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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-14
(45)【発行日】2022-06-22
(54)【発明の名称】プロバイオティクス組成物およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/747 20150101AFI20220615BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220615BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220615BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220615BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20220615BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20220615BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20220615BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20220615BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20220615BHJP
【ＦＩ】
A61K35/747
A61P37/06
A61P1/00
A61P43/00 121
A23L33/135
A61K9/48
A61K9/20
A61K9/14
A61K9/19
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019538207
(86)(22)【出願日】2018-01-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-05-21
(86)【国際出願番号】 EP2018050789
(87)【国際公開番号】W WO2018130667
(87)【国際公開日】2018-07-19
【審査請求日】2021-01-12
(31)【優先権主張番号】1700542.2
(32)【優先日】2017-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1709731.2
(32)【優先日】2017-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
【微生物の受託番号】DSMZ DSM13434
【微生物の受託番号】DSMZ DSM15312
(73)【特許権者】
【識別番号】509243300
【氏名又は名称】プロビ アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】100103894
【弁理士】
【氏名又は名称】家入 健
(72)【発明者】
【氏名】アガート ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ラゾウ アーレン，イリーニ
(72)【発明者】
【氏名】ラーション，ラーズ ニクラス
【審査官】福山 則明
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５１１４７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／１０８７６４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００９－５１１４７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１９２１６３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Int J Food Sci Nutr，2014年，Vol. 65, No. 8，pp. 953-959
【文献】Appl Microbiol Biotechnol，2013年，Vol. 97，pp. 3129-3140
【文献】Clinical Microbiology Reviews，2014年，Vol. 27, No. 3，pp. 482-489
【文献】Clinical and Developmental Immunology，2012年，Vol. 2012, Article ID 654143，pp. 1-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／７４７
Ａ２３Ｌ ３３／１３５
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つのプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株と、少なくとも１つのプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２（ＤＳＭ１３４３４）株との組み合わせを含有する組成物であって、対象におけるセリアック病自己免疫（ＣＤＡ）の予防及び／若しくは治療又はセリアック病（ＣＤ）の予防及び／若しくは治療に使用するための組成物。
【請求項2】
前記少なくとも１つのプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ株が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９（ＤＳＭ１５３１２）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記プロバイオティクス株が、１日当たり１×１０６～１×１０１２ＣＦＵの量で投与される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
賦形剤または担体を含有する請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
前記担体が、食品および／または微量栄養素である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記組成物が、経口投与用のカプセル、錠剤、または粉末として提供される、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
凍結乾燥調製物の形態の、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、セリアック病自己免疫（ＣＤＡ）、またはセリアック病（ＣＤ）の対象における予防および／または治療に使用するための、少なくとも１つのプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種株に関する。
【0002】
本発明はまた、かかる使用のための組成物、ならびに有効量の当該プロバイオティクス株を対象に投与することを含む、ＣＤＡおよび／またはＣＤを予防および／または治療する方法を提供する。
【0003】
概論
セリアック病（ＣＤ）は、小腸の腸粘膜に影響を与える慢性的な免疫介在性疾患である。これは、小麦、ライ麦、および大麦に見られる主要な貯蔵タンパク質、グルテンに対する不耐性によって引き起こされる（Ｓｃｈｕｐｐａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３７（６）：１９１２－３３）。セリアック病の基本的な症状および臨床徴候としては、腹部の不快感、膨満、および下痢、それに続く栄養失調の徴候（例えば、体重減少、貧血、および骨粗鬆症）が挙げられる。しかしながら、患者の大部分は症状がなく、スクリーニングを通じて診断される（Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１；２６９（６）：５６０－７１）。現在、治療は生涯にわたるグルテン除去食（ＧＦＤ）からなる。
セリアック病（ＣＤ）は、小腸の腸粘膜に影響を与える慢性的な免疫介在性疾患である。これは、小麦、ライ麦、および大麦に見られる主要な貯蔵タンパク質、グルテンに対する不耐性によって引き起こされる（Ｓｃｈｕｐｐａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３７（６）：１９１２－３３）。セリアック病の基本的な症状および臨床徴候としては、腹部の不快感、膨満、および下痢、それに続く栄養失調の徴候（例えば、体重減少、貧血、および骨粗鬆症）が挙げられる。しかしながら、患者の大部分は症状がなく、スクリーニングを通じて診断される（Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１；２６９（６）：５６０－７１）。現在、治療は生涯にわたるグルテン除去食（ＧＦＤ）からなる。
【0004】
ＣＤの病態生理学は完全には理解されていないが、Ｔ－細胞駆動型であると提唱されている。小腸でのグルテンタンパク質の消化の後得られるグリアジンペプチドは、何らかの形で上皮性関門を通過し、ＭＨＣ－ＩＩ構造上の抗原提示細胞によって提示され、粘膜固有層でのグリアジン特異的ＣＤ４＋Ｔ－ヘルパー（ＴＨ）１細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ（ＴＣ）細胞の活性化を可能にする。これはいくつかのサイトカイン、特にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２１の上方制御をもたらし、前者の２つは筋線維芽細胞の活性化を通して典型的な粘膜リモデリングおよび絨毛萎縮を引き起こすが、後者はＣＤ４＋細胞の活性の維持に関与すると思われる（Ｓｃｈｕｐｐａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，前出）。過去１０年間で、グリアジンによる先天性免疫系の同時の直接刺激は、疾患の発症におけるさらなる重要な因子であることが示されてきた。これは現在、樹状細胞およびマクロファージにおけるＩＬ－１５シグナル伝達の上方制御に起因し、上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の活性化を通じて粘膜損傷を引き起こす（Ｌｏｎｄｅｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５；４２（８）：９１３－８）。
【0005】
ＣＤの世界的な罹患率はおおよそ１％と推定されているが、民族や地理的な位置間で大きく異なる。とりわけスウェーデンは、１．５～３％の推定罹患率を有し、最も罹患率の高い国とランク付けされている（Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．，前出）。どのプロセスがグリアジン構造に対するこの機能不全反応の誘発を助長するのか、またなぜ疾患罹患率が集団間で異なるのかは、未だ完全には決定されていない。ほとんどすべてのセリアック病患者がＤＲ３－ＤＱ２および／またはＤＲ４－ＤＱ８ハプロタイプの保有者であるという事実によって証明されるように、ＣＤには明らかな遺伝的要素がある（Ｓｏｌｌｉｄ ＬＭ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９８９；１６９（１）：３４５－５０）。加えて、多数の他の影響の少ない遺伝子も疾患の危険性に影響を及ぼすことが見出されており、それらのほとんどは適応免疫応答の活性化に関連している（Ｈｕｎｔ ＫＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００８；４０（４）：３９５－４０２）。ＣＤはこれらの遺伝的危険性の特色を他のいくつかの自己免疫不全、最も重要なことには１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）と共有し、これはＨＬＡ－ＤＱＢ１およびＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座ならびにいくつかの非ＨＬＡ遺伝子座においてその主要な感受性遺伝子を共有している（Ｓｍｙｔｈ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８；３５９（２６）：２７６７－７７）。それにもかかわらず、これらのハプロタイプを保有する少量の少数だけがこの疾患を発症するので、遺伝学だけではＣＤを説明することはできない。過去数十年の間に多くの国で観察されている急速に増加する発生率もまた、何らかの形で病因に寄与している環境要因を指している。重要な調査分野としては、乳児の授乳習慣、母乳の授乳、（および腸内細菌叢の変動または乱れが挙げられる（Ｄｅ Ｐａｌｍａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅ：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｉｌｉｅｕ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；８７（５）：７６５－７８）。
【0006】
