特許 7090886 ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物および該加水分解物を製造する方法ならびに該加水分解物の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-17

(45)【発行日】2022-06-27

(54)【発明の名称】ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物および該加水分解物を製造する方法ならびに該加水分解物の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/9789 20170101AFI20220620BHJP

   A61K 8/66 20060101ALI20220620BHJP

   A61K 36/61 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 17/18 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20220620BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20220620BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20220620BHJP

【ＦＩ】

A61K8/9789

A61K8/66

A61K36/61

A61P17/00

A61P17/02

A61P17/04

A61P17/16

A61P17/18

A61P37/08

A61P39/06

A61Q19/00

A61Q19/02

【請求項の数】 19

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2018075008

(22)【出願日】2018-04-09

(65)【公開番号】P2019182777

(43)【公開日】2019-10-24

【審査請求日】2021-04-07

(73)【特許権者】

【識別番号】518123752

【氏名又は名称】頂宏生物科技股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(74)【代理人】

【識別番号】100175651

【弁理士】

【氏名又は名称】迫田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】江 春暉

【審査官】池田 周士郎

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０２２２８２０７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４５２２６１７（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０６０１０８６７（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２００２－００３３６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２－２７５０２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００１－２２０３１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】SUPAPVANICH, S. et al.，Effects of 'Queen' and 'Smooth cayenne' pineapple fruit core extracts on browning inhibition of fresh-cut wax apple fruit during storage，International Food Research Journal，2017年04月，Vol.24, No.2，page.559-564

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９

Ａ６１Ｑ １／００－９０／００

Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １７／００－１７／１８

Ａ６１Ｐ ３９／０６

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

Ａ０１Ｎ ６５／００－６５／４８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジャワフトモモの果実材料を水で抽出処理して水抽出物を得ることと、
前記水抽出物をブロメラインで加水分解処理することと、
を含む、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物を製造する方法。

【請求項2】

前記ジャワフトモモの果実材料の水に対する重量比が１：０．５から１：５の範囲にある、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記水抽出物のブロメラインに対する重量比が１５０：１から６００：１の範囲にある、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記加水分解処理の後に固液分離処理を行って前記加水分解処理により発生した固形分を除去することを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ジャワフトモモの果実材料はジャワフトモモの果肉を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ジャワフトモモの果実材料はジャワフトモモの果皮とジャワフトモモの種子を更に含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ジャワフトモモの果実材料を水で抽出処理して水抽出物を得ることと、
前記水抽出物をブロメラインで加水分解処理することと、を含む方法により製造される、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物。

【請求項8】

前記ジャワフトモモの果実材料の水に対する重量比が１：０．５から１：５の範囲にある、請求項７に記載の加水分解物。

【請求項9】

前記水抽出物のブロメラインに対する重量比が１５０：１から６００：１の範囲にある、請求項７または８に記載の加水分解物。

【請求項10】

前記方法は、前記加水分解処理の後に固液分離処理を行って前記加水分解処理により発生した固形分を除去することを更に含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の加水分解物。

【請求項11】

前記ジャワフトモモの果実材料はジャワフトモモの果肉を含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の加水分解物。

【請求項12】

前記ジャワフトモモの果実材料はジャワフトモモの果皮とジャワフトモモの種子を更に含む、請求項１１に記載の加水分解物。

【請求項13】

請求項７～１２のいずれか一項に記載の加水分解物を含む組成物。

【請求項14】

肌の美白のために用いられる請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

肌の保湿性の向上のために用いられる請求項１３に記載の組成物。

【請求項16】

創傷治癒の改善のために用いられる請求項１３に記載の組成物。

【請求項17】

酸化ストレスの軽減のために用いられる請求項１３に記載の組成物。

【請求項18】

局所投与剤形に形成された、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

経口投与剤形に形成された、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ジャワフトモモ（Syzygium samarangense）の水抽出物の加水分解物および該加水分解物を製造する方法に関する。また、本発明は、前記加水分解物の、肌の美白、肌の保湿性向上、創傷治癒の改善、および酸化ストレスの軽減のための使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は人体における最大のバリアであり、水分の喪失、病原体の侵入、および様々な有害な環境による損傷を防ぐことができる。しかし、紫外線（ＵＶ）、電離放射線、薬物、生体異物に過度に曝されると、皮膚において活性酸素種（ＲＯＳ）やフリーラジカルが産生される。蓄積された活性酸素種やフリーラジカルの量が細胞や組織の抗酸化能を超えると、酸化ストレスを引き起こす。具体的には、活性酸素種やフリーラジカルが細胞の構成要素（ＤＮＡ、タンパク質、脂質等）と反応することにより、皮膚が悪影響を受ける。活性酸素種やフリーラジカルが、メラニン生成に重要な役割を果たすだけでなく、創傷治癒の遅延をも引き起こすという報告がなされている(Kim Y.J. and Yokozawa T. (2009), Biol. Pharm. Bull., 32:1155-1159; 及び Kurahashi T. and Fujii J. (2009), J. Dev. Biol., 3:57-70)。

【0003】

メラニン形成は、チロシナーゼの触媒作用および一連の酸化還元反応の下で、メラノサイトのチロシンがメラニンに変換されるプロセスである。メラニン形成は、通常、ＵＶ照射（特にＵＶ－Ｂ）によって誘導される。皮膚が紫外線に曝されると、ケラチノサイトで生成されたＲＯＳおよびフリーラジカルは、腫瘍タンパク質５３（ｐ５３）の発現を誘導し、それによってプロオピオメラノコルチン遺伝子（ＰＯＭＣ遺伝子）の発現を引き起こし、α-メラノサイト （α‐ＭＳＨ）および副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）などのＰＯＭＣ由来ペプチドを放出する。更に、メラノサイト中のチロシン遺伝子が発現され、大量のメラニンが皮膚上に蓄積する。

【0004】

皮膚がダメージ（例えば、うっ血、外傷、外科的損傷、挫傷など）を受けて傷口ができると、創傷部位で炎症反応が誘発される。このとき、免疫細胞の抗病原体作用を増強するために、膨大な量のＲＯＳとフリーラジカルが放出される。しかしながら、過剰なＲＯＳおよびフリーラジカルは、傷口の周囲にある組織に損傷を引き起こす。一方、創傷治癒の過程では、線維芽細胞が創傷部位で凝集及び増殖して成長因子を放出し、それにより血管新生、上皮化、コラーゲン再形成などが促される。しかし、過剰のＲＯＳおよびフリーラジカルは、血管新生を阻害するだけでなく、シグナル伝達経路に関与する酵素を不活性化させ、よって創傷治癒が妨げられる。

【0005】

近年、肌の美白、保湿、創傷治癒の促進、抗酸化の需要が高まっている。特に、肌に望ましくない有害な副作用を引き起こさない天然成分の使用は、美容医学の分野におけるトレンドとなっている。従って、健康産業及び化粧品業界の研究者は、そのような大きな需要を満たすために、伝統的中国医薬（ＴＣＭ）又は植物から、美白、保湿、創傷治癒及び抗酸化に作用の有る安全な有効成分を探すことに努めている。

