特許 7089726 魚節由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンＳ及びＬ阻害組成物並びに前記組成物を含有する医薬組成物及び保健機能食品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-15

(45)【発行日】2022-06-23

(54)【発明の名称】魚節由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンＳ及びＬ阻害組成物並びに前記組成物を含有する医薬組成物及び保健機能食品

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/05 20060101AFI20220616BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20220616BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220616BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20220616BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220616BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220616BHJP

   A61P 19/02 20060101ALN20220616BHJP

   A61P 19/04 20060101ALN20220616BHJP

   A61P 19/08 20060101ALN20220616BHJP

【ＦＩ】

A61K38/05

A23L33/18

A61P3/10

A61P19/00

A61P35/00

A61P43/00 111

A61P19/02

A61P19/04

A61P19/08

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2017120636

(22)【出願日】2017-06-20

(65)【公開番号】P2019006683

(43)【公開日】2019-01-17

【審査請求日】2020-06-17

(73)【特許権者】

【識別番号】000114732

【氏名又は名称】ヤマキ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100194113

【弁理士】

【氏名又は名称】八木田 智

(74)【代理人】

【識別番号】100206069

【弁理士】

【氏名又は名称】稲垣 謙司

(72)【発明者】

【氏名】関 英治

(72)【発明者】

【氏名】藤原 佳史

(72)【発明者】

【氏名】朝田 仁

【審査官】原口 美和

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－１６４１３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，1998年，Vol. 8, No. 12，pp. 1537-1540

【文献】Food Chemistry，2013年，Vol. 141, No. 1，pp. 644-653

【文献】Journal of Molecular Graphics，1996年，Vol. 14, No. 4，pp. 213-216

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／０５

Ａ２３Ｌ ３３／１８

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３８／０５

Ａ２３Ｌ ３３／１８

Ａ６１Ｐ ３／１０

Ａ６１Ｐ １９／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｐ １９／０２

Ａ６１Ｐ １９／０４

Ａ６１Ｐ １９／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

魚節由来の組成物であって、有効成分としてトリプトファン－バリン（Ｔｒｐ－Ｖａｌ）又はその塩を、前記組成物の乾燥物に基づき０．００１～０．１質量％の量で含有することを特徴とする、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物。

【請求項2】

少なくとも３０００μｇ／ｍＬ（ＩＣ５０）のカテプシン阻害活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の組成物を含有することを特徴とするジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びLを阻害するための医薬組成物。

【請求項4】

請求項１又は２に記載の組成物を含有することを特徴とするジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びLを阻害するための保健機能食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、魚節由来の魚節由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物並びに前記組成物を含有する医薬組成物及び保健機能食品であって、従来から食材として用いられてきた安全性の高い魚節、例えば鰹節由来の前記組成物並びに医薬組成物及び保健機能食品に関する。

【背景技術】

【0002】

昨今、成人病、特に糖尿病を罹患する患者が増加しているが、糖尿病についてはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）阻害活性を有する物質を患者に投与することによって、それらの症状を和らげる試みが為されている。これは、インスリン分泌を増強するインクレチンを分解してしまうＤＰＰＩＶの活性を阻害することを原理とする。
ＤＰＰＩＶの阻害活性を有する物質として、以前は化学合成品が主流であったが、近年、安全性の点から、天然物又は食品由来のものが、具体的には天然又は食品由来のジ－、トリ－、又はオリゴ－ペプチドが、そのような物質として推奨されつつある。
例えば、本出願人による特許文献１は、食品である魚節、例えば鰹節由来のペプチドを含有するＤＰＰＩＶ阻害活性組成物に関し、当該組成物を投与することによって、ＤＰＰＩＶ活性を阻害して、血糖値を低下させ得ることを開示している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特許第５８７２７２５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

