▶ ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-27
(45)【発行日】2022-07-05
(54)【発明の名称】組織学的試料のための試薬のインクジェット沈着
(51)【国際特許分類】
G01N 1/30 20060101AFI20220628BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20220628BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220628BHJP
【ＦＩ】
G01N1/30
G01N33/48 P
G01N33/53 Y
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2017554833
(86)(22)【出願日】2016-04-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-07-05
(86)【国際出願番号】 EP2016058801
(87)【国際公開番号】W WO2016170008
(87)【国際公開日】2016-10-27
【審査請求日】2019-04-05
【審判番号】
【審判請求日】2021-03-25
(31)【優先権主張番号】62/150,122
(32)【優先日】2015-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507179346
【氏名又は名称】ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】グロール，ヘニング
(72)【発明者】
【氏名】ポラスク，メリンダ・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】コジコウスキ，レイモンド・ティー，ザ・サード
(72)【発明者】
【氏名】クレイン，エリック・エル
(72)【発明者】
【氏名】パルシュツィク，チャナ・アール
(72)【発明者】
【氏名】ハザー，メリス
(72)【発明者】
【氏名】タークル，ラヴィラジ
【合議体】
【審判長】石井 哲
【審判官】井上 香緒梨
【審判官】伊藤 幸仙
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００４／１１１６１０（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２００８－９６２４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００３－１３０８６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９８／５８２４０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００３－４６０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第０３／０７２２５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１２２１９７（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
G01N1/30
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的試料（９０８）の上に試薬を分配する方法であって、保護液体層を、支持媒体上に沈着されている生物学的試料（９０８）上に重層すること、
一次染色試薬組成物および抗体試薬組成物からなる群より選択される試薬組成物を含む試薬小滴であって、該試薬小滴が該保護液体層に浸透し、そして該生物学的試料（９０８）と接触するように、１ｐＬ～５０ｐＬの間の試薬小滴を分配すること、
を含んでなり、
該生物学的試料の上に分配される該試薬の量は、特定の生物学的試料および/またはアッセイに基づいて、分配機構の多数回のパスによる試薬の適用、試薬分配のインチあたりのドット（ｄｐｉ）の変化、小滴体積の変化、および／または試薬濃度の変化によって、変化させる、そして、
該試薬組成物は塩化アルミニウムを含む、
前記方法。
【請求項2】
前記試薬小滴を、５ｍ／ｓ～１５ｍ／ｓの間の速度で分配する、請求項１の方法。
【請求項3】
前記保護液体層が、水性パドル、非混和性油からなる群より選ばれる、請求項１または２の方法。
【請求項4】
前記保護液体層が非混和性油であり、前記試薬小滴の密度が、該非混和性油の密度より大きい、
請求項１～３のいずれか１項の方法。
【請求項5】
前記試薬小滴が試料にヒットする際の前記試薬小滴の動力学エネルギーが９．５２ｘ１０－１０ジュールより大きい、請求項１～４のいずれか１項の方法。
【請求項6】
前記一次染色試薬組成物が、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、１ｃｐ～４０ｃｐの範囲の粘性および２５ダイン／ｃｍ～４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する、請求項１～５のいずれか１項の方法。
【請求項7】
前記色素が、ヘマトキシリン、エオジン、アクリジンオレンジ、ビスマルクブラウン、カーミン、クーマシーブルー、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ＤＡＰＩ（「２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキサミジン」）、エチジウムブロミド、酸性フクシン、ヘキスト染色剤、ヨウ素、マラカイトグリーン、メチルグリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド、ナイルブルー、ナイルレッド、四酸化オスミウム、ローダミン、およびサフラニンからなる群より選択される、請求項６の方法。
【請求項8】
前記一次染色試薬組成物の粘性が、６ｃｐ～１０ｃｐの範囲である、請求項６または７の方法。
【請求項9】
前記一次染色試薬組成物が、１ｘ１０５ｓ－１～１ｘ１０７ｓ－１の間の剪断速度で分配される、請求項６～８のいずれか１項の方法。
【請求項10】
前記抗体試薬組成物が、一次抗体、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、４ｃｐ～７ｃｐの範囲の粘性、および２０ダイン／ｃｍ～４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する、請求項１～５のいずれか１項の方法。
【請求項11】
前記抗体試薬組成物が、５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配される、請求項１０の方法。
【請求項12】
自動化スライド染色装置であって、１ｐＬ～５０ｐＬの範囲の体積を有する試薬小滴を分配するためのディスペンサー、
顕微鏡スライドを保持するように適応したスライド支持体、
色素、界面活性剤、塩化アルミニウム、および粘性修飾剤を含み、１ｃｐ～４０ｃｐの範囲の粘性および２５ダイン／ｃｍ～４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する一次染色組成物、および
抗体、抗体コンジュゲート、マルチマー、および酵素からなる群より選択される巨大分子、界面活性剤、塩化アルミニウム、ならびに粘性修飾剤を含み、４ｃｐ～７ｃｐの範囲の粘性、および２０ダイン／ｃｍ～４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する巨大分子染色組成物、
からなる群より選ばれる組成物であって、インクジェットプリンティングヘッド（９０５）に供給される前記組成物を収容する少なくとも１つの試薬リザーバー、
プロセッサ（９０２）およびメモリを含有する制御モジュールであって、該スライド支持体によって保持された顕微鏡スライド上に少なくとも１つの試薬リザーバー中の組成物を分配するよう分配装置に命令するようにプログラミングされている制御モジュール、
を備え、
該ディスペンサーは、該生物学的試料の上に分配される該試薬の量を、特定の生物学的試料および/またはアッセイに基づいて、分配機構の多数回のパスによる試薬の適用、試薬分配のインチあたりのドット（ｄｐｉ）の変化、小滴体積の変化、および／または試薬濃度の変化によって、変化させるように設定され、そして
該制御モジュールが、請求項１～１１のいずれか１項の方法を実行するようプログラミングされている、
前記自動化スライド染色装置。
【請求項13】
組織化学的または細胞化学的分析のために、細胞または組織試料を染色するための、請求項１２記載の自動化スライド染色装置の使用。
【請求項14】
インクジェットプリンティングヘッド（９０５）に、請求項１～１１のいずれか１項の方法を実行させるプログラムを記憶している、永続性（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｉｔｏｒｙ）コンピュータ読み取り可能媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対するクロスリファレンス
[0001]本出願は、２０１５年４月２０日出願の米国仮特許出願第６２／１５０，１２２号の出願日の利益を主張し、その開示は本明細書に援用される。
[0001]本出願は、２０１５年４月２０日出願の米国仮特許出願第６２／１５０，１２２号の出願日の利益を主張し、その開示は本明細書に援用される。
【0002】
産業上の利用可能性の言及
[0002]本開示は、診断の分野において産業上の利用可能性を有する。
[0002]本開示は、診断の分野において産業上の利用可能性を有する。
【背景技術】
【0003】
[0003]分子病理学は、疾患を引き起こすかまたは疾患に関連する、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質の分子レベルでの検査である。この検査から、患者診断、予後、および治療オプションに関する重要な情報を解明することが可能である。疾患、例えば癌は、多くの異なる方法によって診断可能である。１つの方法は、特定の癌タイプに相関するか、または相関すると考えられているバイオマーカー、例えば癌バイオマーカーの、組織または細胞中の存在を同定することである。
【0004】
[0004]ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）は、少なくとも１世紀に渡って使用されてきた主な染色剤であり、そして現代の癌診断の基礎を形成する、多様な組織タイプおよび形態学的変化を認識するために必須である。該染色剤は、多様な固定法でよく働き、そして広い範囲の細胞質、核、および細胞外マトリックス特徴を提示する。ヘマトキシリンは、深い青紫色を呈し、そして複雑な反応によって核酸を染色する。エオジンはピンクであり、そして非特異的にタンパク質を染色する。典型的な組織において、核は青に染色され、一方、細胞質および細胞外マトリックスは、多様な度合いのピンクの染色を有する。よく固定された細胞は、かなりの核内詳細を示す。核は、ヘテロクロマチン凝集の多様な細胞タイプおよび癌タイプ特異的パターン（ヘマトキシリン染色）を示し、これは診断的に非常に重要である。核小体はエオジンで染色される。豊富なポリリボソームが存在する場合、細胞質は特徴的な青い外観を有するであろう。ゴルジ帯は、核に近い領域における染色の欠如によって、暫定的に同定可能である。したがって、該染色剤は、特定の機能的暗示とともに、豊富な構造情報を開示する。
【0005】
[0005]組織化学および細胞化学は、顕微鏡上で視覚化可能な方式で、バイオマーカーに特異的に結合する分子で試料を標識することによって、インタクトな細胞の関連で、バイオマーカーを同定するためにしばしば用いられる技術である。免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、バイオマーカーを標識するために抗体を用いるタイプの組織化学および細胞化学である。組織環境または細胞環境の関連で、バイオマーカーを同定することによって、バイオマーカー、および細胞または組織試料の他の形態学的または分子特徴の間の空間的関係が解明可能であり、これは、他の分子技術または細胞技術からは明らかではない情報を明らかにしうる。
【0006】
[0006]これらの技術は、典型的には、顕微鏡スライド、例えばガラス、プラスチック、または水晶顕微鏡スライド上にマウントされた組織切片（例えば腫瘍生検）または細胞試料（例えば血液または骨髄）に対して行われる、一連の処理工程を必要とする。しばしば用いられる工程には、マウントし、そして染色するために組織試料を調製する前処理（例えば脱パラフィン化、再水和、および／または抗原回復）、バイオマーカー特異的抗体またはプローブでの組織試料標識、酵素標識二次処理およびインキュベーション、バイオマーカーに関して標識された試料のフルオロフォアまたは発色団強調領域を生じるための酵素との基質反応、対比染色等が含まれる。これらの工程の大部分は、先の工程由来の未反応残渣試薬を除去する、多数のリンス工程によって分離される。インキュベーションはしばしば、上昇した温度、通常およそ３７℃で行われ、そして組織は脱水から連続して保護されなければならない。
【0007】
[0007]ＩＨＣに必要な多数の反復処理工程を考慮して、自動化システムが導入されて、人の労働およびコスト、ならびにそれらに関連するエラー率が減少し、そして均一性が導入されてきた。成功裡に使用されてきた自動化システムの例には、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（アリゾナ州ツーソン）から入手可能な、ＥＳ（登録商標）、ＮｅｘＥＳ（登録商標）、ＤＩＳＣＯＶＥＲＹＴＭ、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫＴＭおよびＧｅｎ ＩＩ（登録商標）染色システムが含まれる。これらのシステムは、放射状に配置されたスライドを支持する回転カルーセルを含むマイクロプロセッサ制御システムを使用する。ステッピングモーターはカルーセルを回転させて、各スライドを、スライド上に配置された一連の試薬ディスペンサーの１つの下に配置する。スライドおよび試薬ディスペンサー上のバーコードが、コンピュータの適切なプログラミングによって、多様な組織試料各々に関して、異なる試薬処理が実行可能であるように、ディスペンサーおよびスライドのコンピュータ制御配置を可能にする。
【0008】
[0008]プロセシング中に試薬および他の液体を導入するため、試薬送達システムおよび送達法をしばしば用いる。典型的には、試薬送達システムは、試薬リザーバーまたはバイアル内に、針またはプラスチックチューブを挿入し、モーター駆動シリンジで、チューブ内に試薬を吸い上げ、針をスライド（または他の容器）に移動させ、そしてシリンジを逆転させて、試薬を分配することによって、試薬を自動的にピペッティングする。前述のようなプロセスにおいて、多くの試薬を、正確に測定された少量（マイクロリットル規模程度の少なさ）で、スライド上に沈着させなければならない。
【0009】
[0009]Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＥＳ（登録商標）、ＮｅｘＥＳ（登録商標）、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（登録商標）およびＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）システムなどの装置は、基本的に、制御された環境条件下で、１ｘ３インチのガラス顕微鏡スライド上にマウントされた組織切片に、試薬を連続して適用するよう設計されている。装置は、いくつかの基本的な機能、例えば試薬適用、洗浄（以前に適用された試薬を除去するため）、ジェット排出（洗浄に続いて、スライド上の残渣緩衝剤体積を減少させるための技術）、Ｌｉｑｕｉｄ ＣｏｖｅｒｓｌｉｐＴＭ適用（試薬を封じ込め、そして蒸発を防止するために用いる軽油適用）、および他の装置機能を行わなければならない。
【0010】
[0010]スライド上の組織を染色するプロセスは、上述の基本的な装置機能の連続的な反復からなる。本質的に、試薬を組織に適用し、次いで、特定の温度で、特定された時間に渡ってインキュベーションする。インキュベーション時間が完了したら、すべての試薬が適用され、そして染色プロセスが完了するまで、試薬をスライドから洗い流し、そして次の試薬を適用し、インキュベーションし、そして洗い流す等を行う。
【発明の概要】
【0011】
[0011]本開示の１つの側面において、色素（例えばヘマトキシリンまたはエオジン）、界面活性剤、および粘性修飾剤を含む、一次染色組成物を開示する。いくつかの態様において、一次染色組成物は、本明細書にさらに記載するように、小滴オンデマンド試薬分配システムから分配するために適している。いくつかの態様において、小滴オンデマンド試薬分配システムは、インクジェット分配システムである。いくつかの態様において、一次染色組成物は、塩化アルミニウムをさらに含む。
【0012】
[0012]本開示の別の側面において、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含む、一次染色組成物を開示し、ここで、組成物は、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲の粘性、および約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、組成物は、約６ｃｐ～約１０ｃｐの範囲の粘性を有する。いくつかの態様において、色素は、ヘマトキシリン、エオジン、アクリジンオレンジ、ビスマルクブラウン、カーミン、クーマシーブルー、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ＤＡＰＩ（「２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキサミジン」）、エチジウムブロミド、酸性フクシン、ヘキスト染色剤、ヨウ素、マラカイトグリーン、メチルグリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド、ナイルブルー、ナイルレッド、四酸化オスミウム、ローダミン、およびサフラニンからなる群より選択される。いくつかの態様において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。いくつかの態様において、粘性修飾剤はグリコールである。いくつかの態様において、粘性修飾剤はプロピレングリコールである。いくつかの態様において、界面活性剤は、一次染色組成物の総重量の約０．０１％～約０．５％の間の範囲の量で存在する。いくつかの態様において、粘性修飾剤は、一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の間の範囲の量で存在する。いくつかの態様において、一次染色組成物は、緩衝剤をさらに含む。いくつかの態様において、一次染色組成物は、緩衝剤をさらに含む。いくつかの態様において、一次染色組成物は、約２～約５の範囲のｐＨを有する。いくつかの態様において、一次染色組成物は、約２．２のｐＨを有する。いくつかの態様において、一次染色組成物は、塩化アルミニウムをさらに含む。