【0006】

ジャワフトモモ（学名：Syzygium samarangense、一般名：レンブ（蓮霧）、中国語ピンイン：lian wu）は、フトモモ科（Myrtaceae）フトモモ属（Syzygium）に属し、対生で楕円形状の単葉をつけ、淡黄色の花冠を有する腋花が咲き、そして倒円錐形の果実が実る多年生常緑樹である。ジャワフトモモは、台湾、インドネシア、フィリピン、マレーシアなどに分布している。ジャワフトモモの果実の一般的な品種としては、ダークレッド品種、ペールレッド品種、「黒真珠（Black Pearl）」、「黒金剛(Black King Kong)」、「黒鑚石（Black Diamond）」などが挙げられ、広く食用されている。中国民間医療において、ジャワフトモモの果実は、肺の滋養、鎮咳、去痰、涼血、収斂促進に使用されている。更に、ジャワフトモモの果実は、解熱、利尿、ストレス緩和に有効であると考えられている。

【0007】

ジャワフトモモはその抽出物の医薬品分野への応用が研究されている。例えば、輔仁大学（台湾）の食品栄養学科の羅珮文（Pei-Wen Lo）による論文「台湾特有果実の抗酸化・フリーラジカル消去活性の評価」では、ジャワフトモモの果実及びその他の種類の果実の抗酸化作用の調査結果が報告されている。具体的には、１４種類の果実（オレンジ（Citrus sinensis Osbeck）、タンカン（Citrus tankan Hayata）、文旦（Citrus grandis (L) Osbeck）、晩白柚（Citrus grandis Osbeck）、キンカン（Citrus micro carpa）、イチゴ（Fragaria ananassa Duch）、ドラゴンフルーツ（Hylocereus undatus）、ジャワフトモモ（Syzygium samarangense）、柿（Diospyros kaki L.）、マンゴー （Mangifera indica L.）、パパイヤ（Carica papaya L.）、ナツメ（Zizyphus jujuba）、スターフルーツ（Averrhoa carambola L.）、およびグァバ（Psidium guajava L.）の果実）を凍結乾燥した後に挽いて粉末にする。それぞれの果実の粉末１０ｇをメタノール１００ｍＬで６時間抽出処理した後、ろ紙でろ過処理し、得られたろ液を濃縮乾固した。これにより得られた１４種の果実のメタノール抽出物につき抗酸化作用が試験された。実験の結果、上記の１４種の果実のメタノール抽出物が異なる試験において異なるレベルの活性を呈したことが示された。具体的には、α, α-ジフェニル-β-ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカル消去能の試験により、ジャワフトモモの果実材料（果皮および果肉を含む）のメタノール抽出物は、ＤＰＰＨラジカル消去能が最も低いことが判明した。更に、スーパーオキシドアニオン生成を阻害する能力の試験の結果、ジャワフトモモの果実材料のメタノール抽出物は、スーパーオキシドアニオン生成を阻害することができず、むしろスーパーオキシドアニオン生成を誘導することが明らかになった。

【0008】

また、嘉南薬理大学（台湾）の化粧品研究所の陳宜貞（Yi-Zhen Chen）による論文「ジャワフトモモの花の抽出物の抗酸化における応用」（Application of Extracts from Wax Apple Flowers on Antioxidantion"）に記載されているように、ジャワフトモモの花における抗酸化効力およびチロシナーゼ阻害能が調査されている。具体的には、ジャワフトモモの花の乾燥粉末５０ｇを８０％メタノール５００ｍｌで１時間抽出処理する。その後、ろ紙を用いてろ過処理を行う。得られた２つのろ液を濃縮し、凍結乾燥し、ジャワフトモモの花のメタノール抽出物およびジャワフトモモの花の水抽出物を得た。これら２つの抽出物に対して、抗酸化効力およびチロシナーゼ阻害活性に関する試験が行われた。大部分の抗酸化作用試験（即ち、スーパーオキシドアニオン消去能、脂質過酸化阻害活性、第一鉄イオンキレート化能の試験）において、上記水抽出物の抗酸化作用が上記メタノール抽出物の抗酸化作用よりも優れていることが発見された。しかしながらこれらの結果は、上記メタノール抽出物のチロシナーゼ阻害能が上記水抽出物のチロシナーゼ阻害能よりも顕著に優れていることを示している。

【0009】

台湾特許第Ｉ４６５２５８号は、ジャワフトモモの花のエタノール抽出物（肌の美白とアンチエイジング効果を有する）およびその調製方法を開示している。上記調製方法は、ジャワフトモモの花の乾燥粉末を９５％エタノールで抽出処理した後、ろ過処理を行い、得られたろ液を濃縮処理する工程を含む。また、上記ジャワフトモモの花のエタノール抽出物が抗酸化剤、チロシナーゼ阻害剤として作用し、コラーゲン生成を促進することが実験から検証されている。

【0010】

中国特許出願公開第１０２２２８２０７号は、ジャワフトモモおよびそれによって得られた生成物を処理するための方法を開示している。この方法では、ジャワフトモモと水とを混合し、塩酸を用いてｐＨを３．５に調整し、ペプシンを用いて酵素加水分解反応を行う。続いて、得られたペプシン加水分解物のｐＨをＮａＯＨを用いて７．５に調整し、トリプシンを用いて酵素加水分解反応を行う。このようにして得られたトリプシン加水分解物を遠心分離し、得られた上澄みを回収し、ろ過する。このようにして得られたろ液を濃縮処理することにより、生成物が得られる。このように処理された生成物は、肺の乾燥や咳、痔による出血、消化不良、腸炎や赤痢の治療に有効であることが実験により証明されている。

【0011】

上記の文献が既にあるが、この分野の研究者は、ジャワフトモモからより満足できる生物活性成分を探し出すことを試みている。これまでの研究において本願出願人は、ジャワフトモモの果実材料の水抽出物が、チロシナーゼの活性阻害、肌の保湿性向上、創傷治癒の改善に多少の効果があることを突き止めている（なお、このような発見は未発表である）。更なる研究において、本願出願人は、ジャワフトモモの果実材料から得られた水抽出物をブロメラインで加水分解することによって調製された加水分解物は、意外にも水抽出物そのものと比べて、チロシナーゼの活性をより効果的に阻害し、肌の保湿性を向上させ、創傷治癒を改善させられることを発見した。したがって、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、化粧品または医薬組成物のための有効成分として役立つことが期待される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】台湾特許第Ｉ４６５２５８号

【文献】中国特許出願公開第１０２２２８２０７号

【非特許文献】

【0013】

【文献】Kim Y.J. and Yokozawa T. (2009), Biol. Pharm. Bull., 32:1155-1159

【文献】Kurahashi T. and Fujii J. (2009), J. Dev. Biol., 3:57-70

【文献】輔仁大学（台湾）食品栄養学科、羅珮文（Pei-Wen Lo）、「台湾特有果実の抗酸化・フリーラジカル消去活性の評価」

【文献】嘉南薬理大学（台湾）、化粧品研究所、陳宜貞（Yi-Zhen Chen）、「ジャワフトモモの花の抽出物の抗酸化における応用」（Application of Extracts from Wax Apple Flowers on Antioxidantion"）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

