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特許7093952イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング材料及びその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-23
(45)【発行日】2022-07-01
(54)【発明の名称】イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング材料及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20220624BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220624BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220624BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20220624BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12N15/12
C12N5/10 ZNA
C12M1/34 A
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2018549069
(86)(22)【出願日】2017-11-01
(86)【国際出願番号】 JP2017039641
(87)【国際公開番号】W WO2018084221
(87)【国際公開日】2018-05-11
【審査請求日】2020-09-08
(31)【優先権主張番号】P 2016214685
(32)【優先日】2016-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】506218664
【氏名又は名称】公立大学法人名古屋市立大学
(73)【特許権者】
【識別番号】507125642
【氏名又は名称】株式会社チャネロサーチテクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】110000110
【氏名又は名称】弁理士法人 快友国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】今泉 祐治
(72)【発明者】
【氏名】山村 壽男
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 良明
(72)【発明者】
【氏名】川▲崎▼ 桂輔
(72)【発明者】
【氏名】成田 寛
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／００２４６０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】第89回日本薬理学会年会要旨集，2016年03月，p.[3-O-03]
【文献】J. Biomol. Screen.，2012年，vol. 17, no. 6，pp. 773-784
【文献】J. Pharmacol. Sci.，2013年，vol. 123, no. 2，pp. 147-158
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／０２
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｍ １／３４
Ｇ０１Ｎ ３３／１５
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングする方法であって、電位依存性Ｎａイオンチャネルの変異体であって脱分極に伴う活動電位の持続時間が１分以上であるＮａｖ１．５チャネルの変異体と、
静止膜電位－５０ｍＶ以下であるＫイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、を備える細胞を用い、
前記細胞に対して、前記Ｋイオンチャネルに対する選択的阻害剤を供給する工程と、
前記細胞に対して、前記標的イオンチャネルを阻害する又は活性化する可能性のある被験化合物を供給する工程と、
前記被験化合物の供給による前記細胞の細胞死への影響を評価する工程と、
を備え、
前記標的イオンチャネルは、前記選択的阻害剤によって惹起される前記細胞における脱分極又は該脱分極による前記細胞の細胞死を抑制するイオンチャネルである、方法。
【請求項2】
前記標的イオンチャネルは、前記Ｋイオンチャネルの前記選択的阻害剤に対する感受性が、前記細胞の前記選択的阻害剤による前記細胞死を抑制できる程度に低いイオンチャネルである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｋイオンチャネルは、Kir2.1、Kir2.2、Kir3.X、Kir4.X、Kir4.X、Kir5.X及びKir6.X及びKir7.Xからなる内向き整流性Ｋイオンチャネル群、Ｋ2Pイオンチャネル群及びCaイオン活性化Ｋイオンチャネル群から選択される1種以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｋイオンチャネルは、Kir2.1イオンチャネルである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記標的イオンチャネルは、電位依存性イオンチャネル、リガンド依存性イオンチャネル、機械刺激依存性イオンチャネル、温度依存性イオンチャネル、漏洩チャネルイオンチャネル及びリン酸化依存性イオンチャネルからなる群から選択される、請求項1～4のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、電位依存性Ｎａイオンチャネルの変異体であって脱分極に伴う活動電位の持続時間が１分以上であるＮａｖ１．５チャネルの変異体と、静止膜電位が－５０ｍＶ以下であるＫイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、を備える細胞と、
前記Ｋイオンチャネルの選択的阻害剤と、
を備え、
前記標的イオンチャネルは、前記選択的阻害剤によって惹起される前記細胞における脱分極又は該脱分極による前記細胞の細胞死を抑制できるイオンチャネルである、キット。
【請求項7】
前記標的イオンチャネルは、前記Ｋイオンチャネルの前記選択的阻害剤に対する感受性が、前記細胞の前記選択的阻害剤による前記細胞死を抑制できる程度に低いイオンチャネルである、請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記標的イオンチャネルは、電位依存性イオンチャネル、リガンド依存性イオンチャネル、機械刺激依存性イオンチャネル、温度依存性イオンチャネル、漏洩チャネルイオンチャネル及びリン酸化依存性イオンチャネルからなる群から選択される、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項9】
前記Ｋイオンチャネルは、Kir2.1イオンチャネルであり、
前記選択的阻害剤は、Ｂａイオン含有化合物である、請求項６～８のいずれかにに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書は、イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング材料及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
イオンチャネルは生理的に重要な機能を有している。イオンチャネルを標的として、当該イオンチャネルに作用する作用剤や阻害剤を探索することで、有用な薬剤を提供することが期待されている。こうしたイオンチャネル、例えば、電位依存性イオンチャネルを標的とする薬剤のスクリーニング系の評価手法として、細胞における膜電位の変化を電位感受性蛍光色素で検出する蛍光膜電位測定法が知られている（特許文献１）。
【0003】
また、本発明者らは、膜電位を検出する方法を改良した新たなスクリーニング系を開発している（特許文献２）。このスクリーニング系は、Ｎａ+イオンチャネル（以下、単にＮａイオンチャネルという。）とＫ+イオンチャネル（以下、単にＫイオンチャネルという。）を導入することにより、通常の状態では生存するが一旦細胞の脱分極が惹起されると細胞死が誘導される細胞死誘導系を備えるように構築した形質転換体（スクリーニング材料）を用いる。かかるスクリーニング材料によるスクリーニングの一種として、脱分極刺激を用いた標的イオンチャネルへの阻害剤のスクリーニングがある。かかるスクリーニングは、例えば、上記スクリーニング材料にさらに標的イオンチャネルを導入し発現させた上で、被験化合物と脱分極を惹起する電気刺激とをスクリーニング材料に付与する。そして、このスクリーニング材料の細胞死が抑制されるとき、被験化合物は標的イオンチャネルに対する阻害剤候補といえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２００６－１２６０７３号公報
【文献】国際公開第ＷＯ２０１２／００２４６０号
【発明の概要】
【0005】
しかしながら、特許文献２によるスクリーニング方法であっても、上記のように、被験化合物の標的イオンチャネルに対するスクリーニングにおいて、細胞の脱分極を惹起するための電気刺激を付与するという操作を要する場合が主であった。電気刺激の付与には、汎用でない電気刺激装置が必要であり、また操作を煩雑にするものであった。すなわち、脱分極付与のための電気刺激操作は、時間及び労力を要するものであった。したがって、効率的な大規模スクリーニングや一次スクリーニングに好適なスクリーニング系の確立が要請されている。
【0006】
本明細書は、脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を備えるスクリーニング材料のスクリーニング効率を一層向上させるスクリーニング方法及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、細胞死誘導系を備えるスクリーニング材料を用いるスクリーニング系において、脱分極の惹起に関連する要素の１つであるＫイオンチャネル、特に内向き整流性Ｋイオンチャネルに着目した。かかるＫイオンチャネルは、従来、細胞死誘導系を備えるスクリーニング材料では、静止膜電位を負の方向に深くして、脱分極による活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルの細胞死に向けた作用を通常状態で抑制して細胞としての生存を確保している。
【0008】
本発明者らは、このＫイオンチャネルに対して特異的な阻害作用を示す阻害剤を供給することで脱分極を惹起し細胞死を誘導できることを見出した。さらに、本発明者らは、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下でも、スクリーニング材料の静止膜電位を負の方向へ導くイオンチャネルを標的イオンチャネルとして発現させること、あるいは、活動電位の持続時間の短縮に寄与するイオンチャネルを標的イオンチャネルとして発現させることで、過分極状態を維持し脱分極を惹起しない定常状態では細胞死を抑制できることを見出した。さらに、本発明者らは、かかるスクリーニング材料の標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤を供給するなどして標的イオンチャネルの状態が変化すると、細胞内イオン環境が変化して、過分極の維持又は脱分極の惹起が生じて、こうした結果を、細胞生存又は細胞死としてそれぞれ検出できることを見出した。本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
【0009】
（１） 標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤のスクリーニング材料であって、
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、
を備える細胞を含み、
前記Ｎａイオンチャネルと前記Ｋイオンチャネルと前記標的イオンチャネルとが、前記Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を構築している、スクリーニング材料。
（２） 前記標的イオンチャネルは、前記細胞死誘導系によって誘導される細胞死に抑制的に作用する、（１）に記載のスクリーニング材料。
（３） 前記Ｋイオンチャネルに対する選択的阻害剤を用いる、（１）又は（２）に記載のスクリーニング材料。
（４） 前記標的イオンチャネルは、前記Ｋイオンチャネルの阻害剤に対する感受性が、前記Ｋイオンチャネルよりも低い、（３）に記載のスクリーニング材料。