腸生検は以前はＣＤの診断のための黄金律とみなされていたが、その高い診断感度と特異性のために臨床的に現在最も一般的な組織トランスグルタミナーゼ自己抗体（ｔＴＧＡ）のうちのいくつかの血清学的マーカーが発見されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊａｍａ．２０１０；３０３（１７）：１７３８－４６）。さらに、２０１２年に欧州小児消化器肝臓栄養学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）（ＥＳＰＧＨＡＮ）からの改訂されたガイドライン（Ｈｕｓｂｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，ＥＳＰＧＨＡＮ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２０１２；５４（１）：１３６－６０））は、適切なさらなる試験が続く場合、顕著に高いｔＴＧＡレベルによって、診断を確認するための生検の必要性を排除することができることを示唆している。大部分のＣＤ患者において、ｔＴＧＡレベルはＧＦＤの導入後に減少する。
【0007】
小児ではまた、かかる減少によって腸粘膜が組織学的に改善されることが高く予想され、（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ ＥＧ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１４；１０９（９）：１４７８－８３）、ｔＴＧＡが二元的な診断ツールとしてのみならず、疾患活動性および食事療法遵守度用のマーカーとしても使用することができることを示している。しかしながら、これは持続的に高いｔＴＧＡレベルを有することが見出された、いわゆるＣＤ自己免疫（ＣＤＡ）、またはより一般的には正常な腸生検の特色で確認される場合、潜在的ＣＤと称される無症候性患者をどのように管理するのかという問題をもたらす。これらの小児は、ＣＤを発症する危険性が高く（Ｌｉｕ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；３７１（１）：４２－９）、ＧＦＤ以外にその危険性を低減または排除するために現在利用可能な治療法の選択肢はない。
【背景技術】
【0008】
以前の研究では、活性型ＣＤを有する患者の微生物叢は、健康な対照および無症状の患者と比較して、より高い程度のグラム陰性病原体で構成されていることが示されている（Ｎａｄａｌ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｂａｌａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｕｏｄｅｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｏｆ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｃｏｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；５６（Ｐｔ１２）：１６６９－７４）。したがって、後の研究では、かかる微生物叢がグリアジンに応答してより高い程度の炎症反応を増強し（Ｄｅ Ｐａｌｍａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅ：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｉｌｉｅｕ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；８７（５）：７６５－７８）、逆にある種のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株がグリアジンの消化に影響を及ぼしそれらの免疫学的潜在能力を低減する（Ｌａｐａｒｒａ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｌｉａｄｉｎｓ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｘｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１０；１０９（４）：８０１－７）ことを示唆している。
【0009】
最近発表されたいくつかの研究では、すでに臨床的に明らかにされているＣＤとの関連で、特定のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を投与する効果が調べられている。Ｏｌｉｖａｒｅｓら（Ｏｌｉｖａｒｅｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２０１４；１１２（１）：３０－４０）は、最近ＣＤと診断された３６人の小児を、３ヵ月間、ＧＦＤに加えてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ＣＥＣＴ７３４７またはプラセボを毎日消費させることによって無作為に治療した。ＧＦＤの導入によって免疫学的パラメータにおけるプロバイオティクス効果は理解が困難であり、この研究ではｔＴＧＡレベルは調べられなかったが、プラセボと比較して治療グループの成熟Ｔ細胞の合計レベルに顕著な減少が見られた。加えて、プロバイオティクス治療を受けたグループの小児たちが、対照と比較してより高い身長パーセンテージ増加を達成したことを示した。
【0010】
また、Ｓｍｅｃｕｏｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１３；４７（２）：１３９－４７）は、現在ＧＦＤを行っていない成人ＣＤ患者２２人をＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓまたはプラセボで３週間毎日治療し、腸管透過性、免疫学的パラメータ、および症状の変化を評価した。プロバイオティクス治療を受けたグループの参加者は、対照と比較して胃腸症状の改善を報告した。しかしながら、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＣＥＣＴ７３４７とは異なり、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ（ＮＬＳ）は、炎症マーカー、ならびに腸内細菌叢および宿主関連防御機構に影響を与えなかった。
【0011】
特定のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株を用いた上記の研究は両方とも、ＣＤにおけるそれらのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株のいくつかの有益な役割を示唆しているが、それらはまたさらなる研究の必要性を強調している。
【0012】
したがって、ＣＤＡおよびＣＤの顕著な調査にもかかわらず、現在利用可能なＣＤの唯一の治療法は、グルテン除去食（ＧＦＤ）である。したがって、セリアック病自己免疫（ＣＤＡ）を予防および／もしくは治療するための、またはセリアック病（ＣＤ）を予防および／もしくは治療するための組成物および方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0013】
本発明によれば、セリアック病自己免疫（ＣＤＡ）の予防および／もしくは治療のために、またはセリアック病（ＣＤ）の予防および／もしくは治療のために対象へ使用するための少なくとも１つのプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種株が提供される。
【0014】
「予防および／または治療のための使用」によって、ＣＤＡまたはＣＤに関連する予防、遅延、重症度の低減、および／または１つ以上の症状の除去、および／または他のマーカーの対象への効果を生じる使用を意味する。
【0015】
プロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の好ましいプロバイオティクス株は、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、およびＬ．ｌａｃｔｉｓから選択される。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の好ましいプロバイオティクス株は、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、およびＬ．ｌａｃｔｉｓから選択される。
【0016】
好ましくは、少なくとも１つのプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉおよび／またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍである。
【0017】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株寄託
本発明に従って使用するためのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｌｉの好ましい株は、以下のように、Ｐｒｏｂｉ ＡＢ（Ｓｏｌｖｅｇａｔａｎ４１，Ｌｕｎｄ２２３７０，Ｓｗｅｄｅｎ）によってブダペスト条約の下で寄託されている。
本発明に従って使用するためのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｌｉの好ましい株は、以下のように、Ｐｒｏｂｉ ＡＢ（Ｓｏｌｖｅｇａｔａｎ４１，Ｌｕｎｄ２２３７０，Ｓｗｅｄｅｎ）によってブダペスト条約の下で寄託されている。
【表1】
【0018】
好ましくは、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ株は、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２（ＤＳＭ１３４３４）Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ０２：Ａ（ＤＳＭ１３４３２）のうちの１つ以上から選択される。
【0019】
好ましくは、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ株は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９（ＤＳＭ１５３１２）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ２９９ｖ（ＤＳＭ９８４３）、および／またはＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ２９９（ＤＳＭ６５９５）のうちの１つ以上から選択される。
【0020】
有利には、本発明は、セリアック病自己免疫（ＣＤＡ）の予防および／もしくは治療のために、またはセリアック病（ＣＤ）の予防および／もしくは予防のために、対象に使用するための少なくとも１つのプロバイオティクスＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ株と少なくとも１つのＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ株との組み合わせを提供する。
【0021】
最も好ましくは、組み合わせは、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２（ＤＳＭ１３４３４）とＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９（ＤＳＭ１５３１２）とである。
【0022】
組成物は特定のプロバイオティクス株またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｌｉ株を含み得るが、好ましくはそれらは別の有効量の任意の他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉのプロバイオティクス株または他の微生物を含まない特定の株からなる。
【0023】
組成物および製剤
本発明のプロバイオティクス株は、好ましくは凍結乾燥されている。
本発明のプロバイオティクス株は、好ましくは凍結乾燥されている。
【0024】
本発明のプロバイオティクス株は、固体または液体製剤として好適な担体、希釈剤または賦形剤と一緒に提供することができ、これは一実施形態では医薬製剤であり得る。
【0025】
好適な液体担体の例としては、水および他の水性溶媒が挙げられる。
【0026】
好適な固体担体の例としては、マルトデキストリン、イヌリン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、または他の植物デンプン、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、および糖アルコールが挙げられる。
【0027】
組成物は、乾式発酵または非発酵組成物であってもよい。乾燥非発酵組成物の場合、発酵は、対象による組成物の摂取後に胃腸管で行われる。
【0028】
使用において、本発明のプロバイオティクス株（複数可）は、対象に投与する前に液体または固体の担体と混合してもよい。例えば、対象は、接種前に株（複数可）を水もしくは他の何らかの水性溶媒、または飲み物からなる担体と混合してもよい。同様に、プロバイオティクス株は、１つ以上の食品からなる担体と混合してもよい。好ましい食品は、ヨーグルト、フルーツジュースなどの発酵または非発酵乳製品；飲料、スープ、大豆製品などの植物系食品、ドライフードバー、離乳食、乳児用栄養食、乳児用製剤、出生時からの母乳代替品などのグルテン除去製品である。
