(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-01
(45)【発行日】2022-07-11
(54)【発明の名称】抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、その製造方法及び用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220704BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220704BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220704BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220704BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220704BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220704BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220704BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220704BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220704BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220704BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220704BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220704BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
C12P21/08
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 T
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P37/06
A61P31/00
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2019536981
(86)(22)【出願日】2018-01-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-20
(86)【国際出願番号】 CN2018073575
(87)【国際公開番号】W WO2018137576
(87)【国際公開日】2018-08-02
【審査請求日】2019-07-05
(31)【優先権主張番号】201710054783.5
(32)【優先日】2017-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】510277073
【氏名又は名称】三生国健薬業（上海）股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮＳＨＩＮＥ ＧＵＯＪＩＡＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ ＩＣＡＬ（ＳＨＡＮＧＨＡＩ）ＣＯ．，ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110002516
【氏名又は名称】特許業務法人白坂
(72)【発明者】
【氏名】趙▲ジエ▼
(72)【発明者】
【氏名】高宏海
(72)【発明者】
【氏名】郭錦林
(72)【発明者】
【氏名】党尉
(72)【発明者】
【氏名】朱玲巧
(72)【発明者】
【氏名】張成海
(72)【発明者】
【氏名】趙楽
(72)【発明者】
【氏名】陳建鶴
(72)【発明者】
【氏名】黄浩旻
(72)【発明者】
【氏名】朱禎平
【審査官】新留 豊
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２３２６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０１５６８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０１１５８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５３０７５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－３４０７１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０６００８７１４（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１１２９００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０１４６８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０５８１１５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】生物学辞典，第1版，2010年，第600頁
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖相補性決定領域と、軽鎖相補性決定領域とを含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表され、かつ軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で表される
ことを特徴とする、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体。
【請求項2】
前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体において、重鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表され、かつ軽鎖のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表される、請求項１に記載の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体。
【請求項3】
請求項１～２の何れか１項に記載の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
【請求項4】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で表され、かつ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表される、請求項３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項5】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で表され、かつ軽鎖をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表される、請求項３に記載のヌクレオチド分子。
【請求項6】
請求項３～４の何れか１項に記載のヌクレオチド分子を含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項7】
請求項６に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項8】
請求項１～２の何れか１項に記載の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を製造する方法であって、発現条件において、請求項７に記載の宿主細胞を培養して抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を発現させる工程ａと、
前記工程ａで発現させる抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を分離精製する工程ｂと
を含むことを特徴とする、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項9】
請求項１～２の何れか１項に記載の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項10】
腫瘍及び／又は治療感染症を治療するための薬物の製造方法であって、請求項１～２の何れか１項に記載の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体又は請求項９に記載の組成物を用いることを特徴とする腫瘍及び／又は治療感染症を治療するための薬物の製造方法。
【請求項11】
前記腫瘍は、大腸癌であることを特徴とする、請求項１０に記載の腫瘍及び／又は治療感染症を治療するための薬物の製造方法。
【請求項12】
重鎖相補性決定領域と、軽鎖相補性決定領域とを含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表され、かつ軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表される、
ことを特徴とする、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体。
【請求項13】
請求項１２に記載の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
【請求項14】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で表され、かつ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表される、請求項１３に記載のヌクレオチド分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品に関し、具体的には抗ＰＤ－１モノクローナル抗体、その製造方法及び用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトプログラム細胞死受容体－１（以下、「ＰＤ－１」とも称する）は、２８８個のアミノ酸からなるＩ型膜タンパク質であり、免疫チェックポイント（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）のうち主な１つとして知られている（Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，５４：３０７～３１４）。ＰＤ－１は、活性化Ｔリンパ球で発現され、そのリガンドであるプログラム細胞死受容体－リガンド１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ １、以下「ＰＤ－Ｌ１」とも称する）及びプログラム細胞死受容体－リガンド２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ ２、以下「ＰＤ－Ｌ２」とも称する）に結合することでＴリンパ球の活性及び関連体内細胞の免疫反応を抑制することができる。ＰＤ－Ｌ２は、主にマクロファージと樹状細胞で発現され、一方、ＰＤ－Ｌ１は、Ｂリンパ球とＴリンパ球、微小血管上皮細胞などの末梢性細胞、及び肺臓、肝臓、心臓等の組織細胞で広く発現されている。大量の研究により、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用が体内免疫系の均衡維持に必須であると同時に、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞が免疫監視から逃れるための主な機序と原因であることが解明されている。したがって、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル経路に対するガン細胞の負の調節を遮断して免疫系を活性化することは、Ｔ細胞に関連する腫瘍特異的な細胞免疫反応を促進することができ、新たな腫瘍治療法としてガン免疫療法を確立するのに有用であると考えられる。
【0003】
Ｐｄｃｄ１遺伝子によってコードされるＰＤ－１は、ＣＤ２８とＣＴＬＡ－４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーに属するメンバーである。ＰＤ－１がそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合すると、抗原受容体を介したシグナル伝達を阻害することが研究により解明され、また、ラットＰＤ－１の構造及びマウスＰＤ－１とヒトＰＤ－Ｌ１の共結晶構造（Ｚｈａｎｇ、Ｘ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０：３３７～３４７（２００４）； Ｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：３０１１～６（２００８））も既に解明されている。ＰＤ－１及びそれに類似するファミリーメンバーは、Ｉ型の膜貫通糖タンパク質であり、リガンド結合用のＩｇ可変型（Ｖ－型）ドメインとシグナル伝達分子結合用の細胞質尾部を含む。ＰＤ－１細胞質尾部には、チロシン残基に基づくシグナル伝達モチーフであるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ）及びＩＴＳＭ（免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフ）を含む。