【0013】
[0013]いくつかの態様において、色素はヘマトキシリンであり、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、粘性修飾剤はプロピレングリコールであり；そしてプロピレングリコールの量は一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲である。いくつかの態様において、色素はエオジンであり、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、粘性修飾剤はプロピレングリコールであり；そしてプロピレングリコールの量は一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲である。
【0014】
[0014]本開示の別の側面において、第一の一次染色組成物および第二の一次染色組成物を含む、キットを開示し、ここで第一の一次染色組成物は、ヘマトキシリン、非イオン性界面活性剤、およびプロピレングリコールを含み、プロピレングリコールは、第一の一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲の量で存在し；そして第二の一次染色組成物は、エオジン、非イオン性界面活性剤、およびプロピレングリコールを含み、プロピレングリコールは、第二の一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲の量で存在する。
【0015】
[0015]本開示の別の側面において、抗体、抗体コンジュゲート、酵素、およびマルチマーからなる群より選択される生物学的分子；界面活性剤；ならびに粘性修飾剤を含む、巨大分子試薬組成物を開示し；ここで、抗体組成物は、本明細書にさらに記載するような小滴オンデマンド試薬分配システムから分配するために適している。いくつかの態様において、小滴オンデマンド試薬分配システムは、インクジェット分配システムである。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、塩化アルミニウムをさらに含む。
【0016】
[0016]本開示の別の側面において、抗体または抗体コンジュゲート、界面活性剤、および粘性修飾剤を含む抗体染色組成物を開示し、ここで、抗体組成物は、約４ｃｐ～約１１ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、抗体染色組成物は、少なくとも１つのキャリアータンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのキャリアータンパク質は、ウシ血清アルブミンおよび正常ヤギ血清からなる群より選択される。いくつかの態様において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。いくつかの態様において、界面活性剤は、抗体染色組成物の総重量の約０．０１％～約０．５％の範囲の量で存在する。いくつかの態様において、粘性修飾剤はグリセロールである。いくつかの態様において、粘性修飾剤は、抗体染色組成物の総重量の約２％～約５０％の範囲の量で存在する。いくつかの態様において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、粘性修飾剤はグリセロールまたは高分子量デキストランであり、そして組成物は、ウシ血清アルブミンをさらに含み；そしてグリセロールまたは高分子量デキストランの量は、抗体染色組成物の総重量の約２％～約５０％の範囲である。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、塩化アルミニウムをさらに含む。
【0017】
[0017]本開示の別の側面において、抗体染色組成物を含む第一の組成物および少なくとも１つの一次染色組成物を含む第二の構成要素を含む、キットを開示する。いくつかの態様において、一次染色組成物は、ヘマトキシリンまたはエオジンの一方、非イオン性界面活性剤、およびプロピレングリコールを含み、プロピレングリコールは、一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲の量で存在する。いくつかの態様において、抗体組成物は、一次抗体、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、ここで抗体組成物は、約４ｃｐ～約１１ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。
【0018】
[0018]本開示の別の側面において、組織試料を染色する方法であって、（ａ）小滴オンデマンドプリントヘッド（例えばインクジェットプリントヘッドまたは他の小滴分配手段）を、染色試薬を受け取る組織試料の部分の近傍（例えば、ｘ、ｙ、ｚ空間において近く、その上、またはその周囲）に配置し、プリントヘッドは染色試薬供給源と液体連絡があり；（ｂ）あらかじめ決定した量の染色試薬を、インクジェットプリントヘッドから、そして組織試料の部分上に、あらかじめ決定した速度で分配する工程を含む、前記方法を開示する。いくつかの態様において、方法は、工程（ｂ）を１回またはそれより多く反復する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、工程（ｂ）を少なくとも３回反復する工程を含む。いくつかの態様において、方法を組織試料の異なる部分に関して反復する。
【0019】
[0019]いくつかの態様において、方法は、分配された染色試薬の染色強度を測定する工程をさらに含む。いくつかの態様において、測定した染色強度が、あらかじめ決定した閾値を満たさない場合、工程（ｂ）を反復する。いくつかの態様において、あらかじめ決定した閾値は、約３０ＡＵ（任意的単位）～約１６０ＡＵの間の吸光度値である。いくつかの態様において、あらかじめ決定した閾値は、約２５ＡＵ～約６０ＡＵの間の吸光度値である。いくつかの態様において、あらかじめ決定した閾値は、約３０ＡＵ～約７０ＡＵの間の吸光度値である。いくつかの態様において、あらかじめ決定した閾値は、約４４ＡＵ～約１４５ＡＵの間の吸光度値である。
【0020】
[0020]いくつかの態様において、染色試薬の累積量が、約１０μＬ／ｉｎ２～約３０μＬ／ｉｎ２の範囲になるまで、工程（ｂ）を反復する。いくつかの態様において、染色試薬の累積量が、約１２μＬ／ｉｎ２～約２８μＬ／ｉｎ２の範囲になるまで、工程（ｂ）を反復する。いくつかの態様において、染色試薬の累積量が、約１４μＬ／ｉｎ２～約２８μＬ／ｉｎ２の範囲になるまで、工程（ｂ）を反復する。
【0021】
[0021]いくつかの態様において、分配法は、組織試料の部分と連絡がある染色剤枯渇層に補充する。いくつかの態様において、あらかじめ決定した速度は、染色試薬が、組織試料と連絡があるパドルに浸透し、そして染色剤枯渇層に補充することを可能にするものである。いくつかの態様において、あらかじめ決定した速度は、組織試料の界面層での混合を可能にするものである。いくつかの態様において、あらかじめ決定した速度は、約５ｍ／ｓ～約１５ｍ／ｓの範囲である。
【0022】
[0022]いくつかの態様において、２つの染色試薬を組織試料に連続して適用する。いくつかの態様において、染色試薬は一次染色剤である。いくつかの態様において、染色試薬は、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含む組成物であり、該組成物は、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲の粘性および約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、組成物は、約１ｘ１０５ｓ－１～約１ｘ１０７ｓ－１の間の剪断速度で分配される。いくつかの態様において、ヘマトキシリンまたはエオジンの一方を、まず組織試料の少なくとも部分に適用し、そして続いて、ヘマトキシリンまたはエオジンのもう一方を、組織試料の少なくとも同じ部分に二番目に適用する。
【0023】
[0023]いくつかの態様において、染色試薬は巨大分子染色組成物である。いくつかの態様において、巨大分子染色組成物は、抗体、抗体コンジュゲート、マルチマー、および酵素からなる群より選択される巨大分子；界面活性剤；ならびに粘性修飾剤を含み、約４ｃｐ～約１１ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、巨大分子染色組成物は、約５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配される。
【0024】
[0024]いくつかの態様において、方法は、各分配工程の前または後に、１またはそれより多いさらなる試薬を場合によって沈着させる工程をさらに含み、１またはそれより多いさらなる試薬が、脱パラフィン化剤、洗浄剤、リンス剤、希釈剤、緩衝剤、または検出試薬からなる群より選択される。いくつかの態様において、１またはそれより多い試薬を場合によって沈着させる工程を、インクジェットプリントヘッドから１またはそれより多い試薬を分配することによって行う。いくつかの態様において、１またはそれより多い試薬を場合によって沈着させる工程を、別の沈着手段によって行う。
【0025】
[0025]本開示の別の側面において、生物学的試料の上に試薬を分配する方法であって：保護液体層を生物学的試料上に重層する、該生物学的試料は支持媒体上に沈着されている；約１ｐＬ～約５０ｐＬの間の試薬小滴を分配し、試薬小滴が保護液体層に浸透し、そして生物学的試料と接触するようにする；ここで、試薬小滴は、一次染色試薬組成物および抗体試薬組成物からなる群より選択される試薬組成物を含む工程を含む、前記方法を開示する。いくつかの態様において、試薬小滴を、約５ｍ／ｓ～約１５ｍ／ｓの間の速度で分配する。いくつかの態様において、保護液体層は水性パドルである。いくつかの態様において、保護液体層は非混和性油である。いくつかの態様において、試薬小滴の密度は、非混和性油の密度より大きい。いくつかの態様において、試薬小滴の動力学エネルギーは、非混和性油の表面張力より大きい。いくつかの態様において、試薬小滴の動力学エネルギーは、保護液体層の表面張力より大きい。いくつかの態様において、動力学エネルギーは９．５２ｘ１０－１０ジュールより大きい。
【0026】
[0026]いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲の粘性および約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、約１ｘ１０５ｓ－１～約１ｘ１０７ｓ－１の間の剪断速度で分配される。いくつかの態様において、抗体試薬組成物は、一次抗体、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約４ｃｐ～約７ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、抗体組成物は、約５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配される。
【0027】
[0027]本開示の別の側面において、生物学的試料の上に試薬を分配する方法であって：保護液体層を生物学的試料上に重層する、該生物学的試料は支持媒体上に沈着されている；ｐＨ修飾剤を、生物学的試料に分配し；そして試薬小滴を、約５ｍ／ｓ～約１５ｍ／ｓの間の速度で分配する；ここで、試薬小滴は、一次染色試薬組成物および抗体試薬組成物からなる群より選択される試薬組成物を含む工程を含む、前記方法を開示する。いくつかの態様において、分配される試薬小滴の量は、約１０μＬ／ｉｎ２～約３０μＬ／ｉｎ２の範囲である。いくつかの態様において、ｐＨ修飾剤は、約３～約５の範囲のｐＨを有する。いくつかの態様において、保護液体層は非混和性油であり、そして試薬小滴の動力学エネルギーは非混和性油の表面張力より大きい。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物が、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲の粘性および約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、約１ｘ１０５ｓ－１～約１ｘ１０７ｓ－１の剪断速度で分配される。いくつかの態様において、抗体試薬組成物は、一次抗体、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約４ｃｐ～約７ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、抗体組成物は、約５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配される。
【0028】
[0028]本開示の別の側面において、生物学的試料の上に試薬を分配する方法であって：保護液体層を生物学的試料上に重層する、該生物学的試料は支持媒体上に沈着されている；試薬小滴が保護液体層に浸透して生物学的試料に到達するために十分な動力学エネルギーで、試薬小滴を分配し、そして生物学的試料上に沈着される試薬小滴の空間密度が約５０ｄｐｉ～約１２００ｄｐｉであるように分配する、ここで、試薬小滴は、一次染色試薬組成物および巨大分子染色組成物からなる群より選択される試薬組成物を含む工程を含む、前記方法を開示する。いくつかの態様において、保護液体層は非混和性油であり、そして試薬小滴の密度は非混和性油の密度より大きい。いくつかの態様において、巨大分子染色組成物は、抗体、抗体コンジュゲート、マルチマー、および酵素からなる群より選択される巨大分子；界面活性剤；ならびに粘性修飾剤を含み、約４ｃｐ～約７ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、巨大分子染色組成物が、約５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配される。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲の粘性および約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、１ｘ１０５ｓ－１～約１ｘ１０７ｓ－１の間の剪断速度で分配される。
【0029】
[0029]本開示の別の側面において、生物学的試料の上に１またはそれより多い試薬を分配する方法であって、保護液体層を生物学的試料上に重層する、該生物学的試料は支持媒体（例えば顕微鏡スライド）上に沈着されている；試薬小滴が保護液体層に浸透し、そして生物学的試料に接触するように、小滴オンデマンドシステムを通じて、試薬小滴を分配する；ここで、試薬は、一次染色試薬組成物または巨大分子試薬組成物からなる群より選択される工程を含む、前記方法を開示する。いくつかの態様において、一次染色組成物は、色素、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲の粘性および約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、色素はヘマトキシリンであり、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、粘性修飾剤はプロピレングリコールであり；そしてプロピレングリコールの量は一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲である。いくつかの態様において、色素はエオジンであり、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、粘性修飾剤はプロピレングリコールであり；そしてプロピレングリコールの量は一次染色組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲である。いくつかの態様において、巨大分子染色組成物は、一次抗体、界面活性剤、および粘性修飾剤を含み、約４ｃｐ～約７ｃｐの範囲の粘性、および約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。いくつかの態様において、保護液体層は水性パドルである。いくつかの態様において、試薬小滴を、生物学的試料周囲の枯渇層に浸透させ、そして補充するために十分な速度で提供する。いくつかの態様において、試薬小滴を、約５ｍ／ｓ～約１５ｍ／ｓの間の速度で分配する。いくつかの態様において、保護液体層は非混和性液体、例えば油である。いくつかの態様において、試薬小滴の密度は、非混和性油の密度より大きい。いくつかの態様において、試薬小滴の動力学エネルギーは、非混和性油の表面張力より大きい。いくつかの態様において、試薬小滴のウェーバー数は約１８未満である。いくつかの態様において、一次染色試薬溶液は、約１ｘ１０５ｓ－１～約１ｘ１０７ｓ－１の剪断速度で分配され、そして抗体試薬溶液は、約５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配される。
【0030】
[0030]本開示の別の側面において、一次染色試薬組成物または巨大分子試薬染色組成物を、組織試料に分配するための手段を開示し、ここで、分配される一次染色試薬組成物または巨大分子試薬染色組成物の体積は、約１０μＬ／ｉｎ２～約３０μＬ／ｉｎ２の範囲である。いくつかの態様において、分配手段はインクジェットプリントヘッドである。いくつかの態様において、分配手段は、ターゲット画像化システム、相対運動システム、プリントヘッド、液体リザーバー、および圧制御手段を含む、小滴オンデマンドシステムである。いくつかの態様において、分配手段は、プリントヘッドクリーニングシステムをさらに含む。いくつかの態様において、分配手段は、図１Ａに例示するとおりである。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物および巨大分子試薬染色組成物は、分配手段での分配に適した粘性を有するように配合される。
