【図1】 図1は、MPSロッドのSEM画像である。これらのロッドのランダムスタッキングおよび自己組織化は、細胞浸潤を可能にする三次元空間を生じる。

【図2】 図2は、異なる長さのMPSロッドに依存する表面マーカー発現を示す棒グラフである。100μgの異なる長さのMPSロッドを骨髄由来の樹状細胞と共に18時間インキュベートした。炎症のマーカーとして、活性化細胞の割合を、細胞表面受容体であるCD11c（DCマーカー）、MHCII（抗原提示マーカー）およびCD86（共刺激受容体）を染色することによって決定した。ロッドの炎症特性は、長さの増加と共に増加した。望ましい骨格（scaffold）は、（PLG骨格対照と同様に）炎症特性を示すため、30～100μmまたは120μmのロッドを以下の実験で使用した。

【図3A】 図3は、マウスにおけるMPSロッドの効果を示す一連の画像である。図3Aは、5mgのローダミン標識MPSロッドをC57bl/6jマウスに皮下注射した7日後に切除された骨格注射部位を示す写真である。皮下ポケットは、ロッドが局在化され、三次元微小環境を生じるために自己組織化されることを示す。

【図3B】 図3は、マウスにおけるMPSロッドの効果を示す一連の画像である。図3Bは、骨格部位への細胞浸潤を示す切除された骨格部位のSEM画像である。

【図3C】 図3は、マウスにおけるMPSロッドの効果を示す一連の画像である。図3Cは、生細胞の動員を示す、MPS骨格から分離された生細胞／死細胞の画像を示す。

【図4】 図4Aは、MPSロッドからのGM-CSF放出を示す線グラフである。1μgのGM-CSFをMPSロッドに負荷し、0.1％のBSA／PBS中でインキュベートした。上清を一定期間ごとに回収し、ELISA（R＆D）を用いてGM-CSFを測定した。GM-CSFは、MPSロッドから連続的に放出される。図4Bは、インビトロでのMPSと骨髄由来樹状細胞（BMDC）の共培養における表面マーカー発現を示す棒グラフである。100μgの未修飾MPSロッド、アミン修飾MPSロッド、チオール修飾MPSロッド、クロロ修飾MPSロッド、およびホスホネート修飾MPSロッドを106/mlのBMDCと共に18時間インキュベートした。その後、細胞をMHCクラスIIおよび共刺激分子CD86の発現に対して解析した。MPS により刺激されたBMDCのMHCIIおよびCD86の発現の増加は、MPSロッドが炎症性であり、この特性が表面修飾MPSロッドによって調節されたことを示す。

【図5】 図5Aは、GM-CSFを負荷したMPSロッドによるCDの動員を示す棒グラフである。1μg／マウスGM-CSFを負荷した5mg／マウスMPSロッド、またはこれを負荷していない5mg／マウスMPSロッドを皮下注射した。骨格部位由来の細胞を回収し、CD11c受容体（DCマーカー）を染色した。GM-CSFを負荷したMPS骨格は、ブランクMPS骨格よりもより多くのDCを動員することができた。図5Bは、DCの表面マーカー発現を示す棒グラフである。GM-CSFおよびCpG-ODNを負荷したMPS骨格は、CpG-ODN無しのものより、より多くのDCを活性化した。

【図6】 図6A～Bは、骨格部位でのB220+細胞の割合（図6A）または骨格部位でのB220+細胞の総数（図6B）を示す棒グラフである。1μg／マウスGM-CSF、100μgのCpG-ODN、および130μgのオボアルブミンを負荷した5mg／マウスMPSロッド、またはこれらを負荷していない5mg／マウスMPSロッドを皮下注射した。骨格部位由来の細胞を一定期間ごとに回収し、B220受容体（B細胞マーカー）を染色した。GM-CSF、CpG-ODN、およびOvaを負荷したMPS骨格は、3日目までにより多くのB細胞を動員することができた。

【図7A】 図7Aは、フローサイトメトリー散布図である。GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格は、流入領域リンパ節（dLN）に戻った抗原特異的DCの増殖を誘導した。dLN細胞を樹状細胞マーカーCD11c、およびマーカーMHC-I-SIINFEKLで染色した。マーカーMHC-I-SIINFEKLは、オボアルブミンタンパク質の一部であるペプチド配列SIINFEKLがMHC-I複合体の細胞表面に提示されることを示す。

