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特許7090357チョウザメの性別を同定するための、プライマーセット、キット、ならびにマイクロＲＮＡ血清マーカー及びプライマーセットの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-16
(45)【発行日】2022-06-24
(54)【発明の名称】チョウザメの性別を同定するための、プライマーセット、キット、ならびにマイクロＲＮＡ血清マーカー及びプライマーセットの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220617BHJP
C12Q 1/6879 20180101ALI20220617BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220617BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6879 Z
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021027320
(22)【出願日】2021-02-24
(65)【公開番号】P2021171052
(43)【公開日】2021-11-01
【審査請求日】2021-02-24
(31)【優先権主張番号】202010314533.2
(32)【優先日】2020-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】516168849
【氏名又は名称】広東省科学院動物研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】張 秀娟
(72)【発明者】
【氏名】陳 金平
(72)【発明者】
【氏名】呉 文化
(72)【発明者】
【氏名】周 佳濱
(72)【発明者】
【氏名】李 林妙
(72)【発明者】
【氏名】江 海英
【審査官】進士 千尋
(56)【参考文献】
【文献】Comparative Biochemistry and Physiology, Part D, 2016, Vol.18, pp.54-61
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／６８７９
Ｃ１２Ｑ １／６８６
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロＲＮＡ血清マーカーを検出するためのプライマーセットであって、
前記マイクロＲＮＡ血清マーカーは、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃであり、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの塩基配列が配列番号２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの塩基配列が配列番号３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの塩基配列が配列番号８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの塩基配列が配列番号１１に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーであり、
前記マイクロＲＮＡ血清マーカーを検出するための検出プライマーを含み、前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの検出プライマーは次の通りである：
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１６に示され、
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１７に示され、
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１８に示され、
前記ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーが配列番号１９に示され、
リバースプライマーがユニバーサルリバースプライマーであり、配列が配列番号２０に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するための検出プライマーセット。
【請求項2】
チョウザメの性別を同定するキットの調製における検出標的としてのマイクロＲＮＡ血清マーカーの使用であって、
前記マイクロＲＮＡ血清マーカーは、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃであり、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの塩基配列が配列番号２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの塩基配列が配列番号３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの塩基配列が配列番号８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの塩基配列が配列番号１１に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーである、
使用。
【請求項3】
チョウザメの性別を同定するキットの調製における請求項１に記載の検出プライマーセットの使用。
【請求項4】
チョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーの含有量を検出するための試薬を含む、チョウザメの性別を同定するキットであって、
前記マイクロＲＮＡ血清マーカーは、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃであり、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの塩基配列が配列番号２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの塩基配列が配列番号３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの塩基配列が配列番号８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの塩基配列が配列番号１１に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーであり、
請求項１に記載の検出プライマーセットを含む、
