特許 7098187 多能性幹細胞及びその分化したＴ細胞と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-07-01

(45)【発行日】2022-07-11

(54)【発明の名称】多能性幹細胞及びその分化したＴ細胞と使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20220704BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20220704BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220704BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20220704BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220704BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/0735

C12N5/0783

C12N15/85 Z

C12N15/12

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020535615

(86)(22)【出願日】2018-01-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-03-25

(86)【国際出願番号】 CN2018072254

(87)【国際公開番号】W WO2019127664

(87)【国際公開日】2019-07-04

【審査請求日】2020-07-03

(31)【優先権主張番号】201711490483.8

(32)【優先日】2017-12-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】514321264

【氏名又は名称】中国科学院広州生物医薬与健康研究院

【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ ＯＦ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＥ ＡＮＤ ＨＥＡＬＴＨ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】１９０ Ｋａｉ Ｙｕａｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０５３０（ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】王 金勇

(72)【発明者】

【氏名】郭 栄群

(72)【発明者】

【氏名】張 梦雲

(72)【発明者】

【氏名】劉 麗娟

(72)【発明者】

【氏名】劉 暁飛

(72)【発明者】

【氏名】呂 ▲スイ▼

(72)【発明者】

【氏名】杜 ▲ケン▼

【審査官】竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１３９７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０７０３３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Cell Research，Vol.30，2020年，p.21-33

【文献】Nature，Vol.545，2017年05月，p.432-438, Supplementary Information

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム発現ベクターを多能性幹細胞に組込み、耐性スクリーニングを行うステップと、
（２）Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、Ｄ３培地、Ｄ４培地、Ｄ５培地、Ｄ６培地、およびＤ７培地を順に用いてステップ（１）に記載の多能性幹細胞を培養し、造血幹細胞前駆細胞へ指向性分化するステップと、
（３）ステップ（２）に記載の造血幹細胞前駆細胞とＯＰ９－ＤＬ１細胞と共培養し、Ｔ系列のプロジェニターを取得するステップと、
（４）ステップ（３）に記載のＴ系列のプロジェニターをＴ細胞に分化するように誘導するステップと、
を含み、
前記Ｄ０培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ２．５培地は、３～８ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび３～８ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ３培地は、３～８ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、および３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ４培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ５培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、および１０～３０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドを含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ６培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、１０～３０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、および１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ７培地は、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、１０～３０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、および１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、且つ、
前記基礎分化培地は、１０～２０％のウシ胎仔血清、１８０～２２０μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０^－４Ｍのチオグリセロール、１～３ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、０．４～０．６ｍＭのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地である、ことを特徴とする多能性幹細胞を用いてＴ細胞を指向性分化する方法。

【請求項2】

ステップ（１）に記載のＲｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム発現ベクターを多能性幹細胞のＲｏｓａ２６部位に組込む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（１）に記載の多能性幹細胞は、遺伝子編集後の誘導性多能性幹細胞および／または胚性多能性幹細胞株である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ステップ（１）に記載の組込みの方法は、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、トランスフェクション、またはウイルス感染のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

ステップ（１）に記載の耐性スクリーニングはハイグロマイシンＢを採用する、ことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記Ｄ０培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ２．５培地は、５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ３培地は、５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ４培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ５培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、および２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドを含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ６培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、および１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ７培地は、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、および１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、
前記基礎分化培地は、１５％のウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０^－４Ｍのチオグリセロール、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、０．５ｍＭのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地である、ことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

ステップ（３）に記載の共培養過程において、ドキシサイクリンを用いて誘導する、ことを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

ステップ（４）に記載のＴ細胞は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞である、ことを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記Ｔ細胞は、ＴＣＲβ細胞および／またはＴＣＲγ／δ細胞である、ことを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記多能性幹細胞を用いてＴ細胞を指向性分化する方法は、
（１）Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム発現ベクターを遺伝子組換えにより多能性幹細胞のＲｏｓａ２６部位に組込み、ハイグロマイシンＢを用いて耐性スクリーニングを行うステップと、
（２）Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、Ｄ３培地、Ｄ４培地、Ｄ５培地、Ｄ６培地、およびＤ７培地を順に用いてステップ（１）に記載の多能性幹細胞を培養し、１１日目に造血幹細胞前駆細胞に指向性分化させるステップと、
（３）ステップ（２）に記載の造血幹細胞前駆細胞とＯＰ９－ＤＬ１細胞とを共培養し、ドキシサイクリンを用いて誘導し、Ｔ系列のプロジェニターを取得するステップと、
（４）ステップ（３）に記載のＴ系列のプロジェニターを、ＴＣＲβ細胞および／またはＴＣＲγ／δ細胞であるＴ細胞に分化するように誘導するステップと、
を含み、
前記Ｄ０培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ２．５培地は、５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ３培地は、５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ４培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ５培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、および２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドを含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ６培地は、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、および１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、
前記Ｄ７培地は、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、および１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地であり、
前記基礎分化培地は、１５％のウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０^－４Ｍのチオグリセロール、２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、０．５ｍＭのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地である、ことを特徴とする請求項１～９のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬生物工程の技術分野に関し、多能性幹細胞及びその分化したＴ細胞と使用に関する。

