▶ ホーフェイ インスティテューツ オブ フィジカル サイエンス， チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-29
(45)【発行日】2022-07-07
(54)【発明の名称】ヒトＦＧＦ２１変異体、その製造方法、及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/18 20060101AFI20220630BHJP
C07K 14/50 20060101ALI20220630BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220630BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20220630BHJP
C12N 15/74 20060101ALI20220630BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220630BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220630BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220630BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220630BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20220630BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220630BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220630BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220630BHJP
【ＦＩ】
C12N15/18
C07K14/50 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/70 Z
C12N15/74 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/18
A61P3/04
A61P3/06
A61P3/10
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2020509145
(86)(22)【出願日】2018-04-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-06-25
(86)【国際出願番号】 CN2018082669
(87)【国際公開番号】W WO2018196616
(87)【国際公開日】2018-11-01
【審査請求日】2020-04-22
(31)【優先権主張番号】201710302732.X
(32)【優先日】2017-04-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519384884
【氏名又は名称】ホーフェイ インスティテューツ オブ フィジカル サイエンス， チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ワン， ジュンフォン
(72)【発明者】
【氏名】ヂャオ， ホンシン
(72)【発明者】
【氏名】ヂュ， レイ
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１５－１６５８０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２６４４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２１５９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５０７９３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Hecht, R.et al.，Rationale-based engineering of a potent long-acting FGF21 analog for the treatment of type 2 diabetes，PLOS ONE，2012年，Vol. 7(11)：e49345，pp. 1-14
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列への下記のアミノ酸改変：１）野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の３１番目のＡｌａと３２番目のＨｉｓの間に挿入された一つのＣｙｓ、ならびに４３番目のＧｌｙ又は４４番目のＡｌａからＣｙｓへの変異、及び
２）野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の１７１番目のＰｒｏからＧｌｙへの変異を含み、
前記位置番号は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置番号に相当する
ヒトＦＧＦ２１変異体。
【請求項2】
さらに、野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の２４～３１番目のアミノ酸フラグメント代替物としての８アミノ酸のフラグメントを含み、
前記アミノ酸フラグメント代替物のアミノ酸配列は、ＳＧＰＨＧＬＳＳである、
請求項１に記載のヒトＦＧＦ２１変異体。
【請求項3】
前記変異体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のものである、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項4】
