特許 7090604 びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の予後予測因子、及び予後予測方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-16

(45)【発行日】2022-06-24

(54)【発明の名称】びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の予後予測因子、及び予後予測方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20220617BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220617BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68 ZNA

C12N15/09 Z

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019518738

(86)(22)【出願日】2018-05-10

(86)【国際出願番号】 JP2018018165

(87)【国際公開番号】W WO2018212071

(87)【国際公開日】2018-11-22

【審査請求日】2021-04-28

(31)【優先権主張番号】P 2017097943

(32)【優先日】2017-05-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(74)【代理人】

【識別番号】100179431

【弁理士】

【氏名又は名称】白形 由美子

(72)【発明者】

【氏名】土橋 映仁

(72)【発明者】

【氏名】竹内 賢吾

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】Blood, 2012, Vol.120, No.19, p.3986-3996

【文献】Hypertens. Res., 2010, Vol.33, No.5, p.511-514

【文献】Blood, 2017.12.07, Vol.130, No.Suppl 1, Article.1464 [online], [retrieved on 2018.07.18], Retrieved

【文献】Oncotarget. 2018.04.13, Vol.9, No.28, p.19555-19568

【文献】病理と臨床, 2015, Vol.33, No.5, p.512-516

【文献】日本臨牀, 2015, Vol.73, No.増刊号8, p.149-153

【文献】日本リンパ網内系学会会誌, 2017.05.30, Vol.57, p.87(O-4)

【文献】日本リンパ網内系学会会誌, 2017.05.30, Vol.57, p.97(P5-3)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の予後予測検査方法であって、
ＴＰ５３の変異を検出し、
一方のアリルにＴＰ５３の変異が、
他方のアリルに１７ｐ欠損が併存している場合に予後不良であるとすることを特徴とする検査方法。

【請求項2】

ＤＬＢＣＬの予後予測検査方法であって、
ＯＳＢＰＬ１０の変異を検出し、
ＯＳＢＰＬ１０の変異を有する場合に予後良好であるとする検査方法。

【請求項3】

ＤＬＢＣＬの予後予測検査方法であって、
請求項１及び２記載の検査方法によって予後予測することを特徴とする予後予測検査方法。

【請求項4】

ＤＬＢＣＬの予後を予測するための検査キットであって、
ＴＰ５３の変異及び１７ｐ欠損を検出するための試薬、並びに／又はＯＳＢＰＬ１０の変異を検出するための検出試薬を含む検査キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ-ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ、以下ＤＬＢＣＬと記載する。）の予後予測因子、及び予後予測を検査する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＤＬＢＣＬは、リンパ腫の１種であり、Ｂ細胞から発生する非ホジキンリンパ腫である。我が国の非ホジキンリンパ腫のうち３０～５０％はＤＬＢＣＬであると言われており最も頻度の高いリンパ腫である。ＤＬＢＣＬとしての初発例以外に、他の低悪性度Ｂ細胞リンパ腫から組織学的進展する例もあり、様々な病態を示す疾患群である。

【0003】

ＤＬＢＣＬは、形態学的、分子生物学的、免疫組織学的に不均一な集団であり、種々のバリアント、あるいはサブグループに分類される。２００４年、Ｈａｎｓのクライテリアと呼ばれる胚中心Ｂ細胞（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ Ｂ－ｃｅｌｌ、ＧＣＢ）とｎｏｎ-ＧＣ（ＣＤ１０、ＢＣＬ－６、ＭＵＭ－１の発現により分類）サブタイプの２群への分類が提唱された（非特許文献１）。その後、ＷＨＯのＤＬＢＣＬの分類では、幾度かの変遷を経て、２０１６年にＧＣＢと活性化Ｂ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ－ｃｅｌｌ、ＡＢＣ）のサブタイプの２群に分類するようになった（非特許文献２）。

【0004】

ＤＬＢＣＬの治療は、現在ＣＨＯＰ療法（シクロホスファミド、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、オンコビン（商品名）（ビンクリスチン）、プレドニゾロン）に抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブを加えたＲ-ＣＨＯＰが標準療法となっている。ＤＬＢＣＬはＲ－ＣＨＯＰ療法の導入により飛躍的に予後が改善されたが、一方でＲ－ＣＨＯＰ療法の効かない患者群が存在する。ＷＨＯの分類も患者の予後とは対応しておらず、分類はされてはいるものの治療の層別化は行われていないのが現状である。