（５） 前記標的イオンチャネルは、静止膜電位を負方向に深くすることに寄与するイオンチャネルであって、前記Ｋイオンチャネルとは異なる他のＫイオンチャネルである、（１）～（４）のいずれかに記載のスクリーニング材料。
（６） 前記他のＫイオンチャネルは、Ｋ２Ｐチャネルである、（５）に記載のスクリーニング材料。
（７） 前記標的イオンチャネルは、脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである、（１）～（６）のいずれかに記載のスクリーニング材料。
（８） 標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングする方法であって、
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、を備える細胞であって、前記Ｎａイオンチャネルと前記Ｋイオンチャネルと前記標的イオンチャネルとが、前記Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を構築している細胞を用い、
前記細胞に対して、前記阻害剤を供給する工程と、
前記細胞に対して、前記標的イオンチャネルを阻害する又は活性化する可能性のある被験化合物を供給する工程と、
前記被験化合物の供給による前記細胞の細胞死への影響を評価する工程と、
を備える、方法。
（９） 標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、を備える細胞であって、前記Ｎａイオンチャネルと前記Ｋイオンチャネルと前記標的イオンチャネルとが、前記Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を構築している細胞と、
前記阻害剤と、
を備える、キット。
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、
を備える細胞を含み、
前記Ｎａイオンチャネルと前記Ｋイオンチャネルと前記標的イオンチャネルとが、前記Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を構築している、スクリーニング材料。
（２） 前記標的イオンチャネルは、前記細胞死誘導系によって誘導される細胞死に抑制的に作用する、（１）に記載のスクリーニング材料。
（３） 前記Ｋイオンチャネルに対する選択的阻害剤を用いる、（１）又は（２）に記載のスクリーニング材料。
（４） 前記標的イオンチャネルは、前記Ｋイオンチャネルの阻害剤に対する感受性が、前記Ｋイオンチャネルよりも低い、（３）に記載のスクリーニング材料。
（５） 前記標的イオンチャネルは、静止膜電位を負方向に深くすることに寄与するイオンチャネルであって、前記Ｋイオンチャネルとは異なる他のＫイオンチャネルである、（１）～（４）のいずれかに記載のスクリーニング材料。
（６） 前記他のＫイオンチャネルは、Ｋ２Ｐチャネルである、（５）に記載のスクリーニング材料。
（７） 前記標的イオンチャネルは、脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである、（１）～（６）のいずれかに記載のスクリーニング材料。
（８） 標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングする方法であって、
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、を備える細胞であって、前記Ｎａイオンチャネルと前記Ｋイオンチャネルと前記標的イオンチャネルとが、前記Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を構築している細胞を用い、
前記細胞に対して、前記阻害剤を供給する工程と、
前記細胞に対して、前記標的イオンチャネルを阻害する又は活性化する可能性のある被験化合物を供給する工程と、
前記被験化合物の供給による前記細胞の細胞死への影響を評価する工程と、
を備える、方法。
（９） 標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングするためのキットであって、
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルと、を備える細胞であって、前記Ｎａイオンチャネルと前記Ｋイオンチャネルと前記標的イオンチャネルとが、前記Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系を構築している細胞と、
前記阻害剤と、
を備える、キット。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本明細書に開示されるスクリーニング材料の概要を示す図である。
【図2】本明細書に開示されるスクリーニング技術による標的イオンチャネル、例えば、４回膜貫通型及び２ポア型Ｋイオンチャネル（Ｋ２Ｐチャネル）に対する開口薬（作用剤）及び閉口薬（阻害剤）の作用を示す図である。
【図3】各種疾患と関連するＫ２Ｐチャネルを示す図である。なお、斜字で示すイオンチャネルは阻害剤（閉口薬）が治療に有効な薬剤となるイオンチャネルを示し、斜字でないイオンチャネルは、作用剤（開口薬）が治療に有効な薬剤となるイオンチャネルを示す。
【図4】Ｋ２Ｐチャネル非発現細胞に対するＢａ2+イオン（以下、単にＢａイオンという。）の作用の評価結果を示す図である。
【図5】Ｂａイオン感受性の高いＫイオンチャネル変異体の作製例を示す図である。
【図6】ＴＲＥＫ－１（Ｋ２Ｐチャネルの一種である。）発現細胞における、Ｂａイオン存在下でのＴＲＥＫ－１阻害薬による細胞死及びＴＲＥＫ－１の温度感受性を示す図である。
【図7】ＴＡＳＫ－１又はＴＡＳＫ－３（ともにＫ２Ｐチャネルの一種である。）発現細胞における、ＴＡＳＫ－１及びＴＡＳＫ－３の阻害薬であるＰＫ－ＴＨＰＰ及びＭＬ３６５の用量作用曲線を示す図である。
【図8】ＴＡＳＫ－３（Ｋ２Ｐチャネルの一種である。）発現細胞におけるＢａイオン誘発性の細胞死の抑制を示す図である。
【図9】ＳＫ２及びＳＫ４発現細胞におけるＳＫチャネル対する活性化剤（ＤＣＥＢＩＯ、ＮＳ３０９）及び阻害薬の作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書は、イオンチャネルを標的とするスクリーニング系に関する。具体的には、イオンチャネル(膜輸送タンパク質)に作用する化合物をスクリーニングするために用いることができる細胞を含むスクリーニング材料及び当該材料を利用したスクリーニング方法、並びにスクリーニング用キット等に関する。
【0012】
標的イオンチャネルに対する薬剤による細胞死を指標とするスクリーニングには、脱分極が惹起されない定常状態では生存しているが、脱分極が惹起されると細胞死に至るシステムの構築が必要である。本発明者らは、本発明者らがこれまでに開発した細胞死誘導系を備える細胞、すなわち、脱分極の惹起により発生する活動電位の持続時間が延長されているが、脱分極が惹起されない状態では膜電位を負の方向に深くすることによって生存している細胞においては、脱分極の惹起のために電気刺激を要していた。
【0013】
今回、本発明者らは、当該細胞の有する細胞死誘導系を脱分極が惹起できる系としても利用できることを初めて見出した。換言すると、本発明者らは、従来の細胞死誘導系自身に、電気刺激によらないで脱分極及び細胞死を制御できる仕組みを内在させることが可能であることを見出した。さらに、本発明者らは、標的イオンチャネルとして、電気刺激によらない脱分極を抑制できるようなイオンチャネルを用いることで、この種の標的イオンチャネル（以下、抑制的標的イオンチャネルともいう。）に対する被験化合物の作用を簡易に評価できる新たな細胞死誘導系（評価系）を構築できることを見出したことに基づいている。図１に、本スクリーニング材料の概要を示す。
【0014】
図１には、本スクリーニング材料における、脱分極が惹起されない定常状態では生存しているが、脱分極が惹起されると細胞死に至るシステムを示す。図１に示すように、本スクリーニング材料は、脱分極に伴って発生する活動電位の持続時間を延長するＮａイオンチャネルと、静止膜電位を深くするＫイオンチャネルと、を備えている。また、本スクリーニング材料は、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルを備えている。これらのＮａイオンチャネルとＫイオンチャネルと抑制的標的イオンチャネルとは、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で脱分極の惹起により細胞死が誘導される細胞死誘導系、換言すれば、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤存在下での抑制的標的イオンチャネルに対する作用の評価系を構築している。
【0015】
図１においては、例えば、ＮａイオンチャネルとしてＮａｖ１．５ ＩＦＭ／ＱＱＱを用いており、ＫイオンチャネルとしてＫｉｒ２を用いており、また、抑制的標的イオンチャネルとしてＫ２Ｐイオンチャネルを用いている。
【0016】
このスクリーニング材料において、Ｋイオンチャネルを阻害する薬剤、例えばＢａイオンが、Ｋイオンチャネルに作用することで、Ｋイオンチャネルの静止膜電位を深くする方向の作用が抑制されて脱分極が惹起されやすくなり、スクリーニング材料は細胞死に至る傾向が強くなる。一方、こうした阻害剤による脱分極に対して本来的に抑制するように作用する抑制的標的イオンチャネルが発現していることで、阻害剤による脱分極が抑制されて、スクリーニング材料の細胞死傾向が抑制される。その結果、細胞は生存可能となる。ここで、スクリーニング材料に抑制的標的イオンチャネルの作用を阻害する薬剤、例えば、阻害剤（閉口薬）が供給されると、抑制的標的イオンチャネルによる細胞死の抑制傾向が阻害されることになり、スクリーニング材料の細胞死傾向が強まり、細胞死が誘導される。また、標的イオンチャネルの作用を促進する薬剤、例えば作用剤（開口薬）が供給されると、抑制的標的イオンチャネルの細胞死の抑制傾向は維持されるか又は促進されるため、スクリーニング材料において細胞死は誘導されない。
【0017】
図２には、ＮａイオンチャネルとＫイオンチャネルと抑制的標的イオンチャネルとを備える本スクリーニング材料と、ＮａイオンチャネルとＫイオンチャネルとを備える細胞とを対比して、抑制的標的イオンチャネル、例えばＫ２Ｐチャネルに対する開口薬（作用剤）と閉口薬（阻害剤）の作用を示す。
【0018】
図２に示すように、抑制的標的イオンチャネルを備えない細胞では、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤を供給すると、脱分極に抑制的に制御するイオンチャネルが存在しないか又はその活性が低いため、細胞膜の静止膜電位はもはや維持されずに脱分極が惹起され、それにより細胞死が誘導される。
【0019】
一方、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下、抑制的標的イオンチャネルを備える細胞である本スクリーニング材料に、抑制的標的イオンチャネルに対する開口薬（作用剤）を供給すると、抑制的標的イオンチャネルの活性化によって、細胞膜の静止膜電位は維持されるか又は過分極方向に変化するため、脱分極は惹起されず細胞死は誘導されないで細胞は生存する。これに対して、抑制的標的イオンチャネルに対する閉口薬（阻害剤）を供給すると、抑制的標的イオンチャネルによる細胞死の抑制傾向が阻害されることにより、スクリーニング材料の細胞死傾向が強まり、細胞死が誘導される。
【0020】
すなわち、図２に示すスクリーニング材料では、静止膜電位が維持されるか否か又はその程度によって、最終的に細胞の生存／細胞死という細胞の運命が決定される。
【0021】
このように、本明細書に開示される本スクリーニング材料は、細胞死誘導系を構成するＮａイオンチャネル及びＫイオンチャネルのほかに、この誘導系における脱分極に対して抑制的に作用する標的イオンチャネルを備えることで、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の細胞への供給による脱分極の惹起を利用して、抑制的標的イオンチャネルに対する薬剤の作用を評価し、阻害剤や作用剤をスクリーニングすることができる。
【0022】