前記野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載のものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載の変異体をコードする核酸。
【請求項6】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項7】
前記ベクターが発現ベクターである請求項６に記載のベクター。
【請求項8】
前記ベクターが原核発現ベクターである請求項６に記載のベクター。
【請求項9】
請求項６～８のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項10】
請求項１～４のいずれかに記載の変異体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項11】
２型糖尿病、肥満、脂質異常症又はメタボリックシンドロームの治療のための医薬品の製造における、請求項１～４のいずれかに記載の変異体、請求項５に記載の核酸、請求項６～８のいずれかに記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞、又は請求項１０に記載の医薬組成物の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質工学分野に属する。具体的には、人線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２１）変異体、当該変異体をコードする遺伝子、当該変異体の製造方法、及び当該変異体による２型糖尿病、肥満、又は脂質異常症、代謝異常症の治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＦＧＦ２１は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）１９サブファミリーに属する分泌タンパク質である。前記線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）サブファミリーには、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１とＦＧＦ２３が含まれる（非特許文献１）。ＦＧＦ２１は非典型的なＦＧＦであり、ヘパリンから独立して、グルコース代謝、脂質代謝およびエネルギー代謝において機能している。ＦＧＦ２１は、ＧＬＵＴ１の表現を向上することで脂肪細胞中のグルコース吸収を促しており、そのメカニズムはインスリンとは異なる。糖尿病を患っているげっ歯類、サルと人においては、ＦＧＦ２１は空腹時血糖値を下げて、さらにトリグリセリド、インスリンとグルカゴンのそれぞれの空腹時の血清中濃度を下降する。また、食餌性肥満させたげっ歯類動物のモデルでは、ＦＧＦ２１を投与することで、累積体重量は用量依存的に減らされたことになる。実験的研究は、糖尿病、肥満、脂質異常症、代謝異常症の治療のためのＦＧＦ２１の薬理学的投与を裏付ける。
【0003】
ヒトＦＧＦ２１は分解しやすい性質を有し、投与量が高くで、安定性と効能が低いため、患者への投与量を減らすように、野生型ＦＧＦ２１に対して改変を行って、ヒトＦＧＦ２１の効能と安定性を上げる必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｉｔｏｈ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄ Ｇｅｎｅｔ．２０：５６３－６９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
前記課題を解決するために、本発明は、代わりのヒトＦＧＦ２１変異体、それをコードする遺伝子、当該変異体の製造方法、及びその使用を提供する。
【0006】
特に、本発明は、一方で、野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列における下記のアミノ酸改変を有するヒトＦＧＦ２１変異体を提供する。
１） 野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列において、３１番目のＡｌａと３２番目のＨｉｓの間に挿入された一つのＣｙｓ、並びに４３番目のＧｌｙ及び４４番目のＡｌａのいずれか１つまたは２つからＣｙｓへの変異（挿入されたＣｙｓが変異Ｃｙｓと分子内ジスルフィド結合を形成）
２）野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の１７１番目のＰｒｏからＧｌｙへの変異、及び／又は
３）野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の２４～３１番目のアミノ酸配列フラグメント代替物としての５～１５アミノ酸、好ましくは６～１４アミノ酸、より好ましくは７～１３アミノ酸、さらに好ましくは８～１０アミノ酸、最も好ましくは８アミノ酸のフラグメント。
１） 野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列において、３１番目のＡｌａと３２番目のＨｉｓの間に挿入された一つのＣｙｓ、並びに４３番目のＧｌｙ及び４４番目のＡｌａのいずれか１つまたは２つからＣｙｓへの変異（挿入されたＣｙｓが変異Ｃｙｓと分子内ジスルフィド結合を形成）
２）野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の１７１番目のＰｒｏからＧｌｙへの変異、及び／又は
３）野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列の２４～３１番目のアミノ酸配列フラグメント代替物としての５～１５アミノ酸、好ましくは６～１４アミノ酸、より好ましくは７～１３アミノ酸、さらに好ましくは８～１０アミノ酸、最も好ましくは８アミノ酸のフラグメント。
【0007】
本発明の好ましい態様として、前記アミノ酸配列フラグメント代替物は任意のアミノ酸の組み合わせである。
【0008】
本発明に用いるアミノ酸の略語は以下の通りである。
【0009】
【表0】