【0004】
ＰＤ－１は、腫瘍の免疫逃避機構において重要な役割を果たす。腫瘍免疫療法とは、人体自身の免疫系を利用してガンを抵抗することを意味し、腫瘍治療法としては前例のない革新的なものである。しかしながら、腫瘍微小環境に起因して腫瘍細胞が有効な免疫破壊から免れるため、如何に腫瘍微小環境を打開するかが腫瘍治療にとって重要である。ＰＤ－１の腫瘍微小環境における作用については、現在、ＰＤ－Ｌ１がマウスやヒト腫瘍で発現し（殆どのＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍細胞系ではＩＦＮγによって誘導可能である）、腫瘍の免疫逃避において重要なターゲットであると推定されている（Ｉｗａｉ Ｙ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３～１２２９７（２００２）； Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１～６５０５（２００３）。免疫組織化学法を利用して組織生検を行ったところ、人においてＰＤ－１が多くの原発腫瘍（例えば、腫瘍浸潤性リンパ球）で発現し、及び／又はＰＤ－Ｌ１が腫瘍細胞で発現することが実証されている。これらの組織としては、肺ガン、肝ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、皮膚ガン、結腸ガン、神経膠腫、膀胱ガン、乳癌、腎臓ガン、食道ガン、胃ガン、口腔扁平上皮癌、尿路上皮癌、膵癌及び頭頸部腫瘍などが挙げられる。そこで、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を遮断することは腫瘍特異的なＴ細胞の免疫活性を向上させ、免疫系による腫瘍細胞の排除に有利であるため、ＰＤ－１は、腫瘍免疫治療薬の開発において注目されるターゲットになっている。
【0005】
ところで、従来の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、選択性が弱く、結合性が低いといった欠陥があるため、新型の抗ＰＤ－１のモノクローナル抗体を開発して腫瘍や自己免疫疾患などを治療するための薬品とすることが期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、従来の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体に選択性が弱く、結合性が低いといった欠陥がある課題に鑑みてなされたものであり、新たな抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を提供すると同時に、該モノクローナル抗体の製造方法及び用途を提供することをその目的とする。
【0007】
つまり、本発明の第１の側面においては、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を提供する。
【0008】
本発明の第２の側面においては、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【0009】
本発明の第３の側面においては、前記ヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
【0010】
本発明の第４の側面においては、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0011】
本発明の第５の側面においては、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の製造方法を提供する。
【0012】
本発明の第６の側面においては、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を含む組成物を提供する。
【0013】
本発明の第７の側面においては、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の薬物製造における用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
上記目的を達成すべく、本発明は、以下の技術案で構成される。
【0015】
つまり、本発明は、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を提供し、前記モノクローナル抗体は、
１）重鎖相補性決定領域としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、及び
２）軽鎖相補性決定領域としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む。
１）重鎖相補性決定領域としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、及び
２）軽鎖相補性決定領域としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む。
【0016】
抗体の結合領域は、通常、１つの軽鎖可変領域と１つの重鎖可変領域を含み、各可変領域には何れもＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つのドメインを含む。本発明に係る一本鎖抗体は、通常の一本鎖抗体であり、重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び１５～２０個のアミノ酸残基からなる短いペプチドで構成される。好ましくは、本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表されるアミノ酸配列を有し、その軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表されるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表されるアミノ酸配列を有し、その軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表されるアミノ酸配列を有する。
【0017】
本発明に係るモノクローナル抗体は、当分野で慣用の技術手段を用いて製造することができ、これらの技術手段としては、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、シングルリンパ球遺伝子導入技術などが挙げられるが、ハイブリドーマ技術を用いて野生型やトランスジェニックマウスからモノクローナル抗体を製造することが好ましい。
【0018】
更に、本発明は、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【0019】
そのうち、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で表されるヌクレオチド配列を有し、その軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表されるヌクレオチド配列を有する。
【0020】
好ましくは、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で表されるヌクレオチド配列を有し、その軽鎖をコードするヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表されるヌクレオチド配列を有し、又は、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で表されるヌクレオチド配列を有し、その軽鎖をコードするヌクレオチド分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表されるヌクレオチド配列を有する。
【0021】
本発明に係るヌクレオチド分子は、当分野で慣用の製造方法で製造することができ、これらの製造方法としては、例えば、ＰＣＲ法などの遺伝子工学技術で上記モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を取得し、或いは全長遺伝子を人工合成する方法を利用して上記モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を取得する。
【0022】
当業者であれば、上記モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、例えば、置換、欠損、変更、挿入や増加などを適宜加えることでポリヌクレオチドのホモログを得ることのできることを熟知している。本発明に係るポリヌクレオチドのホモログは、該モノクローナル抗体をコードする遺伝子における１個又は２個以上の塩基を、抗体活性を維持する前提で置換、欠損又は増加することで取得することができる。
【0023】
更に、本発明は、上述のヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
【0024】
そのうち、前記発現ベクターは、当分野で慣用の発現ベクターであり、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、標識遺伝子及び／又は配列などの適切な調節配列、及び他の適切な配列を含んでなる発現ベクターを使用することができる。前記発現ベクターとしては、ウイルスや、ファージ又はファージミドなどのプラスミドであってもよく、より具体的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９」を参照することができ、核酸操作に関連する方法と策略は、Ａｕｓｕｂｅｌら編集の「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版」を参照することができる。
【0025】
本発明に係る発現ベクターとしては、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＤＨＦＲ、ｐＣＧ－５３又はｐＣＨＯ １．０が好ましく、ｐＣＨＯ １．０がより好ましい。
【0026】
更に、本発明は、上述の発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【0027】
本発明に係る宿主細胞は、当分野で慣用の各種の宿主細胞を使用することができ、上記組換え発現ベクターが安定に自己複製し、且つ持ち込まれたヌクレオチドが効率よく発現可能である限り特に制限がない。そのうち、前記宿主細胞は、原核発現細胞や真核発現細胞であってもよく、前記発現ベクターとしては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＴＧ１が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（一本鎖抗体又はＦａｂ抗体発現用）又はＣＨＯ－Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体発現用）がより好ましい。本発明において、上記発現ベクターを宿主細胞に導入することで組換え発現形質転換体を得ることができる。そのうち、上述の形質転換では当分野で慣用の形質転換法を利用することができるが、化学試薬による形質転換法、ヒートショック法又はエレクトロポレーション法がより好ましい。
【0028】
更に、本発明は、上記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の製造方法を提供し、該製造方法は、発現条件において、本発明に係る宿主細胞を培養することで抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を発現させる工程ａと、前記工程ａで得られる抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を分離精製する工程ｂとを含む。
【0029】
本発明において、宿主細胞の培養方法及び前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の分離精製方法は、何れも当分野で慣用の方法であり、具体的な操作は、細胞培養やモノクローナル抗体の分離精製に関連する技術マニュアルを参考して遂行することができる。本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の製造方法は、発現条件において上記宿主細胞を培養することで抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を発現させる工程と、前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を分離精製する工程とを含む。上記方法を利用することで組換えタンパク質をほぼ均一な物質に精製することができ、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動でシングルバンドとすることができる。
【0030】
本発明において、アフィニティークロマトグラフィーを利用して抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を分離精製することができ、この場合、アフィニティーカラムの特性に基づき、例えば、高塩濃度緩衝液、ｐＨ変更などといった通常の方法を利用してアフィニティーカラムに吸着するモノクローナル抗体を溶出することができる。本発明者は、得られた抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体に対して評価を行ったところ、該モノクローナル抗体が比較的高い親合力でヒトＰＤ－１に効率よく結合することを確認した。