なお、上記説明では、抑制的標的イオンチャネルとして、静止膜電位を負方向に深くするイオンチャネルについて説明したが、抑制的標的イオンチャネルとしては、脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮するイオンチャネルも包含する。すなわち、スクリーニング材料は、脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮するイオンチャネルを抑制的標的イオンチャネルとして備えることもできる。なお、静止膜電位を負方向に深くするイオンチャネルは、同時に脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮するイオンチャネルでもある。脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮するイオンチャネルを抑制的標的イオンチャネルとして備えるスクリーニング材料に、抑制的標的イオンチャネルに対する開口薬（作用剤）を供給しても、活動電位の持続時間の短縮が維持されるため細胞死は誘導されないで細胞は生存する。一方、抑制的標的イオンチャネルに対する閉口薬（阻害剤）を供給すると、もはや抑制的標的イオンチャネルによる活動電位の持続時間の短縮は維持されず持続時間は保持又は延長され、細胞死が誘導される。
【0023】
すなわち、こうしたスクリーニング材料によれば、活動電位の持続時間が短縮されるか否か又はその程度によって、最終的に細胞の生存／細胞死という細胞の運命が決定される。
【0024】
また、本明細書に開示されるスクリーニング材料によれば、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の濃度によって、スクリーニング材料の細胞死率を調整できる。このため、例えば、５０％の細胞が死滅する阻害率で阻害剤を存在させて、被験化合物をスクリーニング材料に供給することで、被験化合物の標的イオンチャネルに対する開口薬（作用剤）か閉口薬（阻害剤）かの双方の評価を定性的にも定量的にも評価することができる。
【0025】
本明細書の開示のスクリーニング材料によれば、標的イオンチャネルに対する作用を、当該標的イオンチャネルを含めて構築された、Ｋイオンチャネル阻害剤を用いる評価系を備えることで、効率的なスクリーニングが可能となっている。
【0026】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニング材料及びその利用」を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
【0027】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【0028】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【0029】
なお、本明細書において、イオンチャネルに対する作用剤とは、意図するイオンチャネルの本来的な機能を維持又は促進する薬剤（化合物やタンパク質など）をいう。また、イオンチャネルに対する阻害剤とは、意図するイオンチャネルの本来的な機能を少なくとも部分的に阻害する薬剤（化合物や生物由来製剤など）をいう。
【0030】
（スクリーニング材料）
本スクリーニング材料は、脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルを備えている。また、本スクリーニング材料は、静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルを備えている。さらに、本スクリーニングは、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルを備えている。
本スクリーニング材料は、脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルを備えている。また、本スクリーニング材料は、静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネルを備えている。さらに、本スクリーニングは、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである標的イオンチャネルを備えている。
【0031】
本スクリーニング材料の細胞は、イオンチャネルのスクリーニング用として用いることができるものであれば特に限定しないで、各種の動植物細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳動物や昆虫など特にその種類は限定されない。細胞が、ヒトのほか、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、トリ、イヌ、ネコ、ウサギ等の細胞の場合には、これらの動物における疾患の予防又は治療のための薬剤のスクリーニング材料を取得できる。また、昆虫細胞を宿主とする場合には、昆虫を対象とする駆除薬等のスクリーニング材料を取得できる。また、細胞を植物細胞とするときは、農薬等のスクリーニング材料を取得できる。動物細胞としては、典型的には、ヒト胎児腎由来細胞（HEK細胞）、アフリカミドリザル腎由来細胞（COS細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、ベビーハムスター腎細胞（BHK細胞）及びアフリカツメガエル卵母細胞が用いられる。また、各種組織由来培養細胞を用いることもできる。
【0032】
（Ｎａイオンチャネル）
本スクリーニング材料が備えるＮａイオンチャネルは、脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルである。かかるＮａイオンチャネルは、換言すれば、不活性化を抑制されたＮａイオンチャネルということもできる。
本スクリーニング材料が備えるＮａイオンチャネルは、脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルである。かかるＮａイオンチャネルは、換言すれば、不活性化を抑制されたＮａイオンチャネルということもできる。
【0033】
ここで電位依存性Ｎａイオンチャネルとは、細胞膜の膜電位に依存して開口してＮａイオンの受動拡散を媒介する細胞膜上のタンパク質である。本明細書において用いる電位依存性Ｎａイオンチャネルは、特に限定しないで公知の各種電位依存性Ｎａイオンチャネルを用いることができるが、好ましくは、Nav1.5チャネルである。Nav1.5チャネルは、心筋細胞などに分布しており、活動電位の発生と興奮伝導に関与していると考えられている。
【0034】
電位依存性Ｎａイオンチャネルは、膜電位に依存してゲートが開きＮａイオン透過性を発揮した後、不活性化機構が働いてＮａイオン透過性を失う（不活性化）。これに対して、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルは、こうした不活性化機構を抑制（消失）させたものである。すなわち、不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルは、膜電位に依存してゲートが開きイオン透過性を発揮した後、こうした不活性化が生じないＮａイオンチャネルを意味している。不活性化を抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルでは、細胞膜において脱分極が惹起されて当該イオンチャネル自身が活性化されるとイオンチャネルを開口してＮａイオンの受動拡散を媒介しうる状態をとるが、イオンチャネル自身の不活性化が抑制されているため、イオンチャネルの開口した状態が維持される。この結果、不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルでは、刺激を受けて活動電位が一旦発生すると、イオンチャネルの不活性化が遅延されるため、活動電位が本来の電位依存性Ｎａイオンチャネルより長く継続する。
【0035】
また、不活性が抑制されたＮａイオンチャネルは、定常的若しくは比較的に深い静止膜電位でも活性化されやすくなっている（いわゆるウィンドウ電流が大きくなっている）。従ってかかるＮａイオンチャネルを発現した細胞では、充分に深い負電位に静止膜電位を保持した場合にのみ、過剰なＮａイオンの流入を防ぐことができる。かかる電位依存性Ｎａイオンチャネルを充分に発現した細胞においては、脱分極により容易にＮａイオンチャネル活性が増大し、１分以上、好ましくは２分以上、より好ましくは３分以上、さらに好ましくは５分以上程度、活動電位あるいは脱分極が維持される。このため細胞内への過剰なＮａ流入が生じて細胞を死に至らしめる。
【0036】
かかる不活性化の抑制は、電位依存性Ｎａイオンチャネルのアミノ酸配列に対してアミノ酸変異を導入することによって適宜実現することができる。Ｎａｖ１．５チャネルの不活性化を抑制するには、いくつかの具体的な手法が開示されている。たとえば、ＩＦＭモチーフを改変すること（Grant et al., Biophys. J., 79: 3019-3035, 2000）、406番目のアスパラギンをグルタミン酸やアルギニン、リシンに変異させること（McNulty et al., Mol. Pharmacol., 70: 1514-1523, 2006）、ドメインＩＩＩ－ＩＶをつなぐIFM部分を含むリンカー部位を欠損させること(Patton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A , 89: 10905-10909, 1992、West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,: 10910 - 10914, 1992)、ドメインＩＶのセグメント４のアミノ酸を変異させること（Chen et al., J. Gen. Physiol., 108: 549-556, 1996)などが報告されている。アミノ酸配列に対する変異導入は、当業者であればこれらの文献や周知技術に基づいて適宜実施することができる。
【0037】
本スクリーニング材料は、こうしたＮａイオンチャネル（天然タンパク質又は変異体タンパク質）をコードするＤＮＡ（以下、第１のＤＮＡともいう。）を保持して発現していることが好ましい。本スクリーニング材料は、当該変異体、すなわち、不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該ＤＮＡは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。ＤＮＡは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター（構成的プロモーター）の制御下に連結されている。このようなスクリーニング材料は、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、ＤＮＡを含む発現ベクター等を構築し、これをスクリーニング材料の宿主に導入し形質転換することで、定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。
【0038】
また、Ｎａイオンチャネルの発現量は、第１のＤＮＡを制御するプロモーターなどの制御領域の種類や、導入する第１のＤＮＡを含む発現カセット数や、遺伝子導入後の細胞培養条件などを制御することで調整することができる。
【0039】
なお、電位依存性Ｎａイオンチャネルが２以上のサブユニットからなる場合であって、不活性化のために有効な変異を含むサブユニットが全体の一部であるとき、当該一部のサブユニットのみをそれぞれコードするＤＮＡを１又は２以上のＤＮＡとしてスクリーニング材料に発現させることもできるし、当該Ｎａイオンチャネルを構成する他のサブユニットも同時に共発現させるように、これらのサブユニットをコードするＤＮＡをＤＮＡとしてそれぞれ発現可能に保持させるようにしてもよい。さらに、発現される不活性化が抑制された電位依存性Ｎａイオンチャネルを、より効果的に機能させるために必要な酵素や他のタンパク質、化合物などがあれば、これらの物質を適宜発現または供給するようにしてもよい。
【0040】
（静止膜電位を負方向に深くするＫイオンチャネル）
本スクリーニング材料が備えるＫイオンチャネルは、静止膜電位が負の方向に深くなるように、換言すれば、より負の電位が大きくなるような機能（活性）を有するイオンチャネルである。すなわち、かかるＫイオンチャネルによれば、その発現や活性によるＫイオン透過性の亢進により深い静止膜電位を形成することができる。上記したＮａイオンチャネルを備えると、細胞内外におけるＮａイオンの濃度差により、Ｎａイオンが細胞内に過剰に流入する状態となり、最終的には細胞内のＮａイオン濃度が高まり細胞は死んでしまう。細胞をスクリーニング材料として用いるには、かかる細胞死誘導系が誘導されるまでは細胞が生存している必要がある。そこで、静止膜電位を深く（低く）するために、静止膜電位が負の方向に深くするＫイオンチャネルを用いる。
本スクリーニング材料が備えるＫイオンチャネルは、静止膜電位が負の方向に深くなるように、換言すれば、より負の電位が大きくなるような機能（活性）を有するイオンチャネルである。すなわち、かかるＫイオンチャネルによれば、その発現や活性によるＫイオン透過性の亢進により深い静止膜電位を形成することができる。上記したＮａイオンチャネルを備えると、細胞内外におけるＮａイオンの濃度差により、Ｎａイオンが細胞内に過剰に流入する状態となり、最終的には細胞内のＮａイオン濃度が高まり細胞は死んでしまう。細胞をスクリーニング材料として用いるには、かかる細胞死誘導系が誘導されるまでは細胞が生存している必要がある。そこで、静止膜電位を深く（低く）するために、静止膜電位が負の方向に深くするＫイオンチャネルを用いる。