【背景技術】

【0002】

多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＰＳＣｓ）は、無限増殖能を有し、分化して異なる系の細胞組織を形成し、遺伝子修飾しやすい細胞であり、現在の幹細胞研究のホットスポットである。患者自体に由来する多能性幹細胞を分化させて異なる組織を形成するように誘導することは、倫理的論議を回避することができるだけでなく、更に免疫拒絶のリスクを低減し、再生医学分野の適用のホットスポットである。ＣＡＲ－Ｔは、新興の免疫細胞療法として、特異性が強く、癌細胞の除去効率が高いという特徴を有することで、広く注目されている。現在、ＣＡＲ－Ｔ療法の免疫細胞は、主に患者自体のＴ細胞に由来するが、一部の患者（例えば、乳児、腫瘍後期免疫不全患者、および重度化学療法患者）は有効量のＴ細胞を提供することができず、且つ費用が高く、該療法の適用を大きく制限する。多能性幹細胞により機能性Ｔ細胞を取得することで、上記問題を解決することができる。

【0003】

ヒト多能性幹細胞に由来する生血内皮で転写因子ＥＲＧ、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＬＣＯＲ、ＲＵＮＸ１、およびＳＰＩ１を発現することにより、多系列の造血再構成能力を有する造血幹細胞・プロジェニター（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ、ＨＳＰＣｓ）を取得し、移植後に複数の造血系列細胞（Ｔ細胞を含む）を生じることができるという基礎研究が既にある（Ｒ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ、５４５、４３２～４３８（２０１７））が、上記研究は、７つまでの転写因子を用いて幹細胞誘導を行う必要があり、操作が複雑で、安定性が悪く、効率が低い。

【0004】

更に、内皮細胞で転写因子ＦＯＳＢ、ＧＦＩ１、ＲＵＮＸ１、およびＳＰＩ１を発現することで、一部の系列の造血再構成能力（Ｔ細胞系列造血再構成能力がない）を有するヒト造血多能性プロジェニター（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）および全系列造血再構成能力を有するマウス造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を取得することができるという研究報告がある（Ｖ．Ｍ．Ｓａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５１１、２１３～３１８（２０１４）、Ｒ．Ｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５、４３９～４４５（２０１７））が、上記研究には、内皮細胞を入手しにくく、遺伝子編集が困難で、技術的方法が煩雑であり、Ｔ系列の発生効率が低い等の問題が存在する。そのため、多能性幹細胞を誘導して単一のＴ系列細胞を取得する簡単な方法が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来技術の不足に対し、本発明は、多能性幹細胞及びその分化したＴ細胞と使用を提供し、得られた多能性幹細胞に由来するＴ細胞は、機能が正常であるだけでなく、更に腫瘍形成のリスクがない。

【課題を解決するための手段】

【0006】

第１の態様では、本発明は、Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム共発現を含むベクターを提供する。

【0007】

本発明において、Ｒｕｎｘ１およびＨｏｘａ９のｃＤＮＡ配列を同一のベクターにタンデム発現させ、宿主細胞を感染するために用い、安定して発現するＲｕｎｘ１およびＨｏｘａ９の宿主細胞を取得することができ、操作が簡単で効率が高く、得られた宿主細胞はＴ細胞へ分化する能力を有する。

【0008】

第２の態様では、本発明は、第１の態様に記載のベクターを発現する核酸を提供する。

【0009】

第３の態様では、本発明は、
第１の態様に記載のベクターを含み、
好ましくは、前記宿主細胞は多能性幹細胞である宿主細胞を提供する。

【0010】

第４の態様では、本発明は、
（１）Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム発現ベクターを多能性幹細胞に組込み、耐性スクリーニングを行うステップと、
（２）ステップ（１）に記載の多能性幹細胞を造血幹細胞前駆細胞へ指向性分化するステップと、
（３）ステップ（２）に記載の造血幹細胞前駆細胞とマウス骨髄間質細胞と共培養し、Ｔ系列のプロジェニターを取得するステップと、
（４）ステップ（３）に記載のＴ系列のプロジェニターをＴ細胞に分化するように誘導するステップと、
を含む多能性幹細胞を用いてＴ細胞を指向性分化する方法を提供する。

