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特許7098731新規Ｌ－トリプトファン排出タンパク質及びそれを用いたＬ－トリプトファンを生産する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-01
(45)【発行日】2022-07-11
(54)【発明の名称】新規Ｌ－トリプトファン排出タンパク質及びそれを用いたＬ－トリプトファンを生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220704BHJP
C12P 13/22 20060101ALI20220704BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220704BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220704BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P13/22 A
C12N15/63 Z
C12N15/31
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020536860
(86)(22)【出願日】2019-02-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-04-08
(86)【国際出願番号】 KR2019002238
(87)【国際公開番号】W WO2019164348
(87)【国際公開日】2019-08-29
【審査請求日】2020-07-01
(31)【優先権主張番号】10-2018-0022054
(32)【優先日】2018-02-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCCM KCCM12099P
(73)【特許権者】
【識別番号】513178894
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョン ムヨン
(72)【発明者】
【氏名】ソ チャンイル
(72)【発明者】
【氏名】キム ヒョジン
(72)【発明者】
【氏名】キム テヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム ヒョナ
(72)【発明者】
【氏名】ソン ソンクァン
(72)【発明者】
【氏名】ヨ ヘリョン
(72)【発明者】
【氏名】イ ジェミン
(72)【発明者】
【氏名】チョン キヨン
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００３／０４４１９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】WP_050478745.1, drug/metabolite DMT transporter permease [Herbaspirillum rhizosphaerae]. [online]，2021年8月13日検索、インターネット，2017年，<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/913733518?sat=48&satkey=55716412>
【文献】FEMS Microbiol Lett，2007年，Vol.275, p.312-318
【文献】International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007年，Vol.57, p.2284-2288
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変された、Ｌ－トリプトファンを生産する、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属に属する微生物。
【請求項2】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はエシェリキア・コリである、請求項１に記載のＬ－トリプトファンを生産する微生物。
【請求項3】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変された、Ｌ－トリプトファンを生産する、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属に属する微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からＬ－トリプトファンを回収するステップとを含む、Ｌ－トリプトファンの生産方法。
【請求項4】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム又はエシェリキア・コリである、請求項３に記載のＬ－トリプトファンの生産方法。
【請求項5】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が微生物中で発現するように改変するステップを含む、微生物のトリプトファン排出能を向上させる方法であって、前記微生物は、コリネバクテリウム属又はエシェリキア属に属する微生物である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、トリプトファン排出活性を有する新規タンパク質が発現するように改変された、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物、及び前記微生物を用いてＬ－トリプトファンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－トリプトファンは、必須アミノ酸の一つであり、飼料添加剤、輸液剤などの医薬品原料や健康食品素材などとして広く用いられている。現在は、微生物を用いた直接発酵法がＬ－トリプトファン生産に主に用いられている。
【0003】
Ｌ－トリプトファン生産に用いられる微生物として、初期には化学的又は物理的突然変異によるアナログ耐性を示す選択菌株が主に用いられていたが、１９９０年代に遺伝子組換え技術が急激に発展し、分子レベルの調節機序が解明されることにより、遺伝子操作技法を用いた組換え菌株が主に用いられている。
【0004】
一方、特定アミノ酸排出遺伝子の発現は、微生物における当該アミノ酸の生産性向上をもたらした。コリネバクテリウム属微生物のＬ－リシン排出遺伝子（ｌｙｓＥ）の発現強化は、リシンの生産性を向上させた（特許文献１）。また、大腸菌におけるｒｈｔＣ遺伝子の強化は、Ｌ－トレオニン（L-threonine）に対する耐性を向上させると共に、Ｌ－ホモセリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－ロイシンの生産性を向上させた（特許文献２）。大腸菌において機能が知られていない遺伝子であるｙａｈＮ遺伝子、ｙｅａＳ遺伝子、ｙｆｉＫ遺伝子及びｙｇｇＡ遺伝子を強化することにより、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－リシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－アラニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－バリン及びＬ－イソロイシンの生産性が向上するという特許（特許文献３）も開示されている。
【0005】
しかし、現在、Ｌ－トリプトファンに特異性を示す排出タンパク質は報告されていない。大腸菌のｙｄｄＧ遺伝子が知られているが、Ｌ－トリプトファンよりＬ－フェニルアラニンに高い特異性を示す（非特許文献１）。また、Ｌ－アミノ酸発酵の生産菌株として主に用いられるコリネバクテリウム属微生物においては、Ｌ－トリプトファン又は芳香族アミノ酸排出遺伝子が全く報告されていない（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】国際公開第９７／０２３５９７号
【文献】欧州特許出願公開第１０１３７６５号明細書
【文献】欧州特許第１０１６７１０号明細書
【文献】韓国登録特許第１０－０６２００９２号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１７８３１７０号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１６３２６４２号公報
【文献】韓国登録特許第１０－１１２６０４１号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】FEMS Microbiol Lett 275 (2007) 312-318
【文献】J Ind Microbiol Biotechnol. 2015 May;42(5):787-97
