7093087 遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを含む組成物および遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-21

(45)【発行日】2022-06-29

(54)【発明の名称】遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを含む組成物および遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20220622BHJP

   C12N 15/16 20060101ALI20220622BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220622BHJP

   C07K 14/59 20060101ALI20220622BHJP

【ＦＩ】

C12P21/02 C ZNA

C12N15/16

C12N5/10

C07K14/59

【請求項の数】 9

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020115714

(22)【出願日】2020-07-03

(62)【分割の表示】P 2018542093の分割

【原出願日】2016-11-04

(65)【公開番号】P2020182471

(43)【公開日】2020-11-12

【審査請求日】2020-08-03

(31)【優先権主張番号】10-2015-0154882

(32)【優先日】2015-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】516351304

【氏名又は名称】ジェネクシン・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＸＩＮＥ， ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】４Ｆ，Ｂｌｄｇ． Ｂ，７００，Ｄａｅｗａｎｇｐａｎｇｙｏ－ｒｏ，Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ，Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １３４８８，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(73)【特許権者】

【識別番号】518438092

【氏名又は名称】プロゲン・シーオー．，エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＧＥＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】１３０９－ｈｏ， ２２２， Ｂａｎｐｏ－ｄａｅｒｏ， Ｓｅｏｃｈｏ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０６５９１， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100108855

【弁理士】

【氏名又は名称】蔵田 昌俊

(74)【代理人】

【識別番号】100103034

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信久

(74)【代理人】

【識別番号】100179062

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 正

(74)【代理人】

【識別番号】100199565

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 茂

(74)【代理人】

【識別番号】100153051

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100162570

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 早苗

(72)【発明者】

【氏名】スン、ユン・チュル

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、ジュンヨン

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】特表平０４－５０１８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／０９１１２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Applied Biochemistry and Biotechnology，2011年，Vol.164，p.401-409

【文献】Australian and New Zealand Journal of Surgery，2005年，Vol.75，p.10-20

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴｐｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）ｒｈＴＳＨを産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養する工程；
２）培養細胞数が細胞５×１０^６から１×１０^７個／ｍＬに達した時に、前記培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げることにより前記細胞株を培養する工程；ならびに
３）（ｉ）抗－性腺刺激ホルモン抗体に結合した樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより一次精製液を得る工程、
（ｉｉ）前記一次精製液をフィルターで深層ろ過することにより二次精製液を得る工程、
（ｉｉｉ）前記二次精製液をダイアフィルトレーションすることにより三次精製液を得る工程、および
（ｉｖ）前記三次精製液をアニオン交換クロマトグラフィーにより精製することにより、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が１００ｐｐｍ未満のｒｈＴＳＨを得る工程
を含む、培養液からｒｈＴＳＨを得る工程
を含む、遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを流加培養により高収率および高純度で生産する方法。

【請求項2】

前記ヒト甲状腺刺激ホルモンが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程１）のｒｈＴＳＨを産生する前記細胞株が、ｒｈＴＳＨのαサブユニットをコードする遺伝子とそのβサブユニットをコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

工程１）の前記培養温度が３６℃から３８℃の範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記培養温度が３７℃である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程２）において前記培養温度を下げる時の前記培養細胞数が細胞６×１０^６から８×１０^６個／ｍＬの範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記細胞数が細胞６×１０^６個／ｍＬである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

工程２）の前記培養温度が３１℃から３３℃の範囲である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記培養温度が３３℃である、請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを含む組成物および遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）は、脳下垂体前葉を通して視床下部より分泌され、様々な機序、たとえば神経系などの組織の全般的な増殖、基礎代謝率の促進、成長ホルモンおよびプロラクチンの生産および分泌、ホルモン活性、グルコース再吸収の増加、ミトコンドリア酸化／リン酸化の亢進、副腎髄質の活性、酵素合成の誘導などに関与している。ある特定のシグナル伝達経路を活性化するため、ＴＳＨは甲状腺の甲状腺濾胞細胞のＴＳＨレセプターと結合し、上記の機序に介在するＴ３（トリヨードチロニン）およびＴ４（チロキシン）と呼ばれる２つのホルモンの生産および分泌を誘導する。さらに、ＴＳＨは２つのサブユニットから成り、これらは９２個のアミノ酸を含むαサブユニットと１１８個のアミノ酸を含むβサブユニットと呼ばれる。

【0003】

甲状腺がんの有病率は世界中で増加し続けている。米国では１９８０年から２０１０年の３０年で甲状腺がんの患者数が６倍に増加し、韓国では１９９０年から２０１０年の２０年で約１８倍に増加した。米国では２０１０年から２０３０年の２０年で甲状腺がんの患者数は約３．５倍に増加すると見込まれているが、他の主ながんの患者数は同じ期間に一定で推移するかわずかに減少すると見込まれている。

【0004】

甲状腺がんと診断された場合、ほとんどの治療で甲状腺組織を患者から完全に切除する。甲状腺切除術を受けた患者は、甲状腺機能を維持するため残りの生涯にわたって甲状腺ホルモンであるＴ３およびＴ４の投与を受けなければならない。これらの甲状腺がんの治療においては、甲状腺切除術後の残存組織によるがんの再発や転移を防ぐため、事後検査が非常に重要である。初期の甲状腺がんの再発の確定診断に関しては、Ｔ３およびＴ４の投与を長期間中断した後に血中のサイログロブリンタンパク質を定量することにより再発を確認しているが、このような方法では一定期間Ｔ３およびＴ４の投与を中断するため様々な副作用、たとえば甲状腺機能低下が生じる。このため、この２０年では、Ｔ３およびＴ４のホルモンの投与を中断せずに、遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモン（ｒｈＴＳＨ）を投与した後２から３日以内に血中のサイログロブリンタンパク質を定量することにより甲状腺がんの再発を診断する方法が広く用いられている。

【0005】

さらに、再発甲状腺がんを副作用なく効果的に治療できるように、甲状腺を切除した患者から残存する甲状腺組織を切除する場合、ｒｈＴＳＨは治療目的の放射性同位体（ヨウ素）の吸収率を増加させるために併用することが可能である。

【0006】

しかし、現在、市販のｒｈＴＳＨは生産性と精製収率が低いため消費者に大きな負担を強いている。従って、本発明の発明者らは、ｒｈＴＳＨの生産性と精製収率の向上のため研究を行い、ｒｈＴＳＨを生産する最適な培養および精製条件を確立し、本発明を完成した。

【発明の開示】

【0007】

［発明が解決しようとする課題］
本発明の目的は、本発明の方法により生産される遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを含む、再発甲状腺がんの治療または診断のための組成物を提供することである。

【0008】

本発明の別の目的は、流加培養により遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法を提供することである。
［課題を解決するための手段］
上記の目的を達成するため、本発明は、活性成分として遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモン（ｒｈＴＳＨ）を含む、再発甲状腺がんの診断または治療のための組成物を提供するものであり、ｒｈＴＳＨは、ｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養すること、培養細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬに達した時に培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げて細胞株を培養すること、および培養液からｒｈＴＳＨを得ることを含む流加培養により得られる。

【0009】

上記の別の目的を達成するため、本発明は、ｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養すること、培養細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬに達した時に培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げて細胞株を培養すること、および培養液からｒｈＴＳＨを得ることを含む流加培養により遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法を提供する。
［発明の効果］

【0010】

本発明による遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法では、流加培養による培養でありながらｒｈＴＳＨの効率的な生産が可能であり、精製収率と純度が高い。従って、上記の方法で生産された遺伝子組み換え甲状腺刺激ホルモンは、再発甲状腺がんの診断および治療に効果的に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、本発明により調製されたｒｈＴＳＨ発現ベクター（図１Ａ）とそれを含む細胞株の長期安定性試験の結果を示すグラフ（図１Ｂ）である。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、ｒｈＴＳＨの生産において最適な温度を確認するために選択した細胞の生細胞密度と生産性（図２Ａ）および生存率（図２Ｂ）を示すグラフである。図２Ａの生産性のグラフでは、それぞれのバーは左から３７℃→３３℃、３７℃、３７℃→３５℃、および３７℃→３１℃の培養温度を表す。

【図3】図３は、培養プロセス中に温度を下げる時の細胞数に応じた生細胞密度を示すグラフである。

【図4】図４は、細胞数が細胞６×１０^６個／ｍＬである時に培養温度を下げた場合の細胞の生細胞密度を示すグラフである。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、ｒｈＴＳＨの従来の精製方法の簡単な概要（図５Ａ）と従来の方法で精製したタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図（図５Ｂ）である。

