特許 7097398 ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためのアデノ随伴ウイルスベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-06-29

(45)【発行日】2022-07-07

(54)【発明の名称】ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためのアデノ随伴ウイルスベクター

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20220630BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220630BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20220630BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20220630BHJP

   A61K 31/713 20060101ALN20220630BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220630BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00 ZNA

A61K35/76

A61P27/06

A61K38/17

A61K31/713

C12N15/113 Z

【請求項の数】 6

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020036344

(22)【出願日】2020-03-04

(62)【分割の表示】P 2017534525の分割

【原出願日】2015-09-16

(65)【公開番号】P2020105194

(43)【公開日】2020-07-09

【審査請求日】2020-03-09

(31)【優先権主張番号】62/051,299

(32)【優先日】2014-09-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ピーター・ペカン

(72)【発明者】

【氏名】エイブラハム・スケーリア

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・アーディンジャー

【審査官】柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】特許第６６７３９２３（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】Mol. Ther., (2011), 19, [Suppl.1], p.S255(664)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／１７

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／７６

Ａ６１Ｐ ２７／０６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためのキットであって、該キットは、哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸を送達するための医薬組成物を含み、該医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２粒子を含み、該ＡＡＶ２粒子はｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは該核酸を含み、該核酸は、治療用導入遺伝子をコードし、該治療用導入遺伝子は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記キット。

【請求項2】

（ｉ）使用説明書；および／または（ｉｉ）緩衝剤および／または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む請求項１に記載のキット。

【請求項3】

ｒＡＡＶ粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する、請求項１または２に記載のキット。

【請求項4】

治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項5】

哺乳動物はヒトである、請求項１～４のいずれか１項に記載のキット。

【請求項6】

医薬組成物は、硝子体内投与用および／または前房内投与用である、請求項１～５のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１６日に出願した米国仮出願第６２／０５１，２９９号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１５９７９２０１２５４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１５年９月１５日、サイズ：３１ＫＢ）。

【0003】

本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためのＡＡＶベクターおよびＡＡＶベクターの使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ミオシリン（ＭＹＯＣ）突然変異は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ；米国患者数約９０，０００）の約２％～４％についての主原因である。詳細には、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異Ｐ３７０ＬまたはＹ４３７Ｈは、若年性のＰＯＡＧ（ＪＯＡＧ；米国患者数約６，０００）の１０％～３０％についての主原因であり、眼圧（ＩＯＰ）上昇、網膜神経節細胞死、および視神経乳頭（ＯＮＨ）損傷に関連している（特許文献１；特許文献２）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｓｈｉｍｉｚｕら（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３０：１６５～７７頁

【文献】ＦａｎおよびＷｉｇｇｓ（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：３０６４～７２頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＭＹＯＣ突然変異と緑内障とのこの関連性にもかかわらず、眼の機能に対するＭＹＯＣ突然変異体の効果は依然として不明である。したがって、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するための新規治療戦略を見いだすために、ＭＹＯＣおよび突然変異型ＭＹＯＣの機能をさらに理解する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物の眼におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる薬剤を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼の線維柱帯網（ＴＭ）細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼におけるＲ－スポンジン１（ＲＳＰＯ１）、Ｒ－スポンジン２（ＲＳＰＯ２）、Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）、および／またはＲ－スポンジン４（ＲＳＰＯ４）活性を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼における１つまたはそれ以上のＲＳＰＯ活性を増加させる１つまたはそれ以上のさらなる薬剤と併用される。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳ
ＰＯ１を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、短縮型ＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ２を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、短縮型ＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ３を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、短縮型ＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ４を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、短縮型ＲＳＰＯ４である。

【0008】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる第２の薬剤の投与を提供する。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭにおけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭにおけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＭＹＯＣの発現を標的とする阻害性核酸をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、ＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡである。

【0009】

いくつかの態様において、本発明の薬剤は、哺乳動物の眼におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、前記薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭにおけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、前記薬剤は、ＭＹＯＣの発現を標的とする阻害性核酸をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉである。さらなる実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、ＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡである。

【0010】

本発明のいくつかの態様において、前記方法は、哺乳動物の眼におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる第２の薬剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭにおけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼におけるＲ－スポンジン１（ＲＳＰＯ１）、Ｒ－スポンジン２（ＲＳＰＯ２）、Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）またはＲ－スポンジン４（ＲＳＰＯ４）活性を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ１を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、短縮型ＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ２を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、Ｒ
ＳＰＯ２またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、短縮型ＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ３を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、短縮型ＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、哺乳動物の眼のＴＭ内のＲＳＰＯ４を増加させる。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、短縮型ＲＳＰＯ４である。

【0011】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物の眼におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させる薬剤と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を低減または阻害する薬剤とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。さらに他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、ＭＹＯＣを標的とするｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。

【0012】

いくつかの態様において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とする阻害性核酸をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本
発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含むｒＡＡＶ）粒子とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障である。

【0013】

いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。本発明のいくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、ミオシリンの突然変異を伴う。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、ヒトミオシリンの突然変異を伴う。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、Ｅ３２３Ｋ、Ｋ３９８Ｒ、Ｑ３６８Ｘ、Ｇ３６４Ｖ、Ｐ３７０Ｌ、Ｄ３８０Ａ、Ｋ４２３Ｅ、Ｙ４３７ＨおよびＩ４７７Ｓから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、Ｐ３７０Ｌアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、Ｙ４３７Ｈアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＣ）である。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障（ＪＯＡＣ）である。本発明のいくつかの実施形態において、処置は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の症状を軽減する。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の症状の軽減は、眼圧の低下、ＭＹＯＣの線維柱帯網内蓄積の低減、高眼圧の低下、または線維柱帯網からの房水流出の増加である。

【0014】

いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、ヒトＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、ヒトＲＳＰＯ１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号８に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号１１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号１２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、ヒトＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、ヒトＲＳＰＯ２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、配列番号９に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、配列番号１３に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳ
ＰＯ２は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、配列番号１４に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、ヒトＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、ヒトＲＳＰＯ３に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１５に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１７に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、ヒトＲＳＰＯ４である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、ヒトＲＳＰＯ４に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号１０に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号１８に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号１２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、および／またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、および／またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、および／またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。

【0015】

いくつかの実施形態において、本発明のＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、ヒトＭＹＯＣを標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、配列番号６に記載のＭＹＯＣのアミノ酸配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、配列番号７のループ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現させることができる。さらなる実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現させることがで
きる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）の発現は、哺乳動物の眼におけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）の発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣは、野生型ＭＹＯＣである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣは、突然変異型ＭＹＯＣである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣは、野生型ＭＹＯＣおよび突然変異型ＭＹＯＣである。さらなる実施形態において、突然変異型ＭＹＯＣは、ヒトＭＹＯＣのＰ３７０Ｌおよび／またはＹ４３７Ｈアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、Ｅ３２３Ｋ、Ｋ３９８Ｒ、Ｑ３６８Ｘ、Ｇ３６４Ｖ、Ｐ３７０Ｌ、Ｄ３８０Ａ、Ｋ４２３Ｅ、Ｙ４３７ＨおよびＩ４７７Ｓから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。

【0016】

上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されているような変異型ＡＡＶ６カプシド、例えばＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載されているような修飾ＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンカプシド突然変異体、ヘパリン結合カプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開２０１２／００６６７８３号に記載されている他の任意のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開番号ＷＯ／２００３／０４２３９７に記載されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５またはＲ５８８位のうちの１カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ血清型２カプシドを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ血清型２カプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ血清型２ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびカプシドを含む。他の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のカプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２カプシドを含み、この場合のベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の少なくとも１×１０^９ゲノムコピーが哺乳動物に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、哺乳動物の眼の角膜に、網膜におよび／または強膜に投与される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、硝子体内注射および／または前房内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、眼の１カ所より多くの位置に投与される。

【0018】

いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物はヒトである、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＣ）である。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障（ＪＯＡＣ）である。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、医薬組成物中のものである。さらなる実施形態において、医薬組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。

【0020】

上記方法のいくつかの実施形態において、薬剤（例えば、ＡＡＶ粒子）は、Ｒ－スポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／またはＲＳＰＯ４）の活性を増加させる１つまたはそれ以上のさらなる薬剤と併用される。

【0021】

いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶベクターを含む組換えＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含む、前記組換えＡＡＶ粒子を提供する。他の態様において、本発明は、哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とする阻害性核酸をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。他の態様において、本発明は、哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。さらに他の態様において、本発明は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードし、かつ哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0022】

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体は、ヒトＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体は、配列番号８、１１および／または１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体は、配列番号８、１１および／または１２のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体は、ヒトＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体は、配列番号９、１３および／または１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体は、配列番号９、１３および／または１４のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ３またはその機能的変
異体は、ヒトＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体は、配列番号１および／または１５～１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体は、配列番号１および／または１５～１７のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ４をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ４は、ヒトＲＳＰＯ４である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体は、配列番号１０、１８および／または１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体は、配列番号１０、１８および／または１９のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、および／またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。

【0023】

いくつかの実施形態において、哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とする阻害性核酸は、ＲＮＡｉである。いくつかの実施形態において、本発明のＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、ヒトＭＹＯＣを標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、配列番号６に記載のＭＹＯＣのアミノ酸配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、配列番号７のループ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現させることができる。さらなる実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）の発現は、哺乳動物の眼におけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）の発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣは、野生型ＭＹＯＣである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣは、突然変異型ＭＹＯＣである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣは、野生型ＭＹＯＣおよび突然変異型ＭＹＯＣである。さらなる実施形態において、突然変異型ＭＹＯＣは、ヒトＭＹＯＣのＥ３２３Ｋ、Ｋ３９８Ｒ、Ｑ３６８Ｘ、Ｇ３６４Ｖ、Ｐ３７０Ｌ、Ｄ３８０Ａ、Ｋ４２３Ｅ、Ｙ４３７ＨおよびＩ４７７Ｓアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、突然変異型ＭＹＯＣは、ヒトＭＹＯＣのＰ３７０Ｌおよび／またはＹ４３７Ｈアミノ酸置換に対応するアミ
ノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＣ）に関連している。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、若年性の原発開放隅角緑内障（ＪＯＡＣ）に関連している。

【0024】

上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されているような変異型ＡＡＶ６カプシド、例えばＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載されているような修飾ＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンカプシド突然変異体、ヘパリン結合カプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開２０１２／００６６７８３号に記載されている他の任意のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開番号ＷＯ／２００３／０４２３９７に記載されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５またはＲ５８８位のうちの１カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ血清型２カプシドを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ血清型２カプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、またはマウスＡＡＶ血清型逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ血清型２ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびカプシドを含む。他の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のカプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２カプシドを含み、この場合のベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。

【0025】

本発明は、本明細書に記載する組換えＡＡＶ粒子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。本発明は、本明細書に記載する任意の方法に好適である医薬組成物も提供する。本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するための薬物の製造における、本明細書に記載する医薬組成物および組換えＡＡＶ粒子の使用を提供する。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＣ）である。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障（ＪＯＡＣ）である。

【0026】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためのキットであって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはそ
の機能的変異体をコードするベクターを含むｒＡＡＶウイルス粒子；ＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶウイルス粒子であって、該ベクターが、哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とする阻害性核酸（例えば、ｓｈＲＮＡを含む、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ）をコードする核酸を含む、ｒＡＡＶウイルス粒子；および／またはＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶウイルス粒子であって、該ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４もしくはその機能的変異体をコードし、かつ哺乳動物におけるＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸を含む、ｒＡＡＶウイルス粒子を含む、前記キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の処置に関する使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、緩衝剤および／または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。

【0027】

いくつかの実施形態において、本発明のキットは、哺乳動物におけるＭＹＯＣの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、ヒトＭＹＯＣの発現を標的とする。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、配列番号６に記載のＭＹＯＣのアミノ酸配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡは、配列番号７のループ配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ＡＡＶベクターであって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含む、前記ＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体は、ヒトＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体は、配列番号８、１１および／または１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ１またはその機能的変異体は、配列番号８、１１および／または１２のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体は、ヒトＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体は、配列番号９、１３および／または１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ２またはその機能的変異体は、配列番号９、１３および／または１４のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体は、ヒトＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体は、配列番号１および／または１５～１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ３またはその機能的変異体は、配列番号１および／または１５～１７のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体
は、ヒトＲＳＰＯ４である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体は、配列番号１０、１８および／または１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体は、配列番号１０、１８および／または１９のアミノ酸配列に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉを発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉを発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉの発現は、哺乳動物の眼におけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉの発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。

【0028】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載するＡＡＶ粒子は、Ｒ－スポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／またはＲＳＰＯ４）の活性を増加させる１つまたはそれ以上のさらなる薬剤と併用される。

【0029】

いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ベクターと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されているような変異型ＡＡＶ６カプシド、例えばＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載されているような修飾ＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンカプシド突然変異体、ヘパリン結合カプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開２０１２／００６６７８３号に記載されている他の任意のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開番号ＷＯ／２００３／０４２３９７に記載されているＡＡＶカプシドとを含む、ＡＡＶウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５またはＲ５８８位のうちの１カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドを含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ血清型２カプシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型２カプシド
は、ＡＡＶ２ ＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ血清型２ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、同じＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲおよびカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ｒＡＡＶウイルス粒子のカプシドとは異なるＡＡＶ血清型に由来する１つまたはそれ以上のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２カプシドを含み、ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ２カプシドは、ＡＡＶ２ ＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む。

【0030】

上記キットのいくつかの実施形態において、キットのＡＡＶ粒子は、Ｒ－スポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／またはＲＳＰＯ４）の活性を増加させる１つまたはそれ以上のさらなる薬剤と併用される。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、本明細書に記載のＡＡＶ粒子と、Ｒ－スポンジン（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／またはＲＳＰＯ４）の活性を増加させる１つまたはそれ以上のさらなる薬剤とを含む。

【0031】

本発明は、本明細書に記載する方法のいずれか１つにおける使用に好適なキットを提供する。本発明は、本明細書に記載する組換えＡＡＶ粒子のいずれかを含むキットを提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載するキットは、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の処置に関する使用説明書をさらに含む。いくつかの態様において、本明細書に記載するキットは、緩衝剤および／または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。

【0032】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸（例えば、治療用導入遺伝子をコードする核酸）を送達する方法であって、ｒＡＡＶベクターを含むＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含み、該ｒＡＡＶベクターは核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼障害を処置する方法であって、ｒＡＡＶベクターを含むＡＡＶ２粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含み、該ｒＡＡＶベクターは、治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、硝子体内および／または前房内投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。

【0033】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸（例えば、治療用導入遺伝子をコードする核酸）を送達するための組換えＡＡＶ２粒子であって、該ＡＡＶ２粒子はｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは該核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡ
Ｖ２カプシドタンパク質を含む、前記組換えＡＡＶ２粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼障害を処置するための組換えＡＡＶ２粒子であって、該ＡＡＶ２粒子はｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記組換えＡＡＶ２粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。

【0034】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸（例えば、治療用導入遺伝子をコードする核酸）を送達するための組換えＡＡＶ２粒子の使用であって、該ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは該核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記使用を提供する。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼障害を処置するための組換えＡＡＶ２粒子であって、該ＡＡＶ粒子はｒＡＡＶベクターを含み、該ｒＡＡＶベクターは、治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記組換えＡＡＶ２粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、硝子体内および／または前房内投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。

【0035】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸（例えば、治療用導入遺伝子をコードする核酸）を送達するキットであって、ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２粒子を含み、該ｒＡＡＶベクターは核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記キットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼障害を処置するためのキットであって、ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２粒子を含み、該ｒＡＡＶベクターは、治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドタンパク質を含む、前記キットを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、硝子体内および／または前房内投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。

【0036】

特許出願および公報を含めて、本明細書に引用するすべての参考文献は、それら全体が参照によって組み入れられている。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】ＭＹＯＣ突然変異体Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈが分泌されず、野生型ＭＹＯＣ（「ｗｔＭＹＯＣ」）の分泌を遮断することを実証する図である。ｗｔＭＹＯＣおよび／またはＭＹＯＣ突然変異体を発現する構築物がトランスフェクトされた２９３細胞からの細胞培養培地または細胞溶解物（標示の通り）を、抗ヒトＭＹＯＣ抗体を使用してウェスタンブロッティングによって探索した。

【図2】２９３Ｔ細胞においても、ＳＶ４０ Ｔ抗原が形質変換されたヒト線維柱帯網（「ｈＴＭ－Ｔ」）細胞においても、ＭＹＯＣ突然変異体Ｐ３７０Ｌは分泌されず、野生型ＭＹＯＣ（「ｗｔＭＹＯＣ」）の分泌を遮断することを示す図である。ｗｔＭＹＯＣおよび／またはＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣを発現する構築物がトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞またはｈＴＭ－Ｔ細胞からの細胞培養培地または細胞溶解物（標示の通り）を、抗ヒトＭＹＯＣ抗体を使用してウェスタンブロッティングによって探索した。

【図3】Ｗｎｔシグナル伝達に対するｗｔＭＹＯＣ、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣ、またはＹ４３７Ｈ発現の効果を示す図である。実験ごとに、「ｍＷｎｔ３ａなし」のバーが左側にあり、「ｍＷｎｔ３ａあり－４００ｎｇ／ｍｌ」のバーが右側にある。

【図4】ＲＳＰＯ３発現はＰ３７０ＬまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣと共発現時にＷｎｔシグナル伝達を回復させることができることを示す図である。実験ごとに、「ｍＷｎｔ３ａなし」のバーが左側にあり、「ｍＷｎｔ３ａ－４００ｎｇ／ｍｌ」のバーが右側にある。

【図5】ＲＳＰＯ３発現はＰ３７０Ｌ ｈＴＭ－Ｔ細胞においてＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣとの共発現時にＷｎｔシグナル伝達を回復させることができることを示す図である。実験ごとに、「ｍＷｎｔ３ａなし」のバーが左側にあり、「４００ｎｇ／ｍｌ－ｈＷｎｔ３ａ」のバーが右側にある。

【図6】２９３Ｔ細胞におけるＭＹＯＣ発現に対するＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの効果を示す図である。２９３Ｔ細胞からの細胞培養培地または細胞溶解物を抗ヒトＭＹＯＣ抗体でのウェスタンブロッティングによって探索した。ｗｔＭＹＯＣ（レーン１）；ｗｔＭＹＯＣおよびＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ ＃７９（２）；ｗｔＭＹＯＣおよびＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ ＃９３（３）；ｗｔＭＹＯＣおよびスクランブルｓｈＲＮＡ対照（４）；またはＥＧＦＰ（５）を発現するプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。５５／５７ｋＤバンドは、グリコシル化（５７ｋＤ）および非グリコシル化（５５ｋＤ）形態のフルサイズＭＹＯＣタンパク質を表す。２２ｋＤバンドは、カルパインＩＩ切断産物のＮ末端を表す。

【図7】ｈＴＭ－Ｔ細胞におけるＭＹＯＣ発現に対するＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの効果を示す図である。ｈＴＭ－Ｔ細胞からの細胞培養培地または細胞溶解物を抗ヒトＭＹＯＣ抗体でのウェスタンブロッティングによって探索した。ｗｔＭＹＯＣ（レーン１）；Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣ（２）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣ（３）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよびＧｒｐ９４ ｓｈＲＮＡ ＃１（４）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよびＧｒｐ９４ ｓｈＲＮＡ ＃２（５）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよびＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ ＃５３（６）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよびｐＧＩＰＺ ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ ＃７９（７）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよびｐＧＩＰＺ ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ ＃９３（８）；ｗｔＭＹＯＣおよびＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよびスクランブルｓｈＲＮＡ対照（９）；またはＥＧＦＰ（１０）を発現するプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。

