき、試験抗体が、ＦｃγＲＩＩＩＡ^Ｖ１５８を発現するレポーター細胞株を活性化するそれらの能力について調べられた、レポーターアッセイの結果である。使用された試験抗体は、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６、二価単一特異性抗体ｐａｂ２０４９、およびアイソタイプ対照抗体であった。相対的光単位（ＲＬＵ）は、試験された最高濃度のアイソタイプ対照抗体で処理された試料におけるＲＬＵ値に標準化され、試験抗体の用量タイトレーションに対してプロットされる。図３Ｃおよび３Ｄは、抗体が、ＧＩＴＲを発現するジャーカット細胞（図３Ｃ）、またはＯＸ４０を発現するジャーカット細胞（図３Ｄ）に結合したとき、試験抗体が、ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８発現レポーター細胞を活性化するそれらの能力について調べられる、同様のレポーターアッセイの結果である。使用された試験抗体は、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６（Ｆ４０５Ｌ／Ｆ４０５Ｌ）、二価単一特異性抗体ｐａｂ２０４９（Ｋ４０９Ｒ／Ｋ４０９Ｒ）、およびアイソタイプ対照抗体であった。ＲＬＵは、広範囲の抗体濃度に対してプロットされる。図３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、アイソタイプ対照抗体、ｐａｂ１８７６、ｐａｂ２０４９、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、もしくはｐａｂ１８７６とｐａｂ２０４９の組み合わせの存在下での、活性化エフェクターＴ細胞または活性化ＴｒｅｇのＮＫ細胞介在性溶解を測定するアッセイの結果である。図３Ｅは、フローサイトメトリーにより測定される通り、活性化エフェクターＴ細胞もしくはＴｒｅｇ上でのＧＩＴＲ（左）またはＯＸ４０（右）の発現を示すヒストグラムのペアである。図３Ｆおよび３Ｇにおいて、％細胞毒性は、抗体濃度のタイトレーションに対してプロットされる。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【0082】

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後の２人のドナー由来の初代ヒトＴ細胞上でのＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の機能活性を描写するグラフである。ＩＬ－２の濃度は、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ２０４９×アイソタイプ、およびアイソタイプ対照抗体の用量タイトレーションにてプロットされる。

【0083】

【図5】図５Ａおよび５Ｂ：図５Ａは、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、３量体ＧＩＴＲＬ、およびアイソタイプ対照抗体が、ジャーカットｈｕＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞を活性化するそれらの能力について試験された、レピーターアッセイの結果である。相対的光単位（ＲＬＵ）は、広範囲の抗体またはＧＩＴＲＬ濃度に対してプロットされる。図５Ｂは、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、およびアイソタイプ対照抗体が、ＧＩＴＲＬ誘導性ＮＦ－κＢシグナル伝達をブロックするそれらの能力について調べられる、レポーターアッセイの結果である。このレポーターアッセイにおいて、３量体ＧＩＴＲＬにより活性化される前に、ジャーカットｈｕＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞は、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、またはアイソタイプ対照抗体と共に事前インキュベーションされた。抗体濃度の用量タイトレーションの存在下での％ＧＩＴＲＬ活性が示される。

【0084】

【図6】図６Ａおよび６Ｂ：図６Ａは、多量体ＯＸ４０Ｌ、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、またはアイソタイプ対照抗体により引き金を引かれたジャーカットｈｕＯＸ４０－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞由来のＮＦ－κＢルシフェラーゼシグナルを描写する。ＲＬＵは、ＯＸ４０Ｌまたは抗体濃度の用量タイトレーションに対してプロットされる。図６Ｂは、多量体ＯＸ４０Ｌにより活性化される前に、ジャーカットｈｕＯＸ４０－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞が、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、またはアイソタイプ対照抗体と共に事前インキュベーションされた、レポーターアッセイの結果である。％ＯＸ４０Ｌ活性は、広範囲の抗体濃度に対してプロットされる。

【0085】

【図7】図７は、ＧＩＴＲ－ｂｉｏが、キメラ親２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７５、またはｐａｂ１８７６抗体と共に事前インキュベーションされたとき、ビオチン化ＧＩＴＲ（ＧＩＴＲ－ｂｉｏ）へのキメラ親２３１－３２－１５抗体を発現する１６２４－５前Ｂ細胞の結合の喪失を示すヒストグラムである。図７の右側の特性は、ＧＩＴＲ－ｂｉｏへのキメラ親２３１－３２－１５抗体を発現する１６２４－５前Ｂ細胞の結合を描写する。しかしながら、左側の特性において、キメラ親２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７５、またはｐａｂ１８７６抗体のいずれかとのＧＩＴＲ－ｂｉｏの事前インキュベーション後に、ＧＩＴＲ－ｂｉｏへのキメラ親２３１－３２－１５抗体を発現する１６２４－５細胞の結合の喪失が存在する。

【0086】

【図8】図８は、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００／２００）により測定されたエピトープ競合アッセイの結果を示す。ＧＩＴＲ抗原は、ＣＭ５センサーチップ上に固定され、抗ＧＩＴＲ抗体は、３００ｎＭの濃度にて適用された。キメラ親２３１－３２－１５抗体がまず適用され、続いて、マウス抗体６Ｃ８が適用された。

【0087】

【図9A】図９Ａおよび９Ｂは、エラープローンＰＣＲにより作り出された、ＧＩＴＲバリアントを発現する細胞ライブラリーを使用した、エピトープマッピングの結果である。図９Ａおよび９Ｂにおいて、ポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体に結合するが、抗ＧＩＴＲキメラ親２３１－３２－１５抗体に結合しない、ＧＩＴＲバリアント由来の配列アライメントが示される。

【図9B】同上。

【0088】

【図10A】図１０Ａおよび１０Ｂは、アラニンスキャニングを使用したエピトープマッピングの結果である。ヒトＧＩＴＲにおける以下の位置（配列番号４１に従い番号付けた）：Ｐ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｇ３０Ａ、Ｇ３１Ａ、Ｐ３２Ａ、Ｔ５４Ａ、Ｔ５５Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｃ５７Ａ、Ｃ５８Ａ、Ｒ５９Ａ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６１Ａ、Ｐ６２Ａ、Ｇ６３Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｃ６６Ａ、Ｃ６７Ａ、Ｓ６８Ａ、Ｅ６９Ａ、Ｗ７０Ａ、Ｄ７１Ａ、Ｃ７２Ａ、Ｍ７３Ａ、Ｃ７４Ａ、Ｖ７５ＡおよびＱ７６Ａを、アラニンに別々に変異させた。図１０Ａにおいて示される実験において試験された抗体は、モノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、ｐａｂ１９７９、およびｍ６Ｃ８；ならびにポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体（ＡＦ６８９、Ｒ＆Ｄシステムズ）を含んでいた。図１０Ａは、ヒトＧＩＴＲアラニン変異体を発現する１６２４－５細胞へのｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、ｐａｂ１９７９、および参照抗体ｍ６Ｃ８の結合を要約する表である。図１０Ｂは、モノクローナル抗体２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７６、もしくはｍ６Ｃ８、またはポリクローナル抗体を使用した、野生型ヒトＧＩＴＲ、Ｄ６０Ａ変異体、あるいはＧ６３Ａ変異体を発現する１６２４－５細胞の染色を示すフローサイトメトリーのセットである。ＧＩＴＲ陽性細胞の百分率が、それぞれのプロットにおいて示される。

【図10B】同上。

【0089】

【図11A】図１１Ａは、ヒトＧＩＴＲ、Ｖ１ＭカニクイザルＧＩＴＲ、およびＶ１Ｍ／Ｑ６２Ｐ／Ｓ６３ＧカニクイザルＧＩＴＲの配列アライメントであり、カニクイザルＧＩＴＲ由来の２つのアミノ酸（ＧｌｎＳｅｒ）が、ヒトＧＩＴＲにおける対応する残基（ＰｒｏＧｌｙ）によって置換された位置６２および６３を強調する。図１１Ｂは、モノクローナル抗体２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７６、もしくはｍ６Ｃ８、またはポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を使用した、ヒトＧＩＴＲ、Ｖ１ＭカニクイザルＧＩＴＲ、あるいはＶ１Ｍ／Ｑ６２Ｐ／Ｓ６３ＧカニクイザルＧＩＴＲを発現する１６２４－５細胞の染色を示すフローサイトメトリープロットのセットである。

【図11B】同上。

【0090】

【図12】図１２は、ヒトＯＸ４０アラニン変異体を発現する１６２４－５細胞へのモノクローナル抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９、およびｐａｂ１９２８の結合を要約する表である。

【発明を実施するための形態】

【0091】

７．発明を実施するための形態
ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）および／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が、本明細書において提供される。

【0092】

例えば、ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメイン、および第２の抗原結合ドメインを含有し得る多特異性（例えば、二重特異性）抗体が、本明細書において提供される。第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと異なり得る。第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと異なる抗原（すなわち、ＯＸ４０ではない抗原）に結合し得る。第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと異なるエピトープに結合し得る。一例において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含有する抗体が、本明細書において提供される。ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ２７、またはＨＶＥＭであり得る。一例において、本明細書において提供される抗体は、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含有する。

【0093】

別の例において、本明細書において提供される抗体は、第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインを含有し得る。第１の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと異なり得る。第１の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと異なる抗原（すなわち、ＧＩＴＲではない抗原）に結合し得る。第２の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと異なるエピトープに結合し得る。一例において、本明細書において提供される抗体は、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含有する。ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質は、例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＤＲ３、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＣＤ２７、またはＨＶＥＭであり得る。別の例において、本明細書において提供される抗体は、ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインを含有する。一例において、本明細書において提供される抗体は、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する第２の抗原結合ドメインを含有する。

【0094】

ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）およびＴＮＦスーパーファミリータンパク質に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体もまた、本明細書において提供される。かかる抗体は、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）を発現する細胞、およびＴＮＦスーパーファミリータンパク質の受容体に結合し得る。ＴＮＦスーパーファミリータンパク質、およびＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む抗体もまた、本明細書において提供される。かかる抗体は、ＴＮＦスーパーファミリータンパク質の受容体を発現する細胞、およびＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に結合し得る。ＴＮＦスーパーファミリータンパク質は、例えば、ＧＩＴＲリガンド、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ１３７リガンド、ＤＲ３リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＢＡＦＦＲリガンド、ＣＤ２７リガンド、またはＨＶＥＭリガンドであり得る。ＴＮＦスーパーファミリータンパク質は、本明細書において提供される任意の多特異性（例えば、二重特異性）抗体における第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインを置換し得る。

【0095】

１つの態様において、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合し、１つもしくは複数のＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０活性を増強するか、誘導するか、あるいは増大する多特異性（例えば、二重特異性）抗体が、本明細書において提供される。別の態様において、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合し、１つもしくは複数のＧＩＴＲまたはＯＸ４０活性を低減するか、阻害するか、あるいは低下させる多特異性（例えば、二重特異性）抗体が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、抗体は単離される。

【0096】

かかる抗体をコードする、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のような、単離された核酸（ポリヌクレオチド）もまた、提供される。かかる抗体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）を含むベクター（例えば、発現ベクター）および細胞（例えば、宿主細胞）が、さらに提供される。かかる抗体を作製する方法もまた、提供される。他の態様において、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０活性を誘導する、増大するか、または増強する、ならびに癌のような、ある種の状態を処置する方法ならびに使用が、本明細書において提供される。ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０活性を阻害する、低下させる、または低減する、ならびに炎症性または自己免疫疾患および障害のような、ある種の状態を処置する方法ならびに使用が、さらに提供される。関連する組成物（例えば、医薬組成物）、キット、および検出方法もまた、提供される。

【0097】

７．１ 専門用語
本明細書において使用される、用語「約」および「およそ」は、数値または数値範囲を修飾するために使用されるとき、値または範囲の５％～１０％上および５％～１０％下の逸脱が、列挙される値または範囲の意図される意味にとどまることを示す。

【0098】

本明細書において使用される通り、Ａが例えば、所定の実験において、または複数の実験の平均値を使用して、特定の領域について増大するにつれ、Ｂが実質的に増大するなら、Ｂは、Ａ値の特定の領域についてＡの「実質的に増加関数」である。この定義により、Ａの特定の値に対応するＢの値が、Ａの任意のより低い値に対応するＢの値と比べ、最大１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、または２０％低いことを可能にする。

【0099】

本明細書において使用される通り、Ａが例えば、所定の実験において、または複数の実験の平均値を使用して、特定の領域について増大するにつれ、Ｂが実質的に低下されるなら、Ｂは、Ａ値の特定の領域についてＡの「実質的な減少関数」である。この定義により、Ａの特定の値に対応するＢの値が、Ａの任意のより低い値に対応するＢの値と比べ、最大１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、または２０％高いことを可能にする。

【0100】

本明細書において使用される、用語「抗体」および「抗体（複数形）」は、当該技術分野の用語であり、本明細書において互換的に使用され得、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を指す。

【0101】

抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換えで製造された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、表面再処理された抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む４量体抗体、抗体軽鎖１量体、抗体重鎖１量体、抗体軽鎖２量体、抗体重鎖２量体、抗体軽鎖－抗体重鎖対、細胞内抗体、ヘテロ接合抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディー、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、二重特異性抗体、および多特異性抗体を含み得る。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、もしくはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａもしくはＩｇＧ_２ｂ）のものであり得る。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＩｇＧ抗体、あるいはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、もしくはＩｇＧ_４）またはサブクラスである。特定の実施形態において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。別の特定の実施形態において、抗体は、ヒトモノクローナル抗体、例えば、つまり、免疫グロブリンである。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、またはＩｇＧ_４抗体である。

【0102】

「多特異性」抗体は、少なくとも２つの異なる抗原結合部位を有する抗体である。多特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部位（Ｆｃ領域を除く）を含有する二重特異性抗体を含む。多特異性抗体は、例えば、組換えで製造された抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、表面再処理された抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む４量体抗体、抗体軽鎖１量体、ヘテロ接合抗体、結合単鎖抗体または結合単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディー、結合Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、化学結合Ｆｖｓ、およびジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）を含み得る。多特異性抗体は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、もしくはＩｇＡ_２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａもしくはＩｇＧ_２ｂ）のものであり得る。ある実施形態において、本明細書において記載される多特異性抗体は、ＩｇＧ抗体、あるいはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、もしくはＩｇＧ_４）またはサブクラスである。

【0103】

本明細書において使用される、用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」、および同様の用語は、抗体分子に抗原に対するその特異性を与えるアミノ酸残基を含む抗体分子の部分（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を指す。抗原結合領域は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）およびヒトのような、任意の動物種に由来し得る。

【0104】

本明細書において使用される、用語「抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０」抗体は、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に結合する抗原結合ドメイン、およびＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に結合する抗原結合ドメインを含有する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を指す。

【0105】

本明細書において使用される、用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、互換的に使用され、当該技術分野において一般的である。可変領域は、典型的には、抗体の部分、一般的には、軽または重鎖の部分、典型的には、成熟重鎖におけるアミノ末端の約１１０～１２５個のアミノ酸および成熟軽鎖における約９０～１１５個のアミノ酸を指し、抗体の間で配列が大々的に異なり、特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。配列における可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるその領域に集中し、一方、可変ドメインにおけるより高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。任意の特定のメカニズムまたは理論により結び付けられることを望まないが、軽および重鎖のＣＤＲが、抗体の抗原との相互作用および特異性の主な原因であると考えられている。ある実施形態において、可変領域は、ヒト可変領域である。ある実施形態において、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。ある実施形態において、可変領域は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。ある実施形態において、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲおよび霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。

【0106】

用語「ＶＬ」および「ＶＬドメイン」は、抗体の軽鎖可変領域を指すように互換的に使用される。

【0107】

用語「ＶＨ」および「ＶＨドメイン」は、抗体の重鎖可変領域を指すように互換的に使用される。

【0108】

用語「Ｋａｂａｔ番号制」ならびに同様の用語は、当該技術分野において認識され、抗体の重および軽鎖可変領域、またはその抗原結合部分におけるアミノ酸残基を番号付けるシステムを指す。特定の態様において、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号制に従い決定され得る（例えば、Ｋａｂａｔ ＥＡ ＆ Ｗｕ ＴＴ（１９７１）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９０：３８２－３９１およびＫａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）。Ｋａｂａｔ番号制を使用し、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、場合により、３５の後に、１つまたは２つのさらなるアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付けスキームにおいて３５Ａおよび３５Ｂとして言及される）を含み得る、アミノ酸位置３１～３５（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～６５（ＣＤＲ２）、ならびにアミノ酸位置９５～１０２（ＣＤＲ３）に存在する。Ｋａｂａｔ番号制を使用し、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは、典型的には、アミノ酸位置２４～３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０～５６（ＣＤＲ２）、およびアミノ酸位置８９～９７（ＣＤＲ３）に存在する。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに従い決定された。

【0109】

本明細書において使用される、用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、互換可能であり、当該技術分野において一般的なその意味を有する。定常領域は、抗体部分、例えば、抗体の抗原との結合に直接的には関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用のような、様々なエフェクター機能を提示し得る、軽および／または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般的には、免疫グロブリン可変ドメインと比べ、より保存されたアミノ酸配列を有する。

【0110】

本明細書において使用される、用語「重鎖」は、抗体に関して使用されるとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）を指し、それは、それぞれ、ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、およびＩｇＧ_４を含む、抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ならびにＩｇＭクラスを生じる。

【0111】

本明細書において使用される、用語「軽鎖」は、抗体に関して使用されるとき、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）を指すことができる。軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野において周知である。特定の実施形態において、軽鎖はヒト軽鎖である。

【0112】

本明細書において使用される、用語「ＥＵ番号制」は、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８－８５（１９６９）およびＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１そのそれぞれが、参照により全体が本明細書に組み込まれるにおいて記載される通り、抗体の定常領域についてのＥＵ番号付け慣習を指す。

【0113】

「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間での非共有結合性相互作用の合計の強さを指す。別の方法で示されない限り、本明細書において使用される、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間での１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋ_Ｄ）により表され得る。親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）、および平衡結合定数（Ｋ_Ａ）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の多数の方法で測定され、および／または表され得る。Ｋ_Ｄは、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの割合から計算され、一方、Ｋ_Ａは、ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆの割合から計算される。ｋ_ｏｎは、例えば、抗体の抗原への結合率定数を指し、ｋ_ｏｆｆは、例えば、抗体の抗原への解離を指す。ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆは、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはＫｉｎＥｘＡのような、当業者に公知の技術により決定され得る。

【0114】

本明細書において使用される、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族性側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。ある実施形態において、抗体のＣＤＲ（複数を含む）内もしくはフレームワーク領域（複数を含む）内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換され得る。

【0115】

本明細書において使用される、「エピトープ」は、当該技術分野における用語であり、抗体が特異的に結合し得る抗原の限局した領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続アミノ酸（直鎖または連続エピトープ）であり得るか、あるいはエピトープは、例えば、ポリペプチドまたは複数のポリペプチドの２つ以上の不連続領域から一体となり得る（立体構造、非直線、非連続、もしくは不連続エピトープ）。ある実施形態において、抗体が結合するエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析連結水素／ジュウテリウム交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴ－ペプチドスキャニングアッセイ、および／または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）により決定され得る。Ｘ線結晶解析のため、結晶化は、当該技術分野において公知の方法のいずれかを使用して成し遂げられてもよい（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究され得、Ｘ－ＰＬＯＲ（エール大学、１９９２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布；例えば、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４ ＆ １１５，ｅｄｓ Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．，；米国公開第２００４／００１４１９４号を参照）、およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３）のようなコンピューターソフトウエアを使用して精密化され得る。変異誘発マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法を使用して、成し遂げられ得る。アラニンスキャニング変異誘発技術を含む、変異誘発技術の説明について、例えば、Ｃｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１３８８－１３９４およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ ＆ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１－１０８５を参照。特定の実施形態において、抗体のエピトープは、アラニンスキャニング変異誘発研究を使用して決定される。

【0116】

本明細書において使用される、用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、および「特異的に認識する」は、抗体の文脈において類似の用語であり、かかる結合が当業者により理解される通り、抗原（例えば、エピトープまたは免疫複合体）に結合する分子を指す。例えば、抗原に特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＫｉｎＥｘＡ ３０００ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ボイシ、アイダホ州）、または当該技術分野において公知の他のアッセイにより決定される通り、一般的により低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドに結合し得る。特定の実施形態において、抗原に免疫特異的に結合する分子は、分子が別の抗原に非特異的に結合するとき、Ｋ_Ａより少なくとも２ｌｏｇ、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ以上であるＫ_Ａで抗原に結合する。多特異性（例えば、二重特異性）抗体の文脈において、用語「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、および「特異的に認識する」は、１つより多くの抗原に対して、または単一抗原上の１つより多くのエピトープに対して異なる特異性を有する抗体を指す。例えば、二重特異性抗体は、例えば、ヒトＯＸ４０およびヒトＧＩＴＲのそれぞれに、例えば、異なる抗原結合ドメインで特異的に結合してもよい。

【0117】

別の特定の実施形態において、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合ドメインは、同様の結合条件下で他のタンパク質と交差反応しない。別の特定の実施形態において、ＧＩＴＲ抗原に免疫特異的に結合する抗原結合ドメインは、他の非ＧＩＴＲタンパク質と交差反応しない。別の特定の実施形態において、ＯＸ４０抗原に免疫特異的に結合する抗原結合ドメインは、他の非ＯＸ４０タンパク質と交差反応しない。特定の実施形態において、別の無関連の抗原より高い親和性でＧＩＴＲまたはＯＸ４０に結合する抗原結合ドメインを含有する抗体が、本明細書において提供される。ある実施形態において、例えば、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、または動態排除アッセイにより測定される通り、別の無関連の抗原より２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上の親和性で、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはヒトＯＸ４０）に結合する抗原結合ドメインを含有する抗体が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲ抗原結合ドメインの無関連の非ＧＩＴＲタンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイにより測定される通り、抗原結合ドメインのＧＩＴＲタンパク質への結合の１０％、１５％、または２０％より低い。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗原結合ドメインの無関連の非ＯＸ４０タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイにより測定される通り、抗原結合ドメインのＯＸ４０タンパク質への結合の１０％、１５％、または２０％より低い。

【0118】

特定の実施形態において、別の種のＧＩＴＲより高い親和性でヒトＧＩＴＲに結合する抗原結合ドメイン、および／または別の種のＯＸ４０より高い親和性でヒトＯＸ４０に結合する抗原結合ドメインを含有する抗体が、本明細書において提供される。ある実施形態において、例えば、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、または動態排除アッセイにより測定される通り、別の種のＧＩＴＲより５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％以上の親和性でヒトＧＩＴＲに結合し、および／または別の種のＯＸ４０より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％以上の親和性でヒトＯＸ４０に結合する抗原結合ドメインを含有する抗体が、本明細書において提供される。特定の実施形態において、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０に結合する、本明細書において記載される抗体は、例えば、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、または動態排除アッセイにより測定される通り、抗体のヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０タンパク質への結合の１０％、１５％、または２０％未満で別の種のＧＩＴＲならびに／あるいはＯＸ４０タンパク質に結合する。

【0119】

本明細書において使用される、用語「グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連受容体」または「ＧＩＴＲ」または「ＧＩＴＲポリペプチド」は、天然のＧＩＴＲ、ＧＩＴＲのアイソフォーム、またはＧＩＴＲの種間ＧＩＴＲ相同体を含むが、これらに限定されない、ＧＩＴＲを指す。ＧＩＴＲはまた、活性化誘導可能なＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ）、ＧＩＴＲ－Ｄ、ＣＤ３５７、および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）としても知られている。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＢＣ１５２３８１およびＢＣ１５２３８６は、ヒトＧＩＴＲ核酸配列を提供する。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５－１（ＴＮＲ１８＿ＨＵＭＡＮ；配列番号４１）、およびＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ＿００４１８６は、アイソフォーム１についての典型的なヒトＧＩＴＲアミノ酸配列を提供する。このアミノ酸配列は、シグナル配列をコードする最初の２５個のアミノ酸残基を有する２４１アミノ酸長である。アイソフォーム１は、タイプＩ膜タンパク質である。ヒトＧＩＴＲの典型的な成熟アミノ酸配列は、配列番号４０として提供される。対照的に、アイソフォーム２は、ヒトＧＩＴＲの分泌された形態であり、およそ２５５アミノ酸長である。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５－２、およびＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ＿６８３６９９は、アイソフォーム２についての典型的なヒトＧＩＴＲアミノ酸配列を提供する。ヒトＧＩＴＲのアイソフォーム３は、およそ２３４アミノ酸長である。Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５－３、およびＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ＿６８３７００（アイソフォーム３前駆体）は、アイソフォーム３についての典型的なヒトＧＩＴＲアミノ酸配列を提供する。特定の実施形態において、ＧＩＴＲはヒトＧＩＴＲである。別の特定の実施形態において、ＧＩＴＲは、ヒトＧＩＴＲアイソフォーム１（配列番号４１）である。ある実施形態において、ＧＩＴＲは、ヒトアイソフォーム２（配列番号４２）またはアイソフォーム３（配列番号４３）である。ヒトＧＩＴＲは、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：８７８４と命名される。配列番号４４は、カニクイザルＧＩＴＲアミノ酸配列を提供し、配列番号４４のアミノ酸２６～２３４は、カニクイザルＧＩＴＲの成熟形態を表す。本明細書において使用される、用語「ヒトＧＩＴＲ」は、配列番号４０のポリペプチド配列を含むＧＩＴＲを指す。

【0120】

本明細書において使用される、用語「ＧＩＴＲリガンド」および「ＧＩＴＲＬ」は、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質リガンドを指す。ＧＩＴＲＬは、そうでなければ、活性化誘導性ＴＮＦ関連リガンド（ＡＩＴＲＬ）および腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＳＦ１８）として知られている。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＦ１２５３０３は、典型的なヒトＧＩＴＲＬ核酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ＿００５０８３およびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＮＧ２は、典型的なヒトＧＩＴＲＬアミノ酸配列を提供する。

【0121】

本明細書において使用される、用語「ＯＸ４０受容体」または「ＯＸ４０」または「ＯＸ４０ポリペプチド」は、天然のＯＸ４０、ＯＸ４０のアイソフォーム、またはＯＸ４０の種間ＯＸ４０相同体を含むが、これらに限定されない、ＯＸ４０を指す。ＯＸ４０はまた、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＩＭＤ１６、およびＴＸＧＰ１Ｌとしても知られている。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＢＣ１０５０７０およびＢＣ１０５０７２は、ヒトＯＸ４０核酸配列を提供する。参照配列番号ＮＰ＿００３３１８．１は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列を提供する。ヒトＯＸ４０の未熟アミノ酸配列は、配列番号７３として提供される。ヒトＯＸ４０の成熟アミノ酸配列は、配列番号７２として提供される。ヒトＯＸ４０は、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：７２９３と命名される。参照配列番号ＸＭ＿００５５４５１２２．１およびＸＰ＿００５５４５１７９．１は、それぞれ、推定カニクイザルＯＸ４０核酸配列およびアミノ酸配列を提供する。ヒトＯＸ４０の可溶性アイソフォームもまた、報告されている（Ｔａｙｌｏｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５５：６７－７２）。本明細書において使用される、用語「ヒトＯＸ４０」は、配列番号７２のポリペプチド配列を含むＯＸ４０を指す。