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、本発明の方法に従い生産したｒｈＴＳＨの精製方法の簡単な概要（図６Ａ）と本発明の方法により精製したタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図（図６Ｂ）である。

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、本発明の方法に従い生産したｒｈＴＳＨの品質分析のため、等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析（図７Ａ）とペプチドマッピング（図７Ｂ）を行った結果を示す図である。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、本発明の方法に従い生産したｒｈＴＳＨのin vitro活性（図８Ａ）とin vivo活性（図８Ｂ）を確認した結果を示すグラフである。

【発明を実施するための最良の形態】

【0012】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0013】

本発明は、活性成分として遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモン（ｒｈＴＳＨ）を含む、再発甲状腺がんの診断または治療のための組成物を提供するものであり、ｒｈＴＳＨは、ｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養すること、培養細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬに達した時に培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げて細胞株を培養すること、および培養液からｒｈＴＳＨを得ることを含む流加培養により得られる。

【0014】

ここで用いる場合、「遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモン（ｒｈＴＳＨ）」という用語は、脳下垂体前葉を通して視床下部より分泌されるタンパク質であり、９２個のアミノ酸を含むαサブユニットと１１８個のアミノ酸を含むβサブユニットから成っている。ｒｈＴＳＨは再発甲状腺がんの患者の診断と治療のための補助剤として用いられている。本発明による遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るαサブユニットと配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るβサブユニットを含んでいてもよい。

【0015】

本発明の方法により生産、精製されたｒｈＴＳＨを含む、再発甲状腺がんの診断または治療のための組成物は、甲状腺切除術後の腫瘍組織の再発の診断に使用してもよく、または再発甲状腺がんの治療のためヨウ素同位体と併用してもよい。再発甲状腺がんの治療に使用するｒｈＴＳＨは、抗がん治療のためのヨウ素同位体用補助剤として用いてもよい。

【0016】

ｒｈＴＳＨはさらに薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は、患者内への送達に適した無毒性の物質であればどのような担体でもよい。蒸留水、アルコール、脂質、ワックスおよび不活性な固形物を担体として含んでいてもよい。薬学的に許容される補助剤（たとえば、緩衝剤および分散剤）も薬学的な組成物に含むことができる。

【0017】

本発明のｒｈＴＳＨは様々な方法でも患者に投与が可能である。たとえば、組成物は非経口的に投与してもよい。たとえば、皮下、点眼、腹腔内、筋肉内、経口、直腸内、眼窩内、脳内、頭蓋内、椎骨内、脳室内、髄腔内、大槽内、嚢内、鼻腔内、および静脈内に投与してもよい。具体的には、組成物は筋肉内に投与してもよい。組成物の投与経路は、投与方法に応じて液量、粘度等を考慮して決定できる。

【0018】

上記のように非経口的に投与する場合は、組成物は、好ましくは水性のまたは生理学的に許容される体液の懸濁液または溶液を部分的に含む。従って、生理学的に許容される担体または輸送材料を組成物に添加し患者に送達することができ、これは患者の電解質および／または容積バランス（volume balance）に有害な影響を及ぼさない。従って、組成物の体液物質として生理食塩水は一般的に含まれる。

【0019】

上記の投与は、１回以上、１から３回で行うことができ、より具体的には、２回に分けて投与できる。本発明の組成物を反復投与する場合、１２から４８時間、または２４から３６時間の間隔で反復投与が可能であり、具体的には２４時間間隔で投与可能である。

【0020】

このような組成物は、従来公知の滅菌技術により滅菌することができる。さらに、本発明による組成物は、薬学的に許容される補助物質ならびに生理的条件、たとえばｐＨの調節に必要な、補助剤、毒性調節剤、およびその類縁体を含んでいてもよく、その例として酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等が挙げられる。組成物に含まれ得るｒｈＴＳＨの濃度は変えてもよい。

【0021】

本発明による組成物の単位用量は、成人を基準とすると０．６から１．２ｍｇ、具体的には０．８から１．０ｍｇ、より具体的には０．９ｍｇであってもよい。単位用量は治療される疾患および副作用の有無により変えてもよく、最適用量は通常の実験法により決定することができる。

【0022】

本発明による組成物は、再発甲状腺がんの診断および治療のためヨウ素同位体と併用してもよい。この場合、ヨウ素同位体は、本発明による組成物を投与して１２から３６時間後、１８から３０時間後、または２０から２５時間後に投与することができる。具体的には、２４時間後に投与することができる。

【0023】

一方、再発甲状腺がんの診断は、本発明の組成物とヨウ素同位体を投与後に診断的スキャニング（diagnostic scanning）または血清甲状腺グロブリン（Ｔｇ）検査で行ってもよい。この場合、診断的スキャニングはヨウ素同位体を投与して２４から６０時間後、３６から５４時間後、または４６から５０時間後に行うことができる。具体的には、４８時間後に行うことができる。血清甲状腺グロブリン検査の血清試料の採取は、ヨウ素同位体を投与して４８から９６時間後、６０から８４時間後、または７０から７４時間後に行ってもよく、具体的には７２時間後に行ってもよい。

【0024】

本発明の組成物を調製するため、本発明はｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５から４０℃で培養する工程を含む。

【0025】

本発明によるｒｈＴＳＨを産生する細胞株は、上記のαサブユニットとβサブユニットを含む発現ベクターを有する細胞株であってもよく、上記のαサブユニットとβサブユニットはそれぞれのベクターまたは１つのベクターに含まれるように調製されていてもよく、それぞれのサブユニットは、それぞれのプロモーター（デュアルベクター）により発現し、または内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）により結合され、個別に発現するように調製されている。本発明の１つの具体的な態様によれば、それぞれのサブユニットはＩＲＥＳにより個別に発現するように調製することができる。

【0026】

ここで用いる場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞の中に導入され、組み換えられ、宿主の細胞ゲノムに挿入されることが可能な、または自発的にエピソームへの複製が可能な、ヌクレオチド配列を含む核酸手段を意味している。適切な発現ベクターは、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列とともに、発現制御要素、たとえばプロモーター、開始コドン、停止コドン、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを含んでおり、目的に応じて種々調製することが可能である。標的タンパク質をコードする遺伝子構成体を対象に導入した時、開始コドンと停止コドンは明らかに活性を示し、コード配列でインフレームでなければならない。

【0027】

ここで用いる場合、「デュアルベクター」という用語は、１つのベクターの２つの遺伝子がそれぞれのプロモーターにより制御され、標的タンパク質を別々に発現することが可能なベクターを意味している。さらに、ベクターは、標的タンパク質で形質転換された細胞を選択することができるマーカーを含んでいてもよく、本発明の具体的な態様によれば、そのマーカーはＤＨＦＲであってもよい。

【0028】

活性を示すＴＳＨを生産するためには、αサブユニットとβサブユニットが二量体を形成しなければならない。この場合、βサブユニットの発現レベルは、細胞内でα／β二量体を高効率で形成するために、αサブユニットの３倍から４倍高くなければならない。従って、発現ベクターを調製する際には、βサブユニットの発現レベルが高くなるようにプロモーターを選択してもよい。本発明の具体的な態様によれば、βサブユニットをＣＭＶプロモーターに結合し、βサブユニットとαサブユニットとを内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を介して結合することで、２つのサブユニットの発現レベルを調節してもよい。

【0029】

本発明の別の側面によれば、本発明はベクターを含む宿主細胞またはヒト以外の宿主対象を提供する。宿主細胞またはヒト以外の宿主対象は、本発明のｒｈＴＳＨを得る方法だけでなく医学／医薬品の環境においても有用である。

【0030】

本発明の態様によるベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞またはヒト以外の宿主対象は、ベクターにより遺伝子操作された宿主細胞またはヒト以外の宿主対象であってもよい。ここで用いる場合、「遺伝子操作された」という用語は、宿主細胞、ヒト以外の宿主対象、前駆体（predecessor）、または親（parent）が、本発明の態様に従いポリヌクレオチドまたはベクターを有しており、それらが、宿主細胞、ヒト以外の宿主対象、前駆体、または親にそれら自身のゲノムに加えて導入されていることを意味している。さらに、本発明の態様によるポリヌクレオチドまたはベクターは、遺伝子操作された宿主細胞またはヒト以外の宿主対象に、ゲノム外の外部の独立した分子として存在していてもよく、具体的には複製可能な分子として存在していてもよく、または宿主細胞もしくはヒト以外の宿主対象のゲノムに安定的に挿入されていてもよい。