チョウザメの性別を同定するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、チョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカー、プライマーセット、キット及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
チョウザメは非常に貴重な魚類で、チョウザメの魚卵から作られたキャビアは、人体の必須アミノ酸、多くの不飽和脂肪酸、ビタミンなどの物質を大量に含み、栄養価値が非常に高く、「黒い黄金」の美称があり、２０１３年にその国際販売価格は１キログラム当たり８００～９００ドルに達し、そのため雌性チョウザメは雄性チョウザメより更に高い経済価値を持っている。現在、チョウザメの養殖とキャビアの生産は新興産業として、中国での発展は非常に急速で、初歩的な統計により、中国のチョウザメ商品魚養殖の年間生産量はすでに２万トンを突破し、世界のチョウザメの総生産量の６６．１７％を占め、養殖の総生産量の７２．４６％を占め、すでに最大のチョウザメの養殖国と主要なキャビアの輸出国となり、巨大な市場の潜在力を持っている。例えば、アムールチョウザメ（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ ｓｃｈｒｅｎｃｋｉｉ）は中国黒竜江水系の特有の希少で貴重な大型経済魚類である。アムールチョウザメの人工繁殖は１９世紀３０年代に始まり、成長速度が速く、抗病力と適応性が高いなどという利点があるため、前世紀９０年代以来、チョウザメ養殖産業においてチョウザメの交雑親とキャビアを生産するチョウザメの養殖産業における重要な養殖品種の１つとなっている（Ｗｅｉら、２０１１年）。養殖において、早期にアムールチョウザメの性別をスクリーニングすることができれば、雌、雄群体に対して方向性選別育成を行うことができ、より高い経済的効果を得ることができる。しかし、チョウザメの雌雄性個体間には青年期ひいては成人期にも明らかな第二性徴がなく、形態的には雌雄を判別することができず、且つ性成熟時間が長い。雌雄性別に従ってそれぞれ集約化養殖又は一定の性別比率で飼育することができないため、雄性個体を過度に飼育するという資源の浪費をもたらし、養殖コストを増加させ、チョウザメ養殖産業化の急速な発展を阻害している。そのため、チョウザメの性別同定の新技術は現在チョウザメ養殖産業の持続可能化発展の重点注目分野である。
【0003】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長さが２２ｂｐ前後で、高度に保存されている非コード小分子ＲＮＡであり、主に標的遺伝子の３’末端非翻訳領域（３’ＵＴＲ）との完全又は不完全な対合によって、標的遺伝子を分解し又はその翻訳を抑制し、それにより広範な生命活動過程に関与し、成長、分化、発育、腫瘍発生および配偶子の形成などを含む（Ａｍｂｒｏｓ、２００４；Ｒｙａｚａｎｓｋｙら、２０１４年）。ｍｉＲＮＡは血清中に長期間安定的に存在し、ＲＮａｓｅによって分解されにくく、煮沸、繰り返し凍結融解、酸アルカリ環境、長期保存などの極端な条件は、すべて血清ｍｉＲＮＡの損失を引き起こさない。さらに重要なのは、最近の研究により、血清中のｍｉＲＮＡ発現スペクトルの変化が腫瘍の組織と密接に関連し、腫瘍の状態を提示することができることが示され、そのため、ｍｉＲＮＡは、癌の早期診断、悪性等級分け、個性化診療および予後判断に用いられる有効な腫瘍マーカーの新技術として、重点的に注目され、ひいてはｍｉＲＮＡを腫瘍治療の標的として、臨床薬品の使用を指導することができる。
【0004】
最近の研究により、性別決定と分化遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡは、動物の雌雄二型性特徴の形成において正確で有効で重要な調節作用を発揮していることが示された（Ｒｙａｚａｎｓｋｙ ｅｔら、２０１４年；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｐｅｒｅｚら、２０１８年）。例えば、マウスでは、ｍｉＲ－１２４が精巣分化を制御するＳｏｘ９遺伝子（ＳＲＹ－ｂｏｘ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｅｎｅ ９）は、卵巣細胞の運命を決定する（Ｒｅａｌら、２０１３年）；ｍｉＲ－２０２－５ｐ／３ｐは、Ｓｏｘ９遺伝子の上流の制御により精巣分化に作用する（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら、２０１３年）；ｍｉＲ－１９ａ／ｂ標的性別決定因子Ｄｍｒｔ１（ｄｏｕｂｌｅｓｅｘ ａｎｄ Ｍａｂ－３ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １）は、性逆転に作用する（Ｌｉｕら、２０１５年）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の第１目的は、チョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーを提供することであり、前記マーカーはａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの組み合わせであり、各マイクロＲＮＡの塩基配列は次の通りである：
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ：ＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣ（配列番号２）。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ：ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧ（配列番号３）。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ：ＣＡＧＵＧＣＡＡＵＡＵＵＡＡＡＡＧＧＧＣＡＵ（配列番号８）。
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ：ＡＧＧＣＡＧＵＧＣＡＧＵＵＡＧＵＵＧＡＵＵＡＣ（配列番号１１）。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ：ＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣ（配列番号２）。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ：ＵＵＵＧＧＵＣＣＣＣＵＵＣＡＡＣＣＡＧＣＵＧ（配列番号３）。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ：ＣＡＧＵＧＣＡＡＵＡＵＵＡＡＡＡＧＧＧＣＡＵ（配列番号８）。