上記特許文献１に記載の発明は、生理活性としてＤＰＰＩＶ阻害活性のみを発現するペプチドを含有する組成物に関するものであるが、仮に、複数の生理活性を有する単一のペプチドが見出された場合、有効成分として当該ペプチドを投与することにより、同時に複数の疾病の治療又は予防が可能となると考えられる。
また、異なる生理活性を有する複数の有効成分を併用する必要がなくなるため、有効成分間の拮抗作用の懸念がなく、それぞれの活性効果が有効に発揮されることも期待される。
そのような有効成分が、食品由来のものから見出されれば、安全性も高く、且つ、単一の有効成分で複数の生理活性を発揮し得る効率の良い保健機能食品又は医薬品への用途が期待される。
そこで本発明は、食品、例えば魚節由来のペプチドから、そのような有効成分、及びそれを含有する組成物を見出すことを課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者は、鋭意研究の結果、比較的高いＤＰＰＩＶ阻害活性のみならず、カテプシン阻害活性をも同時に併せ持つ魚節由来のペプチド、及び当該ペプチドを含有する組成物を見出し、本発明を完成するに至った。
これまで、ＤＰＰＩＶ阻害活性とカテプシン阻害活性とを併せ持つ単一のペプチドの存在は知られていなかったため、この事実は非常に驚くべきことであった。

【0006】

即ち本発明は、魚節由来の組成物であって、有効成分としてトリプトファン－バリン（Ｔｒｐ－Ｖａｌ）又はその塩を、前記組成物の乾燥物に基づき０．００１～０．１質量％の量で含有することを特徴とするジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物に関する。
本発明の好ましい態様は、少なくとも３０００μｇ／ｍＬ（ＩＣ５０）のカテプシン阻害活性を有することを特徴とする、請求項１に記載のＤＰＰＩＶ阻害組成物に関する。
また本発明の別の態様は、前述のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物を含有することを特徴とする、医薬組成物又は保健機能食品に関する。

【0007】

カテプシンは、細胞内リソソームに含まれる蛋白分解酵素の一種であり、特にカテプシンＳ及びカテプシンＬと呼ばれるシステインプロテアーゼが結合組織の分解に関与していることが知られている〔エセール他，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３７（２），２３６（１９９４）〕。
そして、これらカテプシンの過剰な亢進が、変形性関節炎、リウマチ性関節炎、骨粗鬆症などの結合組織の破壊を伴う疾患（結合組織疾患と呼ぶ）又は骨吸収の阻害が指摘されている骨疾患の原因と考えられていることから、カテプシン阻害剤（システインプロテアーゼ阻害剤）はこれら疾患の予防又は治療に有効であると考えられている。
また、カテプシン阻害剤は、腫瘍（特に腫瘍浸潤及び腫瘍転位）、冠動脈疾患、アテローム性動脈硬化（アテローム性プラーク破壊及び不安定化を含む）を含むシステインカテプシン依存疾患及び症状の処置にも使用され得る。

【0008】

他方、ＤＰＰＩＶは、インスリン分泌を増強するインクレチンの分解酵素である。このＤＰＰＩＶを阻害することによって、インクレチンの分解が抑制され、血中のインクレチン濃度が上昇し、その結果、インスリン分泌が促進され、血糖値を低下させる。
従って、ＤＰＰＩＶ阻害剤は、抗糖尿病剤としての利用が期待される。

【0009】

本発明の組成物は、ＤＰＰＩＶ阻害活性及びカテプシン阻害活性の両方を併せ持っており、従って、血糖値上昇抑制剤としてだけでなく、結合組織疾患の予防及び治療剤、又は腫瘍抑制剤への用途としてもまた期待される。
この場合、医薬品はもちろんのこと、特定保健用食品などの保健機能食品への応用も可能である。
このような本発明の組成物は、下記のようにして、得ることができる。