【文献】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【文献】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【文献】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【文献】DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
【文献】Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545
【文献】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Nov. 1987, p. 5330-5332
【文献】Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol. 73(14): 4491-4498, 2007
【文献】J. Biochem. Mol. Biol. 32, 20-24 (1999)
【文献】One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6;97(12):6640-5
【文献】JOURNAL OF BACTERIOLOGY,July 1997, p. 4426-4428
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本出願では、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物においてＬ－トリプトファンに特異性を有する新規トリプトファン排出タンパク質を発現させたところ、Ｌ－トリプトファン生産量が画期的に向上することを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本出願は、Ｌ－トリプトファン排出活性を有する新規タンパク質が発現するように改変された、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物を提供することを目的とする。
【0010】
また、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップと、前記培養した微生物又は培地からＬ－トリプトファンを回収するステップとを含むＬ－トリプトファン生産方法を提供することを目的とする。
【0011】
さらに、本出願は、Ｌ－トリプトファン排出活性を有する新規タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供することを目的とする。
【0012】
さらに、本出願は、Ｌ－トリプトファン排出活性を有する新規タンパク質が微生物中で発現するように改変するステップを含む、Ｌ－トリプトファン排出能を向上させる方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0013】
本出願は、Ｌ－トリプトファンに特異性を有する新規排出遺伝子を見出し、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物において前記遺伝子を発現させたところ、前記遺伝子を発現しない親株に比べてＬ－トリプトファン生産量が画期的に向上することが確認されたので、それによりＬ－トリプトファンを効果的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】各糖消費量におけるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＣＡ０４－８３５２及びＣＡ０４－８４０５の細胞内のトリプトファン濃度を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本出願をより詳細に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれの他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。
【0016】
前記目的を達成するための本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように強化された、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物を提供する。
【0017】
本出願における「Ｌ－トリプトファン（L-tryptophan）」とは、α－アミノ酸の一つであって、体内で合成されない必須アミノ酸であり、Ｃ１１Ｈ１２Ｎ２Ｏ２の化学式で表される芳香族Ｌ－アミノ酸を意味する。
【0018】
本出願における「Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質」とは、特異的にＬ－トリプトファンを細胞外に排出する活性を有する膜タンパク質を意味する。
【0019】
前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質は、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と混用されてもよい。
【0020】
具体的には、本出願における配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質とは、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）由来のタンパク質のうちＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質を意味する。ここで、「ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）」とは、ヘルバスピリラム属に属するグラム陰性菌であって、韓国内では鬱陵島などで分離された菌株であり、土壌内の根圏（rhizosphere）から分離される。
【0021】
また、本出願のＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質は、たとえ配列番号１のアミノ酸を含むタンパク質であると定義したとしても、配列番号１のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一又は相当する活性を有するものであれば、本願のＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質に含まれることは当業者にとって自明である。具体的には、本願のＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと８０％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、そのような相同性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0022】
前記「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド部分（moiety）間の同一性の割合を意味する。与えられたアミノ酸配列又は塩基配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列又は塩基配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％の相同性」と表される。一部分から他の部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定されてもよい。例えば、スコア（score）、同一性（identity）、類似度（similarity）などのパラメーター（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的にはＢＬＡＳＴ ２．０を用いるか、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献３、４）で決定されてもよい。
【0023】
前記ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）由来のＬ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、前記タンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。より具体的には、前記配列は、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、配列番号２のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと混用されてもよい。
【0024】