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ：ＡＧＧＣＡＧＵＧＣＡＧＵＵＡＧＵＵＧＡＵＵＡＣ（配列番号１１）。
【0006】
本発明の第２目的は、前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを検出するための検出プライマーを含むチョウザメの性別を同定する検出プライマーセットを提供することである。
好ましくは、前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの検出プライマーは次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１６に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１７に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーは配列番号１９に示され、
リバースプライマーがユニバーサルリバースプライマーであり、塩基配列が配列番号２０に示される。
好ましくは、前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの検出プライマーは次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１６に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１７に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーは配列番号１９に示され、
リバースプライマーがユニバーサルリバースプライマーであり、塩基配列が配列番号２０に示される。
【0007】
本発明の第３目的は、チョウザメの性別を同定するキットの調製における検出標的としての上記マイクロＲＮＡ血清マーカーの使用を提供することである。
【0008】
本発明の第４目的は、チョウザメの性別を同定するキットの調製における上記検出プライマーセットの使用を提供することである。
【0009】
本発明の第５目的は、前記チョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーの含有量を検出するための試薬を含むチョウザメの性別を同定するためのキットを提供することである。
【0010】
前記キットは、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの検出プライマーを含み、具体的には次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１６に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１７に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーは配列番号１９に示され、
リバースプライマーはユニバーサルリバースプライマーであり、配列番号が配列番号２０に示される。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１６に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１７に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーは配列番号１８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーは配列番号１９に示され、
リバースプライマーはユニバーサルリバースプライマーであり、配列番号が配列番号２０に示される。
【0011】
好ましくは、逆転写ステムループプライマーをさらに含み、具体的には次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの逆転写ステムループプライマーは配列番号１２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーは配列番号１３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーは配列番号１４に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの逆転写ステムループプライマーは配列番号１５に示される。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの逆転写ステムループプライマーは配列番号１２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーは配列番号１３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーは配列番号１４に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの逆転写ステムループプライマーは配列番号１５に示される。
【0012】
前記キットは、ＰＣＲ技術で一般的に使用される試薬をさらに含む。
【発明の効果】
【0013】
先行技術と比較すると、本発明の利点は次の通りである。
本発明は、チョウザメの性別を同定するために新規な検出方法を提供する。本発明は、従来技術と比較すると、血漿／血清中の性別に関連する、安定的なマイクロＲＮＡを検出し、定量的検出には、ｍｉＲＮＡの定量感度と特異性が非常に高い、リアルタイム定量ＰＣＲ技術を採用することにより、チョウザメの雌雄性別を効果的に区別することができる。本発明のチョウザメの性別を同定するためのリアルタイム定量ＰＣＲ ｍｉＲＮＡ検出キットのチップ法による検出は、その検出率が８０％に達し、未知の若齢チョウザメサンプルの雌雄を効果的に区別することができ、当該チョウザメの種類はアムールチョウザメに限定されず、シベリア交雑チョウザメのような他の種類のチョウザメに対しても高い検出率がある。また、本発明によるチョウザメの性別同定は、チョウザメの器官を切断してＤＮＡを取得する必要がなく、チョウザメへのダメージがきわめて低い。本発明の方法は操作が簡単で、再現性が高く、チョウザメの性別を効率的に早期に同定する技術分野における新しい突破口であり、普及と使用に適しており、チョウザメ養殖産業における生産コストが高く、効率が低いなどという産業発展を厳しく制約する問題を根本的に解決する。