【0010】

本発明の組成物は、おおまかにいうと、魚節を酵素分解した後、分離及び精製することにより得ることができるが、経済性の面から、魚節そのものよりも、魚節を熱水抽出した後に残存する魚節粕を利用するのが好ましい。
魚節は古くから食されてきた食材であり、安全性の面で非常に好ましい。本発明において用いられる魚節としては、例えば、鰹節、宗田鰹節、鯖節、鰯節、鯵節又は鮪節等を挙げることができる。これら魚節は、当業者に既知の手法により製造されたものであれば十分であり、もちろん市場に流通しているものでも構わない。

【0011】

魚節粕は、例えば、鰹節を適当に削ったものに水を加え、およそ５分間～６０分間の間、およそ５０℃以上の温度に、好ましくは８０℃～１００℃の温度に加熱し、熱水で抽出し他後、遠心分離等によって、上澄を除いた沈澱として得ることが出来る。このとき同時に得られた上澄は、そのまま食すことも、また調味料の成分として利用することもできる。

【0012】

得られた魚節粕はその後、適切なプロテアーゼにより、加水分解に付される。そのようなプロテアーゼは、安全性の観点から、食品工業用途のものが選択される。特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｉｚａｅ属より選択される菌株由来のプロテアーゼが好ましく、特に、スミチームＬＰ５０Ｄ （新日本化学工業社製；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ属；至適温度４５℃～６０℃（５０℃）；至適ｐＨ５～８（ｐＨ７））が好ましい。

【0013】

上記プロテアーゼは、本発明の完成のために本発明者らによって選択されたもので、食品工業用途であって安全性が高く、且つ、魚節粕を酵素分解したときに、より高いＤＰＰＩＶ阻害活性及びカテプシン阻害活性をその酵素分解組成物に付与し得る。

【0014】

上記プロテアーゼによる処理条件は、プロテアーゼの特性に合せて適宜選択すればよい。酵素量及び処理時間については、特に限定はないが、酵素量は０．１％～２％対原料タンパク質である。また、反応時間は２時間から２０時間が好ましい。また、反応温度は、３５℃～６０℃が好ましい。
なお、プロテアーゼ処理は、加熱等により酵素を失活させることで終了させることができる。また、酵素反応後のｐＨは、その後の市販適用のために中和することが望ましい。

【0015】

プロテアーゼ処理で得られたプロテアーゼ分解物は、そのまま公知の手段で濾過又は遠心分離にかけて、未分解物を除去し、清澄液（上澄）を得る。そして、収率よく高活性のＤＰＰＩＶ阻害活性及びカテプシン阻害活性が得られる観点から、得られた清澄液を濃縮等し、さらに凍結乾燥又は噴霧乾燥することが望ましい。さらに各種の精製方法に供することで、ＤＰＰＩＶの阻害活性及びカテプシン阻害活性をより高めた画分を得ることもできる。樹脂精製法で精製することも好ましい。

【0016】

樹脂精製法で使用する樹脂としては、例えば、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、多孔性樹脂、特殊樹脂（キレート樹脂、合成吸着剤、蛋白分離剤）等が挙げられるが、回収した画分の脱塩処理工程が不要であることから、合成吸着剤を用いるのが好ましい。合成吸着剤としては、例えば、芳香族（スチレン－ビニルベンゼン）系、芳香族系修飾型、アクリル（メタクリル）系等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0017】

また、樹脂精製法において、ＤＰＰＩＶ阻害成分及びカテプシン阻害成分を含むプロテアーゼ分解物の樹脂への吸着は、公知の手法により行えばよい。
次いで、吸着したプロテアーゼ分解物の溶離には、酸、アルカリ又は種々の有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコールや、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、アセトン等のケトン類を用いることできるが、これらに限定されるものではない。又は、酸、アルカリとの混合溶媒としてもよい。なお、経済性と安全性の点からは、濃度５０％以下のエタノール水溶液又は水を用いて溶離するのが好ましい。樹脂精製法は、バッチ法又はカラム法にて行うことができる。回収した画分は減圧又は限外濾過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。