【0005】

免疫組織学的な解析や、全ゲノムシーケンス、全エクソームシーケンス、トランスクリプトームシーケンスなどの解析手法を用いてＤＬＢＣＬの変異が解析されているが（非特許文献３－７）、これら解析間で体細胞変異が一致しているものは１０－２０％に過ぎない（非特許文献８）。すなわち、ＤＬＢＣＬは、体細胞変異の観点から見ても多様な疾患であることが示唆される。また、遺伝子変異を治療効果予測につなげようという試みもされているが、実用化には至っていない（特許文献１、２）。

【0006】

近年、変異とＲ-ＣＨＯＰ療法などの治療法と予後との関連が解析されている（非特許文献９－１３）。２１５症例の再発、難治性のＤＬＢＣＬについて、文献や全エクソーム解析より選択した３４遺伝子を解析した報告によれば、ＴＮＦＡＩＰ３及びＧＮＡ１３の変異が、ＡＢＣ（活性化Ｂ細胞）に分類される患者においてＲ-ＣＨＯＰ療法の予後が悪いことと相関している（非特許文献９）。また、他の再発、難治症例の全エクソーム解析によれば、ＡＢＣサブタイプでは、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＩＲＦ４の変異、ＲＥＬ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＨＹＡＬ２、及びＴＰ５３のコピー数に変異が生じていることが報告されている（非特許文献１０）。さらに、他の３８症例の難治性のＤＬＢＣＬの全エクソーム解析によれば、ＴＰ５３、ＦＯＸＯ１、ＫＭＴ２Ｃ、ＣＣＮＤ３、ＮＦＫＢ１Ｚ、及びＳＴＡＴ６の変異と治療抵抗性とが相関することが報告されている（非特許文献１１）。また、ＴＰ５３のミスセンス変異やコピー数の欠失、ＣＤ５８の変異などが予後と相関することが報告されている（非特許文献１２、１３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特表２０１１－５２５１０６号公報

【文献】国際公開第２００６／１１２４８３号

【非特許文献】

【0008】

【文献】Hans C.P., et al., 2004, Blood, Vol.103(1), pp.275-282.

【文献】Swerdlow S.H., et al., 2016, Blood. Vol.127(20), pp.2375-2390.

【文献】Morin R.D., et al., 2011, Nature, Vol.476(7360), pp.298-303.

【文献】Morin R.D., et al., 2013, Blood, Vol.122(7), pp1256-1265.

【文献】Zhang J., et al., 2013, Proc Natl Acad Sci U S A., Vol.110(4), pp.1398-1403.

【文献】Lohr J.G., et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A., Vol.109(10), pp.3879-3884.

【文献】Pasqualucci L., et al., 2011, Nat Genet. Vol.43(9), pp.830-837.

【文献】Dobashi A., 2016, J Clin Exp Hematop. Vol.56(2), pp.71-78.

【文献】Dubois S., et al., 2016, Clin. Cancer Res., Vol.22(12), pp.2919-2928.

【文献】Mareschal S., et al., 2016, Genes Chromosomes Cancer, Vol.55(3), pp.251-267.

【文献】Morin R.D., et al., 2016, Clin. Cancer Res., Vol.22(9), pp.2290-2300.

【文献】Park H.Y., et al., 2016, Oncotarget, Vol.7(52), pp.86433-86445

【文献】Cao Y., et al., 2016, Oncotarget, Vol.7(50), pp.83294-83307.

【文献】Robinson J.T., et al., 2011, Nat. Biotechnol., Vol.29(1), pp.24-26.

【文献】Ng P.C, and Henikoff, S., 2003, Nucleic Acids Res. Vol.31(13), pp.3812-3814.