そこで、第１の態様において、本発明は、ジャワフトモモの果実材料を水で抽出処理して水抽出物を得ることと、前記水抽出物をブロメラインで加水分解処理することと、を含む、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物を製造する方法を提供する。
第２の態様において、本発明は、ジャワフトモモの果実材料を水で抽出処理して水抽出物を得ることと、前記水抽出物をブロメラインで加水分解処理することと、を含む方法により製造されるジャワフトモモの水抽出物の加水分解物を提供する。
第３の態様において、本発明は、上記ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物を含む組成物を提供する。
第４の態様において、本発明は、肌の美白のための手段を提供する。該手段は、対象への上記組成物の投与を含む。
第５の態様において、本発明は、肌の保湿性向上のための手段を提供する。該手段は、対象への上記組成物の投与を含む。
第６の態様において、本発明は、創傷治癒の改善のための手段を提供する。該手段は、対象への上記組成物の投与を含む。
第７の態様において、本発明は、酸化ストレスの軽減のための手段を提供する。該手段は、対象への上記組成物の投与を含む。
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照する以下の実施形態の詳細な説明において明白になるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳ（ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物）のＨＰＬＣ溶出プロファイルである。

【図2】実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳと実施例３で製造したＡＰＨＷＥＳＳ（ジャワフトモモの水抽出物の動物由来プロテアーゼ加水分解物）の第一鉄イオンキレート化能を示す。

【図3】実施例1で製造したＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳ（ジャワフトモモの水抽出物）のチロシナーゼ活性阻害効果を示し、記号「###」は対照試料と比較してｐ＜０．００１であることを表し、記号「***」はＷＥＳＳ試料と比較してｐ＜０．００１であることを表す。

【図4】実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳの創傷治癒における改善効果を示し、記号「##」は対照群と比較してｐ＜０．０１であることを表し、記号「**」はＷＥＳＳ群と比較してｐ＜０．０１であることを表す。

【図5】実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよび実施例３で製造したＡＰＨＷＥＳＳの創傷治癒における改善効果を示し、記号「###」は対照群と比較してｐ＜０．００１であることを表し、記号「***」はＡＰＨＷＥＳＳ群と比較してｐ＜０．００１であることを表す。

【図6】実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳの角質層含水量向上効果を示しており、記号「###」は対照エリアと比較してｐ＜０．００１であることを表し、記号「**」、「***」はそれぞれＷＥＳＳエリアと比較してｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１であることを表す。

【図7】実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよび実施例３で製造したＡＰＨＷＥＳＳの角質層含水量向上効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下の説明において先行技術文献を引用する場合があるが、これら引用は、当該文献が本発明が属する技術分野における一般常識の一部を形成していることを認めるものではないことを理解されたい。
また、以下の説明において、「～を含む」とは、「～を含むがそれには限らない」ことを意味する。
ここで用いられる全ての技術的及び学術的用語は、特に定義がない限り、本発明が属する分野において通常の知識を有する者が通常理解する意味で用いられる。
更に、当業者であれば、本明細書に記載されているものと類似または同等の多くの方法および材料が、本発明の実施において使用され得ることを理解するであろう。本発明は、明示された方法および材料に限定されない。

【0017】

本願出願人は、長期間使用するのに安全なスキンケア組成物を開発するために、様々な方法を用いてジャワフトモモ果実の抽出物を得ることを試みた。本願出願人は、ジャワフトモモ果実の水抽出物をブロメラインで加水分解することにより製造された加水分解物が、水抽出物そのものよりも、第一鉄イオンキレート化の促進（即ち、酸化防止剤として機能する）、チロシナーゼ阻害活性、肌の保湿性向上、創傷治癒の改善においてより効果的であることを発見した。

【0018】

したがって、本発明は、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物と、それを製造する方法を提供する。本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、ジャワフトモモの果実材料を水で抽出処理して水抽出物を得ることと、前記水抽出物をブロメラインで加水分解処理することと、を含む方法により製造される。

【0019】

本発明において、ジャワフトモモの果実材料は、ジャワフトモモの果肉を含む。実施形態によっては、ジャワフトモモの果実材料は更にジャワフトモモの果皮と種子とを含む。

【0020】

本発明において、ジャワフトモモの果実材料は、栽培品種が異なる各種のジャワフトモモ果実から得ることができる。実施形態によって、ジャワフトモモの果実材料は、「黒真珠（Black Pearl）」、ダークレッド品種、ペールレッド品種、ピンク品種（南洋種とも）、「黒鑚石（Black Diamond）」、「黒金剛(Black King Kong)」から選ばれる栽培品種に属する１種または２種以上のジャワフトモモ果実から得られる。例示的な実施形態において、ジャワフトモモの果実材料は、「黒真珠（Black Pearl）」品種に属するジャワフトモモの果実から得られる。

【0021】

本発明において、ジャワフトモモの果実材料を得るためのジャワフトモモ果実は成熟度に幅があってよい。実施形態によっては、ジャワフトモモの果実材料は、開花１ヵ月後に収穫された未熟なジャワフトモモ果実から得られる。

【0022】

本発明において、水で抽出されるジャワフトモモの果実材料は、新鮮なジャワフトモモの果実材料であってもよく、あるいは、乾燥させる、粉砕する、切り刻む、微粉砕するといった処理あるいはこれら処理を組み合わせた処理を、水による抽出処理前に行なってもよい。

【0023】

本発明において、水による抽出処理は、当業者にとってよく知られた技術を用いて実行することができる。例えば、水による抽出処理は、前述の嘉南薬理大学（台湾）の化粧品研究所の陳宜貞（Yi-Zhen Chen）による論文に示されている方法に従って行なうことができる。

【0024】

本発明の開示において、ジャワフトモモの果実材料の水に対する重量比は１：０．５から１：５の範囲にある。本発明の一実施形態において、ジャワフトモモの果実材料の水に対する重量比は１：１．５である。

【0025】

本発明において、水による抽出処理は３５℃～６５℃の温度下で行なうことができる。本発明の一実施形態において、水による抽出処理は５０℃の温度下で行なわれる。

【0026】

なお、水による抽出処理の条件は、所望の抽出結果を得るために、いくつかの要因（例えばジャワフトモモの果実材料の前処理、ジャワフトモモの果実材料の水に対する重量比など）によって変化する。

【0027】

本発明の開示において、水抽出物のブロメラインに対する重量比は１５０：１から６００：１の範囲にある。本発明の一実施形態において、水抽出物のブロメラインに対する重量比は２００：１である。

【0028】

本発明において、ブロメラインによる加水分解処理は、３０℃～６０℃の温度範囲で３時間～６時間行うことができる。本発明の一実施形態において、ブロメラインによる加水分解処理は、４５℃で４時間行われる。

【0029】

なお、ブロメラインによる加水分解処理の条件は、所望の加水分解処理結果を得るために、諸要因（例えばブロメラインの水に対する重量比など）によって変化する。

【0030】

本発明において、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物の製造工程は、加水分解処理の後に固液分離処理を行い、加水分解処理により発生した固形分を除去する工程を更に含めてもよい。固液分離処理は、当業者に周知の技術を用いて行うことができる。固液分離処理の具体例としては、ろ過、遠心分離、デカンテーション等が挙げられるが、これらに限らない。 本発明の一実施形態では、固液分離処理は、遠心分離工程およびその後のろ過工程を含む。

【0031】

本願出願人は、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物が、以下に記載される生物学的効果を有することを見出した。

【0032】

第１に、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物がチロシナーゼ活性を効果的に阻害できることをインビトロ実験によって確認した。従って、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、肌の美白に有効であることが期待される。