【図7B】 図7Bは、DC表面のMHC-I-SIINFEKL（SEQ ID NO: 1）マーカーの存在を示す棒グラフである。GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格は、流入領域リンパ節（dLN）に戻った抗原特異的DCの増殖を誘導した。dLN細胞を樹状細胞マーカーCD11c、およびマーカーMHC-I-SIINFEKLで染色した。マーカーMHC-I-SIINFEKLは、オボアルブミンタンパク質の一部であるペプチド配列SIINFEKLがMHC-I複合体の細胞表面に提示されることを示す。

【図7C】 図7Cは、DC表面のMHC-I-SIINFEKL（SEQ ID NO: 1）マーカーの存在を示す棒グラフである。GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格は、流入領域リンパ節（dLN）に戻った抗原特異的DCの増殖を誘導した。dLN細胞を樹状細胞マーカーCD11c、およびマーカーMHC-I-SIINFEKLで染色した。マーカーMHC-I-SIINFEKLは、オボアルブミンタンパク質の一部であるペプチド配列SIINFEKLがMHC-I複合体の細胞表面に提示されることを示す。

【図8】 図8A～Bは、MPS骨格による胚中心の形成を示す棒グラフである。GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格は、胚中心を誘導し、dLNの活性化および抗原刺激B細胞に戻ることができた。dLN細胞を、体細胞突然変異およびアイソタイプスイッチの工程において活性化されるB細胞のみを存在させる胚中心の形成を調べるために、B220（B細胞マーカー）およびGL7（胚中心マーカー）で染色した。

【図9】 図9A～Bは、GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格が、モデル抗原を特異的に認識することができるCD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の増殖を誘導することができたことを示す棒グラフである。脾細胞をCD8（キラーT細胞マーカー）に対し、およびT細胞がMHCI複合体に提示された特異的抗原を認識することができるかどうかを示すMHCI四量体SIINFEKL抗体で染色した。

【図10】 図10A～Cは、GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格が、dNLおよび脾臓の抗原特異的CD8+ CTLのクローン増殖を誘導することができたことを示すヒストグラムである。OT-Iマウス由来の注射された脾細胞は、細胞追跡色素であるCFSEで染色された。その蛍光は、細胞分裂ごとに半分になる。完全に負荷されたワクチン群における脾臓およびdNLのCFSE染色脾細胞の弱い蛍光は、ova特異的CTL増殖を示す。

【図11】 図11A～Cは、GM-CSF、CpG-ODN、およびモデル抗原であるオボアルブミンを負荷したMPS骨格が、dLNおよび脾臓の抗原特異的CD4+ THのクローン増殖を誘導することができたことを示すヒストグラムである。OT-IIマウス由来の注射された脾細胞は、細胞追跡色素であるCFSEで染色された。その蛍光は、細胞分裂ごとに半分になる。完全に負荷されたワクチン群および抗原群のみを負荷したMPSにおける脾臓およびdLNのCFSE染色脾細胞の弱い蛍光は、ova特異的CD4+ TH細胞増殖を示す。

【図12】 図12A～Bは、抗体力価が、抗体-血清溶液が希釈され、検出可能な量の抗体を依然として含むことができる程度として規定されることを示すヒストグラムである。抗オボアルブミン血清抗体を滴定した。GM-CSF、CpG-ODN、およびovaを負荷したMPS骨格は、強力かつ長期間のTH1およびTH2抗体応答を誘発した。OVAのみを負荷したMPSは、MPSの物質自体のアジュバント能力を示す強力なTH2応答を誘発することができる。

【図13】 図13A～Bは、制御され持続された様式で、GM-CSFがMPS微粒子から放出されることを示す線グラフである。A）1μgのGM-CSFを5mgのMPSロッドに負荷し、0.1％のBSA／PBS中でインキュベートした。上清を一定期間ごとに回収し、ELISA（R＆D）を用いてGM-CSFを測定した。GM-CSFは、少量ではあるがMPSロッドから連続的に放出された。B）1μgのGM-CSFを、OVAおよびCpGを含む5mgのMPSロッドに負荷した。その後、それをC57BL/6jマウスに皮下注射した。様々な時点で、注射された粒子骨格の周囲の組織を採取し、GM-CSFレベルを解析した。GM-CSFのレベルは、1週間を通して維持された。

【図14A】 図14Aは写真である。高いアスペクト比のMPS微粒子が、より多くの細胞を動員する。図14Aは、10μm～20μmの長さまたは80μm～120μmの長さのいずれかであるMPS微粒子のSEM画像を示す。より長いロッドが、ロッド間でより大きな面積または空間を有する組成物を生じた。