【0010】
本発明の好ましい態様として、前記アミノ酸配列フラグメント代替物は、式Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８で表される８アミノ酸のフラグメントである。
【0011】
本発明の好ましい態様として、Ｘ１～Ｘ８は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択されるものであり、好ましくはＸ１がＳｅｒ又はＡｓｐ、Ｘ２がＧｌｙ又はＡｓｐ、Ｘ３がＰｒｏ又はＡｌａ、Ｘ４がＡｌａ又はＧｌｎ、Ｘ５がＧｌｙ又はＧｌｎ、Ｘ６がＬｅｕ又はＴｙｒ、Ｘ７がＳｅｒ又はＨｉｓ、Ｘ８がＳｅｒ又はＡｌａである。
【0012】
本発明の態様において、本発明者らはＦＧＦ２１の空間構造を基づいて、ＦＧＦ２１のＣ端の第１７１番目のアミノ酸Ｐは表面に暴露して酵素で分解されやすいことを見出しており、本発明では、当該アミノ酸をＧに変異させることで、ＦＧＦ２１の活性を損なわずにＦＧＦ２１の安定性を高める（データは示さない）。さらに、本発明者らはＦＧＦ２１の空間構造を基づいて、ＦＧＦ２１のＮ端の２４～３１番目のアミノ残基の空間構造はループ環になっており、そのループ環の長さはＦＧＦ２１の安定性に著しい影響を与え、ＦＧＦ２１の活性を維持することを見出した。また、ＦＧＦ２１の空間構造によって、本発明者らはさらに野生型ＦＧＦ２１の３１番目と３２番目のアミノ酸は、４３番目と４４番目のアミノ酸と三次元的に近いが、それらからなる構造は不安定であることを見出した。本発明者らが鋭意検討の結果として、２３～３２番目のアミノ残基の間のループ環の長さに影響を及ぼすことなく、３１番目と３２番目との間に一つのシステイン（Ｃｙｓ）が挿入されると、当該システインが４３番目又は４４番目の変異されたシステインとジスルフィド結合を形成することで、その構造が安定化されたことと、また、ループ環上のアミノ酸に対して変異を行って、構造を安定化するように３１～３２番目の間に挿入されたＣｙｓと、４３番目又は４４番目の変異されたＣｙｓとでジスルフィド結合を形成して、２４～３１番目に存在するループ環のアミノ酸組成を変えることで、ＦＧＦ２１の活性を十分に向上できることとを予想外に見出した。ＦＧＦ２１の構造はすでに本実験室によって解析された。変異体のジスルフィド結合を形成した後の構造がより安定したことは、ＣＤ試験とＮＭＲ試験にて十分に証明された。本実験室は、ＦＧＦ２１ループ環のアミノ酸組成を変異させる前後の比較を行った結果、変異後の活性は変異前の活性より顕著に高くなる。
【0013】
本発明の態様において、野生型ヒトＦＧＦ２１タンパクのアミノ酸配列は、３１～３２番目の間に追加したＣｙｓと、４３番目又は４４番目のＣｙｓとの間に安定なジスルフィド結合を形成している場合に、野生型ＦＧＦ２１の２３～３２番目の間のアミノ酸配列の長さがＦＧＦ２１の安定性に影響する効果は顕著になる。そのため、当業者は本明細書に開示した内容に基づいて、前記フラグメントの長さやアミノ酸種類を任意に選択して、本発明に対して効果予期可能な変更又は改善を行こうことができる。
【0014】
本発明の好ましい態様において、前記アミノ酸フラグメント代替物は、ＤＤＡＱＱＴＥＡ（以下、その対応する変異体はＦＧＦ２１－ＡＧとも呼ばれる）であり、当該変異体をコードする核酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示し、そのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す。
【0015】
さらに他の好ましい態様において、前記アミノ酸フラグメント代替物は、ＳＧＰＨＧＬＳＳ（以下、その対応する変異体はＦＧＦ２１－ＬＧとも呼ばれる）であり、当該変異体をコードする核酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示し、そのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す。
【0016】
本発明における「野生型ＦＧＦ２１」は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／からＦＧＦ２１を検索し、得られた結果から生物種（ｏｒｇａｎｉｓｍ）をホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）に指定して得られたものである。ヒト由来のＦＧＦ２１のｕｎｉｐｒｏｔの番号はＱ９ＮＳＡ１であり、本発明者らが得たＦＧＦ２１のタンパク質配列は２０９残基を有する。Ｎ端にいる２８アミノ酸のシグナルペプチドを除去し、得られた１８１残基を有するＦＧＦ２１の配列は、いわゆる野生型ＦＧＦ２１配列とする。その核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。
【0017】
したがって、本発明に記載の「野生型ヒトＦＧＦ２１タンパク」とは、人体に天然に存在する成熟したＦＧＦ２１タンパク（以下、ＦＧＦ２１とも呼ばれる）であり、典型的には、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と９０％以上、９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を持つアミノ酸配列である。
【0018】