本発明は、チョウザメの性別を同定するために新規な検出方法を提供する。本発明は、従来技術と比較すると、血漿／血清中の性別に関連する、安定的なマイクロＲＮＡを検出し、定量的検出には、ｍｉＲＮＡの定量感度と特異性が非常に高い、リアルタイム定量ＰＣＲ技術を採用することにより、チョウザメの雌雄性別を効果的に区別することができる。本発明のチョウザメの性別を同定するためのリアルタイム定量ＰＣＲ ｍｉＲＮＡ検出キットのチップ法による検出は、その検出率が８０％に達し、未知の若齢チョウザメサンプルの雌雄を効果的に区別することができ、当該チョウザメの種類はアムールチョウザメに限定されず、シベリア交雑チョウザメのような他の種類のチョウザメに対しても高い検出率がある。また、本発明によるチョウザメの性別同定は、チョウザメの器官を切断してＤＮＡを取得する必要がなく、チョウザメへのダメージがきわめて低い。本発明の方法は操作が簡単で、再現性が高く、チョウザメの性別を効率的に早期に同定する技術分野における新しい突破口であり、普及と使用に適しており、チョウザメ養殖産業における生産コストが高く、効率が低いなどという産業発展を厳しく制約する問題を根本的に解決する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】蛍光定量ＰＣＲによって雌性、雄性アムールチョウザメ血清における３６個のｍｉＲＮＡの発現を検出する。
【図2】１１種類のｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線である。
【図3】９６穴ＰＣＲプレート（即ちチョウザメの性別同定の蛍光定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出チップ）における検出プライマーの配置である。略称は、それぞれＡｍ１３３（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ）、Ａｍ１３３ａ（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ）、Ａｍ１３０（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ）、Ａｍ３４ｃ（ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ）、Ｕ６（内部参照遺伝子Ｕ６）、５Ｓ（５Ｓ ｒＲＮＡ）の遺伝子を表す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下の実施例は、本発明の更なる説明であり、本発明を限定するものではない。
本発明は、ハイスループット小ＲＮＡシーケンシング技術とマイクロＲＮＡチップ技術を利用し、３齢のアムールチョウザメ性腺（精巣と卵巣）の差次的に発現するｍｉＲＮＡのタイプと発現量をスクリーニングし、その中の３６個のｍｉＲＮＡをスクリーニングしてアムールチョウザメ性別を同定する血清ｍｉＲＮＡマーカーに使用し、通常の血清ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡの取得及びリアルタイム定量ＰＣＲなどの技術集合によって、アムールチョウザメの性別同定のための血清ｍｉＲＮＡマーカーの新しい方法を確立し、且つ低年齢チョウザメの中で検証することにより、チョウザメ養殖産業の性別同定の困難度をある程度で解決することができ、チョウザメ養殖産業の持続可能性とグリーンで健康な発展を促進して支援することができる。
本発明は、ハイスループット小ＲＮＡシーケンシング技術とマイクロＲＮＡチップ技術を利用し、３齢のアムールチョウザメ性腺（精巣と卵巣）の差次的に発現するｍｉＲＮＡのタイプと発現量をスクリーニングし、その中の３６個のｍｉＲＮＡをスクリーニングしてアムールチョウザメ性別を同定する血清ｍｉＲＮＡマーカーに使用し、通常の血清ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡの取得及びリアルタイム定量ＰＣＲなどの技術集合によって、アムールチョウザメの性別同定のための血清ｍｉＲＮＡマーカーの新しい方法を確立し、且つ低年齢チョウザメの中で検証することにより、チョウザメ養殖産業の性別同定の困難度をある程度で解決することができ、チョウザメ養殖産業の持続可能性とグリーンで健康な発展を促進して支援することができる。
【0016】
（実施例１）
１．アムールチョウザメ性腺差異発現ｍｉＲＮＡのスクリーニング
｜Ｌｏｇ２（ＦＣ）｜＞２ （ＦＣ、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）のアムールチョウザメ性腺差異発現ｍｉＲＮＡと性腺特異性保存発現ｍｉＲＮＡ（ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｂとｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ）を、ファミリー類似性が１００％のｍｉＲＮＡを除去し、３６個のｍｉＲＮＡを保持する。ｍｉＲＮＡ遺伝子情報リストを表１に示す。
１．アムールチョウザメ性腺差異発現ｍｉＲＮＡのスクリーニング
｜Ｌｏｇ２（ＦＣ）｜＞２ （ＦＣ、ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）のアムールチョウザメ性腺差異発現ｍｉＲＮＡと性腺特異性保存発現ｍｉＲＮＡ（ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｂとｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ）を、ファミリー類似性が１００％のｍｉＲＮＡを除去し、３６個のｍｉＲＮＡを保持する。ｍｉＲＮＡ遺伝子情報リストを表１に示す。
【0017】
【表1】
【0018】
２．血清の採取
１ロットの３齢アムールチョウザメを取り、その体重、体長、全長を測り、性腺組織のパラフィンスライスを作製した。ヘマトキシリンエオシン染色法で組織観察を行い、性別を正確に判定した。尾部静脈で採血し、１．５ｍＬの無菌ＥＰチューブに入れ、室温で３０分間静置し、低温遠心分離機で３５００ｒｍｐで１５分間遠心分離した。分離した血清を収集し、－８０℃の冷蔵庫で保存し、最後に性別が決定されたシュチョウザメ３０尾（雌性個体１５尾と雄性個体１５尾）の血清を選択して次のステップに使用する。
１ロットの３齢アムールチョウザメを取り、その体重、体長、全長を測り、性腺組織のパラフィンスライスを作製した。ヘマトキシリンエオシン染色法で組織観察を行い、性別を正確に判定した。尾部静脈で採血し、１．５ｍＬの無菌ＥＰチューブに入れ、室温で３０分間静置し、低温遠心分離機で３５００ｒｍｐで１５分間遠心分離した。分離した血清を収集し、－８０℃の冷蔵庫で保存し、最後に性別が決定されたシュチョウザメ３０尾（雌性個体１５尾と雄性個体１５尾）の血清を選択して次のステップに使用する。
【0019】
３．血清ｍｉＲＮＡの抽出と逆転写
抽出キット：ＴＩＡＮＧＥＮ社のｍｉＲｃｕｔｅ血清／血漿ｍｉＲＮＡ抽出分離キット（ＤＰ５０３）は、試薬説明書に従って操作し、性別が決定されたシュチョウザメ３０尾（雌性個体１５尾と雄性個体１５尾）の血清のｍｉＲＮＡを抽出し、紫外分光光度計を使用してｍｉＲＮＡの濃度と純度を検出した。