【図14B】 図14Bは写真である。高いアスペクト比のMPS微粒子が、より多くの細胞を動員する。図14Bは、マウスから採取されたMPS組成物を示す。5μgのMPS微粒子をマウスに皮下注射し、注射後7日目に骨格部位を採取した。

【図14C】 図14Cは棒グラフである。高いアスペクト比のMPS微粒子が、より多くの細胞を動員する。図14Cは、骨格から単離された細胞の計数を示す棒グラフである。高いアスペクト比のMPS微粒子が、より多くの細胞を動員した。

【図15】 図15A～Bは棒グラフである。樹状細胞（DC）は、GM-CSFに対する応答としてMPS微粒子に動員される。MPS微粒子は、GM-CSF（0ng、500ng、1000ng、3000ng）で負荷され、マウスに皮下注射された。注射後7日目に骨格を採取し、フローサイトメトリーを用いて解析した。図15Aは、動員されたCD11c+CD11b+DCがGM-CSF用量の増加と共に増加することを示す。図15Bは、動員された成熟CD11c+MHCII+DCもDCもGM-CSF用量の増加と共に増加することを示す。

【図16】 図16は、GM-CSFが流入領域LNへの動員されたDCの輸送を増加させることを示す棒グラフである。MPS微粒子は、Alexa 647標識オボアルブミン（OVA）、またはAlexa 647標識OVAおよび1μgのGM-CSFで負荷され、マウスに皮下注射された。注射後7日目に流入領域リンパ節（dLN）を採取し、フローサイトメトリーを用いて解析した。抗原（OVA）の添加により、骨格に輸送されたAlexa 647+CD11c+DCおよび取り込まれたOVAが軽度に増加する。しかし、GM-CSFの添加は、骨格からdLNへのDC輸送を著しく増加させる。

【図17-1】 図17A～Cは散布図である。MPS微粒子骨格からのCpG-ODNの局所的送達は、活性化DCの循環を増加させる。MPS微粒子は、1μgのGM-CSF、300μgのOVA、および100μgのCpG-ODNで負荷された。その後、それらをマウスに皮下注射した。注射後7日目にdLNを採取し、解析した。LN細胞をCD11cおよびCD86で染色した。MPS骨格から局所的に放出されるCpG-ODNの添加は、dLNにおける活性化成熟DCの割合および数をさらに増加させる。

【図17-2】 図17Dは棒グラフである。MPS微粒子骨格からのCpG-ODNの局所的送達は、活性化DCの循環を増加させる。MPS微粒子は、1μgのGM-CSF、300μgのOVA、および100μgのCpG-ODNで負荷された。その後、それらをマウスに皮下注射した。注射後7日目にdLNを採取し、解析した。LN細胞をCD11cおよびCD86で染色した。MPS骨格から局所的に放出されるCpG-ODNの添加は、dLNにおける活性化成熟DCの割合および数をさらに増加させる。

【図18-1】 図18A～Cは写真である。タンパク質は、制御され持続された様式で、MPS微粒子骨格から放出される。緩衝液中またはMPS微粒子に負荷されたAlexa 647標識オボアルブミンをマウスの側腹部に皮下注射した。様々な時点で、相対蛍光をIVISを用いて測定した。緩衝液中のものを注射した場合、タンパク質は1日未満で注射部位から拡散する。しかし、MPS微粒子に負荷されたものの場合、タンパク質は維持された様式で、例えば1週間を通じて（2日、3日、4日、5日、7日、またはそれ以上の日数）、局所的骨格部位から放出される。

【図18-2】 図18Dは棒グラフである。タンパク質は、制御され持続された様式で、MPS微粒子骨格から放出される。緩衝液中またはMPS微粒子に負荷されたAlexa 647標識オボアルブミンをマウスの側腹部に皮下注射した。様々な時点で、相対蛍光をIVISを用いて測定した。緩衝液中のものを注射した場合、タンパク質は1日未満で注射部位から拡散する。しかし、MPS微粒子に負荷されたものの場合、タンパク質は維持された様式で、例えば1週間を通じて（2日、3日、4日、5日、7日、またはそれ以上の日数）、局所的骨格部位から放出される。