【図8】ＲＳＰＯ３発現およびＭＹＯＣサイレンシングはＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣと共発現時にＷｎｔシグナル伝達を相乗的に回復させることを示す図である。標示の通り、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣ、Ｇｒｐ９４ ｓｈＲＮＡ、ｐＧＩＰＺ ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡｓ ＃７９（第１）および＃９３（第２）、ならびに／またはＲＳＰＯ３プラスミドに加えて、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物およびｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）を、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えマウスＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝１～３複製ウェル）をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。実験ごとに、「Ｗｎｔ添加なし」のバーが左側にあり、「４００ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ添加」のバーが右側にある。

【図9】ＭＹＯＣサイレンシングはＰ３７０ＬまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣと共発現時にＷｎｔシグナル伝達を回復させることを示す図である。標示の通り、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣ、Ｙ４３７Ｈ ＭＹＯＣ、ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ、および／またはスクランブル対照ｓｈＲＮＡ（「ｐＧＩＰＺ－Ｎｕｌｌ」）に加えて、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物およびｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）を、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えマウスＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝１～３複製ウェル）をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。実験ごとに、「Ｗｎｔ添加なし」のバーが左側にあり、「４００ｎｇ／ｍｌ Ｗｎｔ３ａ添加」のバーが右側にある。

【図10】野生型ＡＡＶウイルス粒子（上のパネル）およびカプシドタンパク質のＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ粒子による、線維柱帯網の細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ（左パネル）およびｉｎ ｖｉｖｏ（右パネル）形質導入を示す図である。

【図11】標示の通り、フューリン様Ｃｙｓリッチドメイン、トロンボスポンジン１型ドメイン、および正電荷を有するＣ末端ドメインを図示するヒトＲＳＰＯファミリータンパク質のドメイン図を示す図である（Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９：２５８８～２５９６頁出典の図）。

【図12】図１１に記載のタンパク質ドメインを図示するヒトＲＳＰＯファミリー遺伝子のドメイン図を示す図である。アミノ酸配列ナンバリングを示す。各ファミリーメンバーについて試験した短縮型突然変異体は標示の通りである（Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５：２３～２６頁出典の図）。

【図13】図１３Ａは、完全長ヒトＲＳＰＯ３（配列番号１）の配列を示す図である。シグナル配列、ＦＵ１、ＦＵ２およびＴＳＰ１ドメインを標示した。図１３Ｂは、活性ヒトＲＳＰＯ３断片（配列番号１６）の配列を示す図である。シグナル配列、ＦＵ１およびＦＵ２ドメインを標示した。シグナルペプチドがない使用した断片は、配列番号１６のアミノ酸２２～１４６に対応し、Ｈｉｓタグを含めて１５ｋＤａである。図１３Ｃは、完全長ｈＲＳＰＯ３のドメイン構造を示す図である。シグナルペプチド、ＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰ１およびＢＲを標示した。各ドメインの推定機能を下に収載する。図１３Ｄは、完全長ｈＲＳＰＯ３およびｈＲＳＰＯ３断片のウェスタンブロットを示す図である。

【図14】試験したｈＲＳＰＯ３断片を示す図である。シグナルペプチド、ＦＵ１、ＦＵ２、ＴＳＰ１およびＢＲドメインを標示した完全長ｈＲＳＰＯ３のドメイン構造、ならびに各ドメインについての推定機能も下に提供する。

【図15】完全長ＲＳＰＯ３およびＲＳＰＯ３断片の発現はＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣと共発現時にＷｎｔシグナル伝達を回復させることを示す図である。

【図16】ＲＳＰＯファミリーメンバーの発現は、Ｙ４３７Ｈ ＭＹＯＣと共発現時に、Ｗｎｔ３ａの添加がなくてもＷｎｔシグナル伝達を誘導することができることを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物の眼におけるＷｎｔシグナル伝達を；例えば、Ｒ－スポンジン１（ＲＳＰＯ１）、Ｒ－スポンジン２（ＲＳＰＯ２）、Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）および／またはＲ－スポンジン４（ＲＳＰＯ４）の発現によって、増加させる。いくつかの実施形態では、ミオシリン（ＭＹＯＣ）（例えば、突然変
異型ミオシリン）の発現を；例えば、ＭＹＯＣ発現を標的とするＲＮＡｉの使用によって、阻害する。いくつかの態様において、ＡＡＶ粒子は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４、ならびに／またはそれらに関する機能的変異体をコードするベクターを含む。他の態様において、ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを含む。他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４、ならびに／またはそれらに関する機能的変異体をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子と、該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子との混合物を、該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４、ならびに／またはそれらに関する機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するための組成物およびキットであって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４ならびに／またはそれらに関する機能的変異体ならびに／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを使用する、前記組成物およびキットも提供する。本発明は、組換えＡＡＶ粒子、組成物およびキットも提供する。

【0039】

いくつかの態様において、本発明は、線維柱帯網の細胞に形質導入するためにＡＡＶ２を標的化する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａ突然変異を含むｒＡＡＶ２粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、線維柱帯網に関連する眼疾患（例えば、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障）を処置するための方法および組成物であって、突然変異カプシドタンパク質（例えば、Ｒ４７１Ａアミノ酸置換）を含むＡＡＶ２ウイルス粒子を使用する、前記方法および組成物を提供する。

【0040】

Ｉ．一般技術
本明細書に記載するまたは本明細書中で参照する技術および手順は一般によく理解されており、当業者によって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅ
ｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３～８頁）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）のような従来の方法論を用いて一般に利用される。

【0041】

ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書で用いる場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。

【0042】

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で用いる場合、任意の長さの重合体形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖もしくは多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学もしくは生化学修飾、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む重合体を含むが、これらに限定されない。核酸の主鎖は、（ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて通常見いだされるように）糖およびリン酸エステル基を含むことがあり、または修飾もしくは置換されている糖もしくはリン酸エステル基を含むこともある。あるいは、核酸の主鎖は、ホスホルアミデートなどの合成サブユニットの重合体を含むことがあり、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ_２）または混合ホスホルアミデート－ホスホジエステルオリゴマーであることがある。加えて、二本鎖核酸は、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から、相補鎖の合成およびそれらの鎖の適切な条件下でのアニーリングによって、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマーを使用する相補鎖のデノボ合成によって、得ることができる。

【0043】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を指すために同義で用いており、最小長に限定されない。アミノ酸残基のそのような重合体は、天然アミノ酸残基を含有することもあり、または非天然アミノ酸残基を含有することもあり、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および多量体を含むがこれらに限定されない。完全長タンパク質とそれらの断片の両方がこの定義に包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、
リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的では、「ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する修飾、例えば欠失、付加および置換（一般に、本質的に保存的なもの）を含むタンパク質を指すが、ただし、該タンパク質が所望の活性を維持することを条件とする。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであることもあり、または偶然なもの、例えば、タンパク質を生産する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーであることもある。

【0044】

「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス由来でない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸には少なくとも１つ、好ましくは２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。

【0045】

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つ、好ましくは２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染しており（または好適なヘルパー機能を発現しており）、かつ、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体におけるもの、または別のベクター、例えば、クローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドにおけるもの）に組み込まれている場合には、そのｒＡＡＶベクターは「プロベクター」と呼ばれることもがあり、該プロベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下での複製およびカプシド封入によって「レスキュー」される。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、直鎖状人工染色体を含む（しかしこれらに限定されない）多数の形態のいずれであってもよく、ｒＡＡＶベクターを脂質と複合体化することができ、リポソームに封入することができ、実施形態によっては、ウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子、のカプシドに封入することができる。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生じさせることができる。ＡＡＶヘルパー機能（すなわち、ＡＡＶの複製および宿主細胞によるパッケージングを可能にする機能）は、ＡＡＶ複製およびパッケージングを助けるヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子が含むがこれらに限定されない、多数の形態のいずれかで提供される。他のＡＡＶヘルパー機能は、当技術分野において公知である。

【0046】

「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質とカプシドに封入されたｒＡＡＶベクターゲノムとで構成されているウイルス粒子を指す。

【0047】

「異種」には、比較されるまたは導入されるもしくは組み込まれる実体の残部のものと遺伝子型的に異なる実体に由来するという意味がある。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞タイプに導入された核酸は、異種核酸である（および、発現されたとき、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部分）は、そのベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。

【0048】

用語「導入遺伝子」は、細胞に導入される核酸であって、ＲＮＡに転写されること、ならびに場合により、適切な条件下で翻訳および／または発現されることが可能である前記核酸を指す。複数の態様において、導入遺伝子は、その導入遺伝子が導入される細胞に所望の特性を付与するか、または所望の治療もしくは診断アウトカムを別様にもたらす。別の態様において、導入遺伝子は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉を媒介する分子に翻訳され
ることもある。

【0049】

ウイルス力価に関して用いる場合の用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム当量」または「ゲノムコピー」は、感染性または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター製剤中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例に記載のもの、または例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１～１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２～２７８頁に記載のものなどの手順によって測定することができる。

【0050】

ウイルス力価に関して用いる場合の用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染粒子」または「複製単位」は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３～１９７３頁に記載されているような複製中心アッセイとしても公知の、感染中心アッセイによって測定されるような、感染性かつ複製可能な組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0051】

ウイルス力価に関して用いる場合の用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、本明細書の実施例に記載のもの、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３～１２４頁に記載のもの；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０～５３２頁に記載のもの（ＬＦＵアッセイ）などの機能性アッセイで測定されるような、機能性導入遺伝子産物の生産をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。

【0052】

「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当技術分野において十分に理解されている用語であり、反対向きであるウイルスゲノムの末端に見られる比較的短い配列を指す。

【0053】

当技術分野において十分に理解されている用語、「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列は、ネイティブ一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在するおおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間の異質性をもたらす、２つの二者択一配向のいずれかで存在することができる。最も外側の１２５ヌクレオチドは、自己相補性のいくつかのより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と呼ばれる）も含有し、これらの領域が、ＩＴＲのこの部分の中での鎖内塩基対合の発生を可能にする。

【0054】

「末端切断配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製中にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域内の配列である。突然変異型末端切断配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断を受けにくい。

【0055】

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、（欠陥パルボウイルスである）ＡＡＶの複製および宿主細胞によるパッケージングを可能にするウイルスを指す。多数のそのようなヘルパーウイルスが同定されており、それらにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアが含まれる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最もよく使用されている。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類由来の非常の多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ＡＴＣＣなどの寄託機関から同じく入手可能であるヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。

【0056】

参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入
した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、該参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義する。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、補遺３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているものを使用する、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含む、当技術分野における技術の範囲内の様々な方法で達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的では、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することができる）を次のように算出する：１００×分数Ｘ／Ｙ（ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムによってそのプログラムのＡとＢのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同一でない場合、Ｂに対してのＡのアミノ酸配列同一性％が、Ａに対してのＢのアミノ酸配列同一性％と同一にならないことは理解されるであろう。本明細書の目的では、所与の核酸配列Ｄに対しての、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの核酸同一性％（あるいは、所与の核酸配列Ｄに対しての、それとの、またはそれに対する特定の核酸配列同一性％を有するまたは含む所与の核配列Ｃと表現することができる）を次のように算出する：１００×分数Ｗ／Ｚ（ここで、Ｗは、配列アライメントプログラムによってそのプログラムのＣとＤのアライメントで同一マッチとしてスコアされるヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと同一でない場合、Ｄに対してのＣの核酸配列同一性％が、Ｃに対してのＤの核酸配列同一性％と同一にならないことは理解されるであろう。

【0057】

「単離された」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞は、それが、その天然の環境の成分から同定および分離および／または回収されたことを意味する。

【0058】

「有効量」は、臨床結果（例えば、症状の改善、臨床エンドポイントの達成など）を含む、有益なまたは所望の結果を達成するために十分な量である。有効量を１回またはそれ以上の投与で投与することができる。病状の点からは、有効量は、疾患の改善、安定化、または発症遅延に十分な量である。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸などの異種核酸の所望の量を表す。

【0059】

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体または対象はヒトである。

【0060】

本明細書で用いる場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であろうと、検出不能であろうと、症状の軽減、疾患の程度の低下、安定化された（例えば、悪化しない）病状、疾患の拡大（転移）の予防、疾患進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分寛解であろうと、完全寛解であろうと）を含むが、これらに限定さ
れない。「処置」は、処置を受けていない場合に予期される生存期間と比較して生存期間の延長も意味することができる。

【0061】

本明細書で用いる場合、用語「線維柱帯網」は、房水を眼から血液に排出するように機能する、角膜および虹彩付近に位置するスポンジ様組織を指す。房水を眼から血液に排出するように機能する、角膜および虹彩付近に位置するスポンジ様組織。線維柱帯網は、内皮で囲まれた空間（線維柱帯間の空間）を含有し、そこを通って房水をシュレム管に送る。線維柱帯網は、通常は、２つの部分：角膜および強膜と接触しており、シュレム管に開口している角強膜網目構造と、前房に面しているぶどう膜網目構造と、に分けられる。

【0062】

用語「中心網膜」は、本明細書で用いる場合、外黄斑および／または内黄斑および／または中心窩を指す。用語「中心網膜細胞タイプ」は、本明細書で用いる場合、例えばＲＰＥおよび光受容器細胞などの、中心網膜の細胞タイプを指す。

【0063】

用語「黄斑」は、周辺網膜と比較して高い相対濃度の光受容器細胞、特に杆体および錐体を含有する、霊長類の中心網膜領域を指す。本明細書で用いる場合の用語「外黄斑」は、「周辺黄斑」も指すことがある。本明細書で用いる場合の用語「内黄斑」は、「中心黄斑」も指すことがある。

【0064】

用語「中心窩」は、周辺網膜および黄斑と比較して高い相対濃度の光受容器細胞、特に錐体を含有する、直径がおおよそ０．５ｍｍ以下の、霊長類の中心網膜内の小領域を指す。

【0065】

用語「網膜下腔」は、本明細書で用いる場合、網膜内の光受容器細胞と網膜色素上皮細胞の間の位置を指す。網膜下腔は、流体の任意の網膜下注射前などの、潜在空隙であることもある。網膜下腔は、潜在空隙に注射される流体を含有することもある。この場合、流体は、「網膜下腔と接触している」。「網膜下腔と接触している」細胞としては、ＲＰＥおよび光受容器細胞などの、網膜下腔に隣接する細胞が挙げられる。

【0066】

用語「ブレブ」は、本明細書で用いる場合、眼の網膜下腔内の液腔を指す。本発明のブレブは、単一の腔への流体の単回注射によって形成されることもあり、同じ腔への１つもしくはそれ以上の流体の複数回の注射によって形成されることもあり、複数の腔への複数回の注射によって形成されることもあり、または再配置されたときに網膜下腔の所望の部分に対する治療効果の達成に有用な全液腔を生じさせる、複数の腔への複数回の注射によって形成されることもある。

【0067】

「ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ３９６５２６によって表されるニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）βアクチン）に由来するポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いる場合、「ニワトリβ－アクチンプロモーター」は、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９～７７頁に記載されている配列などの、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素とニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーターならびに第１エクソンおよびイントロンとウサギβ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターとを含有するプロモーターを指すこともある。本明細書で用いる場合、用語「ＣＡＧプロモーター」を同義で用いることがある。本明細書で用いる場合、用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」を同義で用いることがある。

【0068】

「ミオシリン（ＭＹＯＣ）」は、細胞骨格機能、細胞接着、細胞シグナル伝達および細胞遊走（線維柱帯網誘導性グルココルチコイド応答、ＧＰＯＡ、ＴＩＧＲ、ＧＬＣ１Ａ、
ＪＯＡＧおよびＪＯＡＧ１としても公知）に関与するタンパク質（または前記タンパク質をコードする遺伝子）を指す。ミオシリンは、多くの異なる細胞タイプにおいて分泌タンパク質として発現される。眼では、ミオシリンは、眼圧（ＩＯＰ）の調節に肝要な組織である、線維柱帯網によって房水に分泌されると考えられている。上で説明したように、ミオシリンの突然変異は、原発開放隅角緑内障のサブセット、特に、若年性のこの障害の主原因であると考えられている。

【0069】

本明細書で用いる場合、「ミオシリン」は、完全長前駆体はもちろん、プロセシングされたあらゆる形態のこのタンパク質（例えば、細胞から分泌された成熟タンパク質）も指すことがある。ミオシリンタンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコミオシリン、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００２５２、ＮＰ＿０３４９９５、ＮＰ＿００１０４１４９５およびＮＰ＿００１２６５７７９を挙げることができる。ミオシリン遺伝子の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコミオシリン遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４６５３（ＭＹＯＣ、別名ＧＰＯＡ、ＪＯＡＧ、ＴＩＧＲ、ＧＬＣ１ＡおよびＪＯＡＧ１）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １７９２６（Ｍｙｏｃ、別名ＴＩＧＲ、ＧＬＣ１ＡおよびＡＩ９５７３３２）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４９０３４４、およびＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０１０８７６３２を挙げることができる。

【0070】

「Ｒ－スポンジン１（ＲＳＰＯ１）」は、Ｗｎｔシグナル伝達の修飾に関与するＲ－スポンジンファミリーのメンバーである。用語「ＲＳＰＯ１」は、ＲＳＰＯ１タンパク質を指すこともあり、またはＲＳＰＯ１タンパク質をコードする遺伝子を指すこともある。トロンボスポンジン１型反復配列（ＴＳＲ－１）含有タンパク質のスーパーファミリーのメンバー、Ｒ－スポンジンは、シグナルペプチド、ＴＳＲ－１ドメイン、および２つのフューリン様反復配列を含む。正確なメカニズムは不明であるが、Ｒ－スポンジンファミリーポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化すると考えられている。Ｒ－スポンジンとＷｎｔシグナル伝達間の関連のさらなる説明については、例えば、Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５：２３～２６頁；Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９：２５８８～２５９６頁；Ｊｉｎ，Ｙ．Ｒ．およびＹｏｏｎ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４４：２２７８～２２８７頁；ならびにｄｅ Ｌａｕ，Ｗ．Ｂ．ら（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ
Ｂｉｏｌ．１３（３）：２４２頁を参照されたい。

【0071】

本明細書で用いる場合、「ＲＳＰＯ１」は、完全長前駆体はもちろん、プロセシングされたあらゆる形態のこのタンパク質（例えば、細胞から分泌された成熟タンパク質）も指すことがある。ＲＳＰＯ１タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ１、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２２９８３７、ＮＰ＿６１９６２４、ＸＰ＿００５６２８９０およびＸＰ＿００３９８９９１８を挙げることができる。ＲＳＰＯ１遺伝子の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ１遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２８４６５４（ＲＳＰＯ１、別名ＲＳＰＯおよびＣＲＩＳＴＩＮ３）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １９２１９９（Ｒｓｐｏ１、別名ＲスポンジンおよびＲ－スポンジン）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ６０８１７９、およびＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０１０９１０３３を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、ＲＳＰＯ１の機能的変異体である。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ１変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失（例えば、短縮化）を含むことがあるが、完全長ＲＳＰＯ１の１つまたはそれ以上の活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達活性、本明細書に記載および／または例示するアッセイ）に関する一部または
すべての活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ１変異体は、短縮型ＲＳＰＯ１である。短縮型ＲＳＰＯ１ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号１１および１２、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１１および１２が挙げられる。