抽出キット：ＴＩＡＮＧＥＮ社のｍｉＲｃｕｔｅ血清／血漿ｍｉＲＮＡ抽出分離キット（ＤＰ５０３）は、試薬説明書に従って操作し、性別が決定されたシュチョウザメ３０尾（雌性個体１５尾と雄性個体１５尾）の血清のｍｉＲＮＡを抽出し、紫外分光光度計を使用してｍｉＲＮＡの濃度と純度を検出した。
【0020】
逆転写：統一量に従い、ＴＩＡＮＧＥＮ社のｍｉＲｃｕｔｅ増強型ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡファーストストランド合成キット（ＫＲ２１１）を用いて、上のステップで抽出されたｍｉＲＮＡの逆転写を行い、逆転写産物を取得した。このステップでは、Ａテイリング反応と逆転写反応を統合することで、ｍｉＲＮＡのＡテイリング産物はすべて更なる逆転写反応を行うことができ、低存在度のｍｉＲＮＡの検出率を大幅に向上させることができる。
【0021】
４．蛍光定量ＰＣＲ
上記ステップで得られた逆転写産物をテンプレートとして、上記３６個のアムールチョウザメ性腺差異発現ｍｉＲＮＡ及び内部参照遺伝子Ｕ６に対してそれぞれ相対定量ＰＣＲを行い、ＴＩＡＮＧＥＮ社のｍｉＲｃｕｔｅ増強型ｍｉＲＮＡ蛍光定量検出キット（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）（ＦＰ４１１）に従って操作する。ｍｉＲＮＡプライマー配列を表２に示す。
上記ステップで得られた逆転写産物をテンプレートとして、上記３６個のアムールチョウザメ性腺差異発現ｍｉＲＮＡ及び内部参照遺伝子Ｕ６に対してそれぞれ相対定量ＰＣＲを行い、ＴＩＡＮＧＥＮ社のｍｉＲｃｕｔｅ増強型ｍｉＲＮＡ蛍光定量検出キット（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）（ＦＰ４１１）に従って操作する。ｍｉＲＮＡプライマー配列を表２に示す。
【0022】
【表2】
【0023】
蛍光定量ＰＣＲ反応条件は次の通りである：９５℃１５分間；９５℃１５分間、６０℃３０秒間、７２℃３４秒間、５サイクル；９４℃２０秒間、６０℃３４秒間、４５サイクル；溶解曲線解析。
【0024】
５．結果分析
Ｕ６を検出内部参照として、リアルタイム定量ＰＣＲ結果は２－ΔΔＣＴ法で分析し、ＳＰＳＳ１７．０は２群間の独立サンプルＴテスト（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ Ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して分析を行い、差異性顕著意味を統計する（Ｐ＜０．０５）。その結果により、図１に示すように、ａｓｃ－ｍｉＲ－１０７、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ａｓｃ－ｌｅｔ－７ｇ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１０－５ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃなどの１１個のｍｉＲＮＡが、雄性アムールチョウザメの血清の中で一致して顕著に上昇することが示された。
Ｕ６を検出内部参照として、リアルタイム定量ＰＣＲ結果は２－ΔΔＣＴ法で分析し、ＳＰＳＳ１７．０は２群間の独立サンプルＴテスト（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓａｍｐｌｅ Ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して分析を行い、差異性顕著意味を統計する（Ｐ＜０．０５）。その結果により、図１に示すように、ａｓｃ－ｍｉＲ－１０７、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ａｓｃ－ｌｅｔ－７ｇ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１０－５ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１０ｂ－５ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－２２３－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃなどの１１個のｍｉＲＮＡが、雄性アムールチョウザメの血清の中で一致して顕著に上昇することが示された。
【0025】
６．統計法を使用し、上記１１個のｍｉＲＮＡを単独でアムールチョウザメの性別同定の標準とする能力の評価を行い、アムールチョウザメの性別を同定する血清マーカーとしての個別ｍｉＲＮＡの感度と特異性、及び対応するＲＯＣ曲線を検出し、図２と表３に示す。
【0026】
【表3】
【0027】
図２と表３から分かるように、各ｍｉＲＮＡの診断能力ＲＯＣ曲線下面積はいずれも０．７４以上であり、上記１１種類のｍｉＲＮＡをアムールチョウザメの性別同定に用いることができ、一定の同定意義がある。
【0028】
７．さらに３種類の場合に分けて統計分析を行う：（１）１１個のｍｉＲＮＡを組み合わせる；(２）特異性指数＞０．７の６個のｍｉＲＮＡ（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｌｅｔ－７ｇ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１６－５ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを含む）を組み合わせて分析する；(３）特異性指数＞０．９の４個のｍｉＲＮＡ（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ和ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを含む）を組み合わせて分析し、総合指標の診断能力を評価した。表４に示すように、組み合わせ指標によるアムールチョウザメの性別同定のＲＯＣ曲線下面積、及びその精度と特異性を検出する。
【0029】
【表4】
【0030】
表４から分かるように、その中の４個のｍｉＲＮＡ（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを含む）の組み合わせ検出は最も高い識別効果を有し、その診断能力は、正解率（線下面積）が８２．６％で、その識別感度と特異度がそれぞれ８０．４％と９５．５％であった。
【0031】
８．チョウザメの性別同定のためのリアルタイム定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出キットの調製