参照ポリペプチド配列に対する「％同一性」は、配列をアラインメントして、保存的置換を配列同一性の一部として考慮することなく必要に応じて最大パーセントの配列同一性を達成するためにギャップを導入することによって、参照ポリペプチド配列における同一のアミノ酸残基に対する候補配列における同一のアミノ酸残基のパーセント値によって定義され得る。アミノ酸配列の％同一性を決定することを目的とするアラインメントは、本分野の技術範囲の複数の手段で果せばよい、例えば、一般公衆が取得できるコンピュータソフト、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトを用いることができる。比較する配列の全長に渡って最大アラインメントを達成するためのいかなる算法も含まれる、配列のアラインメントに用いる適切なパラメータは、当業者が決定できる。なお、本明細書では、％同一性の値は配列比較コンピュータプログラムのＡＬＩＧＮ－２で得たものである。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、著者がＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のものであり、ソースコードはすでにユーザーファイルとともに米国著作権局Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出され、米国著作権アクセッション番号ＴＸＵ５１００８７で登録されたものである。一般公衆はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａからＡＬＩＧＮ－２プログラムを取得することができ、あるいはソースコードから前記プログラムにコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標） オペレーティングシステム（数字ＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄも含む）に用いるものにコンパイルされるべきである。全部の配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ－２プログラムで設定されるものであり、変更する必要はない。
【0019】
一方、本発明は、上記の変異体のいずれかをコードする核酸を提供する。
【0020】
本発明はまた上記の核酸を含むベクターを提供する。好ましい態様において、前記ベクターは発現ベクターであり、より好ましくは原核発現ベクターである。
【0021】
本発明はまた上記のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0022】
好ましい態様において、前記宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
【0023】
本発明はまた、前記ヒトＦＧＦ２１変異体をコードする遺伝子と前記発現ベクターとを作動可能に連結して、組換え発現ベクターを得る工程、
組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、
組換え宿主細胞を培養し、組換えタンパクの発現を誘導し、発現したタンパク質を回収して精製する工程
を含む、ヒトＦＧＦ２１変異体を調製する方法を提供する。
組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換する工程、
組換え宿主細胞を培養し、組換えタンパクの発現を誘導し、発現したタンパク質を回収して精製する工程
を含む、ヒトＦＧＦ２１変異体を調製する方法を提供する。
【0024】
好ましい態様において、前記方法は、ＳＵＭＯタグ付きの遺伝子（ＳＵＭＯタグ遺伝子のＮ端に６つのｈｉｓタグを有する）と、前記ヒトＦＧＦ２１変異体をコードしうる核酸配列とを順に連結する工程、
当該遺伝子と発現ベクターとを作動可能に連結して、組換え発現ベクターを得る工程、
組換え発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
組換え宿主細胞を培養し、組換えタンパク質の発現を誘導し、発現させたタンパク質を回収して精製する工程、
ＳＵＭＯ酵素でタンパク質を消化し、タンパク質を再精製する工程
を含む。
当該遺伝子と発現ベクターとを作動可能に連結して、組換え発現ベクターを得る工程、
組換え発現ベクターにより宿主細胞を形質転換する工程、
組換え宿主細胞を培養し、組換えタンパク質の発現を誘導し、発現させたタンパク質を回収して精製する工程、
ＳＵＭＯ酵素でタンパク質を消化し、タンパク質を再精製する工程
を含む。
【0025】
前記宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
【0026】
本発明者らは、本発明に記載の変異体についての誘導発現条件として、１０～３７℃で細胞を培養して、ＯＤ６００が０．２～１．０になっている時に、最終濃度が０．１～１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えて、４～３７℃で２～２０時間誘導発現することを見出した。より好ましい態様において、前記条件として、３７℃で細胞を培養して、ＯＤ６００が０．８になっている時に最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えて、２５℃で６時間誘導発現する。
【0027】
本発明の精製方法は、回収した菌体を、溶解バッファー（２０Ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００Ｍｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で再懸濁し、細胞を粉砕し、遠心分離で上清液を回収し、上清液と精製充填剤を混合し、０．１～１０時間でインキュベートし、混合物をクロマトグラフィーカラムに移してタンパク質の精製を行って、得られたＳＵＭＯ融合ヒトＦＧＦ２１変異体タンパクをＳＵＭＯ酵素で酵素消化するものである。酵素消化条件は、温度が０～３７℃であり、バッファーが２０Ｍｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌであり、ｐＨ値は６．８～８．０であり、０～２４時間で消化し、Ｎｉメタロキレートアフィニティークロマトグラフィーを用いてヒトＦＧＦ２１変異体を得ることを含む。さらに分子排除クロマトグラフィーにて、ＦＧＦ２１変異体タンパクを再精製する。
【0028】
一方、本発明は、２型糖尿病、肥満、脂質異常症又はメタボリックシンドロームの治療のための医薬品の製造における前記変異体の使用を提供する。
【0029】