【0029】
乳児または幼児用調製乳は、本発明のプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ株（複数可）にとって特に好ましい担体である。すぐに供給可能な液体形態として幼児に供給する前に水と混合するために、乾燥粉末形態であってもよい。これは通常牛乳から作られ、ホエーおよびカゼインタンパク質を含有する。
【0030】
本発明のプロバイオティクス株（複数可）はまた、既知の栄養補助食品の１つ以上の成分、例えばビタミンおよびミネラルなどの微量栄養素と一緒に組成物中で提供されてもよい。
【0031】
セリアック病の基本的な症状および臨床徴候としては、腹部の不快感、膨満、および下痢、それに続く栄養失調の徴候（例えば、体重減少、貧血、および骨粗鬆症）が挙げられる。栄養失調に関連する危険性を考慮すると、セリアック病と新たに診断された小児はビタミンＤ、亜鉛、および鉄が欠乏していることが発表されている（Ｅｒｄｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｔａｍｉｎ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｕｒｋ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１５；４５（４）：８３３－６ ２０１５）。同様に、新たにセリアック病と診断された成人および未治療のＣＤ患者もまた、ビタミンＢ６およびＢ１２、ビタミンＤ、葉酸、亜鉛、マグネシウム、および鉄の基準値を下回る値を有することが見出された（Ｗｉｅｒｄｓｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｔａｍｉｎ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｅｖａｌｅｎｔ ｉｎ ｎｅｗｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ．２０１３ Ｓｅｐ ３０；５（１０）：３９７５－９２．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎｕ５１０３９７５，Ｃａｒｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１３ Ａｎｎ Ｍｅｄ．２０１３ Ｄｅｃ；４５（８）：５２２－３１．ｄｏｉ：１０．３１０９／０７８５３８９０．２０１３．８４９３８３．Ｒｅｖｉｅｗ，Ｓｃｈｏｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｎｄ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ－ｏｎｓｅｔ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａ ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ Ｄａｎｉｓｈ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｈｏｒｔ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．５１，ＩＳＳ．３，２０１６）。ほとんどの場合、ひとたびＣＤまたはＣＤＡと診断されて食事からグルテンを除去すると、腸の「健康な」組織構造が回復し、ビタミンおよびミネラルの状態の正常化に至る。しかしながら、グルテン除去食に順応することによって粘膜炎症を解決することは、ミネラル欠乏の緩和には必ずしも十分ではない（Ｃａｒｕｓｏ ｅｔ ａｌ、２０１３前出）。したがって、ＣＤ／ＣＤＡと診断された、またはＣＤ／ＣＤＡを発症する危険性のある人々に、ビタミンおよび／またはミネラルの補給と一緒に本発明によるプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを使用してもよい。好ましくは、ビタミン（複数可）および／またはミネラル（複数可）は、ビタミンＡ、Ｂ６、Ｂ１２、Ｄ：および／またはミネラル：鉄、亜鉛、マグネシウムのうちの１つ以上から選択される。
【0032】
好ましくは、本発明のプロバイオティクス株（複数可）組成物は、カプセルもしくは錠剤、または経口投与用の粉末の形態で提供される。スティックパックは、食品業界および医薬品分野で使用されている一般的なタイプの単回分／単回用量包装である（ｗｗｗ．ｓｅｌｏ．ｃｏｍ／ｐａｃｋａｇｉｎｇ－ｍａｃｈｉｎｅｓ／ｓｔｉｃｋ－ｐａｃｋｓ／を参照）。それらは消費者が使用するのに非常に便利であり、所定量の本発明のプロバイオティクス組成物を収容することによって、確実に正しい用量が摂取され、本発明に従った所望の予防的および／または治療的効果を達成する。
【0033】
好ましくは、使用時に本発明のプロバイオティクス株（複数可）は、１日１×１０６～１×１０１４コロニー形成単位（ＣＦＵ）、好ましくは１×１０９～１×１０１１ＣＦＵ、および最も好ましくは１×１０１０ＣＦＵの量で対象に投与される。１日のＣＦＵの量は、好ましくは単回用量または単回投与で投与される。
【0034】
治療対象
好ましくは、対象はヒトである。有利には、ヒト対象は小児である。好ましくは、小児は、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳未満である。有利には、本発明の組成物は、出生時から、特に離乳時から、すなわち、幼児への母乳での授乳を完全にやめる時点から投与するためのものである。
好ましくは、対象はヒトである。有利には、ヒト対象は小児である。好ましくは、小児は、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１歳未満である。有利には、本発明の組成物は、出生時から、特に離乳時から、すなわち、幼児への母乳での授乳を完全にやめる時点から投与するためのものである。
【0035】
危険性のある対象の同定
好ましくは、対象は、１つ以上のＣＤの症状がないが、ＣＤを発症する危険性が高い。
好ましくは、対象は、１つ以上のＣＤの症状がないが、ＣＤを発症する危険性が高い。
【0036】
理想的には、対象は、１つ以上の血清学的、免疫学的、および／または遺伝的危険因子の存在によってＣＤの危険性が高いと同定されている。
【0037】
血清学的、免疫学的、および／または遺伝的危険因子の存在を検出するための様々な方法が当業者に周知であるが、便宜上特に適切な方法の例が、本明細書に提供されている。
【0038】
ＣＤＡおよび／またはＣＤ関連マーカー
●血清型分類
○ＤＱ２陽性
○ＤＱ８陽性
●遺伝子試験
○ＤＱ２．５シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０５／ＤＱＢ１＊０２）
○ＤＱ２．２シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０２：０１／ＤＱＢ１＊０２：０２）
○ＤＱ２．５トランスハプロタイプ、例えばＤＱ７．５シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０５：０５／ＤＱＢ１＊０３：０１）を含むＤＱ２．２シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０２：０１／ＤＱＢ１＊０２：０２）
○ＤＱ８シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０３／ＤＱＢ１＊０３：０２）
○ＤＱＡ１＊０５：０１アレル
○ＤＱＡ１＊０５：０５アレル
○ＤＱＢ１＊０３：０２アレル
●血清型分類
○ＤＱ２陽性
○ＤＱ８陽性
●遺伝子試験
○ＤＱ２．５シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０５／ＤＱＢ１＊０２）
○ＤＱ２．２シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０２：０１／ＤＱＢ１＊０２：０２）
○ＤＱ２．５トランスハプロタイプ、例えばＤＱ７．５シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０５：０５／ＤＱＢ１＊０３：０１）を含むＤＱ２．２シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０２：０１／ＤＱＢ１＊０２：０２）
○ＤＱ８シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０３／ＤＱＢ１＊０３：０２）
○ＤＱＡ１＊０５：０１アレル
○ＤＱＡ１＊０５：０５アレル
○ＤＱＢ１＊０３：０２アレル
【0039】
セリアック病を発症する高い危険性は、免疫学的血清型分類および／または遺伝子分析によって決定することができる。免疫学的血清型分類は、ＤＱ２血清型マーカーおよび／またはＤＱ８血清型マーカーの存在を同定するために使用される。ゲノムＤＮＡの遺伝子分析は、配列特異的プライマーを使用する配列特異的ＰＣＲ（ＰＣＲ－ＳＳＰ）または遺伝子配列決定によって実施することができる。配列特異的ＰＣＲ方法としては、配列特異的プライマーを用いるＰＣＲ（ＰＣＲ－ＳＳＰ）（Ｓａｃｃｈｅｔｔｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ＤＱＡ１＊０５０１，ＤＱＢ１＊０２０１，ａｎｄ ＤＲＢ１＊０４ Ａｌｌｅｌｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｉａｃ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ａ ＰＣＲ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ．１９９７ Ｎｏｖ；４３（１１）：２２０４－６．）、配列特異的プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを用いる定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（Ｒｅｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＱＡ１＊０５，ＤＱＢ１＊０２ ａｎｄ ＤＱＢ１＊０３０２ ｔｏ ａｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６ Ｏｃｔ ２０；３１６（１－２）：１２５－３２．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｓｅｐ １８）、配列特異的プライマーを用いるｑＰＣＲおよび融解曲線分析（Ｓｅｌｌｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｎｇ ＨＬＡ－ＤＱ ａｌｌｅｌｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｒｑ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ａｐｒ－Ｊｕｎ；５２（２）：１４３－６．ｄｏｉ：１０．１５９０／Ｓ０００４－２８０３２０１５０００２０００１３．）、ＰＣＲ増幅とそれに続く配列特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション遺伝子が挙げられる配列決定方法としては、連鎖停止ジデオキシヌクレオチドを用いるサンガー配列決定、パイロシーケンシング、合成による配列決定（イルミナ配列決定）、ライゲーションによる配列決定（ＳＯＬｉＤ配列決定）、ナノ細孔配列決定（ＭｉｎＩＯＮ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体配列決定、および単一分子リアルタイム配列決定（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。
【0040】
ＤＱ２またはＤＱ８血清型に対応する遺伝子マーカーとしては、ＤＱ２．５シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０５／ＤＱＢ１＊０２）、ＤＱ２．２シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０２：０１／ＤＱＢ１＊０２：０２）、ＤＱ２．５トランスハプロタイプ、例えばＤＱ７．５シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０５：０５／ＤＱＢ１＊０３：０１）を含むＤＱ２．２シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０２：０１／ＤＱＢ１＊０２：０２）、ＤＱ８シスハプロタイプ（ＤＱＡ１＊０３／ＤＱＢ１＊０３：０２）、ＤＱＡ１＊０５：０１対立遺伝子、ＤＱＡ１＊０５：０５対立遺伝子、ＤＱＢ１＊０３：０２対立遺伝子が挙げられる。
【0041】