【文献】http://www.divat.fr/en/softwares/ipwsurvival

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上述のように、難治性のＤＬＢＣＬと関連の高い遺伝子変異に関する報告は、数多くあるものの、変異の報告されている遺伝子が多岐にわたっており、再現性が必ずしも高くはない。そのため、遺伝子変異と治療抵抗性との関連が報告間で必ずしも一致しておらず、予後予測が十分になされているとは言えない。ＤＬＢＣＬに対してＲ－ＣＨＯＰ療法を行っても、治療効果がさほど期待できない患者を予め検出することができれば、代替する療法としてサルベージ療法を行うなど、患者に合わせてより良い長期治療計画を立てることが可能となる。効果のあまりない治療を継続することは、患者にとって望ましいことではないだけでなく、医療経済上も望ましいことではない。

【0010】

また、Ｒ-ＣＨＯＰ療法に対して反応性が高い患者を検出することも重要なことである。Ｒ-ＣＨＯＰ療法で用いられるドキソルビシンは心毒性があるため、過剰な治療を避ける必要があるからである。すなわち、ＤＬＢＣＬの予後不良、及び予後の良い患者の両方を検出することは、治療計画を立てるうえで重要なことである。本発明は、種々の病態を示す疾患群であるＤＬＢＣＬを層別化し、ＤＬＢＣＬの予後因子、予後予測を検査する方法を提供し、有効な治療を可能とすることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は以下に示すびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の予後予測の検査方法、予後予測因子、予後予測を行うための検査キットを提供する。
（１）ＤＬＢＣＬの予後予測検査方法であって、ＴＰ５３及び／又はＯＳＢＰＬ１０の変異を検出することを特徴とする検査方法。
（２）一方のアリルにＴＰ５３の変異が、他方のアリルに１７ｐ欠損が併存している場合に、予後不良であるとする（１）記載の検査方法。
（３）ＯＳＢＰＬ１０の変異を有する場合に、予後良好であるとする（１）記載の検査方法。
（４）ＤＬＢＣＬの予後予測因子であって、一方のアリルにＴＰ５３の変異が存在し、他方のアリルの１７ｐ欠損が併存していること、及び／又はＯＳＢＰＬ１０の変異であることを特徴とする予後予測因子。
（５）（４）記載のＤＬＢＣＬの予後予測因子を検出するための検出試薬を含む検出キット。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】Ｄｐ群（予後が極端に悪い症例、ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｃａｓｅ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ；Ｄｐ）、Ｄｇ群（予後が良い症例（３年間無増悪生存）、ｇｏｏｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｃａｓｅ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ；Ｄｇ）における変異の数を示す図。

【図2】図２Ａは探索群におけるＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異の位置や種類を示す図。図２Ｂは検証群におけるＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異の位置や種類を示す図。

【図3】ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異と全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）、無増悪生存期間（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＦＳ）との関係を示す図。図３ＡはＴＰ５３の変異の検証群における全生存期間及び無増悪生存期間を示す。ＴＰ５３Ｄ：ＴＰ５３欠損、ＴＰ５３Ｍ：ＴＰ５３変異、ＴＰ５３Ｗ：ＴＰ５３野生型、ＴＰ５３Ｍ＋Ｄ：ＴＰ５３変異かつ欠損。図３ＢはＯＳＢＰＬ１０の変異と検証群における全生存期間及び無増悪生存期間を示す。ＯＳＢＰＬ１０Ｗ：ＯＳＢＰＬ１０野生型、ＯＳＢＰＬ１０Ｍ：ＯＳＢＰＬ１０変異。

【図4】傾向スコア解析（ＩＰＷ）によるＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異と全生存期間、無増悪生存期間との関係を示す図。図４ＡはＴＰ５３の変異と全生存期間及び無増悪生存期間を示す。ＴＰ５３ ｗｔ：ＴＰ５３野生型、ＴＰ５３ ｍｕｔ ｗｉｔｈ ｄｅｌ：ＴＰ５３変異かつ欠損を示す。図４Ｂは、ＯＳＢＰＬ１０の変異と全生存期間及び無増悪生存期間を示す。ＯＳＢＰＬ１０ ｍｕｔ：ＯＳＢＰＬ１０変異、ＯＳＢＰＬ１０ ｗｔ：ＯＳＢＰＬ１０野生型を示す。