【0041】
細胞の生存に影響しない範囲で静止膜電位は、負の方向に深いほど好ましい。膜電位は、好ましくは、－５０ｍＶ、より好ましくは－６０ｍＶ、さらに好ましくは－７０ｍＶ程度、一層好ましくは－８０ｍＶ程度とすることが適している。
【0042】
こうしたＫイオンチャネルとしては、たとえば、内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）、４回膜貫通型及び２ポア型Ｋイオンチャネル（Ｋ２Ｐチャネル）などが活性化している状態が挙げられる。４回膜貫通型及び２ポア型のＫイオンチャネル（Ｋ２Ｐチャネル）は性質が異なる様々な種類が存在し、ＴＷＩＫ、ＴＲＥＫ、ＴＡＳＫ、ＴＡＬＫ、ＴＨＩＫ、ＴＲＥＳＫなどに分類される。これらのイオンチャネルは電位及び時間依存性が殆どないことからリークチャネルとして機能している。漏洩チャネルの性質上、これらのＫイオンチャネルは、細胞の静止膜電位の維持（固定）に働いている。
【0043】
内向き整流性Ｋイオンチャネルは、特に限定しないが、例えば、Ｋｉｒ２．１、２．２、２．３及び２．４などの各種Ｋｉｒ２ｘチャネルが挙げられる。Ｋｉｒ２．１は、２回膜貫通型構造を持つ内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）である。電位依存性を持たず、膜電位をＫイオンの平衡電位である－８０ｍＶ付近に近づける性質を持つ。神経や心臓、骨格筋などに発現しており、静止膜電位の形成やその安定化及び維持を行なっている。Ｋｉｒ２．２は、Ｋｉｒ２．１と同様の内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）であるがＫｉｒ２．１よりも内向き整流性が強い。心臓や脳、骨格筋などにＫｉｒ２．１とともに発現しており、ヒトの血管内皮細胞においては内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）活性の中で主要な働きをしている。また、Ｋｉｒ２．２は、後述するように、例えば、Ｂａイオンなどによって特異的に阻害される点において本スクリーニング材料に好適である。
【0044】
Ｋｉｒ．２．ｘイオンチャネルについては、Circ. Res. 94:1332-1339 (2004)及びAm. J. Physiol. Cell Physiol. 289:C1134-C1144 (2005)等に記載されている。例えば、ヒト由来のＫｉｒ２.ｘチャネルをコードする遺伝子の塩基配列は、Ｋｉｒ２．１（GenBank accession No. U12507, NM#000891(Human KCNJ2)）、Ｋｉｒ２．２（GenBank accession No. AB074970, NM#021012(Human KCNJ12)）、Ｋｉｒ２．３（GenBank accession No. U07364, U24056, NM#152868(Human KCNJ4)）、Ｋｉｒ２．４（GenBank accession No. AF081466, NM#013348(Human KCNJ14)）等が挙げられる。
【0045】
同様に、Ｇ蛋白制御内向き整流性Ｋイオンチャネル（ＧＩＲＫチャネル，Ｋｉｒ）が挙げられる。GIRKチャネル(Ｋｉｒ3)は、内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）であるが、Ｋｉｒ2と異なりGタンパク質によって活性化されるＫイオンチャネルである。これらのサブユニットには組織特異性があり心臓ではＫｉｒ３．１/Ｋｉｒ３．４、中枢神経ではＫｉｒ３．１/Ｋｉｒ３．２で構成する異種四量体を形成している。通常時には活性化せず、アゴニスト刺激により活性化する。しかし、イオンチャネルポアを形成する膜貫通ヘリックスのアミノ酸を変異させることで、常時イオンチャネルが開いたままになることがアフリカツメガエル卵母細胞の実験で報告されている（Claydon et. al., J. Biol. Chem. 278: 50654-50663,2003）。このことからこの変異体を利用することでＫｉｒ２．１と同様に深い静止膜電位を形成できると考えられる。例えば、ヒト由来のＫｉｒ３.ｘチャネルをコードする塩基配列は、Ｋｉｒ３．１ (GenBank accession No. NM#002239(Human KCNJ3)）、Ｋｉｒ３．２ （GenBank accession No.NM#002240(Human KCNJ6)）、Ｋｉｒ３．３（GenBank accession No. NM#004983(Human KCNJ9)）、Ｋｉｒ３．４ （GenBank accession No.NM#000890(Human KCNJ5)）が挙げられる。
【0046】
さらに、ＡＴＰ感受性内向き整流性Ｋイオンチャネル（KATPチャネル、Ｋｉｒ6）が挙げられる。KATPチャネルはATPで抑制され、ADPで活性化される内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）である。KATPチャネルは細胞の代謝状態に応じて細胞の興奮性を制御している。KATPチャネルは４個のKATPチャネルと４個のスルフォニルウレア受容体（ＳＵＲ）から構成される異種８量体である。KATPチャネルのみでは機能をもたないがKATPチャネルのC末端を欠損させることでKATPチャネルのみで機能をもつようになることが報告されている（Tucker et. al., EMBO J. EMBO J 17: 3290-3296, 1998）。また、この欠損体にさらに変異をかけることでATP感受性を下げ、常時活性化させることができる。この変異体を用いることでも深い静止膜電位を形成できる。ヒト由来のＫｉｒ６．ｘチャネルをコードする塩基配列は、Ｋｉｒ６．１（GenBank accession No. NM#004982(Human KCNJ8)）、Ｋｉｒ６．２（GenBank accession No. NM001166290(Human KCNJ11)）が挙げられる。
【0047】
また、４回膜貫通型及び2ポア型Ｋイオンチャネル（Ｋ２Ｐチャネル）としては、例えば、ＴＨＩＫチャネル（ＨＥＫ２９３細胞に発現させると膜電位が深くなること；Campanucci et al., Neuroscience, 135: 1087-1094, 2005）、ＴＡＳＫ－２チャネル（アフリカツメガエル卵母細胞に発現させると静止膜電位が深くなること；Kindler et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 306: 84-92, 2003.）、電位依存性Ｋチャネル（平滑筋組織で電位依存性Ｋチャネルが静止膜電位を深くすること；McDaniel et al., J. Appl. Physiol. (1985) 91: 2322-2333, 2001）などが知られている。
【0048】
４回膜貫通型及び２ポア型Ｋイオンチャネル（Ｋ２Ｐチャネル）は、ＴＷＩＫ、ＴＲＥＫ、ＴＡＳＫ、ＴＡＬＫ、ＴＨＩＫ及びＴＲＥＳＫの各サブファミリーに分類される。ＴＷＩＫサブファミリーは、ＴＷＩＫ－１、ＴＷＩＫ－２チャネルを含んでいる（Lotshaw, Cell Biochem. Biophys. 47: 209-256, 2007）。ＴＷＩＫチャネルは、ヒトでは多くの組織に存在している。例えば、ヒト由来のＴＷＩＫイオンチャネルは、ＴＷＩＫ－１（GenBank accession No.NM#002245(ＫＣＮＫ１)）及びＴＷＩＫ－２（GenBank accession No.NM#004823(ＫＣＮＫ６)）が挙げられる。
【0049】
TREKサブファミリーは、ＴＲＥＫ－１、ＴＲＥＫ－２及びＴＲＡＡＫチャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のＴＲＥＫイオンチャネルは、ＴＲＥＫ－１（GenBank accession No. NM#014217(ＫＣＮＫ２)）、ＴＲＥＫ－２（GenBank accession No. NM#138317(ＫＣＮＫ１０)）及びＴＲＡＡＫ（GenBank accession No. NM#033310(ＫＣＮＫ４)）が挙げられる。
【0050】
ＴＡＳＫサブファミリーは、ＴＡＳＫ－１、ＴＡＳＫ－３及びＴＡＳＫ－５チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のＴＡＳＫイオンチャネルは、ＴＡＳＫ－１（GenBank accession No. NM#002246(ＫＣＮＫ３)）、TASK-3（GenBank accession No. NM#016601(ＫＣＮＫ９)）及びTASK-5（GenBank accession No. NM#022358(ＫＣＮＫ１５)）が挙げられる。
【0051】
ＴＡＬＫサブファミリーは、ＴＡＬＫ－１、ＴＡＬＫ－２及びＴＡＳＫ－２チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のＴＡＬＫイオンチャネルは、ＴＡＬＫ－１（GenBank accession No. NM#001135106(ＫＣＮＫ１６)）、ＴＡＬＫ－２（GenBank accession No. NM#001135111(ＫＣＮＫ１７)）及びＴＡＳＫ－２（GenBank accession No. NM#003740(ＫＣＮＫ５)）が挙げられる。
【0052】
ＴＨＩＫサブファミリーは、ＴＨＩＫ－１、ＴＨＩＫ－２チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のＴＨＩＫイオンチャネルは、ＴＨＩＫ－１（GenBank accession No. NM#022054(ＫＣＮＫ１３)）、ＴＨＩＫ－２（GenBank accession No. NM#022055(ＫＣＮＫ１２)）が挙げられる。
【0053】
ＴＲＥＳＫサブファミリーは、ＴＲＥＳＫ（GenBank accession No. NM#181840(ＫＣＮＫ１８)）が挙げられる。
【0054】
Ｋイオンチャネルは、こうした各種の天然のＫイオンチャネルのほか、これらを改変したＫイオンチャネル変異体を用いることもできる。本スクリーニング材料は、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で使用することが好適である。当該阻害剤は、Ｋイオンチャネルをできるだけ高い選択性で、できるだけ高い感度で（低濃度で）阻害できることが好ましい。したがって、阻害剤に対するより好適な選択性や感受性をＫイオンチャネルに付与するため、Ｋイオンチャネルに適宜改変を加えることもできる。
【0055】
例えば、図５に示すように、Ｋｉｒ２．２のアミノ酸配列を、Ｋｉｒ２．１のアミノ酸配列とアライメントしたとき、Ｋｉｒ２．２のアミノ酸配列においてＫｉｒ２．１のＥ１２５に対応するＱ（グルタミン）をＥ（グルタミン酸）、アルパラギン酸（Ｄ）などの酸性アミノ酸残基に置換することで好適なＢａイオン感受性が得られると考えられる。なお、Ｋｉｒチャネルタンパク質については、膜貫通領域やポア領域など種々の領域が既に特定されている（Scharm et al., Cardiovasc. Res. 59: 328-338, 2003等）。また、Ｋｉｒ２．１のＥ１２５は、ＢａイオンとＫｉｒチャネルとの相互作用を補助していることも既に知られている（Alagem et al., J. Physiol. 534: 381-393, 2001）。
【0056】
なお、公知のタンパク質について、意図した機能を付与又は削除、増強又は減弱等するために改変する技術は当業者において公知である。目的のタンパク質について、特に、イオンチャネルなどに関しては膜貫通領域やポア領域などよく研究されていることから、タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを利用して、適切な改変可能部位をある程度特定することは当業者における日常的な作業である。そして、改変可能部位についてのアライメント情報に基づいて可能性あるアミノ酸残基の置換を検討して変異体を取得し、当該変異体の機能を評価することも当業者の日常的な作業である。
【0057】
本スクリーニング材料においては、こうしたＫイオンチャネルによって静止膜電位を深くする目的で、１又は２以上適宜組み合わせて用いることができる。
【0058】