【0033】

なお、本明細書において、「肌を美白する」、「肌の色を明るくする」、「肌を白くする」、「肌を明るくする」、「メラニンを淡色化する」、「メラニン生成を抑制する」、および「メラニン合成を阻害する」という用語は、ほぼ同義で用いられる。

【0034】

第２に、本願出願人による予備的なヒト試験の結果、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、望ましくない副作用を招くことなく角質層の含水量を効果的に増加させることができることが示された。従って、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、肌の保湿性を高める上で有用であると期待される。

【0035】

第３に、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、線維芽細胞を介する創口閉鎖の改善に有効であることがインビトロ実験により証明された。このように、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、創傷治癒の改善に使用することができると考えられる。

【0036】

第４に、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、優れた第一鉄イオンキレート化能を有することがインビトロ実験によって証明された。したがって、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、酸化ストレスを軽減するための抗酸化剤として使用することができる。

【0037】

第５に、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、抗酸化活性を有することから、皮膚の老化予防や老化遅延に効果的であることが期待される。

【0038】

なお、本明細書中で使用される場合、「遅延」という用語は、疾患または障害の1つ以上の臨床的徴候を治療、軽減、緩和、改善、鎮静または抑制し、症状または症状に関する重症度の進行を緩和、停止、逆行させることを意味する。

【0039】

また、本明細書で使用される場合、「皮膚の老化」という用語は、自然に起こる内因性の皮膚の老化、および、環境因子（例えば紫外線）によって引き起こされる外因性の皮膚の老化を包含することを意図する。皮膚の老化現象には、毛細血管の拡張、表皮の薄化、皮膚の萎縮、肌のきめが粗くなること、乾燥、しわ形成および色素変化（例えばほくろ、そばかす、低色素沈着または色素沈着過多など）が含まれるが、これらに限定されない。

【0040】

したがって、本発明は、肌の美白、肌の保湿性向上、創傷治癒の改善、酸化ストレスの軽減、皮膚の老化の防止や遅延に適した、上記ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物を含む組成物（以下単に組成物とも）を提供する。

【0041】

また、本発明は、上記組成物を用いる以下の手段を提供する。
第一に、本発明は、上記組成物を対象に投与することを含む、肌の美白のための方法を提供する。有効量の組成物が、被験者の皮膚が有意に白くなるまで十分な時間投与され得る。上記組成物は有効量であっても被験者の皮膚に有害な副作用を引き起こさない。

【0042】

本発明において、肌の美白のための組成物の投与量および頻度は、以下の因子によって変化する。すなわち、皮膚におけるメラニン淡色化の対象エリアの初期状態、投与経路、達成したい美白効果の程度によって組成物の投与量および頻度は変化する。例えば、本発明による局所投与のための組成物の投与量は、皮膚エリア１平方ｃｍあたり１～１０ｍｇとすることができ、そして1日当たり１～３回投与され得る。特定の実施形態において、経口投与のための組成物の投与量は、体重１ｋｇあたり０．０５～５ｍｇとすることができ、そして1日に１～３回投与され得る。

【0043】

第二に、本発明は、上記組成物を被験体に投与することを含む、肌の保湿性を向上する手段を提供する。有効量の組成物が、被験者の肌の保湿性が有意に向上されるまで十分な時間投与され得る。上記組成物は有効量であっても皮膚に有害な副作用を引き起こさない。

【0044】

本発明において、肌の保湿性を高めるための組成物の投与量および頻度は、以下の因子によって変化する。すなわち、皮膚における保湿性向上の対象エリアの初期状態、投与経路、および達成したい保湿性向上効果の程度によって組成物の投与量および頻度は変化する。例えば、本発明による局所投与のための組成物の投与量は、皮膚エリア１平方ｃｍあたり１～１０ｍｇとすることができ、そして1日当たり１～３回投与され得る。特定の実施形態において、経口投与のための組成物の投与量は、体重１ｋｇあたり０．０５～５ｍｇとすることができ、そして1日に１～３回投与され得る。

【0045】

第三に、本発明は、上記組成物を被験体に投与することを含む、創傷治癒を改善する手段を提供する。有効量の組成物が、創傷領域が有意に減少するまで十分な時間投与され得る。上記組成物は有効量であっても創傷に対して有害な副作用を引き起こさない。

【0046】

本発明において、創傷治癒を改善するための組成物の投与量および頻度は、以下の因子によって変化する。すなわち、創傷の程度、投与経路、および達成したい治癒効果の程度によって組成物の投与量および頻度は変化する。例えば、本発明による局所投与のための組成物の投与量は、皮膚エリア１平方ｃｍあたり１～１０ｍｇとすることができ、そして1日当たり１～３回投与され得る。特定の実施形態において、経口投与のための組成物の投与量は、体重１ｋｇあたり０．０５～５ｍｇとすることができ、そして1日に１～３回投与され得る。

【0047】

第四に、本発明は、上記組成物を被験体に投与することを含む、酸化ストレスを軽減する手段を提供する。有効量の組成物が、酸化ストレスが有意に軽減されるまで十分な時間投与され得る。上記組成物は有効量であっても被験者に対して副作用を引き起こさない。

【0048】

本発明において、酸化ストレスを軽減するための組成物の投与量および頻度は、以下の因子によって変化する。すなわち、酸化ストレスの程度、投与経路、および達成したい抗酸化効果の程度によって組成物の投与量および頻度は変化する。例えば、本発明による局所投与のための組成物の投与量は、皮膚エリア１平方ｃｍあたり１～１０ｍｇとすることができ、そして1日当たり１～３回投与され得る。特定の実施形態において、経口投与のための組成物の投与量は、体重１ｋｇあたり０．０５～５ｍｇとすることができ、そして1日に１～３回投与され得る。

【0049】

第五に、本発明は、上記組成物を被験体に投与することを含む、皮膚の老化を防止または遅延する手段を提供する。有効量の組成物が、少なくとも一種の皮膚の老化現象が有意に改善されるまで十分な時間投与され得る。上記組成物は有効量であっても被験者に対して副作用を引き起こさない。

【0050】

本発明において、皮膚の老化を防止または遅延するための組成物の投与量および頻度は、以下の因子によって変化する。すなわち、皮膚の老化現象の程度、投与経路、および達成したい効果の程度によって組成物の投与量および頻度は変化する。例えば、本発明による局所投与のための組成物の投与量は、皮膚エリア１平方ｃｍあたり１～１０ｍｇとすることができ、そして1日当たり１～３回投与され得る。特定の実施形態において、経口投与のための組成物の投与量は、体重１ｋｇあたり０．０５～５ｍｇとすることができ、そして1日に１～３回投与され得る。

【0051】

ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物に関する上記のような生物活性と安全性から、当該加水分解物（肌の美白、肌の保湿性向上、創傷治癒の改善、酸化ストレスの軽減、皮膚老化の予防や遅延に適する）を含む組成物は、医薬組成物または化粧料組成物であり得る。