ＣＤＡおよび／またはＣＤの免疫学的マーカーとしては、放射性リガンド結合アッセイによることを含む組織トランスグルタミナーゼ抗体レベル（Ａｇａｒｄｈ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ：１９９２）．２００４；９３（８）：１０４６－５１、Ａｇａｒｄｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌｅｎｔ ｃｅｌｉａｃ ｄｉｓｅａｓｅ ａｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｔｙｐｅ１ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＨＬＡ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００１；２（２）：５８－６５．）、合計血清ＩｇＡの欠乏がない場合を含む、ＩｇＡ子宮内膜抗体（ＥＭＡ）レベル、脱アミノ化グリアジンペプチド（ＤＧＰ ＩｇＡおよびＩｇＧ）レベルが挙げられる。
【0042】
好ましくは、１つ以上の危険因子（複数可）は、ＨＬＡ－ＤＱ２および／またはＨＬＡ－ＤＱ８である。
【0043】
好ましくは、１つ以上の免疫学的危険因子は持続的な組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧＡ）陽性、すなわちｔＴＧＡ陽性試験で２回以上連続した場合である。
【0044】
ｔＴＧ陽性は、本明細書に記載されるように、ｔＴＧ自己抗体、好ましくはＩｇＡ－ｔＴＧＡおよび／またはＩｇＧ－ｔＴＧＡの存在によって示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【図1】プラセボグループと比較したＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ＋Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ株治療グループの平均ｔＴＧＡ－ＩｇＡレベルの経時変化を示す。
【図2】プラセボと比較したＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ＋Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ治療グループの平均ｔＴＧＡ－ＩｇＧレベルの経時変化を示す。
【実施例】
【0046】
以下の材料、方法および実施例は、本発明の態様を具体化する。
【0047】
材料および方法
遺伝血清学的および免疫学的危険因子によってＣＤの高い危険性を有する対象の研究集団同定
参加者は、ＣｉＰｉＳとスウェーデンのＴＥＤＤＹ研究参加者から募集した。ＴＥＤＤＹ研究プロトコルは、他で完全に記載されている（Ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｏｕｎｇ（ＴＥＤＤＹ）ｓｔｕｄｙ：ｓｔｕｄｙ ｄｅｓｉｇｎ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００７；８（５）：２８６－９８）。端的には、２００４年から２０１０年の間のこれらのセンターの新生児を、ＨＬＡ遺伝子型分類し、以下の遺伝子型：ＤＲ３－ＤＱ２／ＤＲ４－ＤＱ８、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ４－ＤＱ８、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ８、ＤＲ３－ＤＱ２／ＤＲ３－ＤＱ２、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ４ｂ、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ１、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ１３、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ９、またはＤＲ３－ＤＱ２／ＤＲ９のうちの１つを保有していれば適格であるとみなした。スウェーデンのセンターでは、合計４８，１４０人の小児たちをスクリーニングし、そのうち３，７２３人がＨＬＡ適格であることを見出した。これらのうち、合計２，５２５件の事例で両親または主な保護者が、研究参加に対する書面によるインフォームドコンセントを提供した。ＴＥＤＤＹプロトコル内では、血液サンプルを６か月ごとに採取し、２歳からｔＴＧＡのために小児を毎年スクリーニングする。ｔＴＧＡ陽性を示したら、以前の血液サンプルを遡及的に分析して、セロコンバージョン時間を決定する。２つの連続した血液サンプルで陽性と試験された参加者を、持続的にｔＴＧＡ陽性とみなし、ＣＤＡの対象とする。すべての決定的な結果は、Ｓｏｕｔｈｍｅａｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の欧州参照検査室で実施された検査室分析に基づく。ＣＤに関するさらなる評価は、ＴＥＤＤＹプロトコルの範囲外である。スウェーデンでは、ｔＴＧＡレベル、症状の程度、および栄養失調の兆候に応じて、ケースバイケースで腸生検の実施を決定する。
遺伝血清学的および免疫学的危険因子によってＣＤの高い危険性を有する対象の研究集団同定
参加者は、ＣｉＰｉＳとスウェーデンのＴＥＤＤＹ研究参加者から募集した。ＴＥＤＤＹ研究プロトコルは、他で完全に記載されている（Ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｙｏｕｎｇ（ＴＥＤＤＹ）ｓｔｕｄｙ：ｓｔｕｄｙ ｄｅｓｉｇｎ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００７；８（５）：２８６－９８）。端的には、２００４年から２０１０年の間のこれらのセンターの新生児を、ＨＬＡ遺伝子型分類し、以下の遺伝子型：ＤＲ３－ＤＱ２／ＤＲ４－ＤＱ８、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ４－ＤＱ８、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ８、ＤＲ３－ＤＱ２／ＤＲ３－ＤＱ２、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ４ｂ、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ１、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ１３、ＤＲ４－ＤＱ８／ＤＲ９、またはＤＲ３－ＤＱ２／ＤＲ９のうちの１つを保有していれば適格であるとみなした。スウェーデンのセンターでは、合計４８，１４０人の小児たちをスクリーニングし、そのうち３，７２３人がＨＬＡ適格であることを見出した。これらのうち、合計２，５２５件の事例で両親または主な保護者が、研究参加に対する書面によるインフォームドコンセントを提供した。ＴＥＤＤＹプロトコル内では、血液サンプルを６か月ごとに採取し、２歳からｔＴＧＡのために小児を毎年スクリーニングする。ｔＴＧＡ陽性を示したら、以前の血液サンプルを遡及的に分析して、セロコンバージョン時間を決定する。２つの連続した血液サンプルで陽性と試験された参加者を、持続的にｔＴＧＡ陽性とみなし、ＣＤＡの対象とする。すべての決定的な結果は、Ｓｏｕｔｈｍｅａｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の欧州参照検査室で実施された検査室分析に基づく。ＣＤに関するさらなる評価は、ＴＥＤＤＹプロトコルの範囲外である。スウェーデンでは、ｔＴＧＡレベル、症状の程度、および栄養失調の兆候に応じて、ケースバイケースで腸生検の実施を決定する。
【0048】
ＣｉＰｉＳ研究では、２０００年から２００４年の間にＳｋａｎｅで生まれた小児たちを、臍帯血のＨＬＡ遺伝子型分類および母方要因に関するアンケートを使用してスクリーニングした。ＤＱ２および／またはＤＱ８を保有する小児は、ＨＬＡ危険性があるとみなした。危険性のある合計６２０２人の小児、ならびに対照としてＨＬＡ危険性のない７６５４人の小児を招待した。ｔＴＧＡスクリーニングは、３歳の１６２０／６２０６人（２６．１％）のＨＬＡ危険性のあるグループの参加者および対照の１８１５／７６５４人（２３．７％）、ならびに９歳の１９１０／５８７０人（３２．５％）のＨＬＡ危険性のある参加者および２１７６人中７０７２人（３０．６％）の対照に実施した。ｔＴＧＡ陽性であると試験された場合、参加者を少なくとも３か月後に再試験して持続的なｔＴＧＡ陽性であることを確認し、それに基づき腸生検のために地元の小児科医院に紹介した。２０１２年３月から２０１５年８月の間、参加者をこれら２つのコホートに継続的に招待した。包含基準は以下のとおりであった。
●２つの連続したサンプルでのｔＴＧＡ陽性、Ｂｒｉｓｔｏｌ ｔＴＧＡアッセイを使用して＜３０Ｕ／ｍｌ。
●セリアック病の診断なし。
●ＴＥＤＤＹプロトコル（ＧＡＤＡ、ＩＡＡ、ＩＡ－２Ａ、ＺｎＴ８Ａ）でスクリーニングされて、すべての糖尿病関連自己抗体が陰性。
●長距離プロトコルを通じたＴＥＤＤＹ研究に参加していない。
●２つの連続したサンプルでのｔＴＧＡ陽性、Ｂｒｉｓｔｏｌ ｔＴＧＡアッセイを使用して＜３０Ｕ／ｍｌ。
●セリアック病の診断なし。
●ＴＥＤＤＹプロトコル（ＧＡＤＡ、ＩＡＡ、ＩＡ－２Ａ、ＺｎＴ８Ａ）でスクリーニングされて、すべての糖尿病関連自己抗体が陰性。
●長距離プロトコルを通じたＴＥＤＤＹ研究に参加していない。
【0049】
Ｔ１Ｄ関連自己抗体に陽性の小児は、膵島自己免疫の元来の病歴への影響を最小限にするために本研究から除外した。しかしながら、Ｔ１Ｄ関連自己抗体は、ＣＤ発症の高い危険性のための血清学的マーカーを構成し、したがって本発明の使用および方法に従った予防的および／または治療的処置のための好ましい対象を同定するために使用することができる。
【0050】
研究デザイン
参加基準に合致する小児を最初の面談に招待し、次いで経過観察来診をおよそ３か月および６か月後に予定した。参加者は、無作為な１：１の比率で治療グループまたは対照グループであった。最初の面談および最初の経過観察来診時に、各グループにはそれぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉまたはプラセボを含有する粉末製剤を提供し、冷たい液体１００ｍｌ中に溶解した後または果物／食品と混合した後で、毎日１回食事と共に粉末を合計６か月間摂取することにより製品を毎日消費し、プロバイオティクスを含有する任意の他の食料品の消費を停止し、サシェを冷蔵保存（２～８℃）するように指示した。両親にはまた、粉末を熱い飲み物や熱い食品に添加しないように指示した。毎回の来診時に、１０ｍｌの静脈血および便サンプルを採取した。治療グループまたは対照グループへの割り当ては、参加者、臨床医、および研究室職員には知らせなかった。
参加基準に合致する小児を最初の面談に招待し、次いで経過観察来診をおよそ３か月および６か月後に予定した。参加者は、無作為な１：１の比率で治療グループまたは対照グループであった。最初の面談および最初の経過観察来診時に、各グループにはそれぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉまたはプラセボを含有する粉末製剤を提供し、冷たい液体１００ｍｌ中に溶解した後または果物／食品と混合した後で、毎日１回食事と共に粉末を合計６か月間摂取することにより製品を毎日消費し、プロバイオティクスを含有する任意の他の食料品の消費を停止し、サシェを冷蔵保存（２～８℃）するように指示した。両親にはまた、粉末を熱い飲み物や熱い食品に添加しないように指示した。毎回の来診時に、１０ｍｌの静脈血および便サンプルを採取した。治療グループまたは対照グループへの割り当ては、参加者、臨床医、および研究室職員には知らせなかった。
【0051】
組織トランスグルタミナーゼ自己抗体分析－ＣＤ発症の免疫学的危険因子
放射性リガンド結合アッセイ（ＲＢＡ）を使用して、以前記載されたようにｔＴＧＡを評価した（（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００１；２（２）：５８－６５）（Ａｇａｒｄｈ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ：１９９２）．２００４；９３（８）：１０４６－５１）。端的には、ヒト組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）は、３５Ｓ－メチオニン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ））の存在下でＴＮＴ ＳＰ６ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））を使用するｃＤＮＡのインビトロ転写および翻訳によって合成した。ＩｇＧ－ｔＴＧＡとＩｇＡ－ｔＴＧＡの両方を分析した。ＩｇＧ－ｔＴＧＡ分析のために、３５Ｓ－ｔＴＧを希釈し、ヒト血清に添加し、４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡセファロース（ＰＡＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して、血清中のＩｇＧを結合させることによって遊離および抗体結合３５Ｓ－ｔＴＧを分離した。ＰＡＳおよび免疫沈降させた３５Ｓ－ｔＴＧ－血清を９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ ＤＶフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に添加し、プレートシェーカー上でインキュベートし、続いて洗浄した。ＯｐｔｉＰｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＴｒｉＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で反応性を測定した。ＰＡＳの代わりにヤギ抗ヒトＩｇＡアガロース（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したことを除いて、ＩｇＡ－ｔＴＧＡ分析を同様に実施した。ＴＧＡのレベルは、それぞれおよそ２、４、８、１６、３１、６３、１２５、２５０、５００、および１０００Ｕ／ｍＬのＩｇＡ－ｔＴＧＡおよびＩｇＧ－ｔＴＧＡを含有する標準曲線から計算したＵ／ｍＬとして表した。ＩｇＧ－ｔＴＧおよびＩｇＡ－のｔＴＧの正の値のカットオフレベルは、＞４．０Ｕ／ｍＬで設定し、これは３９８人の成人献血者の９９パーセンタイルに相当する（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ．２００４；９３（８）：１０４６－５１）。選択的なＩｇＡ欠乏が疑われるとき、元来の研究の一部として参加者の合計ＩｇＡレベルを試験したが、しかしながら、参加者の間でそのような状態は検出されなかった。