【0031】

本発明の態様による宿主細胞とは真核細胞である。真核細胞としては、真菌、植物細胞、または動物細胞が挙げられる。真菌の例としては、酵母、具体的にはサッカロミセス属（Saccharomyces sp）酵母、より具体的にはＳ．セレビシア（S. cerevisiae）であってもよい。さらに、動物細胞の例としては、昆虫細胞または哺乳類細胞が挙げられ、動物細胞の具体的な例としては、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、Ｕ２－ＯＳＨｅｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＯＬＴ－４、Ｊｕｒｋａｔ、ＰＣ－１２、ＰＣ－３、ＩＭＲ、ＮＴ２Ｎ、Ｓｋ－ｎ－ｓｈ、ＣａＳｋｉ、Ｃ３３Ａ等が挙げられる。宿主細胞、たとえばＣＨＯ細胞は、本発明の１つの態様により、リーダーペプチドの除去、正確な位置での分子のグリコシル化、および機能分子の分泌など、ｒｈＴＳＨタンパク質の翻訳後修飾を行ってもよい。さらに、従来の技術分野で公知の適切な細胞株を、細胞株寄託機関、たとえばアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手してもよい。

【0032】

さらに、本発明の態様によるポリヌクレオチドを含むＣＨＯ細胞は、宿主細胞として特に有用である。ＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する場合、二次修飾、たとえばグリコシル化およびホスホリル化がｒｈＴＳＨで起きてもよい。

【0033】

ヒト以外の宿主対象は、ヒト以外の哺乳類、特にマウス、ラット、ヒツジ、子ウシ、イヌ、サル、および類人猿であってもよい。

【0034】

本発明によるｒｈＴＳＨは、様々な種類の生物、たとえば細菌、酵母、哺乳類細胞、植物、遺伝子導入動物で発現してもよい。しかし、タンパク質治療薬の制御および調製したタンパク質は天然型に類似している必要があることを考慮して、哺乳類細胞を使用することができる。哺乳類細胞の例としては、不死のハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）、ＣＯＳ細胞等が挙げられる。本発明の具体的な態様によれば、ＣＨＯ細胞を使用してもよい。

【0035】

本発明に従い発現ベクターを上記の細胞株に導入するため、その技術分野で公知の従来の技術を使用することができ、その例としては、エレクトロポレーション、細胞質融合法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿法、および塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿法が挙げられる。

【0036】

本発明によるＣＨＯ細胞では、発現ベクターで形質転換されている細胞株を選択するため、プリンおよびチミジル酸を合成する必須酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子がノックダウンされている。ＤＨＦＲ陰性ＣＨＯ細胞は、ナトリウムヒポキサンチンおよびチミジンの混合形態であるＨＴ（ヒポキサンチンおよびチミジン）であり、プリンおよびピリミジンの供給がなければ増殖できない。従って、ＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されていない細胞株はＨＴを含んでいない培地では生存することができない。

【0037】

さらに、本発明では、ｒｈＴＳＨを産生する細胞株は流加培養条件で培養する。

【0038】

ｒｈＴＳＨは従来「灌流培養」により生産されてきた。これは、新たな培養培地を連続的に供給しながら使用した培養培地を連続的に除去する方法である。このような灌流培養には、比較的低い生産性、複雑なプロセス、および高いコストという不利な点がある。

【0039】

ここで用いる場合、「流加培養」という用語は、培養の進行中は培養槽に栄養培地を徐々に添加しながら、培養が終了するまで培養液を培養槽から抜き取らない培養法を意味している。この方法は、特異的な物質の添加速度を微生物による消費速度と釣り合わせることで、培養中に成分濃度を任意の設定値に調節し得るという利点がある。

【0040】

ここで用いる場合、「培養培地」という用語は、人工的なin vitroの多細胞生物の環境または組織外における、細胞の、維持、増殖、繁殖、または増大のための栄養液を意味している。培養培地は特定の細胞培養に最適化してもよく、その例として、細胞増殖を支援するために調製された基礎培養培地、またはモノクローナル抗体の生産を促進するために調製された基礎培養培地、および栄養素が高濃度に濃縮された濃縮培地が挙げられる。

【0041】

「基礎培養培地」とは、細胞増殖を支援することが可能な最小培地を意味している。基礎培養培地は、微量元素、ビタミン、エネルギー源、緩衝系、およびアミノ酸だけでなく、標準的な無機塩、たとえば亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、およびカリウムも供給する。本発明による基礎培養培地は、細胞の増殖期である培養の初期段階に使用されている。基礎培養培地の例として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ハイセル（Hycell）ＣＨＯ等が挙げられる。本発明の具体的な態様によれば、基礎培養培地はハイセルＣＨＯ培地でもよい。

【0042】

本発明による流加培養で細胞株を３５℃から４０℃で培養する工程は細胞の増殖期である。これは細胞を播種した後に細胞増殖が急速に進行する期間であり、一般に細胞増殖の培養条件は細胞の種類、産生される標的タンパク質の種類等に応じて変えてもよい。本発明で使用されているＣＨＯ細胞の場合は、３５℃から３７℃の温度で、ｐＨが６．８から７．３の範囲で、細胞数が最も活発に増加することが知られている。一方、本発明の流加培養における細胞の増殖期は３から７日であってもよく、具体的には培養の初期段階から４から６日であってもよい。本発明の具体的な態様によれば、細胞の増殖期は培養の初期段階から６日であってもよい。

【0043】

増殖期間の培養温度は３５℃から４０℃または３６℃から３８℃であってもよく、本発明の１つの具体的な態様によれば、３７℃であってもよい。細胞を上記の温度範囲外の温度で培養する場合、細胞が順調に増殖しない可能性がある。

【0044】

さらに、本発明は、培養細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬに達した時に、培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げることにより細胞を培養する工程を含む。

【0045】

本発明の流加培養法に従い、細胞の培養温度を下げる時、標的タンパク質の生産を最大化する培養条件で、細胞はタンパク質の産生段階に入る。タンパク質の産生段階に入るために細胞増殖期に培養された生細胞の密度が最大生細胞密度の約６０から９０％、具体的には７０から８０％である時に、培養条件を変更してもよい。本発明の具体的な態様によれば、生細胞密度が約７０％である時に培養条件を変更する。

【0046】

この場合、細胞の培養温度は２９℃から３４℃または３１℃から３３℃であってもよい。本発明の１つの態様によれば、培養温度は３３℃であってもよい。培養温度が３５℃以上の場合は細胞の生存率が急激に低下し、２８℃以下の場合は細胞数が十分に増加しないためｒｈＴＳＨの生産率が低下するという問題が生じる。

【0047】

本発明による流加培養では、細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬ、細胞５×１０^６から１×１０^７個／ｍＬ、または細胞６×１０^６から８×１０^６個／ｍＬの時に培養温度の変更を行ってもよい。本発明の１つの態様によれば、細胞数が細胞６×１０^６個／ｍＬの時に培養温度の変更を行ってもよい。細胞数が細胞３×１０^６個／ｍＬ以下の時に培養温度を変更すると、細胞数が少なく、得られるタンパク質の量が少なくなる。細胞数が細胞２×１０^７個／ｍＬより多い時には、細胞数は多く、それにより産生されるタンパク質の量は多くなるが、ＨＣＰ、たとえば細胞片なども大量に産生され、精製プロセスで医薬品基準に対応する濃度にまでＨＣＰを除去するのが困難であるという問題が生じる。

【0048】

本発明による培養温度の変更は、培養５日目から９日目に、具体的には培養５日目から８日目に、より具体的には培養５日目から７日目に行ってもよい。本発明の具体的な態様によれば、６日目に行ってもよい。

【0049】

ここで用いる場合、「生細胞密度」という用語は、一定の空間内に生存している細胞の量または数を意味している。本発明では、高効率で標的タンパク質を生産するのに十分な生存細胞数となった時に培養条件を変更するために、生細胞密度を測定している。生細胞密度は、細胞の吸光度を測定することで決定してもよい。