本スクリーニング材料は、Ｎａイオンチャネルと同様に、こうしたＫイオンチャネル（天然タンパク質又は変異体タンパク質）をコードするＤＮＡ（以下、第２のＤＮＡともいう。）を保持して発現していることが好ましい。本スクリーニング材料は、天然体又は当該変異体であるＫイオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該ＤＮＡは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。また、第１のＤＮＡと同様、第２のＤＮＡは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター（構成的プロモーター）の制御下に連結されている。さらに、Ｋイオンチャネルが２以上の異なるサブユニットからなる場合には、Ｎａイオンチャネルにおけるのと同様の態様が適用される。また、Ｋイオンチャネルの発現量も、第１のＤＮＡの場合と同様に調整することができる。
【0059】
本スクリーニング材料は、上記Ｎａイオンチャネルを及び上記Ｋイオンチャネルを、それぞれ、細胞膜上等に備えることで、不活性化の抑制された変異型電位依存性Ｎａイオンチャネルを有していても、脱分極が惹起されるまでは、Ｎａイオンの細胞内流入による細胞死が回避された細胞となっている。すなわち、細胞死誘導系を備えているが、脱分極の惹起を待って作動する細胞死誘導系が待機した状態となっている。
【0060】
（抑制的標的イオンチャネル）
本スクリーニング材料が備えることができる抑制的標的イオンチャネルは、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである。抑制的標的イオンチャネルは、本スクリーニング材料が備える、Ｋイオンチャネルに対して阻害的に作用して、細胞死誘導系において脱分極を惹起して細胞死を誘導できる阻害剤（以下、Ｋイオンチャネル阻害剤ともいう。）による脱分極の惹起や細胞死誘導に抑制的に作用することができる。抑制的標的イオンチャネルは、当該阻害剤とは独立して当該阻害剤による作用、すなわち、脱分極の惹起やそれによる細胞死誘導を抑制することができる。こうしたイオンチャネルを選択することで、当該イオンチャネルに関する効率的な評価系を構築できる。
本スクリーニング材料が備えることができる抑制的標的イオンチャネルは、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルである。抑制的標的イオンチャネルは、本スクリーニング材料が備える、Ｋイオンチャネルに対して阻害的に作用して、細胞死誘導系において脱分極を惹起して細胞死を誘導できる阻害剤（以下、Ｋイオンチャネル阻害剤ともいう。）による脱分極の惹起や細胞死誘導に抑制的に作用することができる。抑制的標的イオンチャネルは、当該阻害剤とは独立して当該阻害剤による作用、すなわち、脱分極の惹起やそれによる細胞死誘導を抑制することができる。こうしたイオンチャネルを選択することで、当該イオンチャネルに関する効率的な評価系を構築できる。
【0061】
（Ｋイオンチャネル阻害剤）
Ｋイオンチャネル阻害剤は、Ｋイオンチャネルの作用を阻害して、静止膜電位を負方向に深くすることを抑制する。こうした阻害剤は、例えば、Ｋイオンチャネルの種類によっても異なる。公知情報から、Ｋイオンチャネル阻害剤を取得できるほか、種々のＫイオンチャネルを含む細胞死誘導系を備える細胞を準備して、この細胞に対して、可能性あるＫイオンチャネル阻害剤を供給して脱分極の惹起や細胞死が誘導されるか否かを評価することで、取得することができる。
Ｋイオンチャネル阻害剤は、Ｋイオンチャネルの作用を阻害して、静止膜電位を負方向に深くすることを抑制する。こうした阻害剤は、例えば、Ｋイオンチャネルの種類によっても異なる。公知情報から、Ｋイオンチャネル阻害剤を取得できるほか、種々のＫイオンチャネルを含む細胞死誘導系を備える細胞を準備して、この細胞に対して、可能性あるＫイオンチャネル阻害剤を供給して脱分極の惹起や細胞死が誘導されるか否かを評価することで、取得することができる。
【0062】
例えば、Ｋｉｒ２．ｘに対する阻害薬としては、Ｂａイオンが公知である。Ｂａイオンに対する、本評価系の他の要素、例えば、ＮａイオンチャネルであるＮａｖ１．５や当該変異体、又は後述する標的イオンチャネルとしてのＫ２Ｐチャネルの感受性が低いことが好ましい。より具体的には、細胞死誘導系のＫイオンチャネル以外の他のイオンチャネルの５０％阻害濃度が、細胞死誘導系のＫイオンチャネルの５０％阻害濃度よりも、好ましくは５倍以上、より好ましくは７倍以上、さらに好ましくは１０倍以上、なお好ましくは１５倍以上、一層好ましくは２０倍以上高いことが好ましい。このような選択阻害性を有することで、高い感度で抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を検出し評価できる。なお、こうした阻害濃度等も、本明細書に開示される細胞死誘導系を備える細胞を用いて測定することができる。
【0063】
抑制的標的イオンチャネルは、細胞死誘導系におけるＫイオンチャネル阻害剤の存在下で、当該阻害剤による細胞死の誘導を抑制することができるイオンチャネルを選択する。選択するための指標は、Ｋイオンチャネル阻害剤による５０％阻害濃度が、例えば、上記Ｋイオンチャネル（以下、第１のＫイオンチャネルともいう。）よりも十分に高いこと、第１のＫイオンチャネルに対する阻害剤の作用を抑制できる、が挙げられる。５０％阻害濃度のほか、第１のＫイオンチャネルに対する阻害剤の作用を抑制して細胞死を抑制できるか否かも既述の細胞死誘導系に種々の可能性ある標的イオンチャネルを発現させることで評価できる。
【0064】
抑制的標的イオンチャネルは、静止膜電位を負方向に深くすること及び／又は脱分極に伴う活動電位の持続時間を短縮することに寄与するイオンチャネルであればよく、各種公知のイオンチャネルから、細胞死誘導系におけるＫイオンチャネルの種類やそれに対して用いる阻害剤に応じて、適宜選択される。
【0065】
抑制的標的イオンチャネルにおけるイオンの種類としては、Ｎａイオン、Ｋイオン、Ｃａ2+イオン（以下、単にＣａイオンという。）、Ｃｌ-イオン（以下、単にＣｌイオンという。）等が挙げられる。イオンチャネルには、その開閉の制御性により、電位依存性、リガンド依存性、機械刺激依存性、温度依存性、漏洩チャネル、リン酸化依存性等が挙げられる。本明細書の開示によれば、スクリーニング材料の生死で、抑制的標的イオンチャネルに対する作用（作動性と阻害性）を検出できるため、広くイオンチャネル全般を標的とすることができる。なお、本明細書において、イオンチャネルとは、電位依存性であるかリガンド依存性であるかなどその開閉の制御形式を問うものではない。また、イオンチャネルとしては、電位発生的なイオン輸送を行う細胞膜および核膜やその他の細胞内小器官膜などを含む生体膜の輸送体、イオン交換体（Ｎａ+－Ｃａ2+交換体など）、イオンポンプ（Ｎａ+－Ｋ+ポンプなど）なども包含している。スクリーニング材料における標的イオンチャネルを選択することで、当該標的イオンチャネルが関連する疾患の予防又は治療のためのスクリーニング材料が提供されることになる。
【0066】
標的イオンチャネルとしては、まず、各種のイオンチャネル一体型薬物受容体が挙げられる。かかる受容体としては、ニコチン様アセチルコリン受容体、イオンチャネル型ＡＴＰ受容体（Ｐ２Ｘ受容体）、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、イオンチャネル型γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡA）受容体、イオンチャネル型グリシン受容体、３型セロトニン受容体などが挙げられる。また、各種のＴＲＰ（Transient Receptor Potential）チャネル（非選択性陽イオンチャネル）が挙げられる。また、ＯｒａｉおよびＳＴＩＭ分子などで構成されるストア作動性Ｃａイオンチャネルが挙げられる。また、標的イオンチャネルとしては、各種の電位依存性イオンチャネルが挙げられる。例えば、全ての電位依存性Ｃａイオンチャネル、全ての電位依存性Ｋイオンチャネル（ｈＥＲＧチャネルを含む）、全ての電位依存性Ｎａイオンチャネル、全ての電位依存性Ｃｌイオンチャネルなどが挙げられる。なお、その他のリガンド依存性のＣａイオンチャネル、Ｎａイオンチャネル、プロトンイオンチャネル、カルシウム依存性（Ｃａイオン活性化）Ｋイオン（ＫCa）チャネルなどのＫイオンチャネル、Ｃｌイオンチャネルなどが挙げられる。さらに、電位、温度、ｐＨ、張力、浸透圧、容積、シグナル分子などの刺激を感受して開閉する全てのイオンチャネルが挙げられる。
【0067】
標的イオンチャネルとしては、なかでも、疾患や病態に関連深いとされている標的イオンチャネルが好ましい。例えば、Ｎａイオンチャネルとしては、Ｎａｖ１．１～１．３及び１．５～１．９が挙げられる。これらは、てんかん、神経因性疼痛、不整脈、疼痛などに関連しており、これらを治療又は予防する薬剤のスクリーニングが可能となる。また、Ｃａイオンチャネルとしては、Ｃａｖ１．１、１．２、１．３、１．４、２．１、２．２、２．３、３．１、３．２及び３．３が挙げられる。これらは、循環器疾患、アルツハイマー病、疼痛、てんかん、高血圧などに関連しており、これらを治療又は予防する薬剤のスクリーニングが可能となる。また、Ｋイオンチャネルとしては、Ｋｖ１．１～１．５、２．１、３．２、４．３、７．１～７．５、１０．１、１１．１（ｈＥＲＧを含む）、１２．１～１２．３、ＳＫが挙げられる。これらは、多発性硬化症、自己免疫疾患、疼痛、心房細動、糖尿病、てんかん、神経痛、アルツハイマー病、尿失禁、不整脈、ガン等に関連しており、これらを予防又は治療する薬剤のスクリーニングが可能となる。また、Ｃｌイオンチャネルとしては、ＣＬＣ－１、５、７、Ｋａ及びＫｂは、筋硬直症、腎疾患、骨代謝疾患、高血圧などに関連しており、これを予防又は治療する薬剤のスクリーニングが可能となる。
【0068】
また、例えば、ｈＥＲＧ Ｋイオンチャネルを標的イオンチャネルとすることが好ましい。このイオンチャネルは、６回膜貫通型構造を持ち４量体を形成する電位依存性Ｋイオンチャネルの１つである。他の電位依存性Ｋイオンチャネルとの違いとして内向き整流性を示すことが挙げられる。これはC型不活性化が非常に速く起こることに起因する。心臓における活動電位の第３相である再分極相で強く働いている。再分極相において膜電位を過分極させる働きを持つため不整脈と、また癌とも関わりが強いイオンチャネルとして知られている。ｈＥＲＧ Ｋイオンチャネルを阻害すると致死性の高いQT延長症候群が誘発されるため、現在、全ての種類の薬剤の候補化合物において、心毒性としてのｈＥＲＧ Ｋイオンチャネル阻害作用による催不整脈作用の検討が求められる。このため、標的イオンチャネルをｈＥＲＧ Ｋイオンチャネルとするスクリーニング材料の有用性は高い。スクリーニング材料にｈＥＲＧ Ｋイオンチャネルを発現させた場合、例えば電気刺激により発生する活動電位が短縮されるため、細胞死が生じにくくなる。ｈＥＲＧＫイオンチャネル阻害作用を有する、もしくは有することを疑われる化合物を加えることにより、その阻害程度に依存してスクリーニング材料の細胞死が生じ易くなるため、ｈＥＲＧＫイオンチャネルに対する阻害効果が定量的に評価できる。ｈＥＲＧとしては、例えば、GenBank accession No.NM#000238が挙げられる。
【0069】
抑制的標的イオンチャネルとしては、既に説明した内向き整流性Ｋイオンチャネル（Ｋｉｒチャネル）や静止膜電位を深くすること（固定すること）に寄与するＫイオンチャネルやＣｌイオンチャネルが好適である。Ｋイオンチャネルは、開口により、細胞を過分極方向に誘導し、閉口により、それを阻害するイオンチャネルである。Ｃｌイオンチャネルは、開口により、細胞を脱分極方向に誘導し、閉口により、それを阻害するイオンチャネルである。抑制的標的イオンチャネルとしてのＫイオンチャネルを、阻害剤の作用対象であるＫイオンチャネルと区別するために第２のイオンチャネルと称する。第２のイオンチャネルとしては、Ｋイオンチャネルでは、例えば、既述のＫ２Ｐチャネル、Ｋｖチャネル、Ｋｉｒチャネル等が挙げられる。また、Ｃｌイオンチャネルとしては、ＣＬＣチャネルなどが挙げられる。
【0070】
なかでも、４回膜貫通型及び２ポア型Ｋイオンチャネル（Ｋ２Ｐチャネル）が好適である。Ｋ２Ｐチャネルは、現在、抗疼痛薬、抗炎症薬、抗ガン薬などの創薬標的として有望視されている。Ｋ２Ｐチャネルとしては、図３に示すように、現在１７種類が知られている。図３において、阻害剤（閉口薬）によって疾患に対する治療又は予防効果を期待できるものは斜字で、作用剤（開口薬）によって疾患に対する治療又は予防効果を期待できるものを通常の字体で示す。
【0071】
Ｋ２Ｐチャネルは、静止膜電位を形成するイオンチャネルであって、Ｂａイオン感受性がＫｉｒ２．ｘと比べて十分に低い（例えば、２０倍以上、３０倍以上等）ことが知られており、Ｂａイオン感受性が低いことにおいても有利である。なかでも、図３に提示する各種Ｋ２Ｐイオンチャネルが好適であり、Ｂａイオン感受性の観点から、さらにＴＲＥＫ－１などのＴＲＥＫ系イオンチャネル、ＴＡＳＫ－１、ＴＡＳＫ－３などのＴＡＳＫ系イオンチャネル、ＴＲＡＡＫイオンチャネルが好適である。
【0072】