放射性リガンド結合アッセイ（ＲＢＡ）を使用して、以前記載されたようにｔＴＧＡを評価した（（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２００１；２（２）：５８－６５）（Ａｇａｒｄｈ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ：１９９２）．２００４；９３（８）：１０４６－５１）。端的には、ヒト組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）は、３５Ｓ－メチオニン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ））の存在下でＴＮＴ ＳＰ６ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））を使用するｃＤＮＡのインビトロ転写および翻訳によって合成した。ＩｇＧ－ｔＴＧＡとＩｇＡ－ｔＴＧＡの両方を分析した。ＩｇＧ－ｔＴＧＡ分析のために、３５Ｓ－ｔＴＧを希釈し、ヒト血清に添加し、４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡセファロース（ＰＡＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用して、血清中のＩｇＧを結合させることによって遊離および抗体結合３５Ｓ－ｔＴＧを分離した。ＰＡＳおよび免疫沈降させた３５Ｓ－ｔＴＧ－血清を９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ ＤＶフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に添加し、プレートシェーカー上でインキュベートし、続いて洗浄した。ＯｐｔｉＰｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＴｒｉＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で反応性を測定した。ＰＡＳの代わりにヤギ抗ヒトＩｇＡアガロース（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したことを除いて、ＩｇＡ－ｔＴＧＡ分析を同様に実施した。ＴＧＡのレベルは、それぞれおよそ２、４、８、１６、３１、６３、１２５、２５０、５００、および１０００Ｕ／ｍＬのＩｇＡ－ｔＴＧＡおよびＩｇＧ－ｔＴＧＡを含有する標準曲線から計算したＵ／ｍＬとして表した。ＩｇＧ－ｔＴＧおよびＩｇＡ－のｔＴＧの正の値のカットオフレベルは、＞４．０Ｕ／ｍＬで設定し、これは３９８人の成人献血者の９９パーセンタイルに相当する（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ．２００４；９３（８）：１０４６－５１）。選択的なＩｇＡ欠乏が疑われるとき、元来の研究の一部として参加者の合計ＩｇＡレベルを試験したが、しかしながら、参加者の間でそのような状態は検出されなかった。
【0052】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ培養調製および治療製品の組成
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ培養物はＰｒｏｂｉ ＡＢ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって調製された。活性製品は、各株がそれぞれ等しく組み合わせられた１×１０１０ＣＦＵを含有する粉末形態で、マルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ ＩＴ－１９（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含むＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９（ＤＳＭ１５３１２）と組み合わせた、凍結乾燥したＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２（ＤＳＭ１３４３４）からなる。２つの試験製品（プロバイオティクスおよびプラセボ）の外観および味が同一であるように、プラセボは、色および味を調整するための粉末マルトデキストリンおよび酵母ペプトン（ＨＹＰ－Ａ、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ（Ｆｒａｎｃｅ））からなる。参加者には、製品を冷蔵庫に保管し、毎朝１グラムの製品のサシェを消費するように指示した。製品の有効性に関連するのは、濃度ではなく、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの合計ＣＦＵ（すなわち、組成物の単位質量または体積当たりのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの質量または数）であることが理解されるであろう。
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ培養物はＰｒｏｂｉ ＡＢ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって調製された。活性製品は、各株がそれぞれ等しく組み合わせられた１×１０１０ＣＦＵを含有する粉末形態で、マルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ ＩＴ－１９（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を含むＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９（ＤＳＭ１５３１２）と組み合わせた、凍結乾燥したＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２（ＤＳＭ１３４３４）からなる。２つの試験製品（プロバイオティクスおよびプラセボ）の外観および味が同一であるように、プラセボは、色および味を調整するための粉末マルトデキストリンおよび酵母ペプトン（ＨＹＰ－Ａ、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ（Ｆｒａｎｃｅ））からなる。参加者には、製品を冷蔵庫に保管し、毎朝１グラムの製品のサシェを消費するように指示した。製品の有効性に関連するのは、濃度ではなく、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの合計ＣＦＵ（すなわち、組成物の単位質量または体積当たりのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの質量または数）であることが理解されるであろう。
【0053】
フローサイトメトリー分析
単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
実施例１のコホートからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、親水性多糖（ＢＤ Ｖａｃ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製管ＮＣ ＦＩＣＯＬＬ（商標）４ｍＬ、カタログ番号３６２７６０ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＮＪ，ＵＳＡ））を使用する密度勾配遠心分離（１８００Ｇ）によって全血から分離した。細胞は、血液サンプル採取後２～２４時間以内に分離した。吸引された間期単核層を、Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（ＧＩＢＣＯ番号２１８７５０３４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ））で３回洗浄した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０中で１～４×１０６／ｍＬのリンパ球の最終濃度までＡｂｂｏｔｔ ＣＥＬＬ＿ＤＹＮ Ｒｕｂｙで計数した（すなわち、１ｍＬ当たり１～４×１０６リンパ球があるように、ＰＢＭＣ懸濁液の体積を調整した）。
単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
実施例１のコホートからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、親水性多糖（ＢＤ Ｖａｃ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製管ＮＣ ＦＩＣＯＬＬ（商標）４ｍＬ、カタログ番号３６２７６０ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＮＪ，ＵＳＡ））を使用する密度勾配遠心分離（１８００Ｇ）によって全血から分離した。細胞は、血液サンプル採取後２～２４時間以内に分離した。吸引された間期単核層を、Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（ＧＩＢＣＯ番号２１８７５０３４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ））で３回洗浄した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０中で１～４×１０６／ｍＬのリンパ球の最終濃度までＡｂｂｏｔｔ ＣＥＬＬ＿ＤＹＮ Ｒｕｂｙで計数した（すなわち、１ｍＬ当たり１～４×１０６リンパ球があるように、ＰＢＭＣ懸濁液の体積を調整した）。
【0054】
免疫染色プロトコル
概要
計数後、ＰＢＭＣを表面および細胞内構造に指向されたモノクローナル抗体で染色した。モノクローナル抗体（表２）を４つの蛍光色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で予め標識した。染色した細胞を、４色のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ））を使用してレーザービームを通過させることによって分析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）は細胞集団を定義し、サイズ、粒度、および蛍光強度の特徴的な特色によって細胞を計数する。光検出器は、光信号を増幅し電気データ信号に変換する。データを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
概要
計数後、ＰＢＭＣを表面および細胞内構造に指向されたモノクローナル抗体で染色した。モノクローナル抗体（表２）を４つの蛍光色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で予め標識した。染色した細胞を、４色のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ））を使用してレーザービームを通過させることによって分析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）は細胞集団を定義し、サイズ、粒度、および蛍光強度の特徴的な特色によって細胞を計数する。光検出器は、光信号を増幅し電気データ信号に変換する。データを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏ（登録商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【表2】
【表3】
【表4】
【0055】
ブロッキング
ＰＢＭＣを２本の管に分けた：管ＡにはＲＰＭＩ中約２～４×１０６リンパ球／ｍｌでＰＢＭＣをブロッキングし、管ＢにはブロッキングなしでＰＢＭＣを染色し、ＲＰＭＩの添加によって約１～２×１０６リンパ球／ｍｌに希釈した。管Ａ中のＰＢＭＣを、正常なヒトＩｇＧ（１／３４希釈）と共に遮光して２～８℃で１５分間インキュベートすることによってブロックした。