【0052】

本発明に係る医薬組成物は、当業者に周知の技術を用いて、経口または局所投与のための適切な剤形に製剤することができる。

【0053】

本発明に係る医薬組成物は、製薬に広く使用されている薬学的に許容される担体を更に含むことができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、溶媒、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、崩壊剤、分散剤、結合剤、賦形剤、安定剤、キレート剤、防腐剤、湿潤剤、滑沢剤、希釈剤、吸収遅延剤、リポソーム、甘味料、香料、着色剤などが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体の選択および量は、当業者の専門知識の範囲内である。

【0054】

経口投与剤形の例としては、無菌粉末、錠剤、トローチ、ドロップ形、丸薬、カプセル、散剤または顆粒剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、スラリーなどが挙げられるが、これらに限らない。

【0055】

局所投与剤形の例としては、エマルジョン、ゲル、軟膏、クリーム、パッチ、リニメント、粉末、エアロゾル、スプレー、ローション、セラム、ペースト、泡沫、点滴、懸濁剤、膏薬、包帯などが挙げられるが、これらに限らない。

【0056】

本発明に係る例示的な実施形態において、医薬組成物は、ジャワフトモモの水抽出物の加水分解物を、当該技術分野において周知で一般的に使用されている基剤と混合することによって、外用剤として形成される。

【0057】

本発明において、適切な基剤としては、水、アルコール、グリコール、炭化水素（ワセリンや白色ワセリン）、ワックス（パラフィンや黄ろう）、保存剤、酸化防止剤、界面活性剤、吸収促進剤、安定剤、ゲル化剤（例えばカーボポール（Carbopol）（登録商標）９７４Ｐ、微結晶性セルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、活性剤、湿潤剤、消臭剤、香料、ｐＨ調整剤、キレート剤、乳化剤、閉塞剤、皮膚軟化剤、増粘剤、可溶化剤、浸透増強剤、抗刺激剤、着色剤、噴射剤などから選ばれる一種以上を含むものが挙げられる。これらの添加剤の選択および量は、当業者の専門知識の範囲内である。

【0058】

本発明に係る化粧料組成物は、化粧品製造技術において広く使用されている化粧品に許容されるアジュバントを更に含んでもよい。化粧品に許容されるアジュバントとしては、例えば、溶媒、ゲル化剤、活性化剤、防腐剤、酸化防止剤、遮蔽剤、キレート剤、界面活性剤、着色剤、増粘剤、充填剤、香料、消臭剤から選ばれる一種以上を含むものが挙げられる。これらの添加剤の選択および量は、当業者の専門知識の範囲内である。

【0059】

本発明に係る化粧料組成物は、当業者に周知の技術を用いてスキンケアまたはメイクアップ製品の形態にすることができる。このような形態には、水溶液、水性アルコール溶液または油性溶液、エマルジョン、ゲル、軟膏、クリーム、マスク、パッチ、パック、リニメント、パウダー、エアロゾル、スプレー、ローション、セラム、ペースト、泡沫、懸濁液、ドロップ、ムース、日焼け止め、トニックウォーター、ファンデーション、アイシャドー、化粧落とし、石鹸およびその他のボディクレンジング製品が含まれるが、これらに限らない。

【0060】

本発明に係る化粧料組成物は、少なくとも一種の以下に挙げる外用剤と共に用いることができる。外用剤は即ち、美白剤（トレチノイン、カテキン、コウジ酸、アルブチン、ビタミンＣなど）、保湿剤、抗炎症剤、殺菌剤、紫外線吸収剤、藻類抽出物（アロエ抽出物なども含む）、皮膚栄養剤、麻酔剤、抗ニキビ剤、かゆみ止め、鎮痛剤、制汗剤、抗皮膚炎剤、抗高角質溶解剤、乾燥肌改善剤、老化防止剤、抗しわ剤、抗脂漏剤、創傷治癒剤、コルチコステロイド剤、ホルモン剤である。これらの薬剤の選択および量は、当業者の専門知識の範囲内である。

【実施例】

【0061】

以下、実施例を挙げて、本発明を更に説明する。但し、以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。

【0062】

〔実施例１：ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物の製造〕
台湾の屏東県枋寮郷にて収穫されたジャワフトモモの果実材料（果皮、果肉、種子を含む）３～６ｇを粉砕し、得られた粉砕物と水とを重量比１：１．５で混合し、５０℃で１時間加熱した。これにより、ジャワフトモモの水抽出物（water extract of Syzygium samarangense、以下略してＷＥＳＳと称する）を得た。

【0063】

続いて、ＷＥＳＳと１６００ＩＵ／ｇのブロメライン（台湾 青旺生技社（NEO-ONE BIOTECH CO., LTD.）製、製品番号：１６００ＧＤ）を重量比２００：１で混合し、酵素加水分解反応を４５℃で４時間進行させた。得られた反応液を遠心分離し、上澄みを回収した。この上澄みを、それぞれポアサイズが５μｍ、１μｍ、０．５μｍのフィルター（台湾 徳璽実業社(Tech Seed Enterprise Co., Ltd.)製、製品番号：PureMax、SCB2000-001、SP2000-00A）を順次用いてろ過した。得られたろ液を凍結乾燥することで、ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物（bromelain hydrolysate of water extract of Syzygium samarangense、以下略してＢＨＷＥＳＳと称する）を凍結乾燥粉末として得た。

【0064】

なお、ＢＨＷＥＳＳとの比較のために、ＷＥＳＳに対しても上記の遠心分離、ろ過および凍結乾燥処理を施して粉末形態にした。

【0065】

〔実施例２：ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物におけるＨＰＬＣ分析〕
本発明に係るＢＨＷＥＳＳの主要成分を測定するために、実施例１で得られたＢＨＷＥＳＳを蒸留脱イオン水に溶解して、ＢＨＷＥＳＳ濃度が１ｍｇ／ｍＬの試料を作製し、当該試料に対しＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析を行なった。

【0066】

使用したＨＰＬＣ機器は、ＵＶ-Ｖｉｓ検出器とＣ１８カラム（Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ ＲＰ-１８、製品番号：１５０３５９、サイズ：２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を備えたＨＰ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムである。

【0067】

適用されるＨＰＬＣ操作条件は以下の通りである。移動相はアセトニトリル／脱イオン水（１００：０、ｖ／ｖ）であり、移動相の流速は０．７ｍＬ／分である。移動相を用いた勾配溶出を以下のように３５分間行った：アセトニトリルを０～１０分の間に１００％から９０％に減少させ、１０～３０分の間に９０％から８０％に減少させ、３０分に８０％から１００％に増加させ、３０～３５分まで１００％に維持した。

【0068】

〔結果〕
図１は実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳのＨＰＬＣ溶出プロファイルである。図１に示されているように、０分から３５分の滞留時間の間に４つの主なピーク（それぞれａ、ｂ、ｃ、ｄの記号が付されている）が観測された。

【0069】

〔実施例３：ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物における抗酸化作用の評価〕
本発明に係るＢＨＷＥＳＳが抗酸化作用を有するかどうかを調べるために、実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳの第一鉄イオンキレート化能を分析した。さらに、ＢＨＷＥＳＳとの比較のために、中国特許出願公開１０２２２８２０７Ａに記載されている方法に概ね従って（多少の変更を含む）、ジャワフトモモの水抽出物の動物由来プロテアーゼ加水分解物（animal protease hydrolysate of water extract of Syzygium samarangense、以下略してＡＰＨＷＥＳＳと称する）を製造し、これに本発明に係るＢＨＷＥＳＳと同じ実験を行った。実験手順を説明する前に、ＡＰＨＷＥＳＳの製造方法を以下に示す。