【0031】
[0031]本開示の別の側面において、自動化スライド染色装置であって、（ａ）約１ｐＬ～約５０ｐＬの範囲の体積を有する試薬小滴を分配するためのディスペンサー；（ｂ）顕微鏡スライドを保持するように適応したスライド支持体；（ｃ）インクジェットプリンティングヘッドと液体連絡がある、一次染色試薬組成物または巨大分子染色組成物を含む、少なくとも１つの試薬リザーバー；および（ｄ）プロセッサおよびメモリを含有する制御モジュールであって、スライド支持体によって保持された顕微鏡スライド上に組成物を分配するようインクジェットプリンティングヘッドに命令するようにプログラミングされている、前記制御モジュールを含む、前記染色装置を開示する。
【0032】
[0032]本開示の別の側面において、（ｉ）組織試料を含有するスライドの第一の部分を画像化し；（ｉｉ）染色試薬の適用のため、スライドの第二の部分を選択し、ここで第二の部分は第一の部分のサブセットである；（ｉｉｉ）複数回のパスに渡って、インクジェット沈着システムを通じて、第二の部分に染色試薬を沈着させる工程を含む、コンピュータ実装法を開示する。いくつかの態様において、染色試薬は、約３６０ｎＬ／ｉｎ２～約１４．４μＬ／ｉｎ２の間で、沈着システムのパスを通じて、第二の部分に沈着される。
【0033】
[0033]本開示の別の側面において、１またはそれより多いプロセッサおよび少なくとも１つのメモリを含む、組織試料を染色するためのコンピュータシステムであって、少なくとも１つのメモリが、１またはそれより多いプロセッサに、小滴オンデマンド分配機構を有し、コンピュータシステムと連絡がある染色装置が、あらかじめ決定した量の一次染色試薬組成物または巨大分子試薬組成物を、生物学的試料の少なくとも部分に分配するように実行させるための永続性コンピュータ読み取り可能命令を記憶する、前記システムを開示する。
【0034】
[0034]慣用的な染色法に比較した際、より正確に（例えば投薬正確性、時間的正確性、ｉｎ ｓｉｔｕ混合）試薬を適用するかまたは分配することが有利であろう。慣用的な染色法に比較した際、より少ない試薬体積（そしてしたがってより少ない無駄）で試薬を分配し、そして／またはより速い速度で、染色動力学を駆動することもまた有利であろう。本出願人らは、小滴オンデマンド技術（例えばインクジェット技術または圧電技術）を通じた試薬溶液の分配が、一貫した結果を可能にし、そして自動化染色プロセス内に取り込むために適していることを見出した。本出願人らはまた、小滴オンデマンドシステムを通じて、より多くのまたはより少ない試薬量を組織に分配することによって、染色強度を最適化する（例えば「ダイヤル合わせする（ｄｉａｌｅｄ－ｉｎ）」）ことが可能であることも見出した。実際、本出願人らは、いくつかの方法の１つによって、試薬量を変動させることが可能であることを見出しており、これらには、本明細書に開示するような、（ｉ）分配機構の多数回のパスによる試薬の適用；（ｉｉ）試薬分配のインチあたりのドット（ｄｐｉ）の変化；（ｉｉｉ）小滴体積の変化；および／または（ｉｖ）試薬濃度の変化が含まれる。本出願人らは、予期せぬことに、本明細書にさらに論じるように、染色反応動力学が、先行技術のパドル技術を用いるよりも、より迅速であるようであることを発見した。本出願人らはまた、小滴オンデマンド沈着プロセスを通じた試薬溶液の分配が、慣用的な染色法と比較した際に、同じ染色強度を提供しながら、試薬使用の有意な減少を可能にすることもまた見出した。これらのおよび他の比較上優れた結果を本明細書にさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【0035】
[0035]本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図を含有する。カラー図を含む本特許または特許出願公開のコピーは、リクエストと必要な料金の支払いがあれば、特許庁に提供されるであろう。
【図4-1】[0040]図４Ａ～４Ｅは、組織が本開示の１つの態様にしたがった試薬分配プロセスで染色されるヘマトキシリンでの組織試料の染色を例示し、そしてさらに、慣用的な染色技術と小滴オンデマンド染色を比較する。
【図4-2】[0040]図４Ａ～４Ｅは、組織が本開示の１つの態様にしたがった試薬分配プロセスで染色されるヘマトキシリンでの組織試料の染色を例示し、そしてさらに、慣用的な染色技術と小滴オンデマンド染色を比較する。
【図4-3】[0040]図４Ａ～４Ｅは、組織が本開示の１つの態様にしたがった試薬分配プロセスで染色されるヘマトキシリンでの組織試料の染色を例示し、そしてさらに、慣用的な染色技術と小滴オンデマンド染色を比較する。
【図5-1】[0041]図５Ａ～５Ｃは、組織が本開示の１つの態様にしたがった試薬分配プロセスで染色されるエオジンでの組織試料の染色を例示し、そしてさらに、慣用的な染色技術と小滴オンデマンド染色を比較する。
【発明を実施するための形態】
【0036】
[0051]一般的に、本開示は、小滴オンデマンド技術を利用した、生物学的試料への１またはそれより多い試薬の送達または分配に関する。分配されたら、試薬は、生物学的試料内の細胞、細胞膜、核および／または組織または構造に分布する。ここに開示する方法は、（ｉ）試料内およびスライド上両方の空間的選択性；（ｉｉ）染色パドル中に存在する任意の拡散枯渇層の厚みより小さい組織切片（高さおよそ４μｍ）のサイズ規模まで試薬フィルムの厚さを低下させて、フィルムを試料上にプリントする能力；および（ｉｉｉ）利用する特定の小滴生成技術によって定義されるような、単一の小滴のサイズ規模まで低下させて、試料上の関心対象の領域を染色する能力を持つ、染色反応のための試薬を沈着させる能力によってユニークに特徴付けられる。例えば、いくつかの態様において、最少染色領域は、直径およそ２５～６０μｍの組織領域である。本明細書にさらに詳細に記載するように、分配される試薬には、生物学的試料内のターゲットが、染色、検出および分析可能であるような、組織化学において有用な一次染色または抗体が含まれる。
【0037】
[0052]本明細書において、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が別の意味を明らかに示さない限り、複数形の参照対象が含まれる。同様に、単語「または（ｏｒ）」は、文脈が別の意味を明らかに示さない限り、「および（ａｎｄ）」を含むよう意図される。
【0038】
[0053]用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」等は、交換可能に用いられ、そして同じ意味を有する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」等は、交換可能に用いられ、そして同じ意味を有する。具体的には、用語各々は、「含むこと」の一般的な米国特許法の定義と一致して定義され、そしてしたがって、「少なくとも以下」を意味するオープンタームであると解釈され、そしてまたさらなる特徴、限定、側面等を排除しないと解釈される。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有するデバイス」は、デバイスが、少なくとも構成要素ａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。同様に、句：「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程およびプロセスは、本明細書において特定の順序で概略されうるが、当業者は、工程およびプロセスの順序は多様でありうることを認識するであろう。
【0039】
[0054]本明細書において、用語「抗体」は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を指し、例えば、そして限定なしに、関心対象の分子（または関心対象の非常に類似の分子群）に特異的に結合して、他の分子への結合を実質的に排除する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、その組み合わせ、および任意の脊椎動物において（例えばヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物において）免疫反応中に産生される類似の分子、ならびに抗体断片（例えば、当該技術分野に知られるようなＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片およびＦａｂ断片）、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、ディアボディ、およびトリアボディ（当該技術分野に知られるようなもの）およびラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄ）抗体））が含まれる。抗体は、さらに、抗原のエピトープを特異的に認識して、そしてこれに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む、ポリペプチドリガンドを指す。抗体は、各々、可変領域を有する、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域と称される重鎖および軽鎖で構成されてもよい。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、一緒に、抗体によって認識される抗原への結合に関与する。用語、抗体にはまた、インタクトな免疫グロブリン、ならびに当該技術分野に周知のその変異体および部分も含まれる。
【0040】
[0055]本明細書において、用語「抗原」は、抗体分子またはＴ細胞受容体などの、特異的体液性または細胞性免疫の産物によって特異的に結合可能である化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純中間代謝産物、糖（例えばオリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに巨大分子、例えば複合糖質（例えば多糖）、リン脂質、核酸およびタンパク質を含む任意のタイプの分子であってもよい。
【0041】
[0056]「生物学的試料」または「組織試料」は、組織化学または細胞化学分析に適している、限定されるわけではないが、単細胞生物、例えばとりわけ細菌、酵母、原生動物、およびアメーバ、多細胞生物（例えば、健康なまたは見かけ上健康なヒト被験体、あるいは診断または研究しようとする状態または疾患、例えば癌に罹患しているヒト患者を含む、植物または動物）を含む、任意の生存生物から得られるか、これらによって排出されるか、またはこれらによって分泌される、任意の固形または液体試料、例えば分析しようとする細胞および／または組織の形態学的特性を保持する試料であってもよい。例えば、生物学的試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、眼房水または硝子体液、あるいは任意の体性分泌物、漏出液、滲出液（例えば、膿瘍あるいは感染または炎症の任意の他の部位から得られる液体）、あるいは関節（例えば正常関節または疾患に罹患した関節）から得られる液体であってもよい。生物学的試料はまた、任意の臓器または組織（生検または検屍標本、例えば腫瘍生検を含む）から得られる試料であってもよく、あるいは細胞（初代細胞または培養細胞いずれであってもよい）、または任意の細胞、組織もしくは臓器によって馴化された培地を含んでもよい。いくつかの例において、生物学的試料は、核抽出物である。特定の例において、試料は品質管理試料である。他の例において、試料は試験試料である。例えば、試験試料は、被験体から得られた生物学的試料から調製された、細胞、組織または細胞ペレット切片である。１つの例において、被験体は、リスクがあるかまたは獲得しているものである。試料は、一般の当業者によって知られる任意の方法を用いて調製可能である。試料は、ルーチンのスクリーニングのため、被験体から得られてもよいし、または障害、例えば遺伝子異常、感染、または新生物を有すると推測される被験体から得られてもよい。また、開示する方法の記載する態様を、「正常」試料と称される、遺伝子異常、疾患、障害等を持たない試料に適用してもよい。試料には、１またはそれより多い検出プローブによって特異的に結合可能である多数のターゲットが含まれてもよい。
【0042】
[0057]本明細書において、句「ディップアンドダンク（ｄｉｐ ａｎｄ ｄｕｎｋ）」は、試料および顕微鏡スライドを、各アッセイ工程に関する染色試薬のパスに浸すことによる染色技術を指す。
【0043】
[0058]本明細書において、用語「滴オンデマンド」、「小滴オンデマンド」、または「小滴に基づく」（および他の同様の用語または句）は、試薬でスライドまたはその上の試料を「水浸しにする（ｆｌｏｏｄｉｎｇ）」のとは対照的に、ターゲット試料上に試薬の別個の小滴を沈着させる染色技術を指す。いくつかの態様において、小滴オンデマンド技術は、インクジェット技術または圧電技術を利用する。本明細書に開示するいくつかの態様において、小滴分配技術は、インクジェットプリントヘッドまたは類似の技術を用いて容易になる。
【0044】
[0059]本明細書において、用語「保水剤」は、物質、例えば組織試料を湿らせておくために用いられる吸湿性物質を指し；乾燥剤とは反対である。これはしばしば、いくつかの親水性基、最も頻繁にはヒドロキシル基を含む分子であるが；アミンおよびカルボキシル基、時にはエステル化されたものもまた、遭遇可能である（水分子と水素結合を形成するアフィニティが必須の特質である）。保水剤は、吸収によって近くの空気中の水分を誘引し、そして保持し、水蒸気を生物／対象の表面内におよび／またはその下に引き入れると考えられる。対照的に、乾燥剤もまた、周囲の水分を誘引するが、水蒸気をフィルム層としての表面上に凝集させることによって、吸収するのではなく吸着させる。インクジェット沈着または類似の技術の関連において、保水剤は、存続可能なノズルを維持するために重要でありうる。いくつかの態様において、組織試料または生物学的試料を、薄フィルムプロセシング中に水和させておくことが重要である。
【0045】
[0060]用語「インクジェット」は、本開示において、分配マニホールドから小滴を作動させるために圧電（または熱）素子を用いる、滴オンデマンド技術のファミリーを指す。これには、商業的プリンティング産業に一般的である直接および非接触法、または商業的プリンティング産業の外で用いられるものが含まれてもよい。
【0046】
[0061]本明細書において、用語「免疫組織化学」は、特異的結合剤、例えば抗体と抗原の相互作用を検出することによって、試料における抗原の存在または分布を決定する方法を指す。試料を、抗体－抗原結合を可能にする条件下で、抗体と接触させる。抗体－抗原結合は、抗体にコンジュゲートされた検出可能標識によって（直接検出）、または一次抗体に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートされた検出標識によって（間接的検出）、検出可能である。
【0047】
[0062]本明細書において、用語「微量流体」は、ガラス顕微鏡スライドの向かい側に設置可能な表面、ならびにギャップ内への染色試薬の流動に基づく導入および排除のための手段を必要とする染色技術を指す。さらに、望ましいギャップの高さは、スライド表面を渡る試薬流動が、層状であり、そしてギャップ内部の総体積が最小限であるように生成すべきである。
【0048】
[0063]本明細書において、用語「一次抗体」は、組織試料中のターゲットタンパク質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は、一般的に、免疫組織化学法において用いられる第一の抗体である。一次抗体にはまた、別の分子（例えば標識、ハプテン等）にコンジュゲートされた抗体も含まれる。一次抗体は、組織試料内のターゲットを検出するための「検出プローブ」として働くことも可能である。
【0049】