【0018】

好ましくは、プロテアーゼ処理後に得られた清澄液を、精製した後、エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによる溶出にかける。これによって、ＤＰＰＩＶ阻害性及びカテプシン阻害活性の有効成分である、トリプトファン－バリン（Ｔｒｐ－Ｖａｌ）を含有する画分を効率的に得ることができる。

【0019】

なお本発明においては、メタノール、エタノール等の有機溶媒沈澱法によって、前記有機溶媒中に前記プロテアーゼ分解物を混合し、沈澱画分と上清画分を分離して、上清画分を回収することで、ＤＰＰＩＶ阻害活性及びカテプシン阻害活性の高い画分を得ることもできる。この場合、沈澱画分と上清画分とが分離するまでは有機溶媒混合物を静置することが好ましい。
なお、静置温度は低温で行うことが好ましい。また、回収した上清画分は減圧又は限外濾過により濃縮し、さらに必要に応じて溶媒を完全に除去して乾固するか凍結乾燥を行ってもよい。

【0020】

こうして得られた上清画分は、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物として、そのまま使用することもできるが、好ましくは水分約５質量％以下となるまで乾燥され得る。そして乾燥後の当該組成物中には、当該組成物の質量に基づき、Ｔｒｐ－Ｖａｌが少なくともおよそ０．００１質量％の量で、好ましくは少なくともおよそ０．０１質量％の量で、或いは概ね、０．００１～０．１質量％の量で、好ましくは０．０１～０．１質量％の量で、含有される。
このような本発明に係る組成物は、少なくともおよそ２００μｇ／ｍＬのＤＰＰＩＶ阻害活性値（ＩＣ５０）を有する（数値として２００＞）。一方で、少なくともおよそ３０００μｇ／ｍＬのカテプシン阻害活性値（ＩＣ５０）をも有する（数値として３０００＞）。
これらの阻害活性値は、本発明に係る組成物を保健機能食品用途として用いるには十分な数値であると考えられる。

【0021】

本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物は、飲料としてそのままでも又は種々の調味料との混合物としても、摂取できる。
また、本発明に係る組成物を含有する保健機能食品は、当該組成物を、１回の摂取量として１００ｍｇ～４００ｍｇ、好ましくは、１２０ｍｇ～３００ｍｇ添加して製造される。
さらにまた、本発明に係る組成物は、乾燥させることによって、取り扱いが容易で安定な固体ないし粉末形態とすることができ、当該形態の水への溶解性もよい。また、胃腸管からの吸収もよい。したがって、食品組成物への添加の時期、及び方法に特別の制限はなく、粉末状、溶液状、懸濁液状等として、食品組成物製造の原料段階、中間工程、最終工程に、食品分野で慣用の方法で添加することが可能である。

【0022】

保健機能食品、例えば特定保健用食品、栄養機能食品又は機能性表示食品の形態としては、固形状、半流動状、流動状、シート状、タブレットやカプセルなどの錠剤、顆粒粉末などを挙げることができる。
半流動状の形態としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状などが挙げられる。
また、流動状の形態としては、ジュース、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤などが挙げられる。
これら種々の形態の保健機能食品を、栄養ドリンクや調味料として、本発明の組成物を継続して摂取することにより、血糖の上昇を抑制し、及び／又は、結合組織疾患又は腫瘍を予防又は治療し得ることも期待できる。

【0023】

本発明のＤＰＰＩＶ阻害物を、医薬組成物として用いる場合には、例えば、患者のＤＰＰＩＶを阻害し、血糖上昇抑制作用を発揮させるために、高血糖症状の患者に食前に投与するとよく、そして本発明の医薬組成物の有効成分は、天然物である魚節由来であることから、継続して安全に使用することもできる。
医薬組成物としての形態は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ等の経口投与剤が好ましい。液剤は、用時溶解できる乾燥固体であってもよい。