【0070】

台湾の屏東県枋寮郷にて収穫されたジャワフトモモの果実材料（果皮、果肉、種子を含む）２０ｇを粉砕し、得られた粉砕物と水とを重量比１：１．５で混合し、９５℃で１５分間加熱した。これにより、ジャワフトモモの水抽出物を得た。

【0071】

５０℃まで冷ましてから、４．５％クエン酸を用いてジャワフトモモの水抽出物のｐＨを３．６８に調整した。続いて、ジャワフトモモの水抽出物と２５００ＩＵ／ｇのペプシン（Ｓｉｇｍａ社製、製品番号：Ｐ７０１２）を重量比５００００：１で混合し、酵素加水分解反応を５０℃で２時間進行させた。

【0072】

得られたペプシン加水分解物のｐＨを水酸化カリウム４ｇ／ｍＬを用いて７．６５に調整してから、９５℃に１５分間加熱した。ペプシン加水分解物と２０００ＩＵ／ｍｇのトリプシン（Ｈｉｍｅｄｉa社製、製品番号：ＲＭ６１８）を２７０００：１の重量比で混合し、酵素加水分解反応を５０℃で３時間進行させた。

【0073】

こうして得られたトリプシン加水分解物のｐＨを４．５％クエン酸を用いて６．２８に調整し、続いて遠心分離し、得られた上澄みを回収した。この上澄みを、それぞれポアサイズが５μｍ、１μｍ、０．５μｍのフィルターを順次用いてろ過した。得られたろ液を凍結乾燥することで、凍結乾燥粉末形態のＡＰＨＷＥＳＳを得た。

【0074】

〔実験手順〕
実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳの適量を蒸留脱イオン水に溶解し、ＢＨＷＥＳＳ濃度０．３５％（ｗ／ｗ）のＢＨＷＥＳＳ試料を作製した。そして、ＢＨＷＥＳＳ試料１ｍＬ、エタノール３．７ｍＬ、２ ｍＭ ＦｅＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ溶液０．１ｍＬを３０秒間混合した。得られた混合物を５ ｍＭフェロジン０．２ｍＬと均一に混合した後、無光環境且つ室温で１０分間定温放置した。この混合物に対し、Ｃｏｌｉｂｒｉ分光光度計（Titertek-Berthold社製）を用いて、５６２ｎｍの吸光度（ＯＤ₅₆₂）を測定した。また、対照試料として９５％エタノール溶液１ｍＬに対しても上記の実験手順を行った。さらに、中国特許出願公開１０２２２８２０７Ａに記載されている方法に概ね従って製造された上述のＡＰＨＷＥＳＳの適量を蒸留脱イオン水に溶解して、ＡＰＨＷＥＳＳ濃度０．３５％（ｗ／ｗ）のＡＰＨＷＥＳＳ試料を作製し、このＡＰＨＷＥＳＳ試料に対してもＢＨＷＥＳＳ試料と同じ実験手順を行なって、ＡＰＨＷＥＳＳの第一鉄イオンキレート化能を分析した。
試料の試験結果において、ＯＤ₅₆₂の値が低いほど、抗酸化作用が強いことが示される。

【0075】

第一鉄イオンキレート化率（％）は、以下の式（Ｉ）を用いて算出した。
Ａ＝［１－（Ｂ／Ｃ）］×１００ （Ｉ）
式中、
「Ａ」は第一鉄イオンキレート化率（％）であり、
「Ｂ」はＢＨＷＥＳＳ、ＡＰＨＷＥＳＳそれぞれのＯＤ₅₆₂の値であり、
「Ｃ」は対照試料のＯＤ₅₆₂の値である。
すべての実験を３回繰り返した。実験データは平均値±標準偏差として表される。

【0076】

〔結果〕
図２は、ＢＨＷＥＳＳ試料と、対照試料と、ＡＰＨＷＥＳＳ試料との第一鉄イオンキレート化率を示す。図２に示されているように、ＢＨＷＥＳＳ試料の第1鉄イオンキレート化率は、対照試料およびＡＰＨＷＥＳＳ試料のそれよりも有意に高い。この結果によって、本願出願人は、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、ジャワフトモモの水抽出物の動物由来プロテアーゼ加水分解物と比較しても、十分な抗酸化作用を発揮できると考える。

【0077】

〔実施例４：ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物におけるメラニン生成抑制効果の評価〕
本実施例では、本発明に係るＢＨＷＥＳＳのメラニン生成抑制効果をチロシナーゼ活性に基づいて評価した。さらに、比較のために、実施例１で製造したＷＥＳＳに対しても、ＢＨＷＥＳＳと同じ実験を行なった。

【0078】

〔実験手順〕
０．１ Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄溶液５００ｍＬとＫＨ₂ＰＯ₄溶液５００ｍＬを混合し、得られたリン酸緩衝液のｐＨを水酸化ナトリウムを用いて６．８に調整した。適量のチロシン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ社製、ロット番号：１０１７４３３０）を適量のリン酸緩衝液に加えて２ｍＭのチロシン溶液を調製した。

【0079】

続いて、実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳそれぞれの適量を適量のリン酸緩衝液に加え、ＢＨＷＥＳＳ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるＢＨＷＥＳＳ試料と、ＷＥＳＳ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるＷＥＳＳ試料を得た。それぞれ２１．６μＬのＢＨＷＥＳＳ試料およびＷＥＳＳ試料を、２５０μＬのチロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ社製、ロット番号：ＳＬＢＪ５６４７Ｖ）（適量のリン酸緩衝溶液中１１５．４２ Ｕ／ｍＬ）および５４０μＬのチロシン溶液に混合した。得られた混合物を、無光環境且つ３７℃で３０分間定温放置した。その後、分光光度計を用いて４７５ｎｍの吸光度（ＯＤ₄₇₅）を測定した。また、対照試料として２９０μＬのリン酸緩衝液に対しても上記の実験手順を行った。試料の試験結果において、ＯＤ₄₇₅の値が低いほど、チロシナーゼ阻害活性が強いことが示される。

【0080】

チロシナーゼ阻害活性率（％）は、以下の式（ＩＩ）を用いて算出した。
Ｄ＝［１－（Ｅ／Ｆ）］×１００ （ＩＩ）
式中、
「Ｄ」はチロシナーゼ阻害活性率（％）であり、
「Ｅ」はＢＨＷＥＳＳ、ＷＥＳＳ、対照試料それぞれのＯＤ₄₇₅の値であり、
「Ｆ」は対照試料のＯＤ₄₇₅の値である。

【0081】

すべての実験を２回繰り返した。実験データは平均値±標準偏差として表され、ＢＨＷＥＳＳ試料、ＷＥＳＳ試料および対照試料の間の差を評価するためにスチューデントのt検定（Student's t-test）によって分析された。統計的有意性はｐ＜０．０５である。

【0082】

〔結果〕
図３は、ＢＨＷＥＳＳ試料、ＷＥＳＳ試料および対照試料のチロシナーゼ活性阻害パーセントを示す。 図３に示すように、ＢＨＷＥＳＳ試料のパーセントチロシナーゼ活性阻害は、ＷＥＳＳ試料および対照試料のそれよりも有意に高い。この実験結果は、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物が、ジャワフトモモの水抽出物と比較してより良好なチロシナーゼ阻害能力を有することを示す。したがって、本願出願人は、本発明に係るジャワフトモモの水分物の加水分解物は、チロシナーゼ活性を抑制することによりメラニン生成を抑制できるので、肌の美白効果を有すると考える。