４個のｍｉＲＮＡ（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを含む）に用いられる特別で専門的な逆転写ステムループプライマーは次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣ－３’；
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＡＴ－３’；
４個のｍｉＲＮＡ（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを含む）に用いられる特別で専門的な逆転写ステムループプライマーは次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣ－３’；
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＡＴ－３’；
【0032】
チョウザメの性別を同定するリアルタイム定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出キットのプライマーペアは、９６ウェルＰＣＲプレートにそれぞれ保存されており、プライマーペアの配列は次の通りである。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣ－３’；
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＡＴ－３’；
ユニバーサルリバースプライマー：５’－ＣＴＣＡＣＡＧＴＡＣＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＴＴＧＴＧ－３’。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＣ－３’；
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣ－３’；
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ－Ｆ：５’－ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＡＴ－３’；
ユニバーサルリバースプライマー：５’－ＣＴＣＡＣＡＧＴＡＣＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＴＴＧＴＧ－３’。
【0033】
上記の好ましいプライマーペアがそれぞれ９６ウェルＰＣＲプレートに保存された配列方式は、図３に示すように、４個のｍｉＲＮＡ遺伝子は、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ（Ａｍ１３３）、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ（Ａｍ１３３ａ）、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ（Ａｍ１３０）及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ（Ａｍ３４ｃ）と略称される。この９６ウェルＰＣＲプレート（すなわち、チョウザメの性別を同定するための蛍光定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出チップ）を使用してサンプルを検出する時、我々は設定した雌性血清（灰色領域Ａ１－Ａ６）の対照と雄性血清（灰色領域Ａ－Ａ１２）の対照の増幅状況に基づいて、被検血清サンプルのｍｉＲＮＡの発現状況を非常に正確に同時に取得することができ、それにより被検血清サンプルの性別を正確に予測することができる。この９６ウェルＰＣＲプレートは、１４個のチョウザメ個体、又は７個のチョウザメ個体（１個の個体を同時に２回検出する）又は少なくとも４個のチョウザメ個体（１個の個体を同時に３回検出する）の性別の同時検出に一度に用いられる。
【0034】
各９６ウェルＰＣＲプレートのホール中のプライマーペアの総量は、好ましくは１～２０×１０－１２ｍｏｌであり、上下流プライマーペアの量が同じである。好ましくは２－８℃の冷蔵庫で保存される。
キットのその他の内容物は２×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ、滅菌脱イオン水である。
チョウザメの性別同定のための蛍光定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出チップとその他の試薬を封入し、取扱説明書と共にキットに入れ、検出キットを構成する。
キットのその他の内容物は２×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ、滅菌脱イオン水である。
チョウザメの性別同定のための蛍光定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出チップとその他の試薬を封入し、取扱説明書と共にキットに入れ、検出キットを構成する。
【0035】
９．キットの検出検証応用
各１ロットの１齢前後のアムールチョウザメとシベリア交雑チョウザメを選択し、その生体血清採取法は、チョウザメのストレス反応を減少し、生体採血に合わせるために、チョウザメは水から離れた後に速やかに用意した氷に移して３～５分間静置し、５ｍＬの使い捨て無菌注射器（０．６×２５ＴＷＬＢ針を使用）を使用し、チョウザメの尾部すなわち排出腔の穴から約０．５－１．０ｃｍのところから３０－４５角度で針を入れ、尾静脈で１ｍＬ採血し、１．５ｍＬの無菌遠心管に入れ、室温で３０～６０分間静置し、低温遠心機で３５００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清液を集め、２ｍＬの冷凍管に入れ、－８０℃で冷蔵庫で保存することである。同時に上記ステップ２の方法でチョウザメの性別を検出し、性別分化が完全で且つ性別が決定したチョウザメサンプル（アムールチョウザメの雌雄各１０尾とシベリア交雑チョウザメの雌雄各１０尾を含む）をスクリーニングし、次に上記ステップ３の方法でｍｉＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社、品番６２１０Ａ）の説明書の操作方法に従い、４個の特異的逆転写ステムループプライマー（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ－ＲＴ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ－Ｆ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ－Ｆ、ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ－Ｆ）を使用し、それぞれ４個のマイクロＲＮＡ血清マーカーａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのｃＤＮＡを取得し、ＰＣＲ計反応プロセスは、４２℃で６０分間インキュベートし、７２℃で１５分間保持し、さらに４℃に下げて－２０℃の冷蔵庫に移して保存することである。