【0072】

「Ｒ－スポンジン２（ＲＳＰＯ２）」は、Ｗｎｔシグナル伝達の修飾に関与するＲ－スポンジンファミリーのメンバーである。用語「ＲＳＰＯ２」は、ＲＳＰＯ２タンパク質を指すこともあり、またはＲＳＰＯ２タンパク質をコードする遺伝子を指すこともある。トロンボスポンジン１型反復配列（ＴＳＲ－１）含有タンパク質のスーパーファミリーのメンバー、Ｒ－スポンジンは、シグナルペプチド、ＴＳＲ－１ドメイン、および２つのフューリン様反復配列を含む。正確なメカニズムは不明であるが、Ｒ－スポンジンファミリーポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化すると考えられている。Ｒ－スポンジンとＷｎｔシグナル伝達間の関連のさらなる説明については、例えば、Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５：２３～２６頁；Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９：２５８８～２５９６頁；Ｊｉｎ，Ｙ．Ｒ．およびＹｏｏｎ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４４：２２７８～２２８７頁；ならびにｄｅ Ｌａｕ，Ｗ．Ｂ．ら（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ
Ｂｉｏｌ．１３（３）：２４２頁を参照されたい。

【0073】

本明細書で用いる場合、「ＲＳＰＯ２」は、完全長前駆体はもちろん、プロセシングされたあらゆる形態のこのタンパク質（例えば、細胞から分泌された成熟タンパク質）も指すことがある。ＲＳＰＯ２タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ２、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿８４８６６０、ＮＰ＿７６６４０３、ＸＰ＿００５６２７９２７およびＸＰ＿００４０００１０４を挙げることができる。ＲＳＰＯ２遺伝子の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ２遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３４０４１９（ＲＳＰＯ２、別名ＣＲＩＳＴＩＮ２）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２３９４０５（Ｒｓｐｏ２、別名ｆｔｌｓ、ＡＡ６７３２４５、Ｄ４３００２７Ｋ２２および２６１００２８Ｆ０８Ｒｉｋ）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４８２００４、およびＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０１０８７３８０を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、ＲＳＰＯ２の機能的変異体である。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ２変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失（例えば、短縮化）を含むことがあるが、完全長ＲＳＰＯ２の１つまたはそれ以上の活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達活性、本明細書に記載および／または例示するアッセイ）に関する一部またはすべての活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ２変異体は、短縮型ＲＳＰＯ２である。短縮型ＲＳＰＯ２ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号１３および１４、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１３および１４が挙げられる。

【0074】

「Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）」は、Ｗｎｔシグナル伝達の修飾に関与するＲ－スポンジンファミリーのメンバーである。用語「ＲＳＰＯ３」は、ＲＳＰＯ３タンパク質を指すこともあり、またはＲＳＰＯ３タンパク質をコードする遺伝子を指すこともある。トロンボスポンジン１型反復配列（ＴＳＲ－１）含有タンパク質のスーパーファミリーのメンバー、Ｒ－スポンジンは、シグナルペプチド、ＴＳＲ－１ドメイン、および２つのフューリン様反復配列を含む。正確なメカニズムは不明であるが、ＲＳＰＯ３は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化すると考えられており、マウスおよびゼノパス属のカエルにおけるＲＳＰＯ３機能の欠損は、Ｗｎｔ機能喪失表現型をもたらす（Ｋａｚａｎｓｋａｙａ，Ｏ．ら（２００８）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３５：３６５５～６４頁）。Ｒ－スポンジンと
Ｗｎｔシグナル伝達間の関連のさらなる説明については、例えば、ｄｅ Ｌａｕ，Ｗ．Ｂ．ら（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１３（３）：２４２頁を参照されたい。

【0075】

本明細書で用いる場合、「ＲＳＰＯ３」は、完全長前駆体はもちろん、プロセシングされたあらゆる形態のこのタンパク質（例えば、細胞から分泌された成熟タンパク質）も指すことがある。ＲＳＰＯ３タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ３、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿１１６１７３、ＮＰ＿０８２６２７、ＸＰ＿００５６１５６７７およびＸＰ＿００３９８６５８３を挙げることができる。ＲＳＰＯ３遺伝子の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ３遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ８４８７０（ＲＳＰＯ３、別名ＰＷＴＳＲ、ＴＨＳＤ２およびＣＲＩＳＴＩＮ１）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ７２７８０（Ｒｓｐｏ３、別名Ｔｈｓｄ２，Ｃｒｉｓｔｉｎ１、ＡＷ７４２３０８および２８１０４５９Ｈ０４Ｒｉｋ）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４７６２８７、およびＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０１０８５６３５を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、ＲＳＰＯ３の機能的変異体である。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ３変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失（例えば、短縮化）を含むことがあるが、完全長ＲＳＰＯ３の１つまたはそれ以上の活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達活性、本明細書に記載および／または例示するアッセイ）に関する一部またはすべての活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ３変異体は、短縮型ＲＳＰＯ３である。短縮型ＲＳＰＯ３ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号１５～１７、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１５～１７が挙げられる。

【0076】

「Ｒ－スポンジン４（ＲＳＰＯ４）」は、Ｗｎｔシグナル伝達の修飾に関与するＲ－スポンジンファミリーのメンバーである。用語「ＲＳＰＯ４」は、ＲＳＰＯ４タンパク質を指すこともあり、またはＲＳＰＯ４タンパク質をコードする遺伝子を指すこともある。トロンボスポンジン１型反復配列（ＴＳＲ－１）含有タンパク質のスーパーファミリーのメンバー、Ｒ－スポンジンは、シグナルペプチド、ＴＳＲ－１ドメイン、および２つのフューリン様反復配列を含む。正確なメカニズムは不明であるが、Ｒ－スポンジンファミリーポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化すると考えられている。Ｒ－スポンジンとＷｎｔシグナル伝達間の関連のさらなる説明については、例えば、Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００６）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ５：２３～２６頁；Ｋｉｍ，Ｋ．Ａ．ら（２００８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．１９：２５８８～２５９６頁；Ｊｉｎ，Ｙ．Ｒ．およびＹｏｏｎ，Ｊ．Ｋ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４４：２２７８～２２８７頁；ならびにｄｅ Ｌａｕ，Ｗ．Ｂ．ら（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ
Ｂｉｏｌ．１３（３）：２４２頁を参照されたい。

【0077】

本明細書で用いる場合、「ＲＳＰＯ４」は、完全長前駆体はもちろん、プロセシングされたあらゆる形態のこのタンパク質（例えば、細胞から分泌された成熟タンパク質）も指すことがある。ＲＳＰＯ４タンパク質の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ４、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１０２５０４２、ＮＰ＿００１０３５７７９、ＸＰ＿５４２９３７およびＸＰ＿０１１２７９２５３を挙げることができる。ＲＳＰＯ４遺伝子の例としては、これらに限定されるものではないが、ヒト、マウス、イヌおよびネコＲＳＰＯ４遺伝子、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３４３６３７（ＲＳＰＯ４、別名ＣＲＩＳＴＩＮ４およびＣ２０ｏｒｆ１８２）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２２８７７０（Ｒｓｐｏ４、別名Ａ７３００９９Ｆ２２およびＡ９３００２９Ｋ１９Ｒｉｋ）、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ４８５８１３、およびＧｅｎＢａｎｋ
Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ １０１０９１５２７を挙げることができる。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、ＲＳＰＯ４の機能的変異体である。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ４変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失（例えば、短縮化）を含むことがあるが、完全長ＲＳＰＯ４の１つまたはそれ以上の活性（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達活性、本明細書に記載および／または例示するアッセイ）に関する一部またはすべての活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、機能的ＲＳＰＯ４変異体は、短縮型ＲＳＰＯ４である。短縮型ＲＳＰＯ４ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号１８および１９、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１８および１９が挙げられる。

【0078】

本明細書で用いる場合、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、通常は特異的ｍＲＮＡ分子の破壊が原因で起こる、ＲＮＡ分子が遺伝子発現を阻害する生物学的過程である。ＲＮＡｉの例としては、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。

【0079】

本明細書で用いる場合、「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「短鎖ヘアピン型ＲＮＡ」（ｓｈＲＮＡ）は、標的遺伝子発現を；例えばＲＮＡ干渉によって、発現停止させるために使用することができる、急なヘアピンターンを生じさせるＲＮＡ分子である。

【0080】

「Ｗｎｔシグナル伝達」は、Ｗｎｔタンパク質とＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）ファミリー受容体との相互作用によって調節される関連細胞シグナル伝達経路の１群を指す（総説については、例えば、Ｌｏｇａｎ，Ｃ．Ｙ．およびＮｕｓｓｅ，Ｒ．（２００４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０：７８１～８１０頁を参照されたい）。これらの経路は、幅広い発生過程および病態形成過程に関係づけられている。本明細書で用いる場合、別段の規定がない限り、用語「Ｗｎｔシグナル伝達」は、正準Ｗｎｔ経路、Ｗｎｔ／平面内細胞極性（ＰＣＰ）経路、および／またはＷｎｔ／カルシウム経路の一部またはすべてを指すことがある。例えば、正準Ｗｎｔ経路では、ＷｎｔのＦｒｉｚｚｌｅｄ／ＬＲＰ受容体複合体との結合は、ディシブルド（Ｄｓｈ）、アキシン、大腸腺腫症（ＡＰＣ）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ－３）活性の修飾をもたらし、最終的にベータ－カテニンの分解を阻害する。したがって、ベータ－カテニンは核に転位し、遺伝子転写を、例えば、リンパ系エンハンサー結合因子１／Ｔ細胞特異的転写因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）転写因子とともに、調節することができる。いくつかの実施形態では、ベーターカテニン活性をＷｎｔシグナル伝達についての読み出しとして（例えば、Ｍｏｌｅｎａａｒ，Ｍ．ら（１９９６）Ｃｅｌｌ ８６（３）：３９１～９頁に特徴が記述されているものなどの、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって）アッセイすることができる。

【0081】

本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体に関する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0082】

本明細書で用いる場合、単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の言及対象を包含する。

【0083】

本明細書に記載する本発明の態様および実施形態が、「含む」、「からなる」および／または「から本質的になる」態様および実施形態を包含することは理解される。

【0084】

ＩＩＩ．処置方法
本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子が哺乳動物の眼に送達される、前記方法を提供する。いくつかの実
施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＣ）である。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障（ＪＯＡＣ）である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒト（例えば、ＰＯＡＣを有するヒトまたはＪＯＡＣを有するヒト）である。いくつかの実施形態において、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有する哺乳動物は、突然変異ＭＹＯＣを有する。いくつかの実施形態において、突然変異ＭＹＯＣは、ヒトＭＹＯＣのＥ３２３Ｋ、Ｋ３９８Ｒ、Ｑ３６８Ｘ、Ｇ３６４Ｖ、Ｐ３７０Ｌ、Ｄ３８０Ａ、Ｋ４２３Ｅ、Ｙ４３７ＨおよびＩ４７７Ｓに対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、突然変異ＭＹＯＣ遺伝子は、ヒトＭＹＯＣのＰ３７０Ｌおよび／またはＹ４３７Ｈアミノ酸置換に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトのミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４もしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えばｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを含む有効量のｒＡＡＶ粒子を該ヒトの眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の症状の軽減；例えば、眼圧の低下、ＭＹＯＣの線維柱帯網内蓄積の低減、高眼圧の低下、または線維柱帯網からの房水流出の増加、に使用される。

【0085】

いくつかの態様において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増進する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を標的とするＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４もしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉを発現する１つまたはそれ以上のウイルス粒子を使用して増進され；例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体とＭＹＯＣ ＲＮＡｉは、異なる組換えウイルスゲノムを有するｒＡＡＶベクターから発現されることもあり、または同じｒＡＡＶウイルスゲノムからのものであることもある。

【0086】

治療用ベクター
本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子が哺乳動物の眼に送達され；例えば、該治療用ベクターは治療用核酸および／または治療用ポリペプチドをコードすることができる、前記方法を提供する。治療用核酸および／または治療用ポリペプチドをコードする治療用ＡＡＶベクターは、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、作成することができる。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、突然変異型ＭＹＯＣの存在下でＷｎｔシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ヒト突然変異型ＭＹＯＣの存在下でＷｎｔシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、緑内障に関連するヒト突然変異型ＭＹＯＣの存在下でＷｎｔシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態において、突然変異型ＭＹＯＣは、Ｐ３７０Ｌおよび／またはＹ４３７Ｈアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、突然変異ＭＹＯＣは、ヒトＭＹＯＣのＥ３２３Ｋ、Ｋ３９８Ｒ、Ｑ３６８Ｘ、Ｇ３６４Ｖ、Ｐ３７０Ｌ、Ｄ３８０Ａ、Ｋ４２３Ｅ、Ｙ４３７ＨおよびＩ４７７Ｓに対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためのｒＡＡＶベクターであって、Ｒ－スポンジン（ＲＳＰＯ）ポリペプチド（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体）をコードする、前記ｒＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１ポリペプチドは、ヒトＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、配列番号８のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。ＲＳＰＯ１機能的変異体の例としては、配列番号８のアミノ酸配列に対する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を有するＲＳＰＯ１が挙げられる。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ１は、配列番号８のアミノ酸配列に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多くの置換、付加および／または欠失を含むが、Ｗｎｔシグナル伝達を（例えば、突然変異型ＭＹＯＣの存在下で）刺激する能力を維持する。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ１は、配列番号８に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１は、短縮型ＲＳＰＯ１である。いくつかの実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ１は、１つまたはそれ以上のフューリン様Ｃｙｓリッチドメイン（例えば、ＦＵ１および／またはＦＵ２）を含むことがあり、しかし次のうちの１つまたはそれ以上がないことがある：シグナルペプチド、トロンボスポンジン１型ドメイン（例えば、ＴＳＲ－１またはＴＳＰ１）、および／または正電荷を有するＣ末端ドメイン（例えば、二分ＮＬＳおよび／またはＢＲドメインを含む；参考のために図１１～１３Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ１は、配列番号１１および／もしくは１２、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１１および／もしくは１２を含むことがある。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ１は、配列番号１１および／または１２に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２ポリペプチドは、ヒトＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、配列番号９のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。ＲＳＰＯ２機能的変異体の例としては、配列番号９のアミノ酸配列に対する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を有するＲＳＰＯ２が挙げられる。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ２は、配列番号９のアミノ酸配列に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多くの置換、付加および／または欠失を含むが、Ｗｎｔシグナル伝達を（例えば、突然変異型ＭＹＯＣの存在下で）刺激する能力を維持する。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ２は、配列番号９に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ２は、短縮型ＲＳＰＯ２である。いくつかの実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ２は、１つまたはそれ以上のフューリン様Ｃｙｓリッチドメイン（例えば、ＦＵ１および／またはＦＵ２）を含むことがあり、しかし次のうちの１つまたはそれ以上がないことがある：シグナルペプチド、トロンボスポンジン１型ドメイン（例えば、ＴＳＲ－１またはＴＳＰ１）、および／または正電荷を有するＣ末端ドメイン（例えば、二分ＮＬＳおよび／またはＢＲドメインを含む；参考のために図１１～１３Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ２は、配列番号１３および／もしくは１４、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１３および／もしくは１４を含むことがある。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ２は、配列番号１３および／または１４に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３ポリペプチドは、ヒトＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、配列番号１のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。ＲＳＰＯ３機能的変異体の例としては、配列番号１のアミノ酸配列に対する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を有するＲＳＰＯ３が挙げられる。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ
３は、配列番号１のアミノ酸配列に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多くの置換、付加および／または欠失を含むが、Ｗｎｔシグナル伝達を（例えば、突然変異型ＭＹＯＣの存在下で）刺激する能力を維持する。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ３は、配列番号１に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ３は、短縮型ＲＳＰＯ３である。いくつかの実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ３は、１つまたはそれ以上のフューリン様Ｃｙｓリッチドメイン（例えば、ＦＵ１および／またはＦＵ２）を含むことがあり、しかし次のうちの１つまたはそれ以上がないことがある：シグナルペプチド、トロンボスポンジン１型ドメイン（例えば、ＴＳＲ－１またはＴＳＰ１）、および／または正電荷を有するＣ末端ドメイン（例えば、二分ＮＬＳおよび／またはＢＲドメインを含む；参考のために図１１～１３Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ３は、配列番号１５、１６および／もしくは１７、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１５、１６および／もしくは１７を含むことがある。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ３は、配列番号１５，１６および／または１７に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４ポリペプチドは、ヒトＲＳＰＯ４である。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、配列番号９のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。ＲＳＰＯ２機能的変異体の例としては、配列番号１０のアミノ酸配列に対する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加および／または欠失を有するＲＳＰＯ２が挙げられる。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ４は、配列番号１０のアミノ酸配列に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より多くの置換、付加および／または欠失を含むが、Ｗｎｔシグナル伝達を（例えば、突然変異型ＭＹＯＣの存在下で）刺激する能力を維持する。いくつかの実施形態において、変異型ＲＳＰＯ４は、配列番号１０に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ４は、短縮型ＲＳＰＯ４である。いくつかの実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ４は、１つまたはそれ以上のフューリン様Ｃｙｓリッチドメイン（例えば、ＦＵ１および／またはＦＵ２）を含むことがあり、しかし次のうちの１つまたはそれ以上がないことがある：シグナルペプチド、トロンボスポンジン１型ドメイン（例えば、ＴＳＲ－１またはＴＳＰ１）、および／または正電荷を有するＣ末端ドメイン（例えば、二分ＮＬＳおよび／またはＢＲドメインを含む；参考のために図１１～１３Ｃを参照されたい）。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ４は、配列番号１８および／もしくは１９、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号１８および１９を含むことがある。ある特定の実施形態において、短縮型ＲＳＰＯ４は、配列番号１８および／または１９に対して約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い同一性を有する。

【0088】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、プロモーターに作動可能に連結されているＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。

【0089】

本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子が哺乳動物の眼に送達され；例えば、該治療用ベクターは治療用核
酸および／または治療用ポリペプチドをコードすることができる、前記方法を提供する。治療用核酸および／または治療用ポリペプチドをコードする治療用ＡＡＶベクターは、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、作成することができる。いくつかの実施形態において、治療用核酸は、ＭＹＯＣの発現を標的とするＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ヒトＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、突然変異型ヒトＭＹＯＣは、Ｐ３７０Ｌアミノ酸置換および／またはＹ４３７アミノ酸置換を含む。治療用核酸の非限定的な例としては、ＲＮＡｉ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および／またはリボザイム（例えば、ハンマーヘッド型およびヘアピンリボザイム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする異種核酸は、ＭＹＯＣ（例えば、野生型および突然変異型ＭＹＯＣ）の発現を低減または阻害するｓｈＲＮＡである。

【0090】

いくつかの態様において、本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子が哺乳動物の眼に送達され、該治療用ベクターは、１つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む、前記方法を提供する。治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、作成することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を標的とする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激にする。

【0091】

いくつかの態様において、本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子が哺乳動物の眼に送達され、該ベクターは、１つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードする核酸と、１つまたはそれ以上の治療用核酸とを含む、前記方法を提供する。治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、作成することができる。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を標的とし、治療用核酸は、ＭＹＯＣ発現を標的とする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激にする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ヒトＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、突然変異型ヒトＭＹＯＣは、Ｐ３７０Ｌアミノ酸置換および／またはＹ４３７アミノ酸置換を含む。治療用核酸の非限定的な例としては、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはリボザイムが挙げられる。