【発明の効果】

【0024】

本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物は、血糖低下効能を有する他の製薬と比較して、ＤＰＰＩＶ阻害活性及びカテプシン阻害活性が適度に抑えられているため、副作用のおそれもより低く、特定保健用食品などの保健機能食品の有効成分としてより適するものといえる。
かような本発明に係る組成物は、哺乳動物の糖尿病、結合組織疾患又は腫瘍の予防又は治療用途として有用である。
また、本発明に係る組成物を、食品である魚節由来のものとすれば、安全性はさらに高まるため、保健機能食品としてより一層適するものであると言える。
また、本発明においては、一回のプロテアーゼ処理工程のみでジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物を得ることができるため、生産効率も高いという利点をも有する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物１２５ｍｇを経口投与したときの血糖値の変化を経時的に示したグラフである。

【図2】図２は、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物２５０ｍｇを経口投与したときの血糖値の変化を経時的に示したグラフである。

【図3】図３は、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物５００ｍｇを経口投与したときの血糖値の変化を経時的に示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

試験例１．ＤＰＰＩＶ阻害活性の測定方法
各試料のＤＰＰＩＶ阻害活性は、下記のとおり行った。
試料を凍結乾燥後、それらの１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ、２ｍｇ、１ｍｇを５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬにそれぞれ溶解し、そして得られた各試料溶液のＤＰＰＩＶ阻害活性を、ＤＰＰＩＶ阻害活性測定キット（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ製；Ｋ７８０－１００型）を用いて測定した。

【0027】

ＤＰＰＩＶを直線的な検量線が認められる反応時間の範囲において、所定の濃度に調製後、各Ｗｅｌｌに５０μＬずつ分取し、各試料（凍結乾燥品）を上記の濃度に調製後、２５μＬをＤＰＰＩＶが５０μＬ入った各Ｗｅｌｌに分注し（各試料の各濃度でｎ＝４回測定）、３７℃１０分間反応させた。

【0028】

次に、疑似サンプル基質(インクレチンホルモン)（Ｈ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－７－アミノ－４－メチルクマリン）を所定の濃度調整後、２５μＬを分注し、反応時間０～３０分の間、数回測定し、検量線直線が認められる反応時間間の増加率から、コントロール（阻害物質なし）と、各種試料の測定値から、ＤＰＰＩＶ測定阻害活性（％）を計算し、そのＤＰＰＩＶの５０％阻害活性が認められる各種試料濃度をＩＣ５０値として算出した。また、各試料の各濃度で４回測定し、得られた４回分のＩＣ５０値の平均値を算出し、これをＤＰＰＩＶ阻害活性（％）とした。
なお、ＤＰＰＩＶ阻害測定は、測定条件励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍの蛍光マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）にて測定した。

【0029】

試験例２．カテプシン阻害活性の測定方法
各試料のカテプシン阻害活性は、原則、下記のとおり行った。
カテプシンＬ又はカテプシンＳの含有溶液と試料（１ｍｇ）とを混合し、ｐＨ５．０にて３０分間反応させた。その後、Ｚ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－ＭＣＡを基質として加え、３７℃にて３０分間反応させた。その後、切断されたＡＭＣの蛍光を蛍光分光光度計にて測定した（なお、記号ＭＣＡは４－メチルクマリル－７－アミドの略称であり、記号ＡＭＣは７－アミノ－４－メチルクマリンの略称である）。

【0030】

実施例．本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物の製造
下記表１に示す通りの条件で、鰹節（鰹荒節）（タンパク質１６０ｋｇ）を熱水抽出した（表１）。

【表1】

【0031】

得られた鰹節粕（タンパク質７２質量％）に水１０倍量（対基質）及びスミチームＬＰ５０Ｄを加え、当該スミチームＬＰ５０Ｄの至適ｐＨ７に調節後、５０℃にて１６時間反応させた。そしてその後、９８℃、１５分間で失活させ、遠心分離（１５０００回転、５分間）した後、清澄液を得た（当該清澄液をＣ１と呼ぶ）。