一方、本発明は本発明に記載の変異体及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。「医薬的に許容される担体」という用語は、製剤の他の成分と相溶する担体、又は補助物質、例えば、希釈剤、賦形剤である。「医薬組成物」という用語には、指定量又は割合で特定成分を含む製品、及び特定量の特定成分を組み合わせることで直接的に又は間接的に得られる製品が含まれる。好ましくは、１種又は複数種の活性成分を含み、場合によっては不活性成分を含む担体を含んでもよい製品や、任意の２種以上の成分の組み合わせ、組成物もしくは凝集体、または１種または複数の成分の分解、または他のタイプの１種または複数の成分の反応もしくは相互作用から直接的または間接的に得られる任意の製品が含まれる。本発明に記載の「変異」には、アミノ酸の置換、欠失、及び付加が含まれる。
【0030】
以上説明したように、本発明の変異体は野生型ＦＧＦ２１よりも多くの利点を有する。これらの利点には、改善された薬理学效能及び／又は改善された医薬安定性が含まれる。本発明のＦＧＦ２１変異体タンパクは、体内により顕著な薬物効力及びより大きい体内熱安定性を含む１つ以上の有益な生理学的特徴を有する。また、本発明のＦＧＦ２１バリアントは、２型糖尿病、肥満、異常脂血症又はメタボリックシンドローム又はその中のいずれの治療において潜在的な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】ＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１変異体の発現ベクターを示す模式図である。
【図2】精製後のＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１－ＬＧ核酸の電気泳動写真であり、ＭはＤＬ５０００ＤＮＡマーカーであり、１はＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１－ＬＧ遺伝子の精製した生成物である。
【図3】精製後のＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１－ＡＧ核酸の電気泳動写真であり、ＭはＤＬ５０００ＤＮＡマーカーであり、１はＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１－ＡＧ遺伝子の精製した生成物。
【図4】精製後のｐＥＴ２２ｂ（ＤＥ３）ＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１－ＬＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図5】精製後のＦＧＦ２１－ＬＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図であり、Ｍはタンパク分子量基準を表し、１はＦＧＦ２１－ＬＧを表す。
【図6】精製後のＦＧＦ２１－ＡＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図であり、Ｍはタンパク分子量基準を表し、１はＦＧＦ２１－ＡＧを表す。
【図7】ＦＧＦ２１－ＬＧタンパクの動物薬効試験（血糖を下げる）結果を示す図である。
【図8】ＦＧＦ２１－ＡＧタンパクの動物薬効試験（血糖を下げる）結果を示す図。
【図9】ＦＧＦ２１－ＬＧタンパクの動物薬効試験（体重への影響）結果を示す図である。
【図10】ＦＧＦ２１－ＡＧタンパクの動物薬効試験（体重への影響）結果を示す図である。
【図11】ＦＧＦ２１－ＬＧタンパクの熱安定性試験を示す。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。本発明の利点と特徴は、説明することでより明らかになる。これらの実施例は例示にすぎないものであり、本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。当業者が分かるように、本発明の精神と範囲から逸脱しない範囲で本発明の技術構成の詳細とその形式に対して補正又は置換を行うことができる。これら補正又は置換はいずれも本発明の保護範囲内にある。
【0033】
発明を実施するための試験用主な試薬、用品および機器：
クローニングに用いるプライマーは、全て上海生工で合成したものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いるＤＮＡポリメラーゼ（ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ）、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、Ｄｐｎ Ｉは、全てＴａｋａｒａ会社から購入した。ＤＮＡマーカーはＴｈｅｒｍｏから購入したものである。通常のＤＮＡ生成物回収キットや、アガロースゲル回収キットはＴＩＡＮＧＥＮ会社から購入した。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株、ｐＥＴ２２ｂ－ＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１プラスミド、ＳＵＭＯプロテアーゼは北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ（索莱宝）テクノロジー有限会社から購入したものである。Ｔｒｉｓ、イミダゾールは上海生工から、他の塩類は国薬から、濃縮チューブはミリポアから購入したものである。ＦＰＬＣ機器には、ＧＥ会社のＫＴＡシステムを使っており、用いたＮｉ－セファロースクロマトグラフィーカラムと、分子排除クロマトグラフィーカラムであるＨｉｌｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇは、ＧＥ会社から購入したものである。ＢＣＡキットはＴｈｅｒｍｏから購入したものである。