【0092】

いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物におけるミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の遺伝子治療の方法であって、１つまたはそれ以上の治療用ペプチドをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子が該哺乳動物に投与され、１つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子が該哺乳動物に投与される、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を標的とし、治療用核酸は、ＭＹＯＣ発現を標的とする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Ｗｎｔシグナル伝達を刺激にする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。い
くつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ヒトＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、突然変異型ヒトＭＹＯＣは、Ｐ３７０Ｌアミノ酸置換および／またはＹ４３７アミノ酸置換を含む。治療用核酸の非限定的な例としては、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはリボザイムが挙げられる。１つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子、および１つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物に同時に投与されることもあり、または逐次的に投与されることもある。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子が投与される前に投与される。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子が投与された後に投与される。

【0093】

本発明の核酸は、細胞内タンパク質であるポリペプチド、細胞膜に固定されているポリペプチド、細胞内に残存するポリペプチド、または本発明のベクターで形質導入された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードすることがある。ベクターを受け取った細胞によって分泌されるポリペプチドについては；好ましくは、該ポリペプチドは可溶性である（すなわち、細胞に付着していない）。例えば、可溶性ポリペプチドは、膜貫通領域を欠き、細胞から分泌される。膜貫通ドメインをコードする核酸配列を同定および除去する技術は、当技術分野において公知である。

【0094】

本発明に従って投与することができるベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）をコードする核酸を含むベクターであって、該ＲＮＡが、該ベクターの該核酸から転写されたとき、発明の病状に関連する異常なまたは過剰なタンパク質；例えばＭＹＯＣ、の翻訳または転写に干渉することによってミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置することができる、前記ベクターも含む。いくつかの例では、本発明の核酸は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高特異的除去または低減によって疾患を処置するＲＮＡをコードすることもある。治療用ＲＮＡ配列としては、様々な形態の遺伝性網膜変性の際に発生するものなどの、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高特異的除去または低減によって疾患を処置することができる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および／またはリボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよびヘアピンリボザイム）が挙げられる。本発明において使用することができる治療用ＲＮＡ配列およびこれらの配列をコードする核酸の例としては、米国特許第６、２２５，２９１号に記載されているものが挙げられ、前記特許文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。

【0095】

本発明のいくつかの実施形態において、治療用ＲＮＡ配列は、ＭＹＯＣの発現を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）配列である。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣの発現を標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）配列は、ＭＹＯＣの発現を低減または阻害するＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）配列である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、ヒトＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＭＹＯＣの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ
ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は、ＭＹＯＣのＱＡＭＳＶＩＨ（配列番号６）アミノ酸配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＭＹＯＣの発現を標的とする（例えば、低減または阻害する）１つより多くのＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を含むベクターをコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（
例えば、ｓｈＲＮＡ）のループ配列は、ＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴ（配列番号７）の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＭＹＯＣの発現を標的とする（例えば、低減または阻害する）１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を含むベクターをコードする。

【0096】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、プロモーターに作動可能に連結されているＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。

【0097】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、本明細書に記載の任意のＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸、および本明細書に記載の任意のＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸、およびＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸は、異なるｒＡＡＶゲノム上にある。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸、およびＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸は、同じｒＡＡＶゲノム上にある。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸、およびＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸は、同じプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸、およびＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸は、異なるプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸は、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸の５’側にある。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸は、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸の３’側にある。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードする核酸、およびＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸は、同じプロモーターに作動可能に連結されており、この場合、前記核酸は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体とＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）核酸との間に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

【0098】

ｒＡＡＶ組成物
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載するｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。一般に、本発明の方法およびシステムに使用するための組成物は、好ましくは、医薬的に許容される賦形剤中の、ポリペプチドおよび／またはＲＮＡをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子の有効量を含む。当技術分野において周知であるように、医薬的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を助長する比較的不活性な物質であり、溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、封入剤、ｐＨ緩衝物質および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。
そのような賦形剤は、過度の毒性なく投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品を含む。医薬的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、そこに含めることができる。医薬的に許容される賦形剤の詳細な論考は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手することができる。

【0099】

一般に、これらの組成物は、眼内注射（例えば、硝子体内、前房内、網膜下注射）による投与用に製剤化される。したがって、これらの組成物は、好ましくは医薬的に許容されるビヒクル、例えば食塩水、リンゲル平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）などと併用される。必須ではないが、場合によっては、組成物を正確な量の投与に好適な単位剤形で供給してもよい。

【0100】

いくつかの実施形態において、本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の処置のためのｒＡＡＶの医薬製剤を提供する。いくつかの実施形態において、製剤は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体とＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）とをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子と、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子とを含む。

【0101】

ｒＡＡＶの眼内送達方法
いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３および／もしくはＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターと、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターとを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、硝子体内および／前房内注射によって眼に送達される。ｒＡＡＶ粒子の眼への投与方法は、当技術分野において公知である。

【0102】

いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４もしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の眼に送達され、そこでその眼の線維柱帯網において前記ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４もしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）は発現される。いくつかの実施形態において、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４またはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の眼に送達され、そこでその眼の他の部分（例えば、網膜神経節細胞が形質導入される。Ｒ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の使用は、線維柱帯網の細胞への形質導入を助長することができる。

【0103】

治療用ポリペプチドまたは核酸配列を含むベクターの眼細胞（例えば線維柱帯網の細胞）への安全かつ効率的形質導入によって、形質導入された細胞がミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障（例えば、ＰＯＡＣまたはＪＯＡＣ）の処置に十分な量の治療用ポリペプチドまたはＲＮＡ配列を産生する本発明の方法は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有する個体；例えばヒトを処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、眼細胞への形質導入は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＡＡＶカプシドタンパク質のＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むｒＡＡＶ２粒子を使用することによって向上される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線維柱帯網の細胞への形質導入増加；例えば、線維柱帯網の細胞の約１０％超、２５％、５０％、７５％、１００％またはこれらの間の任意の数への形質導入を示す。

【0104】

ｒＡＡＶ（いくつかの実施形態では、粒子の形態のもの）の有効量が処置の目的に応じて投与される。例えば、低い形質導入パーセンテージが所望の治療効果を達成できる場合には、処置の目的は、一般に、この形質導入レベルを満たすまたは超えることである。いくつかの例では、この形質導入レベルを、標的細胞（例えば、線維柱帯網の細胞）のたった約１～５％、いくつかの実施形態では所望の組織タイプの細胞の少なくとも約２０％、いくつかの実施形態では少なくとも約５０％、いくつかの実施形態では少なくとも約８０％、いくつかの実施形態では少なくとも約９５％、いくつかの実施形態では所望の組織タイプの細胞の少なくとも約９９％の形質導入によって達成することができる。参考のために、１回の注射で投与される粒子の数は、一般に、粒子約１×１０^６～約１×１０^１４の間、粒子約１×１０^７～１×１０^１３の間、粒子１×１０^９～１×１０^１２の間、または粒子１×１０^９、粒子約１×１０^１０、もしくは粒子約１×１０^１１である。ｒＡＡＶ組成物は、同じ手技の間に、または数日、数週間、数カ月もしくは数年間隔を空けて、１回またはそれ以上の眼内注射によって投与されることがある。いくつかの実施形態では、複数のベクターを使用してヒトを処置することもある。

【0105】

ＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された眼細胞を同定する方法は、当技術分野において公知であり；例えば、免疫組織化学、または高感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を用いて、ウイルス粒子；例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子、の形質導入を検出することができる。

【0106】

本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有する個体；例えば、ＰＯＡＣまたはＪＯＡＣを有するヒトを処置するための、有効量のＡＡＶウイルス粒子の哺乳動物への硝子体内および／または前房内投与を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、前記眼の細胞（例えば、線維柱帯網の細胞）において異種核酸を発現させるために眼内の１カ所またはそれ以上の位置に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、眼内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所または１０カ所より多くの位置のいずれかの１つに注射される。

【0107】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶウイルス粒子は、１カ所より多くの位置に同時にまたは逐次的に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間を超えて間隔を空けない。

【0108】

網膜下送達方法
網膜下送達方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照によって本明細書に組み入れられているＷＯ２００９／１０５６９０を参照されたい。簡単に言うと、ｒＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ２粒子）を黄斑および中心窩の網膜下に送達するための一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない
。

【0109】

一般に、ｒＡＡＶベクターは、手術用顕微鏡を使用して直接観察しながら眼内（網膜下）注射される組成物の形態で送達することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｒＡＡＶ粒子のカプシドに封入され、該ｒＡＡＶ粒子は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する（例えば、ＨＳＰＧ結合を低減または阻害または減少させる）１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む。この手順は、硝子体切開、続いての、網膜下腔への１回またはそれ以上の小さい網膜切開によって細いカニューレを使用するｒＡＡＶベクター懸濁液の注射を含む。

【0110】

簡単に言うと、注入カニューレを所定の位置に縫合して、手術の間ずっと（例えば食塩水の）注入により正常眼球容積を維持することができる。硝子体切除は、適切な口径（例えば、２０～２７ゲージ）のカニューレを使用して行われ、除去される硝子体ゲルの容量は、注入カニューレからの食塩水または他の等張液の注入によって置換される。硝子体切除は、（１）その皮質（後部硝子体膜）の除去がカニューレによる網膜の貫通を助長する；（２）その除去および流体（例えば食塩水）による置換が、ベクターの眼内注射に適応する腔を形成する、および（３）その制御された除去が、網膜裂孔および予定外の網膜剥離の可能性を低減させるため、行うと有利である。

【0111】

いくつかの実施形態では、適切な口径（例えば、２７～４５ゲージ）のカニューレを利用して、中心網膜の外側の網膜下腔にｒＡＡＶ組成物を直接注射し、かくして網膜下腔にブレブを形成する。他の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の網膜注射の前に、少量（例えば、約０．１～約０．５ｍｌ）の適切な流体（例えば、食塩水またはリンゲル液）を中心網膜の外側の網膜下腔に網膜下注射する。網膜下腔へのこの初回注射によって網膜下腔内に最初のブレブが構築され、これに起因してその最初のブレブの位置に網膜剥離が限局される。この最初の流体ブレブは、（ｒＡＡＶ送達前に注射面を規定することにより）網膜下腔へのｒＡＡＶ組成物の標的送達を助長することができ、可能性のある脈絡膜へのｒＡＡＶ投与を最小にすることができ、硝子体腔へのｒＡＡＶ注射または逆流の可能性を最小にすることができる。いくつかの実施形態では、１つもしくはそれ以上のｒＡＡＶ組成物および／または１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤を含む流体を最初の流体ブレブに、同じまたはさらなる細径カニューレいずれかでの最初の流体ブレブへのこれらの流体の直接投与よって、さらに注射することができる。

【0112】

ｒＡＡＶ組成物および／または最初の少量の流体の眼内投与は、注射器に取り付けられた細径カニューレ（例えば、２７～４５ゲージ）を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、この注射器のプランジャーは、機械化デバイスによって、例えば、足踏みペダルを押し下げることによって駆動することができる。細径カニューレを、強膜切開により、硝子体腔を横断して、標的となる網膜の領域に従って各対象の網膜の所定の部位（しかし中心網膜の外側）に進ませる。直接見えるようにしながら、自然に閉じる拡大しない網膜切開で網膜剥離を限局させてベクター懸濁液を網膜神経感覚上皮下に機械的に注射する。上で述べたように、ｒＡＡＶ組成物を網膜下腔に直接注射して中心網膜の外側のブレブを形成することができ、または該ベクターを中心網膜の外側の最初のブレブに注射してそのブレブを膨張させる（そして網膜剥離領域を拡大する）ことができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の注射後に別の流体がブレブに注射される。

【0113】

理論に拘束されることを望むものではないが、網膜下注射の速度および位置によって、黄斑、中心窩および／または下にあるＲＰＥ細胞を損傷させることがある局所的剪断力が生じる結果となることがある。剪断力を最小にするまたは回避する速度で網膜下注射を行
ってもよい。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約１５～１７分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約１７～２０分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約２０～２２分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約３５～約６５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約３５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約４０μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約４５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約５０μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約５５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約６０μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約６５μｌ／分の速度で注射される。ブレブの注射速度および時間が、例えば、中心網膜の細胞に接近するのに十分な網膜剥離を生じさせるために必要なｒＡＡＶ組成物の容量またはブレブのサイズ、ｒＡＡＶ組成物を送達するために使用されるカニューレのサイズ、および本発明のカニューレの位置を安全に維持する能力によって左右されることがあることは、当業者には理解されるであろう。

【0114】

本発明のいくつかの実施形態において、網膜の網膜下腔に注射される組成物の容量は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬのいずれか１つより多いか、またはそれらの間の任意の量である。

【0115】

１つまたは複数（例えば、２、３もしくはそれ以上の）ブレブを形成することができる。一般に、本発明の方法およびシステムによって形成されるブレブの全容量は、眼の流体容量、例えば典型的なヒト対象では約４ｍｌ、を超えることができない。個々のブレブ各々の合計容量は、中心網膜の細胞タイプを暴露するのに十分なサイズの網膜剥離を助長するために、および最適な操作に十分な依存度のブレブを生成するために、好ましくは少なくとも約０．３ｍｌであり、より好ましくは少なくとも約５ｍｌである。本発明の方法およびシステムに従ってブレブを生成する際、眼の構造に対する損傷を回避するために適切な眼圧を維持しなければならないことは、当業者には理解されるであろう。個々のブレブ各々のサイズは、例えば、約０．５～約１．２ｍｌ、約０．８～約１．２ｍｌ、約０．９～約１．２ｍｌ、約０．９～約１．０ｍｌ、約１．０～約２．０ｍｌ、約１．０～約３．０ｍｌであることがある。したがって、一例では、合計３ｍｌのｒＡＡＶ組成物懸濁液を注射するために、各々約１ｍｌの３個のブレブを構築することができる。併せてすべてのブレブの合計容量は、例えば、約０．５～約３．０ｍｌ、約０．８～約３．０ｍｌ、約０．９～約３．０ｍｌ、約１．０～約３．０ｍｌ、約０．５～約１．５ｍｌ、約０．５～約１．２ｍｌ、約０．９～約３．０ｍｌ、約０．９～約２．０ｍｌ、約０．９～約１．０ｍｌとなるだろう。

【0116】

ブレブの原位置の縁部の外側の標的網膜（例えば、中心網膜）領域に安全かつ効率的に形質導入するために、ブレブを操作して形質導入の標的領域にブレブを再配置してもよい。このブレブの操作は、ブレブの容量が生じさせるブレブの依存性によって、眼のブレブを有する位置を変えることによって、ヒトの頭と眼または１つもしくはそれ以上のブレブを有する眼とを位置合わせし直すことによって、および／または液空気置換を用いて行うことができる。これは、特に、中心網膜に関する。この領域は通常は網膜下注射による剥離に耐えるからである。いくつかの実施形態では、流空気置換を用いてブレブを再配置し；注入カニューレからの流体を空気によって、例えば、網膜表面への吹き込み空気によって、一時的に置換する。大量の空気が網膜表面から硝子体腔液を追い出すので、その硝子体腔内の流体はカニューレから流出することができる。硝子体腔液からの圧力の一時的な
欠如に起因して、ブレブは移動し、眼の依存部に引き寄せられる。眼球を適切に配置することによって、隣接領域（例えば、黄斑および／または中心窩）を含むように網膜下ｒＡＡＶ組成物のブレブを操作する。場合によっては、ブレブの大部分は、流空気置換を使用しなくてもブレブを引き寄せさせるのに十分なものである。眼内の所望の位置にブレブを引き寄せさせるように対象の頭の位置を変えることによって、所望の位置へのブレブの移動をさらに助長してもよい。ブレブの所望の立体配置を達成したら、流体を硝子体腔に戻す。この流体は、適切な流体、例えば、作りたての食塩水である。一般に、網膜下ｒＡＡＶ組成物を網膜切開に対する網膜裂孔閉鎖術なしで、および眼内タンポナーデなしで、生体内原位置に放置してもよく、網膜は約４８時間以内に自然に再付着することになる。

【0117】

治療用ポリペプチドまたはＲＮＡ配列を含むベクターの眼細胞（例えば線維柱帯網の細胞）への安全かつ効率的形質導入によって、形質導入された細胞がミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の処置に十分な量の治療用ポリペプチドまたはＲＮＡ配列を産生する本発明の方法は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有する個体；例えばヒトを処置するために使用することができる。

【0118】

ｒＡＡＶ（いくつかの実施形態では、粒子の形態のもの）の有効量が治療目的に応じて投与される。例えば、低い形質導入パーセンテージによって所望の治療効果が達成できる場合には、処置の目的は、一般に、この形質導入レベルを満たすまたは超えることである。いくつかの例では、この形質導入レベルを、標的細胞のたった約１～５％、いくつかの実施形態では所望の組織タイプの細胞の少なくとも約２０％、いくつかの実施形態では少なくとも約５０％、いくつかの実施形態では少なくとも約８０％、いくつかの実施形態では少なくとも約９５％、いくつかの実施形態では所望の組織タイプの細胞の少なくとも約９９％に形質導入することによって達成することができる。上で論じたように、ＨＳＰＧと相互作用するｒＡＡＶカプシドの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換は、ｒＡＡＶ形質導入を向上させる。参考のために、１回の注射で投与される粒子の数は、一般に、粒子約１×１０^６～１×１０^１４の間、粒子約１×１０^７～１×１０^１３の間、粒子約１×１０^９～１×１０^１２の間、または粒子約１×１０^１１である。ｒＡＡＶ組成物は、同じ手技の間に、または数日、数週間、数カ月もしくは数年間隔を空けて、１回またはそれ以上の網膜下注射によって投与されることがある。いくつかの実施形態では、複数のベクターを使用してヒトを処置することもある。

【0119】

いくつかの実施形態において、治療有効量のｒＡＡＶウイルス粒子の眼への投与は、眼細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％のいずれかを超える％、もしくは１００％、またはこれらの間の任意の％への形質導入をもたらす。いくつかの実施形態では、眼細胞の約５％～約１００％、１０％～約５０％、約１０％～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％が形質導入される。ｒＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された眼細胞を同定する方法は、当技術分野において公知であり；例えば、免疫組織化学、または高感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を用いて、ウイルス粒子の形質導入を検出することができる。

【0120】

いくつかの実施形態において、治療有効量のｒＡＡＶウイルス粒子の線維柱帯網への投与は、線維柱帯網細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％のいずれかを超える％、もしくは１００％、またはこれらの間の任意の％への形質導入をもたらす。いくつかの実施形態では、線維柱帯網細胞の約５％～約１００％、１０％～約５０％、約１０～約３０％、約２５％～約７５％、約２５％～約５０％、または約３０％～約５０％に形質導入される。ｒＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された線維柱帯網胞を同定する方法は、当技術分野において公知であり；例えば、免疫組織化学、または高
感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を用いて、ウイルス粒子の形質導入を検出することができる。

【0121】

本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有する個体；例えば、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有するヒトを処置するために、有効量のＡＡＶウイルス粒子を哺乳動物の眼に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、眼細胞において異種核酸を発現させるために眼内の１カ所またはそれ以上の位置に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、眼内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所または１０カ所より多くの位置のいずれかの１つに注射される。