また、抑制的標的イオンチャネルとしては、Ｋ２ＰチャネルやＫｉｒチャネルのほか、Ｃａイオン活性化Ｋイオン（ＫCa）チャネル、ＡＴＰ依存性Ｋイオンチャネルなども好適である。これらも静止膜電位を深くする抑制的イオンチャネルであるからである。
【0073】
例えば、Ｃａイオン活性化Ｋイオンチャネルには、大（Ｂｉｇ）コンダクタンスＣａイオン活性化カリウム（ＢＫ）チャネルと、小（Ｓｍａｌｌ）コンダクタンスＣａイオン活性化カリウム（ＳＫ）チャネルと、これらの中間のコンダクタンスを有する中間（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）コンダクタンスＣａイオン活性化カリウム（ＩＫ）チャネル等が挙げられる。ＳＫチャネルとしては、例えば、ＳＫ１、ＳＫ２及びＳＫ３チャネル等が挙げられる。ＳＫ２チャネルはｓｍａｌｌｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅｃａｌｃｉｕｍａｃｔｉｖａｔｅｄｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｔｙｐｅ２（ＳＫ２；ＫＣＮＮ２；ＫCa２．２）であり、IKチャネルは別名SK4（ＫＣＮＮ４；ＫCa３．１）である。ＳＫ１，ＳＫ２，ＳＫ３，IK（ＳＫ４）は遺伝子的に同類に属するカルシウム活性化カリウムチャネルであるが、IK（ＳＫ４）はＳＫ１、ＳＫ２、ＳＫ３と比べ、カリウムイオン透過性（Ｋ+ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ）が若干大きい。
【0074】
例えば、ＳＫ２、ＳＫ４はカルシウム活性化Ｋイオンチャネルの一種であり、Ｋ２Ｐチャネルとは異なるファミリーに属するＫチャネルである。Ｋ２Ｐチャネル同様、スクリーニング材料に抑制的標的イオンチャネルとしてＳＫチャネルを発現させることで、ＳＫチャネル作用薬の評価が可能となる。活性化剤（例えば、既知のＤＣＥＢＩＯやＮＳ３０９）存在下で、細胞内Ｃａ2+濃度を上昇させるためにＣａ2+イオノフォアのｉｏｎｏｍｙｃｉｎを供給することでＳＫチャネルが強く活性化される。このため、Ｂａ2+添加によりスクリーニング材料のKir2.Xが抑制されても脱分極は惹起されず細胞死は誘導されない。これに対して、さらにＳＫチャネルに対する閉口薬（阻害剤）を加えて供給すると、細胞死の抑制が阻害されることにより、スクリーニング材料の細胞死が誘導される。この方法で活性化薬・阻害薬のどちらも評価できる。
【0075】
本スクリーニング材料は、このような抑制的標的イオンチャネルを機能的に備えていればよい。好ましくは、本スクリーニング材料は、抑制的標的イオンチャネルを特異的発現あるいは高発現している。より精度及び感度の良好なスクリーニングのためである。イオンチャネルは特定の細胞に分布していることが多いため、スクリーニング材料の親株として、予め標的とするイオンチャネルを高発現している細胞を選択することもできる。また、スクリーニング材料において標的イオンチャネルを発現させるには、スクリーニング材料が、当該標的イオンチャネルをコードするＤＮＡ（第３のＤＮＡ）を保持し、発現していることが好ましい。第３のＤＮＡは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター（構成的プロモーター）の制御下に連結され、定常的に抑制的標的イオンチャネルが発現されるようになっている。抑制的標的イオンチャネルについても既述のとおり、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、第３のＤＮＡを含む発現ベクター等を構築し、これをスクリーニング材料の宿主に導入し形質転換することで、所望の定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。また、抑制的標的イオンチャネルの発現量も、第１のＤＮＡの場合と同様に調整することができる。
【0076】
本スクリーニング材料は、上記Ｎａイオンチャネル、上記Ｋイオンチャネル及び上記抑制的標的イオンチャネルを備えることで、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤存在下での細胞死誘導系（細胞死の誘導可能状態で待機する細胞の生存状態）を構築することができる。この細胞死誘導系は、それ自体、抑制的標的イオンチャネルに対する作用剤及び阻害剤の評価系を構成する。すなわち、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の存在によって、静止膜電位を負方向に深くすることが阻害されるが、抑制的標的イオンチャネルによって、脱分極の惹起が抑制された状態となっている。こうした状態から、抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物の阻害作用や促進作用を簡易に効率的に評価することができる。
【0077】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法（以下、本スクリーニング方法ともいう。）は、標的イオンチャネルに対する作用剤及び阻害剤をスクリーニングする方法である。本スクリーニング方法は、本スクリーニング材料に対して、Ｋイオンチャネルの作用を阻害するようにＫイオンチャネルの阻害剤を供給する工程と、本スクリーニング材料に対して、抑制的標的イオンチャネルを阻害する又は活性化する可能性のある被験化合物を供給する工程と、被験化合物の供給による本スクリーニング材料の細胞死への影響を評価する工程と、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、Ｋイオンチャネルの阻害剤を供給してＫイオンチャネルを阻害することで、抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を簡易に評価することができる。例えば、電気刺激を用いなくてもスクリーニング材料の脱分極を惹起することができる。この結果、効率的なスクリーニングが可能となっている。
本明細書に開示されるスクリーニング方法（以下、本スクリーニング方法ともいう。）は、標的イオンチャネルに対する作用剤及び阻害剤をスクリーニングする方法である。本スクリーニング方法は、本スクリーニング材料に対して、Ｋイオンチャネルの作用を阻害するようにＫイオンチャネルの阻害剤を供給する工程と、本スクリーニング材料に対して、抑制的標的イオンチャネルを阻害する又は活性化する可能性のある被験化合物を供給する工程と、被験化合物の供給による本スクリーニング材料の細胞死への影響を評価する工程と、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、Ｋイオンチャネルの阻害剤を供給してＫイオンチャネルを阻害することで、抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を簡易に評価することができる。例えば、電気刺激を用いなくてもスクリーニング材料の脱分極を惹起することができる。この結果、効率的なスクリーニングが可能となっている。
【0078】
また、Ｋイオンチャネル阻害剤によってＫイオンチャネルによる作用を抑制する一方、Ｋイオンチャネル阻害剤による細胞死誘導作用を抑制する抑制的標的イオンチャネルによっても細胞死誘導系が制御されているため、Ｋイオンチャネル阻害剤の濃度を調節することで、意図する被験化合物の性質、すなわち、抑制的標的イオンチャネルに対する阻害剤か作用剤かによって、好適なスクリーニング環境を構築できる。例えば、細胞死率が５０％よりも低くなるようにＫイオンチャネル阻害剤を供給することで、抑制的標的イオンチャネルに対する阻害剤に好適なスクリーニング環境を構築できる。また、例えば、細胞死率が５０％を超えるようにＫイオンチャネル阻害剤を供給することで、抑制的標的イオンチャネルに対する作用剤に好適なスクリーニング環境を構築できる。
【0079】
さらに、例えば、細胞死率が５０％近傍となるようにＫイオンチャネル阻害剤を供給することで、抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物が阻害剤であっても作用剤であっても定性的にかつ定量的に評価することができる。
【0080】
例えば、細胞死率が５０％近傍となる濃度のBaイオンをスクリーニング材料に供給した場合、K2Pチャネル開口薬が存在すれば、細胞死率の割合が５０％近傍よりも減少し、すなわち生き残る細胞の割合は５０％近傍よりも増加する。一方、K2Pチャネル閉口薬が存在すれば、細胞死の割合が５０％近傍よりも増加する、すなわち生き残る細胞の割合は５０％近傍よりも減少する。この手法により、スクリーニング材料の細胞死／細胞の生存、すなわち細胞の死亡率（又は生存率）によって、被験化合物の抑制的標的イオンチャネルに対する作用（作用剤か阻害剤か）を検出し評価できる。
【0081】
スクリーニングにあたっては、１又は２以上の被験化合物をスクリーニング材料に供給することができる。単一の被験化合物を用いて当該化合物による作用を検出してもよいし、２以上の被験化合物を用いてこれらの化合物の複合作用あるいは相加作用、相乗作用を検出してもよい。抑制的標的イオンチャネルに対する作用をスクリーニング材料の細胞死（率）によって検出するにあたっては、被験化合物を供給しなかった場合のスクリーニング材料の細胞死（率）を対照群とすることができる。また、抑制的標的イオンチャネルに対する作用が既知である化合物を対照群としてもよい。こうした対照群との比較によって、被験化合物の抑制的標的イオンチャネルに対する作用の有無や、さらにその作用の程度を検出することができる。
【0082】
被験化合物は、特に限定しない。低分子化合物であるほか、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、オリゴ糖、多糖類、脂質等であってもよい。
【0083】
スクリーニング材料には、必要に応じて、被験化合物のほか、各種刺激が付与されてもよい。これらの刺激との組み合わせで作用が促進又は抑制される場合もあるからである。また、刺激の存在下で活性化するあるいは不活性化する標的イオンチャネルへの作用を評価することもできる。こうした刺激としては、例えば、温度変化（高温、低温）、ｐＨ変化、Ｏ2/CO2濃度変化、浸透圧変化、容積変化などが挙げられる。
【0084】
本スクリーニング方法では、標的イオンチャネルの種類に応じて適宜スクリーニング方法の態様が選択される。より具体的には、標的イオンチャネルの制御様式やその機能に応じて適宜選択される。例えば、標的イオンチャネルの制御様式（電位依存性、リガンド依存性、機械刺激依存性、温度依存性、漏洩チャネル、リン酸化依存性等）に応じ、標的イオンチャネルの活性化（又は不活性化）のための刺激の有無や刺激の種類が選択される。また、標的イオンチャネルの機能に応じて、細胞死（率）を指標とした評価態様（標的イオンチャネルに対して作動性か阻害性か等）が選択される。例えば、標的イオンチャネルが電位依存性イオンチャネルの場合には、活性化（所定の膜電位による活性化）により各種の機能が発現されることが知られている。具体的には、活動電位の発生、興奮伝導(以上、Ｎａイオンチャネル)、神経伝達物質の遊離、神経及び心筋での活動電位の発生（以上、Ｃａイオンチャネル）、膜電位の維持、興奮性の制御、活動電位の再分極（以上、Ｋイオンチャネル）、膜電位の安定化、興奮性の制御、イオンの輸送、細胞容積の調節（以上、Ｃｌイオンチャネル）が挙げられる。
【0085】
本スクリーニング方法における抑制的標的イオンチャネルが、漏洩チャネルなど、スクリーニング材料の細胞膜などの脱分極及び／又は活動電位を抑制する（過分極を促進する）イオンチャネルの場合、以下のような評価工程の態様が挙げられる。すなわち、被験化合物及びＫイオンチャネル阻害剤の存在下で、被験化合物の作用をスクリーニング材料の生死を指標として評価することが挙げられる。この場合、被験化合物の非存在下では、標的イオンチャネルは恒常的に作動して、脱分極を抑制しあるいは活動電位を抑制している。このため、Ｋイオンチャネル阻害剤の存在下でも、活動電位が発生しない、あるいは延長しない。この結果、スクリーニング材料は生存する。一方、このスクリーニング材料に、被験化合物とＫイオンチャネル阻害剤とを付与したとき、スクリーニング材料の細胞死が促進される。かかる態様を示したとき、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対して阻害性を有する阻害剤として判定できる。
【0086】
また、標的イオンチャネルが、ｈＥＲＧ Ｋイオンチャネルなど、活性化によりスクリーニング材料の細胞膜などの生体膜の脱分極及び／又は活動電位を抑制する（過分極を促進する）イオンチャネルであるときには、以下のような評価工程におけるスクリーニング態様が挙げられる。すなわち、被験化合物及びＫイオンチャネル阻害剤の存在下で、被験化合物の作用をスクリーニング材料の生死を指標として評価することが挙げられる。より具体的には、被験化合物をスクリーニング材料に付与すると同時又はその後にＫイオンチャネル阻害剤を供給したとき、スクリーニング材料の細胞死が抑制されたのであれば、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対する作動性を有する作用剤であると判定できる。一方、スクリーニング材料の細胞死が促進されたときは、当該被験化合物は、標的イオンチャネルに対して阻害性を有する阻害剤であると判定できる。