【0011】

本発明において、Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９とを共発現する多能性幹細胞系を指向性分化することにより得られた造血幹細胞前駆細胞を、ＯＰ９－ＤＬ１細胞系と共培養してＴ系列のプロジェニターを取得し、分化後に機能が正常であるＴ細胞を取得し、腫瘍形成のリスクがない。

【0012】

好ましくは、ステップ（１）に記載のＲｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム発現ベクターを多能性幹細胞のＲｏｓａ２６部位に組込む。

【0013】

好ましくは、ステップ（１）に記載の多能性幹細胞は、遺伝子編集後の誘導性多能性幹細胞および／または胚性多能性幹細胞株である。

【0014】

好ましくは、ステップ（１）に記載の組込みの方法は、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、トランスフェクション、またはウイルス感染のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、相同組換えであることが好ましい。

【0015】

好ましくは、ステップ（１）に記載の耐性スクリーニングはハイグロマイシンＢを採用する。

【0016】

好ましくは、ステップ（２）に記載の指向性分化の方法は、Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、Ｄ３培地、Ｄ４培地、Ｄ５培地、Ｄ６培地、およびＤ７培地を順に用いて多能性幹細胞を培養して前記造血幹細胞前駆細胞を取得することである。

【0017】

好ましくは、前記Ｄ０培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む基礎分化培地であり、前記骨形態形成タンパク質４の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0018】

好ましくは、前記Ｄ２．５培地は、３～８ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）および３～８ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む基礎分化培地であり、前記アクチビンＡの濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬまたは８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記塩基性線維芽細胞増殖因子の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0019】

好ましくは、前記Ｄ３培地は、３～８ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）および３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む基礎分化培地であり、前記アクチビンＡの濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記骨形態形成タンパク質４の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記血管内皮増殖因子の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0020】

好ましくは、前記Ｄ４培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）および３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む基礎分化培地であり、前記骨形態形成タンパク質４の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記血管内皮増殖因子の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0021】

好ましくは、前記Ｄ５培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３（ｍＩＬ３）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６（ｍＩＬ６）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）、および１０～３０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦｌｔ３Ｌ）を含む基礎分化培地であり、前記骨形態形成タンパク質４の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記血管内皮増殖因子の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウスインターロイキン３の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウスインターロイキン６の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウス幹細胞因子の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えヒトトロンボポエチンの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記ｈＦｌｔ３Ｌの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0022】

好ましくは、前記Ｄ６培地は、３～８ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、３～８ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３（ｍＩＬ３）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６（ｍＩＬ６）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬのｈＦｌｔ３Ｌ、および１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含む基礎分化培地であり、前記骨形態形成タンパク質４の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記血管内皮増殖因子の濃度は、例えば、３ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、または８ｎｇ／ｍＬであってもよく、５ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウスインターロイキン３の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウスインターロイキン６の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウス幹細胞因子の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えヒトトロンボポエチンの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記ｈＦｌｔ３Ｌの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記ドキシサイクリンの濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬであってもよく、１μｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0023】

好ましくは、前記Ｄ７培地は、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３（ｍＩＬ３）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６（ｍＩＬ６）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）、１０～３０ｎｇ／ｍＬのｈＦｌｔ３Ｌ、および１～２μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を含む基礎分化培地であり、前記組換えマウスインターロイキン３の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウスインターロイキン６の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えマウス幹細胞因子の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記組換えヒトトロンボポエチンの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記ｈＦｌｔ３Ｌの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、または３０ｎｇ／ｍＬであってもよく、２０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、前記ドキシサイクリンの濃度は、例えば、１μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬであってもよく、１μｇ／ｍＬであることが好ましい。

【0024】

好ましくは、前記基礎分化培地は、１０～２０％のウシ胎仔血清、１８０～２２０μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン（ｉｒｏｎ－ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、４．５×１０^－４Ｍのチオグリセロール、１～３ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ－Ｉの添加剤、および０．４～０．６ｍＭのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地であり、前記ウシ胎仔血清の濃度は、例えば、１０％、１５％、または２０％であってもよく、１５％であることが好ましく、前記鉄飽和トランスフェリンの濃度は、例えば、１８０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、または２２０μｇ／ｍＬであってもよく、２００μｇ／ｍＬであることが好ましく、前記チオグリセロールの濃度は、例えば、４×１０^－４Ｍ、４．５×１０^－４Ｍ、または５×１０^－４Ｍであってもよく、４．５×１０^－４Ｍであることが好ましく、前記ＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ－Ｉの添加剤の濃度は、例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、または３ｍＭであってもよく、２ｍＭであることが好ましく、前記アスコルビン酸の濃度は、例えば、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、または０．６ｍＭであってもよく、０．５ｍＭであることが好ましい。