【0031】
更に、本発明は、上記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなる組成物を提供する。
【0032】
本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体と、薬学的に許容可能な担体とを組み合わせて医薬組成物とすることで安定な治療効果を奏することができ、これらの製剤によって本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体のアミノ酸コア配列の構造完全性が確保されると同時に、タンパク質の各官能基が分解する（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）ことから免れるようにすることができる。液体製剤は、通常、２℃～８℃の条件で少なくとも１年以上安定して保存することができ、凍結乾燥製剤は、３０℃で少なくとも６ヶ月以上安定して保存することができる。前記抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体製剤としては、例えば、製薬分野で慣用の懸濁剤、注射剤、凍結乾燥剤などの形態であってもよいが、注射剤、凍結乾燥剤がより好ましい。
【0033】
本発明において、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の注射剤又は凍結乾燥剤に添加する薬学的に許容可能な担体としては、界面活性剤、溶液安定剤、等張化剤及び緩衝液のうち１種又は２種以上を使用することができ、これらについて特に制限がない。そのうち、界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０又はＴｗｅｅｎ－８０）、ポロキサマー（例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ－１８８）、Ｔｒｉｔｏｎなどの非イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウムや、テトラデシル、リノレイル又はオクタデシルサルコシン、プルロニックス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭなどが挙げられるが、これらの界面活性剤については特に制限がなく、その添加量は、抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の粒子化傾向を最小限に抑える程度である。溶液安定剤としては、例えば、還元糖及び非還元糖などの糖類、グルタミン酸ナトリウムやヒスチジンなどのアミノ酸類、三価アルコール、高級糖アルコール、プロパンジオール、ポリエチレングリコールなどのアルコール類のうち１種又は２種以上を併用することができるが、これらの溶液安定剤については特に制限がない。溶液安定剤の添加量は、最後に得られた製剤が一定期間内において安定な状態を保持できると当業者が認める程度である。等張化剤としては、塩化ナトリウム、マンニトールのうち１種又は２種以上を併用することができ、緩衝液としては、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液のうち１種又は２種以上を併用することができるが、これら等張化剤や緩衝液については特に制限がない。
【0034】
更に、本発明は、本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体又はその組成物の、薬物製造における用途を提供する。
【0035】
本発明に係る薬物は、腫瘍、自己免疫疾患、感染症、移植拒否反応を治療するための薬物であり、腫瘍、自己免疫疾患の治療薬であることが好ましく、腫瘍治療薬であることがより好ましい。本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を単独使用してもよいが、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体や他の抗腫瘍薬と併用してもよい。
【0036】
そのうち、前記抗腫瘍薬の適用対象として、例えば、肺ガン、肝ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、皮膚ガン、結腸ガン、神経膠腫、膀胱ガン、乳癌、腎臓ガン、食道ガン、胃ガン、口腔扁平上皮癌、尿路上皮癌、膵癌及び／又は頭頸部腫瘍などが挙げられ、大腸癌を適用対象とすることが特に好ましい。
【0037】
本発明で言う抗腫瘍薬とは、腫瘍に対して抑制及び／又は治療効果を示す薬物を意味し、腫瘍関連症状の進展遅延及び／又は重篤度の低下に繋がる薬物や、腫瘍関連症状の軽減と他の副症状防止に繋がる薬物、並びに腫瘍転移を低減又は防止する薬物などを含む。
【0038】
人を含む動物を適用対象として本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体及びその組成物を投与する際、投与量は、患者の年齢や体重、疾患特性や重篤さ、及び投与ルートに基づいて適宜決め、動物実験結果と実際状況に合わせて総投与量を一定範囲内に調整することができる。例えば、静脈注射の場合、投与量は１～１８００ｍｇ／日である。
【0039】
当分野の周知常識から逸脱しない前提で上述の各条件を任意に組み合わせることにより、本発明の各好適な実施形態を得ることができる。
【発明の効果】
【0040】
本発明に係る抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体は、優れた生物活性を示し、ヒトＰＤ－１タンパク質受容体の細胞外領域に効果的に結合することができ、タンパク質レベルと細胞レベルでＰＤ－１タンパク質をブローキングしてＰＤ－１タンパク質とリガンドＰＤ－Ｌ１の結合を阻害することができる。また、該モノクローナル抗体を単独使用又は他の抗腫瘍薬と併用することで腫瘍免疫治療、ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍患者の診断とスクリーンに用いることができ、腫瘍、感染症、自己免疫疾患及び免疫拒否反応などを治療対象とする薬品の製造に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対するＰＤ－１抗体の促進効果を示す図である。
【図2】ＭＬＲのＩＦＮ－γ分泌に対するＰＤ－１抗体の促進効果を示す図である。
【図3】ＭＬＲの細胞増殖に対するＰＤ－１抗体の促進効果を示す図である。
【図4】ＰＤ－１ファミリーメンバーに対するｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの選択結果を示す図である。
【図5】マウスＭＣ３８腫瘍移植モデルに対するｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0042】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されないことに留意されたい。以下の実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、何れも通常の方法や条件で行われ、又は製品マニュアルに従って行われる。実施例に記載の室温とは１０℃～３０℃の範囲であり、当分野で慣用の室温である。また、本発明で使用する試薬と原料は、何れも市販のものである。
【0043】
以下、実施例で使用する実験材料の由来と実験試薬の調製方法を具体的に説明する。
【0044】
実験材料
ヒト全血は、上海市長海病院より入手し、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心法を利用してヒト全血から分離した。人ＣＤ１４＋単核細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製の磁気細胞ソーティングシステムで分離し、分離された細胞は、ＡＩＭ－Ｖ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで通常のとおりにして培養を行った。
ヒト全血は、上海市長海病院より入手し、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心法を利用してヒト全血から分離した。人ＣＤ１４＋単核細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製の磁気細胞ソーティングシステムで分離し、分離された細胞は、ＡＩＭ－Ｖ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで通常のとおりにして培養を行った。
【0045】
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７は、ｓｉｇｍａ社製であり、ＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ＯｃｔｏＭＡＣＳ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｋｉｔ細胞ソーティングセット及びＭＳ ＭＡＣＳ分離カラムは、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ社製であった。注射用組換えヒト顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）は、廈門市特宝バイオテック社製であり、１００μｇ／ｍｌの母液に調製した後に分注して－８０℃の冷蔵庫に保存した。組換えヒトＩＬ－４は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製であり、１００μｇ／ｍｌの母液に調製した後に分注して－８０℃の冷蔵庫に保存した。ＡＩＭ－Ｖは、Ｇｉｂｃｏ社製であった。ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、抗人ＩＬ－２抗体、ビオチン化抗ヒトＩＬ－２抗体、抗ヒトＩＦＮ－ｇａｍｍａ抗体、ビオチン化抗ヒトＩＦＮ－ｇａｍｍａ抗体及びヒト由来ＩＦＮ－ｇａｍｍａ標準品は、何れもＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製であった。ヒト由来ＩＬ－２標準品は、北京双鷺製薬会社製であり、注射用クラスの製品を高濃度母液に調製した後に分注して－８０℃の冷蔵庫に保存した。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光法細胞活性検出キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ社製であった。
【0046】
試薬
ＥＬＩＳＡコーティング液は、炭酸ナトリウム１．５９ｇ、炭酸水素ナトリウム２．９３ｇをｐＨ７．０の純水で１０００ｍｌとなるように調製した。ＰＢＳＴは、リン酸二水素カリウム０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物２．９ｇ、塩化ナトリウム８．０ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ－２０ １ｍｌをｐＨ７．０の純水で１０００ｍｌとなるように調製した。ＥＬＩＳＡ発色剤Ａは、酢酸ナトリウム１３．６ｇ、クエン酸１．６ｇ及び３０％の過酸化水素水０．３ｍｌをｐＨ７．０の純水で５００ｍｌとなるように調製した。ＥＬＩＳＡ発色剤Ｂは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．２ｇ、クエン酸０．９５ｇ、グリセリン５０ｍｌ、及びＴＭＢ０．１５ｇを３ｍｌのＤＭＳＯ溶かしたものをｐＨ７．０の純水で５００ｍｌとなるように調製した。ＥＬＩＳＡ停止剤は、９８％の濃硫酸１１１ｍｌをｐＨ７．０の純水で１０００ｍｌとなるように調製した。
ＥＬＩＳＡコーティング液は、炭酸ナトリウム１．５９ｇ、炭酸水素ナトリウム２．９３ｇをｐＨ７．０の純水で１０００ｍｌとなるように調製した。ＰＢＳＴは、リン酸二水素カリウム０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム・１２水和物２．９ｇ、塩化ナトリウム８．０ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ－２０ １ｍｌをｐＨ７．０の純水で１０００ｍｌとなるように調製した。ＥＬＩＳＡ発色剤Ａは、酢酸ナトリウム１３．６ｇ、クエン酸１．６ｇ及び３０％の過酸化水素水０．３ｍｌをｐＨ７．０の純水で５００ｍｌとなるように調製した。ＥＬＩＳＡ発色剤Ｂは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．２ｇ、クエン酸０．９５ｇ、グリセリン５０ｍｌ、及びＴＭＢ０．１５ｇを３ｍｌのＤＭＳＯ溶かしたものをｐＨ７．０の純水で５００ｍｌとなるように調製した。ＥＬＩＳＡ停止剤は、９８％の濃硫酸１１１ｍｌをｐＨ７．０の純水で１０００ｍｌとなるように調製した。
【0047】
実施例１：ヒトＰＤ－１及びそのリガンドＰＤ－Ｌ１の製造