【0122】

本明細書において使用される、用語「ＯＸ４０リガンド」および「ＯＸ４０Ｌ」は、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＳＦ４）を指す。ＯＸ４０Ｌは、そうでなければ、ＣＤ２５２、ＧＰ３４、ＴＸＧＰ１、およびＣＤ１３４Ｌとして知られている。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号Ｄ９０２２４．１およびＡＫ２９７９３２．１は、典型的なヒトＯＸ４０Ｌ核酸配列を提供する。参照配列番号ＮＰ＿００３３１７．１およびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２３５１０－１は、アイソフォーム１についての典型的なヒトＯＸ４０Ｌアミノ酸配列を提供する。参照配列番号ＮＰ＿００１２８４４９１．１およびＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ２３５１０－２は、アイソフォーム２についての典型的なヒトＯＸ４０Ｌアミノ酸配列を提供する。ヒトＯＸ４０Ｌは、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅによりＧｅｎｅＩＤ：７２９２と命名される。

【0123】

本明細書において使用される、用語「宿主細胞」は、任意の種類の細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株由来の細胞であることができる。特定の実施形態において、用語「宿主細胞」は、核酸分子で遺伝子導入された細胞、およびかかる細胞の子孫または可能性のある子孫を指す。かかる細胞の子孫は、例えば、後世において生じ得る変異もしくは環境上の影響、または核酸分子の宿主ゲノムへの統合に起因して、核酸分子を遺伝子導入された親細胞と必ずしも同一ではない。

【0124】

本明細書において使用される、対象への治療の投与の文脈における用語「有効量」は、所望の予防または治療効果を達成する治療の量を指す。

【0125】

本明細書において使用される、用語「対象」および「患者」は、互換的に使用される。対象は動物であり得る。幾つかの実施形態において、対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルもしくはヒト）のような哺乳類であり、最も好ましくは、ヒトである。幾つかの実施形態において、対象はカニクイザルである。ある実施形態において、かかる用語は、非ヒト動物（例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコまたはイヌのような非ヒト動物）を指す。幾つかの実施形態において、かかる用語は、ペットまたは家畜を指す。特定の実施形態において、かかる用語はヒトを指す。

【0126】

本明細書において使用される、試験抗体と第１の抗原の間の結合は、例えば、次の工程：（ａ）細胞（例えば、１６２４－５細胞）の表面上で第１の抗原または第２の抗原を発現させること；（ｂ）例えば、フローサイトメトリー解析において２μｇ／ｍｌ試験抗体もしくはポリクローナル抗体を使用して、第１の抗原または第２の抗原を発現する細胞を染色すること、および平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、例えば、１つより多くの測定値の平均として記録すること、ここで、ポリクローナル抗体は、第１の抗原と第２の抗原両方を認識する；（ｃ）第２の抗原を発現する細胞についての試験抗体のＭＦＩ値を、第２の抗原を発現する細胞についてのポリクローナル抗体のＭＦＩ値で割ること（ＭＦＩ比_２）；（ｄ）第１の抗原を発現する細胞についての試験抗体のＭＦＩ値を、第１の抗原を発現する細胞についてのポリクローナル抗体のＭＦＩで割ること（ＭＦＩ比_１）；および（ｅ）１００％×（１－（ＭＦＩ比_１／ＭＦＩ比_２））を計算することにより、結合の低減の百分率を決定することを含むアッセイにより評価される通り、例えば、フローサイトメトリー解析において、もしくは所定の実験において、または複数の実験の平均値を使用して測定される通り、試験抗体と第１の抗原の間の結合が、試験抗体と第２の抗原の間の結合と比べて少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％低減されるなら、試験抗体と第２の抗原の間の結合と比べて「実質的に，減弱されている」。

【0127】

２つの配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）間の「パーセント同一性」の決定はまた、数学的アルゴリズムを使用して成し遂げられ得る。２つの配列の比較のため利用される数学的アルゴリズムの特定の非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ Ｓ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：５８７３－５８７７において改変されたＫａｒｌｉｎ Ｓ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書において記載される核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るためのＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝１００についてワード長＝１２で行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書において記載されるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るためのＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセット、例えば、スコア＝５０に対して、ワード長＝３で行われ得る。比較目的でギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９ ３４０２において記載される通り、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。あるいは、ＰＳＩ ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムの（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）デフォルトパラメーターが使用され得る（例えば、ワールドワイドウェブ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ上の全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を参照）。配列の比較のため利用される数学的アルゴリズムの別の特定の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１ １７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウエアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためＡＬＩＧＮプログラムを利用するとき、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４が使用され得る。

【0128】

２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許可して、または許可しないで、上で記載されたものと同様の技術を使用して決定され得る。パーセント同一性を計算する際、典型的には、完全一致のみがカウントされる。

【0129】

７．２ ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性抗体
特有の態様において、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０）に特異的に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が、本明細書において提供される。例えば、本明細書において提供される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメイン、および第２の抗原結合ドメインを含み得る。本明細書において提供される多特異性（例えば、二重特異性）抗体はまた、第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインを含み得る。これらの多特異性（例えば、二重特異性）抗体はまた、他の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリータンパク質に結合し得、例えば、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０で同時調節されるものである。かかる多特異性抗体は、有利には、１つのＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に結合するだけである単一特異性二価抗体より、標的タンパク質の組み合わせを含有する免疫細胞のある種のサブセットに対してより高い特異性を示す。

【0130】

例えば、ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、またはＤＲ３のような、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリータンパク質に結合する第２の抗原結合ドメインを含む抗体が、本明細書において提供される。別の例において、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、またはＤＲ３のような、ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインを含む抗体が、本明細書において提供される。

【0131】

ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメイン、およびＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインを含む多特異性（例えば、二重特異性）抗体もまた、本明細書において提供される。

【0132】

ＯＸ４０抗原結合ドメインならびにＧＩＴＲ抗原結合ドメインを含有する、本明細書において提供される抗体は、例えば、ＧＩＴＲに結合し、同じＧＩＴＲ抗原結合ドメインを含有する単一特異性二価抗体と比較して、および／またはＯＸ４０に結合し、同じＯＸ４０抗原結合ドメインを含有する単一特異性二価抗体と比較して、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０を発現する細胞（例えば、Ｔ制御性細胞）への増大した結合を示し得る。

【0133】

ＯＸ４０抗原結合ドメインおよびＧＩＴＲ抗原結合ドメインを含有する、本明細書において提供される抗体はまた、ＧＩＴＲに結合し、同じＧＩＴＲ抗原結合ドメインを含有する単一特異性二価抗体と比較して、（例えば、低濃度にて）ＧＩＴＲ陽性、ＯＸ４０陰性細胞への低下した結合を示し得る。

【0134】

ＯＸ４０抗原結合ドメインおよびＧＩＴＲ抗原結合ドメインを含有する、本明細書において提供される抗体はまた、ＯＸ４０に結合し、同じＯＸ４０抗原結合ドメインを含有する単一特異性二価抗体と比較して、（例えば、低濃度にて）ＧＩＴＲ陰性、ＯＸ４０陽性細胞への低下した結合を示し得る。

【0135】

ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において記載される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に結合し得る。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ヒトＣＤ４＋細胞およびカニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する。ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において提供される抗体は、エフェクターＴ細胞と比較して、制御性Ｔ細胞への増強した結合を示し得る。ある場合では、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において提供される抗体は、腫瘍内エフェクターＴ細胞と比較して、腫瘍内制御性Ｔ細胞への増強した結合を示す。

【0136】

ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において提供される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ヒトＧＩＴＲリガンドのヒトＧＩＴＲへの結合を阻害し、および／またはヒトＯＸ４０リガンドのヒトＯＸ４０への結合を阻害し得る。

【0137】

一例において、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において提供される抗体は、以下の表１の１列において示されるＣＤＲの組み合わせを含む。

【表1】

【0138】

一例において、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において提供される抗体は、以下の表２の１列において示される、２つの重鎖可変ドメインと２つの軽鎖可変ドメインの組み合わせを含む。

【表2】

【0139】

一例において、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に特異的に結合する、本明細書において提供される抗体は、以下の表３の１列において示される、２つの重鎖と２つの軽鎖の組み合わせを含む。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0140】

本明細書において提供される、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性抗体、例えば、二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に結合させることにより、もしくは２つのハイブリドーマ細胞株を融合させて、ハイブリッドハイブリドーマを製造することにより、調製され得る。使用され得る他の多価フォーマットは、例えば、Κλボディ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、ＴａｎｄＡｂ、ナノボディ、ＳＭＩＰ、ＤＮＬ、鎖交換操作ドメイン体（ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ）、アフィボディー、フィノマー、クニッツドメイン、Ａｌｂｕ－ｄａｂ、ＤＡＲＴ、ＤＶＤ－ＩＧ、Ｃｏｖｘボディ、ペプチボディ、ｓｃＦｖ－Ｉｇ、ＳＶＤ－Ｉｇ、ｄＡｂ－Ｉｇ、ノブ・イン・ホール、ＤｕｏＢｏｄｙ抗体およびｔｒｉｏｍＡｂを含む。典型的な二重特異性フォーマットは、Ｇａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １３：７９９－８０１（２０１４）（参照により全体が本明細書において組み込まれる）において考察される。

【0141】

本発明の典型的な二重特異性抗体分子は、（ｉ）異なる抗原結合領域を含む２つのアーム、１つはＯＸ４０のような第１の抗原に対する特異性を有し、１つはＧＩＴＲのような第２の抗原に対する特異性を有する、を有する単一抗体、（ｉｉ）ＯＸ４０のような第１の抗原に特異的な１つの抗原結合領域またはアーム、およびＧＩＴＲのような第２の抗原に特異的な第２の抗原結合領域またはアームを有する単一抗体、（ｉｉｉ）例えば、外部ペプチドリンカーによりタンデムに結合した２つのｓｃＦｖを介して、ＯＸ４０のような第１の抗原に対する第１の特異性、およびＧＩＴＲのような第２の抗原に対する第２の特異性を有する単鎖抗体；（ｉｖ）それぞれの軽鎖および重鎖が、短いペプチド連鎖を通じてタンデムに２つの可変ドメインを含有する、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉｇ．ＴＭ．）Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（ｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント；（ｖｉ）標的抗原のそれぞれについての２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの単鎖二重特異性抗体の融合物である、Ｔａｎｄａｂ；（ｖｉｉ）多価分子をもたらす、ｓｃＦｖの二重特異性抗体との組み合わせである、フレキシボディ；（ｖｉｉｉ）Ｆａｂに適用されたとき、異なるＦａｂフラグメントに結合した２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質を生じ得る、タンパク質キナーゼＡにおける「２量体化およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「鍵と鍵穴」分子；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂアームの末端両方に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるサソリ分子；ならびに（ｘ）二重特異性抗体を含む。

【0142】

二重特異性抗体の異なるクラスの例は、ヘテロ２量体化を強制する相補ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子；組換えＩｇＧ様二重ターゲティング分子、ここで、分子の２つの鎖、それぞれが、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂフラグメントまたはＦａｂフラグメントの一部を含有する；ＩｇＧ融合分子、ここで、全長ＩｇＧ抗体は、外部ＦａｂフラグメントまたはＦａｂフラグメントの一部に融合される；Ｆｃ融合分子、ここで、単鎖Ｆｖ分子または安定化二重特異性抗体は、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域またはその一部に融合される；Ｆａｂ融合分子、ここで、異なるＦａｂフラグメントは一体となって融合される；ＳｃＦｖおよび二重特異性抗体ベースならびに重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）、ここで、異なる単鎖Ｆｖ分子または異なる二重特異性抗体または異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）は、互いに、または別のタンパク質もしくは担体分子に融合される、を含むが、これらに限定されない。

【0143】

Ｆａｂ融合二重特異性抗体の例は、Ｆ（ａｂ）_２（Ｍｅｄａｒｅｘ／アムジェン）、Ｄｕａｌ－ＡｃｔｉｏｎまたはＢｉｓ－Ｆａｂ（ジェネンテック）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（イミュノメディクス）、二価二重特異性（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）およびＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）を含むが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ、二重特異性抗体ベースおよびドメイン抗体の例は、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、単鎖二重特異性抗体（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）およびＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重ターゲティングナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、ならびに二重ターゲティング重鎖のみのドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。

【0144】

ある実施形態において、多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある実施形態において、多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントであり得る。

【0145】

ある実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する、多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ＤｕｏＢｏｄｙ抗体である。

【0146】

ある実施形態において、本明細書において記載される、ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌ変異を含むヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域を含み、本明細書において記載される、ＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒ変異を含むヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域を含む。

【0147】

ある実施形態において、本明細書において記載される、ＯＸ４０に結合する第１の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒ変異を含むヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域を含み、本明細書において記載される、ＧＩＴＲに結合する第２の抗原結合ドメインは、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌ変異を含むヒトＩｇＧ_１重鎖定常領域を含む。

【0148】

本明細書において提供される、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０活性を刺激するか、または弱め得る。ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０機能を刺激する抗体は、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０をクラスター形成する抗体を含む。クラスター形成は、例えば、ＦｃとＦｃ受容体（ＦｃＲ）の相互作用の結果として生じ得る。従って、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０を刺激する抗体は、増大したＦｃ受容体結合を有する抗体を含む。Ｆｃ受容体結合を増大する変異は、当該技術分野において公知であり、例えば、アフコシル化Ｆｃを有する抗体、ならびにＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＳＥＬＦ変異体）およびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅのような変異を有する抗体を含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アゴニスト抗体は、Ｋａｂａｔに従い番号付けられた、Ｃ１２７Ｓを含有するＩｇＧ２定常領域を含む。ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０機能を弱める抗体は、減少したＦｃ受容体結合を有する抗体を含む。Ｆｃ受容体結合を減少させる変異は、当該技術分野において公知であり、例えば、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａ；Ｎ２９７Ｑ；Ｄ２６５Ａ；Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ；Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ；Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ；Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｑ；およびＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ｑ／Ｐ３３１Ｓを含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アンタゴニスト抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａを含有するＩｇＧ１定常領域を含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アンタゴニスト抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ｑを含有するＩｇＧ１定常領域を含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アンタゴニスト抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｄ２６５Ａを含有するＩｇＧ１定常領域を含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アンタゴニスト抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａを含有するＩｇＧ１定常領域を含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アンタゴニスト抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択される変異を含有するＩｇＧ１定常領域を含む。

【0149】

幾つかの実施形態において、１つ、２つ、またはそれ以上の変異（例えば、アミノ酸置換）を、本明細書において記載される抗体のＦｃ領域（例えば、ＥＵ番号付けシステムによる番号付けで、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ_１の残基２３１～３４０）および／もしくはＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ_１の残基３４１～４４７））ならびに／またはヒンジ領域に導入して、例えば、エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（例えば、活性化Ｆｃ受容体）に対する抗体の親和性が増大されるか、あるいは低下する。Ｆｃ受容体に対する抗体の親和性を低下させるか、または増大する抗体のＦｃ領域における変異、およびかかる変異をＦｃ受容体またはそのフラグメントに導入する技術は、当業者に公知である。Ｆｃ受容体に対する抗体の親和性を変更するように作製され得る抗体のＦｃ受容体における変異の例は、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）ＰＮＡＳ １０９：６１８１－６１８６、米国特許第６，７３７，０５６号、ならびに国際公開第０２／０６０９１９号；第９８／２３２８９号；および第９７／３４６３１号（参照により本明細書に組み込まれる）において記載される。

【0150】

特定の実施形態において、１つ、２つ、または複数のアミノ酸変異（すなわち、置換、挿入もしくは欠損）を、ＩｇＧ定常ドメイン、またはそのＦｃＲｎ結合フラグメント（好ましくは、Ｆｃもしくはヒンジ－Ｆｃドメインフラグメント）に導入して、インビボでの抗体の半減期が変更される（例えば、低下されるか、または増大される）。例えば、インビボでの抗体の半減期を変更する（例えば、低下させるか、または増大する）変異の例について、国際公開第０２／０６０９１９号；第９８／２３２８９号；および第９７／３４６３１号；ならびに米国特許第５，８６９，０４６号、第６，１２１，０２２号、第６，２７７，３７５号および第６，１６５，７４５号を参照。ある実施形態において、１つ、２つ、または複数のアミノ酸変異（すなわち、置換、挿入もしくは欠損）を、ＩｇＧ定常ドメイン、またはそのＦｃＲｎ結合フラグメント（好ましくは、Ｆｃもしくはヒンジ－Ｆｃドメインフラグメント）に導入して、インビボでの抗体の半減期が低下される。他の実施形態において、１つ、２つ、または複数のアミノ酸変異（すなわち、置換、挿入もしくは欠損）を、ＩｇＧ定常ドメイン、またはそのＦｃＲｎ結合フラグメント（好ましくは、Ｆｃもしくはヒンジ－Ｆｃドメインフラグメント）に導入して、インビボでの抗体の半減期が増大される。特定の実施形態において、抗体は、ＥＵ番号付けシステムによる番号付けで、第２の定常（ＣＨ２）ドメイン（ヒトＩｇＧ_１の残基２３１～３４０）および／もしくは第３の定常（ＣＨ３）ドメイン（ヒトＩｇＧ_１の残基３４１～４４７）における１つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、置換）を有してもよい。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体のＩｇＧ_１の定常領域は、Ｅｕ番号制に従い番号付けられた、位置２５２におけるメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換、位置２５４におけるセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への置換、および位置２５６におけるスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換を含む。米国特許第７，６５８，９２１号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。「ＹＴＥ変異体」と呼ばれる、この種類の変異体ＩｇＧは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して、４倍増大した半減期を提示することが示された（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ＷＦ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１：２３５１４－２４を参照）。ある実施形態において、抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、位置２５１～２５７、２８５～２９０、３０８～３１４、３８５～３８９、および４２８～４３６のアミノ酸残基の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ定常ドメインを含む。

【0151】

さらなる実施形態において、１つ、２つ、または複数のアミノ酸置換を、ＩｇＧ定常ドメインＦｃ領域に導入して、抗体のエフェクター機能（複数を含む）が変更される。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対する変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が変更されているエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号および第５，６４８，２６０号においてさらに詳細に記載される。幾つかの実施形態において、定常領域ドメインの欠損または不活性化（点変異もしくは他の手段を通じた）は、循環抗体のＦｃ受容体結合を低減し、それにより、腫瘍局在性が増大されてもよい。定常ドメインを欠損させるか、または不活性化し、それにより、腫瘍局在性を増大する変異の記載について、例えば、米国特許第５，５８５，０９７号および第８，５９１，８８６号を参照。ある実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換を、本明細書において記載される抗体のＦｃ領域に導入して、Ｆｃ領域上の可能性のあるグリコシル化部位を取り除き、Ｆｃ受容体結合を低減してもよい（例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６０４を参照）。様々な実施形態において、本明細書において記載される抗体の定常領域における以下の変異：ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａ置換；Ｎ２９７Ｑ置換；Ｌ２３５Ａ置換およびＬ２３７Ａ置換；Ｌ２３４Ａ置換およびＬ２３５Ａ置換；Ｅ２３３Ｐ置換；Ｌ２３４Ｖ置換；Ｌ２３５Ａ置換；Ｃ２３６欠損；Ｐ２３８Ａ置換；Ｄ２６５Ａ置換；Ａ３２７Ｑ置換；またはＰ３２９Ａ置換の１つまたは複数が作製されてもよい。

【0152】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７ＱまたはＮ２９７Ａアミノ酸置換を有するＩｇＧ_１の定常ドメインを含む。

【0153】

ある実施形態において、抗体が、変更されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは無効にされた補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、本明細書において記載される抗体の定常領域におけるアミノ酸残基３２９、３３１、および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基で置換され得る。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ）においてさらに詳細に記載される。幾つかの実施形態において、本明細書において記載される抗体のＣＨ２メインのＮ末端領域におけるアミノ酸位置２３１～２３８内の１つまたは複数のアミノ酸残基を変更して、それにより、抗体の補体を固定する能力が変更される。このアプローチは、国際公開第９４／２９３５１号においてさらに記載される。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体のＦｃ領域を修飾して、抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を仲介する能力が増大され、および／あるいはＥＵ番号制に従い番号付けられた、次の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、もしくは４３９の１つまたは複数のアミノ酸を変異させること（例えば、アミノ酸置換を導入すること）により、抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大される。このアプローチは、国際公開第００／４２０７２号においてさらに記載される。

【0154】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、位置２６７、３２８、またはその組み合わせにおける変異（例えば、置換）を有するＩｇＧ_１の定常ドメインを含む。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、およびその組み合わせからなる群から選択される変異（例えば、置換）を有するＩｇＧ_１の定常ドメインを含む。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異（例えば、置換）を有するＩｇＧ_１の定常ドメインを含む。ある実施形態において、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ変異（例えば、置換）を有するＩｇＧ_１の定常ドメインを含む、本明細書において記載される抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、またはＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに対する増大した結合親和性を有する。

【0155】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＩｇＧ_４抗体の定常領域を含み、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、重鎖のアミノ酸残基２２８のセリンは、プロリンに置換される。

【0156】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＩｇＧ_２抗体の定常領域を含み、Ｋａｂａｔに従い番号付けられた、重鎖のアミノ酸残基１２７のシステインは、セリンに置換される。

【0157】

低減したフコース含量を有する抗体は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａのような、Ｆｃ受容体に対して増大した親和性を有することが報告された。従って、ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、低減したフコース含量を有するか、またはフコース含量を有しない。かかる抗体は、当業者に公知の技術を使用して、製造され得る。例えば、抗体は、フコシル化の能力を欠損または欠く細胞において発現され得る。特定の例において、α１，６－フコシルトランスフェラーゼの対立遺伝子両方のノックアウトを有する細胞株を使用して、低減したフコース含量を有する抗体が製造され得る。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（ロンザ）は、低減したフコース含量を有する抗体を製造するために使用され得る、かかるシステムの例である。あるいは、低減したフコース含量を有するか、あるいはフコース含量を有しない抗体は、例えば、（ｉ）フコシル化を防ぐか、もしくは低減する条件下で、細胞を培養すること；（ｉｉ）（例えば、フコシダーゼ酵素での）フコースの翻訳後除去；（ｉｉｉ）例えば、グリコシル化されていない糖タンパク質の組換え発現後の所望の炭水化物の翻訳後負荷；または（ｉｖ）フコシル化されていないその抗体を選択するための、糖タンパク質の精製により、製造され得る。フコース含量を有しないか、または低減したフコース含量を有するその抗体を製造する方法について、例えば、Ｌｏｎｇｍｏｒｅ ＧＤ ＆ Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ Ｈ（１９８２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ １００：３６５－９２およびＩｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：８４を参照。

【0158】

操作されたグリコフォームは、エフェクター機能を増強すること、または低減することを含むが、これらに限定されない、様々な目的に有用であるかもしれない。本明細書において記載される抗体における操作されたグリコフォームを創出する方法は、例えば、Ｕｍａｎａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６－１８０；Ｄａｖｉｅｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８－２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３；Ｎｉｗａ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １：６２４８－６２５５；Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０；Ｋａｎｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １７：１０４－１１８；米国特許第６，６０２，６８４号；第６，９４６，２９２号；および第７，２１４，７７５号；米国特許公開第２００７／０２４８６００号；第２００７／０１７８５５１号；第２００８／００６００９２号；および第２００６／０２５３９２８号；国際公開第００／６１７３９号；第０１／２９２２４６号；第０２／３１１１４０号；および第０２／３０９５４号；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｉｏｗａ、Ｉｎｃ．プリンストン、ニュージャージー州）；ならびにＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｌｙｃａｒｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ、チューリッヒ、スイス）において開示されるものを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ９３：８５１－８６１；国際公開第０７／０３９８１８号；第１２／１３０８３１号；第９９／０５４３４２号；第０３／０１１８７８号；および第０４／０６５５４０号も参照。

【0159】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗体のＦｃドメインを操作するために使用されるテクノロジーは、Ｘｅｎｃｏｒ（モンロビア、カリフォルニア州）のＸｍａｂ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙである。例えば、米国特許第８，３６７，８０５号；第８，０３９，５９２号；第８，１２４，７３１号；第８，１８８，２３１号；米国特許公開第２００６／０２３５２０８号；国際公開第０５／０７７９８１号；第１１／０９７５２７号；およびＲｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７：２５１７－２５２７を参照。

【0160】

ある実施形態において、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、ヒトＩｇＧ１重鎖における位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびにＤ２６５に対応する位置の本明細書において記載される抗体の定常領域におけるアミノ酸残基は、それぞれ、Ｌ、Ｌ、およびＤではない。このアプローチは、国際公開第１４／１０８４８３号において詳細に記載される。ある実施形態において、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、ヒトＩｇＧ１重鎖における位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＤ２６５に対応するアミノ酸は、それぞれ、Ｆ、Ｅ、およびＡ；またはＡ、Ａ、およびＡである。

【0161】

ある実施形態において、１つ、２つ、または複数の変異（例えば、アミノ酸置換）を、本明細書において記載される抗体のＦｃ領域（例えば、ＥＵ番号付けシステムによる番号付けで、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ_１の残基２３１～３４０）および／もしくはＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ_１の残基３４１～４４７））ならびに／またはヒンジ領域に導入して、例えば、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合および／もしくは抗原依存性細胞傷害活性のような、抗体の１つまたは複数の機能特性が変更される。

【0162】

ある実施形態において、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が、例えば、米国特許第５，６７７，４２５号において記載される通り、変更される（例えば、増大されるか、または低下する）ように、１つ、２つ、または複数の変異（例えば、アミノ酸置換）が、Ｆｃ領域（ＣＨ１ドメイン）のヒンジ領域に導入される。ＣＨ１ドメインのヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変更して、例えば、軽および重鎖のアセンブリが促進されるか、または抗体の安定性が変更され得る（例えば、増大されるか、もしくは低下され得る）。

【0163】

ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、抗体なし、または無関連の抗体（例えば、ＧＩＴＲもしくはＯＸ４０に免疫特異的に結合しない抗体）でのＧＩＴＲならびに／あるいはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０）活性と比べ、本明細書において記載される方法および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性を、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、あるいは１００倍増大する。例えば、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、抗体なし、または無関連の抗体（例えば、ＧＩＴＲもしくはＯＸ４０に免疫特異的に結合しない抗体）でのＧＩＴＲならびに／あるいはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０）活性と比べ、本明細書において記載される方法および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、あるいは９９％増大し得る。ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性の非限定的な例は、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）シグナル伝達、細胞増殖、細胞生存、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、および／またはＩＬ－１３）を含み得る。

【0164】

本明細書において提供される通り、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、例えば、以下の実施例において例示される通り、例えば、ＳＥＡアッセイにおいてＩＬ－２放出を刺激することにより、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０機能を刺激し得る。例えば、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて、例えば、電気化学発光により測定される通り、例えば、ＰＢＭＣにおいて、例えば、５日間、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２および９７％湿度での刺激の際、ＩＬ－２産生を誘導し得る。幾つかの実施形態において、ＩＬ－２産生は、抗体濃度、例えば、０．０８μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、または６．７μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌの実質的な増加関数である。ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）と組み合わせて、例えば、ＰＢＭＣにおいてＩＬ－２産生を誘導し得、ここで、ＩＬ－２産生は、例えば、次の工程：（ａ）ＰＢＭＣ（例えば、ウェル中１０^５個の細胞）を、変動する濃度（例えば、２０、４６．７、２．２、０．７４、０．２５、および０．０８μｇ／ｍｌ）の抗体、ならびに例えば、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡの不存在または存在下で、例えば、５日間、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２、および９７％湿度にて培養すること；ならびに（ｂ）清透化された上清を集め、例えば、電気化学発光により、ＩＬ－２のタイターを測定することを含むアッセイにおいて評価される通り、抗体濃度、例えば、０．０８μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、または６．７μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌの実質的な増加関数である。