【図5】図５Ａは、ＴＰ５３の変異かつ欠損とＯＳＢＰＬ１０の変異を組み合わせ、検証群における全生存期間を示す。ＴＰ５３Ｍ＋Ｄ：ＴＰ５３変異かつ欠損、ＷＴ：ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０ともに野生型、ＯＳＢＰＬ１０Ｍ：ＯＳＢＰＬ１０変異。図５Ｂは、検証群における国際予後指標（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ、ＩＰＩ）による全生存期間を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明では、変異を解析するために全エクソームシーケンスを行ったが、ＤＬＢＣＬの予後と相関の見られる遺伝子である１７番染色体短腕（１７ｐ）の欠損（１７ｐ欠損）を伴うＴＰ５３の変異、ＯＳＢＰＬ１０の変異を検出することができればどのような手法を用いてもよい。

【0014】

以下で詳細に説明するが、ＴＰ５３の変異は、ＤＮＡ結合領域に変異が集中している。したがって、ＤＮＡ結合領域の変異の解析を行うことにより検出してもよいが、変異がコーディング領域全域にわたっていることから、コーディング領域全域のシーケンスを行うことが好ましい。ＯＳＢＰＬ１０の変異はエクソン１に偏在しているため、この領域のみをシーケンス解析すればよい。

【0015】

ここで、ＴＰ５３の変異とは、ミスセンス変異、フレームシフト変異などｐ５３タンパク質の機能が変わるような変異をさす。また、１７ｐ欠損とは、ＴＰ５３遺伝子の存在する領域を含む１７番染色体短腕が広範囲に欠失している状態を示す。後述のように、ＤＬＢＣＬでは、片方のアリルのＴＰ５３遺伝子にｐ５３タンパク質の機能が変わる変異が存在し、他方のアリルの１７番染色体短腕が広範囲に欠失している場合に、予後不良であることが明らかとなった。

【0016】

ＴＰ５３の変異は、次世代シーケンサを用いてコーディング領域全域を対象としたアンプリコンシーケンス、ターゲットキャプチャーシーケンスをすることで検出することが可能である。また、簡易的には、ＴＰ５３のコーディング領域のうち、ＤＮＡ結合領域に変異が集中していること（図２）から、この領域のダイレクトシーケンスにより、変異の検出が可能である。ＯＳＢＰＬ１０の変異も同様に、アンプリコンシーケンス、ターゲットキャプチャーシーケンスをすることで検出することが可能であり、さらに、エクソン１に偏在していることから、この領域のダイレクトシーケンスのみでも検出が可能である。また、１７番染色体の短腕の欠損は、１７番染色体の短腕に存在する一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）のターゲットキャプチャーシーケンス、ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）、リアルタイムＰＣＲ法、Ｆｕｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）などの方法を用いて検出することが可能である。

【0017】

２００６年以降に、がん研有明病院で治療を行い、インフォームドコンセントが得られた患者の中から、標準療法であるＲ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療に対して転帰が極端な２群（Ｒ-ＣＨＯＰ抵抗性症例９例、反応性症例２６例）を探索群（ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ）とし、８５例の検証群（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｃｏｈｏｒｔ）で確認した。

【0018】

解析対象とする患者は、凍結組織が存在する、あるいは凍結組織か新鮮材料から抽出したＤＮＡが得られることを選択基準とした。３５のＤＬＢＣＬ症例（２００６年１月～２０１１年１２月に診断）を探索群として、８５症例（２０１２年１月～２０１４年１２月に診断）を検証群としてした。

【0019】

探索群におけるＲ-ＣＨＯＰ抵抗性症例９例は、初期治療（Ｒ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療）に対して不変、あるいは進行性であり、予後が極端に悪い症例（ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｃａｓｅ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ、以下、Ｄｐと記載する。）である。反応性症例２６例は、初期治療に反応し、２０１６年１１月までの観察期間において少なくとも３年間無増悪生存であった症例（ｇｏｏｄ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｃａｓｅ ｉｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｃｏｈｏｒｔ、以下、Ｄｇと記載する。）である。探索群のうち３３症例では、リンパ腫が浸潤していない骨髄試料を正常試料として解析を行った。また、骨髄試料が得られなかったＤｇ２４、Ｄｇ２５症例は、末梢血から得たＤＮＡを正常試料として解析を行った。また、検証群８５症例もＲ-ＣＨＯＰまたは、それに類似した治療を受けた症例である。すべての症例は、通常の組織学的検査を行った後、病理学者によって２００８年のＷＨＯ分類により分類を行った。