【0122】

本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有する個体；例えば、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を有するヒトを処置するために、有効量のＡＡＶウイルス粒子を哺乳動物の線維柱帯網に投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、線維柱帯網細胞において異種核酸を発現させるために線維柱帯網内の１カ所またはそれ以上の位置に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、線維柱帯網内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所または１０カ所より多くの位置のいずれかの１つに注射される。

【0123】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子は、１カ所より多くの位置に同時にまたは逐次的に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間を超えて間隔を空けない。

【0124】

硝子体内注射の方法
硝子体内注射の一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない。硝子体内注射の手技は、当技術分野において公知である（例えば、Ｐｅｙｍａｎ，Ｇ．Ａ．ら（２００９）Ｒｅｔｉｎａ ２９（７）：８７５～９１２頁、ならびにＦａｇａｎ，Ｘ．Ｊ．およびＡｌ－Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．（２０１３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４１（５）：５００～７頁を参照されたい）。

【0125】

簡単に言うと、硝子体内注射の対象に、瞳孔拡大、眼の消毒、および麻酔薬の投与によってその手技のための準備を施すことができる。当技術分野において公知のいずれの好適な散瞳薬を瞳孔拡大に使用してもよい。十分な瞳孔拡大を確認した後、処置することができる。消毒は、眼の消毒処置薬、例えば、ポビドン－ヨード（ＢＥＴＡＤＩＮＥ（登録商標））などのヨウ素含有溶液を適用することによって果たすことができる。まぶた、まつげおよび任意の他の周囲の組織（例えば、皮膚）を清浄にするために同様の溶液を使用してもよい。いずれの好適な麻酔薬、例えばリドカインまたはプロパラカインを、いずれの好適な濃度で使用してもよい。麻酔薬は、限定ではないが、局所滴剤、ゲルまたはゼリー、および麻酔薬の結膜下適用をはじめとする、当技術分野において公知の任意の方法によって投与することができる。

【0126】

注射に先立ち、消毒した開瞼器を使用して、その領域からまつげをなくす。注射部位に注射器で印をつけてもよい。注射部位を患者の水晶体に基づいて選択してもよい。例えば、注射部位は、偽水晶体または無水晶体患者の場合は縁から３～３．５ｍｍ、有水晶体患者の場合は縁から３．５～４ｍｍであることがある。患者は、注射部位とは反対の方を見ることができる。

【0127】

注射中に、針を強膜に垂直に挿入し、眼の中心に向けてもよい。針を、先端が網膜下腔ではなく硝子体腔内で終わるように挿入してもよい。当技術分野において公知のいずれの好適な注射量を使用してもよい。注射後、眼を抗生物質などの消毒薬で処置してもよい。眼をすすいで過剰な消毒薬を除去してもよい。

【0128】

前房内注射の方法
眼への前房内注射方法は、当技術分野において公知である。前房内注射の非限定的な例は、Ｂｕｉｅら（２０１０）ＩＯＶＳ ５１（１）：２３６～２４８頁によって提供されている。

【0129】

硝子体内または前房内注射によるｒＡＡＶ送達の有効性を、本明細書に記載のいくつかの基準によってモニターすることができる。例えば、本発明の方法を使用して対象の処置を行った後、本明細書に記載するものを含む１つまたはそれ以上の臨床パラメータによって、例えば、病状の１つまたはそれ以上の兆候または症状の改善および／もしくは安定化ならびに／または進行遅延について、対象を評価してもよい。そのような試験の例は当技術分野において公知であり、客観的測定はもちろん、主観的（例えば、対象によって報告される）測定も含む。例えば、対象の視覚機能に対する処置の有効性を測定するために、次のうちの１つまたはそれ以上を評価してもよい：対象の主観的な見え方の質または中心視機能の向上（例えば、対象の流暢に読む能力および顔を認識する能力の向上）、対象の視覚の動き（例えば、迷路を進むために必要な時間の減少）、視力（例えば、対象のＬｏｇＭＡＲスコアの向上）、微小視野測定（例えば、対象のｄＢスコアの向上）、暗順応視野測定（例えば、対象のｄＢスコアの向上）、微細マトリックスマッピング（例えば、対象のｄＢスコアの向上）、ゴールドマン視野測定（例えば、暗点領域（すなわち盲領域）のサイズ低減およびより小さい標的を解像する能力の向上）、フリッカー感度（例えば、ヘルツの向上）、自発蛍光、および電気生理学測定（例えば、ＥＲＧの向上）。いくつかの実施形態において、視覚機能は、対象の視覚の動きによって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、対象の視力によって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、微小視野測定によって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、暗順応視野測定によって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、ＥＲＧによって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、対象の主観的な見え方の質によって測定される。

【0130】

本明細書に記載する方法および組成物にいずれについても、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の医学的検査を用いて、本明細書に記載する処置の効能を評価すること、または本明細書に記載する処置の恩恵に浴することができる患者を診断することができる。ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を診断またはモニターするための非常に多くの医学的検査が当技術分野において公知である。例えば、検眼鏡検査、レーザー旋光分析、光干渉断層撮影（ｏｃｕｌａｒ ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、および／または走査レーザー断層撮影を用いて、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障によって損傷されている可能性がある視神経を検査することができる。眼圧は、眼圧検査によって測定することができる。パキメータを使用して中心角膜厚を測定することができる（例えば、薄い中心角膜厚は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を示すことができる）。視野検査を用いて視野を評価することができる。

【0131】

上で説明したように、ミオシリン突然変異は、原発開放隅角ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障（ＰＯＡＧ）関係づけられている。したがって、ＰＯＡＧを診断するための医学的検査を用いて、本明細書に記載する処置の効能を評価すること、または本明細書に記載する処置の恩恵に浴することができる患者を診断することができる。当技術分野において公知のＰＯＡＧを診断するための任意の医学的検査を用いて、例えば、ＰＯＡＧを別の型のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障（例えば、閉塞隅角緑内障）と区別することができる。例え
ば、隅角鏡検査を用いて、ＰＯＡＧの診断を助ける評価を得ることができる。

【0132】

ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の処置の効能を動物モデルで試験することができる。ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の動物モデルは、当技術分野において公知である。例えば、Ｙ４３７ＨヒトＭＹＯＣまたはＹ４２３ＨマウスＭＹＯＣを発現するマウスは、ＰＯＡＧに類似したミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障症状を発症することが実証されている（Ｚｏｄｅら（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１（９）：３５４２～５３頁、およびＳｅｎａｔｏｒｏｖ，Ｖ．ら（２００６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６（４６）：１１９０３～１４頁を参照されたい）。加えて、一酸化窒素受容体可溶性グアニル酸シクラーゼのアルファサブユニットがないマウスは、もう１つのＰＯＡＧモデルである（Ｂｕｙｓ，Ｅ．Ｓ．ら（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（３）：ｅ６０１５６）。ラットモデルも開発されている；アデノウイルス遺伝子導入によって送達されたヒトＴＧＦ－ベータを発現するラットはＩＯＰ上昇を示す（Ｓｈｅｐａｒｄ，Ａ．Ｒ．ら（２０１０）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．５１（４）：２０６７～７６頁）。霊長類、イヌおよびゼブラフィッシュモデルを含む、ＰＯＡＧの様々な態様についての他の動物モデルのさらなる説明は、Ｂｏｕｈｅｎｎｉ，Ｒ．Ａ．ら（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２：６９２６０９において見い出すことができる。

【0133】

一部の眼障害には、あるタイプの細胞の機能の向上が別のタイプの細胞の機能を向上させる「ナース細胞」現象がある。例えば、本発明のｒＡＡＶによる中心網膜のＲＰＥへの形質導入は杆体の機能を向上させることができ、そしてまた、向上された杆体機能が、錐体機能向上をもたらす。したがって、あるタイプの細胞の処置は、別のタイプの細胞に関する機能向上をもたらすことができる。ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障において、ＴＭへの形質導入によるＩＯＰの低下は、神経節細胞構造よび機能の変性を低減させることになる。

【0134】

特定のｒＡＡＶベクターおよび組成物の選択は、個々のヒトの病歴ならびに処置される状態および個体の特徴を含むがこれらに限定されない、多数の異なる因子に依存する。そのような特徴の評価および適切な治療レジメンの設計は、最終的には、処方する医師の責任である。

【0135】

本発明の組成物（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４もしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする、ＡＡＶウイルス粒子）を単独で使用することができ、または眼障害を処置するための１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤と併用することができる。逐次投与間の間隔は、少なくとも数分、数時間もしくは数日（または、代替的に、数分、数時間もしくは数日未満の）単位であってよい。

【0136】

いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤が線維柱帯網に投与されることもある。さらなる治療剤の非限定的な例としては、プロスタグランジン、例えば、キサラタン、ルミガン、トラバタンズおよびレスキュラ；ティモプティックＸＥ、イスタロールおよびベトプティックＳを含むベータ遮断薬；アイオピジン、アルファガン、アルファガン－Ｐを含むアルファ－アドレナリン刺激薬；トルソプトおよびエイゾプト、ダイアモックス、ネプタザンおよびダラナイドを含む炭酸脱水酵素阻害剤；ピロカルピン、カルバコール、エコチオパートおよびデメカリウムを含む副交感神経刺激薬；プロピンを含む、エピネフリン；またはコソプト、コンビガンおよびデュオトラバを含む併用処置が挙げられる。

【0137】

ＩＶ．発現構築物
本発明は、異種核酸を含むｒＡＡＶベクターの網膜下送達によって眼に異種核酸を送達
する方法であって、該ｒＡＡＶベクターは、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むｒＡＡＶカプシドに封入されている、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、異種核酸（例えば、導入遺伝子）は、プロモーターに作動可能に連結されている。例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３～９頁）および伸長因子１－αプロモーター（ＥＦ１－α）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７～２３頁およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２～１０頁）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトβ－グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されているサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、眼の細胞において異種核酸を発現する能力がある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光受容器細胞またはＲＰＥにおいて異種核酸を発現する能力がある。実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、例えば、ヒトＲＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、オプシンプロモーター、例えば、ヒトオプシンプロモーターまたはマウスオプシンプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＣＢＡプロモーターの制御下のＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＣＢＡプロモーターの制御下のＭＹＯＣ（例えば、ヒトＭＹＯＣ）を標的とする（例えば、低減または阻害する）ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＣＢＡプロモーターの制御下のＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子と、ＣＢＡプロモーターの制御下のＭＹＯＣ（例えば、ヒトＭＹＯＣ）を標的とする（例えば、低減または阻害する）ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子とを該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する方法であって、ＣＢＡプロモーターの制御下のＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体とＣＢＡプロモーターの制御下のＭＹＯＣ（例えば、ヒトＭＹＯＣ）を標的とする（例えば、低減もしくは阻害する）ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）とをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子を該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。

【0138】

本発明は、ｒＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングのために治療用ポリペプチドおよび／または核酸をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を導入するための組換えウイルスゲノムの使用を企図している。組換えウイルスゲノムとしては、治療用ポリペプチド
および／または核酸の発現を確立するための任意の要素、例えば、プロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合要素、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を挙げることができる。

【0139】

いくつかの態様において、本発明は、組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子を提供する。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子、および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号；同第７，７６５，５８３号；同第７，７８５，８８８号；同第７，７９０，１５４号；同第７，８４６，７２９号；同第８，０９３，０５４号；および同第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分相補性配列（例えば、導入遺伝子の相補性コードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成することになる。いくつかの実施形態において、第１の異種核酸配列と第２の異種核酸配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結されている。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２０）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端切断配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製中に、ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを突然変異ＩＴＲで切断しないことになり、したがって、５’から３’の順序で以下のものを含む組換えウイルスゲノムは、ウイルスカプシドにパッケージングされることになる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ヌクレオチドに対して逆向きの第２のポリヌクレオチド配列、そして第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

【0140】

ＶＩ．ウイルス粒子およびウイルス粒子の生産方法
ｒＡＡＶウイルス粒子
本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するためにｒＡＡＶ粒子を使用する方法を提供し、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲと隣接している、本明細書に記載するＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えばｓｈＲＮＡ）をコードする配列を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子に封入されている。ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質も含む。いくつかの実施形態において、核酸は、転写方向に成分が作動可能に連結されている目的（例えば、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えばｓｈＲＮＡ）をコードする核酸）のコード配列、転写開始および終結配列を含む制御配列を含み、それによって発現カセットを形成する。発現カセットは、その５’および３’末端に少なくとも１つの機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接している。「機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、該ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングのために意図した通りに機能することを意味する。Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４～４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０～１６頁を参照されたい。これらの参考文献のすべては、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。本発明のいくつかの態様を実施するために、組換えベクターは、カプシド封入に不可欠なＡＡＶの配列のすべておよびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を少なくとも含む。本発明のベクターに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要がなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３～８０１頁に記載の通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって改変されていてもよく、またはいくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由
来するものであってもよい。ＡＡＶの４０より多くの血清型が今では公知であり、新たな血清型、および既存の血清型の変異体が同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１～６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照されたい。任意のＡＡＶ血清型の使用が本発明の範囲内で考えられる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶなどを限定ではないが含む、ＡＡＶ血清型に由来するベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ血清型逆位末端反復配列（ＩＴＲ）などのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体；ＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）；またはＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体と本明細書に記載のＭＹＯＣをさらにコードする。例えば、ＡＡＶ中の核酸は、本明細書において企図される任意のＡＡＶ血清型の、少なくとも１つのＩＴＲを含むことができ、配列番号６を標的とし、かつ配列番号７のループ配列を含むＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸、ならびに／または次のうちの１つもしくはそれ以上をさらにコードすることができる：配列番号８、１１および／もしくは１２を含むＲＳＰＯ１；配列番号９、１３および／もしくは１４を含むＲＳＰＯ２；配列番号１、１５、１６および／もしくは１７を含むＲＳＰＯ３；ならびに配列番号１０、１８および／もしくは１９を含むＲＳＰＯ４。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号８、１１もしくは１２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＲＳＰＯ１；配列番号９、１３もしくは１４と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＲＳＰＯ２；配列番号１もしくは１５～１７と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＲＳＰＯ３；または配列番号１０、１８もしくは１９と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるＲＳＰＯ４をコードする。

【0141】

さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６（例えば、野生型ＡＡＶ６カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載されているような変異型ＡＡＶ６カプシド、例えばＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９（例えば、野生型ＡＡＶ９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載されているような修飾ＡＡＶ９カプシド）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、チロシンカプシド突然変異体、ヘパリン結合カプシド突然変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａカプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８カプシド、ＡＡＶ ＤＪカプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８カプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９カプシド、もしくは米国特許登録前出願公開２０１２／００６６７８３号に記載されている他の任意のカプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａカプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａカプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋカプシド、ヤギＡＡＶカプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラカプシド、ウシＡＡＶカプシド、マウスＡＡＶカプシド、ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１カプシド、または米国特許第８，２８３，１５１号もしくは国際公開番号ＷＯ／２００３／０４２３９７に記載されているＡＡＶカプシドのカプシドタンパク質を含む。いく
つかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５またはＲ５８８位のうちの１カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドを含む。さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～ＦのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、突然変異型カプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドを形成する能力を維持する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線維柱帯網への形質導入を可能にするカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、線維柱帯網への形質導入を可能にする突然変異型カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質であって、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含む前記カプシドタンパク質を含む（Ｌｏｃｈｒｉｅ ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２００６）８０（２）：８２１～８３４頁）。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体をコードするベクター；ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシド；および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを含む、ｒＡＡＶ粒子を提供する。

【0142】

いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するための組成物および方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２ウイルス粒子が該哺乳動物の眼に送達され、そこでその眼の異なる部分（例えば、網膜）が形質導入され得、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａウイルス粒子が該哺乳動物の眼に送達され、そこで線維柱帯網の細胞が形質導入される、前記組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するための組成物および方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａウイルス粒子と、ＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａウイルス粒子とが、該哺乳動物の眼に送達され、そこで線維柱帯網の細胞が形質導入される、前記組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物のミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置するための組成物および方法であって、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードし、かつＭＹＯＣ ＲＮＡｉをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａウイルス粒子が、該哺乳動物の眼に送達され、そこで線維柱帯網の細胞が形質導入される、前記組成物および方法を提供する。

【0143】

いくつかの態様において、本発明は、導入遺伝子を（例えば、治療用導入遺伝子を眼の線維柱帯網に）送達するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、ＡＡＶ２のＶＰ１を基準にしてナンバリングしてＲ４７１Ａアミノ酸置換を含む突然変異型カプシドを含む、ｒＡＡＶ２粒子を使用する。そのような組成物および方法は、眼疾患；例えば、線維柱帯網に関連する眼疾患、例えばミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障、の処置に使用することができる。

【0144】

様々なＡＡＶ血清型が、特定の標的細胞への形質導入を最適化するために、または特定の標的組織（例えば、罹病組織）内の特異的細胞タイプを標的化するために、使用される。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。

【0145】

自己相補型ＡＡＶウイルスゲノム
いくつかの態様において、本発明は、組換え自己相補型ゲノムを含むウイルス粒子を提
供する。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子、および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号；同第７，７６５，５８３号；同第７，７８５，８８８号；同第７，７９０，１５４号；同第７，８４６，７２９号；同第８，０９３，０５４号；および同第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分相補性配列（例えば、導入遺伝子の相補性コードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成することになる。いくつかの実施形態において、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子であって、該ｒＡＡＶゲノムが、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ｍｉＲ－７０８および／またはロドプシンコード鎖）と、第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ｍｉＲ－７０８のアンチセンス鎖および／またはロドプシン非コードもしくはアンチセンス鎖）とを含み、該第１の異種ポリヌクレオチド配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２のポリヌクレオチド配列と鎖間塩基対を形成することができる、前記ＡＡＶウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖間塩基対合を助長する配列；例えば、ヘアピンＤＮＡ構造、によって連結されている。ヘアピン構造、例えば、ｓｉＲＮＡ分子のヘアピン構造は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結されている。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ－３’（配列番号２０）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端切断配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製中に、ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを突然変異ＩＴＲで切断しないことになり、したがって、５’から３’の順序で以下のものを含む組換えウイルスゲノムがウイルスカプシドにパッケージングされることになる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドに対して逆向きの第２の異種ポリヌクレオチド、そして第３のＡＡＶ ＩＴＲ。いくつかの実施形態において、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子であって、該組換えウイルスゲノムが、機能的ＡＡＶ２ ＩＴＲと、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、Ｄ領域の欠失を含み、機能的末端切断配列がない、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲと、該第１のポリヌクレオチド配列のＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする配列に対する相補配列を含む第２のポリヌクレオチド配列と、機能的ＡＡＶ２ ＩＴＲとを含む前記ＡＡＶウイルス粒子を提供する。

【0146】

ＡＡＶ粒子の生産
ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野において公知の方法を用いて生産することができる。例えば、米国特許６，５６６，１１８号；同第６，９８９，２６４号；および同第６，９９５，００６号を参照されたい。本発明を実施する場合、ｒＡＡＶ粒子を生産する宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物細胞および酵母が挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が宿主細胞内に安定的に維持されるパッケージング細胞、またはＡＡＶベクターゲノムが安定的に維持されるプロデューサー細胞である場合もある。例示的パッケージングおよびプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９またはヒーラ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当技術分野において公知の標準的技術を用いてを精製され、製剤化される。