次に、チョウザメの性別同定のためのリアルタイム定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出キット法に従い、２０μＬの反応系は１．０μＬのｃＤＮＡ、０．５μＬのｍｉＲＮＡ特異的プライマーと０．５μＬのユニバーサルリバースプライマー及び１０μＬの２×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭを含み、残りは蒸留水で補う。ＰＣＲ反応プログラムは、９５℃で２分間で、４０サイクル体系（９５℃１５秒間、６０℃３０秒間及び７２℃３０秒間）である。性別二重盲検法で検出する。本発明の上記４個のｍｉＲＮＡマーカーの相対的なアップダウンレギュレーションと雌雄性血清対照の発現状況に基づいて、未知のチョウザメサンプルの性別を判定する。判定標準は、もし未知のチョウザメ血清サンプルが雌性対照血清の４個のｍｉＲＮＡマーカーに比べて相対的に顕著にアップレギュレーションし、且つ相対的発現倍数が少なくとも２倍以上であれば、被検チョウザメサンプルが潜在的な雄性であると判定され、そうでなければ、被検チョウザメサンプルが潜在的な雌性であると判定され、最後の統計結果により、本発明のチョウザメの性別同定のためのリアルタイム定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出キットのチップ法による検出は、若齢のアムールチョウザメとシベリア交雑チョウザメに対する検出率はいずれも８０％に達し、未知の若齢のチョウザメサンプルの雌雄性を効果的に区分することができることが示された。
各１ロットの１齢前後のアムールチョウザメとシベリア交雑チョウザメを選択し、その生体血清採取法は、チョウザメのストレス反応を減少し、生体採血に合わせるために、チョウザメは水から離れた後に速やかに用意した氷に移して３～５分間静置し、５ｍＬの使い捨て無菌注射器（０．６×２５ＴＷＬＢ針を使用）を使用し、チョウザメの尾部すなわち排出腔の穴から約０．５－１．０ｃｍのところから３０－４５角度で針を入れ、尾静脈で１ｍＬ採血し、１．５ｍＬの無菌遠心管に入れ、室温で３０～６０分間静置し、低温遠心機で３５００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清液を集め、２ｍＬの冷凍管に入れ、－８０℃で冷蔵庫で保存することである。同時に上記ステップ２の方法でチョウザメの性別を検出し、性別分化が完全で且つ性別が決定したチョウザメサンプル（アムールチョウザメの雌雄各１０尾とシベリア交雑チョウザメの雌雄各１０尾を含む）をスクリーニングし、次に上記ステップ３の方法でｍｉＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社、品番６２１０Ａ）の説明書の操作方法に従い、４個の特異的逆転写ステムループプライマー（ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ－ＲＴ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ－Ｆ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ－Ｆ、ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃ－Ｆ）を使用し、それぞれ４個のマイクロＲＮＡ血清マーカーａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのｃＤＮＡを取得し、ＰＣＲ計反応プロセスは、４２℃で６０分間インキュベートし、７２℃で１５分間保持し、さらに４℃に下げて－２０℃の冷蔵庫に移して保存することである。次に、チョウザメの性別同定のためのリアルタイム定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出キット法に従い、２０μＬの反応系は１．０μＬのｃＤＮＡ、０．５μＬのｍｉＲＮＡ特異的プライマーと０．５μＬのユニバーサルリバースプライマー及び１０μＬの２×ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭを含み、残りは蒸留水で補う。ＰＣＲ反応プログラムは、９５℃で２分間で、４０サイクル体系（９５℃１５秒間、６０℃３０秒間及び７２℃３０秒間）である。性別二重盲検法で検出する。本発明の上記４個のｍｉＲＮＡマーカーの相対的なアップダウンレギュレーションと雌雄性血清対照の発現状況に基づいて、未知のチョウザメサンプルの性別を判定する。判定標準は、もし未知のチョウザメ血清サンプルが雌性対照血清の４個のｍｉＲＮＡマーカーに比べて相対的に顕著にアップレギュレーションし、且つ相対的発現倍数が少なくとも２倍以上であれば、被検チョウザメサンプルが潜在的な雄性であると判定され、そうでなければ、被検チョウザメサンプルが潜在的な雌性であると判定され、最後の統計結果により、本発明のチョウザメの性別同定のためのリアルタイム定量ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ検出キットのチップ法による検出は、若齢のアムールチョウザメとシベリア交雑チョウザメに対する検出率はいずれも８０％に達し、未知の若齢のチョウザメサンプルの雌雄性を効果的に区分することができることが示された。
【0036】
以上は本発明の好ましい実施形態にすぎず、なお、上記好ましい実施形態は本発明に対する制限と見なすべきではなく、本発明の保護範囲は請求項によって限定される範囲に準じるべきである。当業者にとって、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、いくつかの改良及び装飾を行うことができ、これらの改良及び装飾も本発明の保護範囲と見なすべきである。
【0037】
（付記）
（付記１）
チョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーであって、前記マーカーはａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃであり、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの塩基配列が配列番号２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの塩基配列が配列番号３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの塩基配列が配列番号８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの塩基配列が配列番号１１に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカー。