ヒトＰＤ－１のｃＤＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入した（カタログ番号：ＳＣ１１７０１１）。プライマーを設計した後、ＰＤ－１遺伝子のｃＤＮＡをテンプレートとして細胞外コーディング領域を増幅し、ヒトＩｇＧ１遺伝子のｃＤＮＡをテンプレートとしてＦｃコーディング領域を増幅した。上記増幅で得られたＰＣＲ断片を回収し、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを利用して上記断片を１つの組換え断片に繋いた。プライマー設計時に、５’末端にシグナルペプチド（ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ）のコーディング領域を導入し、更に、両端に予定の制限酵素認識サイトを導入した。そして、Ａｖｒ ＩＩとＰａｃ Ｉを用いてｐＣＨＯ１．０ベクター及び上記組換えＰＣＲ断片を消化し、消化産物を精製した後にライゲーションしてＴＯＰ１０コンピテント細胞に導入し、ＬＢ（Ａｍｐ）平板培地で塗布して一晩培養した。細菌コロニーをピックアップし、拡大培養してプラスミドを抽出し、Ａｖｒ ＩＩとＰａｃ Ｉでプラスミドを消化して遺伝子断片の挿入があるか否かを確認した。そして、陽性プラスミドについて配列測定を行い、配列が完全に正しいクローンを選んでＣＨＯ細胞に導入した。ＰＤ－１リガンドであるＰＤ－Ｌ１のｃＤＮＡは、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社より購入し、カタログ番号がＨＧ１００８４－Ｍであった。同様に、上記方法を利用してＰＤ－Ｌ１細胞外領域とヒト抗体Ｆｃ領域との融合遺伝子発現ベクターを構築した。
ヒトＰＤ－１のｃＤＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入した（カタログ番号：ＳＣ１１７０１１）。プライマーを設計した後、ＰＤ－１遺伝子のｃＤＮＡをテンプレートとして細胞外コーディング領域を増幅し、ヒトＩｇＧ１遺伝子のｃＤＮＡをテンプレートとしてＦｃコーディング領域を増幅した。上記増幅で得られたＰＣＲ断片を回収し、Ｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを利用して上記断片を１つの組換え断片に繋いた。プライマー設計時に、５’末端にシグナルペプチド（ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ）のコーディング領域を導入し、更に、両端に予定の制限酵素認識サイトを導入した。そして、Ａｖｒ ＩＩとＰａｃ Ｉを用いてｐＣＨＯ１．０ベクター及び上記組換えＰＣＲ断片を消化し、消化産物を精製した後にライゲーションしてＴＯＰ１０コンピテント細胞に導入し、ＬＢ（Ａｍｐ）平板培地で塗布して一晩培養した。細菌コロニーをピックアップし、拡大培養してプラスミドを抽出し、Ａｖｒ ＩＩとＰａｃ Ｉでプラスミドを消化して遺伝子断片の挿入があるか否かを確認した。そして、陽性プラスミドについて配列測定を行い、配列が完全に正しいクローンを選んでＣＨＯ細胞に導入した。ＰＤ－１リガンドであるＰＤ－Ｌ１のｃＤＮＡは、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社より購入し、カタログ番号がＨＧ１００８４－Ｍであった。同様に、上記方法を利用してＰＤ－Ｌ１細胞外領域とヒト抗体Ｆｃ領域との融合遺伝子発現ベクターを構築した。
【0048】
リポソーム法を利用して上記ｐＣＨＯ １．０（ヒトＰＤ－１－ｈＦｃとＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃ）ベクターをそれぞれＣＨＯ－Ｓ細胞系（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に導入し、６ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２日間培養した後、ピューロマイシン（Ｇｅｎｅ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ社製）とアミノプテリン（Ｓｉｇｍａ社製）で陽性クローン細胞をスクリーニングした。陽性クローン細胞を取って振とうフラスコに接種し、各フラスコが総量２００ｍｌ、密度３×１０５個／ｍｌとなるようにし、６ｍＭのグルタミン及び体積比で１：１００の抗凝集剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地で１２日間培養した後、上清液を集めてＰｒｏｔｅｉｎ ＡアフィニティーカラムでＰＤ－１－ｈＦｃ抗原とＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃを精製した。タンパク質の定量は、ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＢＣＡ）法を用いて行い、精製済みのタンパク質を次のマウス免疫と解析評価に用いた。
【0049】
実施例２：ヒトＰＤ－１－ｈＦｃ抗原によるマウス免疫、及びハイブリドーマの作製とスクリーニング
実施例１で得られたヒトＰＤ－１－ｈＦｃ抗原を、生理食塩水で濃度が５０μｇ／７５μｌとなるように希釈し、同量のフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社製）と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化した後、４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック会社より購入、動物製造許可証：ＳＣＸＫ（滬）２０１３－００１８）に皮下経由で多箇所に注射した。３週後、ＰＤ－１－ｈＦｃ抗原を生理食塩水で濃度が５０μｇ／７５μｌとなるように希釈し、同量のフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社製）と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化した後、マウスに皮下経由で多箇所に注射することで免疫を行い、２週後には再び同じ免疫を繰り返した。３回の免疫が終わってから７日目にマウスから血液を１滴採取し、血清を分離してＥＬＩＳＡで血清抗体価を測定した。
実施例１で得られたヒトＰＤ－１－ｈＦｃ抗原を、生理食塩水で濃度が５０μｇ／７５μｌとなるように希釈し、同量のフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社製）と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化した後、４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック会社より購入、動物製造許可証：ＳＣＸＫ（滬）２０１３－００１８）に皮下経由で多箇所に注射した。３週後、ＰＤ－１－ｈＦｃ抗原を生理食塩水で濃度が５０μｇ／７５μｌとなるように希釈し、同量のフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ社製）と混ぜ合わせて超音波で完全に乳化した後、マウスに皮下経由で多箇所に注射することで免疫を行い、２週後には再び同じ免疫を繰り返した。３回の免疫が終わってから７日目にマウスから血液を１滴採取し、血清を分離してＥＬＩＳＡで血清抗体価を測定した。
【0050】
抗体価は、ＥＬＩＳＡ法を利用して以下のように行われた。ＥＬＩＳＡプレートをヒトＰＤ－１－ｈＦｃ抗原でコーティング濃度が２．５μｇ／ｍｌ、各ウェル当たり１００μｌとなるようにして４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレート２回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェル当たりに１％のＢＳＡを含むコーティング緩衝液を２００μｌ加えてブローキングし、常温で４時間ブローキングした後に叩いて液体を完全に除き、次に備えて－２０℃の冷蔵庫に保存した。測定時には、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに濃度が異なるマウス血清を１００μｌずつ加え、各濃度に平行して２つのウェルを設け、室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。ＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）をＰＢＳＴで１：１００００倍希釈し、希釈液を１００μｌ加えて室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに発色液を（使用に先立ってＥＬＩＳＡ発色剤Ａと発色剤Ｂを１：１の体積比で混ぜ合わせる）１００μｌを加えて発色させ、そして各ウェルに２ＭのＨ２ＳＯ４停止剤を１００μｌ加えて反応を停止させた。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて波長４５０ｎｍで各ウェルのＯＤ値を測定し、血清抗体価が１０００００を超えるマウスに対して、採血後の１週間内にラット１匹当たりに抗原タンパク質１０μｇ／生理食塩水１００μｌ、尾静脈経由で再び強化免疫を行った。
【0051】
血清抗体価が１０００００を超えるマウスは、強化免疫を行ってから３日目に脾細胞を取って融合させた。生長状態が良好であるハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型培養物保存委員会細胞バンクより入手）を３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで培養し、融合に先立って１日前に培養液を１回新たに入れ替えた。融合及びスクリーニングは、次のように行われた。マウス脾臓を採取し、研磨して脾臓からＢリンパ球を分離し、洗浄した後に細胞数を計測した。脾細胞とｓｐ２／０細胞が１０：１の比例となるように２種類の細胞を混合し、１５００ｒｐｍ、７分間遠心し、上清液を捨てて１分間以内にＰＥＧ－１４５０（Ｓｉｇｍａ社製）を１ｍｌ加えて９０秒間軽く振り回し、２．５分間以内に無血清ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を５ｍｌ加え、そして一気に無血清培地を５ｍｌ加えて反応を停止させた。５分間静置し、１２８０ｒｐｍ、８分間遠心し、９６ウェルプレート１枚当たりｓｐ２／０細胞２００万個、各ウェル当たり２００μｌを均一に接種した。まず、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｈ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ、Ａ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、Ｔ）を含むＨＡＴ培地でスクリーニングを行い、３～４日ごとに培地を半分新たに入れ替えた（旧培地を半分吸取り、同量の新しいＨＡＴ培地を入れる）。１０日後、９６ウェルプレートの底部を１０％埋めるまでハイブリドーマ細胞が増殖すると、上清液を取ってＰＤ－１－ｈＦｃ抗原でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて測定した。ＥＬＩＳＡ測定は、上述の通りにして行い、陽性ハイブリドーマをピックアップし、２４ウェルプレートに移して拡大培養し、限界希釈法を利用してサブクローニングを行った。標的抗体を安定に発現するハイブリドーマ細胞株を取得し、抗体ライブラリーを構築した。
【0052】
実施例３：ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用に対するラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の阻害効果
実施例２で得られた安定型モノクローナル細胞株をＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で７日間培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティーカラム（ＧＥ社製）を用いて培養上清液からラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を精製した。精製済みの抗体に対して濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ法でＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用に対するラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の阻害効果を検討した。
実施例２で得られた安定型モノクローナル細胞株をＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で７日間培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティーカラム（ＧＥ社製）を用いて培養上清液からラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を精製した。精製済みの抗体に対して濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ法でＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用に対するラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の阻害効果を検討した。
【0053】