ＰＢＭＣを２本の管に分けた：管ＡにはＲＰＭＩ中約２～４×１０６リンパ球／ｍｌでＰＢＭＣをブロッキングし、管ＢにはブロッキングなしでＰＢＭＣを染色し、ＲＰＭＩの添加によって約１～２×１０６リンパ球／ｍｌに希釈した。管Ａ中のＰＢＭＣを、正常なヒトＩｇＧ（１／３４希釈）と共に遮光して２～８℃で１５分間インキュベートすることによってブロックした。
【0056】
直接染色（管１～１２）
上記の表の管１～１２に従った抗体混合物をＦＡＣＳ管（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、ＶＷＲカタログ番号３５２０５２）中に調製した。管ＡからのブロックしたＰＢＭＣを管９～１１に添加し、管ＢからのブロックしていないＰＢＭＣを管１～８および１２に添加した。ＦＡＣＳ管１～１２を穏やかにボルテックスし、遮光して２～８℃で３０分間インキュベートした。染色したＰＢＭＣを、２ｍｌの冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０－０１５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ））を添加し、穏やかにボルテックスし、遠心分離し（１０分間、４００×ｇ）、上清を捨てすることによって洗浄した。染色したＰＢＭＣを、２００μｌの冷たいＰＢＳ－１％ホルムアルデヒド溶液（３部のＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０－０１５に対して１部の４％ホルムアルデヒド溶液（Ａｐｏｔｅｋｅｔカタログ番号３４ ２４ ３６）に再懸濁し、遮光しで２℃～８℃で一晩インキュベートすることによって固定した。
上記の表の管１～１２に従った抗体混合物をＦＡＣＳ管（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、ＶＷＲカタログ番号３５２０５２）中に調製した。管ＡからのブロックしたＰＢＭＣを管９～１１に添加し、管ＢからのブロックしていないＰＢＭＣを管１～８および１２に添加した。ＦＡＣＳ管１～１２を穏やかにボルテックスし、遮光して２～８℃で３０分間インキュベートした。染色したＰＢＭＣを、２ｍｌの冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０－０１５、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ））を添加し、穏やかにボルテックスし、遠心分離し（１０分間、４００×ｇ）、上清を捨てすることによって洗浄した。染色したＰＢＭＣを、２００μｌの冷たいＰＢＳ－１％ホルムアルデヒド溶液（３部のＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏカタログ番号１００１０－０１５に対して１部の４％ホルムアルデヒド溶液（Ａｐｏｔｅｋｅｔカタログ番号３４ ２４ ３６）に再懸濁し、遮光しで２℃～８℃で一晩インキュベートすることによって固定した。
【0057】
ヒト制御性Ｔ細胞染色キット（管１３～１４）を用いた染色
ＦＡＣＳ管１３（上記表を参照）を、管Ｂからの１００μｌのブロックしていないＰＢＭＣで調製した。ＦＡＣＳ管１４（上記表を参照）を、２０μｌのＣＤ４ＦＩＴＣ／ＣＤ２５ＡＰＣカクテル、および管Ａからの１００μｌのブロックしたＰＢＭＣを用いて表面染色用に調製し、穏やかにボルテックスし、次いで遮光して２～８℃で３０分間インキュベートした。２ｍｌの冷たいＰＢＳを添加し、穏やかにボルテックスし、遠心分離し（５分間、４００×ｇ）、上清を捨てることによって、管１３および１４中のＰＢＭＣを洗浄した。管１３および１４中のＰＢＭＣを１ｍｌの固定／透過溶液（１部の固定／透過４Ｘ濃縮液および３部の固定／透過希釈液）に再懸濁し、遮光して２～８℃で一晩インキュベートすることによって固定した。
ＦＡＣＳ管１３（上記表を参照）を、管Ｂからの１００μｌのブロックしていないＰＢＭＣで調製した。ＦＡＣＳ管１４（上記表を参照）を、２０μｌのＣＤ４ＦＩＴＣ／ＣＤ２５ＡＰＣカクテル、および管Ａからの１００μｌのブロックしたＰＢＭＣを用いて表面染色用に調製し、穏やかにボルテックスし、次いで遮光して２～８℃で３０分間インキュベートした。２ｍｌの冷たいＰＢＳを添加し、穏やかにボルテックスし、遠心分離し（５分間、４００×ｇ）、上清を捨てることによって、管１３および１４中のＰＢＭＣを洗浄した。管１３および１４中のＰＢＭＣを１ｍｌの固定／透過溶液（１部の固定／透過４Ｘ濃縮液および３部の固定／透過希釈液）に再懸濁し、遮光して２～８℃で一晩インキュベートすることによって固定した。
【0058】
遠心分離（１０分間、４００×ｇ）して上清を捨て、２ｍｌの１Ｘ透過緩衝液（１部の１０Ｘ透過緩衝液および９部の蒸留水）に再懸濁し、穏やかにボルテックスし、先程の４つのステップを再び繰り返し、最後に再び遠心分離する（１０分、４００×ｇ）ことによって固定ＰＢＭＣ（管１３および１４）を洗浄および透過した。管１４中の透過したＰＢＭＣを、遮光して２～８℃で１５分間インキュベートすることによって２μｌの正常なラット血清でブロックした。２０μｌのラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照ＰＥを管１３に、２０μｌの抗ヒトＦｏｘＰ３ＰＥを管１４に添加し、続いて遮光して２～８℃で３０分間インキュベートすることによって、細胞内染色を実施した。染色したＰＢＭＣを２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、穏やかにボルテックスし、遠心分離し（１０分間、４００×ｇ）、フローサイトメトリー分析の前に２００μｌのＰＢＳ中に細胞を再懸濁する前に上清を捨てた。
【0059】
フローサイトメトリー分析
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）は、光学系内の単一の粒子または細胞の６つの異なるパラメータを検出することができる。この機器は、光散乱および蛍光強度をデジタルパルスに変換する。前方散乱（ＦＳＣ）はサイズの尺度を提供し、側面散乱（ＳＳＣ）は細胞質の粒度の尺度を提供する。この機器は、４色蛍光検出器を有する：青色（４８８ｎｍ）レーザーがＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３を検出し、追加の赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）がＦＬ４を検出する。
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）は、光学系内の単一の粒子または細胞の６つの異なるパラメータを検出することができる。この機器は、光散乱および蛍光強度をデジタルパルスに変換する。前方散乱（ＦＳＣ）はサイズの尺度を提供し、側面散乱（ＳＳＣ）は細胞質の粒度の尺度を提供する。この機器は、４色蛍光検出器を有する：青色（４８８ｎｍ）レーザーがＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３を検出し、追加の赤色ダイオードレーザー（６３５ｎｍ）がＦＬ４を検出する。
【0060】
機器の定期的なシステム清浄の後、３色のＣａｌｉＢＲＩＴＥ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ番号３４０４８６）およびＣａｌｉＢＲＩＴＥ ＡＰＣ Ｂｅａｄｓ（ＢＤ番号３４０４８７）を用いる較正チェック、ならびに光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧を設定し、検出器（ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、およびＦＬ４）の蛍光補正を調整および最適化するためのＡｕｔｏＣＯＭＰＴＭソフトウェアを実施した。ＣａｌｉＢＲＩＴＥビーズは正確なサイズのもので、未染色および染色された白血球を模した正確な量の蛍光色素で標識されている。ＡｕｔｏＣＯＭＰ（商標）ソフトウェアはＣａｌｉｂＦｉｌｅを生成する。すべてのモノクローナル抗体をＣａｌｉｂ Ｆｉｌｅ機器設定で予備滴定した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用してＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを実行した。上記の表に従って、各管について、３０００～１００００個の取得、採取、およびゲートされたリンパ球を測定した。
【0061】
アイソタイプが合致する対照抗体（ＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＣＤ４アイソタイプ（ＦＩＴＣ、ＰＥ、およびＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、およびＩｇＧ１アイソタイプ（ＡＰＣ）（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ ＵＳＡ））を使用して、ドットプロット四分円を設定し、混入している非リンパ球を差し引くことを通じてリンパ球集団のパーセントを計算した。リンパ球を同定し、側方散乱（細胞質粒度）およびＦＬ１パラメータ（ＦＩＴＣ陽性強度）ＣＤ３＋Ｔ－細胞を表示するドットプロットにゲートした。次いで、リンパ球の多色バックゲートをＦＳＣおよびＳＳＣドットプロットに示した。領域をこれらの同定されたリンパ球の周囲に設定した（リンパ球ゲート）。対象の染色されたモノクローナル抗体の異なる２つのパラメータの組み合わせ（ＦＬ１、ＦＬ２、ＦＬ３、およびＦＬ４）を用いてリンパ球ゲートから新しいドットプロットを表示し、次いで特徴的なサブセットを同定した。四分円を、アイソタイプ対照、陰性集団からの２つのパラメータのドットプロットに設定した。サブセットは、リンパ球ゲート内の四分円集団のパーセンテージとして報告する。リンパ球ゲート中の染色されていない陰性細胞を差し引いた。本明細書で使用される用語「白血球」とは、ＰＢＭＣ（すなわち、単離された細胞の合計集団）を意味する。
【0062】
具体的には、Ｔ細胞のサブグループ、ＣＤ４＋（Ｔｈ）、またはＣＤ８＋（Ｔｃ）細胞をリンパ球ゲートからゲートした。これらのゲートから、ナイーブ細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ４／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－として、記憶細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ４／ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋としてゲートした。活性化および分化されたエフェクター細胞および記憶細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ４／８＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＣＲ４＋ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＣＲ４＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ９＋β７＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ８＋β７＋ＣＣＲ９＋、ＣＤ４＋ＣＤ３８＋β７＋ＣＤ６２－としてゲートした。Ｂ細胞をＣＤ３－ＣＤ１９＋リンパ球と定義した。リンパ球ゲートから、ＣＤ４＋細胞をゲートし、続いてＣＤ２５＋細胞をゲートした。次いでこの集団のＦｏｘＰ３＋細胞の発現について調べた。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ゲートから、最も高いＣＤ２５発現を有するパーセント、ＣＤ４＋ＣＤ２５高を決定した。次いでＣＤ４＋ＣＤ２５高リンパ球集団の、ＦｏｘＰ３の発現についてさらに調べた。ＮＫ細胞をリンパ球ゲートからゲートした。このゲートから、ＮＫ細胞をＣＤ３－ＣＤ１６＋／ＣＤ５６＋細胞としてゲートした。
【0063】
リンパ球アッセイ領域は＞７０％のリンパ球を含有した。ＣＤ３＋Ｔ－細胞のアッセイ内分析は、３％の共分散を示し、ＣＤ３＋Ｔ細胞のアッセイ間分析は５％の共分散を示した。
【0064】
統計的分析
研究結果は、６か月後のｔＴＧ自己抗体の血清レベルの変化（量が不十分なために１人の小児を除外した）、ならびにＢ細胞、ＮＫ細胞、および制御性Ｔ細胞の亜集団の末梢血免疫応答の変化として評価した、セリアック病自己免疫である。二値変数のグループ間の比較は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定によって行った。連続的および順序付けたカテゴリーのデータにおけるグループ間の比較は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定によって行い、例えば、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を使用して、０、３、および６か月でプロバイオティクス治療グループとプラセボグループとの間のｔＴＧＡレベルを比較した。各グループ内でのｔＴＧＡレベルの経時変化を比較するために、連続変数でのＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付き順位検定を使用した。ＩｇＡ－ｔＴＧＡおよびＩｇＧ－ｔＴＧＡのレベルを別々のデータセットとして分析した。同様に、フローサイトメトリーによって分析されたパラメータについて、ベースラインから３か月および６か月で測定した変化に関して、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定をプロバイオティクス治療グループとプラセボとの間の比較に適用した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き順位検定を使用して、各グループ内の３か月および６か月でのベースラインからの差を測定した。ｔ－検定を使用してグループ間のＨＬＡ分布を比較した。