【0165】

ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて、例えば、電気化学発光により測定される通り、例えば、ＰＢＭＣにおいて、例えば、５日間、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２および９７％湿度での刺激の際、ＩＬ－２産生を誘導し得る。幾つかの実施形態において、抗体が、例えば、０．０８μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、または６．７μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌであるとき、ＩＬ－２産生は、シグモイド用量応答曲線を示す。ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）と組み合わせて、例えば、ＰＢＭＣにおいてＩＬ－２産生を誘導し得、ここで、ＩＬ－２産生は、抗体が、次の工程：（ａ）ＰＢＭＣ（例えば、ウェル中１０^５個の細胞）を、変動する濃度（例えば、２０、６．７、２．２、０．７４、０．２５、および０．０８μｇ／ｍｌ）の抗体、ならびに例えば、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡの不存在または存在下で、例えば、５日間、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２、および９７％湿度にて培養すること；ならびに（ｂ）清透化された上清を集め、例えば、電気化学発光により、ＩＬ－２のタイターを測定することを含むアッセイにおいて評価される通り、例えば、０．０８μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、または６．７μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌであるとき、シグモイド用量応答曲線を示す。ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）（例えば、１００ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせて、例えば、電気化学発光により測定される通り、例えば、ＰＢＭＣにおいて、例えば、５日間、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２および９７％湿度での刺激の際、ＩＬ－２産生を誘導し得、ここで、ＩＬ－２産生は、抗体濃度、例えば、０．０８μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、または６．７μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌの実質的な増加関数である。ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合する抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含む抗体は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）と組み合わせて、例えば、ＰＢＭＣにおいてＩＬ－２産生を誘導し得、ここで、ＩＬ－２産生は、例えば、次の工程：（ａ）ＰＢＭＣ（例えば、ウェル中１０^５個の細胞）を、変動する濃度（例えば、２０、６．７、２．２、０．７４、０．２５、および０．０８μｇ／ｍｌ）の抗体、ならびに例えば、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡの不存在または存在下で、例えば、５日間、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２、および９７％湿度にて培養すること；ならびに（ｂ）清透化された上清を集め、例えば、電気化学発光により、ＩＬ－２のタイターを測定することを含むアッセイにおいて評価される通り、抗体濃度、例えば、０．０８μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、０．７４μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．２μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、または６．７μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍの実質的な増加関数である。

【0166】

特有の態様において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０）に免疫特異的に結合する多特異性（例えば、二重特異性）アンタゴニスト抗体が、本明細書において提供される。

【0167】

特有の態様において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ_１重鎖定常領域を含み、ここで、ＩｇＧ_１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ、およびＰ３３１Ｓからなる群から選択される変異を含む。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｎ２９７ＡまたはＤ２６５Ａである。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｌ２３４ＦおよびＬ２３５Ｅである。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ｅ、およびＤ２６５Ａである。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ｅ、およびＮ２９７Ｑである。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓである。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｑである。ある実施形態において、変異は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、およびＰ３３１Ｓである。特有の態様において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ_１重鎖定常領域を含み、ここで、ＩｇＧ_１重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択される変異を含む。ある実施形態において、抗体はアンタゴニストである。

【0168】

ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載されるアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、抗体なし、または無関連の抗体（例えば、ＧＩＴＲもしくはＯＸ４０に免疫特異的に結合しない抗体）でのＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性に比べて、本明細書において記載される方法、および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性を、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低下させる。ある実施形態において、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載されるアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、抗体なし、または無関連の抗体（例えば、ＧＩＴＲもしくはＯＸ４０に免疫特異的に結合しない抗体）でのＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性に比べて、本明細書において記載される方法、および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低下させる。ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）活性の非限定的な例は、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）シグナル伝達、細胞増殖、細胞生存、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、および／もしくはＩＬ－１３）を含み得る。特定の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０活性は、以下の実施例において記載される通り、評価される。

【0169】

本明細書において提供される通り、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、例えば、以下の実施例において例示される通り、例えば、ＧＩＴＲＬ誘導性シグナル伝達を無効にすることにより、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０機能を弱め得る。例えば、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合するアンタゴニスト抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列の同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含むアンタゴニスト抗体は、例えば、ルシフェラーゼアッセイにより測定される通り、ＧＩＴＲＬ誘導性シグナル伝達を無効にし得る。ある実施形態において、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０に結合するアンタゴニスト抗体、例えば、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に結合し、本明細書において特定されるＣＤＲ配列の組み合わせ、本明細書において特定されるＶＨおよび／またはＶＬ配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬ配列、あるいは本明細書において特定される重および／または軽鎖を含むアンタゴニスト抗体は、例えば、次の工程：（ａ）ジャーカットｈｕＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢルシフェラーゼ細胞を、変動する濃度の抗体（例えば、１２箇所の用量タイトレーション、０．０５～１０，０００ｎｇ／ｍｌ）および３量体ＧＩＴＲＬの不存在または存在下で、２時間、１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ_２にて培養すること、ならびに（ｂ）ルシフェラーゼ活性を検出することを含むルシフェラーゼアッセイにおいて評価される通り、ＧＩＴＲＬ誘導性シグナル伝達を無効にし得る。

【0170】

ある実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する、本明細書において記載されるアンタゴニスト多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０のＧＩＴＲＬならびに／またはＯＸ４０Ｌとの相互作用を阻害する（例えば、ＧＩＴＲＬとＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０ＬとＯＸ４０の互いとの結合を阻害する）。ある実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する、本明細書において記載されるアンタゴニスト多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、ＧＩＴＲＬおよび／もしくはＯＸ４０Ｌにより誘導されるＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０活性（例えば、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０シグナル伝達）を低下させる。ある実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する、本明細書において記載されるアンタゴニスト多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、Ｔ細胞増殖を抑制する。ある実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する、本明細書において記載されるアンタゴニスト多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、またはその組み合わせ）の産生を抑制する。

【0171】

ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する、本明細書において提供される抗体は、検出可能な標識もしくは物質に融合または結合され得る（例えば、共有または非共有結合され得る）。検出可能な標識または物質の例は、グルコース酸化酵素のような酵素標識；ヨウ素（^１２５Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１２１Ｉｎ）、およびテクネシウム（^９９Ｔｃ）のようなラジオアイソトープ；ルミノールのような発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンのような蛍光標識を含む。かかる標識された抗体を使用して、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）タンパク質が検出され得る。例えば、以下のセクション７．５．２を参照。

【0172】

７．２．１ ＯＸ４０抗原結合ドメイン
ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載されるＯＸ４０抗原結合ドメインは、表４において示される通り、
（ａ）アミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号５０）を含む、からなる、または本質的にからなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号５１）を含む、からなる、または本質的にからなるＶＬ ＣＤＲ２、および
（ｃ）アミノ酸配列ＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号５２）もしくはＭＱＡＬＱＴＰＬＴ（配列番号５３）を含む、からなる、または本質的にからなるＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
幾つかの実施形態において、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、本明細書において記載されるＶＬフレームワーク領域を含む。

【0173】

別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、表４において示される通り、
（ａ）アミノ酸配列ＧＳＡＭＨ（配列番号４７）を含む、からなる、または本質的にからなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＲＩＲＳＫＡＮＳＹＡＴＡＹＡＡＳＶＫＧ（配列番号４８）を含む、からなる、または本質的にからなるＶＨ ＣＤＲ２、および
（ｃ）アミノ酸配列ＧＩＹＤＳＳＧＹＤＹ（配列番号４９）を含む、からなる、または本質的にからなるＶＨ ＣＤＲ３ を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
幾つかの実施形態において、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、本明細書において記載されるＶＨフレームワークを含む。特定の実施形態において、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、本明細書において記載される抗体のＶＨフレームワーク領域を含む。

【表4】

【表5】

【0174】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合し、例えば、表４ならびに５において記載される、ｐａｂ１９４９ｗ、またはｐａｂ２０４９ｗの軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲならびに重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ（すなわち、配列番号４７～５２もしくは配列番号４７～５１および５３）を含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0175】

ある実施形態において、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＫＶ２－２８生殖系列配列（例えば、配列番号５８のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＫＶ２－２８＊０１）に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。

【0176】

ある実施形態において、ＯＸ４０抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ３－７３生殖系列配列（例えば、配列番号５７のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＨＶ３－７３＊０１）に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。

【0177】

特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号５５もしくは５６のアミノ酸配列からなる、または本質的にからなるＶＬドメインを含む。

【0178】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号５４のアミノ酸配列からなる、または本質的にからなるＶＨドメインを含む。

【0179】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、それぞれ、配列番号５４、および配列番号５５または５６のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、例えば、表６において示される通り、それぞれ、配列番号５４、および配列番号５５もしくは５６のアミノ酸配列からなる、または本質的にからなる。

【表6】

特有の態様において、軽鎖ならびに重鎖、例えば、別々の軽鎖および重鎖を含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。軽鎖に関して、特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの軽鎖は、カッパ軽鎖である。別の特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの軽鎖は、ラムダ軽鎖である。なお別の特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖である。ある実施形態において、ＯＸ４０ポリペプチド（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５５または５６において記載される配列を含み、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。別のある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５５または５６において記載される配列を含み、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５５または５６において記載される配列を含み、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域配列の非限定的な例は、当該技術分野において記載されており、例えば、米国特許第５，６９３，７８０号、および上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。

【0180】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６７または６９において記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0181】

重鎖に関して、特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの重鎖は、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖であり得る。別の特定の実施形態において、記載される抗原結合ドメインの重鎖は、ヒトアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖を含み得る。ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖を含み、ここで、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５４において記載される配列を含み得、ここで、重鎖の定常領域は、ヒトガンマ（γ）重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖を含み、ここで、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５４において記載される配列を含み、ここで、重鎖の定常領域は、本明細書において記載されるか、または当該技術分野において公知のヒト重鎖のアミノ酸を含む。ヒト定常領域配列の非限定的な例は、当該技術分野において記載されており、例えば、米国特許第５，６９３，７８０号、および上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。

【0182】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６１において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６２において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６３において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６４において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６５において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号７１において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0183】

特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、またはヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ）の定常領域のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、定常領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ）の定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0184】

別の特定の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ヒトＩｇＧ_１（例えば、アロタイプＧ１ｍ３、Ｇ１ｍ１７，１またはＧ１ｍ１７，１，２）、ヒトＩｇＧ_２、またはヒトＩｇＧ_４の定常領域のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ヒトＩｇＧ_１（アロタイプＧｌｍ３）の定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域の非限定的な例は、当該技術分野において記載され、例えば、上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。

【0185】

別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６７において記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号６１、６２、６３、６４、６５、または７１において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号６９において記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号６１、６２、６３、６４、６５、または７１において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0186】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ｐａｂ１９４９ｗまたはｐａｂ２０４９ｗのＶＬドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５５もしくは５６）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメインを含み、例えば、ここで、抗原結合ドメインは、ｐａｂ１９４９ｗまたはｐａｂ２０４９ｗのＶＬ ＣＤＲ同一であるＶＬ ＣＤＲを含む。

【0187】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ｐａｂ１９４９ｗまもしくはｐａｂ２０４９ｗのＶＨドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５４）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインを含み、例えば、ここで、抗原結合ドメインは、ｐａｂ１９４９ｗまたはｐａｂ２０４９ｗのＶＨ ＣＤＲと同一であるＶＨ ＣＤＲを含む。

【0188】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、（ｉ）ｐａｂ１９４９ｗまたはｐａｂ２０４９ｗのＶＬドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５５もしくは５６）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメイン；および（ｉｉ）ｐａｂ１９４９ｗまたはｐａｂ２０４９ｗのＶＨドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５４）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインを含み、例えば、ここで、抗体は、ｐａｂ１９４９ｗまたはｐａｂ２０４９ｗのＶＬ ＣＤＲおよびＶＨ ＣＤＲと同一であるＶＬ ＣＤＲならびにＶＨ ＣＤＲを含む。

【0189】

特有の態様において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）への特異的結合について、配列番号５５または５６において記載されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、および配列番号５４において記載されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗原結合ドメインと（例えば、用量に依存した方法で）競合する抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0190】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号５５または５６において記載されるアミノ酸配列を有するＶＬドメイン、および配列番号５４において記載されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗原結合ドメインにより、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）への特異的結合について、（例えば、用量に依存した方法で）競合的にブロックされるものである。

【0191】

当業者に公知のアッセイ、または本明細書において記載されるアッセイ（例えば、Ｘ線結晶解析、質量分析連結水素／ジュウテリウム交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アラニンスキャニング、ＥＬＩＳＡアッセイなど）を使用して、２つの抗体が同じエピトープに結合するかが決定され得る。

【0192】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ｐａｂ１９４９ｗもしくはｐａｂ２０４９ｗにより結合されるものと、またはエピトープと重複するエピトープと同じエピトープに免疫特異的に結合する。

【0193】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインとバリアントＯＸ４０の間の結合は、抗原結合ドメインと配列番号７２のヒトＯＸ４０配列の間の結合と比べて実質的に減弱され、ここで、バリアントＯＸ４０は、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｐ１１５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択される、または配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａからなる群から選択されるアミノ酸変異（例えば、置換）を除き配列番号７２の配列を含む。

【0194】

幾つかの実施形態において、バリアントＯＸ４０は、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、およびＰ１１５Ａからなる群から選択される、または配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａからなる群から選択される任意の１つの変異を除き配列番号７２の配列を含む。幾つかの実施形態において、バリアントＯＸ４０は、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｗ５８Ａ、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、およびＰ１１５Ａからなる群から選択される、もしくは配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａからなる群から選択される任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの変異を除き配列番号７２の配列を含む。幾つかの実施形態において、バリアントＯＸ４０は、配列番号７２に従い番号付けられた、アミノ酸変異Ｗ５８Ａ、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、およびＰ１１５Ａを除き、または配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａのアミノ酸変異を除き配列番号７２の配列を含む。

【0195】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、１１５、およびその組み合わせからなる群から選択される、もしくは６０、６２、８０、８８、９３、およびその組み合わせからなる群から選出される配列番号７２の残基を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＯＸ４０配列のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、エピトープは、配列番号７２の５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、および１１５からなる群から選択される、もしくは配列番号７２の６０、６２、８０、８８、および９３からなる群から選択される、任意の１つの残基、または任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つの残基を含む、からなる、あるいは本質的にからなる。幾つかの実施形態において、エピトープは、配列番号７２の残基５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、および１１５を含む、本質的にからなる、もしくはからなる、または配列番号７２の残基６０、６２、８０、８８、および９３を含む。

【0196】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、１１５、およびその組み合わせからなる群から選択される残基を含む、本質的にからなる、もしくはからなる配列番号７２のエピトープ、または６０、６２、８０、８８、９３、およびその組み合わせからなる群から選択される残基を含む、本質的にからなる、もしくはからなる配列番号７２のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、エピトープは、配列番号７２の５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、および１１５からなる群から選択される、または配列番号７２の６０、６２、８０、８８、および９３からなる群から選択される任意の１つの残基、または任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つの残基を含む。幾つかの実施形態において、エピトープは、配列番号７２の残基５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、および１１５を含む、からなる、もしくは本質的にからなる、または配列番号７２の残基６０、６２、８０、８８、および９３を含む。

【0197】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、１１５、およびその組み合わせからなる群から選択される、または６０、６２、８０、８８、９３、およびその組み合わせからなる群から選択される配列番号７２の少なくとも１つの残基に結合する。幾つかの実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号７２の５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、および１１５からなる群から選択される、もしくは配列番号７２の６０、６２、８０、８８、および９３からなる群から選択される任意の１つの残基、あるいは任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの残基に結合する。幾つかの実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号７２の残基５８、６０、６２、８０、８８、９３、９９、および１１５に結合する。幾つかの実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号７２の残基６０、６２、８０、８８、および９３に結合する。

【0198】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号７２のヒトＯＸ４０配列への結合と比較して、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、Ｐ１１５Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択される、もしくは配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、およびその組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸変異（例えば、置換）の存在を除き配列番号７２と同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する。幾つかの実施形態において、タンパク質は、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、およびＰ１１５Ａからなる群から選択される、または配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａからなる群から選択される任意の１つの変異を含むアミノ酸変異を除き配列番号７２の配列と同一である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、配列番号７２に従い番号付けられた、Ｗ５８Ａ、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、およびＰ１１５Ａからなる群から選択される、もしくは配列番号７２に従い番号付けられた、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａからなる群から選択される任意の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの変異を除き配列番号７２と同一である。幾つかの実施形態において、タンパク質は、配列番号７２に従い番号付けられた、アミノ酸置換Ｗ５８Ａ、Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、Ｐ９３Ａ、Ｐ９９Ａ、およびＰ１１５Ａの存在を除き、または配列番号７２に従い番号付けられた、アミノ酸置換Ｎ６０Ａ、Ｒ６２Ａ、Ｒ８０Ａ、Ｌ８８Ａ、およびＰ９３Ａの存在を除き配列番号７２と同一である。

【0199】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインのエピトープを免疫原として使用して、抗体が製造される。抗体を製造する方法について、例えば、以下のセクション７．３を参照。

【0200】

特有の態様において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価フォーマットで存在するとき、アゴニストとして機能する。

【0201】

ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価形態で存在するとき、抗体なし、もしくは無関連の抗体（例えば、ＯＸ４０に免疫特異的に結合しない抗体）でのＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）活性と比べて、本明細書において記載される方法、および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）活性を、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、あるいは１００倍増大する。ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価形態で存在するとき、抗体なし、もしくは無関連の抗体（例えば、ＯＸ４０に免疫特異的に結合しない抗体）でのＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）活性と比べて、本明細書において記載される方法、および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）活性を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％増大する。ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）活性の非限定的な例は、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）シグナル伝達、細胞増殖、細胞生存、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、および／またはＩＬ－１３）を含み得る。ある実施形態において、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価形態で存在するとき、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）活性を誘導するか、増強するか、または増大する。特定の実施形態において、ＯＸ４０活性における増大は、以下の実施例において記載される通り、評価される。

【0202】

ある実施形態において、本明細書において提供される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、米国出願第６２／１６１，１９８号（参照により全体が本明細書に組み込まれる）において記載される通り、ＯＸ４０に結合する抗原結合ドメインを含む。
７．２．２ ＧＩＴＲ抗原結合ドメイン

【0203】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、表７において示される通り、
（ａ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ_１ＮＱＫＮＹＬＸ_２（配列番号９０）（式中、Ｘ_１は、ＧまたはＳであり；Ｘ_２は、ＴまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および
（ｃ）ＱＮＸ_１ＹＳＸ_２ＰＹＴ（配列番号９２）（式中、Ｘ_１は、ＤまたはＥであり；Ｘ_２は、Ｙ、ＦまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0204】

別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載されるＧＩＴＲ抗原結合ドメインは、表８において示される通り、
（ａ）Ｘ_１ＹＸ_２ＭＸ_３（配列番号８７）（式中、Ｘ_１は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ_２は、ＡまたはＶであり；Ｘ_３は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；
（ｂ）Ｘ_１ＩＸ_２ＴＸ_３ＳＧＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＹＮＱＫＦＸ_７Ｘ_８（配列番号８８）（式中、Ｘ_１は、ＶまたはＬであり；Ｘ_２は、Ｒ、ＫまたはＱであり；Ｘ_３は、ＹまたはＦであり；Ｘ_４は、Ｄ、ＥまたはＧであり；Ｘ_５は、ＶまたはＬであり；Ｘ_６は、ＴまたはＳであり；Ｘ_７は、Ｋ、ＲまたはＱであり；Ｘ_８は、Ｄ、ＥまたはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｃ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【0205】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、表７において示される通り、
（ａ）ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＸ_１ＮＱＫＮＹＬＴ（配列番号４）（式中、_１は、ＧまたはＳである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ１；
（ｂ）ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ２；および
（ｃ）ＱＮＸ_１ＹＳＸ_２ＰＹＴ（配列番号６）（式中、Ｘ_１は、ＤまたはＥであり；Ｘ_２は、ＹまたはＦである）のアミノ酸配列を含むＶＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

【0206】

別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載されるＧＩＴＲ抗原結合ドメインは、表８において示される通り、
（ａ）Ｘ_１ＹＡＭＸ_２（配列番号１）（式中、Ｘ_１は、Ｄ、Ｇ、またはＥであり；Ｘ_２は、ＹまたはＨである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ１；
（ｂ）Ｘ_１ＩＲＴＹＳＧＸ_２ＶＸ_３ＹＮＱＫＦＸ_４Ｘ_５（配列番号２）（式中、Ｘ_１は、ＶまたはＬであり；Ｘ_２は、ＤまたはＧであり；Ｘ_３は、ＴまたはＳであり；Ｘ_４は、Ｋ、Ｒ、またはＱであり；Ｘ_５は、Ｄ、Ｅ、またはＧである）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ２；
（ｃ）ＳＧＴＶＲＧＦＡＹ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＶＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。

【表7】

【表8】

【0207】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合し、例えば、表１ならびに２（すなわち、配列番号１４、５、１６、７、１０、および３；配列番号１５、５、１７、８、１１、および３；配列番号１４、５、１６、９、１２、および３；もしくは配列番号１４、５、１６、９、１３、および３）において記載される、ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、またはｐａｂ１９７９の軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲならびに重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0208】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＫＶ４－１生殖系列配列（例えば、配列番号２８のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＫＶ４－１＊０１）に由来する軽鎖可変フレームワーク領域を含む。

【0209】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ抗原結合ドメインは、ヒトＩＧＨＶ１－２生殖系列配列（例えば、配列番号２７のアミノ酸配列を有する、例えば、ＩＧＨＶ１－２＊０２）に由来する重鎖可変フレームワーク領域を含む。

【0210】

特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号１９、２１、２３、または２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号１９、２１、２３、もしくは２６のアミノ酸配列からなる、または本質的にからなるＶＬドメインを含む。

【0211】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号１８、２０、２２、２４、または２５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、配列番号１８、２０、２２、２４、もしくは２５のアミノ酸配列からなる、または本質的にからなるＶＨドメインを含む。

【0212】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、それぞれ、配列番号１８および１９；配列番号２０および２１；配列番号２２および２３；配列番号２４および２３；または配列番号２５および２６のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、例えば、表９において示される通り、それぞれ、配列番号１８および１９；配列番号２０および２１；配列番号２２および２３；配列番号２４および２３；もしくは配列番号２５および２６のアミノ酸配列からなる、または本質的にからなる。

【表9】

【0213】

特有の態様において、軽鎖ならびに重鎖、例えば、別々の軽鎖および重鎖を含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。軽鎖に関して、特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの軽鎖は、カッパ軽鎖である。別の特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの軽鎖は、ラムダ軽鎖である。なお別の特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖である。ある実施形態において、ＧＩＴＲポリペプチド（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、または２６において記載される配列を含み、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。別のある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、または２６において記載される配列を含み、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、または２６において記載される配列を含み、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域配列の非限定的な例は、当該技術分野において記載されており、例えば、米国特許第５，６９３，７８０号、および上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。

【0214】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３７または３８において記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0215】

重鎖に関して、特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインの重鎖は、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖であり得る。別の特定の実施形態において、記載される抗原結合ドメインの重鎖は、ヒトアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）またはミュー（μ）重鎖を含み得る。ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖を含み、ここで、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１８、２０、２２、２４、または２５において記載される配列を含み得、ここで、重鎖の定常領域は、ヒトガンマ（γ）重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖を含み、ここで、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１８、２０、２２、２４、または２５において記載される配列を含み、ここで、重鎖の定常領域は、本明細書において記載されるか、または当該技術分野において公知のヒト重鎖のアミノ酸を含む。ヒト定常領域配列の非限定的な例は、当該技術分野において記載されており、例えば、米国特許第５，６９３，７８０号、および上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。

【0216】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３１において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３２において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３３において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３４において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３５において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３９において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0217】

特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、またはヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１，ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ）の定常領域のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、定常領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ_２ａおよびＩｇＧ_２ｂ）の定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0218】

別の特定の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ヒトＩｇＧ_１（例えば、アロタイプＧ１ｍ３、Ｇ１ｍ１７，１もしくはＧ１ｍ１７，１，２）、ヒトＩｇＧ_２、またはヒトＩｇＧ_４の定常領域のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ヒトＩｇＧ_１（アロタイプＧｌｍ３）の定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域の非限定的な例は、当該技術分野において記載され、例えば、上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。

【0219】

別の実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号３７において記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖、および配列番号３１、３２、３３、３４、３５、または３９において記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。

【0220】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＬドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１９、２１もしくは２３）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメインを含み、例えば、ここで、抗原結合ドメインは、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＬ ＣＤＲと同一であるＶＬ ＣＤＲを含む。

【0221】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＨドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１８、２０、２２、もしくは２４）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインを含み、例えば、ここで、抗原結合ドメインは、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＨ ＣＤＲと同一であるＶＨ ＣＤＲを含む。

【0222】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、（ｉ）ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＬドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１９、２１、もしくは２３）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＬドメイン；および（ｉｉ）ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＨドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１８、２０、２２、もしくは２４）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、あるいは少なくとも９８％の配列同一性を有するＶＨドメインを含み、例えば、ここで、抗体は、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗのＶＬ ＣＤＲおよびＶＨ ＣＤＲと同一であるＶＬ ＣＤＲならびにＶＨ ＣＤＲを含む。

【0223】

特有の態様において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）への特異的結合について、それぞれ、配列番号１８および１９；配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、または配列番号２４および２３において記載されるアミノ酸配列を有するＶＨならびにＶＬドメインを含む抗原結合ドメインと（例えば、用量に依存した方法で）競合する抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0224】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）への特異的結合について、それぞれ、配列番号１８および１９；配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、または配列番号２４および２３において記載されるアミノ酸配列を有するＶＨならびにＶＬドメインを含む抗原結合ドメインにより、（例えば、用量に依存した方法で）競合的にブロックされるものである。

【0225】

当業者に公知のアッセイ、または本明細書において記載されるアッセイ（例えば、Ｘ線結晶解析、質量分析連結水素／ジュウテリウム交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アラニンスキャニング、ＥＬＩＳＡアッセイなど）を使用して、２つの抗体が同じエピトープに結合するかが決定され得る。

【0226】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗにより結合されるものと、またはエピトープと重複するエピトープと同じエピトープに免疫特異的に結合する。

【0227】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインとバリアントＧＩＴＲの間の結合は、抗原結合ドメインと配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列の間の結合と比べて実質的に減弱され、ここで、バリアントＧＩＴＲは、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡまたはＧ６３Ａ変異の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１の配列を含む。幾つかの実施形態において、バリアントＧＩＴＲは、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡおよびＧ６３Ａ変異の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１の配列を含む。

【0228】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号４１のアミノ酸６０～６３における少なくとも１つの残基を含む、本質的にからなる、またはからなるヒトＧＩＴＲ配列のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、エピトープは、配列番号４１のアミノ酸６０～６３を含む、本質的になる、またはからなる。

【0229】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基６０、６２、および６３、ならびにその組み合わせからなる群から選択される残基を含む、本質的になる、またはからなるヒトＧＩＴＲのエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、エピトープは、配列番号４１の残基６０、６２、および６３からなる群から選択される任意の１つの残基、または任意の２つ、もしくは３つの残基を含む、本質的になる、あるいはからなる。

【0230】

特有の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、配列番号４１の残基２６～２４１のヒトＧＩＴＲ配列への結合と比較して、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０ＡおよびＧ６３Ａからなる群から選択されるアミノ酸変異（例えば、置換）の存在を除き配列番号４１の残基２６～２４１に同一のタンパク質への低減したまたは不在の結合を提示する。幾つかの実施形態において、置換は、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｄ６０Ａである。幾つかの実施形態において、置換は、配列番号４１に従い番号付けられた、Ｇ６３Ａである。

【0231】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインのエピトープを免疫原として使用して、抗体が製造される。抗体を製造する方法について、例えば、以下のセクション７．３を参照。

【0232】

特有の態様において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価フォーマットで存在するとき、アゴニストとして機能する。