また、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。一方、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチド配列、又はそれと８０％、９０％、９５％もしくは９７％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。また、そのような相同性を有し、実質的に前記タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたポリヌクレオチド配列も本出願に含まれることは言うまでもない。あるいは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等又は類似の活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献３）に具体的に記載されている。例えば、相同性の高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似したヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたヌクレオチド断片が含まれてもよい。具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（非特許文献５参照）。
【0025】
本出願における、タンパク質が「発現するように／する」とは、標的タンパク質が微生物に導入されるか、微生物中に存在するタンパク質の場合、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が強化された状態を意味する。
【0026】
具体的には、「タンパク質の導入」とは、微生物が本来持っていなかった特定タンパク質の活性が現れるようにすること、又は当該タンパク質の内在性活性もしくは改変前の活性に比べて向上した活性が現れるようにすることを意味する。例えば、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物中の染色体に導入されることや、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物に導入されてその活性が現れることであってもよい。また、「活性の強化」とは、微生物が有する特定タンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。
【0027】
具体的には、本出願の活性強化は、前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の細胞内のコピー数を増加する方法、前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列を活性が強力な配列に置換する方法、前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質の活性が強化されるように突然変異させた遺伝子により染色体上の前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、及び前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質の活性が強化されるように前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードする染色体上の遺伝子に変異を導入する方法からなる群から選択される少なくとも１つの方法で行われてもよい。
【0028】
前記遺伝子のコピー数を増加する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われてもよい。具体的には、本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われてもよい。あるいは、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞の染色体内に導入されることにより行われる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。
【0029】
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、スペーサー、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれてもよい。
【0030】
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力なプロモーターが連結されるが、これに限定されるものではない。公知の強力なプロモーターの例としては、ｃｊ１～ｃｊ７プロモーター（特許文献４）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献５）、Ｏ２プロモーター（特許文献６）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0031】
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。
【0032】
このようなタンパク質活性の導入及び強化は、対応するタンパク質の活性又は濃度が野生型や非変形の微生物菌株におけるタンパク質の活性又は濃度に比べて、一般に少なくとも１％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％又は５００％、最大で１０００％又は２０００％まで増加したものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0033】
本出願の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0034】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味する。
【0035】
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
【0036】
本出願に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0037】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内に標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0038】
本出願における「Ｌ－トリプトファンを生産する微生物」とは、培地中の炭素源からＬ－トリプトファンを野生型又は非変型微生物と比較して過剰量で生産する微生物を意味する。また、前記Ｌ－トリプトファンを生産する微生物は組換え微生物であってもよい。具体的には、Ｌ－トリプトファンを生産するものであればその種類が特に限定されるものではなく、エンテロバクター（Enterbacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属又はエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物であってもよい。
【0039】
さらに具体的には、エシェリキア属（Escherichia）微生物は大腸菌（Escherichia coli）であってもよく、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（corynebacterium glutamicum）であってもよいが、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が導入又は強化されてＬ－トリプトファン生産量を増加させる、エシェリキア属又はコリネバクテリウム属に属する微生物であればいかなるものでもよい。
【0040】
前記微生物において、Ｌ－トリプトファンの生産量を増加させるために、Ｅ４Ｐ（erythorse-4-phosphate）などの前駆体を持続的に供給し、エネルギーを効率的に利用できるようにｔｋｔＡ遺伝子の発現を強化したり、生合成経路における側枝経路を遮断することにより生合成を増加させる方法や、用いるＡＴＰを少なくする方法などを用いることができる。
【0041】