クローニングに用いるプライマーは、全て上海生工で合成したものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いるＤＮＡポリメラーゼ（ｐｒｉｍｅｒ ｓｔａｒ）、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、Ｄｐｎ Ｉは、全てＴａｋａｒａ会社から購入した。ＤＮＡマーカーはＴｈｅｒｍｏから購入したものである。通常のＤＮＡ生成物回収キットや、アガロースゲル回収キットはＴＩＡＮＧＥＮ会社から購入した。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α菌株、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株、ｐＥＴ２２ｂ－ＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１プラスミド、ＳＵＭＯプロテアーゼは北京Ｓｏｌａｒｂｉｏ（索莱宝）テクノロジー有限会社から購入したものである。Ｔｒｉｓ、イミダゾールは上海生工から、他の塩類は国薬から、濃縮チューブはミリポアから購入したものである。ＦＰＬＣ機器には、ＧＥ会社のＫＴＡシステムを使っており、用いたＮｉ－セファロースクロマトグラフィーカラムと、分子排除クロマトグラフィーカラムであるＨｉｌｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇは、ＧＥ会社から購入したものである。ＢＣＡキットはＴｈｅｒｍｏから購入したものである。
【0034】
【表1】
ｂ １～３番目は保護用塩基であり、４～９番目は制限エンドヌクレアーゼサイトである。
【0035】
実施例１：組換えＦＧＦ２１変異体の発現ベクターの構築
ｐＥＴ２２ｂ－ＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１プラスミドを鋳型とする一度目の変異には、上流プライマー１７１Ｇ－Ｆと下流プライマー１７１Ｇ－Ｒを用いてＰＣＲ部位特異的変異を行って、ＦＧＦ２１－Ｐ１７１Ｇ変異体が得られた。二度目の変異には、ＦＧＦ２１－Ｐ１７１Ｇ変異体を鋳型とし、４３Ｃ－Ｆを上流プライマー、４３Ｃ－Ｒを下流プライマーとしてＰＣＲ部位特異的変異を行って、ＦＧＦ２１－Ｇ４３Ｃ－Ｐ１７１Ｇ変異体が得られた。三度目の変異には、ＦＧＦ２１－Ｇ４３Ｃ－Ｐ１７１Ｇ変異体を鋳型とし、３１－３２Ｃ－Ｆを上流プライマー、３１－３２Ｃ－Ｒを下流プライマーとしてＰＣＲ部位特異的変異を行って、ＦＧＦ２１－ＡＧ変異体が得られた。四度目の変異は、ＦＧＦ２１－ＡＧを鋳型とし、ＦＧＦ２１－ＬＧ－Ｆを上流プライマー、ＦＧＦ２１－ＬＧ－Ｒを下流プライマーとして変異を行った。ＦＧＦ２１－ＬＧ変異体が得られた。ＰＣＲ反応条件は以下のようにする。ＰＣＲ反応系および反応プログラムにて上記変異過程を行った。
ｐＥＴ２２ｂ－ＳＵＭＯ－ＦＧＦ２１プラスミドを鋳型とする一度目の変異には、上流プライマー１７１Ｇ－Ｆと下流プライマー１７１Ｇ－Ｒを用いてＰＣＲ部位特異的変異を行って、ＦＧＦ２１－Ｐ１７１Ｇ変異体が得られた。二度目の変異には、ＦＧＦ２１－Ｐ１７１Ｇ変異体を鋳型とし、４３Ｃ－Ｆを上流プライマー、４３Ｃ－Ｒを下流プライマーとしてＰＣＲ部位特異的変異を行って、ＦＧＦ２１－Ｇ４３Ｃ－Ｐ１７１Ｇ変異体が得られた。三度目の変異には、ＦＧＦ２１－Ｇ４３Ｃ－Ｐ１７１Ｇ変異体を鋳型とし、３１－３２Ｃ－Ｆを上流プライマー、３１－３２Ｃ－Ｒを下流プライマーとしてＰＣＲ部位特異的変異を行って、ＦＧＦ２１－ＡＧ変異体が得られた。四度目の変異は、ＦＧＦ２１－ＡＧを鋳型とし、ＦＧＦ２１－ＬＧ－Ｆを上流プライマー、ＦＧＦ２１－ＬＧ－Ｒを下流プライマーとして変異を行った。ＦＧＦ２１－ＬＧ変異体が得られた。ＰＣＲ反応条件は以下のようにする。ＰＣＲ反応系および反応プログラムにて上記変異過程を行った。
【0036】
ＰＣＲ反応系：２×Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ（Ｐｒｅｍｉｘ）２５μｌ、上流プライマー（１０μｍ）１μｌ、下流プライマー（１０μｍ）１μｌ、鋳型１μｌ、ｄｄＨ２Ｏ２２μｌ、総体積５０μｌ。
ＰＣＲ反応工程：
ステップ１、予備変性温度９８℃で１０分；
ステップ２、変性温度９８℃で１０秒；
ステップ３、アニーリング温度５７℃で５秒；
ステップ４、伸長温度７２℃で１分。
ステップ２～ステップ４からなるサイクルを３０回繰り返した。
ＰＣＲ反応工程：
ステップ１、予備変性温度９８℃で１０分；
ステップ２、変性温度９８℃で１０秒；
ステップ３、アニーリング温度５７℃で５秒；
ステップ４、伸長温度７２℃で１分。
ステップ２～ステップ４からなるサイクルを３０回繰り返した。
【0037】
毎回変異した生成物はＤｐｎ Ｉ酵素により３７℃で１ｈ酵素消化した。酵素消化した生成物は、アガロースゲル電気泳動に付し、その後ジェル回収キットでプラスミドを回収し、コンピテント細胞１００ｕｌにプラスミド１ｕｌを加えてその細胞を氷上に３０分間置き、４２℃で９０秒間熱ショックし、４００ｕｌ ＬＢ培地を加え、３７℃で４５分間振とう培養後、平板に接種し、倒置して３７℃で一晩培養した。鋳型としてモノクローンを取り出し、ＳＵＭＯ－Ｆを上流プライマー、ＦＧＦ２１－Ｒを下流プライマーとしてＰＣＲ同定を行った。ＦＧＦ２１－ＬＧの同定した結果は図２に示し、ＦＧＦ２１－ＡＧの同定した結果は図３に示す。初歩的同定で確認されたＦＧＦ２１変異体は、遺伝子についてのシークエンサーと結果の分析を行った。サンプルは、生工バイオ工程（上海）有限会社によって配列を測定した。配列はＤＮＡＭＡＮソフトで分析した。配列シークエンサーの結果：変異体ＦＧＦ２１－ＡＧの核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示し、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す。変異体ＦＧＦ２１－ＬＧの核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示し、対応するアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す。図１はその構築ベクターを示す模式図である。
【0038】