【0233】

ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価形態で存在するとき、抗体なしで、もしくは無関連の抗体（例えば、ＧＩＴＲに免疫特異的に結合しない抗体）でのＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）活性と比べて、本明細書において記載される方法、および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）活性を、少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、あるいは１００倍増大する。ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価形態で存在するとき、抗体なしで、もしくは無関連の抗体（例えば、ＧＩＴＲに免疫特異的に結合しない抗体）でのＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）活性と比べて、本明細書において記載される方法、および／または当業者に公知の方法により評価される通り、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）活性を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、あるいは９９％増大する。ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）活性の非限定的な例は、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）シグナル伝達、細胞増殖、細胞生存、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、および／またはＩＬ－１３）を含み得る。ある実施形態において、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、単一特異性二価形態で存在するとき、ＧＩＴＲ（例えば、ヒトＧＩＴＲ）活性を誘導するか、増強するか、または増大する。特定の実施形態において、ＧＩＴＲ活性における増大は、以下の実施例において記載される通り、評価される。

【0234】

ある実施形態において、本明細書において提供される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３２８９５号（参照により全体が本明細書に組み込まれる）において記載される通り、ＧＩＴＲに結合する抗原結合ドメインを含む。

【0235】

７．２．３ 抗原結合ドメイン
特定の態様において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、そのＶＬドメイン単独、もしくはそのＶＨドメイン単独により、またはその３つのＶＬ ＣＤＲ単独、もしくはその３つのＶＨ ＣＤＲ単独により表されてもよい。例えば、オリジナルの抗体の親和性と同じくらい高い、もしくはそれより高い親和性を有するヒト化抗体バリアントをもたらす、それぞれ、ヒト軽鎖または重鎖ライブラリーから、補完する軽鎖あるいは重鎖を同定することによる、マウス抗αｖβ３抗体のヒト化を記載する、Ｒａｄｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）ＰＮＡＳ ９５：８９１０－８９１５（参照により全体が本明細書に組み込まれる）を参照。特異的ＶＬドメイン（またはＶＨドメイン）を使用すること、および相補可変ドメインについてライブラリーをスクリーニングすることによる、特異的な抗原に結合する抗体を製造する方法を記載する、Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（参照により全体が本明細書に組み込まれる）も参照。選別により、ＥＬＩＳＡにより決定される、強力なバインダーである、特異的ＶＨドメインについて１４種の新規パートナー、および特異的ＶＬドメインについて１３種の新規パートナーが作製された。特異的ＶＨドメインを使用すること、および相補ＶＬドメインについてライブラリー（例えば、ヒトＶＬライブラリー）をスクリーニングすることによる、特異的な抗原に結合する抗体を製造する方法であって、順に、選択されたＶＬドメインを使用して、さらなる相補（例えば、ヒト）ＶＨドメインのセレクションが導かれる、を記載する、Ｋｉｍ ＳＪ ＆ Ｈｏｎｇ ＨＪ，（２００７）Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５：５７２－５７７（参照により全体が本明細書に組み込まれる）も参照。

【0236】

特定の態様において、抗原結合ドメインのＣＤＲは、免疫グロブリン構造ループの位置を指す、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従い決定され得る（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ＆ Ｌｅｓｋ ＡＭ，（１９８７），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：７９９－８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（１）：１７５－８２；および米国特許第７，７０９，２２６号を参照）。典型的には、Ｋａｂａｔ番号付け慣習を使用するとき、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｈ１ループは、重鎖アミノ酸２６～３２、３３、または３４に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｈ２ループは、重鎖アミノ酸５２～５６に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｈ３ループは、重鎖アミノ酸９５～１０２に存在し、一方、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｌ１ループは、軽鎖アミノ酸２４～３４に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｌ２ループは、軽鎖アミノ酸５０～５６に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｌ３ループは、軽鎖アミノ酸８９～９７に存在する。Ｋａｂａｔ番号付け慣習を使用して番号付けられるとき、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さに依存して、Ｈ３２～Ｈ３４で変動する（これは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームが、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂにおいて挿入を生じる、３５Ａも３５Ｂも存在しないなら、ループは３２において終わり、３５Ａのみが存在するなら、ループは３３において終わり、３５Ａと３５Ｂ両方が存在するなら、ループは３４において終わる、ためである）。

【0237】

特定の態様において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、ｐａｂ１９７９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１９４９ｗのＶＬのＣｈｏｔｈｉａのＶＬ ＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。特定の態様において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、ｐａｂ１９７９、ｐａｂ２０４９、またはｐａｂ１９４９のＶＨのＣｈｏｔｈｉａのＶＨ ＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。特定の態様において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５ｗ、ｐａｂ１９７９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１９４９ｗのＶＬのＣｈｏｔｈｉａのＶＬ ＣＤＲを含み、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、ｐａｂ１９７９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１９４９ｗのＶＨのＣｈｏｔｈｉａのＶＨ ＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。ある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合する抗原結合ドメインは、１つまたは複数のＣＤＲを含み、ここで、ＣｈｏｔｈｉａおよびＫａｂａｔのＣＤＲは、同じアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0238】

特定の態様において、抗原結合ドメインのＣＤＲは、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ，（１９９９）Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ７：１３２－１３６およびＬｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：２０９－２１２において記載される通り、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従い決定され得る。ＩＭＧＴ番号付けスキームに従い、ＶＨ－ＣＤＲ１は、位置２６～３５にあり、ＶＨ－ＣＤＲ２は、位置５１～５７にあり、ＶＨ－ＣＤＲ３は、位置９３～１０２にあり、ＶＬ－ＣＤＲ１は、位置２７～３２にあり、ＶＬ－ＣＤＲ２は、位置５０～５２にあり、ＶＬ－ＣＤＲ３は、位置８９～９７にある。ある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、例えば、上記Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ（１９９９）および上記Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）において記載される通り、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従い決定される、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、ｐａｂ１９７９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１９４９ｗのＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0239】

特定の態様において、抗原結合ドメインのＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２：７３２－７４５に従い決定され得る。例えば、Ｍａｒｔｉｎ Ａ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ，” ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ３１，ｐｐ．４２２－４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）もまた参照。ある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ＲＭ ｅｔ ａｌにおける方法により決定される、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、ｐａｂ１９７９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１９４９ｗのＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0240】

特定の態様において、抗体のＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の歩み寄りを表し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）により使用される、ＡｂＭ高頻度可変領域を指す、ＡｂＭ番号付けスキームに従い決定され得る。ある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に特異的に結合し、ＡｂＭ番号付けスキームにより決定されるｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、ｐａｂ１９７９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１９４９ｗのＣＤＲを含む抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。

【0241】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインのＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）および／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）領域に沿った１つあるいは複数のＣＤＲの位置は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸位置で変動してもよい。例えば、１つの実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインのＣＤＲを定義する位置は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載される抗原結合ドメインのＣＤＲ位置と比べて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸、ＣＤＲのＮ末端および／またはＣ末端境界をシフトすることにより、変動し得る。別の実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインのＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）および／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３）領域に沿った１つあるいは複数のＣＤＲの長さは、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のアミノ酸、変動してもよい（例えば、より短いか、もしくはより長い）。

【0242】

１つの実施形態において、本明細書において記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、および／またはＶＨ ＣＤＲ３は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載されるＣＤＲ（例えば、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、もしくは配列番号４７～５１および５３）の１つまたは複数より１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上のアミノ酸分短くてもよい。別の実施形態において、本明細書において記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、および／またはＶＨ ＣＤＲ３は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載されるＣＤＲ（例えば、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、もしくは配列番号４７～５１および５３）の１つまたは複数より１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上のアミノ酸分長くてもよい。別の実施形態において、本明細書において記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、および／またはＶＨ ＣＤＲ３のアミノ末端は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載されるＣＤＲ（例えば、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、もしくは配列番号４７～５１および５３）の１つまたは複数と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上のアミノ酸、拡大されていてもよい。別の実施形態において、本明細書において記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、および／またはＶＨ ＣＤＲ３のカルボキシ末端は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載されるＣＤＲ（例えば、配列番号１～６）の１つもしくは複数と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のアミノ酸、拡大されていてもよい。別の実施形態において、本明細書において記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、および／またはＶＨ ＣＤＲ３のアミノ末端は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載されるＣＤＲ（例えば、配列番号１～６）の１つもしくは複数と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のアミノ酸、短くされていてもよい。１つの実施形態において、本明細書において記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、および／またはＶＨ ＣＤＲ３のカルボキシ末端は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が、維持される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、例えば、実質的に維持される）限り、本明細書において記載されるＣＤＲ（例えば、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、もしくは配列番号４７～５１および５３）の１つまたは複数と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上のアミノ酸、短くされていてもよい。当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、本明細書において提供される「実施例」セクション（セクション８）において記載される結合アッセイおよび条件を使用して、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への免疫特異的結合が維持されるかどうかが確認され得る。

【0243】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ｉ）重および軽鎖は、それぞれ、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨならびにＶＬドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、または配列番号４７～５１および５３において記載されるアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常軽鎖ドメインをさらに含み；ならびに（ｉｉｉ）重鎖は、ヒトＩｇＧ_１（場合により、ＩｇＧ_１（アロタイプＧｌｍ３））重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常重鎖ドメインをさらに含む。

【0244】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ｉ）重および軽鎖は、それぞれ、配列番号１８および１９、配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２３、配列番号２５および２６、配列番号５４および５５、または配列番号５４および５６において記載されるアミノ酸配列を、それぞれ含むＶＨドメインならびにＶＬドメインを含み；（ｉｉ）軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常ドメインをさらに含み；（ｉｉｉ）重鎖は、ヒトＩｇＧ_１（場合により、ＩｇＧ_１（アロタイプＧｌｍ３））重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常ドメインをさらに含む。

【0245】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ｉ）重および軽鎖は、それぞれ、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨならびにＶＬドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、または配列番号４７～５１および５３において記載されるアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常軽鎖ドメインをさらに含み；ならびに（ｉｉｉ）重鎖は、ヒトＩｇＧ_４重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常重鎖ドメインをさらに含む。

【0246】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ｉ）重および軽鎖は、それぞれ、配列番号１８および１９、配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２３、配列番号２５および２６、配列番号５４および５５、または配列番号５４および５６において記載されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨドメインならびにＶＬドメインを含み；（ｉｉ）軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常ドメインをさらに含み；ならびに（ｉｉｉ）重鎖は、ヒトＩｇＧ_４重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常ドメインをさらに含む。

【0247】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ｉ）重および軽鎖は、それぞれ、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここで、ＶＨならびにＶＬドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～６、配列番号８７、８８、３、９０、５、および９２；配列番号７、１０、３、１４、５、および１６；配列番号８、１１、３、１５、５、および１７；配列番号９、１２、３、１４、５、および１６；配列番号９、１３、３、１４、５、および１６；配列番号４７～５２、または配列番号４７～５１および５３において記載されるアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常軽鎖ドメインをさらに含み；ならびに（ｉｉｉ）重鎖は、ヒトＩｇＧ_２重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常重鎖ドメインをさらに含む。

【0248】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ｉ）重および軽鎖は、それぞれ、配列番号１８および１９、配列番号２０および２１、配列番号２２および２３、配列番号２４および２３、配列番号２５および２６、配列番号５４および５５、または配列番号５４および５６において記載されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨドメインならびにＶＬドメインを含み；（ｉｉ）軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常ドメインをさらに含み；ならびに（ｉｉｉ）重鎖は、ヒトＩｇＧ_２重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列を含む定常ドメインをさらに含む。

【0249】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、重鎖および軽鎖を含み、ここで、（ａ）重鎖は、アミノ酸位置２９７のＮからＡまたはＱへのアミノ酸置換を有する配列番号５９のアミノ酸配列を含み；および（ｂ）軽鎖は、配列番号６７または６９のアミノ酸配列を含む。

【0250】

別のある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、（ａ）アミノ酸位置２６７のＳからＥ、アミノ酸位置３２８のＬからＦ、ならびにアミノ酸位置２６７のＳからＥとアミノ酸位置３２８のＬからＦ両方からなる群から選択されるアミノ酸置換を有する配列番号５９または２９のアミノ酸配列を含む重鎖；ならびに（ｂ）配列番号６７もしくは６９、または配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0251】

特定の実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、ヒトフレームワーク領域であるか、またはヒトフレームワーク領域に由来するフレームワーク領域（例えば、ＶＬドメインおよび／もしくはＶＨドメインのフレームワーク領域）を含む。ヒトフレームワーク領域の非限定的な例は、当該技術分野において記載され、例えば、上記Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照。ある実施形態において、本明細書において記載される抗原結合ドメインは、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域であるか、または霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域に由来するフレームワーク領域（例えば、ＶＬドメインおよび／もしくはＶＨドメインのフレームワーク領域）を含む。

【0252】

たとえば、典型的には、げっ歯類起源（例えば、マウスまたはラット）の、抗原特異的非ヒト抗体由来のＣＤＲは、相同なヒトまたは非ヒト霊長類アクセプターフレームワークに結び付けられる。１つの実施形態において、非ヒト霊長類アクセプターフレームワークは、旧世界類人猿由来である。特定の実施形態において、旧世界類人猿アクセプターフレームワークは、パン・トログロディテス（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）、パン・パニスクス（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ）、またはゴリラ・ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）由来である。ある実施形態において、非ヒト霊長類アクセプターフレームワークは、チンパンジーパン・トログロディテス由来である。ある実施形態において、非ヒト霊長類アクセプターフレームワークは、旧世界サルアクセプターフレームワークである。特定の実施形態において、旧世界サルアクセプターフレームワークは、マカク（Ｍａｃａｃａ）属由来である。ある実施形態において、非ヒト霊長類アクセプターフレームワークは、カニクイザルマカク・シノモルグス（Ｍａｃａｃａ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）に由来する。非ヒト霊長類フレームワーク配列は、米国特許出願公開第２００５／０２０８６２５号において記載される。

【0253】

別の態様において、本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、もしくはｐａｂ１８７６ｗ）と、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０のエピトープ（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０のエピトープ）と同じあるいは重複するエピトープに結合する抗原結合ドメインを含有する抗体が、本明細書において提供される。ある実施形態において、抗体のエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析連結水素／ジュウテリウム交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴ－ペプチドスキャニングアッセイ、および／または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）により決定され得る。Ｘ線結晶解析のため、結晶化は、当該技術分野において公知の方法のいずれかを使用して成し遂げられてもよい（例えば、Ｇｉｅｇｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５０（Ｐｔ ４）：３３９－３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９９０）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８９：１－２３；Ｃｈａｙｅｎ ＮＥ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１２６９－１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ Ａ（１９７６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５１：６３００－６３０３）。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用して研究されてもよく、Ｘ－ＰＬＯＲ（エール大学、１９９２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布；例えば、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８５）ｖｏｌｕｍｅｓ １１４ ＆ １１５，ｅｄｓ Ｗｙｃｋｏｆｆ ＨＷ ｅｔ ａｌ．，；米国出願第２００４／００１４１９４号を参照）、およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９３）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４９（Ｐｔ １）：３７－６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ（１９９７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６Ａ：３６１－４２３，ｅｄ Ｃａｒｔｅｒ ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５６（Ｐｔ １０）：１３１６－１３２３）のようなコンピューターソフトウエアを使用して精密化されてもよい。変異誘発マッピング研究は、当業者に公知の任意の方法を使用して、行われてもよい。アラニンスキャニング変異誘発技術を含む、変異誘発技術の記載について、例えば、上記Ｃｈａｍｐｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）および上記Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＢＣ ＆ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ（１９８９）を参照。特定の実施形態において、抗原結合フラグメントのエピトープは、アラニンスキャニング変異誘発研究を使用して決定される。加えて、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）の同じあるいは重複するエピトープを認識し、結合する抗原結合フラグメントは、例えば、１つの抗体の、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示すこと、すなわち、競合的結合アッセイによる、イムノアッセイのような日常的技術を使用して同定され得る。競合結合アッセイをまた使用して、２つの抗体が、エピトープに対して同様の結合特異性を有するかどうかが決定される。競合結合は、免疫グロブリンが、試験下で、参照抗体の、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０のような共通抗原への特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定され得る。多数の種類の競合結合アッセイ、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ９：２４２－２５３を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ ＴＮ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３６１４－９を参照）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）；Ｉ－１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５（１）：７－１５を参照）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５２）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：７７－８２）が、公知である。典型的には、かかるアッセイは、これらの未標識試験免疫グロブリンと標識参照免疫グロブリンのいずれかを生じる、固体表面または細胞に結合される精製された抗原（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０のようなＧＩＴＲまたはＯＸ４０）の使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合される標識の量を決定することにより、測定され得る。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在する。通常、競合する抗体が過剰に存在するとき、それは、参照抗体の共通の抗原への特異手的結合を、少なくとも５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％またはそれ以上阻害するだろう。競合的結合アッセイは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して、多数の異なるフォーマットで設計され得る。一般的なバージョンのこのアッセイにおいて、抗原は、９６ウェルプレートに固定される。次に、未標識抗体の、標識抗体の抗原への結合をブロックする能力が、放射性または酵素標識を使用して測定される。さらなる詳細について、例えば、Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３０：２３０８－２３１５；Ｗａｇｅｎｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６８：２６９－２７４；Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５０：４８７２－４８７９；Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ ２１：５２３－５３８；Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １１：３９１－４０７および上記Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ ｅｄｉｔｏｒｓ，ｐｐ．３８６－３８９を参照。

【0254】

１つの実施形態において、競合アッセイは、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））を使用して、例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ ＹＮ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３８６：１７２－１８０により記載されるもののような、「２段階のアプローチ」により行われ、これにより、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗原は、チップ表面、例えば、ＣＭ５センサーチップに固定され、抗ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗体は、次に、チップ上を流される。抗体が、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗原結合ドメインと競合するかを決定するために、抗ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗原結合ドメインを含有する抗体を、まずチップ表面上に流して、飽和が達成され、次に、可能性のある競合抗体が加えられる。次に、競合抗体の結合が決定され、非競合対照と比べて定量され得る。

【0255】

特定の態様において、競合結合アッセイを使用して、抗体が、例えば、用量に依存した方法で、別の抗体により競合的にブロックされ、例えば、２つの抗体が、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用する全ての数の異なるフォーマットで設計され得る、競合ＥＬＩＳＡアッセイのような競合結合アッセイにおいて同一または立体的に重複するエピトープを認識するとき、参照抗体と同じエピトープまたは重複するエピトープに本質的に結合する。ある実施形態において、抗体は、本明細書において記載される抗体（例えば、抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、もしくはｐａｂ１８７６ｗ）、またはそのキメラもしくはＦａｂ抗体、あるいは本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１８７６ｗ）のＶＨ ＣＤＲおよびＶＬ ＣＤＲを含む抗体での競合結合アッセイにおいて試験され得る。

【0256】

別の態様において、当業者に公知、または本明細書において記載されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイもしくは表面プラズモン共鳴）を使用して決定される、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）への結合について、本明細書において記載される抗原結合ドメインと（例えば、用量に依存した方法で）競合する抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。別の態様において、当業者に公知、あるいは本明細書において記載されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ、または懸濁アレイもしくは表面プラズモン共鳴）を使用して決定される、本明細書において記載される抗原結合ドメイン（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、またはｐａｂ１８７６ｗ）が、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に結合するのを（例えば、用量に依存した方法で）競合的に阻害する抗原結合ドメインが、本明細書において提供される。特有の態様において、当業者に公知、または本明細書において記載されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ、または懸濁アレイもしくは表面プラズモン共鳴）を使用して決定される、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への特異的結合について、本明細書において記載されるアミノ酸配列（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、もしくはｐａｂ１８７６ｗのＶＬおよび／またはＶＨアミノ酸配列）を含む抗体と（例えば、用量に依存した方法で）競合する抗原結合フラグメントが、本明細書において提供される。

【0257】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗原結合フラグメントが、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への結合について自己競合するのと同じ程度まで、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への結合について、本明細書において記載される抗原結合フラグメントと競合する抗原結合フラグメントが、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への結合について、本明細書において記載される抗原結合抗体フラグメントと競合する第１の抗原結合抗体フラグメントが、本明細書において提供され、ここで、第１の抗原結合抗体フラグメントは、次の工程：（ａ）ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０を遺伝子導入した細胞を、未標識の形態の第１の抗原結合抗体フラグメントと共に容器内でインキュベーションすること；ならびに（ｂ）容器内の標識形態の本明細書において記載される抗原結合抗体フラグメントを加え、容器内で細胞をインキュベーションすること；ならびに（ｃ）標識形態の本明細書において記載される抗原結合抗体フラグメントの細胞への結合を検出することを含むアッセイにおいて、結合について競合する。ある実施形態において、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への結合について、本明細書において記載される抗原結合抗体フラグメントと競合する第１の抗原結合抗体フラグメントが、本明細書において提供され、ここで、競合は、８０％より多く（例えば、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％、または８０％～８５％、８０％～９０％、８５％～９０％、もしくは８５％～９５％）で、第１の抗原結合抗体フラグメントのＧＩＴＲあるいはＯＸ４０への低減した結合として提示される。

【0258】

７．３ 抗体製造
ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよびヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、抗体の合成について当該技術分野において公知の任意の方法により、例えば、化学合成により、または組換え発現技術により製造され得る。本明細書において記載される方法は、別段示されない限り、分子生物学、マイクロ生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当業者内の関連する分野における従来の技術を利用する。これらの技術は、例えば、本明細書において引用される参考文献において記載され、文献において完全に説明される。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７および年次更新）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７および年次更新）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照。

【0259】

特定の実施形態において、本明細書において記載される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、例えば、ＤＮＡ配列の合成、遺伝子操作を介した、創出を含む任意の手段により調製され、発現され、作られ、または単離された多特異性（例えば、二重特異性）抗体（例えば、組換え抗体）である。ある実施形態において、かかる多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、インビボで動物または哺乳類（例えば、ヒト）の抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列（例えば、ＤＮＡ配列もしくはアミノ酸配列）を含む。

【0260】

多特異性二価抗体、およびそれらを作製する方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、ならびに米国出願公開第２００３／０２０７３４号および第２００２／０１５５５３７号において記載され、そのそれぞれが、参照により全体が本明細書に組み込まれる。多特異性四価抗体、およびそれらを作製する方法は、例えば、国際出願公開第０２／０９６９４８号および第００／４４７８８号において記載され、その両方の開示が、参照により全体が本明細書に組み込まれる。一般に、国際出願公開第９３／１７７１５号、第９２／０８８０２号、第９１／００３６０号、および第９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；および第５，６０１，８１９号；ならびにＫｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３（１９９２）（そのそれぞれが、参照により全体が本明細書に組み込まれる）を参照。

【0261】

本明細書において記載される二重特異性抗体は、例えば、国際公開第２０１１／１３１７４６、第２０１１／１４７９８６号、第２００８／１１９３５３号、および第２０１３／０６０８６７号、ならびにＬａｂｒｉｊｎ ＡＦ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＰＮＡＳ １１０（１３）：５１４５－５１５０において記載される、ＤｕｏＢｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ジェンマブ）に従い作り出され得る。ＤｕｏＢｏｄｙテクノロジーを使用して、２つの重および２つの軽鎖を含有する第１の単一特異性抗体の半分が、２つの重および２つの軽鎖を含有する第２の単一特異性抗体の半分と合わせられ得る。得られたヘテロ２量体は、第２の抗体由来の１つの重鎖および１つの軽鎖と対形成された第１の抗体由来の１つの重鎖ならびに１つの軽鎖を含有する。単一特異性抗体の両方が、異なる抗原上の異なるエピトープを認識するとき、得られたヘテロ２量体は二重特異性抗体である。

【0262】

ＤｕｏＢｏｄｙテクノロジーは、単一特異性抗体のそれぞれが、ＣＨ３ドメインにおける単一の点変異を有する重鎖定常領域を含むことを必要とする。点変異により、単一特異性抗体のいずれかにおけるＣＨ３ドメイン間より、得られた二重特異性抗体におけるＣＨ３ドメイン間のより強い相互作用が可能になる。それぞれの単一特異性抗体における単一の点変異は、例えば、国際公開第２０１１／１３１７４６号において記載される通り、重鎖定常領域のＣＨ３ドメインにおける、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、残基３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、または４０９にある。さらに、単一の点変異は、他の単一特異性抗体と比較して、一方の単一特異性抗体における異なる残基に位置する。例えば、一方の単一特異性抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、変異Ｆ４０５Ｌ（すなわち、残基４０５のフェニルアラニンからロイシンへの変異）を含み得、一方、他の単一特異性抗体は、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、変異Ｋ４０９Ｒ（すなわち、残基４０９のリジンからアルギニンへの変異）を含み得る。単一特異性抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、またはＩｇＧ_４アイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧ_１アイソタイプ）であり得、ＤｕｏＢｏｄｙテクノロジーにより製造された二重特異性抗体は、Ｆｃ介在性エフェクター機能を保持し得る。

【0263】

二重特異性抗体を作り出す別の方法は、「ノブ・イン・ホール」ストラテジー（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照）と呼ばれている。Ｉｇ重鎖の誤対合は、ＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸を変異誘発することにより、このテクノロジーにおいて低減される。２つの重鎖が直接相互作用するＣＨ３ドメイン内の位置において、短い側鎖（ホール）を有するアミノ酸が、一方の重鎖の配列に導入され、長い側鎖（ノブ）を有するアミノ酸が、他の重鎖上の残基位置と相互作用する対応物に導入される。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨ３ドメインが、二重特異性抗体を優先的に形成するように、２つのポリペプチド間の界面にて相互作用する、選択されたアミノ酸を変異誘発することにより修飾された免疫グロブリン鎖を有する。二重特異性抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３）または異なるサブクラス（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ３およびＩｇＧ４）の免疫グロブリン鎖からなり得る。

【0264】

１つの実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する二重特異性抗体は、「ノブ鎖」におけるＴ３６６Ｗ変異、および「ホール鎖」におけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異、ならびに場合により、例えば、Ｙ３４９Ｃ変異を「ノブ鎖」に、およびＥ３５６Ｃ変異またはＳ３５４Ｃ変異を「ホール鎖」に導入することによる、ＣＨ３ドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド架橋；「ノブ鎖」におけるＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異、および「ホール鎖」におけるＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異；「ノブ鎖」におけるＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異、および「ホール鎖」におけるＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異；「ノブ鎖」におけるＴ３６６Ｗ変異、および「ホール鎖」におけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異；「ノブ鎖」におけるＲ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ変異、および「ホール鎖」におけるＤ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ変異；鎖の１つにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異、および対応の鎖におけるＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異；１つの鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異、および対応の鎖におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異；ならびに１つの鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ変異、および対応の鎖におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異（ＥＵ番号付けシステムに従い番号付ける）を含む。

【0265】

ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する二重特異性抗体は、ある場合では、ＩｇＧ４とＩｇＧ１、ＩｇＧ４とＩｇＧ２、ＩｇＧ４とＩｇＧ２、ＩｇＧ４とＩｇＧ３、またはＩｇＧ１とＩｇＧ３鎖ヘテロ２量体を含有し得る。かかるヘテロ２量体重鎖抗体は、例えば、ヘテロ２量体重鎖形成を支持するように、ヒトＩｇＧ４およびＩｇＧ１またはＩｇＧ３におけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸を修飾することにより、日常的に操作され得る。

【0266】

ある実施形態において、多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある実施形態において、多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントであり得る。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合により結合された４量体抗体分子の２つの抗原結合アームを含有する。

【0267】

本明細書において記載される多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、当業者に公知の任意の技術により作り出され得る。例えば、本明細書において記載されるＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、ペプシンのような酵素を使用した、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断により製造され得る。