【0050】

さらに、本発明の流加培養では、タンパク質生産のため基礎培養培地に補給剤を添加してもよい。ここで用いる場合、「補給剤」という用語は、細胞がタンパク質産生期に入った時に、健康を維持しタンパク質を産生するのに十分な栄養素を供給するため基礎培養培地に追加する物質を意味し、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子等が挙げられる。タンパク質生産に使用可能な補給剤の種類は従来の技術分野において公知であり、ＡｃｔｉＣＨＯ（GE Healthcare）、セルブースト（Cell Boost）（GE Healthcare）、ＦＭ（Functional MAX、Gibco）、酵母エキス、フィトンＵＦ（Phytone UF）（BD Biosciences）、ＤＭ１９、ＰＰ３、ＴＣイーストレートＵＦ（TC Yeastolate UF）（BD Biosciences）等が挙げられる。上記の補給剤はＡｃｔｉＣＨＯ、セルブーストおよびＦＭであってもよい。

【0051】

補給剤は、遺伝子組み換えタンパク質を高レベルで生産するために適切な量を添加してもよく、またこれらの補給剤は個々にまたは混ぜて使用してもよい。補給剤は、細胞が増殖期を過ぎてタンパク質産生期に入る時に添加してもよく、本発明の流加培養によれば、タンパク質生産のために温度を下げる１から３日前に添加してもよい。本発明の１つの具体的な態様によれば、１日前に添加してもよい。補給剤は、細胞の生存およびタンパク質生産プロセスで消費されるので、連続的に添加しなければならない。一般的に、補給剤は、添加１日目から１から３日の一定間隔で添加してもよい。補給剤の添加は、細胞の量および種類、培養条件等により変えてもよく、当業者が容易に選択することができる。

【0052】

本発明によるｒｈＴＳＨを生産する培養は、１０から２０日間、具体的には１１から１５日間、より具体的には１２から１８日間維持してもよい。本発明の具体的な態様によれば、１２日間継続してもよい。

【0053】

本発明は、培養液からｒｈＴＳＨを得る工程も含む。

【0054】

培養液からｒｈＴＳＨを得るため、一般に公知の方法によりｒｈＴＳＨを精製してｒｈＴＳＨを得てもよい。しかし、精製により高収率でｒｈＴＳＨを得るために、抗－性腺刺激ホルモン抗体に結合した樹脂を詰めたカラムで精製することにより一次精製液を得る工程、一次精製液をフィルターでろ過することにより二次精製液を得る工程、二次精製液を透析することにより三次精製液を得る工程、および三次精製液をイオンクロマトグラフにより精製することによりｒｈＴＳＨを得る工程によりｒｈＴＳＨを得てもよい。

【0055】

一般的に、ｒｈＴＳＨは幅広いＰＩ値と３つのＮ－グリコシル化部位を持ち、そのため精製中に不純物を除去するのは簡単ではない。従来のｒｈＴＳＨ精製法は、ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーの一連の手順のために、複雑な手順を含み、コストや時間がかかるだけでなく、上記の方法で精製した不純物レベル（たとえば宿主細胞タンパク質）は１，０００ｐｐｍ以上であり、これは医薬品用途のタンパク質に含まれる不純物の許容レベル（１００ｐｐｍ）を超えているという問題がある。従って、本発明者らはｒｈＴＳＨを高収率、高純度で得る精製法を確立した。

【0056】

ここで用いる場合、「培養液」という用語は培養培地を意味しており、細胞を培養した後の細胞から生産され分泌されたタンパク質を含む様々な因子を含む。これは、培養終了後に遠心分離により細胞を除去することにより得られる。

【0057】

ここで用いる場合、「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、生物学的に高い特異的親和性を有する２種類の物質の１つを固定相として用いて、固定相に対する親和性の差を使用して標的物質を分離するクロマトグラフィー法の１つである。従って、上記の工程では、抗－性腺刺激ホルモン抗体に結合した樹脂を詰めたカラムで培養液を精製してもよい。

【0058】

アフィニティークロマトグラフィーに使用する樹脂は、マトリックス、親水性架橋剤、およびリガンドから成っている。ここでは、マトリックスは架橋したアガロース、たとえば高度に架橋した高流速アガロースであってもよい。リガンドは抗－性腺刺激ホルモン抗体であってもよく、これは本発明のｒｈＴＳＨに特異的に結合するタンパク質である。この樹脂では、ｒｈＴＳＨに特異的に結合する抗体が、アガロースフラグメントに共有結合しており、ｒｈＴＳＨに選択的に結合してもよい。さらに、リガンドは樹脂中で長い親水性架橋剤を有しているので、分離する標的タンパク質と容易に結合してもよい。この樹脂の例としてはキャプチャーセレクト（CaptureSelect）が挙げられ、これはThermoFisher Scientific（米国）から特注デザインの培地として市販されている。

【0059】

ここで用いる場合、「抗－性腺刺激ホルモン抗体」という用語は、エピトープとして配列番号１のアミノ酸配列を有するｒｈＴＳＨのαサブユニットを認識し、そこに特異的に結合する抗体を意味している。上記のように、ＴＳＨは２つのサブユニットから成り、そのうちのαサブユニットは通常ＴＳＨを含む他の性腺刺激ホルモンにも含まれている。

【0060】

本発明の具体的な態様によれば、ｒｈＴＳＨは抗－性腺刺激ホルモン抗体が結合した樹脂を詰めたカラムからクエン酸ナトリウム溶液で溶出してもよい。溶液は、適切な濃度とｐＨで使用してもよく、標的タンパク質の品質と活性を変えない程度まで抗－性腺刺激ホルモン抗体との結合を阻害してもよい。溶液の適切な濃度範囲は０．０１から５Ｍ、０．０３から１Ｍ、０．０６から０．５Ｍ、または０．０７から０．３Ｍであってもよい。本発明の具体的な態様によれば、溶液の濃度は０．１Ｍであってもよい。一方、適切なｐＨ範囲は１から５、２から４、または２．５から３．５であってもよい。本発明の具体的な態様によれば、この溶液のｐＨは３であってもよい。

【0061】

アフィニティークロマトグラフィーにより得た一次精製液に含まれる不純物、たとえば不溶の凝集物および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を除去し、標的タンパク質の純度をさらに向上させるため、ろ過を行ってもよい。本発明の具体的な態様では、ろ過は深層ろ過であってもよい。

【0062】

ここで用いる場合、「深層ろ過」という用語は、各層に設置されている孔径の異なる２つ以上のフィルターを用いて行うろ過を意味している。深層ろ過のフィルターの孔径は０．００１から３０μｍ、０．００５から２５μｍ、０．０１５から１５μｍ、または０．０２０から１２μｍであってもよい。本発明の具体的な態様では、フィルターの孔径は０．０２５から１０μｍであってもよい。

【0063】

トリス溶液をろ過に使用してもよく、この場合に使用する溶液は、上記のように適切な濃度とｐＨであってもよい。トリス溶液の適切な濃度は１から３００ｍＭ、１０から２００ｍＭ、２０から１００ｍＭ、または３０から７０ｍＭであってもよい。本発明の具体的な態様によれば、このトリス溶液の濃度は５０ｍＭであってもよい。一方、このトリス溶液の適切なｐＨは６から１２、７から１１、または８から１０であり、本発明の具体的な態様によれば、ｐＨは９であってもよい。

【0064】

ここで用いる場合、「ダイアフィルトレーション」という用語は、小孔を有するフィルターを用いて分子の大きさにより試料中の不純物を除去または分離する希釈工程を意味する。

【0065】

本発明では、０．０１から０．５μｍ、０．１から０．３μｍ、または０．２から０．２５μｍの孔径を有する半透膜をダイアフィルトレーションに用いてもよい。本発明の具体的な態様によれば、ダイアフィルトレーションは、孔径が０．２２μｍの半透膜（Millipak 20、Millipore）を用い１．０ｂａｒ以下の圧力で行い、ろ液の導電率が３０．０μＳ／ｃｍ以下になれば終了する。

【0066】

本発明によるイオンクロマトグラフィーは、化学式１で表される構造を有する化合物が結合している樹脂を詰めたカラムで精製してもよい。

【0067】

【化1】

【0068】

ここで用いる場合、「イオンクロマトグラフィー」という用語は、カラムの固定相に対する親和性の違いに基づく精製法である。イオンクロマトグラフィーカラムによる分離機構は、主に、カチオンまたはアニオン交換材が結合しているイオン交換に基づいており、そこに結合しているイオンとは逆の、移動相中のカチオンまたはアニオンの親和性の程度により競合的な交換が起きる。