ヒトＰＤ－１－ｈＦｃ抗原を用い、コーティング濃度２．５μｇ／ｍｌ、各ウェル当たり１００μｌ、４℃で一晩コーティングすることでＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。プレートをＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ－２０を０．５％含むＰＢＳ）で２回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェル当たりにＢＳＡを１％含むコーティング緩衝液を２００μｌ加えてブローキングし、常温で４時間ブローキングした後に軽く叩いて液体を完全に除き、次に備えて－２０℃の冷蔵庫に保存した。上記ＰＤ－１－ｈＦｃをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに、適宜濃度のビオチン化ＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃ（実施例１で調製したＰＤ－Ｌ１－ｈＦｃをＥＺ－ＬｉｎｋＴＭ ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎでビオチン化し、ビオチン化操作は、メーカー提供のマニュアルに従う）と、ラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体を十分な量にして同時に加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄し、適宜希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰを各ウェル１００μｌずつ加えた後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに発色液を１００μｌ加え、更に２ＭのＨ２ＳＯ４停止剤を１００μｌ加えて反応を停止させた。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、波長４５０ｎｍで各ウェルＯＤ値を測定した。
【0054】
実施例４：混合リンパ球反応（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）に対するラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の促進活性
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いてヒト血液から末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離し、そして付着法を利用してＰＢＭＣにおける単核細胞サブセットを分離し、ＩＬ－４とＧＭ－ＣＳＦを併用することで単核細胞から誘導樹状細胞へ分化誘導した。７日後、上記誘導樹状細胞を消化して集めた。別のトナーの血液から上記と同様にしてＰＢＭＣを分離し、そこからＭＡＣＳマグネットとＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉバイオテック社製）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。誘導樹状細胞（１０４個／ウェル）と分離されたＣＤ４陽性Ｔ細胞（１０５個／ウェル）とを比例に従って均一に混ぜ合わせた後、各ウェル当たり１５０μｌずつ９６ウェルプレートに接種した。数時間後、上記９６ウェルプレートにＡＩＭ－Ｖ培地で希釈したラット由来抗ヒトＰＤ－１抗体を５０μｌ加え、同時に、市販の抗体であるＯｐｄｉｖｏとＫｅｙｔｒｕｄａを陽性対照物とし、ＰＤ－１に結合しない無関連の抗体を陰性対照物とした。９６ウェルプレートを３７℃、４日間インキュベートし、標準操作法に従ってＩＬ－２とＩＦＮ－ｇａｍｍａの分泌、及びリンパ球の増殖状況を確認した。ＩＬ－２とＩＦＮ－ｇａｍｍａの分泌は、標準的な二重抗体サンドイッチ法（測定用抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入）を利用して測定し、リンパ球の増殖は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）法（測定関連試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を利用して測定した。陽性対照抗体であるＯｐｄｉｖｏは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社製であり（ＬＯＴ番号が４Ｍ５９２９１であり、ＥＸＰがＳＥＰ２０１６である）、陽性対照抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａは、Ｍｅｒｋ社製であった（ＬＯＴ番号とＥＸＰが、Ｋ０１３８３５／０７０Ｃ１２０１５である）。本実施例で使用する培地は、ＡＩＭ－Ｖ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）であった。データ読み取りは、多機能プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いてデータを解析してＥＣ５０を算出した。上記精製済のラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体に対してＭＬＲ評価を行い、ＭＬＲ強度の増強効果が特に著しい抗体を選んで次の実験に用いた。
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅを用いてヒト血液から末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）を分離し、そして付着法を利用してＰＢＭＣにおける単核細胞サブセットを分離し、ＩＬ－４とＧＭ－ＣＳＦを併用することで単核細胞から誘導樹状細胞へ分化誘導した。７日後、上記誘導樹状細胞を消化して集めた。別のトナーの血液から上記と同様にしてＰＢＭＣを分離し、そこからＭＡＣＳマグネットとＣＤ４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉバイオテック社製）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。誘導樹状細胞（１０４個／ウェル）と分離されたＣＤ４陽性Ｔ細胞（１０５個／ウェル）とを比例に従って均一に混ぜ合わせた後、各ウェル当たり１５０μｌずつ９６ウェルプレートに接種した。数時間後、上記９６ウェルプレートにＡＩＭ－Ｖ培地で希釈したラット由来抗ヒトＰＤ－１抗体を５０μｌ加え、同時に、市販の抗体であるＯｐｄｉｖｏとＫｅｙｔｒｕｄａを陽性対照物とし、ＰＤ－１に結合しない無関連の抗体を陰性対照物とした。９６ウェルプレートを３７℃、４日間インキュベートし、標準操作法に従ってＩＬ－２とＩＦＮ－ｇａｍｍａの分泌、及びリンパ球の増殖状況を確認した。ＩＬ－２とＩＦＮ－ｇａｍｍａの分泌は、標準的な二重抗体サンドイッチ法（測定用抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入）を利用して測定し、リンパ球の増殖は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）法（測定関連試薬は、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入）を利用して測定した。陽性対照抗体であるＯｐｄｉｖｏは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社製であり（ＬＯＴ番号が４Ｍ５９２９１であり、ＥＸＰがＳＥＰ２０１６である）、陽性対照抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａは、Ｍｅｒｋ社製であった（ＬＯＴ番号とＥＸＰが、Ｋ０１３８３５／０７０Ｃ１２０１５である）。本実施例で使用する培地は、ＡＩＭ－Ｖ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）であった。データ読み取りは、多機能プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いてデータを解析してＥＣ５０を算出した。上記精製済のラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体に対してＭＬＲ評価を行い、ＭＬＲ強度の増強効果が特に著しい抗体を選んで次の実験に用いた。
【0055】
実施例５：ラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体のヌクレオチド配列とアミノ酸配列の測定
実施例３及び実施例４の測定結果に基づき、番号が１－１５及び１－２５であるクローン（ｍＡｂ１－１５及びｍＡｂ１－２５）を選んでリード抗体とした。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でクローン１－１５及びクローン１－２５に対応するハイブリドーマのモノクローナル細胞株からトータルＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、文献に記載されているプライマーペア（Ｒｏｌａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＳｔｅｆａｎ Ｄｕｅｂｅｌ編集の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、第１版、プライマーペアの配列は、第３２３頁に記載されている）を用い、ＰＣＲ法によりラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物をｐＭＤ１８－Ｔベクターに導入して可変領域の遺伝子配列を測定した。
実施例３及び実施例４の測定結果に基づき、番号が１－１５及び１－２５であるクローン（ｍＡｂ１－１５及びｍＡｂ１－２５）を選んでリード抗体とした。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でクローン１－１５及びクローン１－２５に対応するハイブリドーマのモノクローナル細胞株からトータルＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、文献に記載されているプライマーペア（Ｒｏｌａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＳｔｅｆａｎ Ｄｕｅｂｅｌ編集の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、第１版、プライマーペアの配列は、第３２３頁に記載されている）を用い、ＰＣＲ法によりラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅し、ＰＣＲ産物をｐＭＤ１８－Ｔベクターに導入して可変領域の遺伝子配列を測定した。
【0056】
番号が１－１５であるラット由来抗体（ｍＡｂ１－１５）は、重鎖可変領域の遺伝子配列全長が３５４ｂｐであり、１１８個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表され、軽鎖可変領域の遺伝子配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６で表される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６
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【0057】
番号が１－２５であるラット由来抗体（ｍＡｂ１－２５）は、重鎖可変領域の遺伝子配列全長が３５１ｂｐであり、１１７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８で表され、軽鎖可変領域の遺伝子配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０で表される。ＩｇＢＬＡＳＴにおいてアミノ酸配列を対比した結果、両者が何れもマウスＩｇＧ可変領域遺伝子の特徴を示すことを確認できた。ＩｇＢＬＡＳＴにおいてアミノ酸配列を対比した結果、番号が１－１５及び１－２５である抗体は、軽鎖及び重鎖が何れもマウスＩｇＧ可変領域遺伝子の特徴を示すことを確認できた。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０
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【0058】
実施例６：ラット由来抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体のヒト化
実施例５における重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に従って抗体１－１５及び抗体１－２５（ｍＡｂ１－１５及びｍＡｂ１－２５）の３つの抗原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）及び４つのフレーム領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）を確定した。
実施例５における重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に従って抗体１－１５及び抗体１－２５（ｍＡｂ１－１５及びｍＡｂ１－２５）の３つの抗原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）及び４つのフレーム領域（ｆｒａｍｅ ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）を確定した。
【0059】