【0147】

いくつかの態様では、本明細書に開示の任意のｒＡＡＶ粒子を生産する方法を提供し、この方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が生産される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞は、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子［ここで、該ＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製および／またはカプシド封入タンパク質をコードする］と；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲが隣接している本明細書に記載の治療用ポリペプチドおよび／または核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクターと、（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能とを含む、前記工程；および（ｂ）前記宿主細胞によって生産されたｒＡＡＶ粒子を回収する工程を含む。

【0148】

さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を精製する。用語「精製された」は、本明細書で用いる場合、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するまたは元はそこから調製された場所に存在することもある他の成分の少なくとも一部がないｒＡＡＶ粒子の製品を含む。したがって、例えば、ソース混合物、例えば培養溶解物または生産培養上清、からｒＡＡＶ粒子を濃縮する精製技術を用いて、単離されたｒＡＡＶ粒子を製造してもよい。濃縮は、様々な方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率よって、または感染力よって、測定することができ、またはソース混合物中に存在する第２の、干渉する可能性のある物質、例えば、不純物［生産培養不純物もしくは工程内不純物（ヘルパーウイルス、培地成分などを含む）を含む］に関して測定することができる。

【0149】

治療用ポリペプチドおよび／または治療用核酸をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶ粒子であって、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むｒＡＡＶカプシドを含む前記ｒＡＡＶ粒子、ならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も本明細書において提供する。前記医薬組成物は、本明細書に記載する任意の投与方式；例えば網膜下投与によるもの、に好適であるだろう。

【0150】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載するｒＡＡＶと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物は、ヒトへの投与に好適である。そのような担体は、当技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５～１０３８頁および１５７０～１５８０頁を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載するｒＡＡＶと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物は、眼注射に好適である。そのような医薬的に許容される担体は、滅菌液、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油などを含む）であることができる。食塩溶液ならびにデキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール水溶液も、特に注射用溶液のために、液体担体として用いることができる。医薬組成物は、さらなる成分、例えば、保存薬、緩衝剤、等張化剤、抗酸化物質および安定剤、非イオン性湿潤または清澄化剤、増粘剤などをさらに含むことがある。本明細書に記載する医薬組成物を単一単位剤形でまたは複数投与量形態で包装することができる。前記組成物は、一般に、無菌かつ実質的に等張性の溶液として製剤化される。

【0151】

ＶＩＩ．システムおよびキット
本明細書に記載のｒＡＡＶ組成物を、本明細書に記載の発明の方法の１つで使用するために設計されたシステム内に含めてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、個体の眼へのベクターの送達のためのシステムであって、ａ）ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物［ここで、該ベクターは、治療用ポリペプチドおよび／または治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含む］；およびｂ）該ｒＡＡＶの眼内送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする、ｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態
において、ｒＡＡＶ粒子は、ＭＹＯＣ発現を標的とする（例えば、低減または阻害する）１つまたはそれ以上のＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードする、ｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体と、ＭＹＯＣの発現を標的とする（例えば、低減または阻害する）１つまたはそれ以上のＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）とをコードするｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記キットまたはシステムは、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子と、ＭＹＯＣ発現を標的とする（例えば、低減または阻害する）１つまたはそれ以上のＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子とを含む。

【0152】

一般に、前記システムは、２７～４５ゲージである細径カニューレと、１本またはそれ以上の（例えば、１、２、３、４またはそれ以上の）注射器と、本発明の方法での使用に好適な１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４つまたはそれ以上）の流体とを含む。

【0153】

細径カニューレは、網膜下腔に注射されるベクター懸濁液および／または他の流体の網膜下注射に好適である。いくつかの実施形態において、カニューレは２７～４５ゲージである。いくつかの実施形態において、細径カニューレは３５～４１ゲージである。いくつかの実施形態において、細径カニューレは４０または４１ゲージである。いくつかの実施形態において、細径カニューレは４１ゲージである。前記カニューレは、いずれの好適なタイプのカニューレであってもよく、例えば、ｄｅ－Ｊｕａｎ（登録商標）カニューレまたはＥａｇｌｅ（登録商標）カニューレであってもよい。

【0154】

注射器は、いずれの好適な注射器であってもよいが、ただし、流体送達のためのカニューレへの接続が可能であることを条件とする。いくつかの実施形態において、注射器は、Ａｃｃｕｒｕｓ（登録商標）システム注射器である。いくつかの実施形態において、システムは、１本の注射器を有する。いくつかの実施形態において、システムは、２本の注射器を有する。いくつかの実施形態において、システムは、３本の注射器を有する。いくつかの実施形態において、システムは、４本またはそれ以上の注射器を有する。

【0155】

システムは、例えばフットペダルによって作動させることができる、自動インジェクションポンプをさらに含むことがある。

【0156】

本発明の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のベクターの有効量を各々が含む１つまたはそれ以上の流体、最初のブレブを形成するための１つまたはそれ以上の流体（例えば、食塩水または他の適切な流体）、および１つまたはそれ以上の治療剤を含む１つまたはそれ以上の流体が挙げられる。

【0157】

本発明の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のベクターの有効量を各々含む１つまたはそれ以上の流体、最初のブレブを形成するための１つまたはそれ以上の流体（例えば、食塩水または他の適切な流体）、および１つまたはそれ以上の治療剤を含む１つまたはそれ以上の流体が挙げられる。

【0158】

いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８ｍｌより大きい。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約０．９ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の
容量は、少なくとも約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超～約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超～約２．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超～約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超～約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超～約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９～約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９～約２．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９～約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９～約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９～約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約１．０～約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約１．０～約２．０ｍｌである。

【0159】

最初のブレブを形成するための流体は、例えば、約０．１～約０．５ｍｌであることがある。いくつかの実施形態において、システム内のすべての流体の合計容量は、約０．５～約３．０ｍｌである。

【0160】

いくつかの実施形態において、システムは、単一の流体（例えば、ベクターの有効量を含む流体）を含む。いくつかの実施形態において、システムは、２つの流体を含む。いくつかの実施形態において、システムは、３つの流体を含む。いくつかの実施形態において、システムは、４つまたはそれ以上の流体を含む。

【0161】

本発明のシステムは、さらにキットに包装されることがあり、該キットは、使用説明書をさらに含むことがある。いくつかの実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物の網膜下送達のためのデバイスをさらに含む。いくつかの実施形態において、使用説明書は、本明細書に記載する方法の１つに準じた説明書を含む。いくつかの実施形態において、使用説明書は、ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＳＰＯ４ポリペプチドもしくはその機能的変異体および／またはＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子の硝子体内および／または前房内送達についての説明書を含む。

【実施例】

【0162】

本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例を、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。本明細書に記載する実施例および実施形態が単に説明を目的としたものであること、ならびに様々な修飾または変更が、それらの実施例および実施形態を踏まえて当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に記載の範囲に含まれるはずであることが理解される。

【実施例1】

【0163】

緑内障性ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）はＭＹＯＣの分泌を遮断する
ＭＹＯＣ突然変異体が眼、特に、ＩＯＰの一因となることがある細胞、例えば線維柱帯網細胞、の機能にどのような影響を及ぼすのかを理解することは、ミオシリン（ＭＹＯＣ
）緑内障の病態形成を知る上での手がかりとなる。ＭＹＯＣ機能の理解は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障のための、可能性がある治療戦略を見いだすのにも役立つだろう。本明細書に記載する結果は、ＭＹＯＣ突然変異体が野生型ＭＹＯＣ発現を低減させ、Ｗｎｔシグナル伝達を遮断することを実証する。さらに、これらの結果は、Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）の発現および／またはＭＹＯＣのサイレンシングが、突然変異型ＭＹＯＣの発現によって遮断されたＷｎｔシグナル伝達を回復させることができることを示唆する。

【0164】

方法
プラスミドベクター
ＭＹＯＣおよびＲＳＰＯ３プラスミドのためのＭＹＯＣ ｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｅ ＤＢ－Ｓａｎｏｆｉ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって提供された。ＲＳＰＯ３ ｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｅ ＤＢ－Ｓａｎｏｆｉ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって提供された。

【0165】

ｐＣＢＡ２－ｉｎ－ＭＹＯＣ Ｐ３７０Ｌの構築のために、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）ＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を使用して、製造業者の推奨基準ならびにプライマー５’－ＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧ －３’（配列番号２１）および５’－ＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＴ－３’（配列番号２２）に従って所望の単一塩基置換を導入した。

【0166】

ｐＣＢＡ２－ｉｎ－ＭＹＯＣ Ｙ４３７Ｈの構築のために、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を使用して、製造業者の推奨基準ならびにプライマー５’－ＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ－３’（配列番号２３）および５’－ＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡ－３’（配列番号２４）に従って所望の単一塩基置換を導入した。

【0167】

Ｇｒｐ９４ ｓｈＲＮＡプラスミドは、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カタログ番号ＴＲ３１２３０９）から得た。ｐＧＩＰＺ－ＭＹＯＣプラスミド（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、Ｃｌｏｎｅ ＤＢ－Ｓａｎｏｆｉ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって提供された。ＧＩＰＺマイクロＲＮＡ適応ｓｈＲＮＡコレクション（Ｓｔｅｇｍｅｉｅｒら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２：１３２１２～７頁）。ＧＩＰＺ ｓｈＲＮＡデザインは、内因性ＲＮＡｉ経路によるプロセシングを可能にし、最小細胞毒性で特異的遺伝子サイレンシングをもたらすために、ネイティブｍｉＲ－３０一次転写産物に基づくものであった。非標的化ヌルｓｈＲＮＡｍｉｒを発現する構成的ｓｈＲＮＡｍｉｒベクターであるｐＧＩＰＺ－Ｎｕｌｌプラスミドは、Ｃｌｏｎｅ ＤＢ－Ｓａｎｏｆｉ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって提供された。

【0168】

細胞培養および組換えタンパク質
ＨＥＫ２９３細胞（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）をＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳおよび５％ＣＯ２で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）細胞株をＡＴＣＣから得、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳおよび５％ＣＯ２で培養した。

【0169】

初代ヒト線維柱帯網（ｈＴＭ）細胞の不死化
ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ ＴＡｇ）をＡＡＶ２－ＳＶ４０ Ｔ抗原ベクターでの形質導入による不死化に使用した。完全線維芽細胞増殖培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ）中で維持した第７継代ｈＴＭ細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を１０ｃｍ細胞培養プレートに播種し、１×１０^５ＤＲＰのＡＡＶ２－ＳＶ４０－Ｔａｇ（「ｈＴＭ－Ｔ」と標示した）またはＡＡＶ２
－ＥＧＦＰ（陰性対照、「ｈＴＭ－ＥＮＴ」と標示した）のどちらか一方を２４時間、形質導入した。細胞が集密に達したら、それらを２×１５ｃｍプレート（Ｐ８）で継代させた。細胞をおおよそ３～４日ごとに繰り返し継代した。第１０継代で、アリコートを採取して細胞数を判定した。ｈＴＭ－Ｔ細胞からの全細胞数は、ｈＴＭ－ＥＮＴ細胞からの全細胞２．５×１０^５と比較して、５．２×１０^６であった。

【0170】

ウェスタンブロッティングを行って、ＳＶ４０ Ｔ抗原の存在を判定した。簡単に言うと、細胞浮遊液５００ｕＬを遠心分離し、得られた細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液１００μＬに溶解した。細胞溶解物５μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、ｉＢｌｏｔ高速転写システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して免疫ブロットした。ＴＢＳタンパク質不含ブロッカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してブロットをブロックし、モノクローナル抗ＳＶ４０Ｔ抗原抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）とともにインキュベートした。その後、ブロットを抗マウスＨＲＰ標的抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）とともにインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、免疫反応性バンドを可視化した。ＳＶ４０ Ｔ抗原の存在および発現を示す、ＳＶ４０ Ｔ抗原に対応する顕著な８０ｋＤａバンドがｈＴＭ－Ｔから検出されたが、ｈＴＭ－ＥＮＴ細胞からは検出されなかった。同じく８０ｋＤａ ＳＶ４０ Ｔ抗原バンドを有する、２９３Ｔ細胞からの溶解物を、陽性対照とした。ｈＴＭ－Ｔ細胞を増殖させ、細胞バンクを第１２継代（１×１０^６細胞で１０バイアル）、そしてその後、第１８継代（１０^６細胞で４６バイアル）で、細胞凍結培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で凍結させた。

【0171】

ｈＴＭ－Ｔ特徴づけ
ｈＴＭ－Ｔ細胞と初代ｈＴＭ細胞の比較は、細胞形態、集団倍加時間、およびプラスミドトランスフェクション効率の著しい差を示した。初代ｈＴＭ細胞は、長い紡錘形の細胞体で、より大きく、線維芽細胞のように見えたが、不死化ｈＴＭ－Ｔ細胞は、より小さく、立方体状の形状であり、比較的均一なサイズであった。ｈＴＭ－Ｔ細胞株は、増殖速度の増加を示し、集団倍加が初代細胞よりおおよそ３～４倍速く起こった。加えて、ｈＴＭ－Ｔ細胞は、２０細胞継代を超えて増殖し続けたが、初代ｈＴＭ細胞は、第１０継代までに増殖減少を示し、第１２継代までに最終的な増殖停止を示した。同様の細胞密度の両方の細胞タイプに対してＥＧＦＰプラスミドおよびリポフェクタミンを使用して、トランスフェクション効率を判定した。簡単に言うと、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、集密に達していないｈＴＭ－ＴまたはｈＴＭ細胞にＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした。ｈＴＭ－Ｔ細胞のほうが細胞培養面のｍｍ^２当りの細胞数は多かったが、初代ｈＴＭ細胞（約５％）と比較してＥＧＦＰ＋ ｈＴＭ－Ｔ細胞のパーセンテージ（約５０％）のほうが明確に高かった。

【0172】

ウェスタンブロッティング
ｗｔＭＹＯＣ、ＭＹＯＣ突然変異体Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ ＲＳＰＯ３ならびに／またはｓｈＲＮＡを発現するプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２９３ＴまたはｈＴＭ－Ｔ細胞にトランスフェクトした。簡単に言うと、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＲＩＰＡ緩衝液５０～１００μＬに細胞を溶解した。細胞溶解物１０～１３μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、その後、ｉＢｌｏｔ高速転写システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して免疫ブロットした。Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）、０．２％ Ｉ－Ｂｌｏｃｋ（カゼインベースのブロッキング試薬；Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットをブロックし、マウス抗ヒトＭＹＯＣ抗体とともにインキュベートした。その後、ブロットを抗マウスＨＲＰ標的抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）とともにインキュベートした。ＥＣＬ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して免疫反応性バンドを可視化し、ＢｉｏＭａｘ ＸＡＲフィルム（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ）を用いてＫｏｄａｋ Ｘ－Ｏｍａｔ ２０００ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒで現像して可視化した。

【0173】

ルシフェラーゼレポーターアッセイ
２９３ＴまたはｈＴＭ－Ｔ細胞をＣｏｓｔａｒ ９６ウェルホワイトまたはブラックウォールプレートに２×１０^４細胞／ウェルで播種した。細胞播種の１～２日後に、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）をその製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクションを行った。

【0174】

簡単に言うと、４０：１比のＴｃｆ／ｌｅｆ調節ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子とサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）駆動ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を含有する、ＴｏｐＦｌａｓｈレポータープラスミド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、標的プラスミドと１：１混合した。Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ試薬８μＬを添加し、直ちに試料をボルテックスし、１５分間、室温でインキュベートした。プラスミドＤＮＡ複合体を細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。試料を刺激せず、または組換えヒトまたはマウスｗｎｔ３ａタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）４００ｎｇ／ｍＬで刺激し、さらに２０～２４時間インキュベートした。Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をその製造業者のプロトコルに従って使用して、Ｗｎｔシグナル伝達を測定した。Ｃｅｎｔｒｏ ＸＳ^３ ９６０マイクルプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）で吸光度値を測定し、相対発光量（ＲＬＵ）として記録した。トランスフェクション効率を制御するために、ホタルルシフェラーゼＲＬＵをウミシイタケルシフェラーゼＲＬＵに対して正規化した。すべての試料を３反復ウェルで行った。

【0175】

結果
野生型ＭＹＯＣ（ｗｔＭＹＯＣ）は培養細胞から分泌されるが、５種の異なる突然変異型のＭＹＯＣを発現する細胞からはＭＹＯＣが殆どまたは全く分泌されない。また培養細胞への正常ＭＹＯＣと突然変異型ＭＹＯＣのコトランスフェクションはｗｔＭＹＯＣ分泌を抑制することが報告されている（Ｊａｃｏｂｓｏｎら（２００１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１０（２）：１１７～２５頁）。ＭＹＯＣ分泌に対する突然変異型ＭＹＯＣ発現の効果を調査するために、野生型ＭＹＯＣ、Ｐ３７０Ｌ突然変異型ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｈ突然変異型ＭＹＯＣを発現するプラスミドを２９３細胞にトランスフェクトした。

【0176】

図１に示すように、野生型ＭＹＯＣを発現する２９３細胞は、両方の細胞溶解物において検出可能なＭＹＯＣタンパク質発現を示し（「細胞」と標示した、下のブロットを参照されたい）、細胞培養培地に分泌された（「培地」とい標示した、上のブロットを参照されたい）。しかし、Ｐ３７０ＬまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣを発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞は、細胞内発現を示したが、細胞培養培地への分泌を示さなかった。さらに、野生型ＭＹＯＣを発現するプラスミドとＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｙ ＭＹＯＣのどちらら一方を発現するプラスミドとの２９３細胞へのコトランスフェクションは、細胞培養培地へのＭＹＯＣ分泌の欠如をもたらした。これらの結果は、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ突然変異体が２９３細胞から分泌されることができず、そしてまた野生型ＭＹＯＣの分泌を遮断することができることを示唆している。

【0177】

これらの結果がヒトの眼細胞で観察されるかどうかを判定するために、さらなる実験に
着手した。ヒト線維柱帯網細胞株を、上で説明したようにＳＶ４０ラージＴ抗原（ｈＴＭ－Ｔ細胞）のＡＡＶ媒介発現によって不死化した。２９３ＴおよびｈＴＭ－Ｔ細胞に、野生型ＭＹＯＣを発現するプラスミド、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣを発現するプラスミド、または両方のプラスミドをトランスフェクトした。図２は、これらの細胞における細胞内または分泌ＭＹＯＣタンパク質の存在を探索するウェスタンブロットを示す。野生型ＭＹＯＣは、２９３ＴおよびｈＴＭ－Ｔ細胞によって発現され、分泌されたが、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣは、２９３Ｔ細胞によっても、ｈＴＭ－Ｔ細胞によっても、発現はされたが分泌されなかった。Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣはまた、２９３Ｔ細胞においても、ｈＴＭ－Ｔ細胞においても、野生型ＭＹＯＣの分泌を遮断した。

【0178】

これらの結果は、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異体（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）がヒト細胞において野生型ＭＹＯＣの分泌を遮断することができることを実証する。さらに、突然変異型ＭＹＯＣは、ｈＴＭ細胞においてＭＹＯＣ分泌を遮断することもできる。