【0268】

特定の態様において、本明細書において記載される細胞または複数の細胞を培養することを含む、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する抗体あるいは抗原結合フラグメントを作製する方法が、本明細書において提供される。特定の態様において、本明細書において記載される細胞または宿主細胞（例えば、本明細書において記載される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは宿主細胞）を使用して、抗体あるいは抗原結合フラグメントを発現させること（例えば、組換え発現させること）を含む、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する抗体あるいは抗原結合フラグメントを作製する方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、細胞は単離された細胞である。ある実施形態において、外来ポリヌクレオチドが、細胞に導入されている。ある実施形態において、方法は、細胞もしくは宿主細胞から得られた抗体または抗原結合フラグメントを精製する工程をさらに含む。

【0269】

抗体の抗原結合フラグメントは、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはその組み合わせの使用を含む当該技術分野において公知の多種多様な技術を使用して、例えば、モノクローナル抗体から調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の、および例えば、Ｈａｒｌｏｗ Ｅ ＆ Ｌａｎｅ Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３ ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）において教示されるものを含むハイブリドーマ技術を使用して製造され得る。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマテクノロジーを通じて製造される抗体に制限されない。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書において記載される抗体を外来性に発現する宿主細胞から組換え的に製造され得る。本明細書において記載されるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５において記載されるハイブリドーマ方法により作製され得るか、または例えば、本明細書において記載される技術などを使用して、ファージライブラリーから単離され得る。クローン細胞株、およびそれにより発現されるモノクローナル抗体の他の製造方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ １１ ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．、上記Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，を参照）。

【0270】

さらに、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、当該技術分野において公知の様々なファージディスプレイ方法を使用して、作り出され得る。ファージディスプレイ方法において、タンパク質は、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、冒された組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによりｓｃＦｖリンカーと一緒に組換えられ、ファージミドベクターにクローニングされる。ベクターは、エシェリキア・コリにエレクトロポレーションされ、エシェリキア・コリは、ヘルパーファージに感染する。これらの方法において使用されるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合される。特定の抗原に結合する抗体またはフラグメントを発現するファージは、例えば、標識抗原、あるいは固体表面もしくはビーズに結合または捕獲された抗原を使用して、抗原で選択されるか、あるいは同定され得る。本明細書において記載される抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ方法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ＲＳ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ ＆ Ｂａｒｂａｓ ＣＦ（１９９４）Ａｄｖａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５７：１９１－２８０；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４号；国際公開第９０／０２８０９号、第９１／１０７３７号、第９２／０１０４７号、第９２／１８６１９号、第９３／１１２３６号、第９５／１５９８２号、第９５／２０４０１号、および第９７／１３８４４号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号において開示されるものを含む。

【0271】

上記参考文献において記載される通り、ファージ選択後、抗体コード領域が、ファージから単離され、それを使用して、ヒト抗体を含む抗体が作り出され、例えば、後述される通り、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２フラグメントのような抗体を組換えで製造するための技術はまた、ＰＣＴ公開第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－９；Ｓａｗａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：２６－３４；およびＢｅｔｔｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３において開示されるもののような、当該技術分野において公知の方法を使用して用いられ得る。

【0272】

１つの態様において、抗体を作り出すために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限酵素部位、および制限酵素部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、鋳型、例えば、ｓｃＦｖクローンからＶＨまたはＶＬ配列が増幅され得る。当業者に公知のクローニング技術を使用して、ＰＣＲにより増幅されたＶＨドメインが、ＶＨ定常領域を発現するベクターにクローニングされ得、ＰＣＲにより増幅されたＶＬドメインが、ＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングされ得る。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされ得る。次に、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを、細胞株に同時遺伝子導入して、当業者に公知の技術を使用して、抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定または一過性細胞株が作り出される。

【0273】

キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合されたマウスまたはラットモノクローナル抗体の可変領域を含有し得る。キメラ抗体を製造する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－７；Ｏｉ ＶＴ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＬ（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ ＳＤ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、第４，８１６，３９７号、および第６，３３１，４１５号を参照。

【0274】

ヒト化抗体は、予め決定された抗原と結合する能力があり、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域、および非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウス免疫グロブリン）のアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む。ある実施形態において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものを含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含み得る。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、ならびにＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４を含む任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフト（欧州特許第２３９４００号；国際公開第９１／０９９６７号；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（欧州特許第５９２１０６号および第５１９５９６号；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ（１９９１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４；ならびにＲｏｇｕｓｋａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３）、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第９３／１７１０５号；Ｔａｎ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：１１１９－２５；Ｃａｌｄａｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０；Ｍｏｒｅａ Ｖ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７－７９；Ｂａｃａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２（１６）：１０６７８－８４；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（１０）：８９５ ９０４；Ｃｏｕｔｏ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ；Ｃｏｕｔｏ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（８）：１７１７－２２；Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ（１９９４）Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０およびＰｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３５（３）：９５９－７３において開示される技術を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において公知の様々な技術を使用して製造され得る。米国出願公開第２００５／００４２６６４Ａ１号（２００５年２月２４日）（参照により全体が本明細書に組み込まれる）も参照。

【0275】

ある実施形態において、ヒト抗体は、本明細書において記載されるその抗ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗原結合フラグメントと、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）の同じエピトープに結合する、本明細書において記載される抗原結合ドメインを含む。ある実施形態において、ヒト抗体は、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）への結合から、本明細書において記載される抗原結合フラグメント（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗ）の任意の１つを（例えば、用量に依存した方法で）競合的にブロックする抗原結合フラグメントを含む。ヒト抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法を使用して、製造され得る。例えば、機能的内在性免疫グロブリンを発現する能力はないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得る遺伝子導入マウスが、使用され得る。特に、ヒト重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、無作為に、またはマウス胚性幹細胞への相同組換えにより、導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入され得る。マウス重および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と非機能的に別々にまたは同時に与えられ得る。特に、Ｊ_Ｈ領域のホモ接合欠失は、内在性抗体産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を拡大し、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスが製造される。次に、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫が生み出される。遺伝子導入マウスは、通常の様式で、選択された抗原、例えば、抗原（例えば、ＯＸ４０）の全てまたは部分で免疫される。抗原に対して指向されたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫された遺伝子導入マウスから得られ得る。遺伝子導入マウスが宿すヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再構成し、クラススイッチおよび体細胞変異を実質的に経験する。従って、かかる技術を使用し、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するこの技術の概説について、Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ ＆ Ｈｕｓｚａｒ Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５－９３を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するこのテクノロジー、ならびにかかる抗体を製造するプロトコールの詳細な考察について、例えば、国際公開第９８／２４８９３号、第９６／３４０９６号および第９６／３３７３５号；ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号および第５，９３９，５９８号を参照。ヒト抗体を産生する能力があるマウスの例は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．；米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ Ｐｈａｒｍ；米国特許第５，５４５，８０６号および第５，５６９、８２５号）、Ｔｒａｎｓ Ｃｈｒｏｍｏ Ｍｏｕｓｅ（商標）（キリン）およびＫＭ Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／キリン）を含む。

【0276】

ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴもしくはＯＸ４０）に特異的に結合するヒト抗体あるいは抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ方法を含む当該技術分野において公知の様々な方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、および第５，８８５，７９３号；ならびに国際公開第９８／４６６４５号、第９８／５０４３３号、第９８／２４８９３号、第９８／１６６５４号、第９６／３４０９６号、第９６／３３７３５号、および第９１／１０７４１号も参照。

【0277】

幾つかの実施形態において、ヒト抗体は、マウスとヒトのハイブリドーマを使用して製造され得る。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒト末梢血リンパ球を、マウスミエローマ細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウスとヒトのハイブリドーマが産生され得、これらのマウスとヒトのハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原（例えば、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０））に免疫特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものが決定され得る。かかる方法は、当該技術分野において公知であり、記載されており、例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４６：１９－２３；Ｎａｇａｎａｗａ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １４：２７－３１を参照。

【0278】

７．３．１ ポリヌクレオチド
特定の態様において、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）抗原に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗体あるいはそのフラグメント（例えば、可変軽鎖領域および／または可変重鎖領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、エシェリキア・コリおよび哺乳類細胞）における組換え発現のためかかるポリヌクレオチドを含むベクターが、本明細書において提供される。本明細書において提供される抗体のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、例えば、哺乳類細胞におけるそれらの効率的発現のための発現ベクターが、本明細書において提供される。

【0279】

本明細書において使用される、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然の供給源に（例えば、マウスまたはヒトに）存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術により製造されるとき、他の細胞材料もしくは培地を実質的に含み得ないか、または化学的に合成されるとき、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含み得ない。例えば、専門用語「実質的に含まない」は、他の材料、例えば、細胞材料、培地、他の核酸分子、化学前駆体および／もしくは他の化学物質の約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（特に、約１０％未満）を有するポリヌクレオチドあるいは核酸分子の調製を含む。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体をコードする核酸分子（複数を含む）が、単離され、または精製される。

【0280】

特定の態様において、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０ポリペプチド（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合し、本明細書において記載されるアミノ酸配列を含む抗体、ならびにＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０ポリペプチドへの結合についてかかる抗体と（例えば、用量に依存した方法で）競合するか、あるいはかかる抗体のものと同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。

【0281】

特定の態様において、本明細書において記載される抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される（例えば、表１、４、および７を参照）抗体のＶＬ ＣＤＲを含む軽鎖または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される抗体（例えば、表１、５、および８を参照）のＶＨ ＣＤＲを含む重鎖または重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。特定の実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号１９、２１、２３、２６、５５、または５６において記載されるアミノ酸配列を含むＶＬドメインをコードする。特定の実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、配列番号１８、２０、２２、２４、２５、および５４において記載されるアミノ酸配列を含むＶＨドメインをコードする。

【0282】

ある実施形態において、例えば、本明細書において記載される（例えば、表１、４、および７を参照）抗体のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含有する、３つのＶＬ鎖ＣＤＲを含む抗ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態において、例えば、本明細書において記載される（例えば、表１、５、および８を参照）抗体のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含有する、３つのＶＨ鎖ＣＤＲを含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。特定の実施形態において、例えば、本明細書において記載される（例えば、表１、４、および７を参照）抗体のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ならびにＶＬ ＣＤＲ３を含有する、３つのＶＨ鎖ＣＤＲ、ならびに例えば、本明細書において記載される（例えば、表１、５、および８を参照）抗体のいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ならびにＶＨ ＣＤＲ３を含有する、３つのＶＨ鎖ＣＤＲを含む抗ＧＩＴＲまたはＯＸ４０抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。

【0283】

ある実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、本明細書において記載されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１９、２１、２３、２６、５５、もしくは５６）を含む軽鎖可変領域を含む本明細書において提供される抗体または抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体または抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する。

【0284】

ある実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、本明細書において記載されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１８、２０、２２、２４、２５、もしくは５４）を含む重鎖可変領域を含む本明細書において提供される抗体または抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体または抗原結合ドメインは、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲもしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する。

【0285】

特有の態様において、軽鎖ならびに重鎖、例えば、別々の軽鎖および重鎖を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。軽鎖に関して、特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。別の特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ラムダ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。なお別の特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖を含む本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体は、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、２６、５５、または５６において記載されるアミノ酸配列を含み得、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。別のある実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合し、軽鎖を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号１９、２１、２３、２６、５５、または５６において記載されるアミノ酸配列を含み得、ここで、軽鎖の定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば、ヒト定常領域配列は、米国特許第５，６９３，７８０号において記載されるものであり得る。

【0286】

ある実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体は重鎖を含み、ここで、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号１８、２０、２２、２４、２５、または５４において記載されるアミノ酸配列を含み得、ここで、重鎖の定常領域は、ヒトガンマ（γ）重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0287】

ある実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗体のＶＨドメインならびに／あるいはＶＬドメイン（例えば、ＶＨドメインについて配列番号１８、２０、２２、２４、２５、もしくは５４、および／またはＶＬドメインについて配列番号１９、２１、２３、２６、５５、もしくは５６）をコードするヌクレオチド配列（複数を含む）を含む。

【0288】

なお別の特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、抗体は、本明細書において記載される任意のアミノ酸配列を含むＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ここで、定常領域は、ヒトＩｇＧ_１（例えば、アロタイプ１、１７、もしくは３）、ヒトＩｇＧ_２、またはヒトＩｇＧ_４の定常領域のアミノ酸配列を含む。

【0289】

特定の実施形態において、本明細書において指定される（例えば、表１～９を参照）抗ＯＸ４０抗体またはそのドメインをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。

【0290】

例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種性シグナル配列での置換、およびｍＲＮＡ不安定性エレメントの除去により最適化される抗ＧＩＴＲならびに／もしくはＯＸ４０抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドがまた、本明細書において提供される。ｍＲＮＡにおいてコドン変更を導入すること、および／もしくは阻害性領域を除外することによる、組換え発現のための抗ＧＩＲならびに／またはＯＸ４０抗体あるいはそのフラグメント（例えば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン）をコードする最適化された核酸を作り出す方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号；第６，１７４，６６６号；第６，２９１，６６４号；第６，４１４，１３２号；および第６，７９４，４９８号において記載される最適化方法を適切に適用することにより実行され得る。例えば、ＲＮＡ内の可能性のあるスプライス部位および不安定性エレメント（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕリッチエレメント）は、組換え発現のためＲＮＡの安定性を増大するために核酸配列によりコードされるアミノ酸を変更することなく、変異誘発され得る。変更は、例えば、同一のアミノ酸についての代替コドンを使用する、遺伝子コードの縮重を利用する。幾つかの実施形態において、保存的変異、例えば、オリジナルのアミノ酸と同様の化学構造および特性、ならびに／もしくは機能を有する同様のアミノ酸をコードする１つまたは複数のコドンを変更させることが所望であり得る。

【0291】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／あるいはＯＸ４０抗体またはそのフラグメント（例えば、ＶＬドメインもしくはＶＨドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／あるいはＯＸ４０抗体またはそのフラグメント（例えば、ＶＬドメインもしくはＶＨドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、相補）ポリヌクレオチドにハイブリダイズし得る。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０抗体またはフラグメントをコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高度に厳密な条件下で、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０抗体またはそのフラグメントをコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０抗体またはそのフラグメントをコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高度に厳密な、中程度に厳密な、もしくはより低度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０抗体あるいはそのフラグメントをコードする最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えば、米国特許出願公開第２００５／００４８５４９（例えば、段落７２～７３）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。

【0292】

ＤＮＡはまた、例えば、マウス配列の代わりに、ヒト重および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合させることにより、修飾され得る。

【0293】

高度に厳密、中程度またはより低度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において記載される抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドがまた、提供される。特定の実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、高度に厳密、中程度またはより低度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において提供されるＶＨドメインをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１８、２０、２２、２４、２５、５４）および／またはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１９、２１、２３、２５、５５、もしくは５６）にハイブリダイズする。

【0294】

ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野において記載されており、当業者に公知である。例えば、厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、フィルター結合したＤＮＡへの、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）における約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける約５０～６５℃での１回または複数回の洗浄を含み得、高度に厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、フィルター結合した核酸への、６×ＳＳＣにおける約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにおける約６８℃での１回または複数回の洗浄を含み得る。他の厳密なハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者に公知であり、記載されており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｐ．６．３．１－６．３．６および２．１０．３を参照。

【0295】

７．３．２ 細胞およびベクター
特定の態様において、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗体を（例えば、組換えで）発現する細胞（例えば、宿主細胞）、ならびに関連するポリヌクレオチドおよび発現ベクターが、本明細書において提供される。宿主細胞における、好ましくは、哺乳類細胞における組換え発現のため、抗ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０抗体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が、本明細書において提供される。本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０抗体（例えば、ヒトもしくはヒト化抗体）を組換え発現させるためかかるベクターを含む宿主細胞もまた、本明細書において提供される。特定の態様において、宿主細胞においてかかる抗体を発現させることを含む、本明細書において記載される抗体を製造する方法が、本明細書において提供される。

【0296】

ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）に特異的に結合する、本明細書において記載される抗体またはそのフラグメント（例えば、本明細書において記載される抗体の重もしくは軽鎖）の組換え発現は、抗体またはフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含む。本明細書において記載される抗体またはそのフラグメント（例えば、重もしくは軽鎖可変ドメイン）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の製造のためのベクターが、当該技術分野において周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術により製造され得る。従って、ヌクレオチド配列をコードする抗体または抗体フラグメント（例えば、軽鎖もしくは重鎖）を含有するポリヌクレオチドを発現させることにより、タンパク質を調製する方法が、本明細書において記載される。当業者に周知である方法を使用して、抗体または抗体フラグメント（例えば、軽鎖もしくは重鎖）コード配列、ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターが構築され得る。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えを含む。本明細書において記載される抗体分子、抗体の重または軽鎖、抗体もしくはそのフラグメントの重または軽鎖可変ドメイン、あるいはプロモーターに作動可能に結合した重または軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターもまた、本明細書において提供される。かかるベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、国際公開第８６／０５８０７号および第８９／０１０３６号；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖と軽鎖全体両方の発現のためかかるベクターにクローニングされ得る。

【0297】

発現ベクターは、従来の技術により細胞（例えば、宿主細胞）に導入され得、次に、得られた細胞を、従来の技術により培養して、本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）またはそのフラグメントが製造され得る。従って、宿主細胞におけるかかる配列の発現のため、プロモーターに作動可能に結合された本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）あるいはそのフラグメント（例えば、その重もしくは軽鎖、またはそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が、本明細書において提供される。ある実施形態において、２本鎖抗体の発現のため、重および軽鎖両方を個々にコードするベクターは、以下に詳述される通り、免疫グロブリン分子全体の発現のため、宿主細胞において同時発現され得る。ある実施形態において、宿主細胞は、本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）、またはそのフラグメントの重鎖および軽鎖両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。特定の実施形態において、宿主細胞は、２つの異なるベクター、本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）、またはそのフラグメントの重鎖あるいは重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）、またはそのフラグメントの軽鎖あるいは軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含有する。他の実施形態において、第１の宿主細胞は、本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）、またはそのフラグメントの重鎖あるいは重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は、本明細書において記載される抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）の軽鎖あるいは軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。特定の実施形態において、第１の細胞により発現される重鎖／重鎖可変領域は、第２の細胞の軽鎖／軽鎖可変領域と関連して、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）を形成する。ある実施形態において、かかる第１の宿主細胞およびかかる第２の宿主細胞を含む宿主細胞の集団が、本明細書において提供される。

【0298】

ある実施形態において、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）の軽鎖／軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクター、および本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗体（例えば、ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、もしくはｐａｂ１９７９ｗのＣＤＲを含む抗体）の重鎖／重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含むベクターの集団が、本明細書において提供される。

【0299】

様々な宿主発現ベクターシステムを利用して、本明細書において記載される抗体分子が発現され得る（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照）。かかる宿主発現系は、対象のコード配列が製造され、続いて精製される得るビークルを表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換されるか、または遺伝子導入されるとき、本明細書において記載される抗体分子をインサイツで発現し得る細胞も表す。これらは、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで遺伝子導入された細菌（例えば、エシェリキア・コリおよびバチルス・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））のような微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで遺伝子導入された酵母（例えば、サッカロマイセス・ピキア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞システム；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、もしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で遺伝子導入された植物細胞システム（例えば、クラミドモナス・ラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）のような緑藻）；または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、およびＢＭＴ１０細胞）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体（例えば、抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９ｗ、ｐａｂ１８７６ｗ、ｐａｂ１９６７ｗ、ｐａｂ１９７５ｗ、またはｐａｂ１９７９ｗの任意の１つのＣＤＲを含む抗体）を発現するための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ ＧＳ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ロンザ）のＣＨＯ細胞である。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体を発現するための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態において、哺乳類発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。ある実施形態において、エシェリキア・コリのような細菌細胞、または真核生物の細胞（例えば、哺乳類細胞）が、組換え抗体分子の発現のため、特に、組換え抗体分子全体の発現のため使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間早期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと関連する、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞は、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ＭＫ ＆ Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ ４５：１０１－１０５；およびＣｏｃｋｅｔｔ ＭＩ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：６６２－６６７）。ある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞により製造される。特定の実施形態において、ＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０（例えば、ヒトＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０）に免疫特異的に結合する、本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、恒常的プロモーター、誘導可能なプロモーターまたは組織特異的プロモーターにより制御される。

【0300】

加えて、挿入された配列の発現を調整するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾するか、もしくは処理する宿主細胞株が、選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングならびに修飾の特徴的かつ特異的な機序を有する。適当な細胞株または宿主システムを選択して、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングが確かにされ得る。この目的で、遺伝子産物の最初の転写物、グリコシル化、およびリン酸化の適切なプロセッシングの細胞機構を有する真核生物宿主細胞が、使用され得る。かかる哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（任意の免疫グロブリン鎖を内在性に産生しないマウスミエローマ細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ－２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ－Ｗ、Ｌ－Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０抗体は、ＣＨＯ細胞のような、哺乳類細胞において製造される。

【0301】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、低減したフコース含量を有するか、またはフコース含量を有しない。かかる抗体は、当業者に公知の技術を使用して、製造され得る。例えば、抗体は、フコシル化する能力を欠損するか、または欠く細胞において発現され得る。特定の例において、α１，６－フコシルトランスフェラーゼの対立遺伝子両方のノックアウトを有する細胞株を使用して、低減したフコース含量を有する抗体が製造され得る。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（ロンザ）は、低減したフコース含量を有する抗体を製造するために使用され得る、かかるシステムの例である。

【0302】

組換えタンパク質の長期間の高収率の製造のため、安定な発現細胞が作り出され得る。例えば、本明細書において記載される抗ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０抗体を安定的に発現する細胞株が、操作され得る。

【0303】

本明細書において記載される抗体分子が、組換え発現により製造されると、それは、免疫グロブリン分子の精製について当該技術分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、具体的には、タンパク質Ａ後の特異的な抗原に対する親和性、およびサイズ分類カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製され得る。さらに、本明細書において記載される抗体を、本明細書において記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野において公知の異種性ポリペプチド配列に融合して、精製が促進され得る。

【0304】

特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、単離されるか、または精製される。一般的に、単離された抗体は、単離された抗体と異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、ある実施形態において、本明細書において記載される抗体の調製物は、細胞材料および／または化学前駆体を実質的に含まない。専門用語「細胞材料を実質的に含まない」は、抗体が、それが単離されるか、または組換え産生される細胞の細胞成分から分離される、抗体の調製を含む。従って、細胞材料を実質的に含まない抗体は、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、もしくは０．１％（乾燥重量）未満の、異種性タンパク質（本明細書において「混入しているタンパク質」としても言及される）、および／または抗体のバリアント、例えば、抗体の異なる翻訳後修飾された形態を有する抗体の調製物を含む。抗体またはフラグメントは、組換え産生されるとき、それはまた、一般的に、培地を実質的に含まない、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満を表す。抗体またはフラグメントは、化学合成により製造されるとき、それは、一般的に、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それは、タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される。従って、抗体またはフラグメントのかかる調製物は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量）未満の、対象の抗体またはフラグメント以外の化学前駆体または成分を有する。特定の実施形態において、本明細書において記載される抗体は、単離されるか、または精製される。

【0305】

７．４ 医薬組成物
生理的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤において所望の程度の純度を有する本明細書において記載される抗体を含む組成物が、本明細書において提供される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、利用される投薬量および濃度にて受取人に無毒である。

【0306】

本明細書において記載されるアゴニスト抗体を含む、本明細書において記載される医薬組成物は、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０活性を増強する、誘導するか、または活性化する際に、ならびに癌または感染性疾患のような、状態を処置する際に有用であり得る。本明細書において記載される方法に従い処置され得る癌の例は、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、基底細胞癌、膀胱癌、芽細胞腫、脳転移、乳癌、バーキットリンパ腫、癌腫（例えば、（例えば、食道胃接合部の）腺癌）、頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌（結腸癌および直腸癌）、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、食道胃接合部の癌、胃腸癌、神経膠芽腫（例えば、多形神経膠芽腫、例えば、新たに診断された、または再発性）、グリオーマ、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、肝転移、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍）、喉頭癌、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病）、肝臓癌（例えば、肝癌および肝細胞腫）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌および小細胞肺癌）、リンパ芽球性リンパ腫、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、転移性脳腫瘍、転移性癌、ミエローマ（例えば、多発性骨髄腫）、ニューロブラストーマ、眼メラノーマ、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性）、転移性、転移性ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性、アンドロゲン非依存性））、腎細胞癌（例えば、転移性）、唾液腺癌、肉腫（例えば、横紋筋肉腫）、皮膚癌（例えば、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ））、軟部組織肉腫、固形腫瘍、扁平上皮癌、滑膜肉腫、精巣癌、甲状腺癌、移行上皮癌（尿路上皮細胞癌）、ぶどう膜黒色腫（例えば、転移性）、疣状癌、外陰癌、ならびにワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含むが、これらに限定されない。

【0307】

本明細書において記載されるアンタゴニスト抗体を含む、本明細書において記載される医薬組成物は、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０活性を低減するか、阻害するか、または不活性化する際、および炎症性または自己免疫疾患もしくは障害あるいは感染性疾患のような状態を処置する際に有用であり得る。

【0308】

本明細書において記載されるアンタゴニスト抗体を含む、本明細書において記載される医薬組成物は、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０活性を低減するか、不活性化するか、または阻害する際、ならびに感染（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染と関連する内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、ぶどう膜炎、自己免疫ぶどう膜炎、多発性硬化症、ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）およびギラン・バレー症候群のような中枢および末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡネフロパシー、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、心筋梗塞ならびにアテローム性動脈硬化症のような虚血性疾患を含む心疾患（すなわち、心血管疾患）、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、低酸症、ならびに視神経脊髄炎からなる群から選択される状態を処置する際に有用であり得る。

【0309】

インビボ投与のため使用されるべき組成物は、無菌であり得る。これは、例えば、無菌濾過膜を通した濾過により容易に成し遂げられる。

【0310】

７．５ 使用および方法
７．５．１ 治療上の使用および方法
１つの態様において、それを必要とする対象に、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはかかる抗体を含む組成物を投与することを含む、対象において１つもしくは複数の免疫機能または応答を調整する方法が、本明細書において提示される。特有の態様において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはかかる抗体を含む組成物を投与することを含む、対象において１つもしくは複数の免疫機能または応答を活性化するか、増強するか、または誘導する方法が、本明細書において提示される。特定の実施形態において、それを必要とする対象に、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、１つもしくは複数の免疫機能または応答を活性化するか、または増強することが望まれる、疾患を予防および／または処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、感染性疾患を処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、癌を処置する方法が、本明細書において提示される。癌は、メラノーマ、腎臓癌、および前立腺癌からなる群から選択され得る。癌は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、結腸癌、および肺癌からなる群から選択され得る。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、メラノーマを処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、腎臓癌を処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、前立腺癌を処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、結腸癌を処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、肺癌を処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を処置する方法が、本明細書において提示される。

【0311】

ある実施形態において、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、基底細胞癌、膀胱癌、芽細胞腫、脳転移、乳癌、バーキットリンパ腫、癌腫（例えば、（例えば、食道胃接合部の）腺癌）、頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌（結腸癌および直腸癌）、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃癌、食道胃接合部の癌、胃腸癌、神経膠芽腫（例えば、多形神経膠芽腫、例えば、新たに診断された、または再発性の）、グリオーマ、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、肝転移、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、腎臓癌（例えば、腎細胞癌およびウィルムス腫瘍）、喉頭癌、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病）、肝臓癌（例えば、肝癌および肝細胞腫）、肺癌（例えば、非小細胞肺癌および小細胞肺癌）、リンパ芽球性リンパ腫、リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、転移性脳腫瘍、転移性癌、ミエローマ（例えば、多発性骨髄腫）、ニューロブラストーマ、眼メラノーマ、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌（例えば、膵管腺癌）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性）、転移性、転移性ホルモン不応性（例えば、去勢抵抗性、アンドロゲン非依存性））、腎細胞癌（例えば、転移性）、唾液腺癌、肉腫（例えば、横紋筋肉腫）、皮膚癌（例えば、メラノーマ（例えば、転移性メラノーマ））、軟部組織肉腫、固形腫瘍、扁平上皮癌、滑膜肉腫、精巣癌、甲状腺癌、移行上皮癌（尿路上皮細胞癌）、ぶどう膜黒色腫（例えば、転移性）、疣状癌、外陰癌、ならびにワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症からなる群から選択される癌を処置する方法が、本明細書において提示される。