[0064]本明細書において、用語「一次染色剤」は、組織試料において、コントラストを増進する色素または類似の分子である。いくつかの態様において、一次染色剤は、細胞内または細胞上の生物学的構造を、特定の結合剤、例えば抗体の使用を伴わずに直接「標識する」ものである。一次染色剤のいくつかの例には、ヘマトキシリンおよびエオジンが含まれる。一次染色剤の他の例には、アクリジンオレンジ、ビスマルクブラウン、カーミン、クーマシーブルー、クレシルバイオレット、クリスタルバイオレット、ＤＡＰＩ（「２－（４－アミジノフェニル）－１Ｈ－インドール－６－カルボキサミジン」）、エチジウムブロミド、酸性フクシン、ヘキスト染色剤（ビス－ベンズイミダゾール誘導体であるヘキスト３３３４２およびヘキスト３３２５８）、ヨウ素、マラカイトグリーン、メチルグリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド、ナイルブルー、ナイルレッド、四酸化オスミウム、ローダミン、およびサフラニンが含まれる。一次染色剤の他の例には、細菌を染色するために用いられる染色剤（グラム陽性またはグラム陰性染色剤）、内性胞子を同定するために用いられる染色剤（内性胞子染色剤）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の種の同定を補助するために用いられる染色剤（チール・ネールゼン染色剤）、パパニコロー染色キット（ヘマトキシリン、オレンジＧ、エオジンＹ、ライトグリーンＳＦイエローイッシュ、および時によってビスマルクブラウンＹの組み合わせを用いる）、過ヨウ素酸シッフ染色剤（「ＰＡＳ染色剤」）、銀染色剤等が含まれる。さらに他の限定されない一次染色剤には、（ｉ）マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）および他の抗酸生物または構成要素を選択的に示すための組織学的染色剤（例えばＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、アリゾナ州ツーソンより入手可能な、ＡＦＢ ＩＩＩ染色キット）；（ｉｉ）酸性ムチンを中性多糖と区別するための組織学的染色（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＰＡＳ用のアルシアンブルー）；（ｉｉｉ）弱酸性ムコ多糖を示すための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なアルシアンブルー染色キット）；（ｉｖ）ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に関する組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なアルシアンイエロー染色キット）；（ｖ）アミロイドを選択的に示すための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能な、コングロレッド染色キット）；（ｖｉ）中性多糖から酸性ムチンを区別するための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能な、ジアスターゼキット）；（ｖｉｉ）組織切片における弾性線維を示すための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能な、弾性染色キット）；（ｖｉｉｉ）骨髄および他の造血組織（リンパ節）中の白血球を区別するための組織学的染色（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なギムザ染色キット）；（ｉｘ）限定されるわけではないが、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）などの病原性真菌、ならびにニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｓｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）などの他の日和見感染生物を区別可能な染色剤を含む、真菌および他の日和見感染生物の細胞壁中の多糖を示すための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＧＭＳ ＩＩ染色キット）；（ｘ）グラム陰性およびグラム陽性細菌を示すための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なグラム染色キット）；（ｘｉ）結合組織、筋肉およびコラーゲン線維を研究するために用いる組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なトリクローム用グリーン）；（ｘｉｉ）骨髄、ヘモクロマトーシス組織、およびヘモジデリン沈着症における鉄色素を検出するための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能な鉄染色キット）；（ｘｉｉｉ）毛細血管基底膜を示すための組織学的染色剤（例えば、どちらもやはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＪｏｎｅｓ Ｈ＆Ｅ染色キットまたはＪｏｎｅｓライトグリーン染色キット）；（ｘｉｖ）真菌検出用の組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＰＡＳ用ライトグリーン）；（ｘｖ）酸性ムコ多糖（ムチン）を検出するための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なムチアルミン（Ｍｕｃｉａｒｍｉｎｅ）染色キット）；（ｘｖｉ）陽性細網線維、基底膜、真菌、および中性ムコ多糖の同定を補助可能な染色剤、または未分化ＰＡＳ陰性扁平上皮癌から、ＰＡＳ陽性分泌性腺癌を区別する際に補助可能な染色剤を含む、グリコーゲンの存在を示すために用いられる組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＰＡＳ染色キット）；（ｘｖｉｉ）細網線維を示すための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能な細網ＩＩ染色キット）；（ｘｖｉｉｉ）特定の好銀性微生物を研究するために用いられる組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＳｔｅｉｎｅｒ ＩＩ染色キット）；（ｘｉｘ）ある種の胃潰瘍（Ｈ．ピロリ（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ））、ライム病、レジオネラ病、ネコひっかき熱等の疾患の原因生物の同定を補助するための組織学的銀染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なＳｔｅｉｎｅｒ染色キット）；（ｘｘ）結合組織、筋肉およびコラーゲン線維を研究するための組織学的染色剤（例えば、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なトリクロームＩＩブルー染色キット）；（ｘｘｉ）結合組織、筋肉およびコラーゲン線維を研究するための組織学的染色剤（例えば、各々、やはりＶｅｎｔａｎａより入手可能なトリクローム染色キット、トリクロームＩＩＩブルー染色キット、またはトリクロームＩＩＩグリーン染色キット）が含まれる。当業者はまた、本開示のキット、方法、および組成物（例えば一次染色組成物、試薬組成物）と組み合わせて使用可能な他の一次染色剤、またはそれに関しては色素が存在することを認識するであろう。
【0050】
[0065]本明細書において、用語「パドル」は、それによって、顕微鏡スライドの試料表面全体が各アッセイ工程に関してある体積の試薬で覆われる、単一スライド染色技術を指す。
【0051】
[0066]本明細書において、用語「試薬」は、形態学的（例えばヘマトキシリンおよびエオジン）、免疫組織化学的、または特殊染色の関連で用いられる、組織切片または細胞学試料上に沈着される任意の液体を指すことも可能である。これには、限定されるわけではないが、ワックスを除去する（すなわち脱パラフィン化）ための油、有機物、および架橋試薬；洗浄剤、リンス剤、希釈剤、または反応条件を設定するために用いられる緩衝剤、適切な濃度にするか、反応を停止するか、または過剰な反応物質を洗い流すための希釈試薬；形態学的染色および特殊染色に用いられる小分子色素；ＩＨＣまたはＩＣＣ染色に用いられる、抗体、抗体コンジュゲート、酵素、マルチマー、増幅剤、発色原基質、蛍光検出化学物質、化学発光基質、および酵素反応補因子が含まれる。
【0052】
[0067]本明細書において、「界面活性剤」は、化学作用の様式に応じて、陰イオン性、陽イオン性、または非イオン性と分類される。一般的に、界面活性剤は、２つの液体の間の界面張力を減少させる。界面活性剤分子は、典型的には、極性またはイオン性「ヘッド」および非極性炭化水素「テール」を有する。水への溶解に際して、界面活性剤分子は凝集し、そしてミセルを形成し、その中で、非極性テールは内側に向き、そして極性またはイオン性ヘッドは水性環境に向かい外側に向く。非極性テールは、ミセル内に非極性「ポケット」を生成する。溶液中の非極性化合物は、界面活性剤分子によって形成されたポケット中に隔離され、したがって、非極性化合物が水溶液内で混合されたままであることを可能にする。いくつかの態様において、界面活性剤を用いて、組織切片に渡る試薬の均一な拡散を生じるとともに、バックグラウンド染色を減少させることも可能である。
【0053】
[0068]本明細書において、「ターゲット」は、生物学的試料における特定の組織、あるいは生物学的試料における特定の分子またはマーカーであることも可能である。ターゲットの例には、抗原（ハプテンを含む）、抗体、および酵素が含まれる。ターゲットのさらなる例には、一般的に、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、および脂質が含まれる。本開示で使用するための試薬は、生物学的試料中に存在するターゲット物質を、ターゲットの局在が検出可能であるように（例えば視覚的に）、検出可能な型に変換することが可能なものであることも可能である。
【0054】
[0069]小滴オンデマンド分配システムおよび試薬を分配する方法
[0070]本開示の１つの側面において、小滴オンデマンド技術を利用する試薬沈着システム、例えばインクジェット分配システムを含む、生物学的試料上に１またはそれより多い試薬を沈着させるためのデバイスまたはシステムを開示する。本開示にしたがって、試薬、または試薬を含む組成物を、生物学的試料、あるいはその領域または部分上に、小滴の形で送達して、試薬溶液での試料のスポッティングまたは染色を達成する。圧電またはインクジェット分配技術を含む小滴オンデマンド技術は、例えば、米国特許第４，８７７，７４５号およびＰＣＴ公報第ＷＯ９８／４７００６号にさらに記載され、これらの開示は、その全体が本明細書に援用される。
[0070]本開示の１つの側面において、小滴オンデマンド技術を利用する試薬沈着システム、例えばインクジェット分配システムを含む、生物学的試料上に１またはそれより多い試薬を沈着させるためのデバイスまたはシステムを開示する。本開示にしたがって、試薬、または試薬を含む組成物を、生物学的試料、あるいはその領域または部分上に、小滴の形で送達して、試薬溶液での試料のスポッティングまたは染色を達成する。圧電またはインクジェット分配技術を含む小滴オンデマンド技術は、例えば、米国特許第４，８７７，７４５号およびＰＣＴ公報第ＷＯ９８／４７００６号にさらに記載され、これらの開示は、その全体が本明細書に援用される。
【0055】
[0071]本開示のいくつかの態様にしたがった小滴オンデマンド染色システム９００の要素を図１Ａに示す。図１Ａは、プリントヘッド９０５およびターゲット試料９０８との関係を例示する（ターゲット試料は、標準的顕微鏡スライド上にマウントされた生物学的試料または組織試料であってもよい）。「染色ジョブ」を生じるため、ターゲット試料９０８を、いくつかの態様において、ターゲット画像化システム９０１によって分析して、ターゲット試料の空間的位置を決定してもよい。この情報を次いで、続いて、中央処理装置９０２にフィードし、該装置は画像化情報およびアッセイを解釈し、そして次いで、続いて、例えば、タイミングおよび協調情報を含む命令をプリントヘッド９０５、圧制御システム９０３、および相対運動システム９０４に送る。相対運動システム９０４は、プリントヘッド９０５および／またはターゲット試料９０８を、整列させて、試料上に染色小滴（例えば試薬染色小滴）の分配を開始するように設計される。いくつかの態様において、液体または試薬を、試薬カートリッジ９０６から、プリントヘッド９０５に、そしてターゲット試料９０８上にフィードする。相対運動システム９０４は、中央処理装置９０２を通じて、プリントヘッド９０５からの分配タイミングと協調し、９０１において提供され、そして９０２によって解釈された画像によって定義されるように、望ましい染色画像を生じる。定期的に、プリントヘッドクリーニングステーション９０７を通じて、プリントヘッドのクリーニングが必要である。要素９０７は、プリントヘッドと直接相互作用して、能動的にクリーニングし、そしてプリントノズルを通じて液体を押し出し、ノズルを染色のためにプライミングする。いくつかの態様において、ノズルから液体を能動的に一掃するために、小さい陽圧、例えば約１０ｐｓｉまたはそれ未満をカートリッジに適用してもよい。
【0056】
[0072]当業者は、小滴オンデマンド染色システム９００が、さらなる構成要素、例えば分析装置、スキャナ、コンピュータシステム等に連絡可能にカップリングされていてもよいことを認識するであろう（図１Ｂを参照されたい）。一般的に、小滴オンデマンド染色システム９００には、限定なしに、１またはそれより多い画像捕捉デバイスを有するターゲット画像化システム９０１が含まれてもよい。画像捕捉デバイスには、限定なしに、カメラ（例えばアナログカメラ、デジタルカメラ等）、オプティクス（例えば１またはそれより多いレンズ、センサー焦点レンズグループ、顕微鏡対物レンズ等）、画像化センサ－（例えば電荷結合素子（ＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）画像センサー等）、写真フィルム等が含まれてもよい。デジタル態様において、画像捕捉デバイスには、協調して作動中焦点合わせを立証する、複数のレンズが含まれてもよい。ＣＣＤセンサーは、標本のデジタル画像を捕捉可能である。デジタル画像を産生する１つの方法には、標本の少なくとも部分を含む顕微鏡スライド領域を含むスキャン領域を決定する工程が含まれる。スキャン領域を複数の「スナップショット」に分割してもよい。個々の「スナップショット」を組み合わせることによって、画像を生じてもよい。いくつかの態様において、ターゲット画像化システム９０１は、標本全体の高解像度画像を生じ、こうした装置の１つの例は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（アリゾナ州ツーソン）のＶＥＮＴＡＮＡ ｉＳｃａｎ ＨＴスライドスキャナであり、そしてこれはシステム９００と連絡可能にカップリングしていてもよい。
【0057】
[0073]図１Ｂを参照すると、コンピュータデバイス１４には、中央処理装置（ＣＰＵ９０２であってもよいし、または別個のＣＰＵであってもよい）が含まれてもよく、そしてコンピュータデバイス１４には、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレット等が含まれてもよく、そしてデジタル電子回路、ファームウェア、ハードウェア、メモリ、コンピュータ記憶媒体、コンピュータプログラム、プロセッサ（プログラムされたプロセッサを含む）等が含まれてもよい。図１Ｂの例示される計算システム１４は、スクリーン１６およびタワー１８を有するデスクトップコンピュータである。タワー１８は、ターゲット画像化システム９０１由来のデジタル画像をバイナリ型で記憶可能である。いくつかの態様において、ネットワーク２０または直接連結は、小滴オンデマンド染色システム９００およびコンピュータシステム１４を相互連結する。コンピュータシステムには、一連のコンピュータ実行可能命令でプログラミングされる１またはそれより多いプロセッサが含まれ、命令はメモリに記憶される。
【0058】
[0074]当業者は、小滴オンデマンド構成要素が、生物学的試料を調製し、プロセシングし、そして／または分析する際に有用なさらなる構成要素を含む、より大きなシステムの部分であってもよいことを認識するであろう。例えば、本開示の小滴オンデマンドシステム９００を、組織標本の１またはそれより多い調製プロセスを実行可能な標本プロセシング装置に（システム９００の上流または下流のいずれかで）結びつけてもよい。調製プロセスには、限定なしに、標本の脱パラフィン化、標本の馴化（例えば細胞馴化）、標本の染色、抗原回復の実行等が含まれてもよい。当業者はまた、本開示の小滴オンデマンド分配システムが、試料の染色（例えば一次染色またはＩＨＣ染色）の手段を提供するものの、該システムを、他の染色システム、例えば免疫組織化学染色（標識を含む）を実行し、そして／またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＳＩＳＨ、ＦＩＳＨ等）染色（標識を含む）を実行するためのもの、ならびに顕微鏡分析、微量分析、質量分析法、または他の分析法のために標本を調製するための他のプロセスとカップリングしてもよいことも認識するであろう。
【0059】
[0075]図２は、自動化染色システムの一部として小滴オンデマンド技術を利用するプロセスを示す。図２は、インクジェット分配技術の関連で、プロセスマップを例示するが、当業者は、システムが、一般的な当業者に知られるような、他の小滴オンデマンド技術を利用してもよいことを認識するであろう。図２を参照して、生物学的試料をまず８０２に導入する。いくつかの態様において、生物学的試料には、脱パラフィン化組織切片、凍結組織切片、または細胞試料が含まれてもよい。いくつかの態様において、小滴オンデマンド分配システムには、組織切片の脱パラフィン化のための分配試薬が含まれてもよい（または脱パラフィン化を、上流プロセスにおいて、別に行ってもよい）。受け入れ試料に関する必要なアッセイ情報８０１を、プロセス工程および／またはパラメータに変換し、そして次いで、ハードウェア立体配置によってユニークに定義されるか、または異なるプロセスブロックを定義するハードウェアに関して、ソフトウェア命令によって定義される「インクジェット染色ブロック」８０３に分割する。プロセスブロック８０３は、システム内で空間的に分離されていてもよいし、またはこれらのブロック各々に関して再形成可能な一体化構造として存在してもよい。完全なアッセイは、さらなる下流プロセシング８０４の用意ができた変換試料の結果を伴う、８０３プロセスブロックの連続的実行と定義される。
【0060】
[0076]図２はまた、インクジェット染色プロセスブロック８０３の１つの態様の拡大された図も提供する。いくつかの態様において、受け入れ試料は、８０２と定義されるが、インクジェット染色プロセスブロックに導入する前に、試料上で行う、場合によるさらなるインクジェットまたは小滴に基づくプロセシング操作を伴う。ブロック８０６は、インクジェットアッセイ情報８０１および試料８０５のインプットを合成し、そしてプロセスブロックにおいて実行しようとするインクジェット染色作業を定義する、パラメータ設定に分割する、フロントエンドプロセシング工程を定義する。いくつかの態様において、プロセスのこの工程でセットされるパラメータ８０７には（ｉ）分配しようとする特定の染色試薬；（ｉｉ）試料に対して行うプリントパスの数；（ｉｉｉ）（ａ）顕微鏡スライド全体、（ｂ）スライド上の組織試料を有する領域のみ、または（ｃ）試料領域およびガラス領域、多数の組織試料、または単一の試料内の多数の領域の何らかの組み合わせをプリントしうる、プリント画像ファイルの関連における染色領域；（ｉｖ）ターゲット上に分配される小滴の密度を定義する、プリントＤＰＩ；（ｖ）プロセスブロックの温度条件；および（ｖｉ）プロセスブロックに必要なインキュベーション時間およびルーチンが含まれる。プロセスブロックを定義したら、８０８、８０９、および８１０に定義するように、インクジェット染色プロセスの実行のため、試料をブロック内に導入する。これらの３つの工程は、一般的に、試料と試薬の分配および／または反応の活性部分に相当する（図７および８Ａもまた参照されたい）。最後に、８１１で、残りの未反応プリント試薬も洗い流し、そしてスライド上の過剰な液体を除去し、８０４でさらに下流プロセシングする準備ができた変換試料を生じる。