【0025】

本発明において、発明者は、培地における添加物質を変えることにより、指向性造血分化系を設計して最適化させ、多能性幹細胞を造血させて造血幹細胞前駆細胞へ分化するように誘導し、前記造血幹細胞前駆細胞は、更にマウス骨髄間質細胞と共培養することにより、Ｔ系列のプロジェニターを取得する。

【0026】

好ましくは、ステップ（３）に記載の間質細胞はＯＰ９－ＤＬ１細胞である。

【0027】

好ましくは、ステップ（３）に記載の共培養過程において、ドキシサイクリンを用いて誘導する。

【0028】

好ましくは、ステップ（４）に記載のＴ細胞は、主にＣＤ３^＋Ｔ細胞である。

【0029】

好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＴＣＲβ細胞および／またはＴＣＲγ／δ細胞である。

【0030】

好ましい技術案として、本発明は、
（１）Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのタンデム発現ベクターを遺伝子組換えにより多能性幹細胞のＲｏｓａ２６部位に組込み、ハイグロマイシンＢを用いて耐性スクリーニングを行うステップと、
（２）Ｄ０培地、Ｄ２．５培地、Ｄ３培地、Ｄ４培地、Ｄ５培地、Ｄ６培地、およびＤ７培地を順に用いてステップ（１）に記載の多能性幹細胞を培養し、１１日目に造血幹細胞前駆細胞に指向性分化させるステップと、
（３）ステップ（２）に記載の造血幹細胞前駆細胞とＯＰ９－ＤＬ１細胞とを共培養し、ドキシサイクリンを用いて誘導し、Ｔ系列のプロジェニターを取得するステップと、
（４）ステップ（３）に記載のＴ系列のプロジェニターを、ＴＣＲβ細胞および／またはＴＣＲγ／δ細胞であるＴ細胞に分化するように誘導するステップと、
を含む多能性幹細胞を用いてＴ細胞を指向性分化する方法を提供する。

【0031】

第５の態様では、本発明は、第１の態様に記載の方法で製造されたＴ系列のプロジェニターおよび／またはＴ細胞を提供する。

【0032】

第６の態様では、本発明は、第１の態様に記載のベクター、第３の態様に記載の宿主細胞、第５の態様に記載のＴ系列のプロジェニターまたはＴ細胞のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む医薬組成物を提供する。

【0033】

好ましくは、前記医薬組成物は、医薬的に許容されるベクター、賦形剤、または希釈剤のうちのいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを更に含む。

【0034】

第７の態様では、本発明は、第４の態様に記載の医薬組成物の、免疫応答を強化する医薬の製造における使用であって、Ｔ細胞の免疫応答を強化する医薬の製造における使用であることが好ましい使用を提供する。

【0035】

本発明において、前記医薬組成物は、免疫応答を強化するために使用でき、特に、Ｔ細胞の免疫応答を強化するために使用できる。

【0036】

第８の態様では、本発明は、第４の態様に記載の医薬組成物の、免疫不全を予防および／または治療する医薬の製造における使用、Ｔ細胞免疫不全を予防および／または治療する医薬の製造における使用を提供する。

【0037】

本発明において、前記医薬組成物は、免疫不全を予防および／または治療するために使用でき、特に、Ｔ細胞免疫不全を予防および／または治療するために使用できる。

【0038】

第９の態様では、本発明は、第４の態様に記載の医薬組成物の、Ｔ細胞免疫療法で腫瘍を治療する医薬の製造における使用を提供する。

【0039】

本発明において、前記医薬組成物はＴ細胞免疫療法に使用できる。

【発明の効果】

【0040】

従来技術と比べ、本発明は以下のような有益な効果を有する。
（１）本発明は、外因性Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９との共発現ベクターを多能性幹細胞に導入し、誘導性共発現外因性Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９の多能性幹細胞の構築が成功し、前記多能性幹細胞は、Ｔ細胞へ分化する能力を有し、且つ、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療するおよび腫瘍を治療する医薬の製造に使用できる。
（２）本発明は、指向性分化系および共培養方法を採用し、前記多能性幹細胞をＴ系列のプロジェニターへ指向性分化し、前記Ｔ系列のプロジェニターは、Ｔ細胞へ分化するように誘導され得、且つ、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療するおよび腫瘍を治療する医薬の製造に使用できる。
（３）本発明の方法で得られた多能性幹細胞に由来するＴ細胞は、機能が正常であり、腫瘍形成のリスクがなく、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療するおよび腫瘍を治療する医薬の製造に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１（Ａ）は多能性幹細胞のＲｏｓａ２６部位に部位特異的ノックインした誘導可能な発現システムの模式図であり、前記発現システムはｐ２ａ配列を用いてＲｕｎｘ１とＨｏｘａ９とのｃＤＮＡ配列を直列連結し、ドキシサイクリンで遺伝子発現を誘導する。図１（Ｂ）は、ハイグロマイシンによる耐性スクリーニングにより得られたｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞のライトフィールドチャートである。図１（Ｃ）は、ドキシサイクリンで処理してから２４時間後のＲｕｎｘ１およびＨｏｘａ９の相対発現レベルである。