【0312】

別の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体を、癌と診断された患者に投与して、患者において、１つもしくは複数の免疫細胞集団（例えば、ＣＤ４^＋かつＣＤ８^＋Ｔ細胞のようなＴ細胞エフェクター細胞）の増殖および／またはエフェクター機能が増大される。

【0313】

特定の実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、当該技術分野において周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、および細胞増殖アッセイを使用して、本明細書において記載されるＧＩＴＲならびに／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体を投与されない対象における免疫機能と比べて、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、もしくは少なくとも１０％、あるいは１０％～２５％、２５％～５０％、５０％～７５％、または７５％～９５％の範囲で、対象において１つもしくは複数の免疫機能または応答を活性化するか、あるいは増強するか、あるいは誘導する。特定の実施形態において、免疫機能は、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、および／またはＩＬ－１３産生）である。別の実施形態において、免疫機能は、Ｔ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８）を発現する細胞の数を検出するために例えば、フローサイトメトリーによりアッセイされ得る、Ｔ細胞増殖／拡大である。別の実施形態において、免疫機能は、例えば、ＥＬＩＳＡによりアッセイされ得る、抗体産生である。幾つかの実施形態において、免疫機能は、例えば、細胞毒性アッセイまたは当該技術分野において周知の他のアッセイによりアッセイされ得る、エフェクター機能である。別の実施形態において、免疫機能は、Ｔｈ１応答である。別の実施形態において、免疫機能は、Ｔｈ２応答である。別の実施形態において、免疫機能は、メモリー応答である。

【0314】

特定の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体により増強されるか、または誘導され得る免疫機能の非限定的な例は、エフェクターリンパ球の増殖／拡大（例えば、エフェクターＴリンパ球の数の増大）、およびエフェクターリンパ球（例えば、エフェクターＴリンパ球）のアポトーシスの阻害である。ある実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体により増強されるか、または誘導される免疫機能は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、アルファ／ベータＴ細胞、およびガンマ／デルタＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば、血漿細胞）、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、腫瘍常在性Ｔ細胞、ＣＤ１２２^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、もしくは多形核白血球の数における増殖／拡大、またはその活性化である。１つの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、リンパ球前駆細胞の増殖／拡大もしくは数を活性化するか、または増強する。幾つかの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、陰性対照（例えば、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体で処理されていないか、培養されていない、または接触されていないそれぞれの細胞の数）と比べ、およそ少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、もしくは少なくとも１０％、または１０％～２５％、２５％～５０％、５０％～７５％、もしくは７５％～９５％で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、アルファ／ベータＴ細胞、およびガンマ／デルタＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば、プラズマ細胞）、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、腫瘍常在性Ｔ細胞、ＣＤ１２２^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、または多形核白血球の数を増大する。

【0315】

幾つかの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ＩＤＯ（インドールアミン－（２，３）－ジオキシゲナーゼ）およびＴＤＯ（トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ）のような、免疫調節性酵素（複数を含む）を標的にする化合物と組み合わせて、対象に投与される。ある実施形態において、かかる化合物は、エパカドスタット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｏｒｐ）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、およびＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）からなる群から選択される。１つの実施形態において、化合物はエパカドスタットである。別の実施形態において、化合物はＦ００１２８７である。別の実施形態において、化合物はインドキシモドである。別の実施形態において、化合物はＮＬＧ９１９である。

【0316】

幾つかの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、ワクチンと組み合わせて対象に投与される。

【0317】

幾つかの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、熱ショックタンパク質ベースの腫瘍ワクチンまたは熱ショックタンパク質ベースの病原体ワクチンと組み合わせて、対象に投与される。特定の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、熱ショックタンパク質ベースの腫瘍ワクチンと組み合わせて、対象に投与される。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、全ての種に渡り一様に見出される高度に保存されたタンパク質のファミリーである。それらの発現は、熱ショック、または毒素への曝露、酸化ストレスもしくはグルコース欠乏を含む他の形態のストレスの結果として、ずっと高いレベルまで強力に誘導され得る。５つのファミリーが、分子量に従い、ＨＳＰ－１１０、－９０、－７０、－６０および－２８に分類されている。ＨＳＰは、Ｔ細胞活性化を導く、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）における交差提示経路を通じて免疫原性ペプチドをもたらす。ＨＳＰは、腫瘍特異的免疫を誘導することができる複合体を形成する、腫瘍関連抗原性ペプチドのシャペロン担体として機能する。瀕死の腫瘍細胞からの放出の際、ＨＳＰ－抗原複合体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により持ち上げられ、ここで、抗原は、抗腫瘍ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を導く、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合するペプチドに処理される。腫瘍調製物に由来するＨＳＰ複合体により引き出された免疫は、それぞれの対象の癌により発現される固有の抗原性ペプチドレパートリーに対して特異的に指向される。

【0318】

熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）は、抗原性ペプチドと非共有結合で複合体を形成した熱ショックタンパク質からなるタンパク質ペプチド複合体である。ＨＳＰＰＣは、自然および適応免疫応答両方を誘発する。特定の実施形態において、抗原性ペプチド（複数を含む）は、処置されている癌に対する抗原性を提示する。ＨＳＰＰＣは、膜受容体（主に、ＣＤ９１）を介してＡＰＣにより、またはＴｏｌｌ様受容体への結合により、効率的にサイズ分類される。ＨＳＰＰＣ内部移行は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単球ならびにＴｈ１およびＴｈ－２介在性免疫応答の活性化を導く、ケモカインならびにサイトカイン産生を伴うＡＰＣの機能的成熟をもたらす。幾つかの実施形態において、本明細書において開示される方法において使用されるＨＳＰＰＣは、抗原性ペプチドと複合体を形成させたストレスタンパク質のｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、もしくはｈｓｐ９０ファミリー由来の１つまたは複数の熱ショックタンパク質を含む。幾つかの実施形態において、ＨＳＰＰＣは、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレティキュリン、またはその２つもしくはそれ以上の組み合わせを含む。

【0319】

特定の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体を、熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）、例えば、熱ショックタンパク質ペプチド複合体９６（ＨＳＰＰＣ－９６）と組み合わせて対象に投与して、癌が処置される。ＨＳＰＰＣ－９６は、抗原性ペプチドと複合体を形成させた、９６ｋＤａ熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）、ｇｐ９６を含む。ＨＳＰＰＣ－９６は、対象の腫瘍から製造された癌免疫療法であり、癌の抗原性「フィンガープリント」を含有する。幾つかの実施形態において、このフィンガープリントは、特定の対象の特異的な癌細胞においてのみ存在する固有の抗原を含有し、ワクチンの注射は、特異的な癌フィンガープリントで任意の細胞を認識し、攻撃するように、対象の免疫系を刺激することが意図される。

【0320】

幾つかの実施形態において、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ－９６は、対象の腫瘍組織から産生される。特定の実施形態において、ＨＳＰＰＣ（例えば、ＨＳＰＰＣ－９６）は、処置される癌またはその転移のタイプの腫瘍から産生される。別の特定の実施形態において、ＨＳＰＰＣ（例えば、ＨＳＰＰＣ－９６）は、処置される対象にとって自己である。幾つかの実施形態において、腫瘍組織は、非壊死性腫瘍組織である。幾つかの実施形態において、非壊死性腫瘍組織少なくとも１グラム（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０グラム）を使用して、ワクチン投薬計画が生み出される。幾つかの実施形態において、外科的切除後、非壊死性腫瘍組織は、ワクチン調製における使用に先立ち凍結される。幾つかの実施形態において、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ－９６は、精製技術により、腫瘍組織から単離され、濾過され、注射可能なワクチン用に調製される。幾つかの実施形態において、対象は、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＣＣ－９６ ６～１２用量を投与される。かかる実施形態において、ＨＳＰＰＣ、例えば、ＨＳＰＰＣ－９６用量は、最初４用量を毎週、次に、２～８追加用量を隔週で投与されてもよい。

【0321】

本明細書において記載される方法に従い使用され得るＨＳＰＰＣのさらなる例は、全目的のため参照により全体が本明細書に組み込まれる、以下の特許ならびに特許出願、米国特許第６，３９１，３０６号、第６，３８３，４９２号、第６，４０３，０９５号、第６，４１０，０２６号、第６，４３６，４０４号、第６，４４７，７８０号、第６，４４７，７８１号および第６，６１０，６５９号において開示される。

【0322】

１つの態様において、本明細書において提示される対象において１つもしくは複数の免疫機能または応答を調整する方法は、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、対象において１つもしくは複数の免疫機能または応答を不活性化するか、低減するか、あるいは阻害する方法である。特定の実施形態において、それを必要とする対象に、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合する多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、１つもしくは複数の免疫機能または応答を不活性化するか、低減するか、あるいは阻害することが望まれる、疾患を予防および／あるいは処置する方法が、本明細書において提示される。

【0323】

ある実施形態において、それを必要とする対象に、有効量の、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体、またはその組成物を投与することを含む、自己免疫または炎症性疾患もしくは障害を処置する方法が、本明細書において提示される。ある実施形態において、疾患または障害は、感染（ウイルス、細菌、真菌および寄生虫）、感染と関連する内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、脈管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、関節炎、髄膜脳炎、ぶどう膜炎、自己免疫ぶどう膜炎、多発性硬化症、ループス（例えば、全身性エリテマトーデス）およびギラン・バレー症候群のような中枢および末梢神経系の免疫介在性炎症性疾患、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡネフロパシー、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、心筋梗塞ならびにアテローム性動脈硬化症のような虚血性疾患を含む心疾患（すなわち、心血管疾患）、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周炎、低酸症、ならびに視神経脊髄炎からなる群から選択される。ある実施形態において、自己免疫または炎症性疾患もしくは障害は、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、脈管炎、喘息、関節リウマチ、皮膚炎、炎症性腸疾患、ぶどう膜炎、ループス、大腸炎、糖尿病、多発性硬化症、または気道炎症である。ある実施形態において、対象はヒトである。

【0324】

別の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体を、自己免疫または炎症性疾患もしくは障害と診断された患者に投与して、患者において、１つもしくは複数の免疫細胞集団（例えば、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のようなＴ細胞エフェクター細胞）の増殖および／またはエフェクター機能が低下される。ある実施形態において、自己免疫または炎症性疾患もしくは障害は、移植片拒絶、移植片対宿主疾患、脈管炎、喘息、関節リウマチ、皮膚炎、炎症性腸疾患、ぶどう膜炎、ループス、大腸炎、糖尿病、多発性硬化症、または気道炎症である。

【0325】

特定の実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、当該技術分野において周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、および細胞増殖アッセイを使用して、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体を投与されない対象における免疫機能と比べて、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、もしくは少なくとも１０％、または１０％～２５％、２５％～５０％、５０％～７５％、もしくは７５％～９５％の範囲で、対象において１つもしくは複数の免疫機能または応答を不活性化するか、あるいは低減するか、あるいは阻害する。特定の実施形態において、免疫機能は、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、および／またはＩＬ－１３産生）である。別の実施形態において、免疫機能は、Ｔ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８）を発現する細胞の数を検出するために、例えば、フローサイトメトリーによりアッセイされ得る、Ｔ細胞増殖／拡大である。別の実施形態において、免疫機能は、例えば、ＥＬＩＳＡによりアッセイされ得る、抗体産生である。幾つかの実施形態において、免疫機能は、エフェクター機能であり、例えば、細胞毒性アッセイまたは当該技術分野において周知の他のアッセイによりアッセイされ得る。別の実施形態において、免疫機能は、Ｔｈ１応答である。別の実施形態において、免疫機能は、Ｔｈ２応答である。別の実施形態において、免疫機能は、メモリー応答である。

【0326】

特定の実施形態において、ＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体により低減されるか、または阻害され得る免疫機能の非限定的な例は、エフェクターリンパ球の増殖／拡大（例えば、エフェクターＴリンパ球の数の低下）、およびエフェクターリンパ球（例えば、エフェクターＴリンパ球）のアポトーシスの刺激である。ある実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体により低減されるか、または阻害される免疫機能は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、アルファ／ベータＴ細胞、およびガンマ／デルタＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば、プラズマ細胞）、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、腫瘍常在性Ｔ細胞、ＣＤ１２２^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、もしくは多形核白血球の数における増殖／拡大、またはその活性化である。１つの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、リンパ球前駆細胞の増殖／拡大もしくは数を不活性化するか、または低減する。幾つかの実施形態において、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体は、陰性対照（例えば、本明細書において記載されるＧＩＴＲおよび／もしくはＯＸ４０に結合するアンタゴニスト多特異性（例えば、二重特異性）抗体で処理されていない、培養されていない、または接触されないそれぞれの細胞の数）と比べ、およそ少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、もしくは少なくとも１０％、または１０％～２５％、２５％～５０％、５０％～７５％、もしくは７５％～９５％で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球、アルファ／ベータＴ細胞、およびガンマ／デルタＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば、プラズマ細胞）、メモリーＴ細胞、メモリーＢ細胞、腫瘍常在性Ｔ細胞、ＣＤ１２２^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、単球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、または多形核白血球の数を低下させる。

【0327】

７．５．１．１ 投与および投薬の経路
本明細書において記載される抗体または組成物は、様々な経路により、対象にデリバリーされ得る。

【0328】

状態の処置および／もしくは予防において有効であるであろう抗体または組成物の量は、疾患の性質に依存するであろうし、標準的な臨床技術により決定され得る。

【0329】

組成物において利用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患の重症度に依存するであろうし、施術者の判断およびそれぞれの対象の状況に従い、決定されるべきである。例えば、有効な用量はまた、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態（年齢、体重および健康状態を含む）、患者がヒトもしくは動物であるかどうか、投与される他の医薬、または処置が予防または治療であるかどうかに依存して変動してもよい。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳類を含む非ヒト哺乳類もまた処置され得る。処置投薬量を、最適にタイトレーションして、安全性および有効性が最適化される。

【0330】

ある実施形態において、インビトロアッセイを利用して、最適な投薬範囲を同定することが助けられる。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験システムに由来する用量応答曲線から推定されてもよい。

【0331】

一般的に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他の種由来の抗体より、ヒト抗体内でより長い半減期を有する。従って、より少ない用量のヒト抗体およびより低い頻度の投与が、頻繁に可能である。

【0332】

７．５．２ 検出および診断上の使用
本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗体（例えば、セクション７．２を参照）を使用して、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）のようなイムノアッセイ、免疫沈降、またはウエスタンブロッティングを含む、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して、生物学的試料においてＯＸ４０タンパク質レベルがアッセイされ得る。安定な抗体アッセイ標識は、当該技術分野において公知であり、グルコース酸化酵素のような酵素標識；ヨウ素（^１２５Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１２１Ｉｎ）、およびテクネシウム（^９９Ｔｃ）のようなラジオアイソトープ；ルミノールのような発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン、およびビオチンのような蛍光標識を含む。かかる標識を使用して、本明細書において記載される抗体が標識され得る。あるいは、本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗体を認識する２次抗体が、標識され、それを、抗ＯＸ４０抗体と組み合わせて使用して、ＯＸ４０タンパク質レベルが検出され得る。

【0333】

ＯＸ４０タンパク質の発現レベルについてアッセイすることは、直接的（例えば、絶対的タンパク質レベルを決定するか、もしくは推定することにより）、または比較的（例えば、第２の生物学的試料における疾患関連タンパク質レベルと比較することにより）のいずれかで、第１の生物学的試料におけるＯＸ４０タンパク質のレベルを定性的もしくは定量的に測定または推定することを含むことが意図される。第１の生物学的試料におけるＯＸ４０ポリペプチド発現レベルが、測定されるか、または推定され、標準的ＯＸ４０タンパク質レベル、障害を有していない個体から得られた第２の生物学的試料から解釈されている、または障害を有していない個体の集団からレベルを平均化することにより決定されている標準と比較され得る。当該技術分野において理解される通り、「標準的な」ＯＸ４０ポリペプチドレベルが公知であると、それは、比較用の標準として繰り返し使用され得る。

【0334】

本明細書において使用される、用語「生物学的試料」は、対象、細胞株、組織、またはＯＸ４０を潜在的に発現する細胞の他の供給源から得られる任意の生物学的試料を指す。動物（例えば、ヒト）から組織生検および体液を得る方法は、当該技術分野において周知である。生物学的試料は、抹消単核血液細胞を含む。

【0335】

本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗体は、技術者に周知および標準的な、ならびに本記載に基づくインビトロならびにインビボ適用を含む、予後適用、診断適用、モニタリングならびにスクリーニング適用のため使用され得る。免疫系の状態および／または免疫応答のインビトロ判断および評価のための、予後アッセイ、診断アッセイ、モニタリングおよびスクリーニングアッセイならびにキットは、免疫不全を有することが分かっているか、もしくは有することが疑われるもの、あるいは予想されるもしくは所望の免疫系応答、抗原応答、またはワクチン応答に関するものを含む患者試料を評価するために予想し、診断し、モニタリングするために利用されてもよい。免疫系状態および／または免疫応答の判断ならびに評価はまた、異なる薬剤もしくは抗体に対抗した、薬物の臨床試験について、または特定の化学療法剤もしくは抗体の投与について（その組み合わせを含む）、患者の適合性を決定する際に有用である。この種の予後および診断のモニタリングならびに判断は、アッセイが、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を使用する抗体療法について患者を評価するためにも使用される、乳癌においてＨＥＲ２タンパク質に対する抗体を利用して、既に実施中である（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）、Ｄａｋｏ）。インビボ適用は、指向された細胞療法、および免疫系調整、および免疫応答の放射線画像化を含む。

【0336】

１つの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、生検試料の免疫組織化学において使用され得る。

【0337】

別の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体を使用して、ＯＸ４０のレベル、または膜表面にＯＸ４０を含有する細胞のレベルが検出され得、次に、そのレベルが、ある種の疾患症状と結び付けられ得る。本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗体は、検出可能または機能的標識を有してもよい。蛍光標識が使用されるとき、当該技術分野において公知の、現在利用可能な顕微鏡および蛍光活性化細胞選別解析（ＦＡＣＳ）または両方の方法手法の組み合わせを利用して、特異的な結合メンバーが同定され、定量されてもよい。本明細書において記載される抗ＯＸ４０抗体は、蛍光標識を有し得る。典型的な蛍光標識は、例えば、反応性および結合したプローブ、例えば、アミノクマリン、フルオレセインおよびテキサスレッド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｃｙ色素、ならびにＤｙＬｉｇｈｔ色素を含む。抗ＯＸ４０抗体は、アイソトープ^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^６７Ｃｕ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１１７Ｌｕ、^１２１Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１９８Ａｕ、^２１１Ａｔ、^２１３Ｂｉ、^２２５Ａｃおよび^１８６Ｒｅのような、放射性標識を有し得る。放射性標識が使用されるとき、当該技術分野において公知の、現在入手可能なカウント手法を利用して、ＯＸ４０（例えば、ヒトＯＸ４０）への抗ＯＸ４０抗体の特異的結合が同定され、定量されてもよい。標識が酵素である場合において、検出は、当該技術分野において公知の、現在利用される比色分析技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流測定技術、または気体定量技術のいずれかにより成し遂げられてもよい。これは、試料または対照試料を抗ＯＸ４０抗体と、抗体とＯＸ４０の間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより、達成され得る。抗体とＯＸ４０の間で形成される任意の複合体は、検出され、試料と対照において比較される。ＯＸ４０について本明細書において記載される抗体の特異的結合に照らして、その抗体を使用して、細胞の表面上でのＯＸ４０発現が特異的に検出され得る。本明細書において記載される抗体をまた使用して、免疫親和性精製を介してＯＸ４０が精製され得る。

【0338】

例えば、ＯＸ４０またはＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ複合体の存在の程度の定量的解析のための試験キットの形態で調製されてもよいアッセイシステムはまた、本明細書において含まれる。システムまたは試験キットは、標識された成分、例えば、標識された抗体、および１つまたは複数のさらなる免疫化学試薬を含んでもよい。例えば、キットの詳細については以下のセクション７．６を参照。

【0339】

７．６ キット
本明細書において記載される１つもしくは複数の抗体、またはその結合物を含むキットが、本明細書において提供される。特定の実施形態において、本明細書において提供される１つもしくは複数の抗体のような、本明細書において記載される医薬組成物の成分の１つまたは複数を充填した１つあるいは複数の容器を含む医薬パックあるいはキットが、本明細書において提供される。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書において記載される医薬組成物、および本明細書において記載されるもののような、任意の予防または治療剤を含有する。ある実施形態において、キットは、例えば、植物性凝集素（ＰＨＡ）および／もしくはホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）のようなＴ細胞マイトジェン、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体のようなＴＣＲ複合体刺激抗体を含有してもよい。ヒト投与のための製造、使用、または販売の機関による承認を示す、医薬もしくは生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態の通知が、場合により、かかる容器（複数を含む）と結び付けられ得る。

【0340】

上記の方法において使用され得るキットもまた、本明細書において提供される。１つの実施形態において、キットは、１つまたは複数の容器において、本明細書において記載される抗体、好ましくは、精製された抗体を含む。特定の実施形態において、本明細書において記載されるキットは、対照として使用され得る、実質的に単離されたＯＸ４０抗原（例えば、ヒトＯＸ４０）を含有する。別の特定の実施形態において、本明細書において記載されるキットは、ＯＸ４０抗原と反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の実施形態において、本明細書において記載されるキットは、ＯＸ４０抗原への抗体の結合を検出するため１つまたは複数のエレメントを含有する（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物のような検出可能な基質に結合され得る抗体、または１次抗体を認識する２次抗体に、検出可能な基質を結合させ得る）。特定の実施形態において、本明細書において提供されるキットは、組換え製造された、または化学的に合成されたＯＸ４０抗原を含み得る。キットにおいて提供されるＯＸ４０抗原はまた、固体支持体に結合され得る。より特定の実施形態において、上記キットの検出手段は、ＯＸ４０抗原が結合される固体支持体を含む。かかるキットはまた、結合していないレポーター標識抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体を含み得る。この実施形態において、抗体のＯＸ４０抗原への結合は、当該レポーター標識抗体の結合により検出され得る。

【0341】

以下の実施例は、制限の目的ではなく、説明の目的で与えられる。

【実施例】

【0342】

８．実施例
このセクション（すなわち、セクション８）における実施例は、説明の目的だが、制限の目的ではなく、提示される。

【0343】

８．１ 実施例１ 腫瘍内制御性Ｔ細胞上のＧＩＴＲおよびＯＸ４０発現の特徴決定
腫瘍内制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）上でのＧＩＴＲならびにＯＸ４０の発現を、フローサイトメトリーを使用して特徴付けた。簡単に言うと、複数の腫瘍種類（卵巣、ステージＩＩＣ；結腸直腸、ステージＩＩＩＢ；子宮内膜、ステージＩＢ；腎臓、ステージＩＩＩ；および非小細胞肺癌、ステージＩＩ）由来の冷凍保存した腫瘍細胞を、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏ，ＬＬＣから得た。治療介入に先立ち、腫瘍細胞を単離した。解凍後、細胞を、ヒトＦｃ受容体ブロック（ＦｃＲ ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標））で１５分間室温にて処理して、非特異的結合を低減した。試料を２回洗浄した。全て２．５μｇ／ｍｌの、ＣＤ４を認識する抗体（ＢＶ６０５、ＯＫＴ４、ロット番号Ｂ１８５７６２）、ＣＤ１２７を認識する抗体（ＡＰＣ、Ａ０１９Ｄ５、ロット番号Ｂ１９３０８４）およびＣＤ２５を認識する抗体（ＰＥＣｙ７、Ｍ－Ａ２５１、ロット番号Ｂ１９０２０７）、Ｚｏｍｂｉｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ＦＩＴＣ、ロット番号Ｂ２０１９００）、ならびに抗ＯＸ４０抗体（ＰＥ、ＢＥＲ－ＡＣＴ３５、ロット番号Ｂ２０３５３８）、抗ＧＩＴＲ抗体（ＰＥ、１１０４１６、ロット番号ＬＡＶ０６１４０６１）、または同族のアイソタイプ対照抗体（ＰＥ、ＭＯＰＣ－２１、ロット番号Ｂ１９７８３２）を含有する抗体カクテルを、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）において希釈し、それぞれの試料に加えた。試料を、３０分間４℃にてインキュベーションした。染色に先立ち、単一染色補償対照（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ４５－ＰＥＣｙ７、ＣＤ４５－ＡＰＣ、およびＣＤ４５－ＢＶ６０５；全てクローンＨ１３０）のため、さらなる試料を別にセットした。次に、試料を、ＦＡＣＳバッファーにおいて３回洗浄し、１Ｘ ｆｉｘ－ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｏｘｐ３ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において４５分間室温にて暗所でインキュベーションした。固定後、細胞を、１Ｘ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｏｘｐ３ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において３回洗浄し、１Ｘ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにおいて希釈した２．５μｇ／ｍｌの抗ＦＯＸＰ３またはラットＩｇＧ２ａ抗体と共に、４５分間４℃にてインキュベーションした。試料を、１Ｘ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにおいて２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用して解析した。ＦＡＣＳプロットを、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡとＷＥＨＩ Ｗｅａｓｅｌソフトウエアの組み合わせを使用して解析した。

【0344】

エフェクターＴ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２５＋／－ＦＯＸＰ３－と定義した。制御性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ１２７－ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋と定義した。図１Ａにおいて示す通り、子宮内膜癌腫瘍組織、腎細胞癌（ＲＣＣ）腫瘍組織、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍組織由来の腫瘍内制御性Ｔ細胞は、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０の上昇した発現を示し、一方、同じ腫瘍組織由来の腫瘍内エフェクターＴ細胞は示さなかった。

【0345】

受容体の定量のため、予め定義した数のＰＥ分子を有するビーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｒ－ＰＥ ＭＥＳＦ；バングスラボラトリーズ社）を、定義した装置設定を使用して解析した。ビーズと既に解析したＧＩＴＲ／ＯＸ４０抗体両方についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、腫瘍内制御性Ｔ細胞およびエフェクターＴ細胞について予想した数のＧＩＴＲおよびＯＸ４０受容体を計算した。

【0346】

卵巣腫瘍組織、結腸直腸癌（ＣＲＣ）腫瘍組織、子宮内膜癌腫瘍組織、ＲＣＣ腫瘍組織、およびＮＳＣＬＣ腫瘍組織由来の制御性Ｔ細胞全てが、同じ腫瘍組織由来のエフェクターＴ細胞より、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０の高い発現を示した（図１Ｂ）。