【0069】

化学式１の構造を有する化合物が結合した樹脂を詰めたカラムは、多様式官能性を有する強アニオン交換体である。ここで用いる場合、「多重官能性」という用語は、様々な物質と相互作用が可能であることを意味している。従って、化学式１の構造を有する化合物が結合した樹脂は、イオン相互作用、水素結合、疎水性相互作用等により様々な物質と相互作用し、不純物、たとえばＨＣＰ、凝集体等を除去する。

【0070】

アニオン交換クロマトグラフィーを通した標的タンパク質は、酢酸ナトリウム溶液で溶出してもよく、この場合に使用する溶液は上記の適切な濃度とｐＨであってもよい。酢酸ナトリウム溶液の適切な濃度は１から２００ｍＭ、５から１００ｍＭ、１０から５０ｍＭ、または１５から３０ｍＭであってもよい。本発明の具体的な態様によれば、酢酸ナトリウム溶液の濃度は２０ｍＭであってもよい。一方、酢酸ナトリウム溶液の適切なｐＨは２から６、２．５から５、または３から４であり、本発明の１つの具体的な態様によれば、ｐＨは３．８であってもよい。

【0071】

この場合、溶出のための酢酸ナトリウム溶液の流量は、１０から５００ｍＬ／ｍｉｎ、１０から３００ｍＬ／ｍｉｎ、１０から１００ｍＬ／ｍｉｎ、または１０から５０ｍＬ／ｍｉｎの範囲でもよい。本発明の具体的な態様によれば、上記酢酸ナトリウム溶液の流量は１５ｍＬ／ｍｉｎであってもよい。

【0072】

上記のすべての工程により最終的に精製したｒｈＴＳＨは、さらにダイアフィルトレーションの工程を経て、最終的なタンパク質産物を保持する適切な溶液としてもよい。タンパク質産物の保存溶液は、たとえ長期間タンパク質を保存するとしても、タンパク質の品質や活性を変えてならない。従って、本発明によるｒｈＴＳＨタンパク質の保存溶液は、リン酸ナトリウム、マニトール、および塩化ナトリウムを含んでいてもよい。

【0073】

本発明は、ｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養すること、培養細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬに達した時に培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げて細胞を培養すること、および培養液からｒｈＴＳＨを得ることを含む流加培養により遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法を提供するものである。

【0074】

本発明による遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンは、配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るαサブユニットと配列番号２で表されるアミノ酸配列から成るβサブユニットを含んでいてもよく、これを生産する一般的な特性は上記の通りである。

【0075】

本発明の方法に従い選択した単細胞クローンを用いて、遺伝子組み換えｒｈＴＳＨをより簡便に生産する流加培養条件を確立した。

【0076】

細胞培養の基礎培養培地はＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ハイセルＣＨＯ等である。本発明の具体的な態様によれば、基礎培養培地はハイセルＣＨＯ培地であってもよい。

【0077】

本発明による流加培養で、細胞株を３５℃から４０℃で培養する工程は細胞の増殖期間である。上記増殖期間の培養温度は３５℃から４０℃、または３６℃から３８℃であってもよく、本発明の１つの具体的な態様によれば、３７℃であってもよい。上記の温度範囲外の温度で細胞を培養すると、細胞が十分に増殖しないという問題が生じる。

【0078】

本発明による流加培養法によれば、細胞の培養温度を下げると、標的タンパク質の産生を最大化する培養条件で、細胞はタンパク質の産生期に入る。この場合、温度は２９℃から３４℃または３１℃から３３℃であってもよい。本発明の１つの具体的な態様によれば、培養温度は３３℃であってもよい。培養温度が３５℃以上では細胞の生存率が急激に低下し、培養温度が２８℃以下では細胞が十分に増殖しないためｒｈＴＳＨの生産率が低下するという問題が生じる。

【0079】

本発明による流加培養では、細胞数が細胞３×１０^６から２×１０^７個／ｍＬ、細胞５×１０^６から１×１０^７個／ｍＬ、または細胞６×１０^６から８×１０^６個／ｍＬの時に培養温度の変更を行ってもよい。本発明の１つの態様によれば、細胞数が細胞６×１０^６個／ｍＬの時に培養温度の変更を行ってもよい。細胞数が細胞３×１０^６個／ｍＬ以下の時に培養温度を変更すると、細胞数が少なく、得られるタンパク質の量が少なくなる。細胞数が細胞２×１０^７個／ｍＬより多い時には、細胞数は多く、それにより産生されるタンパク質の量は多くなるが、ＨＣＰ、たとえば細胞片なども大量に産生され、精製プロセスで医薬品基準に対応する濃度にまでＨＣＰを除去するのが困難であるという問題が生じる。

【0080】

さらに、本発明の流加培養では、タンパク質生産の基礎培養培地に補給剤を添加してもよい。補給剤の例としては、ＡｃｔｉＣＨＯ（GE Healthcare）、セルブースト（GE Healthcare）、ＦＭ（Functional MAX、Gibco）、酵母エキス、フィトンＵＦ（BD Biosciences）、ＤＭ１９、ＰＰ３、ＴＣイーストレートＵＦ（BD Biosciences）等が挙げられ、上記補給剤はＡｃｔｉＣＨＯ、セルブーストおよびＦＭであってもよい。補給剤は、遺伝子組み換えタンパク質を高レベルで生産するために適切な量を添加してもよく、またこれらの補給剤は個々にまたは混ぜて使用してもよい。

【0081】

本発明によるｒｈＴＳＨを生産する培養は、１０から２０日間、具体的には１１から１５日間、より具体的には１２から１８日間維持してもよい。本発明の具体的な態様によれば、１２日間継続してもよい。

【0082】

流加培養法で高純度および高品質を維持するｒｈＴＳＨを生産するため、本発明の発明者らは、ｒｈＴＳＨのαサブユニットとβサブユニットを発現できるベクターを調製し、これをＣＨＯ細胞株中に形質転換させてｒｈＴＳＨを高レベルで発現するモノクローナル細胞を選択し、選択した単細胞クローンをそれぞれ＃１、＃２、および＃３と命名した（図１Ａおよび図１Ｂ）。

【0083】

これらの選択した細胞を使って、高いｒｈＴＳＨの生産性を有する流加培養法を確立した。培養６日目まで３７℃で培養後、培養７日目から培養温度を３３℃に下げた場合、ｒｈＴＳＨの生細胞密度および生産性が高まることが確認された（図２Ａおよび２Ｂ）。

【0084】

さらに、細胞数に依存するｒｈＴＳＨの生産性を確認した結果、細胞数が増加するに従いｒｈＴＳＨの生産も増加するが、温度変更時の細胞数が細胞１．１×１０^７個／ｍＬを超える場合、ｒｈＴＳＨの生産だけでなく不純物も増加した（表１）。

【0085】

次に、確立した生産法で培養したｒｈＴＳＨ発現細胞株中のｒｈＴＳＨを精製する方法を確立した。具体的には、細胞上清から採取したＴＳＨ特異的抗体をアフィニティークロマトグラフィーの固定相として使用して、一連のアフィニティークロマトグラフィー、深層ろ過、ダイアフィルトレーション、およびアニオン交換クロマトグラフィーを順番に行った場合に、従来のｒｈＴＳＨ精製法と比較してタンパク質の収率と純度が高いことが示され、精製タンパク質中の不純物量は医薬品用途の基準値以内に減少し（図５Ａから６Ｂ）、活性の点でも、現在市販されているｒｈＴＳＨ［タイロゲン（登録商標）］と同様であることが確認された（図７Ａおよび図７Ｂ）。

【0086】

従って、本発明による流加培養法では、生産されたｒｈＴＳＨの活性および品質がすぐれているだけでなく、生産プロセスも簡便で経済的である。従って、上記の方法で生産されたｒｈＴＳＨは再発甲状腺がんの診断および治療に有用である。

【0087】

本発明は、薬学的に活性な成分として本発明のｒｈＴＳＨを含む組成物を投与することにより疾患を治療する方法も提供する。

【0088】

このような方法は、本発明による組成物の有効量を、目的の疾患と直接に関連するまたは関連しない健康状態の哺乳類に投与することを含む。たとえば、ｒｈＴＳＨは、治療上の有効量で、対象に、好ましくはヒトを含む哺乳類に投与してもよい。

【0089】

本発明による組成物の投与経路および用量については、治療する疾患、副作用の有無により様々な方法および量で対象に投与してもよい。最適な投与方法および用量は、通常の実験法により決定してもよい。