そのうち、クローン１－１５の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、それぞれＨ－ＣＤＲ１：ＳＹＤＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、Ｈ－ＣＤＲ２：ＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）及びＨ－ＣＤＲ３：ＲＹＤＶＤＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、それぞれＬ－ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）、Ｌ－ＣＤＲ２：ＹＡＳＱＳＩＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）及びＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＳＮＳＷＰＬＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）であった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＳＹＤＭＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＲＹＤＶＤＷＦＡＹ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ＹＡＳＱＳＩＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８
ＱＱＳＮＳＷＰＬＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
ＳＹＤＭＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４
ＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５
ＲＹＤＶＤＷＦＡＹ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６
ＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７
ＹＡＳＱＳＩＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８
ＱＱＳＮＳＷＰＬＴ
【0060】
また、クローン１－２５の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、それぞれＨ－ＣＤＲ１：ＳＹＤＭＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｈ－ＣＤＲ２：ＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）及びＨ－ＣＤＲ３：ＰＹＧＧＹＦＤＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、それぞれＬ－ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｌ－ＣＤＲ２：ＹＡＳＱＳＩＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）及びＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＳＮＳＷＰＨＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）であった。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
ＳＹＤＭＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
ＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
ＰＹＧＧＹＦＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
ＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
ＹＡＳＱＳＩＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
ＱＱＳＮＳＷＰＨＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
ＳＹＤＭＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
ＴＩＳＧＧＧＲＹＴＹＹＰＤＴＶＫＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
ＰＹＧＧＹＦＤＶ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４
ＲＡＳＱＳＩＳＮＦＬＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５
ＹＡＳＱＳＩＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６
ＱＱＳＮＳＷＰＨＴ
【0061】
番号が１－１５である抗体については、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴを利用してヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ３－７＊０３を選んで重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、ラット由来抗体１－１５の重鎖ＣＤＲを該テンプレートに移植して重鎖のＣＤＲ移植抗体を形成した。同様に、ヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ３－１１＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、ラット由来抗体１－１５の軽鎖ＣＤＲを該テンプレートに移植して軽鎖のＣＤＲ移植抗体を形成した。更に、フレーム領域における一部のアミノ酸サイトに復帰変異を導入し、ここで言う復帰変異とは、ヒト由来フレーム領域の一部のアミノ酸残基をラット由来フレーム領域の同一位置のアミノ酸残基に置き換えることを意味する。復帰変異を導入するとき、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。重鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第４４位ＧをＲ、第９４位ＲをＮに変更したほうが好ましく、軽鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第４９位ＹをＫ、第８７位ＹをＦに変更したほうが好ましい。上記可変領域遺伝子配列は、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社がＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用好みを参考にしてコドンを最適化して合成したものであった。
【0062】
得られたヒト化抗体１－１５（ｍＡｂ１－１５－ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）は、重鎖可変領域遺伝子の配列全長が３５４ｂｐであり、１１８個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９で表され、重鎖全長配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表される。また、ヒト化抗体１－１５の軽鎖可変領域遺伝子の配列全長が３２１ｂｐ、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で表され、軽鎖全長配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９
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【0063】
番号が１－２５である抗体については、ＮＣＢＩ ＩｇＢＬＡＳＴにおいてヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ３－７＊０３を選んで重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、ラット由来抗体１－２５の重鎖ＣＤＲを該テンプレートに移植し、重鎖ＣＤＲ移植抗体を形成した。また、上記と同様にヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ３－１１＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、ラット由来抗体１－２５の軽鎖ＣＤＲを該テンプレートに移植して軽鎖のＣＤＲ移植抗体を形成した。更に、フレーム領域における一部のアミノ酸サイトに復帰変異を導入し、ここで言う復帰変異とは、ヒト由来フレーム領域の一部のアミノ酸残基をラット由来フレーム領域の同一位置のアミノ酸残基に置き換えることを意味する。復帰変異を導入するとき、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。重鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第３位Ｑをラット由来のＫ、第４４位ＧをＲ、第７８位ＬをＨ、第９１位ＹをＦ、第９４位ＲをＳにそれぞれ変更したほうが好ましく、軽鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第４９位ＹをＫ、第８７位ＹをＦにそれぞれ変更したほうが好ましい。上記可変領域遺伝子配列は、蘇州ＧＥＮＥＷＩＺ社がＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用好みを参考にしてコドンを最適化して合成したものであった。
【0064】
得られたヒト化抗体１－２５（ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）は、重鎖可変領域遺伝子配列全長が３５１ｂｐであり、１１７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で表される。また、ヒト化抗体１－２５の軽鎖可変領域遺伝子の配列全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で表される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３
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【0065】
上記人工合成によって得られた抗体１－１５（ｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）のヒト化重鎖可変領域配列をヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の定常領域（ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の定常領域は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で表される）と繋ぐことで完全な１－１５のヒト化重鎖（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表される）を形成し、軽鎖可変領域をヒト免疫グロブリンＫａｐｐａ鎖の定常領域（ヒト免疫グロブリンＫａｐｐａ鎖の定常領域は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表される）と繋ぐことで完全な抗体１－１５のヒト化軽鎖（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で表される）を形成した。
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【0066】
上記人工合成によって得られた抗体１－２５（ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）のヒト化重鎖可変領域配列をヒト免疫グロブリンＩｇＧ４定常領域（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で表される）と繋ぐことで完全な抗体１－２５のヒト化重鎖（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表される）を形成し、軽鎖定常領域とヒト免疫グロブリンＫａｐｐａ鎖の定常領域（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表される）を繋ぐことで、完全な抗体１－２５のヒト化軽鎖（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表される）を形成した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１
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【0067】