【0087】
以上のように、本スクリーニング方法によれば、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤を用いることでスクリーニング材料の生死を指標として簡易に標的イオンチャネルに対する作用剤及び阻害剤をスクリーニングできる。本スクリーニング方法は、迅速性が求められるスクリーニング系のほか、構造設計が困難なイオンチャネルを標的とする薬剤のスクリーニング、特に、ハイスループット性が求められる一次スクリーニングなどにも適している。
【0088】
（評価方法）
本スクリーニング方法は、標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用の評価方法としても実施できる。本評価方法によれば、簡易かつ迅速に、被験化合物の標的イオンチャネルへの作用（作用性や阻害性）を測定できる。したがって、被験化合物に一定以上の作用が求められる場合における迅速かつ簡易な評価方法として有用である。本評価方法には、すでに説明した本スクリーニング方法における各種態様をそのまま適用することができる。
本スクリーニング方法は、標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用の評価方法としても実施できる。本評価方法によれば、簡易かつ迅速に、被験化合物の標的イオンチャネルへの作用（作用性や阻害性）を測定できる。したがって、被験化合物に一定以上の作用が求められる場合における迅速かつ簡易な評価方法として有用である。本評価方法には、すでに説明した本スクリーニング方法における各種態様をそのまま適用することができる。
【0089】
（スクリーニングキット）
本明細書に開示されるキットは、標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングするためのキット（以下、本キットともいう。）である。本キットは、本スクリーニング材料と、Ｋイオンチャネルの作用を抑制する阻害剤と、を備えることができる。本キットによれば、標的イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングを容易にかつ効率的に行うことができる。本キットは、本スクリーニング材料と阻害剤のほか、細胞死の測定用の試薬を備えていてもよい。また、本スクリーニング材料に適した培地を備えていてもよい。また、標的イオンチャネルの発現や活性を制御する化合物や、必要に応じて行う電気刺激用の装置などの機材を備えていてもよい。なお、本キットは、被験化合物の標的イオンチャネルに対する作用を評価するためのキットとしても用いることができる。
本明細書に開示されるキットは、標的イオンチャネルに対する作用剤又は阻害剤をスクリーニングするためのキット（以下、本キットともいう。）である。本キットは、本スクリーニング材料と、Ｋイオンチャネルの作用を抑制する阻害剤と、を備えることができる。本キットによれば、標的イオンチャネルに作用する化合物のスクリーニングを容易にかつ効率的に行うことができる。本キットは、本スクリーニング材料と阻害剤のほか、細胞死の測定用の試薬を備えていてもよい。また、本スクリーニング材料に適した培地を備えていてもよい。また、標的イオンチャネルの発現や活性を制御する化合物や、必要に応じて行う電気刺激用の装置などの機材を備えていてもよい。なお、本キットは、被験化合物の標的イオンチャネルに対する作用を評価するためのキットとしても用いることができる。
【0090】
（Ｋイオンチャネルに対する阻害剤のスクリーニング方法）
本明細書は、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤のスクリーニング方法（以下、阻害剤スクリーニング方法ともいう。）も開示する。阻害剤スクリーニング方法によれば、本スクリーニング材料におけるＫイオンチャネルに対する好適な阻害剤、すなわち、用いるＫイオンチャネルに対して特異性がより高く、感受性のより高い阻害剤をスクリーニングすることができる。
本明細書は、Ｋイオンチャネルに対する阻害剤のスクリーニング方法（以下、阻害剤スクリーニング方法ともいう。）も開示する。阻害剤スクリーニング方法によれば、本スクリーニング材料におけるＫイオンチャネルに対する好適な阻害剤、すなわち、用いるＫイオンチャネルに対して特異性がより高く、感受性のより高い阻害剤をスクリーニングすることができる。
【0091】
阻害剤スクリーニング方法は、例えば、本スクリーニング材料におけるＮａイオンチャネル及びＫイオンチャネルを備える細胞を準備し、当該細胞に対してＫイオンチャネルに対する阻害剤候補である被験化合物を供給する工程と、前記細胞の細胞死又は細胞死と同視できる細胞状態を検出してＫイオンチャネルに対する被験化合物の阻害作用を評価する工程と、を備えることができる。阻害剤スクリーニング方法によれば、用いるＫイオンチャネルを低い濃度でも阻害できる阻害剤を容易にスクリーニングできる。また、阻害剤の好適な阻害濃度や５０％阻害濃度（細胞死率５０％濃度）も取得できる。この阻害剤スクリーニング方法は、本発明者らによる特許文献２に開示されるスクリーニング用細胞をそのまま用いることができる。また、細胞死の検出や細胞死と同視できる細胞状態の検出に関しても、特許文献２における関連する態様をそのまま用いることができる。
【0092】
阻害剤スクリーニング方法は、例えば、本スクリーニング材料におけるＮａイオンチャネル及び被験ＫイオンチャネルとしてのＫイオンチャネルを備える被験細胞を準備し、当該細胞に対してＫイオンチャネルに対する阻害剤を供給する工程と、前記細胞の細胞死又は細胞死と同視できる細胞状態を検出して被験細胞の被験Ｋイオンチャネルに対する阻害剤の阻害作用を評価する工程と、を備えることができる。この阻害剤スクリーニング方法によれば、各種のＫイオンチャネルをそれぞれ備える被験細胞を準備することで、特定の被験Ｋイオンチャネルに対して特異性が高い阻害剤を容易にスクリーニングできる。この阻害剤スクリーニング方法についても、本発明者らによる特許文献２に開示される各種態様を適用することができる。特に、抑制的標的イオンチャネルとしてＫイオンチャネル（第２のＫイオンチャネル）を用いるとき、被験Ｋイオンチャネルとして、抑制的標的イオンチャネル候補を適用することで、第１のＫイオンチャネルに特異的で感度が高く、第２のＫイオンチャネルには感度が低い、阻害剤をスクリーニングすることができる。
【0093】
例えば、Ｋイオンチャネルの阻害剤のスクリーニング方法は、以下の態様で実施することができる。すなわち、培地を測定用バッファに置換し、Ｋｉｒ２．１＿イオンチャネル# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ発現細胞等に被験化合物としてのＫイオンチャネルの阻害剤候補を添加する。その後、細胞を37℃、大気圧、5% CO2条件下で約12時間インキュベートして細胞死を観察することでＫイオンチャネルの阻害剤のスクリーニングが可能である。例えば、ＫイオンチャネルとしてＫｉｒ２．１を採用したとすると、Ｋｉｒ２．１の阻害薬であるBaイオン（BaCl2として添加）の用量作用曲線を図4Ｂに示している。なお、測定用バッファの組成（単位はmM）は、137 NaCl, 5.9 KCl, 2.2 CaCl2, 1.2 MgCl2, 14 glucose, 10 HEPES (pH 7.4 with NaOH)とすることができる。
【0094】
（Ｎａイオンチャネルに対する阻害剤及び活性化剤のスクリーニング方法）
本明細書は、Ｎａイオンチャネルに対する阻害剤及び活性化剤のスクリーニング方法も開示する。脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルの当該作用を阻害する阻害剤や当該作用を活性化する活性化剤は、いずれも、本明細書において開示される標的イオンチャネルに対する作用剤等のスクリーニング系に有用であるからである。
本明細書は、Ｎａイオンチャネルに対する阻害剤及び活性化剤のスクリーニング方法も開示する。脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Ｎａイオンチャネルの当該作用を阻害する阻害剤や当該作用を活性化する活性化剤は、いずれも、本明細書において開示される標的イオンチャネルに対する作用剤等のスクリーニング系に有用であるからである。
【0095】
阻害剤のスクリーニング方法は、例えば、以下の態様で実施できる。すなわち、培地を測定用バッファに置換し、Ｋｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ発現細胞等に200 μM Baイオン（BaCl2として添加）及び、被験化合物としてのＮａイオンチャネル阻害剤候補化合物を添加する。その後、細胞を37℃、大気圧、5% CO2条件下で約12時間インキュベートする。被験化合物が阻害剤候補であるとき、細胞死が抑制されると考えられる。
【0096】
また、活性化剤のスクリーニング方法は、例えば、以下の態様で実施できる。すなわち、培地を測定バッファに置換し、Ｋｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ発現細胞に、被験化合物としての活性化剤候補化合物を添加する。その後、細胞を37℃、大気圧、5% CO2条件下で約12時間インキュベートする。被験化合物が活性化剤であるとき、細胞死が誘発されると考えられる。
【実施例】
【0097】
以下、本明細書の開示を具現化した実施例につき説明するが、本明細書の開示はこれに限定されるものではない。
【実施例1】
【0098】
（Nav1.5チャネル不活性化部位IFMモチーフ変異体の作製）
Nav1.5チャネルの不活性化を制御しているIII-IVリンカー領域中に存在する疎水性アミノ酸配列Ile-Phe-Met(IFMモチーフ)をすべてGlnに変異させることとした。変異後のアミノ酸配列（部分）を以下に示す。
Nav1.5チャネルの不活性化を制御しているIII-IVリンカー領域中に存在する疎水性アミノ酸配列Ile-Phe-Met(IFMモチーフ)をすべてGlnに変異させることとした。変異後のアミノ酸配列（部分）を以下に示す。
【0099】
hNav1.5アミノ酸配列（変異対象となるＩＦＭを含む領域のみ表示）（配列番号１）
1470-IDNFNQQKKKLGGQDIFMTEEQKKYYNAMKK-1500
（下線部のIFMをQQQに変異）
1470-IDNFNQQKKKLGGQDIFMTEEQKKYYNAMKK-1500
（下線部のIFMをQQQに変異）
【0100】
ヒト由来のNav1.5 (GenBank Accession Number: NM#198056.)をpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングしたpcDNA3.1/Nav1.5を鋳型として、以下に示す特異的なPCRプライマー及びQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、不活性化変異体Nav1.5 IFM/QQQを作製した。得られたクローンのDNA配列はBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)、蛍光キャピラリーシークエンサー(ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer、Applied Biosystems)を用いて確認し、プラスミドDNAをPureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit(Invitrogen)を用いて大量精製した。
【0101】
プライマー
5'-GTTAGGGGGCCAGGACCAACAACAGACAGAGGAGCAGAAG-3’（配列番号２）
5’-CTTCTGCTCCTCTGTCTGTTGTTGGTCCTGGCCCCCTAAC-3’（配列番号３）
5'-GTTAGGGGGCCAGGACCAACAACAGACAGAGGAGCAGAAG-3’（配列番号２）
5’-CTTCTGCTCCTCTGTCTGTTGTTGGTCCTGGCCCCCTAAC-3’（配列番号３）
【実施例2】
【0102】
（細胞培養及び遺伝子導入）