【0061】
[0077]図３は、インクジェット染色システムの別の態様を示し、ＤＭＣ－１１６１０プリントヘッドを利用するカスタムインクジェット染色装置上で開発された、小滴オンデマンド技術を利用する染色プロセスを示す。本明細書にさらに例示するように、図４Ａは、本明細書に概略する方法にしたがって、そして図３に例示するように調製された、染色組織試料を提供する。再び図３を参照すると、工程１４０１で、試料を小滴オンデマンド染色システム（９００）に導入し、そしてこれには、脱パラフィン化組織切片、凍結組織切片、または細胞試料が含まれることも可能である。１４０１で、プリントヘッドに対する試料の位置に関する情報を含めて、試料画像を捕捉する（例えばターゲット画像化システム９０１を用いる）。この画像を、いくつかの態様において、ピクセルマップのスタックに変換し、各ピクセルは、試料上のそれぞれの位置に、プリントヘッドから噴出されるべき１またはそれより多い小滴に相当する。ピクセルマップのスタックは、アッセイにおいて用いようとするプリントヘッド各々に関する命令に相当し、スタックの１またはそれより多い層は、プリントヘッド各々に分割される。工程１４１１で、プリントするサーベル角度（ｓａｂｒｅ ａｎｇｌｅ）を調節することによって、インチあたりのプリントドット（ｄｐｉ）をプリントヘッドが調節可能である（１４１２）ように、命令を生成し、そして／または提供する（サーベル角度に関するさらなる情報に関しては、その開示が本明細書に援用される、米国特許公報第２００９／０３１４１７０号を参照されたい）。いくつかの態様において、サーベル角度は、ＤＭＣ－１１６１０プリントヘッド上のノズル間のスペーシングを設定する。同時に、ピクセルマップもまた、試料輸送システムに送られる、一連の運動に変換される。小滴沈着のタイミングおよびプリント作業１４０４中のプリントヘッドに対する試料の相対運動は、図１Ａおよび１Ｂに例示されるように、コンピュータシステムによって協調される。
【0062】
[0078]いくつかの態様において、過剰な液体を受け入れ試料から除去する（１４０２）。これは、小滴沈着技術での染色剤沈着につながる統合工程であると考えられ、これは、過剰な液体が１４０４で沈着される小体積の染色剤を希釈するか、または不均一な染色剤沈着を導く可能性があるためである。染色用の試料を調製する１４０３ため、非染色液の沈着を用いて、組織試料内のｐＨおよび緩衝条件を調節する。この特定の態様において、バルク分配を用いてこれを行うことも可能であり；プリントヘッドに染色調製液を装填するか；または続く染色工程（単数または複数）にマッチしたｐＨ条件を「ダイヤル合わせ」するため、組織上に比率計測的に分配される、異なる緩衝剤を装填された２つのプリントヘッドを組み合わせてもよい。比率計測緩衝系の例として、表２は、ヘマトキシリンでの最適染色のために組織を調製するために適した範囲に渡って滴定可能なギ酸および酢酸緩衝系を記載する。工程１４０４、１４０５、１４０６、および１４０７は、図１および２に示すような、染色剤の強度および特異性を「ダイヤル合わせ」するように、同じ染色剤の多数のプリント層を沈着させるための、プリント、インキュベーション、フィードバックループを含む、プリント染色を実行するためのプロセスを示す。プリント染色工程が完了した後、試料をリンスして１４０７、いかなる未反応プリント試薬も除去し、そしてプロセス１４０８を通じてループを戻り、次の染色工程（例えばプリントヘマトキシリン工程に続いてプリントエオジン工程）をプリントするか、またはエアナイフ（例）工程１４０２を通じて、下流プロセシングのために放出して、過剰な液体を除去したのち、変換された試料を生じる１４０９。
【0063】
[0079]当業者は、分配する試薬のタイプ、生物学的試料のタイプ、または生物学的試料の調製法に応じて、異なるプロセシングパラメータを提供するように、小滴オンデマンド分配システムを「チューニング」可能であると認識するであろう。本明細書に先に示すように、チューニング可能ないくつかのパラメータには、限定されるわけではないが、小滴体積、および小滴速度が含まれる。いくつかの態様において、小滴オンデマンド分配システムは、沈着システムの小滴あたり、約１ｐＬ～約１０ｎＬの間の試薬を分配することが可能である。他の態様において、小滴オンデマンド分配システムは、沈着システムの小滴あたり、約１ｐＬ～約１ｎＬの間の試薬を分配することが可能である。さらに他の態様において、小滴オンデマンド分配システムは、沈着システムの小滴あたり、約１ｐＬ～約５００ｐＬの間の試薬を分配することが可能である。さらなる態様において、小滴オンデマンド分配システムは、沈着システムの小滴あたり、約１ｐＬ～約２５０ｐＬの間の試薬を分配することが可能である。さらにさらなる態様において、小滴オンデマンド分配システムは、沈着システムの小滴あたり、約１ｐＬ～約１００ｐＬの間の試薬を分配することが可能である。さらにさらなる態様において、小滴オンデマンド分配システムは、小滴オンデマンド分配システムの小滴あたり、約１ｐＬ～約５０ｐＬの間の試薬を分配することが可能である。
【0064】
[0080]いくつかの態様において、試薬を約０．５ｍ／ｓ～約２０ｍ／ｓの間の速度で小滴オンデマンド分配システムから分配し、そして／または沈着させる。他の態様において、試薬を約４ｍ／ｓ～約１０ｍ／ｓの間の速度でデバイスから分配し、そして／または沈着させる。
【0065】
[0081]本明細書にさらに記載するように、異なる試薬または試薬を含む組成物を、小滴オンデマンド分配システムから分配することも可能である。当業者は、異なる試薬組成物または配合物が、異なる特性を含むことも可能であり、そしていくつかの態様において、異なる剪断速度で分配されることも可能であることを認識するであろう。例えば、一次染色試薬組成物（またはそれに関しては、任意の小分子色素）は、約１ｘ１０５ｓ－１～約１ｘ１０７ｓ－１の間の剪断速度で分配可能である。別の例として、巨大分子試薬組成物は、約２ｘ１０６ｓ－１未満の剪断速度で分配可能である。さらなる例として、抗体試薬溶液は、約５ｘ１０５ｓ－１未満の剪断速度で分配可能である。適切な剪断速度は、一般の当業者によって、各組成物に関して決定可能であり、そして分配デバイスは適宜チューニング可能である。
【0066】
[0082]本出願人らは、本開示の小滴オンデマンド分配システムが、生物学的試料上への試薬の正確な分配を可能にすることを示す。実際、そして先行技術に比較した際、開示する分配デバイスを用いて、生物学的試料上に沈着される試薬の量または質量は、試薬の量を「ダイヤル合わせ」することによって、変化させることが可能である。したがって、当業者は、染色強度を特定の試料および／またはアッセイに基づいて、変化させることも可能であることを認識するであろう。実際、本出願人らは、驚くべきことに、（ｉ）分配機構の多数回のパスにより、試料を適用して（例えば約１～約２５回のパスまたはそれより多く）、試薬材料の累積沈着を提供するようにすること；（ｉｉ）分配する試薬のインチあたりのドット（ｄｐｉ）（例えば約５０ｄｐｉ～約１２００ｄｐｉ）を変化させること；（ｉｉｉ）小滴体積（例えば約１ｐｌ～約１ｎＬ）を変化させること；および／または（ｉｖ）任意の試薬組成物または配合物における試薬濃度を変化させることを含むいくつかの方法の１つによって、試薬量を変化させることが可能であることを発見した。
【0067】
[0083]本発明の試薬分配デバイスは、先行技術に比較した際に、利用されるおよび／または無駄になる試薬の量をより少なくすることを可能にすると考えられる。表１は、多様な染色プロセスを示し、そして異なる装置間のアッセイ工程あたりのスライド被覆体積および空間的染色能力を比較して例示する。表１は、自動化染色組織染色プラットホームの関連において、インクジェットまたは別の小滴生成技術を用いて、顕微鏡スライドの特定の領域を染色するための試薬体積節約および能力を示す。アッセイ工程、例えば本明細書記載の小滴オンデマンドシステムに関して、全試料を覆うために必要な総体積は、約１０マイクロリットルから約１マイクロリットル未満まで多様である。同時に、約１０ピコリットルの単一小滴体積で、約１０の細胞またはそれ未満の特定の領域を染色することが可能であると考えられる。例えば、そして表１に列挙するように、アッセイ工程あたり、スライドあたり、約１０ｍＬ～１００ｍＬの試薬を必要とする、先行技術の「ディップアンドダンク」技術に比較した際、本デバイスは、いくつかの態様において、アッセイ工程あたり、スライドあたり、約０．００１ｍＬの試薬の利用が必要とされるのみであり、利用する試薬体積の有意な減少を生じる（すなわち数桁の相違）。さらに、本出願人らは、本開示記載のデバイスが、本明細書にさらに記載するように、先行技術の方法と比較した際、反応動力学の増加を可能にすることを発見した。
【0068】
表１：染色プロセスの相違の比較
【0069】
【表1】
【0070】
[0084]一次染色剤、ヘマトキシリンおよびエオジンの関連において、分配する試薬の量が増加するにつれて（パス回数が増加するにつれて）、染色強度が増加する（例えば図４Ａ～４Ｅおよび５Ａ～５Ｃを参照されたい）。図４Ａ～４Ｅは、標本スライド上に固定された扁桃腺組織上に分配されたヘマトキシリン試薬を例示する（染色法に関しては、本明細書の実施例６を参照されたい）。図４Ａは、インクジェットプロセスに関して、パス回数が増加し、そして分配試薬体積が増加する（４μＬ／ｉｎ２、８μＬ／ｉｎ２、１４μＬ／ｉｎ２）とともに、染色強度が増加することを定性的に示す。図４Ｂは、総染色沈着に基づいて、ヘマトキシリン一次染色の吸光度を例示する（６００ｄｐｉ、３ｐＬ滴サイズ、プリントヘッドパスあたり、約１μＬ／ｉｎ２）。慣用的な染色装置と比較するため、対照スライドからの吸光度値を図４Ｂの示すバンド中に示す。試薬分配デバイスからの約１４μＬ／ｉｎ２の染色剤沈着は、２分間のインキュベーション時間で、慣用的な染色装置で提供されるものとほぼ同等の染色を生じる。開示する方法にしたがった染色例として、図４Ｃは、本開示に記載するインクジェット染色プロセスによって生じるような、高品質組織染色の重大な巨視的特徴である、胚中心を取り巻くリンパ濾胞の鮮明な染色を示す。図４Ｃにおいて、矢印は、リンパ濾胞の縁における強い染色を有する胚中心を示す。図４Ｄは、インクジェット染色扁桃腺組織の巨視的外観を提供し、そしていくつかの核における凝集クロマチンおよび核膜を見る能力を含めて、明白な核染色を示す。図４Ｄにおいて、矢印は、周囲の核よりも、凝集核物質が、明らかに暗く染色される、核の例を示す。図４Ｅは、開示する技術が特異的染色を提供することを示す、染色された扁桃腺切片の視野を提供し；該視野において、染色された核および染色されない赤血球（矢印によって示す）の両方が存在する。
【0071】
[0085]修飾された商業的に入手可能なヘマトキシリンを充填した非ＯＥＭリフィル可能インクカートリッジを備えたカスタム改良ＥＰＳＯＮ Ｃ８８＋プリンターを用いて、図４Ａ～４Ｅに例示する実験結果を得た。プリント特性は上記の通りであった。簡潔には、実験は：１）ＦＦＰＥブロックから４μｍ扁桃腺切片を調製し、２）染色用の切片を調製し、３）プリントしようとする試薬の上にプリンターを導くプリント画像ファイル、染色用のｘ－ｙ座標、およびプリントしようとするパターンを生成して、４）組織切片およびガラススライドを、プリントフィード機構上に装填して、５）プリンティングプロセスを反復して、望ましい染色強度を達成し、そして６）過剰な染色剤を手動で洗い落として、そしてスライドにカバースリップを掛ける工程からなった。ＶＥＮＴＡＮＡ ｉＳｃａｎ ＨＴスライドスキャナを用いてスライドを画像化し、そしてＩｍａｇｅＪおよびＭＡＴＬＡＢを用いて、強度値を抽出した。
【0072】
[0086]いかなる特定の理論に束縛されることも望ましくないが、上述の結果の意味は２つあると考えられる。第一に、染色強度（量で制限される染色）の「ダイヤル合わせ」は、小滴オンデマンドプリンティングプロセス（例えばインクジェット沈着または別の小滴沈着技術）によって可能になることを示す。以前には、すべての他の技術は、染色強度を「ダイヤル合わせ」するために、インキュベーション時間、温度、または多様な試薬濃度の組み合わせを必要としたため、いかなる他の組織染色技術もこの能力は持たなかった。第二に、この結果は、図４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅにおいて可視である巨視的および顕微鏡的特徴によって立証されるように、この低体積染色形式で、組織乾燥が非特異的染色を生じないことを示す。
【0073】
[0087]別の例として、図５Ａ～５Ｃは、標本スライド上に固定された結腸組織に対するエオジン試薬分配を例示する。図５Ａは、ここに開示する分配デバイスおよびプロセスを利用して、染色剤沈着（５μＬ／ｉｎ２、１５μＬ／ｉｎ２、２５μＬ／ｉｎ２）を増加させると、エオジン染色強度が増加することを例示する。図５Ｂは、総染色沈着に基づく、エオジン一次染色剤の吸光度を例示する。慣用的な染色装置との比較のため、対照スライド由来の吸光度値を影のバンドで示す。試薬分配デバイスからの染色剤沈着約２５μＬ／ｉｎ２は、慣用的染色装置を用いた２分間のインキュベーション時間と同等の染色を生じる。図５Ｃは、インクジェットプロセスを用いた結腸組織染色を比較し、ここで、エオジンの３つの別個の影が明らかに観察可能であり、そしてこれによって、当業者が組織領域（平滑筋、結合組織、および赤血球）を区別することが可能になる。図５Ｃにおいて、逆方向斜線矢印は、結合組織の明るく染色された領域を示し、順方向斜線矢印は、赤血球の強く染色された領域を示し、そして白い矢印は、血管を取り巻く、中程度に染色された平滑筋を示す。ヘマトキシリンが修飾エオジン配合物で置換されたこと以外は、本明細書記載の方法を用いて、この実験結果を得た。図４Ａ～４Ｅにおけるように、図５Ａ～５Ｃは、染色強度の「ダイヤル合わせ」が、小滴オンデマンド試薬分配プロセスによって可能になり、そしてさらに低体積染色環境が、図５Ｃにおいて明らかであるように、染色の必要な特異性を阻害しないことを立証する。
【0074】
[0088]もちろん、当業者は、例えば２つの一次染色剤（または任意の２つの試薬）を生物学的試料上に沈着させる多工程プロセスにおいて、染色剤を沈着させることも可能であることを認識するであろう。図６Ａおよび６Ｂは、本開示にしたがって、小滴オンデマンド分配デバイスを用いて、ヘマトキシリンおよびエオジン一次染色剤の両方を用いた染色の例示を提供し、ここで、沈着される総染色剤体積は、約８μＬ／ｉｎ２および約１２μＬ／ｉｎ２であった。本出願人らは、多数回の染色剤分配作業が干渉せず、そしてインクジェット技術のために配合されるカスタム試薬が、許容されうる染色結果を提供することを発見した。図６Ａは、その特徴の微細的構造に基づいて、適宜、異なる比のヘマトキシリンおよびエオジンで染色された組織の多数の形態学的領域を伴う、巨視的染色結果を示す。図６Ｂは拡大視野を示し、胚中心のリンパ濾胞に対する高い度合いの核染色、およびこの扁桃腺標本の活性領域間の結合組織における高い度合いのエオジン染色を示す。図６Ｂにおいて、左の矢印は、胚中心（より明るいヘマトキシリン染色）を取り巻くリンパ濾胞（より暗いヘマトキシリン染色）の領域を示し、そして上部右の矢印は、エオジンで強く染色された扁平上皮領域を示す。
【0075】
[0089]Ｄｉｍａｔｉｘ ＤＭＰ－２８３１ Ｍａｔｅｒｉａｌｓプリンターと、Ｄｉｍａｔｉｘ ＤＭＣ－１１６１０プリントカートリッジを用いて、図６Ａおよび６Ｂの実験結果を得た。これらの１６ノズルプリントヘッドからの滴サイズは、約１０ｐＬに固定されることが知られ、そしてプリントジョブの小滴スペーシングは、ヘマトキシリンおよびエオジン両方のプリンティングに関して、約１２７０ｄｐｉに設定された。この染色に関して、本明細書に記載するように、ヘマトキシリンおよびエオジンに関するカスタムインクジェット配合物を開発した。本明細書にさらに示すように、これらの配合物は、いくつかの目的を達成するように設計され、これには：１）流体の物理的特性の設計（すなわち、ジェット形成および小滴離脱（ｂｒｅａｋｏｆｆ）のための、適切な粘性および表面張力の設定）を通じた、分配信頼性および一貫性の改善、２）カートリッジ中の試薬の安定性改善（例えばヘマトキシリン配合物への塩化アルミニウムの導入）、および３）必要なプリンティングパス回数を最小限にするための、配合物の染色強度の増加（例えば、図５Ａ～５Ｃにおいて、最も暗い染色のために２５回のパスが必要であるのに対して、「インクジェットエオジン」の５回のパスで、より暗いエオジン染色が生じる）が含まれる。この実験におけるプリンティングプロセスは、以下の工程：１）ガラススライド上にマウントされた組織切片の位置、形状、およびサイズに関するプリント画像ファイルの生成、２）組織上にプリントしようとする特定の試薬のためのカートリッジおよびプリントヘッドの装填、３）染色プロセスのため、正しいＤＰＩをダイヤル合わせするための、プリントヘッドサーベル角度の設定、４）運動ステージ上への顕微鏡スライドおよび試料の装填、および５）適切な染色強度を発展させるための、望ましい回数の相互作用でのプリントジョブの実行からなった。ヘマトキシリンのためのブルーイング溶液、またはエオジンを区別するための溶液の適用を、手動でオフラインで行った。
【0076】
[0090]いくつかの態様において、液体の薄い境界層に浸透し、そして試料と連絡して染色試薬を補充するよう、任意の試薬を分配可能であるように、試薬沈着デバイスを設定する。いかなる特定の理論に束縛されることも望ましくないが、現在の染色技術は、受動的に拡散して組織試料へ下降する濃度勾配を作る染色試薬のパドルに依存すると考えられる。パドル－組織界面での試薬の能動的な混合を欠くと考えられるこれらの染色システムにおいて、組織内への染色剤拡散は、界面での染色剤濃度枯渇層の構築によって仲介され、染色動力学を制限する。本開示は、（ｉ）枯渇層のものに近い厚みの染色フィルムを生成し；そして（ｉｉ）枯渇層に染色剤分子を補充し、それによって受動染色剤拡散の限界を克服することによって、先行技術の染色技術を改善すると考えられる。
【0077】