研究結果は、６か月後のｔＴＧ自己抗体の血清レベルの変化（量が不十分なために１人の小児を除外した）、ならびにＢ細胞、ＮＫ細胞、および制御性Ｔ細胞の亜集団の末梢血免疫応答の変化として評価した、セリアック病自己免疫である。二値変数のグループ間の比較は、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定によって行った。連続的および順序付けたカテゴリーのデータにおけるグループ間の比較は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定によって行い、例えば、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定を使用して、０、３、および６か月でプロバイオティクス治療グループとプラセボグループとの間のｔＴＧＡレベルを比較した。各グループ内でのｔＴＧＡレベルの経時変化を比較するために、連続変数でのＷｉｌｃｏｘｏｎの符号付き順位検定を使用した。ＩｇＡ－ｔＴＧＡおよびＩｇＧ－ｔＴＧＡのレベルを別々のデータセットとして分析した。同様に、フローサイトメトリーによって分析されたパラメータについて、ベースラインから３か月および６か月で測定した変化に関して、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定をプロバイオティクス治療グループとプラセボとの間の比較に適用した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き順位検定を使用して、各グループ内の３か月および６か月でのベースラインからの差を測定した。ｔ－検定を使用してグループ間のＨＬＡ分布を比較した。
【0065】
欠損データは帰属しなかった、すなわち分析は観察された症例についてのものである。脱退者の影響を避け、治療の比較を臨床試験の指示に完全に従った小児たちに限定するために、治療意志分析およびプロトコルごとの分析を実施した。報告されているすべてのｐ－値は両側であり、多重度に調整しなかった（すなわち、公称）。＜０．０５のｐ－値を統計的に顕著であるとみなした。統計的分析は、ＳｔａｔＸａｃｔバージョン１０．１（Ｃｙｔｅｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ））で実施した。
【0066】
結果－Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ株を用いる治療は、セリアック病自己免疫（ＣＤＡ）におけるｔＴＧＡ自己抗体を低減する。
合計１１８人の小児が選択基準を満たし、研究に参加するよう招待された。これらのうち、９０人（１人はＣｉＰｉＳ研究から、残りの８９人はＴＥＤＤＹ研究から）の小児とその保護者が研究参加に同意した。これらのうち１２人（１３％）が、最初の来診後研究を辞退した。ｔＴＧＡ分析を実施するには血液サンプルの量が不十分なため、１人の小児を除外した。プロバイオティクス治療グループで４０人（５２％）、プラセボグループで３７人（４８％）の合計７７人（８７％）の小児を最終的なデータセットにそれぞれ含んだ。これらのグループのベースライン特徴を表３に、ＨＬＡ分布を表３Ａに示す。研究期間の平均値および中央値は、それぞれ１８８日および１９０日であった（Ｑ１：１７６．５日、Ｑ３：２０３日、分布１５３～２３７日）。
１Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、両側；２Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定、両側
１Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定、両側
合計１１８人の小児が選択基準を満たし、研究に参加するよう招待された。これらのうち、９０人（１人はＣｉＰｉＳ研究から、残りの８９人はＴＥＤＤＹ研究から）の小児とその保護者が研究参加に同意した。これらのうち１２人（１３％）が、最初の来診後研究を辞退した。ｔＴＧＡ分析を実施するには血液サンプルの量が不十分なため、１人の小児を除外した。プロバイオティクス治療グループで４０人（５２％）、プラセボグループで３７人（４８％）の合計７７人（８７％）の小児を最終的なデータセットにそれぞれ含んだ。これらのグループのベースライン特徴を表３に、ＨＬＡ分布を表３Ａに示す。研究期間の平均値および中央値は、それぞれ１８８日および１９０日であった（Ｑ１：１７６．５日、Ｑ３：２０３日、分布１５３～２３７日）。
【表5】
【表6】
【表7】
【0067】
３か月後、ｔＴＧ－ＩｇＧのレベルは、ベースラインレベル（それぞれｐ＝０．０４６およびｐ＝０．０３４）と比較して、プロバイオティクスグループで平均２９．４±５１３Ｕ／ｍＬ減少し、プラセボグループで平均６．３±４８Ｕ／ｍＬ増加したが、３か月後にはグループ間でＩｇＡ－ｔＴＧレベルの顕著な差は観察されなかった。６か月後、ベースラインと比較して、プロバイオティクスグループでは、ＩｇＡ－ｔＴＧ（平均減少１０７．０±８５５Ｕ／ｍＬ、ｐ＝０．０１３）およびＩｇＧ－ｔＴＧ（平均減少８４．７±７４８Ｕ／ｍＬ、ｐ＝０．０６２）の両方でレベルが減少した一方で、プラセボグループでは反対のことが当てはまり、ＩｇＡ－ｔＴＧ（平均増加２５．０±１６１ＳＤＵ／ｍＬ、ｐ＝０．０４３）およびＩｇＧ－ｔＴＧ（平均増加５６．２±３４９Ｕ／ｍＬ、ｐ＝０．００８）の両方でのレベルの増加を示した。
【0068】
結果－Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ株およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ株を用いた治療は、ナチュラルキラーＴ細胞の割合を減少させ、ナチュラルキラー細胞の割合の増加を打ち消し、細胞傷害性Ｔ細胞におけるＣＤ６２Ｌ発現を低減する。
両方の研究グループにおいて、フローサイトメトリー分析を使用して、ベースライン時および各経過観察来診時の白血球集団のサイズおよび活性化状態の変化を調べた。
両方の研究グループにおいて、フローサイトメトリー分析を使用して、ベースライン時および各経過観察来診時の白血球集団のサイズおよび活性化状態の変化を調べた。
【0069】
表５は、２回目の経過観察来診時までに、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞として同定されたナチュラルキラーＴ（ＮＫ－Ｔ）細胞のパーセンテージが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療で減少し、この低減が、治療グループ内（ｐ＝０．０２９７）および治療グループとプラセボグループとの間で（ｐ＝０．００７９）統計的に顕著であったことを示す。表６は、６か月目の来診時までに、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として同定されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のパーセンテージが、プロバイオティクスグループと比較して、プラセボグループでは統計的に顕著に増加したことを示す（ｐ＝０．０３８１）。
【0070】
表７は、最初の経過観察来診（３か月目）においてのみ、プラセボグループで平均１．７４％（ｐ＝０．０１７）増加した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）の数を示す。表７Ａは、２回目の経過観察来診（６か月目）までにプラセボグループでは平均５．５５％（ｐ＝０．０３９）減少したゲートされたＴＨ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の割合を示す一方で、プロバイオティクスグループでは顕著な変化は観察されなかった。
【0071】
表７に加えて、表８および９のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の表面上のＣＤ６２Ｌの発現は、２回目の経過観察来診時のプラセボと比較して、プロバイオティクス治療では、より多くのＣＤ６２Ｌ低細胞傷害性Ｔ細胞（ｐ＝０．０８１５）およびより少ないＣＤ６２Ｌ高細胞傷害性Ｔ細胞（ｐ＝０．０７２９）への統計的傾向を示す。ＣＤ６２Ｌは、リンパ球の内皮細胞との相互作用に関与する細胞接着分子Ｌ－セレクチンであり、二次リンパ組織への侵入を助ける。細胞表面上のＣＤ６２Ｌの存在はナイーブ状態（ＣＤ６２Ｌ高）を示す一方で、細胞が活性化されるとそれらは表面からＣＤ６２Ｌを放出する（ＣＤ６２Ｌ低）。表９Ａはまた、２回目の経過観察来診時にプラセボグループにおいてより少ないＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ低細胞（平均０．８６％減少、ｐ＝０．０１４）を示す一方で、プロバイオティクスグループでは顕著な変化は観察されなかった。
【0072】
表７Ａに加えて、表９Ｂは、プラセボグループにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ低細胞の減少傾向（平均５．５５％の減少、ｐ＝０．０３９）を示す一方で、プロバイオティクスグループでは顕著な変化は観察されなかった。
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【0073】
結果－Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ株およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ株を用いた治療は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞）の活性化の増加およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の増加を予防する。
さらなるフローサイトメトリー分析は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋として同定されたＴヘルパー細胞に焦点を合わせ、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の亜集団は２つの研究グループ間で異なった。
さらなるフローサイトメトリー分析は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋として同定されたＴヘルパー細胞に焦点を合わせ、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の亜集団は２つの研究グループ間で異なった。
【0074】
表１０は、２回目の経過観察来診時（６か月目）のナイーブＴＨ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－）の集団が、プラセボグループにおいて平均４．７３％（ｐ＝０．００２）減少したことを示す。表１０はまた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療が、プラセボと比較してナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡ＋／ＲＯ－を含む細胞の割合におけるこの減少を予防したことを示す（Ｖ１－Ｖ０ではｐ＝０．０５３２、Ｖ２－Ｖ０ではｐ＝０．０２１７）。逆に、表１１は、記憶ＴＨ細胞の集団（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋）が２回目の経過観察来診（６か月目）までにプラセボグループにおいて、平均３．０７％（ｐ＝０．００３）増加したことを示す。表１１はまた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療は、プラセボと比較して記憶Ｔ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡ－／ＲＯ＋を含む細胞の割合におけるこの増加を予防したことを示す（Ｖ１－Ｖ０ではｐ＝０．０６５０、Ｖ２－Ｖ０ではｐ＝０．０１９８）。
【0075】
表１０Ａは、２回目の経過観察来診時（６か月目）のプラセボグループで、平均２．１７％（ｐ＝０．０３０）減少したナイーブＴＣ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－）集団を示す一方で、プロバイオティクスグループでは顕著な変化は観察されなかった。