ヒト胎児腎由来細胞(HEK293細胞)はヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB)から購入した。10% FBS(Fatal Bovine Serum; Gibco)を添加し、100 U/ml ペニシリン(和光純薬)、100μｇ/ml ストレプトマイシン(明治製菓)を加えたD-MEM（Dulbeco’s Modified Eagle Medium）培地(和光純薬)中で37℃、5％ CO2条件下で培養した。ヒト由来のＫｉｒ2.1(NM#000891)をpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングしたpcDNA3.1/Ｋｉｒ2.1をLipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて遺伝子導入し、上記のD-MEM培地に0.2 mg/ml Zeocin(Invitrogen)を加えた培地で培養し、Zeocin耐性細胞をクローニングし、Ｋｉｒ2.1定常発現細胞(HEK#Ｋｉｒ)を作製した。また同様の方法でＫｉｒ2.1定常発現細胞に不活性化変異体Nav1.5 IFM/QQQを遺伝子導入した(HEK#Ｋｉｒ#mutated Nav)。
ヒト胎児腎由来細胞(HEK293細胞)はヒューマンサイエンス研究資源バンク(HSRRB)から購入した。10% FBS(Fatal Bovine Serum; Gibco)を添加し、100 U/ml ペニシリン(和光純薬)、100μｇ/ml ストレプトマイシン(明治製菓)を加えたD-MEM（Dulbeco’s Modified Eagle Medium）培地(和光純薬)中で37℃、5％ CO2条件下で培養した。ヒト由来のＫｉｒ2.1(NM#000891)をpcDNA3.1(+)(Invitrogen)にサブクローニングしたpcDNA3.1/Ｋｉｒ2.1をLipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて遺伝子導入し、上記のD-MEM培地に0.2 mg/ml Zeocin(Invitrogen)を加えた培地で培養し、Zeocin耐性細胞をクローニングし、Ｋｉｒ2.1定常発現細胞(HEK#Ｋｉｒ)を作製した。また同様の方法でＫｉｒ2.1定常発現細胞に不活性化変異体Nav1.5 IFM/QQQを遺伝子導入した(HEK#Ｋｉｒ#mutated Nav)。
【0103】
さらに、上記と同様にして、ヒト由来Ｋ２Ｐチャネルの一種であるｈＴＲＥＫ－１（GenBank Accession Number: NM#001017424）を、pcDNA3.1(+)にサブクローニングし、先に作製したＫｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞に遺伝子導入してｈＴＲＥＫ－１#Ｋｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞（以下、ＴＲＥＫ－１試験細胞という。）を作製した。
【0104】
ＴＲＥＫ－１試験細胞において、培地を測定用バッファ（137ｍＭ NaCl, 5.9ｍＭ KCl, 2.2ｍＭ CaCl2, 1.2ｍＭ MgCl2, 14ｍＭ glucose, 10ｍＭ HEPES (pH 7.4 with NaOH)、以下、同様。）に置換して、Ｋｉｒ２．１の阻害剤であるＢａイオンを200 μMとなるようにBaCl2を添加した。その後、細胞を37℃、大気圧、5% CO2条件下で約12時間インキュベートして細胞死について観察した。なお、細胞死は、ＴＲＥＫ－１阻害剤である、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰを供給して観察した。なお、細胞死の測定は本発明者らによる論文（Yamazaki, D., et. al., Am J Physiol Cell Physiol 300, C75-86, 2011）を参考にMTT法を用いて行った。結果を図６に示す。
【0105】
図６Ａに示すように、ＴＲＥＫ－１試験細胞に対してＢａイオンを全量で２００μＭを供給しても細胞死は生じないが、Ｂａイオンの存在下、ＴＲＥＫ－１の阻害剤を供給したところ、細胞死が生じた。また、図６Ｂに示すように、培養温度を２７℃に下げることで、細胞死が誘発された。これは、ＴＲＥＫ－１の温度感受性によるものと考えられた（Maingret et al., EMBO J., 19, 2483-2491, 2000）。すなわち、ＴＲＥＫ－１は室温（27℃）では活性が低いため、細胞死の抑制効果も弱くなる一方、高温（37℃）ではＴＲＥＫ－１が活性化するため、細胞死抑制効果が室温の場合と比較して有意に高くなったためと考えられた。
【実施例3】
【0106】
ヒト由来Ｋ２Ｐチャネルの一種であるhTASK-1（野生型は細胞膜に移行しにくいため、電流が小さく、測定が難しいという問題があったため、Δi20変異体を用いた。本変異体は膜へ移行しやすいことが報告されている。Renigunta et. al., Traffic 7: 168-181, 2006）及びｈＴＡＳＫ－３（GenBank Accession Number: NM#001282534）を、ウイルスベクターであるバキュロウイルスベクターにサブクローニングし、実施例２で作製したＫｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞に遺伝子導入してｈＴＡＳＫ－１及びｈＴＡＳＫ－３を一過的に発現するＴＡＳＫ－１#Ｋｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞及びｈＴＡＳＫ－３#Ｋｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞（以下、ＴＡＳＫ－１試験細胞及びＴＡＳＫ－３試験細胞という。）を作製した。なお、バキュロウイルスベクター作製用培地としては、Sf-900 III SFM (Thermo Fisher Scientific)を用い、試験細胞用培地としては、10% FBS(Fatal Bovine Serum)添加D-MEM(Dulbeco’s Modified Eagle Medium)培地を用いた。
【0107】
ＴＡＳＫ－１試験細胞及びＴＡＳＫ－３試験細胞につき、培地を測定用バッファに置換して、200 μM BaイオンとなるようにBaCl2を添加しても細胞死は生じなかった。一方、図７Ａに示すように、同量のＢａイオン存在下に、ＴＡＳＫ１－及びＴＡＳＫ－３選択的阻害剤であるＴＫ－ＰＨＰＰを加えたところ、用量依存的に細胞死の誘発が観測された。ＴＫ－ＴＨＰＰのＩＣ50値は、それぞれ２．３６ｎＭ及び３４．７ｎＭであった。ＴＡＳＫ－３については、文献値３５ｎＭ（Coburn et al., Chem Med Chem., 7(1), 123-33, 2012）と同等であった。
【0108】
また、図７Ｂに示すように、ＴＡＳＫ－１の選択的阻害剤であるＭＬ３６５（Flaherty et al., Bioorg Med Chem Lett., 15; 24(16): 3968-3973, 2014）を使用した場合にも、濃度依存的な細胞死が観察された。そして、ＴＡＳＫ－１試験細胞については、１１．５ｎＭ、ＴＡＳＫ－３試験細胞については、１００ｎＭを超えた点から急激に細胞死が誘発された。報告されているＴＡＳＫ－１及びTASK－3 に対するML365 のIC50値はそれぞれ、１２ｎＭ及び４８０ｎＭである（Zou et al., Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program, 2010）。したがって、ＴＡＳＫ－１試験細胞及びＴＡＳＫ－３試験細胞を用いることで、パッチクランプ法と同等の結果が得られることが明らかとなった。
【実施例4】
【0109】
実施例３に準じて、ヒト由来Ｋ２Ｐチャネルの一種であるｈＴＡＳＫ－３をサブクローニングしたウイルスベクターであるバキュロウイルスの導入量を３倍（培地の２．５％、同５％、同１０％）までの範囲において、実施例２で作製したＫｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞に遺伝子導入して３種類のＴＡＳＫ－３試験細胞を作製し、ウイルス感染２４時間後に、Ｂａイオンを供給して細胞死試験に供した。
【0110】
これら３種のＴＡＳＫ－３試験細胞に、実施例３に準じてＢａイオンを供給して、細胞死を観察した。結果を図８に示す。
【0111】
図８に示すように、TASK-3 の細胞死抑制効果は、その導入量と相関性が認められた。この事実は探索標的イオンチャネルの発現レベルを調節すれば、過剰なBaイオン投与による細胞死の割合を変えられることを示している。発現量をある一定以上高くすればＢａイオンにより完全にＫｉｒ2.x を抑制しても細胞死は100%に達しない。この場合は標的イオンチャネルの阻害薬スクリーニングに適する。以上のことから、適度な定常発現状態の試験細胞と適切なＢａイオン濃度を選択することにより、Ｂａイオン投与によりほぼ５０％の細胞死が生じる条件を設定することができ、阻害剤も作用剤も最も感度の高い条件下でスクリーニングすることが可能となることがわかった。
【実施例5】
【0112】
ヒト由来Ｃａイオン活性化イオンチャネルの一種であるｈＳＫ２及びｈＳＫ４をウイルスベクターであるバキュロウイルスベクターにそれぞれサブクローニングし、実施例２で作製したＫｉｒ２．１# ｍｕｔａｔｅｄ Ｎａｖ細胞に遺伝子導入してｈＳＫ２及びｈＳＫ４を一過的に発現するＫｉｒ２．１＋ＩＦＭ／ＱＱＱ＋ＳＫ２細胞（以下、ＳＫ２試験細胞という。）及びＫｉｒ２．１＋ＩＦＭ／ＱＱＱ＋ＳＫ４細胞（以下、ＳＫ４試験細胞という。）を作製した。なお、バキュロウイルスベクター作製用培地としては、Sf-900 III SFM (Thermo Fisher Scientific)を用い、試験細胞用培地としては、10% FBS(Fatal Bovine Serum)添加D-MEM(Dulbeco’s Modified Eagle Medium)培地を用いた。
【0113】
ＳＫ２試験細胞及びＳＫ４試験細胞につき、培地を測定用バッファに置換して、Ｃａイオン（１００ｎＭ）、ＳＫ／ＩＫ活性化剤、ＳＫ阻害剤、ＩＫ選択的阻害剤を適宜加えて培養して、細胞死を判定した。結果を、図９に示す。
【0114】
図９Ａに示すように、ＳＫ２試験細胞にＣａイオン１００ｎＭ存在下で、ＳＫ／ＩＫ活性化剤であるＮＳ３０９（3-オキシム-6,7-ジクロロ-1H-インドール-2,3-ジオン）を併存させると、ＳＫ２試験細胞の細胞死が抑制された。すなわち、ＮＳ３０９のようなＳＫ活性化剤の作用を確認することができた。また、さらに、ＳＫ／ＩＫ活性化剤であるＮＳ３０９及びＳＫ阻害剤であるＵＣＬ１６８４を併存させると、ＮＳ３０９による細胞死の抑制が解消された。以上のことから、この評価系によると、ＳＫイオンチャネルも標的イオンチャネルとすることができるとともに、当該イオンチャネルに対する活性化剤及び阻害剤の作用を評価できることがわかった。
【0115】
また、図９Ｂに示すように、ＳＫ４試験細胞にＣａイオン１００ｎＭ存在下で、ＳＫ／ＩＫ活性化剤であるＤＣＥＢＩＯ（５，６－ジクロロ－１－エチル－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－ オン）を併存させると、ＳＫ４試験細胞の細胞死が抑制された。すなわち、ＤＣＥＢＩＯのようなＳＫ活性化剤の作用を確認することができた。また、さらに、ＳＫ／ＩＫ活性化剤であるＤＣＥＢＩＯ及びＩＫ選択的阻害剤であるＴＲＡＭ３４を併存させると、ＤＣＥＢＩＯによる細胞死の抑制が解消された。以上のことから、この評価系によると、ＳＫ４（ＩＫ）イオンチャネルも標的イオンチャネルとすることができるとともに、当該イオンチャネルに対する活性化剤及び阻害剤の作用を評価できることがわかった。
【0116】
このように、本スクリーニング材料はＫ２Ｐチャネル以外のイオンチャネル、例えばSKチャネルやナトリウム活性化カリウムチャネルのSlackチャネル（KCNT1）やSlickチャネル（KCNT2）にも適しており、さらには他の多くのカリウムチャネルやクロライドチャネルに対する作用薬の探索にも用いることができることがわかった。
【0117】
以下、本明細書に開示される技術に関連する文献を示す。以下の文献は、参照により本明細書の一部に組み込まれるものとする。
1. Alagem N, Dvir M, and Reuveny E. Mechanism of Ba2+ block of a mouse inwardly rectifying K+ channel: differential contribution by two discrete residues. J Physiol 534: 381-393, 2001.
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配列番号２～３：プライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
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【図8】
【図9】
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