（付記１）
チョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーであって、前記マーカーはａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃであり、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの塩基配列が配列番号２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの塩基配列が配列番号３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの塩基配列が配列番号８に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの塩基配列が配列番号１１に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカー。
【0038】
（付記２）
付記１に記載のａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを検出するための検出プライマーを含み、前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの検出プライマーは次の通りである：
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１６に示され、
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１７に示され、
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１８に示され、
前記ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーが配列番号１９に示され、
リバースプライマーがユニバーサルリバースプライマーであり、配列が配列番号２０に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するための検出プライマーセット。
付記１に記載のａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃを検出するための検出プライマーを含み、前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐ、ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ及びｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの検出プライマーは次の通りである：
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１６に示され、
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１７に示され、
前記ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐのフォワードプライマーが配列番号１８に示され、
前記ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃのフォワードプライマーが配列番号１９に示され、
リバースプライマーがユニバーサルリバースプライマーであり、配列が配列番号２０に示される、
ことを特徴とするチョウザメの性別を同定するための検出プライマーセット。
【0039】
（付記３）
チョウザメの性別を同定するキットの調製における検出標的としての付記１に記載のマイクロＲＮＡ血清マーカーの使用。
チョウザメの性別を同定するキットの調製における検出標的としての付記１に記載のマイクロＲＮＡ血清マーカーの使用。
【0040】
（付記４）
チョウザメの性別を同定するキットの調製における付記２に記載の検出プライマーセットの使用。
チョウザメの性別を同定するキットの調製における付記２に記載の検出プライマーセットの使用。
【0041】
（付記５）
付記１に記載のチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーの含有量を検出するための試薬を含む、チョウザメの性別を同定するキット。
付記１に記載のチョウザメの性別を同定するためのマイクロＲＮＡ血清マーカーの含有量を検出するための試薬を含む、チョウザメの性別を同定するキット。
【0042】
（付記６）
付記２に記載の検出プライマーセットを含む、
ことを特徴とする付記５に記載のキット。
付記２に記載の検出プライマーセットを含む、
ことを特徴とする付記５に記載のキット。
【0043】
（付記７）
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの逆転写ステムループプライマーが配列番号１２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーが配列番号１３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーが配列番号１４に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの逆転写ステムループプライマーが配列番号１５に示される、
逆転写ステムループプライマーをさらに含むことを特徴とする付記５又は６に記載のキット。
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３－３ｐの逆転写ステムループプライマーが配列番号１２に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３３ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーが配列番号１３に示され、
ａｓｃ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐの逆転写ステムループプライマーが配列番号１４に示され、
ｄｒｅ－ｍｉＲ－３４ｃの逆転写ステムループプライマーが配列番号１５に示される、
逆転写ステムループプライマーをさらに含むことを特徴とする付記５又は６に記載のキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】