【図2】図２（Ａ）は、ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞を、造血前駆体、造血幹細胞前駆細胞および血液細胞へ指向性分化するように誘導する胚様体－単層培養系の模式図であり、図２（Ｂ）は、ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞を誘導して指向性分化させて１１日目の細胞形態図であり、図２（Ｃ）は、フローサイトメトリーで分析した指向性分化の１１日目の造血関連細胞の構成および割合である。

【図3】図３（Ａ）は、造血幹細胞前駆細胞のフロー選別策略であり、図３（Ｂ）は、選別された造血幹細胞前駆細胞集団（ＣＤ３１^＋ＣＤ４１^ｌｏｗＣＤ４５^－ｃ－Ｋｉｔ^＋ＣＤ２０１^ｈｉｇｈ）とＯＰ９－ＤＬ１細胞系とを共培養する模式図であり、図３（Ｃ）は、造血幹細胞前駆細胞集団とＯＰ９－ＤＬ１細胞系とを１０日間共培養した後、顕微鏡で観察した玉石状形成領域の数であり、図３（Ｄ）は、造血幹細胞前駆細胞集団とＯＰ９－ＤＬ１細胞系とを１０日間共培養した後、顕微鏡で観察した玉石状形成領域のライトフィールドチャートである。

【図4】図４（Ａ）は、造血幹細胞前駆細胞とＯＰ９－ＤＬ１細胞系とを共培養した後に得られたＴ系列のプロジェニターをＣＤ４５．１^＋ＮＯＤ／ＳＣＩＤ免疫不全のマウスに移植する図であり、図４（Ｂ）は、移植してから４週間後に、多能性幹細胞に由来する血液細胞をフローサイトメトリーで同定する図であり、ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９グループでは造血キメラが検出でき、図４（Ｃ）は、５週間後の犠牲したレシピエントマウスの末梢血、骨髄、脾臓および胸腺における多能性幹細胞に由来する造血細胞の系列分布およびＣＤ３^＋Ｔリンパ球の表現型であり、図４（Ｄ）は、多能性幹細胞に由来する血液細胞ゲノムのＰＣＲおよび配列決定である。

【図5】図５（Ａ）は、４週間後の犠牲したレシピエントマウスの胸腺における多能性幹細胞に由来するＤＮ細胞集団（ＤＮ１／ＤＮ２／ＤＮ３／ＤＮ４）分析であり、図５（Ｂ）は、４週間後の犠牲したレシピエントマウスの末梢血、脾臓およびリンパ節における多能性幹細胞に由来するＣＤ３^＋Ｔ細胞内のＴＣＲ－βおよびＴＣＲ－γ／δ集団の分析であり、図５（Ｃ）は、４週間後の犠牲したレシピエントマウスの混合リンパ球反応実験（ＭＬＲ）であり、ＰＳＣ－Ｔは、Ｒｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９が多能性幹細胞系を誘導して分化させてＴ系列のプロジェニターを取得してＮＯＤ－ＳＣＩＤレシピエントマウスに埋め込んでから６週間後に、脾臓内の磁気ビーズが富化したＣＤ３^＋Ｔ細胞である。

【図6】ＥＬＩＳＡ法で検出したインビトロ刺激によるＴ細胞が分泌した代表的な細胞因子であり、ここで、ＩＬ１０はインターロイキン１０であり、ＩＦＮ－γはγインターフェロンであり、ＩＬ－２はインターロイキン２であり、ＴＮＦ－αは腫瘍壊死因子αである。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本発明で採用する技術的手段およびその効果を更に説明するために、以下、実施例および図面を参照しながら本発明について更に説明する。なお、ここで説明する具体的な実施形態は、本発明を解釈するためのものであり、本発明を限定するものではない。

【0043】

実施例に具体的な技術または条件が明記されていないものは、本分野内の文献に記載の技術または条件、あるいは製品仕様書に従って行う。使用される試薬または機器にメーカーが明記されていないものは、いずれも公式チャネルにより入手可能な通常の製品である。