【0090】

組成物は、治療する疾患に治療効果を有する他の薬剤または生理活性物質と組み合わせて投与してもよく、または他の薬剤との合剤の形態として製剤化してもよい。

【0091】

本発明は、本発明のｒｈＴＳＨを含む組成物を投与することにより、再発甲状腺がんを診断する方法も提供する。

【0092】

上記の方法では、本発明のｒｈＴＳＨを投与した後に放射性ヨウ素を投与し、診断的スキャニングまたは血清サイログロブリン（Ｔｇ）検査により再発甲状腺がんを診断してもよい。

【0093】

再発甲状腺がんの診断のための、本発明による組成物の投与経路と用量については、治療する疾患、および副作用の有無により様々な方法および量で対象に投与してもよく、最適な投与方法および用量は、通常の実験法により決定してもよい。

【発明の形態】

【0094】

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明をさらに例示することを意図するものであり、その範囲を限定するものではない。

【0095】

例１
遺伝子組み換えヒトＴＳＨ（ｒｈＴＳＨ）発現ベクターの調製および形質転換
本発明の発明者らは、ｒｈＴＳＨを高収率で生産するための発現ベクターを調製した。

【0096】

具体的には、ｒｈＴＳＨのβサブユニットを含む遺伝子断片およびＩＲＥＳとｒｈＴＳＨのαサブユニットの遺伝子を、Top Gene Technologies（カナダ）を使用して合成した。合成した遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＡＤ５（Genexine）ベクターにクローン化した後に、ｐＡＤ－ｒｈＴＳＨと命名した。

【0097】

その結果、図１Ａに示す構造を有する発現ベクターを作製した。

【0098】

上記の発現ベクターは、従来の技術分野で周知の方法を使用して宿主細胞中に形質転換させることにより調製した。従って、ベクターを単離するためにエンドフリープラスミド精製キット（Qiagen、米国）を使用し、単離したベクターを使用して、高収率でｒｈＴＳＨを発現する細胞を調製した。

【0099】

例２
ｒｈＴＳＨを高収率で発現する単細胞クローンの調製
例１で調製したｐＡＤ－ｒｈＴＳＨ発現ベクターから、ｒｈＴＳＨを高収率で発現することができる細胞を以下に示すように調製した。

【0100】

具体的には、ｐＡＤ－ｒｈＴＳＨ発現ベクターをＣＨＯ ＤＧ４４（－）ＤＨＦＲ（米国コロンビア大学のLawrence Chasin氏より入手）細胞株にいくつかの条件で形質転換した後、最適化した条件下、形質転換細胞を６ウェルプレートでＨＴ（ハイポキサンチンおよびチミジン）を含む基礎培地中で４８時間培養した。その後、細胞を、ＨＴを含まない培地中で１４日間培養し、この期間に培養スケールを６ウェルプレートから１２５ｍＬフラスコに上げた。高レベルでｒｈＴＳＨを発現している細胞クローンをＴＳＨ特異的ＥＬＩＳＡキット（Genway Biotech、米国）を用いて選択した。

【0101】

選択したクローンを１２５ｍＬフラスコで１０ｎＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）を含む培地中で１４から２８日間培養し、最も高レベルでｒｈＴＳＨを発現しているフラスコを選択して、細胞を９６ウェルプレートの２０ウェルに播種した。１４日間培養後、比較的高レベルのｒｈＴＳＨを発現している単一コロニーを、イメージクローナー（image cloner）を用いて選択した。選択した単一コロニーを、９６ウェルプレートから６ウェルプレートにスケールを変えて、２１から２７日間培養した。培養細胞のｒｈＴＳＨの生産性を、再度ＴＳＨ特異的ＥＬＳＡキットを用いて測定した。ＭＴＸ濃度を２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、および２００ｎＭと上げながら上記のプロセスを繰り返し、最終的に最も高いｒｈＴＳＨの生産性を持つモノクローナル細胞を選択し増幅させた。選択した細胞は研究用セルバンク（ＲＣＢ）の候補として選択し、３５継代まで培養して長期培養時の安定を確認し、ｒｈＴＳＨのＴｄ（２倍時間）、生産性および細胞形態をすべての継代で確認した。

【0102】

その結果、図１Ｂに示すように３つのＲＣＢクローン＃１、＃２、および＃３を選択した。

【0103】

例３
ｒｈＴＳＨを生産する細胞培養法の確立
上記の例２で選択した３つのＲＣＢクローンについて、ｒｈＴＳＨを生産する最適な細胞培養法を確立した。現在Genzymeという会社からのみ市販されているｒｈＴＳＨであるタイロゲン（登録商標）は溶液状態で比較的不安定であることが知られており、その生産には灌流培養が使用されている。他の培養法と比べて、灌流培養は比較的生産性が低く、そのプロセスは複雑でコストがかかる。Genzymeのタイロゲン（登録商標）の灌流培養による生産収率は２０から３０ｍｇ／Ｌであることが知られている。一方、流加培養の場合、生産性は灌流培養に比べて比較的高く、プロセスは複雑ではなく、培養プロセスにおいてｒｈＴＳＨを高品質に維持できるという利点もある。従って、ｒｈＴＳＨを生産する有益な培養条件の確立が試みられてきた。そのタンパク質の溶液形態での安定性が、様々な要因、たとえば温度、ｐＨ、細胞生存率、培養期間等により影響を受けることが知られているので、Genzymeのタイロゲン（登録商標）（以下「対照群」と呼ぶ）の品質と比較することにより流加培養の最適な条件を確立した。

【0104】

３．１．最適温度の確立
ｒｈＴＳＨを生産する最適温度を確立するために、様々な温度条件で細胞を培養した。

【0105】

最初に、上記の例２で選択したクローン＃３の細胞０．５×１０^５個／ｍＬを３７℃で１５日間ハイセルＣＨＯ培地（Hyclone、米国）中で培養し、この場合、培養５、７、９、１１、および１３日目に０．５％ＡｃｔｉＣＨＯ（GE Healthcare、米国）および４％セルブースト５（ＣＢ５、GE Healthcare、米国）を補給剤として添加した。６日後、生細胞密度が細胞６×１０^６から８×１０^６個／ｍＬに達した時、温度を３７℃、３５℃、３３℃、および３１℃に下げ、１５日目まで培養した。

【0106】

生細胞密度、細胞生存率、ｐＨ、グルコース、ラクテート、グルタミン、およびグルタメートを毎日測定し、上記の例２で述べたようにｒｈＴＳＨの生産性を９、１１、１３、および１５日目に測定した。

【0107】

その結果、図２Ｂに示すように、１５日目まで３７℃で培養した細胞の生存率は５０％以下であり、３７℃の温度で培養後３５℃に変更した（３７℃→３５℃）細胞では約６０％であった。一方、３７℃→３３℃または３７℃→３１℃で培養した細胞では、細胞生存率は９５％以上であった。

【0108】

一方、図２Ａに示すように、培養１５日目のｒｈＴＳＨの生産性に関しては、３７℃→３３℃で培養した細胞が０．７ｇ／Ｌと最も高い生産性を示した。

【0109】

従って、ｒｈＴＳＨを生産する温度は、３７℃から３３℃に下げる条件を最適な培養条件として設定した。この場合、３７℃で６日間培養後、７日目から３３℃に温度を下げ培養を行うことができる。

【0110】

３．２．最適細胞数の確立
上記の例３．１では、ｒｈＴＳＨを生産する温度条件を確立した。しかし、温度を下げる時の生細胞密度のｒｈＴＳＨの生産に対する影響を確認するため、以下の実験を実施した。

【0111】

具体的には、生細胞密度をそれぞれ細胞６．０×１０^６、８．５×１０^６、９．８×１０^６、１０．５×１０^６、１１．５×１０^６、または１２．０×１０^６個／ｍＬとして、すべての実験を、３７℃から３３℃に培養温度を下げた以外は上記の例３．１と同様に実施した。培養後、例２と同様に細胞培養液のｒｈＴＳＨの生産率を測定し、ｒｈＴＳＨの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動およびクーマシーブルー染色を使用して確認した。

【0112】

一方、ＨＣＰを吸光度測定により確認した。０、１、４、２０、７５、および２５０ｎｇ／ｍＬの濃度の標準試料を吸光度測定のために調製した。さらに、それぞれの条件で得たｒｈＴＳＨの試料を標準範囲に応じて希釈し、この希釈したｒｈＴＳＨ １２０μＬと２５０ｎｇ／ｍＬの濃度の標準試料３０μＬを混ぜて混合試料を調製した。この混合試料５０μＬをＥＬＩＳＡストリップの２ウェルに分注し、Ａｎｔｉ－ＣＨＯ：アルカリホスファターゼ２００μＬを添加した。これを密封し、２４℃、１８０ｒｐｍで２時間撹拌し、洗浄液で４回洗浄後、ＰＮＰＰ ２００μＬを添加して室温で１時間３０分反応させ、その吸光度を４０５／４９２ｎｍの二重波長で測定した。