【図19】 図19A～Bは、抗体力価を示す線グラフである。抗体力価は、抗体-血清溶液が希釈され、検出可能な量の抗体を依然として含むことができる程度として規定される。マウスは、300μgのOVA、100μgのCpG-ODN、および1μgのGM-CSFを可溶性形態または5mgのMPS微粒子に負荷された形態でワクチン接種された。抗オボアルブミン血清抗体を滴定する。GM-CSF、CpG-ODN、およびovaを負荷したMPS骨格は、IgG2aおよびIgG1抗体がそれぞれ高力価であることによって示されるように、強力かつ長期間のTH1およびTH2抗体応答を誘発することができる。より印象的に、この応答は、1回の注射によるワクチン接種後、200日を超えて提示される。この応答を米国でヒトへの使用を認可された唯一のアジュバントである水酸化アルミニウムを用いて送達されたOVAと比較した。MPSワクチンは、低分子サイトカイン、タンパク質、およびDNAを負荷する能力のために、TH1およびTH2抗体応答の両方を誘導することができるが、ミョウバン（alum）により誘導される応答は完全にTH2に偏る。MPSワクチンは非常に用途が広く、特異的免疫応答を誘導するために容易に細かく調製され制御される。

【図20-1】 図20Aは、MPSワクチンでのワクチン接種が濾胞性ヘルパーT細胞の増殖を誘導することを示す散布図である。OT-II脾細胞をCFSEで染色し、Thy 1.1+レシピエントマウスに養子移入した。その後、レシピエントマウスをMPSおよびリゾチーム、MPSおよびOVA、ならびにGM-CSFおよびCpGを含む完全型のワクチンでワクチン接種した。ワクチン接種の3日後、dLNを採取し、養子移入細胞を解析した。MPSおよびOVAでワクチン接種されたマウス、ならびに完全型のワクチンでワクチン接種されたマウスは、濾胞性ヘルパーT細胞の強力な集団を生じたことが示される。濾胞性ヘルパーT細胞は、完全機能的抗原特異的抗体を分泌する形質細胞を分化させ成熟させるために、B細胞を「助ける（helping）」直接的原因である細胞である。

【図20-2】 図20B～Dは、MPSワクチンでのワクチン接種が濾胞性ヘルパーT細胞の増殖を誘導することを示す散布図である。OT-II脾細胞をCFSEで染色し、Thy 1.1+レシピエントマウスに養子移入した。その後、レシピエントマウスをMPSおよびリゾチーム、MPSおよびOVA、ならびにGM-CSFおよびCpGを含む完全型のワクチンでワクチン接種した。ワクチン接種の3日後、dLNを採取し、養子移入細胞を解析した。MPSおよびOVAでワクチン接種されたマウス、ならびに完全型のワクチンでワクチン接種されたマウスは、濾胞性ヘルパーT細胞の強力な集団を生じたことが示される。濾胞性ヘルパーT細胞は、完全機能的抗原特異的抗体を分泌する形質細胞を分化させ成熟させるために、B細胞を「助ける（helping）」直接的原因である細胞である。

【図21】 図21A～Dは、MPSワクチンでのワクチン接種がCD4+ヘルパーT細胞のクローン増殖を誘導することを示す線グラフである。OT-II脾細胞をCFSEで染色し、Thy 1.1+レシピエントマウスに養子移入した。その後、レシピエントマウスをMPSおよびリゾチーム、MPSおよびOVA、ならびにGM-CSFおよびCpGを含む完全型のワクチンでワクチン接種した。ワクチン接種の3日後、dLNを採取し、養子移入細胞を解析した。MPSおよびOVAの両方、ならびに完全型のワクチンは、全身性抗原特異的応答を示すCD4+ヘルパーT細胞の強力なクローン増殖を誘導したことが示される。

【図22】 図22A～Bは、MPS微粒子のグリコール酸または乳酸の修飾が、生物活性GM-CSFの放出を助けることを示す線グラフである。1μgのGM-CSFを5mgのグリコール酸または乳酸で修飾されたMPSロッドに負荷し、0.1％のBSA／PBS中でインキュベートした。上清を一定期間ごとに回収し、ELISA（R＆D）を用いてGM-CSFを測定した。未修飾のMPS微粒子から放出されたGM-CSFと比較して、グリコール酸および乳酸の修飾は、20倍を超える生物活性GM-CSFの累積放出を増加させる。

【図23】 図23A～Dは、グリコール酸で修飾されたMPSが、動員されたDCおよび成熟DCの割合を増加させることを示す散布図である。5mgの未修飾またはグリコール酸で修飾されたMPS微粒子が、1μgのGM-CSFで37Cで1時間負荷され、マウスに皮下注射された。7日後に骨格を採取し、解析した。修飾されたMPSが、動員されたCD11c+CD11b+DCの割合をほぼ2倍にし、CD11c+CD86+成熟DCの割合をさらに著しく増加させることは明らかである。これらの結果は、MPS微粒子の大きな表面修飾能力が、免疫応答をより強力に誘導するために、動員細胞の表現型をさらに操作することが可能であることを示す。