【実施例1】

【0044】

本実施例は、電気的形質転換法（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と遺伝子組換えとの組み合わせにより、誘導可能な発現配列を多能性幹細胞のＲｏｓａ２６部位に部位特異的ノックインし、図１（Ａ）に示すように、ノックインされた配列はＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９タンデム配列および耐性スクリーニングに用いられるハイグロマイシンＢ耐性の遺伝子配列を含む。相同組換えの多能性幹細胞の取得に成功するために、電気的形質転換してから２０時間後にハイグロマイシンＢ（１５０μｇ／ｍＬ）を含む多能性幹細胞培地を加え、毎日液体を置き換えた。ハイグロマイシンＢを用いて１０日間を選別した後、顕微鏡で個別のクローンをＭＥＦ細胞が予め播種された１２ウェルプレートに採取し、ウェルごとに１つの多能性幹細胞クローンを入れ、ハイグロマイシン無しの培地で培養した。

【0045】

クローン集団がＭＥＦ細胞層に付着すると、毎日液体を置き換え、３日間後に０．２５％のトリプシンでクローン集団を消化し、１２ウェルプレートに継代し、細胞形態は図１（Ｂ）に示すように、クローン集団が対数増殖期にあり、縁部が整然で明らかであり、ＭＥＦ細胞層と明らかな境界があり、分化しなかった。細胞状態および成長密度に基づいて継代、増殖および凍結保存を行った。

【0046】

Ｄｏｘで処理してから２４時間後のｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞の総ｍＲＮＡ（Ｄｏｘが加えられていないグループを対照グループとする）を抽出し、Ｑ－ＰＣＲによりＲｕｎｘ１およびＨｏｘａ９のｍＲＮＡの発現レベルを取得し、図１（Ｃ）は、Ｄｏｘを加えることにより、Ｒｕｎｘ１およびＨｏｘａ９の発現を誘導することができることを示す。

【実施例2】

【0047】

多能性幹細胞の造血分化を誘導するために、図２（Ａ）に示すような指向性造血分化系を用いた。指向性造血分化系における各培地の処方は以下のとおりである。

【0048】

基礎分化培地ＢＤＭ：１５％のウシ胎仔血清、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０^－４Ｍのチオグリセロール、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ－Ｉの添加剤、０．５ｍＭのアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地。
Ｄ０培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４を含む基礎分化培地。
Ｄ２．５培地：５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子を含む基礎分化培地。
Ｄ３培地：５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地。
Ｄ４培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４および５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子を含む基礎分化培地。
Ｄ５培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、および２０ｎｇ／ｍＬのｈＦｌｔ３Ｌを含む基礎分化培地。
Ｄ６培地：５ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４、５ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍＬのｈＦｌｔ３Ｌ、および１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地。
Ｄ７培地：２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン３、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスインターロイキン６、２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトトロンボポエチン、２０ｎｇ／ｍＬのｈＦｌｔ３Ｌおよび１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む基礎分化培地。

【0049】

具体的なステップは以下のとおりである。

【0050】

４０ｍｉｎ前もって６ウェルプレートに濃度が０．１％である１ｍＬのゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を播種し、スタンバイした。０．０５％のトリプシンで多能性幹細胞を単細胞に消化し、遠心後に多能性幹細胞を再懸濁した。０．１％のｇｅｌａｔｉｎを吸い取り、多能性幹細胞懸濁液をｇｅｌａｔｉｎが被覆されたウェルに移し、インキュベーターに４０ｍｉｎ置くことにより、ＭＥＦ細胞を除去した。

【0051】

懸濁細胞を集め、２５０ｇで５ｍｉｎ遠心させ、ＤＰＢＳで１回洗浄した。Ｄ０培地で細胞を再懸濁させて計数し、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整した。５～１０ｍＬの細胞懸濁液を傾斜した１０ｃｍのディッシュに加入し、２０μＬの細胞懸濁液を吸い取り、１５ｃｍのシャーレに入れて胚様体（ＥＢ）を懸濁させ、単一のＥＢは２０μＬ（約２０００個の細胞）である。その後、シャーレを逆さにし、シャーレの底部に１つの１０ｃｍのシャーレの蓋を置き、蓋に５～６ｍＬの細胞培養用水を加えた。３７℃のインキュベーターで２．５日間培養した。

【0052】

パスツールピペットでＥＢを遠心管に収集し、ＤＰＢＳでシャーレの底部を洗浄し、ＥＢが自然沈降した後、注意深く上清を吸い取り、９０ｇの低速で５ｍｉｎ遠心して上清を除去し、ＤＰＢＳを加え一回濯ぎ、再び沈降させ、または遠心して上清を除去した。Ｄ２．５培地でＥＢを再懸濁した後、低密着性の２４ウェルプレートに移し、１２時間培養してＥＢに汚染があるか否かを観察した。