上記抗体１－１５のヒト化軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子をそれぞれｐＴＴ５発現ベクターに導入し、得られた抗体１－１５のヒト化軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターを組み合わせてＨＥＫ２９３Ｅ発現系（ＮＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）に一過的に導入して抗体を発現した。ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で培養し、ＰＥＩ導入法を利用してプラスミドを細胞に導入してから５日後に細胞上清液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーで精製して抗体を得た。このように精製した完全な抗体分子をｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄと標記した。
【0068】
上記と同様にして、抗体１－２５のヒト化軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子をそれぞれｐＴＴ５発現ベクターに導入し、得られた抗体１－２５のヒト化軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターを組み合わせてＨＥＫ２９３Ｅ発現系に一過的に導入して抗体を発現した。ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地で培養し、ＰＥＩ導入法を利用してプラスミドを細胞に導入してから５日後に細胞上清液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーで精製して抗体を得た。このように精製した完全な抗体分子をｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄと標記した。
【0069】
なお、ラット由来の抗体１－１５及び抗体１－２５について、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲによってそれぞれヒト免疫グロブリンＩｇＧ４の重鎖定常領域（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６で表される）及びＫａｐｐａ軽鎖定常領域（ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８で表され、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表される）と繋ぐことで発現ベクターを形成し、上記と同様にして抗体を発現して精製した。得られたキメラ抗体は、それぞれｍＡｂ１－１５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ及びｍＡｂ１－２５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃと標記した。
【0070】
実施例７：ＭＬＲに対する本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の促進作用
本実施例では、ＭＬＲ（混合リンパ球反応）方法を利用してｍＡｂ１－１５－ＨｕｍａｎｉｚｅｄとｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの生体活性を比較した。ここで、市販のＯｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａを陽性対照抗体とし、具体的には、実施例４でも述べたようにＩＬ－２分泌、ＩＦＮ－γ分泌及び細胞増殖に対する促進活性を評価することで行った。図１－３に示すように、ヒトＩｇＧ４同型の対照抗体はヒトＰＤ－１を認識せず、ＭＬＲに対して明らかな影響が示さないが、陽性対照抗体であるＯｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａは、ＭＬＲを促進することでＩＬ－２分泌量が多くなり、ＥＣ５０がそれぞれ２４．６３ｎｇ／ｍｌ及び１８．３７ｎｇ／ｍｌであった（表１）。一方、本発明のｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄは、上記陽性対照抗体と同様にＭＬＲのＩＬ－２分泌を促進することができ、ＥＣ５０がそれぞれ１６．５１ｎｇ／ｍｌ及び１０．７３ｎｇ／ｍｌであった。また、ｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄとその関連キメラ抗体ｍＡｂ１－１５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃは、ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対する促進活性がほぼ同じく（それぞれ１６．５１ｎｇ／ｍｌ、２３．５６ｎｇ／ｍｌでる）、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄとその関連キメラ抗体ｍＡｂ１－２５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃも、ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対する促進活性がほぼ同じであり（それぞれ１０．７３ｎｇ／ｍｌ、９．９５３ｎｇ／ｍｌである）、本発明に係るラット由来抗体のヒト化操作がその目的を達成していることが実証された。更に、以上で述べたように、ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対する促進活性からして、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄが２つの陽性対照抗体ＯｐｄｉｖｏとＫｅｙｔｒｕｄａを遥かに上回ることが確認できた。
本実施例では、ＭＬＲ（混合リンパ球反応）方法を利用してｍＡｂ１－１５－ＨｕｍａｎｉｚｅｄとｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの生体活性を比較した。ここで、市販のＯｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａを陽性対照抗体とし、具体的には、実施例４でも述べたようにＩＬ－２分泌、ＩＦＮ－γ分泌及び細胞増殖に対する促進活性を評価することで行った。図１－３に示すように、ヒトＩｇＧ４同型の対照抗体はヒトＰＤ－１を認識せず、ＭＬＲに対して明らかな影響が示さないが、陽性対照抗体であるＯｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａは、ＭＬＲを促進することでＩＬ－２分泌量が多くなり、ＥＣ５０がそれぞれ２４．６３ｎｇ／ｍｌ及び１８．３７ｎｇ／ｍｌであった（表１）。一方、本発明のｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄは、上記陽性対照抗体と同様にＭＬＲのＩＬ－２分泌を促進することができ、ＥＣ５０がそれぞれ１６．５１ｎｇ／ｍｌ及び１０．７３ｎｇ／ｍｌであった。また、ｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄとその関連キメラ抗体ｍＡｂ１－１５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃは、ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対する促進活性がほぼ同じく（それぞれ１６．５１ｎｇ／ｍｌ、２３．５６ｎｇ／ｍｌでる）、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄとその関連キメラ抗体ｍＡｂ１－２５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃも、ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対する促進活性がほぼ同じであり（それぞれ１０．７３ｎｇ／ｍｌ、９．９５３ｎｇ／ｍｌである）、本発明に係るラット由来抗体のヒト化操作がその目的を達成していることが実証された。更に、以上で述べたように、ＭＬＲのＩＬ－２分泌に対する促進活性からして、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄが２つの陽性対照抗体ＯｐｄｉｖｏとＫｅｙｔｒｕｄａを遥かに上回ることが確認できた。
【0071】
また、本発明のｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄも、ＭＬＲを刺激してＩＦＮ－γ分泌を促進し、並びにＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖を促進することができ、ＥＣ５０は表１に示される通りであった。
【0072】
【表1】
【0073】
実施例８：抗原に対する本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の結合特性
Ａｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－ＨｕｍａｎｉｚｅｄとＰＤ－１との結合特性については、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。具体的には、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を活性化させ、そしてＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ融合タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ社製）をチップに固定し、固定量が２０００ＲＵであった。ＦＣ３（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ３）を参考セルとし、ＦＣ４（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ４）を試料セルとした。ＦＣ４セルを用いてｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、陽性対照抗体（Ｏｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａ）等をそれぞれ捕捉し、濃度が異なるヒトＰＤ－１（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社製）を注入した。サイクリング条件として、ＦＣの全セルに速度５０μｌ／分間で測定試料を４分間注入し、解離時間２０分間、速度１０μｌ／分間で６Ｍの塩酸グアニジニウムを３０秒間注入して表面を再生させ、最後にＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ １．０を利用して捕捉抗体のシグナルと非捕捉抗体のシグナルの差、及び相互作用の結合特性を算出した。実験結果は、表２に示す。
Ａｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－ＨｕｍａｎｉｚｅｄとＰＤ－１との結合特性については、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定した。具体的には、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＣＭ５センサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を活性化させ、そしてＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ融合タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ社製）をチップに固定し、固定量が２０００ＲＵであった。ＦＣ３（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ３）を参考セルとし、ＦＣ４（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ４）を試料セルとした。ＦＣ４セルを用いてｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、陽性対照抗体（Ｏｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａ）等をそれぞれ捕捉し、濃度が異なるヒトＰＤ－１（北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社製）を注入した。サイクリング条件として、ＦＣの全セルに速度５０μｌ／分間で測定試料を４分間注入し、解離時間２０分間、速度１０μｌ／分間で６Ｍの塩酸グアニジニウムを３０秒間注入して表面を再生させ、最後にＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ １．０を利用して捕捉抗体のシグナルと非捕捉抗体のシグナルの差、及び相互作用の結合特性を算出した。実験結果は、表２に示す。
【0074】
【表2】
【0075】
表２に示すように、本発明のｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－１５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃは、結合特性がほぼ同じく、両者のＰＤ－１に対する結合能力が何れも陽性抗体であるＯｐｄｉｖｏを遥かに上回り、Ｋｅｙｔｒｕｄａと同等のレベルであった。また、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－Ｃｈｉｍｅｒｉｃは、結合特性がほぼ同じく、両者のＰＤ－１に対する結合能力が何れも陽性対照抗体であるＯｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａを遥かに上回り、ＰＤ－１に結合した後には陽性対照抗体に比べて結合が強く、より遅い解離速度を示した。