【0113】

培養温度変更時に、生産率、ｒｈＴＳＨの純度、および生細胞密度に依存する不純物である宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量を測定し、以下の表１に示した。

【0114】

【表1】

【0115】

その結果、上記の表１および図３に示すように、培養温度変更時の生細胞密度が細胞６．０×１０^６から１１．０×１０^６個／ｍＬの範囲では、ｒｈＴＳＨの生産率と純度は同様のレベルであった。しかし、培養温度変更時の生細胞密度が細胞１１．０×１０^６個／ｍＬを超えると、ＨＣＰが過剰量含まれてきて、それにより純粋なｒｈＴＳＨの生産率および純度の測定ができなかった。

【0116】

従って、上記のことから、生細胞密度が細胞６．０×１０^６から１１．０×１０^６個／ｍＬの時に、培養温度を下げてｒｈＴＳＨを高収率および高純度で生産できることが確認された。

【0117】

生細胞密度が細胞８．５×１０^６個／ｍＬの時に培養温度を下げた場合と比べて、密度が細胞６．０×１０^６個／ｍＬの時に培養温度を下げた場合では、生産率は１．１２倍低下したが、ＨＣＰの量が１．５倍以上減少したことが確認された。医薬品の生産においてＨＣＰの量を減らすことは非常に重要であるので、最適条件は、生細胞密度が細胞６．０×１０^６個／ｍＬの時に培養温度を下げる、ＨＣＰの量が生産性に対して最小となる条件とした。

【0118】

一方、生細胞密度が細胞６．０×１０^６個／ｍＬの時に培養温度を下げることが細胞生存率に影響を及ぼすかどうかを確認するため、３つのクローンで、生細胞密度が細胞６．０×１０^６個／ｍＬの時に培養温度を下げること以外は上記の例３．１と同様に実験を行った。培養細胞の生細胞密度の測定結果を図４に示す。

【0119】

その結果、図４に示すように、細胞６．０×１０^６個／ｍＬ時に培養温度を下げたにもかかわらず、細胞生存率は影響を受けず、最終的な細胞密度は、細胞１４．０×１０^６個／ｍＬに増加した。

【0120】

３．３．最適培養期間の確立
ｒｈＴＳＨを生産する最適な培養期間を確立するために、生細胞密度、細胞増殖率、およびｒｈＴＳＨの生産性を、上述したように１８日間の培養期間で確認した。

【0121】

その結果、細胞増殖率は培養１８日目に９０％以上であり、ｒｈＴＳＨの生産性は１ｇ／Ｌよりも高いように思われたが、その品質は対照群よりも低かった。

【0122】

従って、生産されるｒｈＴＳＨの生産性と品質を維持できる最適な流加培養時間は１２日間と設定し、最終的に、上記の一連の実験を通してｒｈＴＳＨ生産の流加培養条件を確立した。

【0123】

本発明で確立した条件下で培養した細胞は培養１２日目にｒｈＴＳＨを０．６ｇ／Ｌ以上産生し、対照群と同等の品質を維持しつつ、生産性は２０倍以上増加することが判明した。

【0124】

比較例１
従来のｒｈＴＳＨタンパク質精製法
性腺刺激ホルモンは、脊椎動物の脳下垂体前葉から分泌される糖タンパク質ポリペプチドホルモンであり、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、およびＴＳＨなどが挙げられ、それらは同じαサブユニットと特異的なβサブユニットを有する。従って、一般的に、ｒｈＴＳＨタンパク質の精製は性腺刺激ホルモンの精製法と同じような方法で実施される。従って、従来の精製法により精製したタンパク質の精製収率と純度を、本発明により精製したタンパク質のものと比較するため、ｒｈＴＳＨタンパク質を従来の精製法で精製した。

【0125】

具体的には、例３で確立した条件下で培養した細胞の上清を採取し、ミリスタックプラスＤＯＨＣ（Millistak+DOHC）およびミリスタックプラスＸＯＨＣ（Millistak+XOHC）フィルターで順番にろ過した。ろ過した上清をポッドデプス（Pod Depth）フィルターおよびＸＯＨＣで限外ろ過し、２０倍に濃縮後、０．２２μｍのミリパック２０フィルターを用いてＡ緩衝液（５０ｍＭ ＣＨＥＳ、４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）でダイアフィルトレーションに付した。ろ過した上清をヌビア（Nuvia）Ｑ樹脂を用いたアニオン交換クロマトグラフィーに付し、３５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。その後、ポッドデプスフィルターで再度ろ過を行い不溶の凝集物を除去した。ろ過した上清はＢ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で平衡化後、ブルー６ ＦＦ樹脂と５３０ｍＭ ＮａＣｌ溶出液で二次精製に付した。フェニルＨＰ樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して三次精製を行い、上記の精製プロセスに付した溶出液をＱメンブレンにＣ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で通過させた。最終生成物をＤ緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、３％マニトール、０．２％ＮａＣｌ）で製剤化した。このようにして精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に付し、クーマシーブルー染色を用いて確認した。

【0126】

その結果、図５Ａおよび図５Ｂに示すように、上記の方法で精製したｒｈＴＳＨタンパク質は、収率は３０％以上で純度は９８％以上を示したが、宿主細胞からの不純物である宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が１，０００ｐｐｍ以上であることが確認された。医薬品用途のタンパク質不純物は１００ｐｐｍ未満であり、これらを除去するには追加の手順が必要であった。

【0127】

例４
ｒｈＴＳＨタンパク質の高収率精製法の確立
一般的に、ｒｈＴＳＨタンパク質は幅広いＰＩ値を持ち、３つのＮ－グリコシル化部位が存在するため不純物を除去するのは簡単ではない。そのため、ｒｈＴＳＨタンパク質を効率的に精製する精製条件を確立した。

【0128】

最初に、抗－性腺刺激ホルモン抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を固定相として用いてキャプチャーセレクトシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でカラムを調製し、カラムに比較例１と同様に調製した細胞上清を流量４０Ｌ／ｈ、３ｇタンパク質／Ｌキャプチャーセレクト量で添加した後、流量４０Ｌ／ｈでカラムに注入するＥ緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）で溶出した。その後、不溶の凝集物とＨＣＰを除去するため、ポッドデプスフィルターでＦ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ９．０）を用いて３．０ｂａｒ以下の圧力下、流量８６ｍＬ／ｍ^２以下でろ過した。ろ液を、孔径０．２２μｍの半透膜（ミリパック２０、ミリポア）で１．０ｂａｒ以下の圧力下で透析し、ろ液の導電率が３０．０μＳ／ｃｍ以下になった時に終了した。この透析精製した中間体産物をキャプトアドヒア（Capto adhere）カラムに１５ｍＬ／ｍｉｎで添加後、Ｇ緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．８）で流量１５ｍＬ／ｍｉｎで溶出した。最後に、溶出液をＤ緩衝液で製剤化した。このように精製したタンパク質はＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に付し、クーマシーブルー染色を用いて確認した。

【0129】

その結果、図６Ａおよび６Ｂに示すように、キャプトアドヒア工程を省略して精製したｒｈＴＳＨタンパク質は１００％に近い純度を示し、ほとんどのＨＣＰは除去されるが、その量は医薬品用途の許容範囲である１００ｐｐｍを超えることが確認された。しかし、キャプトアドヒア工程実施後の精製ｒｈＴＳＨタンパク質では、結果としてＨＣＰが２０ｐｐｍ未満の最終体が得られ、この場合、精製収率が４５％と非常にすぐれていることが確認された。

【0130】

例５
精製したｒｈＴＳＨタンパク質の品質分析
ｒｈＴＳＨタンパク質生産方法の確立の主な目的は、流加培養条件下でタンパク質の生産性を向上させることである。本発明による条件下で、ｒｈＴＳＨの生産のため１８日間細胞を培養した時、タンパク質の生産性は非常にすぐれていたが、タンパク質の品質は低下するという問題があった。従って、１２日間培養したｒｈＴＳＨタンパク質を等電点電気泳動プロファイル（ＩＥＦ）およびペプチドマッピングに付し、市販されている対照群と比較した。