[0091]いくつかの態様において、試薬、または試薬を含む組成物を、組織保存液体媒体の薄フィルムを通じて試薬小滴を駆動するために十分な速度で、非混和性液体を通じて分配する。薄フィルム液体の例には、限定されるわけではないが、ｄｒａｋｓｏｌ、ｌｉｎｐａｒ、ミネラルオイル、またはシリコーン油が含まれる。一般的に、好ましい特質には、室温（例えば２０～３０℃）での液体状態、低い表面張力、および低い蒸気圧が含まれる。非混和性バリア層の液体状態によって、バリアを通じた水性液体の再供給が可能である。低い表面張力によって、バリアが、比較的薄いフィルム（高さ１００μｍまたはそれ未満）として試料上にコーティングされることが可能になる。低い蒸気圧によって、バリア層が試料から蒸発する速度が緩慢であることが確実になる。これによって、試薬が非混和性液体の下で連絡する層内に駆動されると考えられる。本態様に関して、小滴の動力学エネルギー（小滴の量および小滴がフィルムにヒットする際の衝撃速度の積）は、保護層の表面張力／エネルギーより大きくなければならず（それに加えて、置換された液体に相当する十分なさらなるエネルギーを提供しなければならず）、例えば約９．５２ｘ１０－１０Ｊより大きくなければならない。いくつかの態様において、動力学エネルギーは、約６．２３ｘ１０－１０Ｊである。さらに、小滴破壊が衝撃に際して起こらないことを確実にするため、小滴のウェーバー数は、約１８未満でなければならない。いくつかの態様において、表面が破壊されたら、小滴が保護層を通じて続いて組織に直接接触することを確実にするため、小滴は保護フィルムより高い密度を持たなければならない。
【0078】
[0092]他の態様において、局所的にパドルを通じて染色剤を液体－組織染色剤枯渇層に運ぶであろう薄フィルム内に、試薬小滴を駆動するために十分な速度で、あらかじめ存在する水性液体「パドル」内に、試薬を分配する。これは、試料と連絡する界面接触ポイントで、試薬の補充を促進するであろうと考えられる。続いて、これは、染色剤枯渇境界層を排除し、そしていくつかの場合、枯渇層を渡る染色試薬の拡散によって仲介される、染色反応動力学を改善すると考えられる。実際、巨大生体分子、例えば抗体に関して、ターゲットへの分子の結合は、時間および濃度によって駆動される。本明細書に開示するデバイス（および固有の混合）での分配を通じて、さらなる試薬材料で薄フィルムを連続的に破壊することによって、組織表面での有効濃度が増進し、そしてより迅速な取り込みを提供すると考えられる。この態様のため、速度は一般的に、約５ｍ／ｓ～約１５ｍ／ｓの範囲である。
【0079】
[0093]図７を参照すると、組織試料を含有する受け入れスライドは、まず、デバイス１１０によって受け取られる。いくつかの態様において、組織試料は、試料と連絡する保護液体層を含有して、試料が乾燥するのを防止する。次いで、試薬を組織切片１２０上に分配する。工程１２０を、染色強度を構築するために必要なだけ多く反復してもよい。いくつかの態様において、試薬を場合によってインキュベーションする１３０。例えば、巨大生体分子に関しては、時間および濃度によって、結合を駆動することも可能である。インキュベーションを伴うまたは伴わない分配を、必要に応じて反復してもよい１３５。いかなる特定の理論によって束縛されることも望ましくないが、分配試薬の添加で薄フィルムを連続して破壊することによって、組織表面での有効濃度が増進し、より迅速な取り込みを生じる。分配後、残った試薬および／または保護フィルムを工程１４０で除去する。いくつかの態様において、試薬および／または保護フィルムの除去は、洗浄溶液を分配して、希釈し、表面張力を増加させ、そして／または粘性を減少させることによって、促進される。次いで、さらなる下流プロセシングまたは分析のため、組織切片を工程１５０で提供する。
【0080】
[0094]図８Ａは、インクジェットまたは他の小滴オンデマンド技術を用いた、自動化方式での、免疫組織化学染色のためのプロセスを例示するさらなるプロセスマップを示す。工程７０１で、受け入れ試料には、脱パラフィン化組織切片、凍結組織切片、または細胞試料が含まれることも可能である。工程７０２は、一般的な試料調製工程（単数または複数）を提供して、任意の以前のプロセス工程から橋渡しする。一般的に、この工程（単数または複数）は、試料内に、一貫した低体積の残渣液体が存在し、そして反応条件（例えば緩衝剤強度、ｐＨ）が、続くインクジェットまたは小滴に基づく染色工程のために適切に設定されていることを確実にするよう設計される。工程７０２での分配作業は、１マイクロリットルから最大１ミリリットルの体積での、試料上への小滴に基づくプロセスまたはバルク液体分配であってもよい。試料上に残る液体の残渣体積を、約１００ｎＬ～約１００μＬの範囲の最終体積まで正確に減少させるため、液体除去部分を設計してもよい。工程７０３は、インクジェットまたは小滴分配技術を通じた、ターゲティングされたタンパク質結合剤の組織への導入を示し、これは、約１ｐＬ～約１００ｎＬの個々の小滴サイズ、単一の小滴程度の小ささから標準的な顕微鏡スライドサイズまでのプリントパターン、および約１００ｄｐｉ～約１３００ｄｐｉまでのプリント密度を含む。
【0081】
[0095]工程７０４は、特定のアッセイ工程に関して、関心対象の試薬と、別の試薬を同時に分配する、場合による実施を示す。小さい小滴に関しては、これは、ほぼ即時の、スライド上での試薬混合を促進し、そして試薬をｉｎ ｓｉｔｕで混合して、反応を誘発するか；比率計測的に生体分子、色素、または基質の濃度を希釈するか；あるいは試料を渡る染色フィールドをホモジナイズする、ユニークな能力を与えると考えられる。工程７０５は、特異的結合相互作用が、分配された試薬およびターゲット試料の間で起こる期間を示す。工程７０６は、組織との反応を通じて、少量の活性結合剤が消費される一方、過剰な液体が能動的にまたは受動的に試料から除去される、組織上に沈着されたプリント小滴に生じる効果を示す。これらの小体積は、パドル染色技術において観察される、予期される拡散枯渇層よりも薄いと考えられるため、これらの反応は、迅速に進行すると考えられ、そしてその結果、さらなる活性結合剤が補充され、望ましい終点または平衡に向かって、反応を迅速に駆動し続けることが可能であると考えられる。
【0082】
[0096]工程７０７は、効率的な反応を駆動し続けるため、さらなる活性結合剤（生体分子または色素）が試料に再供給される手段を示す。この場合、再供給に必要なプリント密度は、元来のプリント適用よりもはるかにより小さい可能性もある。いくつかの態様において、約５０～約１００ｄｐｉの間の小滴密度は、反応を駆動するために十分である可能性もあり、一方、他の態様においては、元来のプリント密度の完全な再プリントが必要でありうる。最後に、工程７０８において、試料はこのアッセイブロックを完了し、そして次のアッセイブロックに移動する準備ができており、次のブロックは、このプロセスの反復であるが、異なる試薬および反応条件を用いてもよいし、あるいは統合デジタル病理ワークフローの一部としての、異なるプロセス、例えば自動化カバースリップ付与または画像化であってもよい。
【0083】
[0097]図８Ｂは、図８Ａのプロセスにしたがった染色由来の結果例を提供する。この例は、４μｍで切片作製された、扁桃腺のＦＦＰＥ切片上への、抗ＣＤ２０一次抗体の沈着結果を例示する。この特定の例で用いるインクジェット試薬を、本明細書にさらに記載する。一般的に、プロセスは、一次抗体、二次抗体、酵素仲介検出用のリンカー、検出反応を駆動するための酵素、または特異的に連結された酵素に対する基質に適用可能である。本明細書記載のプロセスは、Ｌｉら（Ｓｍａｌｌ， ２０１６， １２， Ｎｏ．８， １０３５－１０４３）に記載されるような、「周期的排出－補充」技術の背後にある理論の非自明な延長である。実際、本明細書に記載するプロセスは、試薬の再供給が、インクジェットプリントヘッドを通じて、組織内へ、ゼロではない速度（この例では、およそ８ｍ／ｓ）で導かれるという意味で、Ｌｉによって記載されるプロセスのいくつかの限界を克服すると考えられる。さらに、Ｌｉによる研究において、焦点は、周期的混合プロセスにある一方、本開示においては、能動的（例えばエアフロー）または受動的（例えば蒸発）プロセスのいずれかを用いて、過剰な液体を排出しつつ、色素または生物学的物質を、インクジェットヘッドでのさらなるプリントパスを通じて再供給する（図８Ａの工程７０７を参照されたい）。これは、続いて、拡散仲介プロセス（緩慢であり、パドルに基づく染色技術に特徴的）から、結合動力学仲介プロセス（迅速であり、枯渇層が生体分子または色素を能動的に再供給可能である、小滴沈着およびフィルムに基づく染色技術に特有）へ、反応速度を駆動すると考えられる。
【0084】
[0098]図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、本明細書に開示する小滴オンデマンドシステムおよび方法を用いて、一次抗体沈着を通じて達成される染色をさらに例示する。一般的に、図９Ａ、９Ｂ、および９Ｃは、扁桃腺組織に対して、抗ＣＤ－２０抗体を用い、小滴オンデマンドプロセスを用いて、沈着した一次抗体の例を示す。図９Ａは、混合薄フィルムパドルに対する静置薄フィルムパドルに関する染色強度を比較する。この場合、フィルム内への液体のジェッティングを通じて混合される薄フィルムは、より低い総抗体曝露（μＬｘ時間）にもかかわらず、より高い染色強度を生じた。これらの示差的結果を駆動する機構の詳細を図８Ａに例示する。図９Ｂおよび９Ｃは、本明細書の染色プロセスにしたがって染色された扁桃腺組織の領域を示し、ここで、図９Ｂに関しては、パラメータは以下のとおりである：１４．４μＬ／ｉｎ２（１２００ｄｐｉ、１０ｐＬ滴、単回プリントヘッドパス）、静置フィルム、１６分間インキュベーション時間。図９Ｃに関しては、パラメータは以下の通りである：３．６μＬ／ｉｎ２（６００ｄｐｉ、１０ｐＬ滴サイズ、単回プリントヘッドパス）、４分間インキュベーション時間、抗体の４００ｎＬ／ｉｎ２（２００ｄｐｉ、１０ｐＬ滴サイズ、単回プリントヘッドパス）の薄フィルムへの添加を通じた混合、その後、さらに４分間のインキュベーション、その後２回のさらなる混合工程。
【0085】
[0099]図１０Ａ～１０Ｃは、本開示にしたがって小滴オンデマンド沈着プロセスを用いて沈着された一次抗体の沈着のさらなる例を提供する（抗ＣＤ２０、扁桃腺組織）。図１０Ａ～１０Ｃは、インクジェットまたは小滴沈着技術が、結合動力学がターゲット上に沈着される試薬量によって駆動されるように、十分に小さい液体体積を提供することをさらに確認する。図１０Ａは、２つの異なる体積の薄フィルムパドルに関する染色強度を比較して、インクジェット薄フィルムプロセスに関する抗体結合が、沈着される抗体の量によって、仲介されることを立証する（すなわち、ＣＤ２０シグナル強度は、組織に沈着される一次抗体の量の関数として増加する）。図１０Ｂおよび１０Ｃは、図１０Ａからそれぞれのプロセスで染色される扁桃腺の領域である。簡潔には、図１０Ｂに関して、試薬１４．４μＬ／ｉｎ２（１２００ｄｐｉ、１０ｐＬ滴、単回プリントヘッドパス）を組織切片上への静置フィルムとしてパターン形成し、そして１６分間室温でインキュベーションした。図１０Ｃに関しては、試薬２８．８μＬ／ｉｎ２（１２００ｄｐｉ、１０ｐＬ滴、２回のプリントヘッドパス）を組織切片上への静置フィルムとしてパターン形成し、そして１６分間室温でインキュベーションした。図１０Ａ～１０Ｃを調製するために用いた抗体配合物を、本明細書にさらに記載する。
【0086】
[00100]本開示の別の側面において、本出願人らは、本開示の分配デバイスが、関心対象の組織領域を同定し、そして染色剤を生物学的試料の領域に選択的に適用可能であるように、試薬沈着のｘ－ｙ空間制御を可能にすることを見出した。いくつかの態様において、試料内の特定の領域または細胞を試薬で処理可能であるように、本明細書記載の分配デバイスを画像化システムと組み合わせる。本開示の別の側面において、（ａ）組織試料を画像化し；（ｂ）試薬の適用のため、組織の特定の領域を選択し；そして（ｃ）圧電沈着システムで、組織の特定の領域に、試薬を沈着させる工程を含む、組織標本の特定の領域に、少なくとも１つの試薬を適用する方法を開示する。いくつかの態様において、約３６０ｎＬ／ｉｎ２（６００ｄｐｉ、１ｐＬ／滴）から約１４．４μＬ／ｉｎ２（１２００ｄｐｉ、１０ｐＬ／滴）の間の試薬を、沈着システムのパスを通じて、組織の特定の領域に適用する。
【0087】
[00101]例えば、図１１は、開示するインクジェット染色プロセスを用いて可能になる、空間沈着／多重化によって、特に可能になる、「スライド上の組織パネル」態様を例示する。図１１を参照して、ＩＨＣ染色用の抗体（標識されたＩＨＣ１およびＩＨＣ４）を、同時に、隣接する組織切片上でインキュベーションする。同時に、一次染色（標識されたＨ＆Ｅ）をスライド上の別の領域で調製する。一次抗体とインキュベーションした後、同じまたは異なる検出化学反応を、ＩＨＣ組織切片上で用いてもよく、これは、一次抗体が、スライド上の異なる組織切片上で空間的に分離されているためである。これは、より迅速なアッセイターンアラウンド時間ならびに単一スライド上での完全診断パネルの利便性を促進すると考えられる。いくつかの態様において、やはり図１１を参照して、３つのＩＨＣマーカー乳房パネルを単一スライド上で実行し、乳癌を表現型決定するための３つの診断ＩＨＣマーカー（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）各々を通じた、一次染色剤での形態学的染色からの病理学者ワークフローを容易にすることも可能である。
【0088】
[00102]試薬組成
[00103]概説
[00104]当業者は、本明細書記載の試薬沈着デバイスおよびプロセスを用いて、任意のタイプの試薬または試薬組成物を、分配してもよいことを認識するであろう。例えば、いくつかの態様において、分配デバイスから分配される試薬は、一次染色剤、例えばヘマトキシリンまたはエオジンである。他の態様において、デバイスから分配される試薬は、組織化学において有用な抗体（例えば一次および二次抗体）、抗体または抗体コンジュゲート（例えば酵素コンジュゲート化抗体、あるいはフルオロフォア、ハプテン、または他の標識にコンジュゲートされた抗体）を含む組成物、および／または抗体または抗体－ターゲット複合体を検出するための検出試薬（例えば、発色原基質、一次抗体にコンジュゲートされた標識に特異的な二次抗体等を含む組成物）である。
[00103]概説
[00104]当業者は、本明細書記載の試薬沈着デバイスおよびプロセスを用いて、任意のタイプの試薬または試薬組成物を、分配してもよいことを認識するであろう。例えば、いくつかの態様において、分配デバイスから分配される試薬は、一次染色剤、例えばヘマトキシリンまたはエオジンである。他の態様において、デバイスから分配される試薬は、組織化学において有用な抗体（例えば一次および二次抗体）、抗体または抗体コンジュゲート（例えば酵素コンジュゲート化抗体、あるいはフルオロフォア、ハプテン、または他の標識にコンジュゲートされた抗体）を含む組成物、および／または抗体または抗体－ターゲット複合体を検出するための検出試薬（例えば、発色原基質、一次抗体にコンジュゲートされた標識に特異的な二次抗体等を含む組成物）である。
【0089】
[00105]いくつかの態様において、試薬または試薬を含む組成物を修飾し、市販の試薬またはこうした試薬を含む組成物と比較して、インクジェット沈着装置または圧電沈着装置を通じた送達および分配をよりよく促進させる。例えば、試薬または試薬を含む組成物を、特定の密度、ｐＨ、粘性、またはレオロジーを有するように改変してもよい。いくつかの態様において、任意の試薬組成物は、緩衝剤、レオロジー修飾剤、界面活性剤、キャリアータンパク質、安定化剤、粘性修飾剤、保水剤、保存剤、および他の添加物の１またはそれより多くを含んでもよい。当業者は、適切な量で適切な構成要素を選択して、インクジェット技術を用いた分配を実現するために望ましい特性を有する試薬組成物を提供することが可能であろう。
【0090】
[00106]いくつかの態様において、本開示の試薬組成物は、ようなレオロジー、すなわち溶液の「流動」を有し、圧膜（ｐｉｅｚｏ－ｍｅｍｂｒａｎｅ）の１単位の励起の下に、試薬の単一小滴を促進する。実際、本開示の試薬溶液は、（ｉ）適切な染色を可能にし、（ｉｉ）安定な薄フィルムを形成可能であり；そして（ｉｉｉ）圧電沈着を通じて分散可能であるように、開発されている。いくつかの態様において、試薬組成物は、約１ｇ／ｍＬより大きい密度を有する。他の態様において、試薬組成物は、約０．７５ｇ／ｍＬ～約１．５ｇ／ｍＬの間の密度を有する。
【0091】
[00107]いくつかの態様において、試薬組成物の粘性は、約１ｃｐ～約４０ｃｐの範囲である。他の態様において、試薬組成物の粘性は、約４ｃｐ～約１５ｃｐの範囲である。さらに他の態様において、試薬組成物の粘性は、約６ｃｐ～約１０ｃｐの範囲である。いくつかの態様において、試薬組成物の表面張力は、約２０ダイン／ｃｍ～約７０ダイン／ｃｍの範囲である。他の態様において、試薬組成物の表面張力は、約２０ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの範囲である。さらに他の態様において、試薬組成物の表面張力は、約２０ダイン／ｃｍ～約３５ダイン／ｃｍの範囲である。
【0092】
[00108]一般的に、任意の試薬組成物において使用するための粘性修飾剤は、グリコール、例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリコールエーテル、酢酸グリコールエーテル；糖および多糖、例えばグアーガム、キサンタンガム；セルロースおよび修飾セルロース、例えばヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、プロピルメチルセルロース、メトキシセルロース、メトキシメチルセルロース、メトキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシルエチルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエチルエーテル、およびキトサンより選択される。
【0093】
[00109]いくつかの態様において、本開示の組成物はまた、１またはそれより多い低揮発性水溶性保水剤も含んでもよい。保水剤の代表的な例には：（１）トリオール、例えば；グリセロール、１，２，６－ヘキサントリオール、２－エチル－２－ヒドロキシメチル－プロパンジオール、トリメチロールプロパン、アルコキシル化トリオール、アルコキシル化ペンタエリスリトール、糖類、および糖アルコール；ならびに（２）ジオール、例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、４またはそれより多い酸化アルキレン基を有するポリアルキレングリコール、１，３－プロパンジオール（ｄｉａｌ）、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、１，２－ペンタンジオール、１，５－ペンタンジオール、１，２－ヘキサンジオール、１，６－ヘキサンジオール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、１，２－ヘプタンジオール、１，７－ヘキサンジオール、２－エチル－１，３－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール、２，２，４－トリメチル－１，３－ペンタンジオール、１，８－オクタンジオール；ならびにチオグリコールまたはその混合物が含まれる。望ましい保水剤は、多価アルコールである。