【0032】

次に、得られたＣ１について、エタノール濃度１０％、２５％、５０％及び９９．５％のステップワイズグラジエントによるＤＰＰＩＶ阻害活性画分の分離を行った（表２）。
水溶出分画と、１０％エタノール溶出分画により、ＤＰＰＩＶ阻害活性を９倍の比率で分け得て、酵素分解物（Ｃ１）のＩＣ５０よりも３～４倍高いＩＣ５０＝１０２．９３μｇ／ｍＬの画分を得た（以降、この得られた画分をＡ－２画分と呼ぶ）。酵素分解物（Ｃ１）からの収率は、２０％量得られ、阻害活性の回収率は、約１００％であった。

【表2】

【0033】

得られたＡ－２画分を、下記条件にてＵＰＬＣクロマトグラフィーにかけて精製を行った。
用いたＵＰＬＣクロマトグラフィーの分析条件は、下記のとおりである。
装置：Ｗａｔｅｒｓ製 ＵＰＬＣ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ製 Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（２．１ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ，１．７μｍ）
移動相Ａ：５％アセトニトリル ｉｎ ０．１％トリフルオロ酢酸
Ｂ：２５％アセト二トリルｉｎ ０．１％トリフルオロ酢酸 のイソクラティ
ック溶出
なお、移動相Ａ，Ｂの割合は、下表３及び４の通りである。
流速：０．２ｍＬ／分
温度：４０℃
検出器：フォトダイオードアレイ
検出：ＵＶ２００ｎｍ～３００ｎｍ
試料濃度：固形分０．１ｍｇ～０．５ｍｇ／５～１０μＬ
標品（合成ジペプチド）濃度：０．１μｇ／１～１０μＬ

【表3】

【表4】

【0034】

各画分を、アセトニトリル濃度を変えて、複数回繰り返し分取して精製度を上げた（表５）。

【表5】

【0035】

そして、ＵＰＬＣリクロマトグラフィー（３回目）により得られた画分の組成物について、Ｎ末端アミノ酸配列解析に付した（プロテインシーケンサー：ＰＰＳＱ－３３Ａ；株式会社島津製作所）。その結果、トリプトファン－バリン（Ｔｒｐ－Ｖａｌ）のアミノ酸配列から成るペプチドが同定された。

【0036】

また一方で、Ａ－２画分中のＴｒｐ－Ｖａｌの含有量を測定したところ、当該画分の乾燥質量（水分量５質量％以下）に基づき、１５．２４ｍｇ／１００ｇであった。

【0037】

さらにまた、当該Ｔｒｐ－ＶａｌのＤＰＰＩＶ阻害活性を、上記試験例１に記載のとおりに測定したところ、ＩＣ５０値は３６．９９μＭ（１１．２１μｇ／ｍＬ）であった。
また、Ａ－２画分のＤＰＰＩＶ阻害活性は、上記表２に示すとおり、１０２．９３μｇ／ｍＬ（ＩＣ５０）であった。

【0038】

測定例．本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物のヒト経口試験
上記実施例において得られた、本発明に係る組成物（Ａ－２画分の乾燥物；水分量５質量％以下）についてヒト経口投与試験を行い、血糖値低下を有する保健機能食品として適した投与量の検討を行った。
被験者Ａ、Ｂ及びＣの３名（いずれも年齢５０～６０代の男性）に対して、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物の体内蓄積による影響がないように、まずは、白湯（ペプチドを含まないプラセボ）の摂取試験を一日目に行い、プラセボ効果が消える翌日にジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物を摂取した。夕食を早めに行い、食事の影響が無いように試験時まで絶食した。