【0083】

〔実施例５：ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物における創傷治癒改善効果の評価〕
本実施例では、本発明に係るＢＨＷＥＳＳの創傷治癒改善効果を創傷治癒細胞遊走アッセイによって評価した。さらに、比較のために、実施例１で製造したＷＥＳＳおよび実施例３で製造したＡＰＨＷＥＳＳに対しても、ＢＨＷＥＳＳと同じ評価を行なった。

【0084】

〔実験材料〕
（１）ヒト皮膚線維芽細胞株Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１
本実施例で使用したヒト皮膚線維芽細胞株Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１は、台湾の財団法人食品工業発展研究所（Food Industry Research and Development Institute）の生物資源保存研究センター(Bioresource Collection and Research Center)（台湾新竹市東区食品路３３１号）から購入した。

【0085】

Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０％ペニシリン - ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、型番：１５１４０１２２）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製、製品番号：Ｍ２２７９）を含有するペトリ皿中で培養し、その後インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）中で培養した。２日ごとに培地の交換を行い、培養細胞が８０％～９０％コンフルエントになったときに細胞継代を行った。

【0086】

〔実験手順〕
（Ａ）ＢＨＷＥＳＳとＷＥＳＳとの創傷治癒改善効果の比較
実験材料の（１）で得られたＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞を、ＢＨＷＥＳＳ群、ＷＥＳＳ群、および対照群の３つの群に分けた。Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞の各群を、２×１０⁵細胞／ウェルでＭＥＭ（１０％ＦＢＳを充填）５００μＬを含む２４ウェルプレート中で培養し、次いでインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内で２４時間培養した。

【0087】

培地を新鮮なものに交換した後、２００μＬのプラスチック製ピペットチップを使用して、プレートの各ウェル内のＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞を直径線に沿ってスクラッチした。これにより、各ウェルの直径線に沿って、５００μｍ幅の、細胞が付着していない創傷領域が形成された。洗浄はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回行なわれた。新鮮なＭＥＭ（５％ＦＢＳを充填）で培地交換を行った後、ＢＨＷＥＳＳ群およびＷＥＳＳ群の細胞培養物を、実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳの適量でそれぞれ処置し、ＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳ群の最終濃度をそれぞれ０．０３％（ｗ／ｗ）ＢＨＷＥＳＳおよび０．０３％（ｗ／ｗ）ＷＥＳＳとした。対照群の細胞培養物には上記処置を行わなかった。

【0088】

その後、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内で１２時間培養した。０時間（処置前）および処置後１２時間後に、倍率４０倍の倒立顕微鏡（ニコン社製 ＴＥ３００）を用いて各群の創傷領域を観察し、デジタルカメラ（ニコン社製 Ｄ９０）を用いて撮影し、得られた写真を基にＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて面積計算を行った。

【0089】

創傷治癒率（％）は、以下の式（ＩＩＩ）を用いて算出した。
Ｇ＝［１－（Ｈ／Ｉ）］×１００ （ＩＩＩ）
式中、
「Ｇ」は創傷治癒率（％）であり、
「Ｈ」は処置後１２時間後の創傷領域の面積であり、
「Ｉ」は処置前の創傷領域の面積である。

【0090】

すべての実験を２回繰り返した。実験データは平均値±標準偏差として表され、ＢＨＷＥＳＳ群、ＷＥＳＳ群および対照群の間の差を評価するためにスチューデントのt検定（Student's t-test）によって分析された。統計的有意性はｐ＜０．０５である。
（Ｂ）ＢＨＷＥＳＳとＡＰＨＷＥＳＳとの創傷治癒改善効果の比較

【0091】

まず、２４ウェルプレートの各ウェルの直径線に沿って、幅５００μｍのＳＰＬＳｃａｒ（登録商標）ブロック（台湾Bio-genesis Technologies社製、型番：２０１９０２）を配置した。続いて、実験材料の（１）で得られたＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞を、ＢＨＷＥＳＳ群、ＡＰＨＷＥＳＳ群、および対照群の３つの群に分けた。Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞の各群を、５×１０⁴細胞／ウェルでＭＥＭ（１０％ＦＢＳを充填）５００μＬを含む２４ウェルプレート中で培養し、次いでインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内で２４時間培養した。

【0092】

その後、ＳＰＬＳｃａｒブロックを除去することで、５００μｍ幅の、細胞が付着していない創傷領域が形成された。洗浄はリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回行なわれた。新鮮なＭＥＭ（５％ＦＢＳを充填）で培地交換を行った後、ＢＨＷＥＳＳ群およびＡＰＨＷＥＳＳ群の細胞培養物を、実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよび実施例３で製造したＡＰＨＷＥＳＳの適量でそれぞれ処置し、ＢＨＷＥＳＳ群およびＡＰＨＷＥＳＳ群の最終濃度をそれぞれ０．０２５％（ｗ／ｗ）ＢＨＷＥＳＳおよび０．０３％（ｗ／ｗ）ＡＰＨＷＥＳＳとした。対照群の細胞培養物には上記処置を行わなかった。

【0093】

その後、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）内で１２時間培養した。０時間（処置前）および処置後１２時間後に、倍率４０倍の倒立顕微鏡（オリンパス社製 ＩＸ７３）を用いて各群の創傷領域を観察し、デジタルカメラ（オリンパス社製 ＤＰ８０）を用いて撮影し、得られた写真を基にＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて面積計算を行った。そして式（ＩＩＩ）を用いて創傷治癒率（％）を算出した。

【0094】

すべての実験を３回繰り返した。実験データは平均値±標準偏差として表され、ＢＨＷＥＳＳ群、ＡＰＨＷＥＳＳ群および対照群の間の差を評価するためにスチューデントのt検定（Student's t-test）によって分析された。統計的有意性はｐ＜０．０５である。

【0095】

〔結果〕
図４は、ＢＨＷＥＳＳまたはＷＥＳＳで処置したＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞および処置を受けなかった同細胞の創傷治癒率を示す。図４に示すように、ＷＥＳＳ群と対照群の創傷治癒率に有意差は認められなかった。一方、ＢＨＷＥＳＳ群の創傷治癒率は、対照群およびＷＥＳＳ群のそれよりも有意に高かった。

【0096】

図５は、ＢＨＷＥＳＳまたはＡＰＨＷＥＳＳで処置したＤｅｔｒｏｉｔ５５１細胞および処置を受けなかった同細胞の創傷治癒率を示す。図５に示すように、ＡＰＨＷＥＳＳ群と対照群の創傷治癒率に有意差は認められなかった。しかし、ＢＨＷＥＳＳ群の創傷治癒率は、対照群およびＡＰＨＷＥＳＳ群のそれよりも有意に高かった。

【0097】

以上の実験結果から、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は、線維芽細胞による創傷閉鎖の改善に有効であり、創傷治癒を促進することができることが明らかとなった。