【0020】

遺伝子変異は、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＸＴ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ Ｖ５（アジレント・テクノロジー株式会社）に基づいた特別仕様のキャプチャープローブセットを用いて、３５の探索群のがん部及び正常組織について全エクソームシーケンスを行った。ライブラリーはＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｉｍｅｎｔ ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）を用い、次世代シーケンサＨｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）を用いて行った。解析したがん組織におけるがん細胞の含有率は平均５６．４％（３０．９８－８９．１６％）と推測された。

【0021】

予後の良い群（Ｄｇ群）と悪い群（Ｄｐ群）における検出された体細胞変異の数を示す（図１）。Ｄｇ群、Ｄｐ群の２群間で最も変異の出現頻度に差が見られるのは、ＴＰ５３であり、次にＯＳＢＰＬ１０、ＣＴＢＰ２に差が認められる（図１中、両群で出現頻度に差が見られるＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０、ＣＴＢＰ２を↓で示す。）。

【0022】

Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ、非特許文献１４）を用いて結果を検討し、偽陽性と考えられる変異を除き解析を行った。例えば、ＣＴＢＰ２の変異は、がん組織、正常組織両者に同じ変異が多数見られたことからリファレンスゲノムへのマッピングの誤りであると考えられた。したがって、ＴＰ５３、及びＯＳＢＰＬ１０（図１中★印で示す。）をＤｇ群、Ｄｐ群の２群を区別することのできる変異であると結論づけ、ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異について詳細に検討を行った。

【0023】

ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異がＤＬＢＣＬの予後と相関しているとの結果が探索群で得られたことから検証群を用いてさらに解析を進めた。探索群でＤＬＢＣＬの予後と相関が見出された変異（ＴＰ５３、及びＯＳＢＰＬ１０）については、サンガーシーケンスによって確認を行った。シーケンスに用いたプライマーを以下に示す。

【0024】

ＯＳＢＰＬ１０
Ｆ：ＡＴＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＴＧＡＡＧＧ（配列番号１）
Ｒ：ＣＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号２）
ＴＰ５３
Ｆ１：ＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧ（配列番号３）
Ｒ１：ＴＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＧＡＧＣＣＴＧ（配列番号４）
Ｆ２：ＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＴＧ（配列番号５）
Ｒ２：ＣＣＣＣＡＴＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴ（配列番号６）
Ｆ３：ＡＴＴＴＡＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣＴＣＡＴＧＧＧ（配列番号７）
Ｒ３：ＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡ（配列番号８）
なお、Ｆはフォワードプライマーを、Ｒはリバースプライマーを示し、ＴＰ５３のシーケンスは、１～３の３組のプライマーを用いて行った。

【0025】

検証群については、ＴｒｕＳｅｑ Ｃｕｓｔｏｍ Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｋｉｔ（イルミナ社）を用いてアンプリコンシーケンス解析を行った。なお、解析した領域は、探索群でＤＬＢＣＬの予後と相関が見られたＴＰ５３の全コーディング領域、及びＯＳＢＰＬ１０のエクソン１の領域である。解析は次世代シーケンサＭｉＳｅｑ（イルミナ株式会社）を用いて行った。

【0026】

まず、ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０に、どのような変異が生じているか解析した。探索群（図２Ａ）、検証群（図２Ｂ）に、ＴＰ５３、ＯＳＢＰＬ１０の変異の位置や種類を示す。ＴＰ５３の変異は、コーディング領域全体にわたっているものの、主としてＤＮＡ結合領域に見られることが明らかとなった。また、ＯＳＢＰＬ１０の変異はエクソン１でコードされる領域に偏在していた。

【0027】

まず、ＴＰ５３の変異について解析すると、Ｄｐ群においてＴＰ５３に変異が見られた５人の患者全てにおいて１７番染色体短腕に欠損が見られたのに対し（ＴＰ５３ ｍｉｓｓｅｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ＋１７ｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ：３人、ＴＰ５３ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｉｎｄｅｌ＋１７ｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ：２人）、Ｄｇ群ではそのような欠損が見られたのは１人の患者のみ（ＴＰ５３ ｍｉｓｓｅｎｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ＋１７ｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ：１人）であった。Ｄｇ群では、１７ｐ欠損を有する患者は６人、ＴＰ５３変異が見られた患者は３人いたが、１７ｐ欠損を伴いＴＰ５３変異を有していた患者は１人のみで、ＴＰ５３変異が見られた他の２人の患者は１７ｐ欠損を伴っていなかった。