【実施例2】

【0179】

緑内障性ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）はＷｎｔシグナル伝達を遮断する
ＭＹＯＣは、ストレスファイバーの形成を刺激するアクチン細胞骨格の機構を修飾するＷｎｔシグナル伝達経路の成分、例えば、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚｄ）ファミリーのＷｎｔ受容体、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）ファミリーのＷｎｔアンタゴニスト、およびＷｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ－１）と相互作用すると考えられている（Ｋｗｏｎら（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９：２１３９～５４頁）。ストレスファイバーの形成は、線維柱帯網（ＴＭ）の収縮性およびＩＯＰ調節に肝要である。しかし、正確にどのようにＭＹＯＣがＷｎｔシグナル伝達に関連しているのか、およびこの関連性がＩＯＰにどのような影響を及ぼすのかは不明である。細胞生物学実験に基づいて、マトリックス細胞タンパク質としてのミオシリンの役割が提案されている（ＲｅｓｃｈおよびＦａｕｔｓｃｈ、２００９；Ｋｏｃｈら、２０１４）。他のグループにより、ミオシリンはオリゴデンドロサイト分化の媒介因子であり、マウスの視神経のミエリン形成に関与することが立証されている（Ｋｗｏｎら、２０１４）。

【0180】

ＭＹＯＣは、Ｗｎｔシグナル伝達の修飾因子としての機能を果たすことができること、Ｗｎｔタンパク質は、その機能を実行することによってミオシリンの不在を代償することができることが提案された（Ｋｗｏｎら（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９：２１３９～５４頁）。いくつかのグループにより、ミオシリンの作用と、ｂ－カテニン非依存性メカニズムによって作用するＷｎｔタンパク質の作用との類似性が報告された（ＫｗｏｎおよびＴｏｍａｒｅｖ（２０１１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２６（１２）：３３９２～４０２頁）。緑内障性ＴＭ（ＧＴＭ）細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の低減は、より高い内因性ｓＦＲＰ１レベルに起因することが報告された（Ｗａｎｇら（２００８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１８：１０５６～６４頁；Ｌｉｎ ａｎｄ Ｈａｎｋｅｎｓｏｎ（２０１１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１２：３４９１～５０１頁）。別のグループにより、Ｗｎｔシグナル伝達経路は網膜細胞株ＲＧＣ－５を上昇した圧力から保護することが証明されている（Ｆｒａｇｏｓｏら（２０１１）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３１（１）：１６３～７３頁）。

【0181】

緑内障性ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０ＬまたはＹ４３７Ｈ）にＴＭにおけるＷｎｔシグナル伝達に対して何らかの効果があるのかどうかは、文献からは不明である。ある報告では、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈ Ｗｎｔシグナル伝達アッセイによって測定して、ＴＭからのＭＹＯＣ分泌を阻害する緑内障性ＭＹＯＣ突然変異の、ＴＭにおけるＷｎｔシグナル伝達に対する効果は不明であると述べられている（Ｍａｏら（２０１２）Ｉｎｖｅｓｔ
．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５３（１１）：７０４３～５１頁）。別のグループにより、Ｐ３７０Ｌには、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈ Ｗｎｔシグナル伝達アッセイによって証明される、Ｃａｃｏ－２細胞におけるＷｎｔシグナル伝達に対する刺激効果があることが報告されている（Ｓｈｅｎら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（９）：ｅ４４９０２）。

【0182】

対照的に、本発明者らは、ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）には、ベータ－カテニン活性を記録するＴＯＰ－Ｆｌａｓｈ Ｗｎｔシグナル伝達アッセイに証明されるように、２９３およびＴＭ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達に対する阻害効果があることを発見した。

【0183】

ＭＹＯＣ Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ突然変異体のＷｎｔシグナル伝達に対する効果を評価するために、２９３Ｔ細胞にＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物とｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣプラスミドとをコトランスフェクトした。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えマウスＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝４）をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。

【0184】

図３に示すように、２９３Ｔ細胞に対する組換えマウスＷｎｔ３での刺激は、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーターの増加をもたらした。ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈによってアッセイして、野生型ＭＹＯＣの発現はＷｎｔシグナル伝達に干渉しなかった。しかし、野生型ＭＹＯＣとＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣのどちらか一方との共発現は、２９３Ｔ細胞でのＴＯＰ－Ｆｌａｓｈ活性化を遮断した。これらの結果は、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異体（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）の発現がヒト細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害できることを示す。

【実施例3】

【0185】

緑内障性ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）によって遮断されたＷｎｔシグナル伝達の回復
前の実施例は、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異体Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈがヒト細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を遮断するように作用することを実証した。これらのＭＹＯＣ突然変異体を発現する細胞においてＷｎｔシグナル伝達を回復させることができる可能性があるメカニズムを調査するためのさらなる実験に着手した。

【0186】

Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するＲＳＰＯ３遺伝子によってコードされたタンパク質であるので、ＲＳＰＯ３の発現が、突然変異型ＭＹＯＣ発現によるその阻害時にＷｎｔシグナル伝達を回復させることができるかどうかを調査した。上の図３と同様にこれらの実験については、標示の通り、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物とｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣ、Ｙ４３７Ｈ ＭＹＯＣおよび／またはＲＳＰＯ３プラスミドとを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えマウスＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。

【0187】

図４に示すように、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈによって測定して、ＲＳＰＯ３発現はＷｎｔシグナル伝達の増加をもたらした。重要なこととして、ＲＳＰＯ３とＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣのどちらか一方との共発現は、単独でのＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣの発現時に観察されたＷｎｔシグナル伝達の阻害と比較し
て、Ｗｎｔシグナル伝達を回復させることができた。標示の通り、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物とｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣ、Ｙ４３７Ｈ ＭＹＯＣおよび／またはＲＳＰＯ３プラスミドとを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えマウスＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。

【0188】

同様の効果がｈＴＭ細胞において観察されるかどうかを試験するために、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物とｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ野生型」）、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣおよび／またはＲＳＰＯ３プラスミドとをｈＴＭ－Ｔ細胞にコトランスフェクトした。上で説明したようにＴＯＰ－ＦｌａｓｈアッセイによってＷｎｔ活性を測定した（ルシフェラーゼ活性を平均±ＳＤとして示す、ｎ＝３）。図５は、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣの発現がＷｎｔシグナル伝達の低減をもたらし、野生型ＭＹＯＣを共発現するｈＴＭ－Ｔ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を低減させることができたことを示す。ＲＳＰＯ３の発現は、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣを単独でまたはＰ３７０Ｌ ＭＹＯＣを野生型ＭＹＯＣとの組合せで発現するｈＴＭ－Ｔ細胞においてＷｎｔシグナル伝達を増加させることができた。図４および５に図示する結果は、ＲＳＰＯ３の発現が、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異体を発現する細胞、例えば２９３ＴおよびｈＴＭ－Ｔ細胞、においてＷｎｔシグナル伝達を回復させることを示す。

【0189】

驚くべきことに、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異体の発現によるＷｎｔ阻害は、ＭＹＯＣを（例えば、ＲＮＡｉ）によって発現停止させることによって非常によく反転されることも発見した。ＭＹＯＣ発現に対するＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの効果を２９３Ｔ細胞において試験した。図６に示すように、ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡは、野生型ＭＹＯＣを発現する細胞において、スクランブルｓｈＲＮＡ対照と比較してＭＹＯＣタンパク質発現を低減させた。この低減は、細胞内ＭＹＯＣについても、分泌ＭＹＯＣについても、観察された。

【0190】

図７は、ｈＴＭ－Ｔ細胞におけるＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの効果を示す。ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡは、野生型ＭＹＯＣとＰ３７０Ｌ突然変異型ＭＹＯＣを共発現するｈＴＭ－ＴにおいてＭＹＯＣタンパク質発現を低減させた。この低減は、細胞内ＭＹＯＣについても、分泌ＭＹＯＣについても、観察された。対照的に、Ｇｒｐ９４を標的とするｓｈＲＮＡにはＭＹＯＣ発現に対する効果がなかった。Ｇｒｐ９４は、分泌タンパク質のプロセシングおよび輸送に関与する分子シャペロンである。Ｇｒｐ９４は、ＭＹＯＣ突然変異体のクリアランスを助長すると考えられたので、最近、ＭＹＯＣ緑内障の一部の症例に罹患している患者のための治療薬として提案された（Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍら（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（４８）：４０６６１～９頁）。同様に、スクランブルｓｈＲＮＡ対照にはＭＹＯＣ発現に対する効果がなかった。

【0191】

ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡはＭＹＯＣ発現に影響を及ぼすので、Ｗｎｔシグナル伝達に対するその効果を次に研究した。図８に示すように、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣの発現は、２９３Ｔ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を低減させた。Ｇｒｐ９４ ｓｈＲＮＡおよびスクランブルｓｈＲＮＡ対照は、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣによって阻害されたＷｎｔシグナル伝達を回復させることができなかった。対照的に、ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡは、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣを発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達をほぼ野生型レベル（すなわち、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈによって測定して、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣを発現しない対照細胞において観察されるＷｎｔシグナル伝達レベル）に増加させた。ＲＳＰＯ３の発現も、Ｐ３７０Ｌ
ＭＹＯＣを発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を増加させることが判明し、ＲＳＰＯ３の発現とＭＹＯＣ ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）を組み合わせることによって、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣを発現する細胞においてＷｎｔシグナル伝達の相乗的増加がもた
らされた。

【0192】

Ｇｒｐ９４の阻害はＭＹＯＣ突然変異体の効果を低減させるメカニズムとして報告されているが、本明細書に記載するこれらの結果は、ＭＹＯＣ突然変異体発現の存在下でのＲＳＰＯ３および／またはＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの発現のほうがＷｎｔシグナル伝達の抑制解除に効果的であることを示す。

【0193】

Ｙ４３７Ｈ ＭＹＯＣを発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達に対するＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの効果も調査した。図９に示すように、Ｐ３７０ＬまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣの発現は、２９３Ｔ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を低減させた。しかし、ＭＹＯＣ
ｓｈＲＮＡは、Ｐ３７０Ｌ ＭＹＯＣまたはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣのどちらか一方を発現する細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を回復させることができた。この効果は、スクランブルｓｈＲＮＡ対照の発現時には観察されなかった。

【0194】

要約すると、これらの結果は、ＭＹＯＣ突然変異体（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）によって遮断されたＷｎｔシグナル伝達を、Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）発現および／またはＭＹＯＣの（例えば、ＲＮＡｉによる）阻害によって回復させることができることを実証する。

【実施例4】

【0195】

ＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａは線維柱帯網の細胞に形質導入する
ＡＡＶ粒子が線維柱帯網の細胞に形質導入することができるかどうかを判定するために、ＥＧＦＰをコードするＡＡＶ２ベクターを、（ＶＰ１に基づいてナンバリングして）Ｒ４７１Ａアミノ酸置換を含むＡＡＶ２粒子の野生型ＡＡＶ２粒子にパッケージングした。ＡＡＶ２ ＥＧＦＰおよびＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａ ＥＧＦＰでのｈＴＭ細胞の処置（上記）によって、ウイルス粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。図１０（左パネル）に示すように、ＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａ ＥＧＦＰは、野生型ＡＡＶ２と比較して高いＴＭ細胞形質導入を示した。ＴＭ細胞形質導入をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ＡＡＶ２ ＥＧＦＰおよびＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａ ＥＧＦＰをマウスの眼に注射した。その後、マウスを屠殺し、ＥＧＦＰ発現について分析した。図１０（右パネル）に示すように、ＡＡＶ２ Ｒ４７１Ａ ＥＧＦＰは、野生型ＡＡＶ２と比較して高いＴＭ細胞形質導入をｉｎ ｖｉｖｏで示した。

【実施例5】

【0196】

ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障の動物モデルにおけるＲＳＰＯ３発現またはＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ
上の実施例は、緑内障性ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）がＷｎｔシグナル伝達を遮断すること、およびＷｎｔシグナル伝達のこの阻害をＲ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）発現またはＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡによって反転させることができることを実証した。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＭＹＯＣ突然変異（例えば、Ｐ３７０Ｌおよび／またはＹ４３７Ｈ）は、ＴＭにおけるＷｎｔシグナル伝達に影響を及ぼすことによって、ＩＯＰを変更しＰＯＡＧに寄与する可能性があると考えた。次の実験では、ＡＡＶ２ベクターによって送達されるＲ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）発現またはＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡが、緑内障の症状をこの疾患のマウスモデルにおいて改善することができるかどうかを試験した。

【0197】

ＰＯＡＧのマウスモデルを使用して、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障を処置する上でのＲ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）発現および／またはＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡの眼へのＡＡＶ媒介送達の効能を調査した。例えば、Ｙ４３７Ｈ ＭＹＯＣを発現するマウスモデルを使用することができる（Ｚｏｄｅら（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１（
９）：３５４２～５３頁を参照されたい）。このモデルでは、ヒトＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣがトランスジェニックマウスにおいてＣＭＶプロモーターの制御下で発現される。この系を使用して、ミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障に関連する組織、例えば、線維柱帯網および強膜においてＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣを発現させた。これらのマウスは、肉眼的には正常な眼の形態を示したが、３月齢後にミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障様症状、例えば、ＩＯＰ上昇、および視神経の漸進的な軸索変性を示し始めた。

【0198】

ＧＦＰを発現する導入遺伝子、マウスＲＳＰＯ３を発現する導入遺伝子、マウスＭＹＯＣ（ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ標的、およびプラスミドｐＧＩＰＺ ＃９３からのループ配列；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を標的とするｓｈＲＮＡを発現する導入遺伝子、またはスクランブルｓｈＲＮＡを発現する導入遺伝子を、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列も含有する、プラスミドｐＣＢＡ（２）－ｉｎｔ－ＢＧＨからのハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下のＡＡＶ２ゲノム（Ｘｕ，Ｒ．ら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１３２３～３２頁）にクローニングした。その後、その発現カセットを、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有するプレウイルスプラスミドベクターｐＡＡＶＳＰ７０（Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．ら（２００４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：２３１～４０頁）にクローニングした。ＩＴＲと隣接している領域を含むプラスミドｓｐ７０．ＢＲ／ｓＦＬＴ０１中の得られたＡＡＶゲノムの全サイズは、４．６ｋｂであった。

【0199】

ＡＡＶ２ゲノムを、Ｒ４７１Ａ突然変異を有するＡＡＶ２カプシドにパッケージングして線維柱帯網に感染させた、または野生型ＡＡＶ２カプシドにパッケージングして網膜神経節細胞に感染させた。三重トランスフェクション法を使用する「ガットレス」ベクターアプローチ（例えば、Ｘｉａｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、３：２２２４～３２頁を参照されたい）を使用して、ＡＡＶ２ゲノムをＡＡＶ２野生型またはＲ４７１Ａカプシドにパッケージングした。簡単に言うと、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を治療用遺伝子およびその調節エレメントで置換し、両方を、５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間にサンドイッチした。ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をトランスで別のプラスミドに与え、第３のプラスミドが必要アデノウイルスヘルパー遺伝子に寄与した。あるいは、必要ヘルパー遺伝子を複製欠損アデノウイルスから得た、および／またはアデノウイルスヘルパー遺伝子を宿主細胞ゲノムに安定的に組み込んだ。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ウイルスカプシドが完全に組み立てられ、その後、ＩＴＲと隣接しているベクターゲノムがカプシドポア経由でそのカプシドに挿入される（ＭｙｅｒｓおよびＣａｒｔｅｒ（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０２：７１～８２頁）と仮定した。その後、ゲノム含有カプシドを注射用に製剤化した。

【0200】

ヒトＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣを発現するトランスジェニックマウスをおおよそ３月齢まで成長させ、その後、無作為に処置群に割り当てた。マウスを麻酔し、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクター、マウスＲＳＰＯ３をコードするＡＡＶベクター、マウスＭＹＯＣを標的とするｓｈＴＮＡをコードするＡＡＶベクター、またはスクランブルｓｈＲＮＡをコードするＡＡＶベクターを硝子体内または前房内注射によってマウスに注射した。１つの処置群のマウスには、網膜神経節細胞における効果を試験するために、マウスＲＳＰＯ３を発現する野生型ＡＡＶ２カプシドを有するＡＡＶ２ベクターの注射を施し、ＧＦＰを発現する野生型ＡＡＶ２カプシドを有するＡＡＶ２ベクターの注射を反対側の眼に施した。１つの処置群のマウスには、線維柱帯網における効果を試験するために、マウスＭＹＯＣを標的とするｓｈＲＮＡを発現するＲ４７１Ａ ＡＡＶ２カプシドを有するＡＡＶ２ベクターの注射を施し、スクランブルｓｈＲＮＡを発現するＲ４７１Ａ ＡＡＶ２カプシドを有するＡＡＶ２ベクターの注射を反対側の眼に施した。１つの処置群のマウスには、マウスＲＳＰＯ３を発現するＡＡＶベクターとマウスＭＹＯＣを標的とするｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの混合物の注射を一方の眼に施し、ＧＦＰを発現するＡＡＶベクターおよ
び／またはスクランブルｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの注射を反対側の眼に施した。１つの処置群のマウスには、マウスＲＳＰＯ３を発現し、かつマウスＭＹＯＣを標的とするｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの注射を一方の眼に施し、ＧＦＰを発現し、かつスクランブルｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの注射を反対側の眼に施した。

【0201】

注射後に定期的にミオシリン（ＭＹＯＣ）緑内障症状についてマウスを検査し、実験的処置を施した眼と対照処置を施した眼とを比較した。ＩＯＰを眼圧検査（Ｋｉｍ，Ｃ．Ｙ．ら（２００７）Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ．）２１（９）：１２０２～９頁）によって測定した。角膜厚を超音波パキメータ（Ｌｉｖｅｌｙ，Ｇ．Ｄ．ら（２０１０）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４２（２）：２８１～６頁）によって測定した。虹彩角膜角を隅角鏡検査によって評価した。網膜神経節細胞機能は、パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）を使用する視覚刺激に対するパターン網膜電図応答の分析（Ｚｏｄｅら（２０１１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１（９）：３５４２～５３頁）によって測定した。他の表現型の特徴づけのためにマウスを屠殺して眼を切除した。例えば、網膜神経節細胞の数および／または形態を免疫蛍光顕微鏡法および／または透過型電子顕微鏡法によって評価した。

【実施例6】

【0202】

緑内障性ＭＹＯＣ突然変異によって遮断されたＷｎｔシグナル伝達を回復させるためのＲＳＰＯファミリータンパク質の使用
実施例３で実証したように、ＭＹＯＣ突然変異体（例えば、Ｐ３７０ＬおよびＹ４３７Ｈ）によって遮断されたＷｎｔシグナル伝達を、Ｒ－スポンジン３（ＲＳＰＯ３）発現によって回復させることができる。Ｗｎｔシグナル伝達のこの回復の根底にあるメカニズムをさらに理解するために、Ｗｎｔシグナル伝達を回復させる様々なＲＳＰＯファミリーメンバーおよび変異体の能力を調査した。

【0203】

ヒトＲＳＰＯファミリータンパク質ｈＲＳＰＯ１、２、３および４は、図１１および１２に図示するように、フューリン様ＣｙｓリッチドメインとトロンボスポンジンＩ型ドメインと正電荷を有するＣ末端ドメインとを含む同様のドメイン構造を共有する。Ｗｎｔシグナル伝達の回復に必要な機能性ドメインを調査するために、ヒトＲＳＰＯ３のいくつかの短縮型変異体を作成した。これらの変異体、ならびに各変異体に含まれるおよび含まれない特異的ドメインを図１１、１２、１３Ａおよび１４に示す。

【0204】

Ｗｎｔシグナル伝達に対するＲＳＰＯ３変異体の効果を試験するために、図１５に標示の通り、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物とｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）またはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣとを、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、完全長または部分ＲＳＰＯ３プラスミドもトランスフェクトした。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えヒトＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。