【0098】

〔実施例６：ジャワフトモモの水抽出物のブロメライン加水分解物における皮膚の保湿性向上効果の評価〕
本発明に係るＢＨＷＥＳＳのヒトの皮膚の保湿性に対する向上効果を調べるために、以下の実験を行った。

【0099】

（Ａ）エッセンスの調製
本実施例では、実施例１で製造したＢＨＷＥＳＳおよびＷＥＳＳと、実施例３で製造したＡＰＨＷＥＳＳとを使用した。表１に示すレシピを用いて、４種類のエッセンス（ＢＨＷＥＳＳエッセンス、ＷＥＳＳエッセンス、ＡＰＨＷＥＳＳエッセンス、対照エッセンス）をそれぞれ調製した。

【0100】

【表1】

【0101】

ＢＨＷＥＳＳエッセンス、ＷＥＳＳエッセンス、ＡＰＨＷＥＳＳエッセンスを調製するプロセスは、以下の通りである。即ち、ブチレングリコールおよびヒドロキシエチルセルロースを撹拌しながら７５℃の脱イオン水に溶解した後に、４０℃～４５℃に冷却した。ＢＨＷＥＳＳ、ＷＥＳＳ、ＡＰＨＷＥＳＳをそれぞれ添加し、続いて撹拌しながらＤｅｒｍｏｓｏｆｔ ＯＭＰと混合した。次に、水酸化ナトリウムを用いて、各々得られた混合物のｐＨを約６～７に調整し、ＢＨＷＥＳＳエッセンス、ＷＥＳＳエッセンス、ＡＰＨＷＥＳＳエッセンスを得た。

【0102】

対照エッセンスを調製するプロセスは、ＢＨＷＥＳＳの代わりに追加の脱イオン水を使用したことを除いて、ＢＨＷＥＳＳエッセンスを調製するプロセスと同様である。

【0103】

（Ｂ）ＢＨＷＥＳＳとＷＥＳＳとの皮膚の保湿性向上効果の比較
台湾屏東県にある允頂企業社（Yeun Diing Enterprise CO., LTD.）および台湾雲林県にある頂宏生物科技社（M.H. Biotechnology Co., Ltd.）の社員から募られた対象者を、表２に記載の除外基準に従ってスクリーニングした。その結果、１０人の適格被験者（２５歳～４０歳の男性４人および女性６人）が、下記の試験に参加した。

【0104】

【表2】

【0105】

被験者の右腕を、それぞれ幅が指４本分の３つの試験エリア（すなわち、ＢＨＷＥＳＳエリア、ＷＥＳＳエリアおよび対照エリア）にランダムに分割し、各エリアに上記「（Ａ）エッセンスの調製」で調製したＢＨＷＥＳＳエッセンス、ＷＥＳＳエッセンスまたは対照エッセンスを、１回０．５ｍＬの用量で１日２回塗布した。各試験エリアの試験期間は合計２８日間とした。

【0106】

０日目（すなわち、試験エッセンスの塗布前）および試験エッセンスの塗布開始後の指定された時点（７、１４、２１、２８日目）に、各被験体の試験エリアに対して、それぞれ静電容量計（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＣＭ２８５、Ｃｏｕｒａｇｅ＆Ｋｈａｚａｋａ社製）を用いて角質層の含水率を測定した。

【0107】

角質層の含水率の向上率（％）は、以下の式（ＩＶ）を用いて算出した。
Ｊ＝［（Ｌ-Ｋ）／Ｋ］×１００ （ＩＶ）
式中、
「Ｊ」は指定された各時点（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）における角質層の含水量の向上率（％）であり、
「Ｋ」は０日目の角質層の含水量であり、
「Ｌ」は指定された各時点における角質層の含水量である。

【0108】

各被験者の試験エリアに対して含水量の測定を３回繰り返した。実験データは平均値±標準偏差として表され、各試験エリア間の差を評価するためにスチューデントのt検定（Student's t-test）によって分析された。統計的有意性はｐ＜０．０５である。

【0109】

加えて、安全性評価が、０日目およびその後の指定された各時点（７日目、１４日目、２１日目、２８日目）に研究者によって行われた。０日目に、少量のエッセンスが安全性評価のため被験者の上腕部内側に塗布され、有害な皮膚反応（かゆみ、刺激および紅斑など）が起きるかどうかが調査された。

【0110】

（Ｃ）ＢＨＷＥＳＳとＡＰＨＷＥＳＳとの皮膚の保湿性向上効果の比較
頂宏生物科技社（M.H. Biotechnology Co., Ltd.）の社員から募られた対象者を、表２に記載の除外基準に従ってスクリーニングした。その結果、９人の適格被験者（２５歳～４０歳の男性６人および女性３人）が、下記の試験に参加した。

【0111】

試験エッセンスの塗布、角質層の含水量の測定、および安全性評価は、以下の相違点を除いて、本実施例の上記（Ｂ）に記載された手順に概ね従って実施した。相違点は、ＡＰＨＷＥＳＳエッセンスをＷＥＳＳエッセンスに置き換えて試験したこと、ＡＰＨＷＥＳＳエッセンスを塗布するエリアをＡＰＨＷＥＳＳエリアとする（すなわち、ＡＰＨＷＥＳＳエリアでＷＥＳＳエリアを置き換える）こと、角質層の含水量の測定を試験エッセンスの塗布開始後の１つの指定された時点（１４日目）にのみ実施したことである。

【0112】

〔結果〕
（１）角質層の含水量の測定結果
図６は、異なる時点におけるＢＨＷＥＳＳ、ＷＥＳＳおよび対照エリアのそれぞれにおける角質層の含水量の向上率を示す。図６に示すように、試験エッセンスの塗布開始後１４日目、２１日目、２８日目において、ＢＨＷＥＳＳエリアの角質層の含水量の向上率は、ＷＥＳＳエリアおよび対照エリアのそれよりも有意に高い。さらに、ＢＨＷＥＳＳエリアの角質層の含水率は時間の経過と共に著しく増加したが、ＷＥＳＳエリアの含水率の向上は非常に遅かった。

【0113】

図７は、ＢＨＷＥＳＳ、ＡＰＨＷＥＳＳおよび対照エリアそれぞれの１４日目における角質層の含水量の改善率を示す。図７に示すように、ＢＨＷＥＳＳエリアにおける角質層の含水量の改善率は、ＡＰＨＷＥＳＳエリアおよび対照エリアのそれよりも高い。

【0114】

上記のデータは、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物が、肌の保湿性を効果的に高めるために使用できることを示唆している。

【0115】

（２）安全性評価結果
試験期間中、すべての被験者において有害な皮膚反応は観察されなかった（データは示されない）。

【0116】

以上のことから、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は優れた抗酸化活性を示し、メラニン生成を抑制し、肌の保湿性を高め、創傷治癒を促進することができる。これにより、本願出願人は、本発明に係るジャワフトモモの水抽出物の加水分解物は有害な副作用を誘発しない長期間の使用のためのスキンケア製品に発展させることができると考える。

【0117】

本明細書に引用されるすべての特許および参考文献は、その全体の内容が本明細書に参照として包含される。但し、参照した内容と本願発明に係る記載との間に矛盾が生まれた場合には、定義を含めて本願発明に係る記載が優先される。

【0118】

以上、本発明の例示的と思われる実施形態を説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々な形態として、全ての修飾および均等な構成を包含するものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】