【0076】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療はまた、プラセボと比較して記憶（ＣＤ４５ＲＯ＋）Ｔ－ヘルパー細胞のパーセンテージの増加を予防し（表１２～１５）、ＣＣＲ４を発現する記憶ＴＨ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ４＋）の割合の増加を予防した（プラセボグループは平均７．６３％の増加、ｐ＝０．００３、比較ｐ＝０．０１１０、表１５Ａ）。
【0077】
２回目の経過観察来診時の傾向では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療は、ＣＤ３８細胞外酵素および糖タンパク質細胞接着分子を発現するがＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）を発現しないＣＤ４＋ＣＤ３８＋ＣＤ６２Ｌ－Ｔヘルパー細胞の減少を予防する（表１６、ｐ＝０．０７５３）。治療はまた、２回目の経過観察来診時に観察されたＣＤ４＋ＣＣＲ９＋β７＋Ｔヘルパー細胞の減少を予防する（表１７、ｐ＝０．０３８２）。Ｔ細胞の表面上の（腸ホーミング受容体α４β７由来の）β７の発現は、腸ホーミング細胞の特徴とみなされる。
【0078】
表１８は、２回目の経過観察来診時までに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療が活性化Ｔヘルパー細胞の割合の増加を予防したことを示し、活性化はＣＤ２５、すなわちインターロイキン－２受容体アルファ鎖によって同定される。表１８Ａは、２回目の経過観察来診時（６か月目）までに、プラセボグループではナイーブＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞のパーセンテージが平均５．７２％（ｐ＝０．０１７９）減少した一方で、プロバイオティクスグループでは顕著な変化は観察されなかったことを示す。
【0079】
表１９はさらに、２回目の経過観察来診時までに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ治療が、高いＣＤ２５陽性（ＣＤ２５高）を有するＣＤ４＋細胞として同定されたＴ制御性細胞の割合の増加を予防したことを示す。
【0080】
表２０は、２回目の経過観察来診時までに、プラセボグループのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞のパーセンテージの増加の傾向（０．３２％の平均増加、ｐ＝０．０５２１）、およびプラセボと比較して全体的なプロバイオティクス治療の顕著な効果を示す（ｐ＝０．０２７５）。
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【表21】
【表22】
【表23】
【表24】
【表25】
【表26】
【表27】
【表28】
【表29】
【0081】
考察
この研究における重要性のうちの主な発見は、セリアック病自己免疫が継続している小児の通常の食事にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を使用することによって、ｔＴＧ自己抗体レベルの増加が遅延されることであった（図１および２）。これは、以前には一度も観察されたことがない早期活性型セリアック病自己免疫に対するプロバイオティクスサプリメントの抑制効果の信頼できる証拠を提示している。過去グルテン除去食のみが、ｔＴＧ自己抗体のレベルを効率的に低減することが示されてきた（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ．２００４；９３（８）：１０４６－５１）。セリアック病自己免疫に対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの効果は、Ｔ細胞の制御に関与する末梢血免疫応答の一貫した変化によってさらに裏付けられたが、これはプラセボグループの小児においてのみ観察された。興味深いことに、プラセボグループで見出されたほとんどのリンパ球サブセットの違いは、活性型セリアック病患者に見出されるものと類似していた。
この研究における重要性のうちの主な発見は、セリアック病自己免疫が継続している小児の通常の食事にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を使用することによって、ｔＴＧ自己抗体レベルの増加が遅延されることであった（図１および２）。これは、以前には一度も観察されたことがない早期活性型セリアック病自己免疫に対するプロバイオティクスサプリメントの抑制効果の信頼できる証拠を提示している。過去グルテン除去食のみが、ｔＴＧ自己抗体のレベルを効率的に低減することが示されてきた（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ．２００４；９３（８）：１０４６－５１）。セリアック病自己免疫に対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの効果は、Ｔ細胞の制御に関与する末梢血免疫応答の一貫した変化によってさらに裏付けられたが、これはプラセボグループの小児においてのみ観察された。興味深いことに、プラセボグループで見出されたほとんどのリンパ球サブセットの違いは、活性型セリアック病患者に見出されるものと類似していた。
【0082】
治療グループでは変化のないままであったが、プラセボグループのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ－細胞の増加は、活性化ＣＤ４＋細胞に対する２つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の下方制御効果によって説明することができた。プラセボグループのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞に観察された低減は、腸粘膜内のグルテン感受性リンパ球の区画化に続発すると考慮され得る。さらに、ＣＤ４５ＲＡを発現するナイーブＴＨ細胞は低減され、一方ＣＤ４５ＲＯを発現するエフェクターおよび記憶ＴＨ細胞のパーセンテージはプラセボグループでより高く、これは治療していないセリアック病患者に以前から観察されており、グルテンによって活性化された循環するＣＤ４５＋αβＴｃＲ＋およびγδＴｃＲ＋リンパ球の高いパーセンテージによって説明されてきた（Ｋｅｒｔｔｕｌａ ＴＯ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１１１（３）：５３６－４０）。この説明は、プラセボグループでＣＣＲ４も発現しているＣＤ４５ＲＯ＋細胞のパーセンテージの増加の発見によってさらに強化され、プライムされた制御性Ｔ－細胞の再循環を示唆している。ＣＣＲ４は、炎症の観点からＴ－細胞を動員するための重要なケモカイン受容体であり、分化した制御性Ｔ細胞上で高度に発現される（Ｉｅｌｌｅｍ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；３３（６）：１４８８－９６）。プラセボグループのＣＤ４＋ＣＤ２５高ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ４＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の増加は、以前に記載されたように継続している腸の炎症および食事に含まれるグルテン抗原に対する免疫応答を消炎しようとしていることを示す（Ｆｒｉｓｕｌｌｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；７０（６）：４３０－５；Ｔｉｉｔｔａｎｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１５２（３）：４９８－５０７）。
【0083】
特に関連性のある３番目の発見は、プロバイオティクスを受けている小児では観察されなかった進行中のセリアック病自己免疫を有するプラセボグループでの、ＮＫ細胞の末梢血の経時変化であった。活性型セリアック病では、ＮＫ細胞およびＮＫ－Ｔ細胞の集団が、組織および末梢血の両方において減少することが見出されている（Ｄｕｎｎｅ ＭＲ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１３；８（１０）：ｅ７６００８）。これは、ＮＫ細胞がプロバイオティクスグループで増加したが、プラセボグループでは増加しなかったことを見出した、この研究の発見と一致している。これはさらに、セリアック病におけるＮＫ細胞の重要性、およびプロバイオティクスサプリメントが末梢血での自己免疫応答の低減として反映されるＮＫ細胞に対する直接的または間接的な刺激効果を有し得ることを裏付けている。
【0084】
結論
要約すると、グループ間で免疫プロファイルを比較することによって、我々は、ｔＴＧ自己抗体のレベルの減少として反映される、セリアック病自己免疫に対する明確な抑制効果を同定することができた。この観察は、プラセボを受けた継続しているセリアック病自己免疫を有する小児において特に見られる、自己免疫制御に関与するＴリンパ球、およびＮＫ細胞の割合の末梢血の変化の一貫した変化によってさらに強化された。この新規の発見は、ヒト自己免疫疾患におけるプロバイオティクス細菌を用いる潜在的な新しい分野の治療的介入を提供する。
要約すると、グループ間で免疫プロファイルを比較することによって、我々は、ｔＴＧ自己抗体のレベルの減少として反映される、セリアック病自己免疫に対する明確な抑制効果を同定することができた。この観察は、プラセボを受けた継続しているセリアック病自己免疫を有する小児において特に見られる、自己免疫制御に関与するＴリンパ球、およびＮＫ細胞の割合の末梢血の変化の一貫した変化によってさらに強化された。この新規の発見は、ヒト自己免疫疾患におけるプロバイオティクス細菌を用いる潜在的な新しい分野の治療的介入を提供する。
【0085】
我々は、ＧＦＤの影響を受けずにＣＤ病理に関連する免疫学的変化を研究することを選択した。ＧＦＤを用いる治療は、ＣＤ患者のｔＴＧＡなどのいくつかの免疫学的マーカーに急速な変化を引き起こす。（Ｍｉｄｈａｇｅｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００４；２５６（６）：５１９－２４）、および（Ａｇａｒｄｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６；１４４（１）：６７－７５）。結果として、顕著に高いｔＴＧＡレベルが腸生検なしにＣＤの診断をするのに十分な証拠であり得ると述べている現在の診断ガイドラインに従って、研究参加のために＜３０Ｕ／ｍｌの低いカットオフ限界を利用した（Ｈｕｓｂｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．２０１２；５４（１）：１３６－６０したがって、継続している自己免疫の初期の兆候として低い初期ｔＴＧＡレベルを有する参加者のうちの大多数が研究に参加するという事実が予想され、我々の集団の固有の要素である。
【0086】
ＩｇＡ－ｔＴＧＡおよびＩｇＧ－ｔＴＧＡレベルの両方がＣＤの有効な診断試験であるが、現在の臨床勧告は、より高い特異性および臨床的関連性のため、正常な合計ＩｇＡレベルを有する小児へのＩｇＡ－ｔＴＧＡの使用を支持している（Ｈｕｓｂｙ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，前出）。
【0087】
この研究では、プロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ治療グループのＩｇＡ－ｔＴＧＡレベルの変化は、プラセボグループよりも顕著に低減された。実際、これは、招待から来診０までに高いレベルまで進行していた２人の小児の、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉで治療を受けた３か月および６か月後のＩｇＡ－ｔＴＧＡレベルが顕著に低減したことによって表され、プロバイオティクスがＣＤ自己免疫を用いて一部の小児に影響を及ぼし得たことを示している（データは示さず）。
【0088】
この臨床研究で使用された例示的なプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ９およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ８７００：２は、グルテンを含有する食事をとっている小児のＣＤ自己免疫に対する抑制効果を示した。これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株が「ＨＬＡ危険性のある」個体においてＣＤの自己免疫を予防および／または遅延させることができることを示しており、ＣＤにおけるプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉの予防的適用の可能性を示唆している。
【0089】
我々の知る限りでは、これは、プロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ種がＣＤの遺伝的危険性がある小児における継続しているＣＤ自己免疫の発症を遅延させ得るかまたは予防し得ることを評価し示す最初の介入研究である。これは、本発明のプロバイオティクスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株がＣＤＡからＣＤへの進行を遅延および／または予防するために使用することができることを示している。
【図1】
【図2】