【0094】
[00110]いくつかの態様において、試薬組成物は、１またはそれより多い安定化剤を含む。一般的に、安定化剤は、ヨウ素酸ナトリウム、塩化アルミニウム六水和物、硫酸アルミニウム十六水和物、およびタンパク質安定化剤（例えばトレハロース、グリセロール、グロブリン、ＢＳＡ等）より選択されてもよい。１またはそれより多い安定化剤を包含すると、試薬分子の沈殿が防止可能であると考えられる。例えば、溶液から沈殿することが当該技術分野から知られるヘマトキシリンを１またはそれより多い安定化剤と配合して、溶液からの沈殿を軽減させるかまたは防止し、そしてしたがって、試薬ラインまたはプリント／インクジェット分配ヘッドの目詰まりを回避することも可能である。
【0095】
[00111]いくつかの態様において、表面張力修飾剤は、界面活性剤である。界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはその混合物の１つであってもよい。いくつかの態様において、適切な界面活性剤は、（ｉ）他の試薬構成要素と組み合わせた際、望ましい表面張力が達成されることを可能にし；（ｉｉ）タンパク質または他の試薬構成要素を変性させず；そして／または（ｉｉｉ）低い泡高を提供するように、選択される。
【0096】
[00112]陰イオン性界面活性剤は、一般的に、硫酸塩、スルホン酸塩、リン酸塩、またはカルボン酸塩に基づき、そして水溶性陽イオンを含有する。スルホン酸塩の代表的な式は、Ｒ－ＳＯ３Ｍであり、式中、Ｒは、スルホン酸官能性にアルコキシまたはオキシアルコキシを通じて連結されていてもよい約５～２２炭素原子の炭化水素基であり、そしてＭはアルカリ金属などの水溶性陽イオンである。陰イオン性界面活性剤には、硫酸アルキルエーテル、硫酸およびスルホン酸アルキル、カルボン酸アルキル、硫酸アルキルフェニルエーテル、スルホン酸アルキルポリ（オキシエチレン）のナトリウム塩、スルホン酸アルキルベンジルのナトリウム塩、例えばスルホン酸ドデシルベンジルのナトリウム塩およびラウリルエーテル硫酸ナトリウムである。陰イオン性界面活性剤にはまた、陰イオン性リン酸エステルも含まれる。
【0097】
[00113]いくつかの態様において、界面活性剤には、限定されるわけではないが、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが含まれ、ここでアルキルは（ＣＨ２）Ｍであり、そしてオキシエチレンは（Ｃ２Ｈ４Ｏ）Ｎであり、式中、Ｍは５～１６、８～１４、または１０～１２の整数であり、そしてＮは１０～４０、１５～３０、または２０～２８の整数である。１つの態様において、界面活性剤は、式（Ｃ２Ｈ４Ｏ）２３Ｃ１２Ｈ２５ＯＨを有するポリオキシエチレンラウリルエーテルである。別の態様において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノアルキレートであり、モノアルキレートは８～１４の間の炭素を含む。別の態様において、界面活性剤は、式Ｃ１２－１４Ｈ２５－２９Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｘを有する直鎖二級アルコールポリオキシエチレンであり、式中、ｘは２～１２の間の整数に等しい。さらに別の態様において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルである。例示的な界面活性剤は、名称：Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ、ＴｒｉｔｏｎＴＭ、ＥｃｏｓｕｒｆＴＭ、ＤｏｗｆａｘＴＭ、ポリソルベート８０ＴＭ、ＢｉｇＣＨＡＰ、デオキシＢｉｇＣＨＡＰ、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）、サポニン、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）、プルロニックＦ－６８、ジギトニン、デオキシコール酸塩等である。特定の開示する作業態様は、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ、ＴｒｉｔｏｎＴＭの名の下に販売されている。
【0098】
[00114]本開示の組成物において有用な陽イオン性界面活性剤は、アミノまたは四級アンモニウム部分を含有する。本明細書で有用なものの陽イオン性界面活性剤は、以下の文書に開示される：Ｍ．Ｃ． Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ， Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ＆ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ， （Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｅｄｉｔｉｏｎ １９７９）； Ｓｃｈｗａｒｔｚら； Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ， Ｔｈｅｉｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９４９；米国特許第３，１５５，５９１号、Ｈｉｌｆｅｒ、１９６４年１１月３日発行；米国特許第３，９２９，６７８号、Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７５年１２月３０日発行；米国特許第３，９５９，４６１号、Ｂａｉｌｅｙら、１９７６年５月２５日発行；および米国特許第４，３８７，０９０号、Ｂｏｌｉｃｈ， Ｊｒ．、１９８３年６月７日発行。
【0099】
[00115]本明細書で有用な四級アンモニウム含有陽イオン性界面活性剤物質には以下の一般式のものがある：
【0100】
【化1】
【0101】
[00116]式中、Ｒ１～Ｒ４は、独立に、約１～約２２炭素原子の脂肪族基、あるいは約１～約２２炭素原子を有する芳香族、アルコキシ、ポリオキシアルキレン、アルキルアミド、ヒドロキシアルキル、アリールまたはアルキルアリール基であり；そしてＸは、ハロゲン（例えば塩素、臭素）、酢酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、リン酸硝酸、硫酸、およびアルキル硫酸ラジカルより選択されるものなどの塩形成性陰イオンである。脂肪族基は、炭素および水素原子に加えて、エーテル結合、および他の基、例えばアミノ基を含有してもよい。より長鎖の脂肪族基、例えば約１２炭素またはそれより多いものは、飽和されていてもまたは不飽和であってもよい。特に好ましいのは、モノ長鎖（例えばモノＣ１２～Ｃ２２、好ましくはＣ１２～Ｃ１８、より好ましくはＣ１６、脂肪族、好ましくはアルキル）、ジ短鎖（例えばＣ１～Ｃ３アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ２アルキル）四級アンモニウム塩である。
【0102】
[00117]一級、二級および三級脂肪アミンの塩もまた、適切な陽イオン性界面活性物質である。こうしたアミンのアルキル基は、好ましくは約１２～約２２炭素原子を有し、そして置換されていてもまたは未置換であってもよい。本明細書で有用なこうしたアミンには、ステアルアミドプロピルジメチルアミン、ジエチルアミノエチルステアルアミド、ジメチルステアルアミン、ジメチルソイアミン、ソイアミン、ミリスチルアミン、トリデシルアミン、エチルステアリルアミン、Ｎ－タロウプロパンジアミン、エトキシル化（酸化エチレン５モルを伴う）ステアリルアミン、ジヒドロキシエチルステアリルアミン、およびアラキジルベヘニルアミンが含まれる。適切なアミン塩には、ハロゲン、酢酸、リン酸、硝酸、クエン酸、乳酸、およびアルキル硫酸塩が含まれる。こうした塩には、ステアリルアミン塩酸、塩化ソイアミン、ギ酸ステアリルアミン、二塩化Ｎ－タロウプロパンジアミン、クエン酸ステアルアミドプロピルジメチルアミン、塩化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化ジセチルジアンモニウムが含まれる。本明細書の組成物において使用するために好ましいのは、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウム、塩化ジセチルジメチルアンモニウム、塩化ジココジメチルアンモニウムおよびその混合物である。より好ましいのは、塩化セチルトリメチルアンモニウムである。
【0103】
[00118]本開示の組成物にはまた、多様な非イオン性界面活性剤も含まれてもよい。適切な非イオン性界面活性剤の中には、糖またはデンプンポリマーと、Ｃ８－Ｃ３０アルコールの縮合産物がある。これらの化合物は、式（Ｓ）ｎ－Ｏ－Ｒによって示され、式中、Ｓは糖部分、例えばグルコース、フルクトース、マンノース、およびガラクトースであり；ｎは約１～約１０００の整数であり、そしてＲはＣ８－Ｃ３０アルキルである。Ｒ基が由来していてもよい適切なＣ８－Ｃ３０アルコールの例には、デシルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール等が含まれる。これらの界面活性剤の特定の例には、デシルポリグルコシドおよびラウリルポリグルコシドが含まれる。
【0104】
[00119]他の適切な非イオン性界面活性剤には、酸化アルキレンと脂肪酸の縮合産物が含まれる（すなわち脂肪酸の酸化アルキレンエステル）。これらの物質は、一般式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＨを有し、式中、Ｒは、Ｃ１０－Ｃ３０アルキルであり、Ｘは－ＯＣＨ２ＣＨ２－（酸化エチレン由来）または－ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３－（酸化プロピレン由来）であり、そしてｎは、約１～約２００の整数である。
【0105】
[00120]さらに他の適切な非イオン性界面活性剤は、式ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＯＣＲを有する酸化アルキレンと脂肪酸の縮合産物であり（すなわち脂肪酸の酸化アルキレンジエステル）、式中、ＲはＣ１０－Ｃ３０アルキルであり、Ｘは－ＯＣＨ２ＣＨ２－（酸化エチレン由来）または－ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３－（酸化プロピレン由来）であり、そしてｎは、約１～約２００の整数である。さらに他の非イオン性界面活性剤は、一般式Ｒ（Ｘ）ｎＯＲ’を有する酸化アルキレンと脂肪アルコールの縮合産物であり（すなわち脂肪アルコールの酸化アルキレンエーテル）、式中、ＲはＣ１０－Ｃ３０アルキルであり、ｎは、約１～約２００の整数であり、そしてＲ’は、ＨまたはＣ１０－Ｃ３０アルキルである。
【0106】
[00121]さらに他の非イオン性界面活性剤は、式、ＲＣＯ（Ｘ）ｎＯＲ’を有する化合物であり、式中、ＲおよびＲ’は、Ｃ１０－Ｃ３０アルキルであり、Ｘは－ＯＣＨ２ＣＨ２－（酸化エチレン由来）または－ＯＣＨ２ＣＨＣＨ３－（酸化プロピレン由来）であり、そしてｎは、約１～約２００の整数である。酸化アルキレン由来非イオン性界面活性剤の例には、セテス－１、セテス－２、セテス－６、セテス－１０、セテス－１２、セテアレス－２、セテアレス６、セテアレス－１０、セテアレス－１２、ステアレス－１、ステアレス－２、ステアレス－６、ステアレス－１０、ステアレス－１２、ステアリン酸ＰＥＧ－２、ステアリン酸ＰＥＧ４、ステアリン酸ＰＥＧ６、ステアリン酸ＰＥＧ－１０、ステアリン酸ＰＥＧ－１２、グリセリルステアリン酸ＰＥＧ－２０、グリセリルタロウ酸ＰＥＧ－８０、グリセリルステアリン酸ＰＰＧ－１０、グリセリルココ酸ＰＥＧ－３０、グリセリルココ酸ＰＥＧ－８０、グリセリルタロウ酸ＰＥＧ－２００、ジラウリル酸ＰＥＧ－８、ジステアリン酸ＰＥＧ－１０、およびその混合物が含まれる。さらに他の有用な非イオン性界面活性剤には、例えば本明細書に援用される米国特許第２，９６５，５７６号、第２，７０３，７９８号、および第１，９８５，４２４号に開示されるポリヒドロキシ脂肪酸アミドが含まれる。
【0107】
[00122]例示的な界面活性剤には、Ｔｏｍａｄｏｌ １２００（Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｏｍａｄｏｌ ９００（Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｏｍａｄｏｌ ９１－８（Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｏｍａｄｏｌ １－９（Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ １５－Ｓ－９（Ｓｉｇｍａ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ １５－Ｓ－１２（Ｓｉｇｍａ）、Ｍａｓｕｒｆ ＮＲＷ－Ｎ（Ｐｉｌｏｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｂｉｏ－Ｓｏｆｔ Ｎ９１－６（Ｓｔｅｐａｎ）、およびＢｒｉｊ－３５（ポリエチレングリコールドデシルエーテル）（Ｓｉｇｍａ）が含まれる。
【0108】
[00123]染色液のプリンティング前に、組織に固有の反応条件が、開示する染色法に関して、染色品質に影響を及ぼすことを示すため、顕微鏡スライド上にマウントされた４μｍ肝臓切片において、ヘマトキシリンのプリンティング前の異なる組織ｐＨの体系的研究を行った。組織に３００μＬの緩衝溶液を適用し、そして次いで、第一の「洗浄（場合によるｐＨ洗浄）適用」工程中、表８に記載するアッセイを用いて、試料上にヘマトキシリンおよびエオジンをプリンティングすることによって、組織切片のｐＨを設定した。図１２Ａは、組織の細胞質および細胞外領域の染色強度に対する、核における染色強度の比を比較する。これらの値の最適な比は、最適な染色条件に相当し、そしてｐＨ増加に関して、全体の染色強度が増加すると仮定された（核に特異的なものおよび非特異的なヘマトキシリン染色の両方が増加するはずである）。ｐＨがある点まで増加するにつれて、染色強度が全体的に増加するのは事実であるが、スケールの最高点、５のｐＨを持つ染色前緩衝液に関しては、全体の染色強度は許容しえないレベルまで減少した（図１２Ｂ）。したがって、次に最適な条件、３．５のｐＨの染色前緩衝液を選択した。この方法は、ユニークな組織タイプまたは異なる染色化学反応および生化学反応に関して、染色前組織緩衝条件をユニークに調節するよう拡張可能であった。
【0109】
[00124]表２は、２プリントヘッドシステムが、組織に緩衝ｐＨ溶液を送達する能力を詳述する。１つの態様において、分配しようとする溶液は、弱酸溶液および希水酸化ナトリウムである。この場合、各液体のプリントパターンのＤＰＩを調節することによって、分配フィルムのｐＨを調節可能であった。これは、ヘマトキシリンプリンティング前の組織のｐＨが、染色強度および染色特異性の両方に影響を有することが見て取れる図１２Ｂと関連する。インクジェット染色のこの適用は、プリント沈着中の２つの溶液のｉｎ ｓｉｔｕ混合のこの必要性を満たすために適している。
【0110】
表２：組織ｐＨを設定する緩衝系の比率計測配合
【0111】
【表2】
【0112】
[00125]一次染色試薬組成物
[00126]一次染色試薬組成物の関連において、組成物は、色素、染色剤、または「一次染色剤」（この用語が本明細書に定義される通り）、粘性修飾剤、および表面張力修飾剤を含む。本明細書の特定の態様または例は、ヘマトキシリンまたはエオジンを含む一次染色組成物を指すことも可能であるが、当業者は、一次染色試薬組成物が、これらの特定の色素に限定されず、そして他の色素、染色剤、「一次染色剤」、または別の方式で、組織試料中の生物学的構造の視覚的コントラストを増進する剤が、限定なしに、同様の方式で配合可能であることを認識するであろう。
[00126]一次染色試薬組成物の関連において、組成物は、色素、染色剤、または「一次染色剤」（この用語が本明細書に定義される通り）、粘性修飾剤、および表面張力修飾剤を含む。本明細書の特定の態様または例は、ヘマトキシリンまたはエオジンを含む一次染色組成物を指すことも可能であるが、当業者は、一次染色試薬組成物が、これらの特定の色素に限定されず、そして他の色素、染色剤、「一次染色剤」、または別の方式で、組織試料中の生物学的構造の視覚的コントラストを増進する剤が、限定なしに、同様の方式で配合可能であることを認識するであろう。
【0113】
[00127]いくつかの態様において、粘性修飾剤の量は、一次染色試薬組成物の総重量の約３５％～約６０％の範囲である。他の態様において、粘性修飾剤の量は、一次染色試薬組成物の総重量の約２５％～約７５％の範囲である。溶解された固体が含まれる（例えばＰＥＧ）、いくつかの態様において、粘性修飾剤の量は、一次染色試薬組成物の総重量の約２％～約６０％の範囲であってもよい。溶解された固体が含まれる、他の態様において、粘性修飾剤の量は、一次染色試薬組成物の総重量の約０．１％～約２％の範囲であってもよい。
【0114】
[00128]いくつかの態様において、表面張力修飾剤の量は、一次染色試薬組成物の総重量の約０．０１％～約０．５％の範囲である。他の態様において、表面張力修飾剤の量は、一次染色試薬組成物の総重量の約０．００１％～約１％の範囲である。
【0115】
[00129]いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、１ｃｐ～約４０ｃｐの粘性を有する。他の態様において、一次染色試薬組成物は、６ｃｐ～約１０ｃｐの粘性を有する。いくつかの態様において、一次染色試薬組成物は、最大約７０ダイン／ｃｍの表面張力を有する。他の態様において、一次染色試薬組成物は、約２５ダイン／ｃｍ～約４５ダイン／ｃｍの表面張力を有する。
【0116】