【0053】

ＥＢを１５ｍＬの遠心管に収集し、自然沈降した後、注意深く上清を吸い取り、ＤＰＢＳを加えて一回濯ぎ、４００μＬの０．０５％のトリプシンを加え、２４ウェルの低密着性シャーレに移し、３７℃で３ｍｉｎ消化した後、ＥＢを繰り返して穏やかに叩き、ＥＢが単細胞状態になると、Ｄ３培地を加えて消化を終了させ、３５０ｇで５ｍｉｎ遠心した。Ｄ３培地で生存細胞を再懸濁して計数し、０．１％のｇｅｌａｔｉｎが予め被覆された１２ウェルプレートに接種し、密度を２×１０^５個／ウェルとした。

【0054】

ＤＰＢＳを用いて一回濯ぎ、Ｄ４培地に置き換えて一日間培養した。

【0055】

ＤＰＢＳを用いて一回濯ぎ、Ｄ５培地に置き換えて一日間培養した。

【0056】

ＤＰＢＳを用いて一回濯ぎ、Ｄ６培地に置き換えて一日間培養した。

【0057】

ＤＰＢＳを用いて一回濯ぎ、Ｄ７培地に置き換えて一日間培養した。

【0058】

その後、１日おきに液体を置き換え、用いられる培地はＤ７培地であった。図２（Ｂ）に示すように、１１日目に、ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９分化グループは明らかな造血クラスターが見られた。図２（Ｃ）に示すフローサイトメトリー分析結果により、指向性分化の１１日目の造血関連細胞集団はＣＤ４１^＋造血前駆細胞およびＣＤ４５^＋血液細胞であることが明らかになった。

【実施例3】

【0059】

多能性幹細胞から分化した造血前駆細胞が、胚胎造血幹細胞前駆細胞集団の増殖能力、すなわち、間質細胞において高増殖潜在能力の玉石状形成領域を形成できる能力を有することを検証するために、発明者は、造血幹細胞前駆細胞とマウス骨髄間質細胞とを共培養した。共培養培地は、１５％のＤＦＢＳ、２００μｇ／ｍＬの鉄飽和トランスフェリン、４．５×１０^－４Ｍのチオグリセロール、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ^ＴＭ－Ｉの添加剤、０．５ｍＭのアスコルビン酸、２％のＡＦＴ０２４－ｍＳＣＦ条件性培地、２％のＡＦＴ０２４－ｍＩＬ３条件性培地、２％のＡＦＴ０２４－ｈＦｌｔ３Ｌ条件性培地、および１μｇ／ｍＬのＤｏｘを含むα－ＭＥＭ培地であった。

【0060】

胚様体－単層培養の１１日目に、図３（Ａ）のような選別策略を用いてフローサイトメーターによる造血幹細胞前駆細胞（ＣＤ３１^＋ＣＤ４１^ｌｏｗＣＤ４５^－ｃ－Ｋｉｔ^＋ＣＤ２０１^ｈｉｇｈ）の選別を行った。その後、玉石状領域形成実験（ＣＡＦＣ）で、多能性幹細胞から分化した造血幹細胞前駆細胞が胚胎に由来する造血幹細胞前駆細胞と同じ増殖能力を有するか否かを検出した。図３（Ｂ）に示すように、選別された造血幹細胞前駆細胞集団をＯＰ９－ＤＬ１間質細胞に再播種し、１０日間後に、１００個あたりの造血幹細胞前駆細胞が形成した玉石状形成領域の数を計数した。図３（Ｃ）および図３（Ｄ）の結果により、ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞に由来する造血幹細胞前駆細胞は、強い玉石状領域形成能力を有し、多能性幹細胞に由来する造血幹細胞前駆細胞は、間質細胞ＯＰ９－ＤＬ１において高さが均一で小さくて丸くて明るい血液細胞を形成することが明らかになった。

【実施例4】

【0061】

インビボ微小環境を用いてＴ細胞を取得するために、発明者は更に共培養後に移植する策略を設計し、図４（Ａ）に示すように、造血幹細胞前駆細胞をＯＰ９－ＤＬ１間質細胞においてＤｏｘを加えて１０日間誘導した後、Ｔ系列のプロジェニターを取得した。４日間前もってＯＰ９－ＤＬ１細胞系を蘇生し、細胞成長状態に基づいてタイムリーに継代し、細胞が過剰成長により劣化することを回避した。使用する前の日に継代し、ウェルごとに５万の細胞（１２ウェルプレート）を再播種し、翌日に使用した。多能性幹細胞に由来する造血幹細胞前駆細胞を共培養した後に得られたＴ系列のプロジェニターを、目の静脈を介して６～８週齢のＣＤ４５．１ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植し、４週間後に、フローサイトメトリーを介して末梢血の造血キメラ状況を検出した。