具体的には、本出願において、前記Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変された、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物の親株は、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物であれば特に限定されるものではない。Ｌ－トリプトファンを生産する微生物は、Ｌ－トリプトファン生合成経路を強化するために、競合経路の遺伝子、Ｌ－トリプトファンオペロンの芳香族経路のオペレーター、Ｌ－トリプトファン流入遺伝子、Ｌ－トリプトファン流入及び分解遺伝子の活性を低下又は不活性化させ、かつ／又はＬ－トリプトファンオペロンの活性を過剰発現させる微生物であってもよい。具体的には、Ｌ－トリプトファン生合成遺伝子の（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）発現を抑制するトリプトファン合成酵素群の調節遺伝子（ｔｒｐＲ）、又は細胞の外部のＬ－トリプトファンを細胞内に流入するＭｔｒ膜タンパク質の活性が内在性活性より低下したもの又は除去されたものであってもよい。
【0042】
前記目的を達成するための本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変された、Ｌ－トリプトファンを生産する微生物を培地で培養するステップと、前記培養における培地又は前記微生物からＬ－トリプトファンを回収するステップとを含む、トリプトファンの生産方法を提供する。
【0043】
前記Ｌ－トリプトファン、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質、タンパク質の発現、及び微生物については前述した通りである。
【0044】
本出願における「培養」とは、前記微生物を好適に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び流加培養であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0045】
本出願における「培地」とは、前記微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
【0046】
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的にはグルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0047】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0048】
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0049】
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
【0050】
培地の温度は、２０℃～５０℃、具体的には３０℃～３７℃であるが、これに限定されるものではない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１０時間～１００時間であるが、これに限定されるものではない。
【0051】
前記トリプトファンを回収するステップは、本出願の微生物の培養法、例えば回分、連続、流加培養法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて培地から目的とするＬ－トリプトファンを回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ及びそれらの組み合わせを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【0052】
前記回収ステップは、さらなる精製工程を含んでもよい。前記精製工程においては、当該技術分野で公知の好適な方法により、回収されたＬ－トリプトファンを精製することができる。
【0053】
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が微生物中で発現するように改変するステップを含む、微生物のトリプトファン排出能を向上させる方法を提供する。
【0054】
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質における、微生物のトリプトファン排出能を向上させるための用途を提供する。
【0055】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質、タンパク質の導入、タンパク質の活性強化については前述した通りである。
【実施例】
【0056】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0057】
排出遺伝子の探索及び選択
大腸菌由来ＥａｍＡ ｆａｍｉｌｙであるＹｄｅＤのアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＮＣＢＩとＫＥＧＧ ｄａｔａｂａｓｅに基づいたＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ探索の結果、トリプトファンを排出する膜タンパク質と考えられる３０種の候補遺伝子とそれを保有する生物を選定した。それらのうち生産菌株に適用できるバイオセーフティーレベル（Biosafety level）と確保可能性を考慮して、表１のように５種の生物を選定した。
大腸菌由来ＥａｍＡ ｆａｍｉｌｙであるＹｄｅＤのアミノ酸配列をｑｕｅｒｙ配列とし、ＮＣＢＩとＫＥＧＧ ｄａｔａｂａｓｅに基づいたＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ探索の結果、トリプトファンを排出する膜タンパク質と考えられる３０種の候補遺伝子とそれを保有する生物を選定した。それらのうち生産菌株に適用できるバイオセーフティーレベル（Biosafety level）と確保可能性を考慮して、表１のように５種の生物を選定した。
【0058】
【表1】
【実施例2】
【0059】
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ（Herbaspirillum rhizosphaerae）由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物の作製
実施例１で選定したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から膜タンパク質をコードする遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＺ＿ＬＦＬＵ０１００００１２．１）を得た。
実施例１で選定したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から膜タンパク質をコードする遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＺ＿ＬＦＬＵ０１００００１２．１）を得た。
【0060】
確保した塩基配列に基づいて、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに挿入するためのプライマーを合成した。ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を増幅するために、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３と配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0061】
その結果、９２４ｂｐの遺伝子（配列番号２）を含む９５６ｂｐの遺伝子断片が得られた。
配列番号３（ｗｅｘ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣ
配列番号４（ｗｅｘ－２）
ｇｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＡＣ
配列番号３（ｗｅｘ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣ
配列番号４（ｗｅｘ－２）
ｇｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＡＣ
【0062】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡプロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（SolGent co.）を用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号５（ＰｇａｐＡ－１）
ｃｃｃｔｔｃｃｇｇｔｔｔＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣ
配列番号６（ＰｇａｐＡ（－ｗｅｘ）－２）
ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
配列番号５（ＰｇａｐＡ－１）
ｃｃｃｔｔｃｃｇｇｔｔｔＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＣ
配列番号６（ＰｇａｐＡ（－ｗｅｘ）－２）
ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
【0063】
増幅したｇａｐＡプロモーター部位とヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子断片、及びＳｃａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺＴｎ（特許文献７）は、ギブソンアセンブリ（非特許文献６）方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0064】
作製したｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーション（非特許文献７）により形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのＰｇａｐＡ－Ｈｒｈ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号７と配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
配列番号７（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ－１）
ＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧ
配列番号８（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ－２）
ＣＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧ
配列番号７（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ－１）
ＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＧ
配列番号８（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿ＰｇａｐＡ－ｗｅｘ－２）
ＣＡＣＧＡＴＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＣＡＧＧ
【0065】
このようにして得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈと命名した。
【実施例3】
【0066】
シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物の作製
実施例１で選定したシュードモナス・スタッツェリ由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＣ＿０１８１７７．１）を得た。
実施例１で選定したシュードモナス・スタッツェリ由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＣ＿０１８１７７．１）を得た。
【0067】
確保した塩基配列に基づいて、シュードモナス・スタッツェリ由来の遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに挿入するためのプライマーを合成した。シュードモナス・スタッツェリ由来の遺伝子を増幅するために、シュードモナス・スタッツェリ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
【0068】
その結果、９４５ｂｐの排出遺伝子（配列番号１０）を含む９７７ｂｐの遺伝子断片が得られた。
配列番号１１（Ｐｓｔ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣ
配列番号１２（Ｐｓｔ－２）
ｇｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＣＧＣＧＧ
配列番号１１（Ｐｓｔ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣ
配列番号１２（Ｐｓｔ－２）
ｇｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＴＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＣＧＣＧＧ
【0069】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡプロモーターを用いるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号１３のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
配列番号１３（ＰｇａｐＡ（－Ｐｓｔ）－２）
ＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
配列番号１３（ＰｇａｐＡ（－Ｐｓｔ）－２）
ＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
【0070】
増幅したｇａｐＡプロモーター部位とシュードモナス・スタッツェリ由来の遺伝子断片、及びＳｃａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺＴｎは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｐｓｔと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0071】
作製したｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｐｓｔベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのＰｇａｐＡ－Ｐｓｔ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号７と配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
【0072】
このようにして得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｐｓｔと命名した。
【実施例4】
【0073】
アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物の作製
実施例１で選定したアルカリゲネス・フェカリス由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＺ＿ＣＰ０１３１１９．１）を得た。
実施例１で選定したアルカリゲネス・フェカリス由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＺ＿ＣＰ０１３１１９．１）を得た。
【0074】
確保した塩基配列に基づいて、アルカリゲネス・フェカリス由来の遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに挿入するためのプライマーを合成した。アルカリゲネス・フェカリス由来の遺伝子を増幅するために、アルカリゲネス・フェカリス菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１６と配列番号１７のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
【0075】
その結果、９１２ｂｐの排出遺伝子（配列番号１５）を含む９４３ｂｐの遺伝子断片が得られた。
配列番号１６（Ａｆａ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣ
配列番号１７（Ａｆａ－２）
ｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＧＴ
配列番号１６（Ａｆａ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣ
配列番号１７（Ａｆａ－２）
ｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＧＴ
【0076】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡプロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号１８のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
配列番号１８（ＰｇａｐＡ（－Ａｆａ）－２）
ＡＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
配列番号１８（ＰｇａｐＡ（－Ａｆａ）－２）
ＡＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
【0077】
増幅したｇａｐＡプロモーター部位とアルカリゲネス・フェカリス由来の遺伝子断片、及びＳｃａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺＴｎは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ａｆａと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0078】
作製したｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ａｆａベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのＰｇａｐＡ－Ａｆａ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号７と配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
【0079】
このようにして得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ａｆａと命名した。
【実施例5】
【0080】
カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物の作製
実施例１で選定したカプリアビダス・ネカトール由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＡＭ２６０４８０．１）を得た。
実施例１で選定したカプリアビダス・ネカトール由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から当該遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＡＭ２６０４８０．１）を得た。
【0081】
確保した塩基配列に基づいて、カプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに挿入するためのプライマーを合成した。カプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子を増幅するために、カプリアビダス・ネカトール菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１と配列番号２２のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
【0082】
その結果、９４５ｂｐのカプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子（配列番号２０）を含む９７７ｂｐの遺伝子断片が得られた。
配列番号２１（Ｃｎｅ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣ
配列番号２２（Ｃｎｅ－２）
ｇｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧ
配列番号２１（Ｃｎｅ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣ
配列番号２２（Ｃｎｅ－２）
ｇｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧ
【0083】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡプロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号２３のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
配列番号２３（ＰｇａｐＡ（－Ｃｎｅ）－２）
ＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
配列番号２３（ＰｇａｐＡ（－Ｃｎｅ）－２）
ＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧＴＡ
【0084】
増幅したｇａｐＡプロモーター部位とカプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子断片、及びＳｃａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺＴｎは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｃｎｅと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0085】
作製したｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｃｎｅベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのＰｇａｐＡ－Ｃｎｅ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号７と配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
【0086】
このようにして得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｃｎｅと命名した。
【実施例6】
【0087】
大腸菌（Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655）由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物の作製
実施例１で選定した大腸菌由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から前記遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＣ＿０００９１３．３）を得た。
実施例１で選定した大腸菌由来の膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有する。米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から前記遺伝子及びその周辺の塩基配列に関する情報（登録番号ＮＣ＿０００９１３．３）を得た。
【0088】
確保した塩基配列に基づいて、大腸菌由来の遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡに挿入するためのプライマーを合成した。大腸菌由来の遺伝子を増幅するために、大腸菌菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２６と配列番号２７のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
【0089】
その結果、８８２ｂｐの排出遺伝子（配列番号２５）を含む９１３ｂｐの遺伝子断片が得られた。
配列番号２６（Ｅｃｏ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＣＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣ
配列番号２７（Ｅｃｏ－２）
ｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＧＴＧＴＣＧＣＣ
配列番号２６（Ｅｃｏ－１）
ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＣＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣ
配列番号２７（Ｅｃｏ－２）
ｇｃｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｔＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＧＴＧＴＣＧＣＣ
【0090】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡプロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５と配列番号２８のプライマーを用いて実施例２と同様にＰＣＲを行った。
配列番号２８（ＰｇａｐＡ（－Ｅｃｏ）－２）
ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧ
配列番号２８（ＰｇａｐＡ（－Ｅｃｏ）－２）
ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＴＧ
【0091】
増幅したｇａｐＡプロモーター部位と大腸菌由来の遺伝子断片、及びＳｃａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺＴｎは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｅｃｏと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0092】
作製したｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｅｃｏベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でトランスポゾン遺伝子の間に１コピーのＰｇａｐＡ－Ｅｃｏ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号７と配列番号８のプライマーを用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより、当該遺伝的操作を確認した。
【0093】
このようにして得た菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｅｃｏと命名した。
【実施例7】
【0094】
様々な微生物由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物菌株のＭＩＣ測定
実施例２～６で作製した５種のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｐｓｔ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ａｆａ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｃｎｅ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｅｃｏがトリプトファン排出能の活性を有するか否かを確認するために、トリプトファンのアナログ（analogue）と他の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンのアナログを用いた最小阻止濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）実験を行った。５種の膜タンパク質をコードする遺伝子を導入した菌株を最小液体培地において３０℃で２４時間培養し、その後３×１０３個及び３×１０４個の細胞に希釈してトリプトファンのアナログ又はフェニルアラニンのアナログを添加した最小固体培地においてスポット（spotting）培養した。
実施例２～６で作製した５種のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｐｓｔ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ａｆａ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｃｎｅ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ＰｇａｐＡ－Ｅｃｏがトリプトファン排出能の活性を有するか否かを確認するために、トリプトファンのアナログ（analogue）と他の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンのアナログを用いた最小阻止濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）実験を行った。５種の膜タンパク質をコードする遺伝子を導入した菌株を最小液体培地において３０℃で２４時間培養し、その後３×１０３個及び３×１０４個の細胞に希釈してトリプトファンのアナログ又はフェニルアラニンのアナログを添加した最小固体培地においてスポット（spotting）培養した。
【0095】
最小阻止濃度実験のために、２．５ｍｇ／ｍｌのパラフルオロフェニルアラニン（ρ'-fluoro-DL-phenylalanine）又は０．２５ｕｇ／ｍｌの５’－フルオロトリプトファン（5-fluoro-DL-trytophan）を最小固体培地に添加し、６０時間後に細胞の成長を観察した（表２）。
【0096】
選択した５種の遺伝子の導入において、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のフェニルアラニンのアナログを添加する条件にて全て成長を可能にした。それらのうち、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ、アルカリゲネス・フェカリス、大腸菌由来の遺伝子の導入が最も良好な成長を示した。シュードモナス・スタッツェリ由来の遺伝子の導入は、前述した３種の菌株に比べて多少劣る成長を示し、カプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子の導入は、最も劣る成長を示した。同一条件にて、野生株ＡＴＣＣ１３８６９においては成長しなかった。また、０．２５ｕｇ／ｍｌの濃度のトリプトファンのアナログを添加する条件にて、唯一ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子の導入において成長を可能にした。
【0097】
これらの結果から、選択した５種の遺伝子の導入は、活性の差はあるものの、全てフェニルアラニン及びそのアナログには耐性を示すのに対して、トリプトファン及びトリプトファンのアナログには唯一ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子が特異的に卓越した耐性を示すと判断される。よって、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子がコードする膜タンパク質のみトリプトファンに対する排出タンパク質として作用すると解釈される。
最小培地（ｐＨ７．２）
グルコース１０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，尿素２ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ，ＮａＣｌ ０．５ｇ，ニコチンアミド５μｇ，パントテン酸カルシウム０．１μｇ，ビオチン０．２μｇ，チアミンＨＣｌ ３μｇ，Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌ（蒸留水１リットル中）
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２Ｏ ０．０９ｇ，（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２７４Ｈ２Ｏ ０．０４ｇ，ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ，ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ ０．２７ｇ，ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ，ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ １ｇ，ＣａＣｌ２ ０．０１ｇ（蒸留水１リットル中）
最小培地（ｐＨ７．２）
グルコース１０ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，尿素２ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５ｇ，ＮａＣｌ ０．５ｇ，ニコチンアミド５μｇ，パントテン酸カルシウム０．１μｇ，ビオチン０．２μｇ，チアミンＨＣｌ ３μｇ，Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌ（蒸留水１リットル中）
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２Ｏ ０．０９ｇ，（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２７４Ｈ２Ｏ ０．０４ｇ，ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ，ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ ０．２７ｇ，ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ ０．０１ｇ，ＦｅＣｌ３６Ｈ２Ｏ １ｇ，ＣａＣｌ２ ０．０１ｇ（蒸留水１リットル中）
【0098】
【表2】
【実施例8】
【0099】