シークエンサーにより確認されたＦＧＦ２１変異体をコードする核酸配列を含むプラスミドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換し、モノクローナル菌株を採取して拡大培養を行い、そしてその菌株は－８０℃の冷蔵庫に保存した。
【0039】
実施例２：ヒト組換えＦＧＦ２１変異体の発現
ＦＧＦ２１変異体菌株は、２％の植菌量で５ｍｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植菌し、２２０ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪培養した。一晩培養した菌液は、２％の量で、５００ｍｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）を入れた２０００ｍｌ三角ボトルに植菌した。ＯＤ６００が０．８になる時点で１．０Ｍ ＩＰＴＧ５００ｕｌを加えて、２５℃で４時間誘導発現した。４℃、８０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を回収して－８０℃に凍結保存した。
ＦＧＦ２１変異体菌株は、２％の植菌量で５ｍｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）に植菌し、２２０ｒｐｍ、３７℃で一晩振盪培養した。一晩培養した菌液は、２％の量で、５００ｍｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）を入れた２０００ｍｌ三角ボトルに植菌した。ＯＤ６００が０．８になる時点で１．０Ｍ ＩＰＴＧ５００ｕｌを加えて、２５℃で４時間誘導発現した。４℃、８０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、上清を捨て、菌体を回収して－８０℃に凍結保存した。
【0040】
実施例３：組換えヒトＦＧＦ２１変異体の精製
（１）組換えヒトＦＧＦ２１変異体の初精製
発現により得られた菌体は、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に再懸濁した後、超音波粉砕（３０％出力、２秒間作動＋５秒間停止で、トータル時間は４５分間）を行った。４℃、１４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清液を回収した。あらかじめバッファーでバランスされたＮｉ－セファロースクロマトグラフィーカラムには、上清液を加えて、４℃で３０分間ロータリーミキシングした。溶液がカラムに通液された後、カラムの体積の５倍に相当するバッファーで洗浄して、結合しなかったタンパク質と不純物を除去し、さらにカラムの体積の５倍に相当する３０ｍＭイミダゾールを含むバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で非特異性の目的外のタンパク質を溶出させた後、もう一度カラムの体積の５倍に相当する３００ｍＭイミダゾールを含むバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて目的タンパク質を溶出して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて精製の結果を検出した（結果は図４に示す）。
（１）組換えヒトＦＧＦ２１変異体の初精製
発現により得られた菌体は、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に再懸濁した後、超音波粉砕（３０％出力、２秒間作動＋５秒間停止で、トータル時間は４５分間）を行った。４℃、１４０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清液を回収した。あらかじめバッファーでバランスされたＮｉ－セファロースクロマトグラフィーカラムには、上清液を加えて、４℃で３０分間ロータリーミキシングした。溶液がカラムに通液された後、カラムの体積の５倍に相当するバッファーで洗浄して、結合しなかったタンパク質と不純物を除去し、さらにカラムの体積の５倍に相当する３０ｍＭイミダゾールを含むバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）で非特異性の目的外のタンパク質を溶出させた後、もう一度カラムの体積の５倍に相当する３００ｍＭイミダゾールを含むバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）を用いて目的タンパク質を溶出して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて精製の結果を検出した（結果は図４に示す）。
【0041】
（２）組換えヒトＦＧＦ２１変異体酵素消化の精製
透析後の融合タンパク質の検出：分子モル比が０．１％の割合でＳＵＭＯ酵素を加え、４℃で２ｈ酵素消化し、酵素消化したタンパク質溶液に終濃度が２０ｍＭであるイミダゾールを加えて、そしてその液体をあらかじめバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）でバランスされたＮｉ－セファロースクロマトグラフィーカラムに加えて、４℃で３０分間ロータリーミキシングした。通液した溶液を回収し、サンプルは濃縮チューブで１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、さらに分子排除クロマトグラフィーバッファー（２０ｍＭ ＰＢＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）によりＳｕｐｅｒｄｅｘ７５分子排除クロマトグラフィーカラムで精製した。得られたタンパク質は、つまりＦＧＦ２１変異体タンパクである。本発明の試験において、ＦＧＦ２１及び変異体であるＦＧＦ２１－ＬＧ、ＦＧＦ２１－ＡＧタンパクは、いずれも上に述べた方法で精製し、さらに１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で検出したものである。なお、ＦＧＦ２１－ＬＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果は図５に示し、ＦＧＦ２１－ＡＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果は図６に示す。