【0028】

検証群において、ＴＰ５３の変異と予後について検討すると、ＴＰ５３変異のみ１２例、欠損のみ７例の各群は、ともに陰性６０例の群と比較し、全生存期間、無増悪生存期間とも差は認められなかった。これに対し、ＴＰ５３の変異かつ欠損がある症例群６例は、全生存期間（ｐ＝０．００１６）、無増悪生存期間（ｐ＝０．０２３）ともに、有意に予後不良であった（図３Ａ）。

【0029】

したがって、ＴＰ５３の変異かつ欠損は、ＤＬＢＣＬにおける予後不良因子であると結論づけた。また、表１は、検証群におけるＴＰ５３の変異かつ欠損を有するＤＬＢＣＬ患者群と、ＴＰ５３が野生型、あるいはＴＰ５３変異、欠損のどちらかを単独で有している患者群との比較を示したものである。ＴＰ５３の変異かつ欠損を有する患者群は、ＥＣＯＧ－ＰＳ（全身状態、ＥＣＯＧ（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）が定めるＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｔａｔｕｓ）が有意に悪かった（ｐ＜０．０１）。

【0030】

【表1】

【0031】

次に、ＯＳＢＰＬ１０の変異について解析を行った（表２）。ＯＳＢＰＬ１０の変異を有しているものは、検証群において、全生存期間（ｐ＝０．０３７）、無増悪生存期間（ｐ＝０．０４１）と有意に予後良好であった（図３Ｂ）。また、ＯＳＢＰＬ１０に変異を有する検証群２１人の患者のＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、乳酸脱水素酵素）値は有意に低かった（ｐ＝０．０４）。ＬＤＨ値は、ＩＰＩ（国際予後指標）において予後因子の一つとして用いられている指標である。

【0032】

【表2】

【0033】

ＩＰＩの影響を除くために、傾向スコア解析（Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ法）を行った。解析は、Ｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３．２（非特許文献１５）及びＩＰＷ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｐａｃｋａｇｅ（非特許文献１６）を用いて行った（図４）。

【0034】

ＩＰＷ法を適用しても、１７ｐ欠損を伴うＴＰ５３変異は、有意に全生存率（ｐ＜０．０１）、無増悪生存期間（ｐ＜０．０１）ともに予後不良であった（図４Ａ）。ＯＳＢＰＬ１０の変異に関しては、ＩＰＷ法を適用した後は、変異を有する群は、全生存率（ｐ＝０．０５）、無増悪生存期間（ｐ＝０．０５）ともに、予後が良い傾向が見られた（図４Ｂ）。

【0035】

一般的にＤＬＢＣＬの予後の指標として用いられているＩＰＩと本発明の方法との比較を行った。ＩＰＩは、年齢、臨床病期、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＬＤＨ）、ＰＳ（全身状態、ＥＣＯＧ－ＰＳ）、リンパ節以外の病変（Ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ ｌｅｓｉｏｎ）の予後因子から算出される値を示す。図５Ｂに検証群におけるＩＰＩの分類による全生存期間を示す。

【0036】

これに対し、本発明の方法による予後予測方法（ＴＰ５３の変異かつ欠損とＯＳＢＰＬ１０の変異を組み合わせたＧｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ：ＧＰＩ）による予後を検証群にて確認した（図５Ａ）。ＩＰＩとＧＰＩを比較すると、ＧＰＩは非常に精度良くＤＬＢＣＬの予後を予測可能であった（ｐ＝０．００３４）。

【0037】

以上、示したように、極端な転帰を示した２群の全エクソームシーケンス解析より、予後を予測し得る因子として、１７番の染色体短腕の欠損を伴うＴＰ５３変異、ＯＳＢＰＬ１０の変異を見出し、検証群にて確認した。これら変異を予後予測因子として用いることによって、ＤＬＢＣＬの予後を予測が可能となり、ＤＬＢＣＬ患者に対して長期の治療計画を立てることができるようになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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