【0062】

図４（Ｂ）により、ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞に由来する造血幹細胞前駆細胞集団を共培養した後に得られたＴ系列のプロジェニターは、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの末梢血に造血キメラを形成することができ、且つＣＤ３^＋Ｔ細胞を主（９７．７％）とし、Ｔリンパ系を効果的に再構成する効果を実現することが明らかになった。

【0063】

ｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞に由来する血液細胞の他の造血、リンパ組織における分布を更に明確にするために、５週間後にマウスを犠牲させた後、フローサイトメトリーによりその末梢血、骨髄、脾臓および胸腺の血液細胞系列を分析した。フローサイトメトリー分析により、図４（Ｃ）に示すように、骨髄、胸腺および脾臓において、多能性幹細胞に由来する血液細胞は同様にＴリンパ系造血を主とすることが分かった。これらのＣＤ３^＋Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋単独陽性細胞を含むとともに、ＣＤ８^＋単独陽性細胞も含み、それと同時に、脾臓、骨髄および胸腺にはいずれも少量のＣＤ４^＋ＣＤ８^＋二重陽性細胞およびＣＤ４^－ＣＤ８^－二重陰性細胞を含む。

【0064】

ゲノムレベルからレシピエントマウスにおけるＣＤ４５．２^＋造血細胞（主にＴ細胞）がｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞に由来することを確認するために、プライマーを設定してＰＣＲ増殖および配列決定を行った。まず、フローソートにより骨髄および脾臓に由来するＣＤ４５．２^＋細胞を選別し、ゲノムを抽出し、遺伝子配列がノックインされた特異性プライマーを用いてＰＣＲ同定を行った。図４（Ｄ）は、これらの細胞ゲノム内にｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９プラスミドに由来する配列があることを示し、ＣＤ４５．２^＋血液細胞（主にＴ細胞）がｉＲｕｎｘ１－ｐ２ａ－Ｈｏｘａ９多能性幹細胞に由来することが証明された。

【実施例5】

【0065】

マウス体内の多能性幹細胞に由来する免疫細胞のタイプを更に同定するために、胸腺ＤＮ細胞集団を分析し、図５（Ａ）から見られるように、レシピエントマウス体内のＴ細胞が正常に発達し、ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３およびＤＮ４細胞集団が検出できた。末梢血、脾臓およびリンパ管における多能性幹細胞に由来するＴ細胞のＴＣＲレシピエントを検出し、図５（Ｂ）に示すように、Ｔ細胞に一定の割合のＴＣＲγ／δ細胞（０．３７－１．７１％）が存在し、ほとんどがＴＣＲβ細胞であった。Ｂａｌｂ／Ｃマウス脾臓細胞を用い、ＣＤ３の磁気ビーズの富化によりレシピエントマウスの脾臓から得られたＴ細胞と混合リンパ球反応させ、それぞれ３日目および６日目に検出を行い、図５（Ｃ）に示すように、多能性幹細胞に由来するＴ細胞は活性化されると増殖することができ、これらのＴ細胞は刺激されると増殖する能力を有することが証明された。

【0066】

ＥＬＩＳＡ技術で培養上清を分析し、図６に示すように、刺激されて増殖した再生Ｔ細胞は大量のインターロイキン１０（ＩＬ１０）、γインターフェロン（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）を分泌することができる。

【0067】

上記をまとめると、本発明は、外因性Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９との共発現ベクターを多能性幹細胞に導入し、誘導性共発現外因性Ｒｕｎｘ１とＨｏｘａ９の多能性幹細胞の構築が成功し、前記多能性幹細胞はＴ系列のプロジェニターへ指向性分化し、且つＴ細胞に発達する。本発明の方法で得られた多能性幹細胞に由来するＴ細胞は、機能が正常であるだけでなく、更に腫瘍形成のリスクがなく、免疫効果を強化し、免疫不全を予防および／または治療するおよび腫瘍を治療する医薬の製造に使用できる。

【0068】

本発明は上記実施例により本発明の詳細な方法を説明したが、本発明は上記詳細な方法に限定するものではなく、すなわち、本発明は上記詳細な方法に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本発明に対するいかなる改良、本発明に使用される原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本発明の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。

【図1(A)】

【図1(B)】

【図1(C)】

【図2(A)】

【図2(B)】

【図2(C)】

【図3(A)】

【図3(B)】

【図3(C)】

【図3(D)】

【図4(A)】

【図4(B)】

【図4(C)】

【図4(D)】

【図5(A)】

【図5(B)】

【図5(C)】

【図6】