透析後の融合タンパク質の検出：分子モル比が０．１％の割合でＳＵＭＯ酵素を加え、４℃で２ｈ酵素消化し、酵素消化したタンパク質溶液に終濃度が２０ｍＭであるイミダゾールを加えて、そしてその液体をあらかじめバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）でバランスされたＮｉ－セファロースクロマトグラフィーカラムに加えて、４℃で３０分間ロータリーミキシングした。通液した溶液を回収し、サンプルは濃縮チューブで１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、さらに分子排除クロマトグラフィーバッファー（２０ｍＭ ＰＢＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）によりＳｕｐｅｒｄｅｘ７５分子排除クロマトグラフィーカラムで精製した。得られたタンパク質は、つまりＦＧＦ２１変異体タンパクである。本発明の試験において、ＦＧＦ２１及び変異体であるＦＧＦ２１－ＬＧ、ＦＧＦ２１－ＡＧタンパクは、いずれも上に述べた方法で精製し、さらに１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で検出したものである。なお、ＦＧＦ２１－ＬＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果は図５に示し、ＦＧＦ２１－ＡＧタンパクのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果は図６に示す。
【0042】
実施例４：ＦＧＦ２１変異体による血糖を下げる試験
変異体タンパクを用いて動物血糖を下げる試験を行った。ｏｂ／ｏｂマウス（南京大学動物パターン所から購入した）モデルは、３グループ各８匹に分けて、それぞれ、ベクター対照グループ（すなわち、生理食塩水を注射した）、ＦＧＦ２１グループ、ＦＧＦ２１－ＬＧグループとする。実施方法は、背中に皮下注射で０．１ｍｇ／ｋｇ／日で７日間連続投与して、毎日投与前の血糖の値を記録した。図７に示すように、野生型ＦＧＦ２１タンパクと比較して、ＦＧＦ２１－ＬＧグループ（図７）はより強い薬効を示した。同様に、ＦＧＦ２１－ＡＧを用いて同じように試験した。実施方法は、０．６ｍｇ／ｋｇ／日で、毎日投与前の血糖の値を記録した。この試験により、ＦＧＦ２１－ＡＧは同様に顕著な血糖を下げる作用を有することを証明した。その結果は図８に示す。
変異体タンパクを用いて動物血糖を下げる試験を行った。ｏｂ／ｏｂマウス（南京大学動物パターン所から購入した）モデルは、３グループ各８匹に分けて、それぞれ、ベクター対照グループ（すなわち、生理食塩水を注射した）、ＦＧＦ２１グループ、ＦＧＦ２１－ＬＧグループとする。実施方法は、背中に皮下注射で０．１ｍｇ／ｋｇ／日で７日間連続投与して、毎日投与前の血糖の値を記録した。図７に示すように、野生型ＦＧＦ２１タンパクと比較して、ＦＧＦ２１－ＬＧグループ（図７）はより強い薬効を示した。同様に、ＦＧＦ２１－ＡＧを用いて同じように試験した。実施方法は、０．６ｍｇ／ｋｇ／日で、毎日投与前の血糖の値を記録した。この試験により、ＦＧＦ２１－ＡＧは同様に顕著な血糖を下げる作用を有することを証明した。その結果は図８に示す。
【0043】
実施例５：ＦＧＦ２１変異体による体重を下げる試験
ＦＧＦ２１変異体タンパクを用いて動物体重を下げる試験を行った。ｏｂ／ｏｂマウスは４グループ各８匹に分けて、それぞれ、ベクター対照グループ（すなわち生理食塩水を注射した）、ＦＧＦ２１グループ、ヒトＦＧＦ２１－ＬＧグループ、ＦＧＦ２１－ＡＧグループとする。精製後のタンパクは０．６ｍｇ／ｋｇ／日で６日間連続投与して、６日後の体重の変動を記録した。この試験により、野生型ＦＧＦ２１タンパクと比較して、ＦＧＦ２１－ＬＧ（図９）とＦＧＦ２１－ＡＧ（図１０）グループは顕著な体重減少作用を有し、より強い薬効を有することを実証した。
ＦＧＦ２１変異体タンパクを用いて動物体重を下げる試験を行った。ｏｂ／ｏｂマウスは４グループ各８匹に分けて、それぞれ、ベクター対照グループ（すなわち生理食塩水を注射した）、ＦＧＦ２１グループ、ヒトＦＧＦ２１－ＬＧグループ、ＦＧＦ２１－ＡＧグループとする。精製後のタンパクは０．６ｍｇ／ｋｇ／日で６日間連続投与して、６日後の体重の変動を記録した。この試験により、野生型ＦＧＦ２１タンパクと比較して、ＦＧＦ２１－ＬＧ（図９）とＦＧＦ２１－ＡＧ（図１０）グループは顕著な体重減少作用を有し、より強い薬効を有することを実証した。
【0044】
実施例６：熱安定性試験
試験にはヒトＦＧＦ２１変異タンパクを用いており、ＦＧＦ２１とＦＧＦ２１－ＬＧに対して円偏光二色性（ＣＤ）にて温度改変試験を行い、２０～９５℃の範囲において５℃間隔で一つ試験点を取って試験を行った。試験の結果は、ＦＧＦ２１の転化温度が６９℃であり、ＦＧＦ２１－ＬＧの転化温度が９８℃であった。この試験より、野生型ＦＧＦ２１と比較して、ヒトＦＧＦ２１－ＬＧはより強い熱安定性（図１１）を有することを実証した。同様に、ＦＧＦ２１－ＡＧを用いた試験では類似したＣＤ結果を得た。
試験にはヒトＦＧＦ２１変異タンパクを用いており、ＦＧＦ２１とＦＧＦ２１－ＬＧに対して円偏光二色性（ＣＤ）にて温度改変試験を行い、２０～９５℃の範囲において５℃間隔で一つ試験点を取って試験を行った。試験の結果は、ＦＧＦ２１の転化温度が６９℃であり、ＦＧＦ２１－ＬＧの転化温度が９８℃であった。この試験より、野生型ＦＧＦ２１と比較して、ヒトＦＧＦ２１－ＬＧはより強い熱安定性（図１１）を有することを実証した。同様に、ＦＧＦ２１－ＡＧを用いた試験では類似したＣＤ結果を得た。
【0045】
以上の結果より、本発明に記載の変異体は、野生型よりも強い熱安定性を有することが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】