【0039】

糖負荷血糖上昇抑制作用のプロトコールは以下の通りである。
１日目 １８時間絶食後、プラセボ（白湯１５０ｍＬ）摂取３０分後、グルコース摂取時から１５分毎に１８０分まで、血糖値を測定した。
２日目 １８時間絶食後、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物（１２５ｍｇ／１５０ｍＬ，２５０ｍｇ／１５０ｍＬ，５００ｍｇ／１５０ｍＬ）摂取３０分後、グルコース摂取時から１５分毎に１８０分まで、血糖値を測定した。
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物の摂取量は、被験者Ａ、Ｂ及びＣに対して下記のとおり割り当てた。なお、今回は、２重盲検対照比較試験ではなく、プラセボ、血糖ペプチドをオープン識別して摂取した。
被験者Ａ：一日目プラセボ１５０ｍＬ摂取～二日目ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物１２５ｍｇ／１５０ｍＬ摂取
被験者Ｂ：一日目プラセボ１５０ｍＬ摂取～二日目ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物２５０ｍｇ／１５０ｍＬ摂取
被験者Ｃ：一日目プラセボ１５０ｍＬ摂取～二日目ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物５００ｍｇ／１５０ｍＬ摂取

【0040】

試験中、各被験者から採血し、それらの血糖値をプロット、グラフ化した（図１～図３）。
縦軸は血糖値を示し、そして横軸は摂取前後の時間を示し、プラセボを白丸、血糖ペプチドは黒丸で示した。
その結果、本発明に係るジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物は、少量で有意な効果及び用量依存性を有することが示された（図１及び２）。安全性は動物実験の結果から最大安全性反復量１ｇ／ｋｇを上限にして設定したが、 図３からも明らかなように、高用量の５００ｍｇ／ヒトは、血糖値の抑制作用がやや効きすぎである結果が示された。

【0041】

全ての摂取量にて、ヒトにおいて、糖負荷血糖上昇抑制作用が認められたことから、下記のことが考察できる。
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物１２５ｍｇ場合は、一錠固形２５０ｍｇ直径８ｍｍ（１２５ｍｇジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物、賦形剤１２５ｍｇ）の品質で、１錠の商品設計が可能であることが分かった。
また、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物２５０ｍｇの場合は、一錠固形２５０ｍｇ直径８ｍｍ（１２５ｍｇジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物、賦形剤１２５ｍｇ）の品質で、２錠の商品設計が可能であることが分かった。
なお、血糖ペプチド５００ｍｇの場合は、結果から、やや効きすぎによる作用が懸念された。
よって、保健機能食品としては、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）並びにカテプシンS及びL阻害組成物１２５ｍｇ～２５０ｍｇの範囲内が好ましいとと判断された。
対照としての従来の血糖値低下作用を示す組成物、例えば、難消化性デキストリンでの同様のヒト試験による結果においては、一度の投与で５ｇを用いなければ有意の効果が得られなかったことを考慮すると、本発明の組成物の上記効果はそのおよそ４０倍の強さであった。

【0042】

全ての摂取量にて、ヒトにおいて、糖負荷血糖上昇抑制作用が認められたことから、下記のことが考察できる。
ＤＰＰＩＶ阻害組成物１２５ｍｇ場合は、一錠固形２５０ｍｇ直径８ｍｍ（１２５ｍｇＤＰＰＩＶ阻害組成物、賦形剤１２５ｍｇ）の品質で、１錠の商品設計が可能であることが分かった。
また、ＤＰＰＩＶ阻害組成物２５０ｍｇの場合は、一錠固形２５０ｍｇ直径８ｍｍ（１２５ｍｇＤＰＰＩＶ阻害組成物、賦形剤１２５ｍｇ）の品質で、２錠の商品設計が可能であることが分かった。
なお、血糖ペプチド５００ｍｇの場合は、結果から、やや効きすぎによる作用が懸念された。
よって、保健機能食品としては、ＤＰＰＩＶ阻害組成物１２５ｍｇ～２５０ｍｇの範囲内が好ましいとと判断された。
対照としての従来の血糖値低下作用を示す組成物、例えば、難消化性デキストリンでの同様のヒト試験による結果においては、一度の投与で５ｇを用いなければ有意の効果が得られなかったことを考慮すると、本発明の組成物の上記効果はそのおよそ４０倍の強さであった。

【図1】

【図2】

【図3】