【0076】
更に、本実施例ではＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用い、別の測定方法によってもｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－ＨｕｍａｎｉｚｅｄとＰＤ－１の結合特性を測定した。具体的には、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて実施例１で得られたＰＤ－１－ｈＦｃをビオチン化し、メーカーのマニュアルに従って操作を行い、ビオチン化が終わると余分なビオチン標識を透析により除去した。そして、ビオチン化ＰＤ－１－ｈＦｃ融合タンパク質をＳＡセンサーチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に固定し、ＦＣ３（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ３）を参考セルとし、ＦＣ４（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ４）を試料セルとした。ＦＣ４セルに濃度が異なるｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ、陽性対照抗体（Ｏｐｄｉｖｏ又はＫｅｙｔｒｕｄａ）等をそれぞれ注入し、サイクリングとしてＦＣの全セルに速度５０μｌ／分間で測定試料を４分間注入し、解離時間を２０分間にし、最後にＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ １．０を利用して捕捉抗体のシグナルと非捕捉抗体のシグナルの差、及び相互作用の結合特性を算出した。実験結果は、表３に示す。
【0077】
【表3】
【0078】
表３に示すように、ＰＤ－１に対する本発明のｍＡｂ１－１５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ及びｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの結合能力が陽性対照抗体であるＯｐｄｉｖｏ及びＫｅｙｔｒｕｄａを遥かに上回り、ＰＤ－１に結合した後には陽性照抗体に比べて結合が強く、より遅い解離速度を示した。
【0079】
実施例９：ＰＤ－１同ファミリーメンバーに対する本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の特異性
ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ等のタンパク質分子は、ＰＤ－１と同じファミリーに属し、配列においても相同性があり、これらのタンパク質分子に対して本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体が交差反応性を示すかどうかを確認するため、以下の実験を行った。ＥＬＩＳＡプレートに、ヒトＰＤ－１－ｈＦｃ、ＣＤ２８－ｈＦｃ、ＣＴＬＡ－４－ｈＦｃ、ＩＣＯＳ－ｈＦｃ等のタンパク質分子（そのうち、ヒトＰＤ－１－ｈＦｃは、実施例１に記載の方法で調製し、ＣＴＬＡ－４細胞外配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１６４１０を参考にして調製し、ＣＴＬＡ－４－ｈＦｃは、実施例１に記載のヒトＰＤ－１－ｈＦｃ製造方法と同様にして調製し、ＣＤ２８－ｈＦｃ及びＩＣＯＳ－ｈＦｃは、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社より購入した）をそれぞれ同じ濃度でコーティングし、コーティング濃度２μｇ／ｍｌ、各ウェル当たり１００μｌずつ、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレートを２回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに１％のＢＳＡを含むコーティング緩衝液を２００μｌ加えてブローキングを行い、常温で４時間ブローキングしてから叩いて液体を完全に除き、－２０℃の冷蔵庫に保存して次に備えた。検出時には、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、希釈によって濃度勾配を形成したｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄを１００μｌずつ加え、各濃度に平行して３つのウェルを設け、室温で１時間インキュベートした。そして、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。ＰＢＳＴで１：５０００倍希釈したＨＲＰ標識のヤギ抗人Ｆａｂ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに発色液（使用に先立って、ＥＬＩＳＡ発色剤Ａと発色剤Ｂを１：１の体積比で混ぜ合わせる）を１００μｌ加えて発色させ、各ウェル当たりに２ＭのＨ２ＳＯ４停止剤を１００μｌ加えて反応を停止させ、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を利用して波長４５０ｎｍで各ウェルのＯＤ値を測定した。
ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ等のタンパク質分子は、ＰＤ－１と同じファミリーに属し、配列においても相同性があり、これらのタンパク質分子に対して本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体が交差反応性を示すかどうかを確認するため、以下の実験を行った。ＥＬＩＳＡプレートに、ヒトＰＤ－１－ｈＦｃ、ＣＤ２８－ｈＦｃ、ＣＴＬＡ－４－ｈＦｃ、ＩＣＯＳ－ｈＦｃ等のタンパク質分子（そのうち、ヒトＰＤ－１－ｈＦｃは、実施例１に記載の方法で調製し、ＣＴＬＡ－４細胞外配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１６４１０を参考にして調製し、ＣＴＬＡ－４－ｈＦｃは、実施例１に記載のヒトＰＤ－１－ｈＦｃ製造方法と同様にして調製し、ＣＤ２８－ｈＦｃ及びＩＣＯＳ－ｈＦｃは、北京Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ社より購入した）をそれぞれ同じ濃度でコーティングし、コーティング濃度２μｇ／ｍｌ、各ウェル当たり１００μｌずつ、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）でプレートを２回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに１％のＢＳＡを含むコーティング緩衝液を２００μｌ加えてブローキングを行い、常温で４時間ブローキングしてから叩いて液体を完全に除き、－２０℃の冷蔵庫に保存して次に備えた。検出時には、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、希釈によって濃度勾配を形成したｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄを１００μｌずつ加え、各濃度に平行して３つのウェルを設け、室温で１時間インキュベートした。そして、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。ＰＢＳＴで１：５０００倍希釈したＨＲＰ標識のヤギ抗人Ｆａｂ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて液体を完全に除いた。各ウェルに発色液（使用に先立って、ＥＬＩＳＡ発色剤Ａと発色剤Ｂを１：１の体積比で混ぜ合わせる）を１００μｌ加えて発色させ、各ウェル当たりに２ＭのＨ２ＳＯ４停止剤を１００μｌ加えて反応を停止させ、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を利用して波長４５０ｎｍで各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0080】
図４に示すように、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄは、ＰＤ－１を特異的に結合するが、ＰＤ－１と同じファミリーに属するタンパク質分子ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４及びＩＣＯＳには結合せず、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄが優れた特異性を有することが実験により確認できた。
【0081】
実施例１０：体内における本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体の腫瘍抑制効果
ヒトＰＤ－１トランスジェニックマウス（遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６である）及びＭＣ３８マウス大腸癌細胞は、上海南方モデル生物研究センターから購入した。該トランスジェニックマウスにおいてマウスの相同部分をヒト由来ＰＤ－１遺伝子の細胞外部分で置き換えたため、本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体は、該トランスジェニックマウスのＰＤ－１分子に結合可能となり、免疫系を活性化させて腫瘍抑制効果を奏することができる。具体的には、血清濃度１０％のＤＭＥＭ（血清と培地は何れもＧｉｂｃｏ社製である）を培地としてＭＣ３８を体外培養し、マウス１匹当たり１×１０６個の細胞となるようにＭＣ３８細胞をヒトＰＤ－１トランスジェニックマウスに接種した。接種した腫瘍細胞が体積約１００ｍｍ３まで生長すると、ランダムに動物を幾つかの組に分けた。このとき、ブランク対照組としてマウス１６匹に生理食塩水のみを注射し、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体組として１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇと３つの投与組を設け、各投与量にマウス８ずつであった。また、Ｋｅｙｔｒｕｄａ陽性対照組としては、投与量を１０ｍｇ／ｋｇとし、マウスが８匹であった。そして、既定の投与計画に従って週に２回、３週間続けて投与を行い、毎週２回の頻度で腫瘍体積を測定した。各組の経時的な腫瘍生長グラフは、図５に示す。
ヒトＰＤ－１トランスジェニックマウス（遺伝的背景がＣ５７ＢＬ／６である）及びＭＣ３８マウス大腸癌細胞は、上海南方モデル生物研究センターから購入した。該トランスジェニックマウスにおいてマウスの相同部分をヒト由来ＰＤ－１遺伝子の細胞外部分で置き換えたため、本発明の抗ヒトＰＤ－１モノクローナル抗体は、該トランスジェニックマウスのＰＤ－１分子に結合可能となり、免疫系を活性化させて腫瘍抑制効果を奏することができる。具体的には、血清濃度１０％のＤＭＥＭ（血清と培地は何れもＧｉｂｃｏ社製である）を培地としてＭＣ３８を体外培養し、マウス１匹当たり１×１０６個の細胞となるようにＭＣ３８細胞をヒトＰＤ－１トランスジェニックマウスに接種した。接種した腫瘍細胞が体積約１００ｍｍ３まで生長すると、ランダムに動物を幾つかの組に分けた。このとき、ブランク対照組としてマウス１６匹に生理食塩水のみを注射し、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ抗体組として１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇと３つの投与組を設け、各投与量にマウス８ずつであった。また、Ｋｅｙｔｒｕｄａ陽性対照組としては、投与量を１０ｍｇ／ｋｇとし、マウスが８匹であった。そして、既定の投与計画に従って週に２回、３週間続けて投与を行い、毎週２回の頻度で腫瘍体積を測定した。各組の経時的な腫瘍生長グラフは、図５に示す。
【0082】
図５に示すように、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄは、薬剤量依存的に体内腫瘍生長を抑制し、ｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）では、対照組に比べてマウス体内のＭＣ３８移植腫瘍生長（Ｐ＝０．０００７＊＊＊）に対して特に顕著な抑制効果を示すことが確認できた。一方、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（１０ｍｇ／ｋｇ）でもＭＣ３８腫瘍生長（Ｐ＝０．００１２＊＊）を抑制することができるが、その抑制効果は本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄの以下であった。また、腫瘍抑制率を見るとき、対照組に比べてｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ（１０ｍｇ／ｋｇ）組では腫瘍抑制率が８０．７％であるが、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（１０ｍｇ／ｋｇ）組では腫瘍抑制率が６５．９％に留まることから、本発明のｍＡｂ１－２５－Ｈｕｍａｎｉｚｅｄがより効果的にマウス体内の腫瘍細胞生長を抑制することのできることが実証できた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】