【0347】

８．２ 実施例２ 抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の特徴決定
この実施例において、ジェンマブのＤｕｏＢｏｄｙテクノロジーを使用して構築した抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体を、それらの結合および機能特徴について調べた。ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９およびＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ１９４９両方が、ＧＩＴＲ結合アーム（ｐａｂ１８７６）およびＯＸ４０結合アーム（ｐａｂ２０４９またはｐａｂ１９４９）を含む。３つのさらなるＤｕｏＢｏｄｙ抗体：ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×アイソタイプ、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ２０４９×アイソタイプ、およびＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１９４９×アイソタイプを対照として使用した。これらのＤｕｏＢｏｄｙ抗体の重鎖および軽鎖配列に対応する配列番号を、表１０において列挙する。加えて、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６、ｐａｂ２０４９、およびｐａｂ１９４９ｗをまた、幾つかの実験において使用した。ｐａｂ１８７６ｗは、配列番号２９の重鎖、および配列番号３７の軽鎖を含むＩｇＧ_１抗体である。ｐａｂ１８７６は、それが、フレームにおける可変領域の定常領域へのクローニングを促進する、Ｋａｂａｔに従い番号付けられた、軽鎖定常ドメインにおけるＴ１０９Ｓ置換（すなわち、野生型軽鎖定常ドメインと比べて、位置１０９のスレオニンのセリンでの置換）を含有することを除き、ｐａｂ１８７６ｗと同じ重および軽鎖配列を含む。この変異は、抗体結合または機能に影響しない保存的修飾である。ｐａｂ２０４９ｗは、配列番号５９の重鎖、および配列番号６７の軽鎖を含むＩｇＧ_１抗体である。ｐａｂ２０４９は、Ｋａｂａｔに従い番号付けられた、軽鎖定常領域におけるＴ１０９Ｓ変異を除きｐａｂ２０４９ｗと同じ重および軽鎖配列を含む。ｐａｂ１９４９ｗは、配列番号５９の重鎖、および配列番号６９の軽鎖を含むＩｇＧ_１抗体である。ｐａｂ１９４９は、Ｋａｂａｔに従い番号付けられた、軽鎖定常領域におけるＴ１０９Ｓ変異を除きｐａｂ１９４９ｗと同じ重および軽鎖配列を含む。

【表10】

【0348】

８．２．１ 抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の選択性
ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に対するＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の選択性を、懸濁アレイテクノロジーを使用して、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のメンバーに対して評価した。組換えヒトＧＩＴＲ－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５０μｇ／ｍｌ）、組換えヒトＯＸ４０－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５０μｇ／ｍｌ）、組換えヒトリンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）－Ｆｃ（アクロバイオシステムズ社、６５μｇ／ｍｌ）、組換えヒト死受容体６（ＤＲ６）－ｂｉｏ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５０μｇ／ｍｌ）、アポトーシス受容体の組換えヒト腫瘍壊死因子様弱インデューサー（ＴＷＥＡＫＲ）－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、５０μｇ／ｍｌ）、組換えヒトＣＤ１３７－Ｆｃ（ＳｒｔＡ－ｂｉｏ、５０μｇ／ｍｌ）、および組換えヒトＢ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦＲ）－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ、５０μｇ／ｍｌ）を含む、ＴＮＦＲスーパーファミリーの多数の組換えタンパク質を、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＯＯＨ結合、１００μｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０）を使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズに結合させた。次に、複数の濃度（８３３３、８３３．３、８３．３、および８．３３ｎｇ／ｍｌ、終）のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９を、抗原結合ビーズと共に、１時間２０℃にて（暗所において６５０ＲＰＭ）インキュベーションした。非特異的結合を取り除くための洗浄（ＰＢＳにおいて２回）後、ビーズを、検出抗体（フィコエリトリンでコートしたヤギ抗ｈｕＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２、２．５μｇ／ｍｌ、終）と共に、１時間２０℃にて（暗所において６５０ＲＰＭ）インキュベーションした。次に、ビーズを２回洗浄し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００（登録商標）上で読み取った。閾値より上（＋）または下（－）の結合を、（ＬＸ２００対照に基づく）カットオフ検出値により決定した。

【0349】

ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、ヒトＧＩＴＲおよびＯＸ４０への特異的結合を示し、他のＴＮＦＲファミリーメンバーへの有意な結合を、試験した濃度で観察しなかった（表１１）。

【表11】

【0350】

８．２．２ ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を発現する細胞への抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の結合
ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現する細胞、ＧＩＴＲのみを発現する細胞、およびＯＸ４０のみを発現する細胞へのＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の結合を、フローサイトメトリーにより調べた。

【0351】

Ｈｕｔ１０２細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫、ＡＴＣＣ）を、７２時間、１μｇ／ｍｌ植物性凝集素（ＰＨＡ）および１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ_２にてインキュベーションして、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０発現を誘導した。ジャーカット細胞へのレンチウイルスベクター（ＥＦ１ａプロモーター）の伝達により、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０を異所性に発現する細胞を作り出した。シングルセルソーティング（ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ Ｆｕｓｉｏｎ）を介して、安定なクローンを作り出した。フローサイトメトリーにより、発現を検証した。結合解析のため、安定なジャーカット細胞または活性化Ｈｕｔ１０２細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）において希釈した試験抗体（１２箇所の用量タイトレーション、０．０１～１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、３０分間４℃にてインキュベーションした。試料をＦＡＣＳバッファーにおいて２回洗浄し、次に、ＡＰＣ結合マウス抗ヒトカッパ検出抗体（ライフテクノロジーズ、ＨＰ６０６２）と共に、３０分間４℃にてインキュベーションした。次に、試料を２回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用して解析した。ＦＡＣＳプロットを、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡとＷＥＨＩ Ｗｅａｓｅｌソフトウエアの組み合わせを使用して解析した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアで、データをプロットした。

【0352】

図２Ａにおいて示す通り、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６およびｐａｂ２０４９と比較して、ＧＩＴＲならびにＯＸ４０を同時発現する細胞への増強した結合を示した。いずれかのアームの、２つの対照ＤｕｏＢｏｄｙ抗体、ｐａｂ１８７６×アイソタイプ、およびｐａｂ２０４９×アイソタイプにおけるアイソタイプアームでの置換が、活性化Ｈｕｔ１０２細胞への低減した結合を導いたので、アーム両方が、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現する細胞への増強した結合に関与する。予想した通り、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０のみを発現するが、両方を発現しない細胞に対して、試験した最高濃度を除き全てで、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６およびｐａｂ２０４９より弱く結合した（図２Ｂおよび２Ｃ）。

【0353】

８．２．３ ＦｃγＲＩＩＩＡレポーター細胞株に対する抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の効果
次に、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０に関与し、ＦｃγＲＩＩＩＡを介してシグナル伝達するＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の能力を、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現するレポーター細胞株（プロメガ）を、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現する標的細胞と一緒に使用して、評価した。ＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖ１５８バリアント、およびホタルルシフェラーゼの発現をもたらすＮＦＡＴ応答エレメントを安定的に発現する、操作したジャーカット細胞を、エフェクター細胞として使用した。抗原が標的細胞の表面に位置する、抗体／抗原複合体のＦｃγＲＩＩＩＡへの結合は、エフェクター細胞のプロモーター／レポーターにシグナル伝達し、ルシフェラーゼ遺伝子転写をもたらす。

【0354】

天然の制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）を活性化して、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現する細胞を作り出した。Ｆｉｃｏｌｌ ｇｒａｄｉｅｎｔ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ）を介して健常ドナーバフィーコートからＰＢＭＣを単離し、磁気ベースのｎＴｒｅｇ濃縮（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９３－６３１、ロット５１５０６２９０３９）の対象にした。次に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ’ｓ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（１３０－０９５－３４５、ロット５１５０４２０１９６）を使用して、８日間、１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ_２にて、細胞を活性化した。Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔを含有する新鮮培地を、単離したｎＴｒｅｇに３～４日毎に加えた。８日目に、フローサイトメトリーにより、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０の細胞発現を確認した。簡単に言うと、２０，０００個の細胞を、ヒトＦｃ受容体ブロックで１５分間室温にて処理して、非特異的結合（ＦｃＲ ｂｌｏｃｋ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を低減した。試料を２回洗浄し、全て２．５μｇ／ｍｌの、ＣＤ４を認識する抗体（ＢＶ６０５、ＯＫＴ４、ロットＢ１８５７６２）、ＣＤ１２７を認識する抗体（ＡＰＣ、Ａ０１９Ｄ５、ロットＢ１９３０８４）、およびＣＤ２５を認識する抗体（ＰＥＣｙ７、Ｍ－Ａ２５１、ロットＢ１９５１６８）、ならびにＺｏｍｂｉｅ Ｇｒｅｅｎ（商標）ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ（ＦＩＴＣ、ロットＢ２０１９００）、ならびに抗ＯＸ４０抗体（ＰＥ、ＢＥＲ－ＡＣＴ３５、ロット番号Ｂ２０３５３８）、抗ＧＩＴＲ抗体（ＰＥ、１１０４１６、ロット番号ＬＡＶ０６１４０６１）、または同族のアイソタイプ対照抗体（ＰＥ、ＭＯＰＣ－２１、ロット番号Ｂ１９７８３２）を含有する抗体カクテルを、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）において希釈し、それぞれの試料に加え、３０分間４℃にてインキュベーションした。染色に先立ち、単一染色補償対照（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ４５－ＰＥＣｙ７、ＣＤ４５－ＡＰＣ、およびＣＤ４５－ＢＶ６０５；全てクローンＨ１３０）のため、さらなる試料を別にセットした。次に、試料を、ＦＡＣＳバッファーにおいて３回洗浄し、１Ｘ ｆｉｘ－ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｏｘｐ３ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ロットＥ０００２９－１６９１）において４５分間室温にて暗所でインキュベーションした。固定後、細胞を、１Ｘ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｏｘｐ３ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）において３回洗浄し、１Ｘ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにおいて希釈した２．５μｇ／ｍｌの抗ＦＯＸＰ３（ｅＦｌｕｏｒ４５０、ＰＣＨ１０１、ロットＥ１１０５６－１６３５）またはラットＩｇＧ２ａ（ｅＦｌｕｏｒ４５０、ｅＢＲ２ａ、ロットＥ０８５１９－１６３３）抗体と共に、４５分間４℃にてインキュベーションした。試料を、１Ｘ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにおいて２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用して解析した。

【0355】

図３Ａにおいて示す通り、活性化したｎＴｒｅｇは、細胞表面上でＧＩＴＲとＯＸ４０両方を発現した。

【0356】

ＦｃγＲＩＩＩＡレポーター細胞に対する影響を評価するために、８日間活性化した１２５，０００個のｎＴｒｅｇを、増加する濃度（６箇所の用量タイトレーション、０．０４～１０μｇ／ｍｌ）のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６、二価単一特異性抗体ｐａｂ２０４９、またはアイソタイプ対照抗体と共にインキュベーションした。ＦｃγＲＩＩＩＡ^Ｖ１５８発現ＮＦＡＴレポーター細胞を、４％熱失活低ＩｇＧ ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中１：１の比の抗体とｎＴｒｅｇの混合物（１２５，０００個の細胞）に、３７℃および５％ＣＯ_２にて加えた。２０時間のインキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ、Ｇ７２０Ａ）を、それぞれの試料に加えた（１：１ｖ／ｖ）。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー）を使用して、発光を測定した。ＦＡＣＳ ＤＩＶＡとＷＥＨＩ Ｗｅａｓｅｌソフトウエアの組み合わせを使用して、ＦＡＣＳプロットを解析した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアで、データをプロットした。

【0357】

ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９が、二価単一特異性抗体ｐａｂ１８７６およびｐａｂ２０４９と比較して、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現する細胞への増強した結合を示した（図２Ａ）という知見と一致して、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現するｎＴｒｅｇに結合したとき、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、ｐａｂ１８７６およびｐａｂ２０４９が示したものより、ＦｃγＲＩＩＩＡのより強い活性化を示した（図３Ｂ）。

【0358】

さらに、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０に関与し、ＦｃγＲＩＩＩＡを介してシグナル伝達するＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の能力を、上記ＦｃγＲＩＩＩＡ発現レポーター細胞株をＧＩＴＲまたはＯＸ４０を発現するが、両方を発現しない標的細胞と一緒に使用して、評価した。簡単に言うと、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０を発現するジャーカット標的細胞をカウントし、４％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０中の濃度６×１０^６細胞／ｍｌにて再懸濁した。複数の９６ウェル白色アッセイプレートの内側の６０ウェルのそれぞれのウェルに、細胞懸濁液２５μｌを加えた。試験抗体を、１０μｇ／ｍｌの開始終濃度と共に３倍希釈で連続希釈した。２重のウェルにおいて、それぞれの抗体希釈液２５μｌを標的細胞に加えた。最後に、ＦｃγＲＩＩＩＡ^Ｖ１５８を発現するＮＦＡＴレポーター細胞を、４％低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０中６×１０^６細胞／ｍｌの濃度にて再懸濁した。これらのレポーター細胞２５μｌを、それぞれのウェルに加え、これは、１：１の標的に対するエフェクター比をもたらした。プレートを、２０時間３７℃および５％ＣＯ_２にてインキュベーションした。このインキュベーション後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ）を室温にて解凍し、７５μｌを、９６ウェル白色アッセイプレートのそれぞれのウェルに加えた。５～１０分以内に、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー）を使用して、発光を測定した。それぞれの試料の測定値からバックグラウンドの発光（ウェルの外側のブランク）を引き、調節した相対的光単位（ＲＬＵ）を記録した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアで、データをプロットした。試験した抗体は、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、二価抗ＧＩＴＲ抗体ｐａｂ１８７６（Ｆ４０５Ｌ／Ｆ４０５Ｌ）、二価抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ２０４９（Ｋ４０９Ｒ／Ｋ４０９Ｒ）、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×アイソタイプ、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ２０４９×アイソタイプ、およびアイソタイプ対照抗体であった。抗体ｐａｂ１８７６（Ｆ４０５Ｌ／Ｆ４０５Ｌ）は、重鎖定常領域両方において、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｆ４０５Ｌ置換を含み、抗体ｐａｂ２０４９（Ｋ４０９Ｒ／Ｋ４０９Ｒ）は、重鎖定常領域両方において、ＥＵ番号制に従い番号付けられた、Ｋ４０９Ｒ置換を含む。

【0359】

ＧＩＴＲまたはＯＸ４０のみを発現するが、両方を発現しない細胞について、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９が、ｐａｂ１８７６ならびにｐａｂ２０４９がしたものより弱く結合した（図２Ｂおよび２Ｃ）という知見と一致して、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０を発現するが、両方を発現しないジャーカット細胞に結合したとき、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、ｐａｂ１８７６（Ｆ４０５Ｌ／Ｆ４０５Ｌ）ならびにｐａｂ２０４９（Ｋ４０９Ｒ／Ｋ４０９Ｒ）が試験した最高濃度を除き全ての濃度にて示したものより、ＦｃγＲＩＩＩＡの弱い活性化を示した（図３Ｃおよび３Ｄ）。

【0360】

８．２．４ ＮＫ細胞介在性ＡＤＣＣ活性に対する抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の効果
この実施例において、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を同時発現する細胞に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞介在性抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を誘導するＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の能力を調べた。

【0361】

健常ドナーバフィーコート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ）からフィコール密度勾配を介して単離したヒトＰＢＭＣを、磁気ビーズ単離（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９４－７７５）を使用して、エフェクターＴ細胞または天然のＴｒｅｇについて濃縮した。濃縮したエフェクターＴ細胞またはＴｒｅｇを、ＣＤ３－ＣＤ２８マイクロビーズ（１：１のビーズ：細胞、インビトロジェン、１１１３２Ｄ）および組換えヒトＩＬ－２（エフェクターＴ細胞について２０Ｕ／ｍｌ；Ｔｒｅｇについて１００Ｕ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０２）で、７日間、１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において３７℃および５％ＣＯ_２にて活性化した。刺激後、フローサイトメトリーを介してＧＩＴＲおよびＯＸ４０発現について、細胞を評価した。非特異的結合を低減するために、細胞を、ＦｃγＲブロッキング抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２）と共に１５分間周囲温度にてインキュベーションした。次に、試料を２回洗浄し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ２５の系統抗体パネル、ならびに固定可能な生／死マーカーと共に３０分間４℃にてインキュベーションした。Ｔｒｅｇ描写のため、次に、試料を２回洗浄し、固定し、透過処理し、抗ＦＯＸＰ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローン番号ＰＣＨ１０１）と共に３０分間４℃にてインキュベーションした。次に、試料を、２回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用して解析した。フローサイトメトリープロットを、ＦＡＣＳ ＤＩＶＡとＷＥＨＩ Ｗｅａｓｅｌソフトウエアの組み合わせを使用して解析した。ＡＤＣＣ活性を評価するために、磁気ビーズ分離（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９２－６５７）を介して健常ドナーＰＢＭＣから、初代ＮＫ細胞を単離した。ＮＫ細胞を、一晩、２０Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０２）で休ませた。ＮＫ細胞を、標的細胞（エフェクターＴ細胞またはＴｒｅｇ）と共に同時培養し、抗体（タイトレーション範囲：０．０００４～１．９μｇ／ｍｌ）と共に４時間、０．５％熱失活ＦＢＳを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０中１０：１のＥ：Ｔ比にてインキュベーションした。５つの処理群：アイソタイプ対照、ｐａｂ１８７６単独、ｐａｂ２０４９単独、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９、およびｐａｂ１８７６とｐａｂ２０４９の組み合わせが存在した。最後の群において、ｐａｂ１８７６およびｐａｂ２０４９を、等モル濃度にて加えて、他の群のものと同じ終濃度を達成した。計２×１０^５標的細胞（エフェクターＴ細胞またはＴｒｅｇ）、および２×１０^６ＮＫ細胞を、それぞれのウェルにおいて総体積１００μｌで加えた。インキュベーション後、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出により評価される、細胞溶解を、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性アッセイ（プロメガ、Ｇ１７８０）を使用して、製造元の指示に従い測定した。以下の式：％細胞毒性＝（実験の、自発エフェクター－自発標的）／（標的最大値－自発標的）×１００ を使用して、細胞毒性（％細胞溶解）を決定した。

【0362】

図３Ｅにおいて示す通り、活性化Ｔｒｅｇは、活性化エフェクターＴ細胞より高いレベルのＧＩＴＲおよびＯＸ４０を発現した。この差次的発現パターンと一致し、ＧＩＴＲおよび／またはＯＸ４０に対する抗体は、バックグラウンドレベルより上の活性化エフェクターＴ細胞の有意な溶解を誘導せず（図３Ｆ）、一方、同じ抗体は、用量に依存した方法で、活性化Ｔｒｅｇに対して強いＮＫ細胞介在性ＡＤＣＣ活性を誘導した（図３Ｇ）。特に、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、ｐａｂ１８７６単独、ｐａｂ２０４９単独、またはｐａｂ１８７６とｐａｂ２０４９の組み合わせより、高いレベルの、活性化Ｔｒｅｇの溶解を誘導した。

【0363】

８．２．５ スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後のヒトＴ細胞に対する抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の効果
初代ヒトＴ細胞に対するＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の機能活性を、スタフィロコッカスエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）刺激後に評価した。簡単に言うと、健常ドナーバフィーコート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ）からフィコール密度勾配を介して単離したＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡスーパー抗原（シグマ・アルドリッチ）および１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において、増加する濃度の試験抗体（７箇所の用量タイトレーション、０．０２～２０μｇ／ｍｌ）と一緒に、５日間３７℃および５％ＣＯ_２にてインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を含まない上清を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡイムノアッセイ（パーキンエルマー）を使用して、ＩＬ－２産生につていアッセイした。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー）を使用して、データを集め、ＩＬ－２標準曲線を使用して、ＩＬ－２の濃度を決定した。値を補間し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用してプロットした。

【0364】

ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、２人のドナー由来の細胞を使用したこの初代ヒトＰＢＭＣアッセイにおいてＩＬ－２産生を誘導した（図４Ａおよび４Ｂ）。重要なことに、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、高いレベルのＩＬ－２産生を、医薬的に関連する抗体濃度にて誘導することができた。ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９が誘導したＩＬ－２産生は、広範囲の抗体濃度（例えば、図４Ａにおいて０．０８～２０μｇ／ｍｌ、および図４Ｂにおいて０．００９～２０μｇ／ｍｌ）に渡る抗体濃度の実質的な増加関数である。

【0365】

８．３ 実施例３ アンタゴニスト抗体としての抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体
ＧＩＴＲおよびＯＸ４０シグナル伝達の活性化は、尖端のアダプタータンパク質を効率的に補充して、細胞内シグナル伝達をもたらす高次受容体複合体を形成するための受容体クラスター形成に依存する。理論が結び付けることなく、セクション８．２．４において示したＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９のアゴニスト活性の１つの可能性のある機序は、アクセサリー骨髄またはリンパ球系細胞、例えば、樹状細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および／もしくはＢ細胞上でのＦｃ－Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）同時関与を介して、ＧＩＴＲならびに／あるいはＯＸ４０受容体をクラスター形成させることによる。ＦｃＲを発現する幾つかの腫瘍細胞、例えば、血液系癌（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、形質細胞癌および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））、ならびにある種の固形（上皮性）腫瘍細胞（例えば、メラノーマ）はまた、抗体クラスター形成を仲介し得る。結果として、抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性アンタゴニスト抗体を発生させる１つのアプローチは、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）およびＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）とそれらのそれぞれの受容体への結合について競合する二重特異性抗体、ならびにＦｃ受容体への二重特異性抗体のＦｃ領域の結合を減少させるか、または除去することである。この実施例において、２つのレポーターアッセイを開発して、第１に、ＦｃＲ相互作用の不存在下でＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９のアゴニスト活性の喪失を確認し、第２に、ＧＩＴＲおよびＯＸ４０受容体を通じたＧＩＴＲＬならびにＯＸ４０Ｌ誘導性シグナル伝達を弱めるＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の能力を調べた。

【0366】

８．３．１ ＧＩＴＲ ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーター細胞に対する抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の効果
第１に、ＧＩＴＲレポーターアッセイを使用して、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９を、そのアゴニスト活性について評価した。ＧＩＴＲ分子のＦｃＲ介在性クラスター形成の可能性を減少させる、少量の、もしあれば、ＦｃＲを発現したジャーカット細胞を使用する、このレポーターアッセイを構築した。

【0367】

レンチウイルスベクター（ＥＦ１ａプロモーター）のジャーカット細胞への伝達により、ＧＩＴＲならびにＮＦ－κＢルシフェラーゼ（Ｎａｎｏ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））レポーターを異所性に発現する細胞を作り出した。シングルセルソーティング（ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ Ｆｕｓｉｏｎ）を介して、安定なクローンを作り出した。フローサイトメトリーにより、ＧＩＴＲの発現を検証した。アゴニスト活性を評価するために、ジャーカットｈｕＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢルシフェラーゼ細胞を、増加する濃度のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９または３量体ＧＩＴＲＬ（１２箇所の用量タイトレーション、０．０５～１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、２時間、１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ_２にてインキュベーションした。ルシフェラーゼ活性の検出のため、試料を、調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ、１：１ｖ／ｖ）と共に、受動的溶解バッファーにおいて、５分間室温にてインキュベーションした。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー）を使用して、データを集めた。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、値をプロットした。

【0368】

ＲＬＵ（相対的ルシフェラーゼ単位）により表される、高レベルのＮＦ－κＢルシフェラーゼ活性を誘導した、３量体ＧＩＴＲＬと対照的に、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９は、試験した最高濃度においてでさえ、ＧＩＴＲレポーター細胞の最小のアゴニスト活性を示した（図５Ａ）。

【0369】

次に、ＧＩＴＲＬ誘導性ＮＦ－κＢシグナル伝達を中和するＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９の能力を、ＤｕｏＢｏｄｙのリガンドブロッキング活性の代替読み取りとして調べた。

【0370】

簡単に言うと、ジャーカットｈｕＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢルシフェラーゼ細胞を、増加する濃度のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９またはアイソタイプ対照抗体（１０箇所の用量タイトレーション、０．５～１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、３０分間インキュベーションした。次に、試料を、２回ＲＰＭＩで洗浄し、１μｇ／ｍｌ３量体ＧＩＴＲＬに再懸濁し、さらに２時間、３７℃にてインキュベーションした。ルシフェラーゼ活性を検出し、上記の通り解析した。％ＧＩＴＲＬ活性を決定するために、抗体を加えていないＧＩＴＲＬ（１μｇ／ｍｌ）のＲＬＵ値を、１００％活性と規定した。ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９およびアイソタイプ対照の相対値を、適切に計算した。

【0371】

図５Ｂにおいて示す通り、増加する濃度のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９とのジャーカットｈｕＧＩＴＲ－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞の事前インキュベーションは、用量に依存した方法で、ＧＩＴＲＬ誘導性ＮＦ－κＢルシフェラーゼ活性を有意に低減した。

【0372】

８．３．２ ＯＸ４０ ＮＦ－κＢ－ルシフェラーゼレポーター細胞に対する抗ＧＩＴＲ／ＯＸ４０二重特異性抗体の効果
同様に、ＯＸ４０発現細胞上でのＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９のアゴニスト活性を試験するＯＸ４０レポーターアッセイを開発した。ＦｃＲ発現が最小である、ジャーカット細胞を使用する、このＯＸ４０レポーターアッセイをまた構築した。

【0373】

レンチウイルスベクター（ＥＦ１ａプロモーター）のジャーカット細胞への伝達により、ＯＸ４０ならびにＮＦ－κＢルシフェラーゼ（Ｎａｎｏ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標））レポーターを異所性に発現する細胞を作り出した。シングルセルソーティング（ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ Ｆｕｓｉｏｎ）を介して、安定なクローンを作り出した。フローサイトメトリーにより、ＯＸ４０の発現を検証した。アゴニスト活性を評価するために、ジャーカットｈｕＯＸ４０－ＮＦ－κＢルシフェラーゼ細胞を、増加する濃度の多量体ＯＸ４０Ｌ、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９またはアイソタイプ対照抗体（１０箇所の用量タイトレーション、０．５～１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、２時間、１０％熱失活ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地において、３７℃および５％ＣＯ_２にてインキュベーションした。ルシフェラーゼ活性の検出のため、試料を、調製したＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ、１：１ｖ／ｖ）と共に、受動的溶解バッファーにおいて、５分間室温にてインキュベーションした。ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（パーキンエルマー）を使用して、データを集めた。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して、値をプロットした。

【0374】

多量体ＯＸ４０Ｌは、広範囲の濃度に渡りＮＦ－κＢルシフェラーゼ活性を誘導した一方、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９とのインキュベーション後に、最小のルシフェラーゼシグナルを観察した（図６Ａ）。

【0375】

次に、ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９を、ＯＸ４０Ｌ誘導性ＮＦ－κＢシグナル伝達をブロックするその能力について評価した。ジャーカットｈｕＯＸ４０－ＮＦ－κＢルシフェラーゼ細胞を、増加する濃度のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９またはアイソタイプ対照抗体（１０箇所の用量タイトレーション、０．５～１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に、３０分間インキュベーションした。次に、試料を、２回ＲＰＭＩで洗浄し、１μｇ／ｍｌ多量体ＯＸ４０Ｌに再懸濁し、さらに２時間、３７℃にてインキュベーションした。ルシフェラーゼ活性を検出し、上記の通り解析した。％ＯＸ４０Ｌ活性を決定するために、抗体を加えていないＯＸ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）のＲＬＵ値を、１００％活性と規定した。ＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９およびアイソタイプ対照の相対値を、適切に計算した。

【0376】

図６Ｂにおいて示す通り、増加する濃度のＤｕｏＢｏｄｙ ｐａｂ１８７６×ｐａｂ２０４９とのジャーカットｈｕＯＸ４０－ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター細胞の事前インキュベーションは、用量に依存した方法で、ＯＸ４０Ｌ誘導性ＮＦ－κＢルシフェラーゼ活性を有意に低減した。

【0377】

８．４ 実施例４ 抗ＧＩＴＲ抗体のエピトープマッピング
この実施例は、抗ＧＩＴＲ抗体：キメラ親２３１－３２－１５抗体ならびにそのヒト化バージョン（ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１８７５、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、およびｐａｂ１９７９）の結合エピトープを特徴付ける。加えて、ｍ６Ｃ８と名前を付けた参照抗ＧＩＴＲ抗体をまた、比較のため幾つかの研究において使用した。ＰＣＴ出願公開第２００６／１０５０２１号（参照により本明細書に組み込まれる）において提供される抗体６Ｃ８の可変領域に基づき、抗体ｍ６Ｃ８を作り出した。これらの抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に対応する配列番号を、表１２において列挙する。