【0131】

最初に、精製したｒｈＴＳＨと対照群のグリコシル化プロファイルをゲルＩＥＦで比較した。試料をｐＨ３から１０のＩＥＦゲル（Invitrogen）に添加し、２００Ｖ、１００Ｖ、および５００Ｖで連続的にそれぞれ１時間、電気泳動を実施した。その後、電気泳動ゲルをクーマシーブルー染色により確認した。

【0132】

一方、精製したｒｈＴＳＨと対照群のペプチドマッピングのパターンをトリプシン処理により分析した。具体的には、２０μＬの８Ｍウレア（Sigma）と２．５μＬの２００ｍＭ ＤＴＴ（シグマ）を１００μｇの試料に添加し、均一に平衡化した後、７０℃で１０分間反応させた。その後、２．５μＬの５５０ｍＭヨードアセトアミド（シグマ）を各反応管に加え、室温で４０分間放置した。５０μＬのトリプシン（Promega）と１０５μＬの１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（シグマ）で試料を処理し、３７℃、１５時間反応させた後、切断されたペプチドを超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）により分析した。

【0133】

その結果、図７Ａおよび７Ｂに示すように、本発明の方法により培養、精製したｒｈＴＳＨタンパク質は、ＩＥＦプロファイルおよびペプチドマッピングの分析において、市販されている対照群と同様な結果を示し、本発明のｒｈＴＳＨタンパク質の品質がすぐれていることが確認された。

【0134】

例６
精製したｒｈＴＳＨタンパク質の生理活性の確認
上述の方法により精製したｒｈＴＳＨタンパク質のin vitroおよびin vivo活性を確認するため、以下の実験を実施した。

【0135】

６．１．ｒｈＴＳＨタンパク質のin vitro活性の確認
ｒｈＴＳＨタンパク質のin vitro活性を確認するため、ＴＳＨ／ＴＳＨＲのシグナル伝達経路により誘導されるセカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰの発現を測定した。

【0136】

具体的には、安定的に甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）とｃＡＭＰ依存性ルシフェラーゼ遺伝子を発現しているｃＡＭＰハンター（Hunter）（商標）ＣＨＯ－Ｋ１ ＴＳＨＲ（Ｌ）Ｇｓ細胞株［DiscoveRx］を、９６ウェルプレートに分注する前に、約７０から８０％の集密度を維持する同じ細胞株［DiscoveRx］の培養に使用した培地中で培養した。培養細胞を９６ウェルプレートに細胞２×１０^４個／ウェルで分注し、３７℃で１８から２０時間培養した後、各ウェルの培地を取り出し、４５μＬのｃＡＭＰ抗体試薬を添加した。3-イソブチル-1-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）で希釈した溶液１５μＬをそこに添加し、３７℃で３０分間反応させた。４０μＬのＥＤ／ＣＬ溶液をそこに添加し、２６℃から２８℃で１時間反応させ、ＥＤ／ＣＬ溶液を、ＥＤ試薬、ヒットハンター（HitHunter）ｃＡＭＰ ＸＳ＋Kit Substrate 2、ヒットハンターｃＡＭＰ ＸＳ＋Kit Substrate 1、および細胞溶解試薬を１５：１：５：９の比で混ぜて調製した。その後、４０μＬのＥＡ溶液を添加し、２６から２８℃で１時間反応させ、相対発光量（ＲＬＵ）をルミノメーター（BioTek、synergy 2)により測定した。ｒｈＴＳＨタンパク質と対照群のＥＣ_５０を測定値として計算して比較した。

【0137】

その結果、図８Ａに示すように、本発明のｒｈＴＳＨタンパク質のＥＣ_５０値は対照群と約９９％類似していることが確認された。

【0138】

６．２．ｒｈＴＳＨタンパク質のin vivo活性の確認
ｒｈＴＳＨタンパク質のin vivo活性を確認するため、ｒｈＴＳＨを動物モデルに投与した時の血中のＴ４量を測定した。

【0139】

最初に、一般的なＣ５７ＢＬ／６マウスを準備し、各群４匹ずつに分け、本発明のｒｈＴＳＨおよび対照群をそれぞれ０．１、０．５、および２ｍｇ／ｋｇの濃度で腹腔内に注射した。投与前、投与６時間後、および投与１２時間後に各マウスから血液を採取した。得られた試料は、分析するまで低温フリーザーで保管し、上記の例２で述べたようにＴＳＨ特異的ＥＬＩＳＡキット（Genway）を用いて血管内のＴ４レベルを確認することにより分析し、比較した。

【0140】

その結果、図８Ｂに示すように、本発明のｒｈＴＳＨタンパク質は、濃度依存的に対照群と同様のレベルでＴ４の発現を誘発した。

【0141】

従って、本発明の方法により生産して精製したｒｈＴＳＨタンパク質は市販製品と同様の活性を示したので、その品質がすぐれていることが判明した。
以下に、本願の実施態様を付記する。
［１］ 遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモン（ｒｈＴＳＨ）を活性成分として含む、再発甲状腺がんの診断または治療のための組成物であって、
１）ｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養する工程；
２）培養細胞数が細胞３×１０ ^６ から２×１０ ^７ 個／ｍＬに達した時に、前記培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げることにより前記細胞株を培養する工程；および
３）培養液からｒｈＴＳＨを得る工程
を含む流加培養により得られる、組成物。
［２］ 前記ヒト甲状腺刺激ホルモンが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、［１］に記載の組成物。
［３］ 工程１）のｒｈＴＳＨを産生する前記細胞株が、ｒｈＴＳＨのαサブユニットをコードする遺伝子とそのβサブユニットをコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含む、［１］に記載の組成物。
［４］ 前記細胞株が不死のハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞、およびＣＯＳ細胞から成る群より選択されるいずれか１つである、［３］に記載の組成物。
［５］ 工程１）の前記培養温度が３６℃から３８℃の範囲である、［１］に記載の組成物。
［６］ 前記培養温度が３７℃である、［５］に記載の組成物。
［７］ 工程２）において前記培養温度を下げる時、前記細胞数が細胞５×１０ ^６ から１×１０ ^７ 個／ｍＬの範囲である、［１］に記載の組成物。
［８］ 前記細胞数が細胞６×１０ ^６ から８×１０ ^６ 個／ｍＬの範囲である、［７］に記載の組成物。
［９］ 前記細胞数が細胞６×１０ ^６ 個／ｍＬである、［８］に記載の組成物。
［１０］ 工程２）の前記培養温度が３１℃から３３℃の範囲である、［１］に記載の組成物。
［１１］ 前記培養温度が３３℃である、［１０］に記載の組成物。
［１２］ 前記組成物が放射性ヨウ素治療において抗がん療法用補助剤として用いられる、［１］に記載の組成物。
［１３］ １）ｒｈＴＳＨを産生する細胞株を３５℃から４０℃の培養温度で培養する工程；
２）培養細胞数が細胞３×１０ ^６ から２×１０ ^７ 個／ｍＬに達した時に、前記培養温度を２９℃から３４℃の範囲に下げることにより前記細胞株を培養する工程；および
３）培養液からｒｈＴＳＨを得る工程
を含む、遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを流加培養により生産する方法。
［１４］ 前記ヒト甲状腺刺激ホルモンが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］ 工程１）のｒｈＴＳＨを産生する前記細胞株が、ｒｈＴＳＨのαサブユニットをコードする遺伝子とそのβサブユニットをコードする遺伝子を発現する発現ベクターを含む、［１３］に記載の方法。
［１６］ 前記細胞株が不死のハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞、およびＣＯＳ細胞から成る群より選択されるいずれか１つである、［１３］に記載の方法。
［１７］ 工程１）の前記培養温度が３６℃から３８℃の範囲である、［１３］に記載の方法。
［１８］ 前記培養温度が３７℃である、［１７］に記載の方法。
［１９］ 工程２）において前記培養温度を下げる時、前記細胞数が細胞５×１０ ^６ から１×１０ ^７ 個／ｍＬの範囲である、［１３］に記載の方法。
［２０］ 前記細胞数が細胞６×１０ ^６ から８×１０ ^６ 個／ｍＬの範囲である、［１９］に記載の方法。
［２１］ 前記細胞数が細胞６×１０ ^６ 個／ｍＬである、［２０］に記載の方法。
［２２］ 工程２）の前記培養温度が３１℃から３３℃の範囲である、［１３］に記載の方法。
［２３］ 前記培養温度が３３℃である、［２２］に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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