【0205】

実施例３で説明したように、突然変異型ＭＹＯＣ Ｙ４３７Ｈは、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定して２９３Ｔ細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害した。図１５は、このアッセイでのＷｎｔシグナル伝達に対する様々なｈＲＳＰＯ３短縮型変異体の効果を示す。図１５に示すように、部分長なものも完全長のものも、試験したｈＲＳＰＯ３型はすべてのＷｎｔ回復活性があり、完全長ＲＳＰＯ３は短縮型の多くのものより強い活性を示した。

【0206】

Ｗｎｔシグナル伝達に対する様々なＲＳＰＯファミリーの効果を試験するために、図１６に標示の通り、ＴＯＰ－Ｆｌａｓｈレポーター構築物とｗｔＭＹＯＣ（「ＭＹＯＣ」）
またはＹ４３７Ｈ ＭＹＯＣとを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、完全長または部分ＲＳＰＯ１、ＲＳＰＯ２またはＲＳＰＯ４プラスミドもトランスフェクトした（ＲＳＰＯ１、２、３および４短縮型の描写については図１２を参照されたい）。Ｗｎｔシグナル伝達は組換えマウスＷｎｔ３ａ（４００ｎｇ／ｍｌ）の添加後に増幅され、それをＴＯＰ－Ｆｌａｓｈアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性（平均±ＳＤ、ｎ＝３）をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。

【0207】

これらの研究の結果を図１６に示す。これらの結果は、完全長および短縮型ＲＳＰＯ１、２および４もＷｎｔ回復活性があり、完全長ＲＳＰＯが短縮型より強い活性を示したことを示す。すべてのＲＳＰＯファミリーメンバーおよび型がＷｎｔ３ａとともに作用した。

【0208】

配列
ＲＳＰＯ３ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＨＬＲＬＩＳＷＬＦＩＩＬＮＦＭＥＹＩＧＳＱＮＡＳＲＧＲＲＱＲＲＭＨＰＮＶＳＱＧＣＱＧＧＣＡＴＣＳＤＹＮＧＣＬＳＣＫＰＲＬＦＦＡＬＥＲＩＧＭＫＱＩＧＶＣＬＳＳＣＰＳＧＹＹＧＴＲＹＰＤＩＮＫＣＴＫＣＫＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬＧＫＣＬＤＮＣＰＥＧＬＥＡＮＮＨＴＭＥＣＶＳＩＶＨＣＥＶＳＥＷＮＰＷＳＰＣＴＫＫＧＫＴＣＧＦＫＲＧＴＥＴＲＶＲＥＩＩＱＨＰＳＡＫＧＮＬＣＰＰＴＮＥＴＲＫＣＴＶＱＲＫＫＣＱＫＧＥＲＧＫＫＧＲＥＲＫＲＫＫＰＮＫＧＥＳＫＥＡＩＰＤＳＫＳＬＥＳＳＫＥＩＰＥＱＲＥＮＫＱＱＱＫＫＲＫＶＱＤＫＱＫＳＶＳＶＳＴＶＨ（配列番号１）

【0209】

ＲＳＰＯ３ポリヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＡＡＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＴＡＣＡＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧＡＧＴＡＴＧＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴＡＴＧＧＡＡＣＴＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＧＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＡＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡＣＴＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＡＡＣＡＣＧＧＧＴＣＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＡＣＡＡＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＣＡＧＴＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＧＴＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＡＣＡＣＴＡＧ（配列番号２）

【0210】

ＭＹＯＣポリペプチド配列
ＭＲＦＦＣＡＲＣＣＳＦＧＰＥＭＰＡＶＱＬＬＬＬＡＣＬＶＷＤＶＧＡＲＴＡＱＬＲＫＡＮＤＱＳＧＲＣＱＹＴＦＳＶＡＳＰＮＥＳＳＣＰＥＱＳＱＡＭＳＶＩＨＮＬＱＲＤＳＳＴＱＲＬＤＬＥＡＴＫＡＲＬＳＳＬＥＳＬＬＨＱＬＴＬＤＱＡＡＲＰＱＥＴＱＥＧＬＱＲＥ
ＬＧＴＬＲＲＥＲＤＱＬＥＴＱＴＲＥＬＥＴＡＹＳＮＬＬＲＤＫＳＶＬＥＥＥＫＫＲＬＲＱＥＮＥＮＬＡＲＲＬＥＳＳＳＱＥＶＡＲＬＲＲＧＱＣＰＱＴＲＤＴＡＲＡＶＰＰＧＳＲＥＶＳＴＷＮＬＤＴＬＡＦＱＥＬＫＳＥＬＴＥＶＰＡＳＲＩＬＫＥＳＰＳＧＹＬＲＳＧＥＧＤＴＧＣＧＥＬＶＷＶＧＥＰＬＴＬＲＴＡＥＴＩＴＧＫＹＧＶＷＭＲＤＰＫＰＴＹＰＹＴＱＥＴＴＷＲＩＤＴＶＧＴＤＶＲＱＶＦＥＹＤＬＩＳＱＦＭＱＧＹＰＳＫＶＨＩＬＰＲＰＬＥＳＴＧＡＶＶＹＳＧＳＬＹＦＱＧＡＥＳＲＴＶＩＲＹＥＬＮＴＥＴＶＫＡＥＫＥＩＰＧＡＧＹＨＧＱＦＰＹＳＷＧＧＹＴＤＩＤＬＡＶＤＥＡＧＬＷＶＩＹＳＴＤＥＡＫＧＡＩＶＬＳＫＬＮＰＥＮＬＥＬＥＱＴＷＥＴＮＩＲＫＱＳＶＡＮＡＦＩＩＣＧＴＬＹＴＶＳＳＹＴＳＡＤＡＴＶＮＦＡＹＤＴＧＴＧＩＳＫＴＬＴＩＰＦＫＮＲＹＫＹＳＳＭＩＤＹＮＰＬＥＫＫＬＦＡＷＤＮＬＮＭＶＴＹＤＩＫＬＳＫＭ（配列番号３）

【0211】

ＭＹＯＣ ｃＤＮＡ配列
ＡＴＧＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＧＡＧＡＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＣＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧＴＡＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣＣＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＡＣＡＣＴＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧＣＴＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＧＧＧＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＧＧＡＴＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＧＧＡＴＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＴＴＣＴＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＴＡＣＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＣＧＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＣＧＧＧＧＡＧＣＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＴＣＡＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＣＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡＣＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＴＧＣＣＡＴＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＣＧＡＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＴＣＧＣＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＣＣＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＣＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＡＧ（配列番号
４）

【0212】

ＭＹＯＣ ｓｈＲＮＡ標的配列
ＧＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＴＣＣＡＴ（配列番号５）
ＱＡＭＳＶＩＨ（配列番号６）

【0213】

ｓｈＲＮＡループ配列
ＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴ（配列番号７）

【0214】

ＲＳＰＯ１ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＲＬＧＬＣＶＶＡＬＶＬＳＷＴＨＬＴＩＳＳＲＧＩＫＧＫＲＱＲＲＩＳＡＥＧＳＱＡＣＡＫＧＣＥＬＣＳＥＶＮＧＣＬＫＣＳＰＫＬＦＩＬＬＥＲＮＤＩＲＱＶＧＶＣＬＰＳＣＰＰＧＹＦＤＡＲＮＰＤＭＮＫＣＩＫＣＫＩＥＨＣＥＡＣＦＳＨＮＦＣＴＫＣＫＥＧＬＹＬＨＫＧＲＣＹＰＡＣＰＥＧＳＳＡＡＮＧＴＭＥＣＳＳＰＡＱＣＥＭＳＥＷＳＰＷＧＰＣＳＫＫＱＱＬＣＧＦＲＲＧＳＥＥＲＴＲＲＶＬＨＡＰＶＧＤＨＡＡＣＳＤＴＫＥＴＲＲＣＴＶＲＲＶＰＣＰＥＧＱＫＲＲＫＧＧＱＧＲＲＥＮＡＮＲＮＬＡＲＫＥＳＫＥＡＧＡＧＳＲＲＲＫＧＱＱＱＱＱＱＱＧＴＶＧＰＬＴＳＡＧＰＡ（配列番号８）

【0215】

ＲＳＰＯ２ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＱＦＲＬＦＳＦＡＬＩＩＬＮＣＭＤＹＳＨＣＱＧＮＲＷＲＲＳＫＲＡＳＹＶＳＮＰＩＣＫＧＣＬＳＣＳＫＤＮＧＣＳＲＣＱＱＫＬＦＦＦＬＲＲＥＧＭＲＱＹＧＥＣＬＨＳＣＰＳＧＹＹＧＨＲＡＰＤＭＮＲＣＡＲＣＲＩＥＮＣＤＳＣＦＳＫＤＦＣＴＫＣＫＶＧＦＹＬＨＲＧＲＣＦＤＥＣＰＤＧＦＡＰＬＥＥＴＭＥＣＶＥＧＣＥＶＧＨＷＳＥＷＧＴＣＳＲＮＮＲＴＣＧＦＫＷＧＬＥＴＲＴＲＱＩＶＫＫＰＶＫＤＴＩＬＣＰＴＩＡＥＳＲＲＣＫＭＴＭＲＨＣＰＧＧＫＲＴＰＫＡＫＥＫＲＮＫＫＫＫＲＫＬＩＥＲＡＱＥＱＨＳＶＦＬＡＴＤＲＡＮＱ（配列番号９）

【0216】

ＲＳＰＯ４ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＲＡＰＬＣＬＬＬＬＶＡＨＡＶＤＭＬＡＬＮＲＲＫＫＱＶＧＴＧＬＧＧＮＣＴＧＣＩＩＣＳＥＥＮＧＣＳＴＣＱＱＲＬＦＬＦＩＲＲＥＧＩＲＱＹＧＫＣＬＨＤＣＰＰＧＹＦＧＩＲＧＱＥＶＮＲＣＫＫＣＧＡＴＣＥＳＣＦＳＱＤＦＣＩＲＣＫＲＱＦＹＬＹＫＧＫＣＬＰＴＣＰＰＧＴＬＡＨＱＮＴＲＥＣＱＧＥＣＥＬＧＰＷＧＧＷＳＰＣＴＨＮＧＫＴＣＧＳＡＷＧＬＥＳＲＶＲＥＡＧＲＡＧＨＥＥＡＡＴＣＱＶＬＳＥＳＲＫＣＰＩＱＲＰＣＰＧＥＲＳＰＧＱＫＫＧＲＫＤＲＲＰＲＫＤＲＫＬＤＲＲＬＤＶＲＰＲＱＰＧＬＱＰ（配列番号１０）

【0217】

ＲＳＰＯ１短縮化１－１３５ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＲＬＧＬＣＶＶＡＬＶＬＳＷＴＨＬＴＩＳＳＲＧＩＫＧＫＲＱＲＲＩＳＡＥＧＳＱＡＣＡＫＧＣＥＬＣＳＥＶＮＧＣＬＫＣＳＰＫＬＦＩＬＬＥＲＮＤＩＲＱＶＧＶＣＬＰＳＣＰＰＧＹＦＤＡＲＮＰＤＭＮＫＣＩＫＣＫＩＥＨＣＥＡＣＦＳＨＮＦＣＴＫＣＫＥＧＬＹＬＨＫＧＲＣＹＰＡＣＰＥＧＳＳＡ（配列番号１１）

【0218】

ＲＳＰＯ１短縮化１－２０６ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＲＬＧＬＣＶＶＡＬＶＬＳＷＴＨＬＴＩＳＳＲＧＩＫＧＫＲＱＲＲＩＳＡＥＧＳＱＡＣＡＫＧＣＥＬＣＳＥＶＮＧＣＬＫＣＳＰＫＬＦＩＬＬＥＲＮＤＩＲＱＶＧＶＣＬＰＳＣＰＰＧＹＦＤＡＲＮＰＤＭＮＫＣＩＫＣＫＩＥＨＣＥＡＣＦＳＨＮＦＣＴＫＣＫＥＧＬＹＬＨＫＧＲＣＹＰＡＣＰＥＧＳＳＡＡＮＧＴＭＥＣＳＳＰＡＱＣＥＭＳＥＷＳＰＷＧＰＣＳＫＫＱＱＬＣＧＦＲＲＧＳＥＥＲＴＲＲＶＬＨＡＰＶＧＤＨＡＡＣＳＤＴＫＥＴＲＲＣＴＶＲＲＶＰＣ（配列番号１２）

【0219】

ＲＳＰＯ２短縮化１－１３４ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＱＦＲＬＦＳＦＡＬＩＩＬＮＣＭＤＹＳＨＣＱＧＮＲＷＲＲＳＫＲＡＳＹＶＳＮＰＩＣＫＧＣＬＳＣＳＫＤＮＧＣＳＲＣＱＱＫＬＦＦＦＬＲＲＥＧＭＲＱＹＧＥＣＬＨＳＣＰＳＧＹＹＧＨＲＡＰＤＭＮＲＣＡＲＣＲＩＥＮＣＤＳＣＦＳＫＤＦＣＴＫＣＫＶＧＦＹＬＨＲＧＲＣＦＤＥＣＰＤＧＦＡＰ（配列番号１３）

【0220】

ＲＳＰＯ２短縮化１－２０３ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＱＦＲＬＦＳＦＡＬＩＩＬＮＣＭＤＹＳＨＣＱＧＮＲＷＲＲＳＫＲＡＳＹＶＳＮＰＩＣＫＧＣＬＳＣＳＫＤＮＧＣＳＲＣＱＱＫＬＦＦＦＬＲＲＥＧＭＲＱＹＧＥＣＬＨＳＣＰＳＧＹＹＧＨＲＡＰＤＭＮＲＣＡＲＣＲＩＥＮＣＤＳＣＦＳＫＤＦＣＴＫＣＫＶＧＦＹＬＨＲＧＲＣＦＤＥＣＰＤＧＦＡＰＬＥＥＴＭＥＣＶＥＧＣＥＶＧＨＷＳＥＷＧＴＣＳＲＮＮＲＴＣＧＦＫＷＧＬＥＴＲＴＲＱＩＶＫＫＰＶＫＤＴＩＬＣＰＴＩＡＥＳＲＲＣＫＭＴＭＲＨＣ（配列番号１４）

【0221】

ＲＳＰＯ３短縮化１－１３５ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＨＬＲＬＩＳＷＬＦＩＩＬＮＦＭＥＹＩＧＳＱＮＡＳＲＧＲＲＱＲＲＭＨＰＮＶＳＱＧＣＱＧＧＣＡＴＣＳＤＹＮＧＣＬＳＣＫＰＲＬＦＦＡＬＥＲＩＧＭＫＱＩＧＶＣＬＳＳＣＰＳＧＹＹＧＴＲＹＰＤＩＮＫＣＴＫＣＫＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬＧＫＣＬＤＮＣＰＥＧＬＥＡ（配列番号１５）

【0222】

ＲＳＰＯ３短縮化１－１４６ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＨＬＲＬＩＳＷＬＦＩＩＬＮＦＭＥＹＩＧＳＱＮＡＳＲＧＲＲＱＲＲＭＨＰＮＶＳＱＧＣＱＧＧＣＡＴＣＳＤＹＮＧＣＬＳＣＫＰＲＬＦＦＡＬＥＲＩＧＭＫＱＩＧＶＣＬＳＳＣＰＳＧＹＹＧＴＲＹＰＤＩＮＫＣＴＫＣＫＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬＧＫＣＬＤＮＣＰＥＧＬＥＡＮＮＨＴＭＥＣＶＳＩＶ（配列番号１６）

【0223】

ＲＳＰＯ３短縮化１－２０６ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＨＬＲＬＩＳＷＬＦＩＩＬＮＦＭＥＹＩＧＳＱＮＡＳＲＧＲＲＱＲＲＭＨＰＮＶＳＱＧＣＱＧＧＣＡＴＣＳＤＹＮＧＣＬＳＣＫＰＲＬＦＦＡＬＥＲＩＧＭＫＱＩＧＶＣＬＳＳＣＰＳＧＹＹＧＴＲＹＰＤＩＮＫＣＴＫＣＫＡＤＣＤＴＣＦＮＫＮＦＣＴＫＣＫＳＧＦＹＬＨＬＧＫＣＬＤＮＣＰＥＧＬＥＡＮＮＨＴＭＥＣＶＳＩＶＨＣＥＶＳＥＷＮＰＷＳＰＣＴＫＫＧＫＴＣＧＦＫＲＧＴＥＴＲＶＲＥＩＩＱＨＰＳＡＫＧＮＬＣＰＰＴＮＥＴＲＫＣＴＶＱＲＫＫＣ（配列番号１７）

【0224】

ＲＳＰＯ４短縮化１－１２８ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＲＡＰＬＣＬＬＬＬＶＡＨＡＶＤＭＬＡＬＮＲＲＫＫＱＶＧＴＧＬＧＧＮＣＴＧＣＩＩＣＳＥＥＮＧＣＳＴＣＱＱＲＬＦＬＦＩＲＲＥＧＩＲＱＹＧＫＣＬＨＤＣＰＰＧＹＦＧＩＲＧＱＥＶＮＲＣＫＫＣＧＡＴＣＥＳＣＦＳＱＤＦＣＩＲＣＫＲＱＦＹＬＹＫＧＫＣＬＰＴＣＰＰＧＴＬＡ（配列番号１８）

【0225】

ＲＳＰＯ４短縮化１－１９５ポリペプチド配列（シグナル配列に下線を引く）
ＭＲＡＰＬＣＬＬＬＬＶＡＨＡＶＤＭＬＡＬＮＲＲＫＫＱＶＧＴＧＬＧＧＮＣＴＧＣＩＩＣＳＥＥＮＧＣＳＴＣＱＱＲＬＦＬＦＩＲＲＥＧＩＲＱＹＧＫＣＬＨＤＣＰＰＧＹＦＧＩＲＧＱＥＶＮＲＣＫＫＣＧＡＴＣＥＳＣＦＳＱＤＦＣＩＲＣＫＲＱＦＹＬＹＫＧＫＣＬＰＴＣＰＰＧＴＬＡＨＱＮＴＲＥＣＱＧＥＣＥＬＧＰＷＧＧＷＳＰＣＴＨＮＧＫＴＣＧＳＡＷＧＬＥＳＲＶＲＥＡＧＲＡＧＨＥＥＡＡＴＣＱＶＬＳＥＳＲＫＣＰＩＱＲＰ（配列番号１９）

【0226】

Ｍｕｔａｔｅｄ ＩＴＲポリヌクレオチド配列
ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧ
ＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ（配列番号２０）

【0227】

ＭＹＯＣ３７０Ｌフォワード変異誘発プライマー（置換は下線付き）
ＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧ（配列番号２１）

【0228】

ＭＹＯＣ３７０Ｌリバース変異誘発プライマー（置換は下線付き）
ＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＴ（配列番号２２）

【0229】

ＭＹＯＣＹ４３７Ｈフォワード突然変異誘発プライマー（置換に下線を引く）
ＴＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣ（配列番号２３）

【0230】

ＭＹＯＣＹ４３７Ｈリバース突然変異誘発プライマー（置換に下線を引く）
ＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡ（配列番号２４）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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