【表12】

【0378】

８．４．１ エピトープ競合細胞結合アッセイ
ヒト化バリアント抗体が、キメラ２３１－３２－１５親抗体のエピトープ特異性を保持したこを確認するために、細胞結合アッセイを行った。キメラ親２３１－３２－１５抗体を発現する１６２４－５前Ｂ細胞を回収し、１ｘ１０^６個の細胞を、ＦＡＣＳバッファー２００μｌ、およびｉ）１５分間、キメラ親２３１－３２－１５抗体２μｇと共に事前インキュベーションしたビオチン化ＧＩＴＲ（ＧＩＴＲ－ｂｉｏ）（１：１０００）；ｉｉ）１５分間、ｐａｂ１８７５ ２μｇと共に事前インキュベーションしたＧＩＴＲ－ｂｉｏ（１：１０００）；ｉｉｉ）１５分間、ｐａｂ１８７６ ２μｇと共に事前インキュベーションしたＧＩＴＲ－ｂｉｏ（１：１０００）；またはｉｖ）ＧＩＴＲ－ｂｉｏ（１：１０００）に再懸濁した。細胞を、２０分間４^ｏＣにてインキュベーションし、次に、ＦＡＣＳバッファー４ｍｌで洗浄し、５分間３００ｇで４^ｏＣにて遠心分離した。細胞ペレットを、ＦＡＣＳバッファー２００μｌおよびストレプトアビジン－ＰＥ（１：１０００）に再懸濁し、次に、上と同様に、インキュベーションし、洗浄した。次に、ＦＡＣＳ－ＡｒｉａＩＩ（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用した解析のため、細胞をＦＡＣＳバッファー２００μｌに再懸濁した。

【0379】

図７は、ヒト化バリアント抗体が、キメラ親２３１－３２－１５抗体のエピトープ特異性を保持したことを示す。右側の特性は、キメラ親２３１－３２－２５抗体を発現する１６２４－５前Ｂ細胞へのＧＩＴＲ－ｂｉｏの結合を示す。しかしながら、ＧＩＴＲ－ｂｉｏを、キメラ親２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７５またはｐａｂ１８７６抗体のいずれかと共に事前インキュベーションしたとき、１６２４－５細胞へのＧＩＴＲ－ｂｉｏの結合の喪失が存在した（左側の特性）。重複するＦＡＣＳ特性は、ヒト化バリアントがまた、互いに、またはキメラ親２３１－３２－１５抗体への非常に類似するＧＩＴＲ結合特性を示すことを示している。

【0380】

８．４．２ エピトープ競合懸濁アレイテクノロジー
抗ＧＩＴＲ抗体（２５μｌ）を、アッセイバッファー（ロッシュ、１１１１２５８９００１）中２μｇ／ｍｌまで希釈し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ）_２特異的、ＪＩＲ、１０５－００６－０９７と結合した１５００ Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズ（５μｌ、ルミネックス株式会社、５番ＬＣ１０００５－０１）と共に、一晩、０．５ｍｌのＬｏＢｉｎｄチューブ（エッペンドルフ、００３０１０８．１１６）において、振盪条件下、暗所でインキュベーションした。次に、この混合物を、予め濡らした９６ウェルフィルタープレート（ミリポア、ＭＡＢＶＮ１２５０）に移した。プレートを２回２００μｌ／ウェルＰＢＳで洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。同時に、２０μｇ／ｍｌの、同じ抗ＧＩＴＲ抗体、異なる抗ＧＩＴＲ抗体、またはアッセイバッファーのいずれかを、Ｒ－ＰＥ標識ＧＩＴＲ抗原（Ｒ＆Ｄシステムズ、ジスルフィド結合ホモ２量体；６８９－ＧＲ；ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ ＬＹＮＸ Ｋｉｔで自家標識、ＬＮＫ０２２ＲＰＥ）２０μｌ（１μｇ／ｍｌ）と共に、１時間、暗所で、６５０ｒｐｍにおいてインキュベーションした。ビーズ混合物と抗原／抗体混合物を、１：１（それぞれから２０μｌ）混合し、さらに１時間、振盪条件下（２０℃、６５０ｒｐｍ）でインキュベーションした。測定の直前に、アッセイバッファー４０μｌを、それぞれのウェルに加え、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００ ｓｙｓｔｅｍ（ミリポア）、および試料体積４８μｌ中の１００個のビーズの読み取りを使用して、解析を行った。競合させていない対照（１００％結合、競合化合物としてアッセイバッファーのみ）のＭＦＩ値を用いて、結合を決定した。

【0381】

キメラ親２３１－３２－１５抗体を、捕獲抗体として使用したとき、ヒト化抗体ｐａｂ１８７５とｐａｂ１８７６両方で、完全な結合競合を観察した。抗ＧＩＴＲ抗体ｍ６Ｃ８を捕獲抗体として使用したとき、キメラ親２３１－３２－１５抗体または２つのヒト化バリアントｐａｂ１８７５およびｐａｂ１８７６で、結合の競合を観察しなかった（データは示していない）。これらの結果は、ｍ６Ｃ８および本明細書において記載する抗ＧＩＴＲ抗体が、ヒトＧＩＴＲ上の異なるエピトープを認識することを示す。

【0382】

８．４．３ エピトープ競合表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴を使用するエピトープ結合のため、「２段階のアプローチ」を使用した（Ａｂｄｉｃｈｅ ＹＮ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８６：１７２－１８０）。その目的のため、異なる密度のＧＩＴＲ抗原（Ｒ＆Ｄシステムズ、ジスルフィド結合ホモ２量体；６８９－ＧＲ）の固定を使用して、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５、ＢＲ－１００５－３０）上に異なるチップ表面を作り出した。フローセル２は、ＧＩＴＲ抗原を低密度（６６７ＲＵ）で含有し、中程度の密度を、フローセル３（１５９５ＲＵ）において、およびフローセル４において評価し、高密度を達成した（４３７１ＲＵ）。フローセル１において、参照のため、卵白アルブミン（１２８９ＲＵ、Ｐｉｅｒｃｅ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ７７１２０）を固定した。アミン結合（０．４Ｍ ＥＤＣおよび０．１Ｍ ＮＨＳでの表面の活性化、ＧＥヘルスケアアミン結合キット、ＢＲ－１０００－５０）のため、製造元（ＧＥヘルスケア）の標準的プロトコールに従い、固定を行った。無反応群を、１Ｍエタノール－アミン－ＨＣｌ、ｐＨ８．５で不活性化した。後に、抗ＧＩＴＲ抗体を、３００ｎＭ（４５μｇ／ｍｌ）の濃度で、２４０秒間、５μｌ／分にて、異なる表面を通過させた。これらの条件を使用し、ＧＩＴＲ表面の飽和を達成すべきだった。競合する抗体（３００ｎＭ、５μｌ／分）を加える前に、解離時間６０秒を含めた。１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０（ＧＥヘルスケア、ＢＲ－１００３－５５）を６０秒間１０μｌ／分にて使用して、チップ表面の再生を行った。応答単位（ＲＵ）の競合しない対照（１００％結合、飽和条件）を使用して、ビニングを行った。

【0383】

図８において示す通り、キメラ親２３１－３２－１５抗体をまずＧＩＴＲに結合させるとき、この抗体のさらなる結合は生じない。しかしながら、キメラ親２３１－３２－１５抗体をまずＧＩＴＲに結合させ、抗体ｍ６Ｃ８を適用するとき、この抗体は、依然としてＧＩＴＲに結合することができる。

【0384】

８．４．４ エピトープマッピング－ＰＣＲ変異誘発およびアラニンスキャニング
本明細書において記載する抗ＧＩＴＲ抗体が結合するＧＩＴＲ上のエピトープをマッピングするために、エラープローンＰＣＲを使用して、ヒトＧＩＴＲ抗原のバリアントを作り出した。バリアントＧＩＴＲタンパク質を、細胞ライブラリーにおける細胞の表面上で発現させ、これらの細胞を、抗ＧＩＴＲ抗体の結合についてスクリーニングした。陽性対照として、ポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、ＧＩＴＲタンパク質の適切なフォールディングを確認した。低減した抗体結合が生じたか、または工程結合が生じない、ヒトＧＩＴＲ抗原のバリアントについて、アラニンスキャニング変異誘発を行い、本明細書において記載する抗ＧＩＴＲ抗体が結合のため必要とする正確なエピトープ残基を決定した。

【0385】

８．４．４．１ ヒトＧＩＴＲバリアントの創出
エラープローンＰＣＲ変異誘発を使用して、細胞外ドメインにおいてランダムな変異を有するヒトＧＩＴＲのバリアントを作り出した。エラープローンＰＣＲのため、製造元の指示に従い、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラタジーン）を使用した。簡単に言うと、自家コンストラクトを鋳型（１３ｎｇ、コンストラクト番号４３７７、ｐＭＡ－Ｔ－ｈｕＧＩＴＲ）、０．０５Ｕ／μｌ Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、１×Ｍｕｔａｚｙｍｅ ＩＩ反応バッファー、０．２μＭ各プライマー、ならびに０．２ｍＭ各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）を使用して、２０回のＰＣＲサイクルを５０μｌの体積で行った。以下のプログラム：９５℃、２分間；９５℃、３０秒間、５６℃、３０秒間、７２℃、１分間の２０サイクル；および７２℃、１０分間の最終伸長工程を使用するＰＣＲ（エッペンドルフ、ドイツ）により、試料を増幅した。１％アガロースゲルを使用して、ＰＣＲ産物をゲル精製し、予想したサイズの７２０ｂｐに対応するＤＮＡバンドを切り出し、製品マニュアルに従い、Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆ＮａｇｅｌのＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ精製キットを使用して、ゲル抽出を行った。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよび１：３（ベクター：インサート）の比を使用して、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位を介して、精製したＤＮＡを自家発現ベクターにライゲーションした。２時間後、１０分間、６５^ｏＣでの熱変性工程で、ライゲーション（２５^ｏＣ）を停止させた。酵母ｔ－ＲＮＡを使用して、ライゲーション反応物由来のＤＮＡを、ＥｔＯＨ沈殿させた。標準的な消化およびライゲーション技術を使用した。ライゲーション反応物を、ＤＨ１０Ｂ細胞（エシェリキア・コリＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞、インビトロジェン；１９００Ｖ／５ｍｓ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細菌を、ＬＢ寒天および１００μｇ／ｍｌアンピシリンプレートに播種し、およそ１．９ｘ１０^８個のコロニーを得た。

【0386】

次に、全てのエレクトロポレーションした細菌をプレートから掻爬し、製造元の指示に従い、大規模ＤＮＡプラスミド調製（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ）について使用し、ＤＮＡライブラリーを作り出した。ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩおよびＢｓｒＧＩ／ＥｃｏＲＩでの制限酵素消化を行い、ライブラリーを品質制御した。単一コロニーをピックアップし、配列決定に送り、最終的なライブラリーの多様性を決定した。

【0387】

８．４．４．２ ヒトＧＩＴＲバリアントを含む細胞ライブラリーの創出
標準的な技術の遺伝子導入、続いて形質導入を使用して、１６２４－５細胞の表面上にヒトＧＩＴＲ変異体を発現させた。レトロウイルス粒子の創出のため、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡ遺伝子導入試薬（ロシュ・ダイアグノスティックスＧｍｂＨ、ドイツ）を使用して、ＤＮＡライブラリー、ならびにレトロウイルスタンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖを発現するベクターを、レトロウイルスパッケージング細胞株（ＨＥＫ細胞）に遺伝子導入した。得られたレトロウイルス粒子は、レトロウイルスパッケージング細胞の細胞培養上清に蓄積した。遺伝子導入の２日後、細胞を含まないウイルスベクター粒子を含有する上清を回収し、１６２４－５細胞のスピンインフェクションの対象にした。およそ４％の形質導入効率（％ヒトＧＩＴＲ発現細胞）を得た。さらに少なくとも１日間の連続培養の際、ピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ）を使用して、細胞を選択した。形質導入していない細胞は、陰性対照（ＮＣ）として機能した。抗生物質セレクション後、大部分の細胞が、細胞表面上にヒトＧＩＴＲ抗原ライブラリーを安定的に発現した。Ｆｉｃｏｌｌ分離工程を介して、生存可能でない細胞を取り除いた。

【0388】

ＦＡＣＳを使用して、ポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、正しくフォールディングされたヒトＧＩＴＲ変異体を発現する細胞を選択し、続いて、抗ＧＩＴＲキメラ親２３１－３２－１５抗体に結合しないヒトＧＩＴＲバリアントを発現する個々の細胞を選択した。簡単に言うと、抗体結合細胞をＦＡＣＳにより解析し、予備高速ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ、ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）により、特異的な抗体結合を提示する細胞を、未結合細胞集団から分離した。抗体反応性または非反応性細胞プールを、組織培養において再度拡大し、レトロウイルスで形質導入した細胞の安定的な発現表現型により、明らかに検出可能な抗ＧＩＴＲ抗体（キメラ親２３１－３２－１５）非反応性細胞集団を得るまで、抗体指向性細胞ソーティングおよび組織培養拡大のサイクルを繰り返した。この抗ＧＩＴＲ抗体（キメラ親２３１－３２－１５）非反応性細胞集団を、最終的なシングルセルソーティング工程の対象にした。数日の細胞拡大後、シングルセルソーティングした細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）での９６ウェルプレート解析を使用して、抗ＧＩＴＲキメラ親２３１－３２－１５抗体への非結合、およびポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体への結合について再度試験した。

【0389】

８．４．４．３ エピトープ解析
表現型（ポリクローナル抗ＧＩＴＲ＋、キメラ親２３１－３２－１５－）を遺伝子型と結び付けるために、シングルセルソーティングしたｈｕＧＩＴＲバリアントの配列決定を行った。図９Ａおよび９Ｂは、これらのバリアント由来の配列アライメントを示す。図９Ａおよび９Ｂにおけるアミノ酸残基は、ヒトＧＩＴＲの未成熟アミノ酸配列（配列番号４１）に従い番号を付けた。配列決定により、増大した変異または「ホットスポット」を有する領域（例えば、Ｐ６２およびＧ６３）を同定し、抗ＧＩＴＲキメラ親２３１－３２－１５抗体が認識するヒトＧＩＴＲ上のエピトープの表示をもたらす。

【0390】

抗ＧＩＴＲ抗体への結合に関与するヒトＧＩＴＲの正確なアミノ酸を確認するために、ホットスポットアミノ酸のアラニン置換を行った。以下の位置（配列番号４１に従い番号付けた）：Ｐ２８Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｇ３０Ａ、Ｇ３１Ａ、Ｐ３２Ａ、Ｔ５４Ａ、Ｔ５５Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｃ５７Ａ、Ｃ５８Ａ、Ｒ５９Ａ、Ｄ６０Ａ、Ｙ６１Ａ、Ｐ６２Ａ、Ｇ６３Ａ、Ｅ６４Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｃ６６Ａ、Ｃ６７Ａ、Ｓ６８Ａ、Ｅ６９Ａ、Ｗ７０Ａ、Ｄ７１Ａ、Ｃ７２Ａ、Ｍ７３Ａ、Ｃ７４Ａ、Ｖ７５Ａ、およびＱ７６Ａを、アラニンに別々に変異させた。標準的な技術の遺伝子導入、続いて形質導入を使用して、１６２４－５細胞の表面上にこれらのヒトＧＩＴＲ変異体を発現させた。

【0391】

最後に、１６２４－５細胞上で発現させたアラニン変異体を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）において、抗ＧＩＴＲヒト化抗体ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５およびｐａｂ１９７９、ならびに参照抗体ｍ６Ｃ８の結合について試験した。簡単に言うと、個々のヒトＧＩＴＲアラニン変異体を発現する１６２４－５細胞を、２μｇ／ｍｌモノクローナル抗ＧＩＴＲ抗体ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、ｐａｂ１９７９、もしくはｍ６Ｃ８；またはＡＰＣと結合したポリクローナル抗ＧＩＴＲ抗体（ＡＦ６８９、Ｒ＆Ｄシステムズ）、およびＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）１００μｌにおいて希釈したＦｃ受容体ブロック（１：２００；ＢＤカタログ番号５５３１４２）と共に、２０分間、４^ｏＣにてインキュベーションした。洗浄後、細胞を、検出のため必要であれば、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）１００μｌにおいて希釈した２次抗ＩｇＧ抗体（ＡＰＣ結合；ＢＤカタログ番号１０９－１３６－０９７）と共に、２０分間、４^ｏＣにてインキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメーター（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用して、獲得した。試験したモノクローナル抗体の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、ポリクローナル抗体のＭＦＩ値で割り、これにより、個々のＧＩＴＲアラニン変異体についてのＭＦＩ比（モノクローナル抗体／ポリクローナル抗体）を作り出した。全ての変異体についての個々のＭＦＩ比に基づき、平均ＭＦＩ比（「ＡＭＦＩ比」）を計算した。図１０Ａは、ヒトＧＩＴＲアラニン変異体を発現する１６２４－５細胞へのｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５、ｐａｂ１９７９、および参照抗体ｍ６Ｃ８の結合を要約する表である。ＡＭＦＩ比の６０％より上である個々のＭＦＩ比は、標準化後、ポリクローナル抗体のものと同様の結合を示すとみなし、図１０Ａにおける「＋」により表される。図１０Ａにおける「＋／－」は、ＡＭＦＩ比の３０％～６０％である個々のＭＦＩ比を表す。図１０Ａにおける「－」は、ＡＭＦＩ比の３０％より下である個々のＭＦＩ比を表す。

【0392】

図１０Ａにおいて示す通り、配列番号４１に従い番号付けた、Ｄ６０Ａ変異体およびＧ６３Ａ変異体は、ｐａｂ１８７６、ｐａｂ１９６７、ｐａｂ１９７５およびｐａｂ１９７９の結合を特異的に妨害するか、または減弱するが、参照抗体ｍ６Ｃ８のものを妨害せず、減弱しなかった。Ｃ５８Ａ変異体は、全５つの抗体の結合を妨害し、エピトープ特異的なものよりむしろ、恐らく構造変異である。Ｃ７４Ａ変異体は、発現を減弱し、結合比較のため使用することができなかった。

【0393】

さらに、抗ＧＩＴＲ抗体２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７６、およびｍ６Ｃ８を、野生型対変異体ヒトＧＩＴＲへのそれらの結合について比較した。簡単に言うと、野生型ヒトＧＩＴＲ、ならびに２つのＧＩＴＲアラニン変異体（配列番号４１に従い番号付けた、Ｄ６０Ａ変異体およびＧ６３Ａ変異体）を、上記の通り、１６２４－５細胞の表面上で発現させ、細胞を、２μｇ／ｍｌの、ＡＰＣに結合した、モノクローナル抗体２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７６、およびｍ６Ｃ８、またはポリクローナル抗体でまず染色し、次に、検出のため必要であれば、２次抗ＩｇＧ抗体（ＡＰＣ結合；１：１０００；ＢＤカタログ番号１０９－１３６－０９７）を使用して染色し、上記の通り、フローサイトメトリー解析において試験した。全ての平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、２つの測定値の平均として計算した。特定の細胞種類についての試験したモノクローナル抗体のＭＦＩ値を、同じ細胞種類についてのポリクローナル抗体のＭＦＩ値で割り、それにより、９つのＭＦＩ比（モノクローナル抗体／ポリクローナル抗体）：ＭＦＩ比_{２３１－３２－１５、ＷＴ}、ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、ＷＴ}、ＭＦＩ比_{ｍ６Ｃ８、ＷＴ}、ＭＦＩ比_{２３１－３２－１５、Ｄ６０Ａ}、ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、Ｄ６０Ａ}、ＭＦＩ比_{ｍ６Ｃ８、Ｄ６０Ａ}、ＭＦＩ比_{２３１－３２－１５、Ｇ６３Ａ}、ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、Ｇ６３Ａ}、およびＭＦＩ比_{ｍ６Ｃ８、Ｇ６３Ａ}の合計を作り出した。野生型ＧＩＴＲと比べ、ＧＩＴＲアラニン変異体への抗体の結合の百分率を、ＧＩＴＲアラニン変異体についての特定のＭＦＩ比を、野生型についての対応するＭＦＩ比で割ること（例えば、ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、Ｄ６０Ａ}を、ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、ＷＴ}で割ること）により計算した。結合における低減の百分率を、例えば、１００％×（１－（ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、Ｄ６０Ａ}／ＭＦＩ比_{ｐａｂ１８７６、ＷＴ}））を計算することにより、決定した。

【0394】

図１０Ｂにおいて示す通り、Ｄ６０Ａ変異体およびＧ６３Ａ変異体は、２３１－３２－１５およびｐａｂ１８７６を特異的に妨害するか、または減弱したが、ｍ６Ｃ８のものを妨害も、減弱もしなかった。図１０Ｂにおいて示す百分率は、それぞれのプロットにおけるＧＩＴＲ陽性細胞の百分率である。ＧＩＴＲ Ｄ６０Ａを発現する細胞を使用して試験したとき、ｍ６Ｃ８についての１０％の低減と比較して、２３１－３２－１５およびｐａｂ１８７６について、それぞれ、８２％ならびに８８％、抗体結合を低減した。同様に、ＧＩＴＲ Ｇ６３Ａを発現する細胞を使用して試験したとき、２３１－３２－１５およびｐａｂ１８７６の結合を、それぞれ、３７％ならびに５９％低減し、一方、ｍ６Ｃ８の結合を、６２％増大した。

【0395】

抗ＧＩＴＲ抗体の結合特徴のさらなる証拠として、カニクイザルＧＩＴＲへの抗体の結合を比較した。カニクイザルＧＩＴＲの未成熟タンパク質は、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。タンパク質発現を増大するために、カニクイザルＧＩＴＲのシグナルペプチドの最初の残基をメチオニンによって置換し、Ｖ１ＭカニクイザルＧＩＴＲを作り出した。次に、配列番号４４に従い番号付けた、位置６２および６３のアミノ酸残基（ＧｌｎＳｅｒ）を、ヒトＧＩＴＲにおける対応する残基（ＰｒｏＧｌｙ）によって置換した、変異体カニクイザルＧＩＴＲ Ｖ１Ｍ／Ｑ６２Ｐ／Ｓ６３Ｇを作り出した。図１１Ａは、ヒトＧＩＴＲ、Ｖ１ＭカニクイザルＧＩＴＲ、およびＶ１Ｍ／Ｑ６２Ｐ／Ｓ６３ＧカニクイザルＧＩＴＲの間の配列アライメントである。図１１Ａにおいて示す３つのタンパク質を、上記の通り、１６２４－５細胞の表面上で発現させ、細胞を、２μｇ／ｍｌの、ＡＰＣに結合した、モノクローナル抗体２３１－３２－１５、ｐａｂ１８７６、およびｍ６Ｃ８、またはポリクローナル抗体でまず染色し、次に、２次抗ＩｇＧ抗体（ＡＰＣ結合；１：１０００；ＢＤカタログ番号１０９－１３６－０９７）を使用して染色し、上記の通り、フローサイトメトリー解析において試験した。

【0396】

図１１Ｂにおいて示す通り、抗ＧＩＴＲ抗体２３１－３２－１５およびｐａｂ１８７６は、Ｖ１Ｍ／Ｑ６２Ｐ／Ｓ６３ＧカニクイザルＧＩＴＲを発現する細胞への結合のみを提示し、Ｖ１ＭカニクイザルＧＩＴＲを発現する細胞への結合は提示しなかった。

【0397】

８．５ 実施例５ 抗ＯＸ４０抗体のエピトープマッピング
この実施例は、抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９、および参照抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ１９２８のエピトープを特徴付ける。米国特許公開第２０１３／０２８０２７５号（参照により本明細書に組み込む）において提供される抗体Ｈｕ１０６－１２２の可変領域に基づき、抗体ｐａｂ１９２８を作り出した。ｐａｂ１９２８は、配列番号１０６のアミノ酸配列の重鎖、および配列番号１０７のアミノ酸配列の軽鎖を含む。

【0398】

８．５．１ エピトープマッピング－アラニンスキャニング
ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９、および参照抗体ｐａｂ１９２８の結合特徴を、アラニンスキャニングにより評価した。簡単に言うと、アジレント・テクノロジーのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇ５９０１Ａ）を使用して、細胞外ドメインにおいてアラニン置換を有するヒトＯＸ４０変異体を作り出した。上記の通り、標準的な遺伝子導入、続いて、形質導入を使用して、１６２４－５細胞の表面上で、ヒトＯＸ４０変異体を発現させた。

【0399】

フローサイトメトリーにおいて、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体への結合により証明した、正しくフォールディングされたヒトＯＸ４０変異体を発現する細胞を、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９、またはｐａｂ１９２８に結合しないヒトＯＸ４０変異体を発現させた亜集団についてさらに選択した。予備高速ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ、ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）により、特異的な抗体結合を提示した細胞を、未結合細胞集団から分離した。抗体反応性または非反応性細胞プールを、組織培養において再度拡大し、レトロウイルスで形質導入した細胞の安定的な発現表現型により、明らかに検出可能な抗ＯＸ４０抗体（ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９、またはｐａｂ１９２８）非反応性細胞集団を得るまで、抗体指向性セルソーティングおよび組織培養拡大のサイクルを繰り返した。この抗ＯＸ４０抗体非反応性細胞集団を、最終的なシングルセルソーティング工程の対象にした。数日の細胞拡大後、シングルセルソーティングした細胞を、フローサイトメトリーを使用して、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体への結合、およびモノクローナル抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９またはｐａｂ１９２８への非結合について再度試験した。簡単に言うと、個々のヒトＯＸ４０アラニン変異体を発現する１６２４－５細胞を、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９またはｐａｂ１９２８と共にインキュベーションした。それぞれの抗体について、２種の抗体濃度を試験した（ｐａｂ１９４９ｗ：２μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌ；ｐａｂ２０４９：１．８μｇ／ｍｌおよび０．３μｇ／ｍｌ；ｐａｂ１９２８：１．１μｇ／ｍｌおよび０．４μｇ／ｍｌ）。ＡＰＣと結合したポリクローナル抗ＯＸ４０抗体（ＡＦ３３８８、Ｒ＆Ｄシステムズ）を、１：２０００で希釈した。Ｆｃ受容体ブロック（１：２００；ＢＤカタログ番号５５３１４２）を加え、試料を、２０分間４^ｏＣにてインキュベーションした。洗浄後、細胞を、検出のため必要であれば、２次抗ＩｇＧ抗体（ＰＥ結合；ＢＤカタログ番号１０９－１１６－０９７）と共に、２０分間、４^ｏＣにてインキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメーター（ベクトン・デッキンソンバイオサイエンス）を使用して、獲得した。

【0400】

表現型（ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体＋、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体－）を遺伝子型と結び付けるために、シングルセルソーティングしたヒトＯＸ４０変異体の配列決定を行った。図１２は、依然として、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体に結合するが、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体ｐａｂ１９４９ｗ、ｐａｂ２０４９、またはｐａｂ１９２８に結合しない、ヒトＯＸ４０アラニン変異体を示す表である。全ての残基を、ヒトＯＸ４０の成熟アミノ酸配列（配列番号７２）に従い番号付ける。フローサイトメトリー解析に基づき、「＋」は、結合を示し、「－」は、結合の喪失を示す。
＊ ＊ ＊

【0401】

本発明は、本明細書において記載される特定の実施形態により、範囲において制限されるべきではない。実際に、記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる修飾は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。

【0402】

本明細書において引用される全ての参考文献（例えば、公報または特許または特許出願）は、それぞれ個々の参考文献（例えば、公報または特許または特許出願）が、全目的のため、参照により全体が組み込まれることを具体的かつ個別に示されるのと同程度まで、参照により全体が、全目的のため、本明細書に組み込まれる。

【0403】

他の実施形態は、以下の請求項内である。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【配列表】

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