[00130]いくつかの態様において、一次染色試薬溶液は、１またはそれより多い安定化剤および／または緩衝剤をさらに含む。いくつかの態様において、安定化剤には、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウムが含まれる。いくつかの態様において、緩衝剤には、酢酸、炭酸、リン酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸、ｔｒｉｓ緩衝剤、およびリン酸緩衝剤が含まれる。一般的に、任意の一次染色試薬組成物内に含まれる安定化剤の量は、一次試薬染色組成物の総重量の約１％～約２０％の範囲である。同様に、任意の一次染色試薬組成物内に含まれる緩衝剤の量は、一次試薬染色組成物の総重量の約０．５％～約５％の範囲である。
【0117】
[00131]巨大分子試薬組成物
[00132]いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、生物学的分子（例えば抗体、抗体コンジュゲート、酵素、マルチマー等）、粘性修飾剤、および表面張力修飾剤を含む。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、１またはそれより多いキャリアータンパク質（例えばウシ血清アルブミン、正常ヤギ血清）をさらに含む。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、緩衝剤および／または保存組成物をさらに含む。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、最大約１５ｃｐまでの範囲の粘性を有する。他の態様において、巨大分子試薬組成物は、約４ｃｐ～約１１ｃｐの範囲の粘性を有する。さらなる態様において、巨大分子試薬組成物は、約４ｃｐ～約７ｃｐの範囲の粘性を有する。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。他の態様において、巨大分子試薬組成物は、約２５ダイン／ｃｍ～約３５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。
[00132]いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、生物学的分子（例えば抗体、抗体コンジュゲート、酵素、マルチマー等）、粘性修飾剤、および表面張力修飾剤を含む。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、１またはそれより多いキャリアータンパク質（例えばウシ血清アルブミン、正常ヤギ血清）をさらに含む。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、緩衝剤および／または保存組成物をさらに含む。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、最大約１５ｃｐまでの範囲の粘性を有する。他の態様において、巨大分子試薬組成物は、約４ｃｐ～約１１ｃｐの範囲の粘性を有する。さらなる態様において、巨大分子試薬組成物は、約４ｃｐ～約７ｃｐの範囲の粘性を有する。いくつかの態様において、巨大分子試薬組成物は、約２０ダイン／ｃｍ～約４０ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。他の態様において、巨大分子試薬組成物は、約２５ダイン／ｃｍ～約３５ダイン／ｃｍの範囲の表面張力を有する。
【0118】
[00133]いくつかの態様において、粘性修飾剤の量は、巨大分子試薬組成物の総重量の約１％～約５０％の範囲である。他の態様において、粘性修飾剤の量は、巨大分子試薬組成物の総重量の約２５％～約７５％の範囲である。いくつかの態様において、表面張力修飾剤の量は、巨大分子試薬組成物の総重量の約０．０１％～約０．５％の範囲である。他の態様において、表面張力修飾剤の量は、巨大分子試薬組成物の総重量の最大約１％の範囲である。当業者は、任意の含まれるキャリアータンパク質および／または一次抗体自体が、表面張力に影響を有する可能性があり、そしていくつかの態様において、表面張力の減少に寄与しうることを認識するであろう。当業者は、抗体試薬組成物内に含める、任意の表面張力修飾剤の量を決定する際に、この要素を考慮に入れることが可能であろう。
【0119】
[00134]任意の巨大分子試薬組成物の部分でありうる抗体の限定されない例には、分化マーカーのクラスター（例えばＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ２５、ＣＤ１６３等）、Ｋｉ－６７、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＰＶ、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＯＸ－４０、ＰＤ－１、ＩＤＬ－１、ＦｏｘＰ３、およびＣＴＬＡ－４に特異的な抗体が含まれる。
【0120】
[00135]任意の巨大分子試薬組成物の一部でありうる酵素の限定されない例には、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、またはβ－ラクタマーゼが含まれる。
【実施例】
【0121】
[00136]
[00137]続く限定されない例は、本開示の特定の態様をさらに例示することを意図する。
[00138]実施例１－ヘマトキシリン配合物
表３：ヘマトキシリン配合物の１つの態様
[00137]続く限定されない例は、本開示の特定の態様をさらに例示することを意図する。
[00138]実施例１－ヘマトキシリン配合物
表３：ヘマトキシリン配合物の１つの態様
【0122】
【表3】
【0123】
[00139]実施例１の組成は、開示する圧電沈着法による分散に十分であることが見出された。組成物の最終ｐＨは約２．２２であり；表面張力は約３０ダイン／ｃｍであり；そして粘性は約５ｃｐであった。
【0124】
[00140]インクジェット分配のためのヘマトキシリンの場合、いくつかの軽減が、この特定の染色剤の分配のための小滴形成プロセスの信頼性およびロバストネスを改善することが発見された。まず、配合物中の塩化アルミニウムの包含は、長鎖金属イオン複合体の不溶性による、自発的凝集および沈殿に対して、配合物の全体の安定性を改善した。
【0125】
[00141]第二に、より高い水分画を含む配合物に比較した際、混合物の蒸気圧を低下させることによって、空気に曝露した際、プロピレングリコールのかなりの分画が、ヘマトキシリン配合物の乾燥を減少させた。これらの改善はどちらも、インクジェット型要因にユニークに適したヘマトキシリン配合物を生成する際にターゲティングされる、非標準（または非伝統的）配合物特性を代表した。
【0126】
[00142]インクジェット技術を含む機能的プリンティングの分野に共通するのは、別の液体で使用した後、プリントヘッドを通じてインクのかなりの体積をフラッシュして、システムをプライミングする必要があることである。これは、多数のインクリザーバーを通じてフィードされるプリントヘッドシステムの設計、およびその結果の大きなデッドボリュームから生じる。いくつかの設計において、これは、インクの２０％を超えるロスに相当しうる。同様に、ＶＥＮＴＡＮＡ ＨＥ ６００システムは、共有試薬マニホールドを有し、そしてパージ／プライムサイクル中、総アッセイ体積の３０％を超える量が消費される。インクジェット分配装置に関する開示される概念において、出願人らは、これらの限界を克服する、カートリッジに基づくインクジェットシステムを利用した。プリンティングシステムにユニークな、そしてこれに合わせてカスタマイズされた試薬の補完的な配合物を調製することによって、ノズル汚染（すなわち小滴分配の失敗）の多くの供給源が軽減された。しかし、インクジェット試薬カートリッジの毎日の使用全体で、そして試薬インクジェットカートリッジの全寿命に渡って、信頼性がある分配完全性を維持するためには、１日あたり５μＬまたはそれ未満のプライムサイクルが適切であることもまた立証された。
【0127】
[00143]実施例２－抗体配合物
表４：抗体配合物の１つの態様
表４：抗体配合物の１つの態様
【0128】
【表4】
【0129】
[00144]実施例２の組成物は、開示する圧電沈着法による分散に十分であることが見いだされた。表面張力は、約２８ダイン／ｃｍであり；そして粘性は約７ｃｐであった。
[00145]実施例３－エオジン配合物
表５：エオジン配合物の１つの態様
[00145]実施例３－エオジン配合物
表５：エオジン配合物の１つの態様
【0130】
【表5】
【0131】
[00146]実施例３の組成物は、開示する圧電沈着法による分散に十分であることが見いだされた。組成物の最終ｐＨは約４．２９９であり；表面張力は約４１ダイン／ｃｍであり；密度は１．０４２ｇ／ｍＬであり；そして粘性は約８．１ｃｐであった。
【0132】
[00147]実施例４－酵素／マルチマー検出配合物
[00148]表５は、酵素／またはマルチマー検出配合物の態様を示す。この特定の限定されない態様において、活性染色構成要素は、マウス抗ヒドロキノン西洋ワサビペルオキシダーゼ（抗ＨＱ ＨＲＰ）であった。
[00148]表５は、酵素／またはマルチマー検出配合物の態様を示す。この特定の限定されない態様において、活性染色構成要素は、マウス抗ヒドロキノン西洋ワサビペルオキシダーゼ（抗ＨＱ ＨＲＰ）であった。
【0133】
表６：酵素／マルチマー検出配合物の１つの態様
【0134】
【表6】
【0135】
[00149]実施例５－巨大分子量粘性修飾剤を含む、代替抗体配合物
[00150]本開示にしたがった代替抗体配合物を表７に示す。
表７：代替抗体配合物
[00150]本開示にしたがった代替抗体配合物を表７に示す。
表７：代替抗体配合物
【0136】
【表7】
【0137】
[00151]実施例６－インクジェット沈着染色法への伝統的な染色法の比較
[00152]本明細書に示すのは、慣用的な単一スライド染色（表９）システムおよび本開示に記載する小滴オンデマンド分配手段（表８）からのアッセイ例の比較である。どちらのアッセイ表も、オフライン脱パラフィン化プロセスならびにアッセイ完了後にカバースリップを掛ける手動ワークアップを仮定する。Ｈ＆Ｅ染色用のＶＥＮＴＡＮＡ ＨＥ ６００アッセイ（慣用的な単一スライド染色装置に相当する）は、インキュベーション時間のみを用いて、染色を調節する「ダイヤル合わせ」が可能である一方、インクジェット染色プロセスは、小滴沈着（すなわちインクジェット）染色プロセスにユニークないくつかの調節ポイントを提供する。第一に、図４Ａおよび５Ｂに示すように、染色は、基本的に量で制限される一方、慣用的な染色システム上での染色強度の主な駆動因子は、インキュベーション時間である。実際、これは、慣用的染色装置の例において、アッセイ強度および特異性を「ダイヤル合わせ」する、カスタマーが対面する唯一の特徴である。
[00152]本明細書に示すのは、慣用的な単一スライド染色（表９）システムおよび本開示に記載する小滴オンデマンド分配手段（表８）からのアッセイ例の比較である。どちらのアッセイ表も、オフライン脱パラフィン化プロセスならびにアッセイ完了後にカバースリップを掛ける手動ワークアップを仮定する。Ｈ＆Ｅ染色用のＶＥＮＴＡＮＡ ＨＥ ６００アッセイ（慣用的な単一スライド染色装置に相当する）は、インキュベーション時間のみを用いて、染色を調節する「ダイヤル合わせ」が可能である一方、インクジェット染色プロセスは、小滴沈着（すなわちインクジェット）染色プロセスにユニークないくつかの調節ポイントを提供する。第一に、図４Ａおよび５Ｂに示すように、染色は、基本的に量で制限される一方、慣用的な染色システム上での染色強度の主な駆動因子は、インキュベーション時間である。実際、これは、慣用的染色装置の例において、アッセイ強度および特異性を「ダイヤル合わせ」する、カスタマーが対面する唯一の特徴である。
【0138】
表８：インクジェット染色アッセイスクリプト
【0139】
【表8-1】
【0140】
【表8-2】
【0141】
【表8-3】
【0142】
[00153]しかし、インクジェット染色システム上で、染色強度をダイヤル合わせするための一次駆動因子は、プリントパスの回数およびＤＰＩ（インチあたりの滴）またはプリント領域の密度であり、これらはどちらも、沈着される染色材料の総量を調節する。図４Ａにおいて、組織上のプリントパスの回数を増加させることによって、ヘマトキシリン強度を駆動し、そして同様に図５Ａにおいて、組織上のさらなるプリント層の沈着によって、エオジン強度を同様に駆動する。表８に示すように、開示する染色プロセスの１つの態様に関して、アッセイ時間は固定される（沈着量での染色強度の「ダイヤル合わせ可能性」のため）、これは、多様である慣用的なプロセス（染色強度の「ダイヤル合わせ可能性」が、インキュベーション時間によって駆動されるため）とは対照的である。さらに、生じる液体浪費の量の有意な減少があり、慣用的なプロセスの約１４．２４ｍＬから、インクジェット染色プロセスの態様に関する約２．７１ｍＬに低下した。この結果は、表１０に示唆するように、インクジェット沈着システムでは、アッセイ体積の最小化が達成可能であることを強調する。
【0143】
表９：慣用的な染色装置アッセイスクリプト
【0144】
【表9-1】
【0145】
【表9-2】
【0146】
[00154]続く表１０は、本開示の態様にしたがった、インクジェット沈着プロセスを例示する。ＶＥＮＴＡＮＡ ＨＥ ６００プロセスと比較した際、インクジェット染色システムに関しては、染色強度をダイヤル合わせするための一次駆動因子は、プリントパスの回数およびＤＰＩ（インチあたりの滴）またはプリント領域の密度であり、これらはどちらも、沈着される染色材料の総量を調節する。この特定のアッセイにおいて、利用した総アッセイ体積は約２．７１ｍｌであり、そして総アッセイ時間は約１４．２４分であった。
【0147】
表１０：インクジェットおよび慣用的アッセイの比較要約
【0148】
【表10】
【0149】
[00155]短いインキュベーション期間は、なお、開示するインクジェット沈着プロセスを通じて染色するためのいくつかのプロセシング工程の構成要素であるが、強いエオジン染色（細胞質染色のため）の適用は、プリンティング後のいかなるさらなるインキュベーションも必要としない。任意の特定の理論によって束縛されることは望ましくないが、これは、染色が、非常に低体積の試薬を用いた際、量に制限されることを例示し、ならびに伝統的な染色技術と比較して、試薬が１００倍減少してもなお、反応動力学が改善可能である（染色時間の７分間から１分間への減少）という事実を例示すると考えられる。
【0150】
[00156]実施例７：パージおよびクリーニング
[00157]インクジェットプリンティングの分野の２つの一般的なプラクティスは、プリントヘッドをパージし、そしてブロットして、液体をキャピラリー空間に流すよう誘導し、そして分配用のノズルをプライミングすることである。パージは、圧電または熱小滴生成要素を作動させずに、液体ジェットをノズルの外に出すための、インク容器内での陽圧適用を指す。パージはまた、閉塞（例えば固体結晶、タンパク質凝集物）を除去し、そしてノズルからの小滴の発動を可能にするためにも使用可能である。ブロットは、プリントヘッドのノズル領域の外に、ウィッキングパッドを適用することを指す。これは、ノズルを通じて流動を誘導し、プリンティングのためにプライミングするか、またはプリントヘッド上のいかなる残渣液体もクリーンアップする。これらの方法の両方が、「よく振る舞う」液体（すなわち結晶化し、そしてノズルを閉塞させる傾向を持たない液体）を管理するため、現在のインクジェット染色システム上でも使用されている。
[00157]インクジェットプリンティングの分野の２つの一般的なプラクティスは、プリントヘッドをパージし、そしてブロットして、液体をキャピラリー空間に流すよう誘導し、そして分配用のノズルをプライミングすることである。パージは、圧電または熱小滴生成要素を作動させずに、液体ジェットをノズルの外に出すための、インク容器内での陽圧適用を指す。パージはまた、閉塞（例えば固体結晶、タンパク質凝集物）を除去し、そしてノズルからの小滴の発動を可能にするためにも使用可能である。ブロットは、プリントヘッドのノズル領域の外に、ウィッキングパッドを適用することを指す。これは、ノズルを通じて流動を誘導し、プリンティングのためにプライミングするか、またはプリントヘッド上のいかなる残渣液体もクリーンアップする。これらの方法の両方が、「よく振る舞う」液体（すなわち結晶化し、そしてノズルを閉塞させる傾向を持たない液体）を管理するため、現在のインクジェット染色システム上でも使用されている。
【0151】
[00158]インクジェット染色研究において、プリントヘッドのクリーニングおよび維持のいくつかの方法が、物理的または化学的処理を用いて開発された。一般的に、物理的処理は、より破壊的でなく、そして比較的容易に自動化可能であるため、好ましい方法であった。プリントヘッドの維持のため、湿った、局所的に高い湿度の環境は、ノズルでの結晶化または沈殿物形成を防止する際の重要な因子である。水およびグリコールの混合物を充填したブロッティングパッドを、インクジェット染色システム上での長期保存中、ノズルプレートの上に乗せることによって、乾燥は軽減された。
【0152】
[00159]プリントヘッドからの結晶化物質のクリーニングに用いた、２つの有効な溶媒系は、３％過ヨウ素酸および過酸化水素／炭酸ナトリウムの混合物であった。どちらも、プリントノズルからの閉塞を除去する際に有効であった。
【0153】
[00160]本明細書に言及され、そして／または出願データシートに列挙された、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、その全体が本明細書に援用される。態様の側面は、必要であれば、多様な特許、出願および刊行物の概念を使用して、修飾し、さらなる態様を提供することも可能である。
【0154】
[00161]本明細書の開示は、特定の態様に言及して記載されてきているが、これらの態様は本開示の原理および適用を単に例示することを理解しなければならない。したがって、付随する請求項によって定義されるような、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、例示する態様に多数の修飾を行うことが可能であり、そして他のアレンジが考案可能であることが理解される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12】