様々な微生物由来の遺伝子を導入した大腸菌用発現ベクターの作製
大腸菌菌株においても、実施例１で選択した様々な微生物由来の遺伝子のトリプトファン又はそのアナログ耐性の確認のために、各遺伝子を大腸菌発現ベクターであるｐＣＬ１９２０にクローニングし、大腸菌菌株Ｗ３１１０のｙｃｃＡプロモーターで発現させた。
大腸菌菌株においても、実施例１で選択した様々な微生物由来の遺伝子のトリプトファン又はそのアナログ耐性の確認のために、各遺伝子を大腸菌発現ベクターであるｐＣＬ１９２０にクローニングし、大腸菌菌株Ｗ３１１０のｙｃｃＡプロモーターで発現させた。
【0100】
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子断片を確保するために、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９と配列番号３０を用いてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＳｏｌｇ ＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（SolGent co.）を用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号２９（Ｈｒｈ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣ
配列番号３０（Ｈｒｈ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＡＣ
配列番号２９（Ｈｒｈ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣ
配列番号３０（Ｈｒｈ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＴＣＣＧＣＣＡＣ
【0101】
大腸菌Ｗ３１１０由来のｙｃｃＡプロモーターを確保するために、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３１と配列番号３２を用いてＰＣＲを行った。重合酵素としてはＳｏｌｇ ＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（SolGent co.）を用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１０秒間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号３１（ＰｙｃｃＡ－１）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＡＴＧＣＧＴＡＡ
配列番号３２（ＰｙｃｃＡ（－Ｈｒｈ）－２）
ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
配列番号３１（ＰｙｃｃＡ－１）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＡＴＧＣＧＴＡＡ
配列番号３２（ＰｙｃｃＡ（－Ｈｒｈ）－２）
ＣＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
【0102】
増幅したｙｃｃＡプロモーター部位とヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子断片、及びＳｍａＩ制限酵素で切断したｐＣＬ１９２０ ｖｅｃｔｏｒ（pSC101 ori, Spr）は、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。得られたｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈを野生型大腸菌Ｗ３１１０に導入し、前記遺伝子が発現する形質転換体であるＷ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈを作製した。
【0103】
シュードモナス・スタッツェリ菌株由来の遺伝子断片を確保するために、シュードモナス・スタッツェリ菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３３と配列番号３４を用いてＰＣＲを行った。また、大腸菌Ｗ３１１０由来のｙｃｃＡプロモーターを確保するためにプライマー配列番号３５を用いたこと以外の全ての実行方法は、前記ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ菌株の遺伝子断片を確保するために用いたものと同一にした。
配列番号３３（Ｐｓｔ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣ
配列番号３４（Ｐｓｔ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＣＧＣＧＧ
配列番号３５（ＰｙｃｃＡ（－Ｐｓｔ）－２）
ＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
配列番号３３（Ｐｓｔ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＡＧＣＧＴＡＡＡＧＣ
配列番号３４（Ｐｓｔ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＣＧＣＧＧ
配列番号３５（ＰｙｃｃＡ（－Ｐｓｔ）－２）
ＡＣＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
【0104】
このように組換えプラスミドを得て、ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｐｓｔと命名し、発現ベクターｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｐｓｔを野生型大腸菌Ｗ３１１０に導入し、前記遺伝子が発現する形質転換体であるＷ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｐｓｔを作製した。
【0105】
アルカリゲネス・フェカリス菌株由来の遺伝子が発現する形質転換体を作製する過程は前記過程と同一であり、断片を確保するためのアルカリゲネス・フェカリス菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３６と配列番号３７を用いたことと、ｙｃｃＡプロモーターを確保するためにプライマー配列番号３８を用いたことのみ異なる。
配列番号３６（Ａｆａ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣ
配列番号３７（Ａｆａ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＧＴ
配列番号３８（ＰｙｃｃＡ（－Ａｆａ）－２）
ＡＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
配列番号３６（Ａｆａ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣ
配列番号３７（Ａｆａ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＣＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＧＴ
配列番号３８（ＰｙｃｃＡ（－Ａｆａ）－２）
ＡＴＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
【0106】
このようにアルカリゲネス・フェカリス由来の遺伝子がクローニングされた組換えプラスミドを得て、ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ａｆａと命名した。また、発現ベクターｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ａｆａを野生型大腸菌Ｗ３１１０に導入した形質転換体であるＷ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ａｆａを作製した。
【0107】
カプリアビダス・ネカトール菌株由来の遺伝子断片を確保するために、カプリアビダス・ネカトール菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３９と配列番号４０を用いてＰＣＲを行った。また、大腸菌Ｗ３１１０由来のｙｃｃＡプロモーターを確保するためにプライマー配列番号４１を用いたこと以外の全ての実行方法は、前記ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ菌株の遺伝子断片を確保するために用いたものと同一にした。
配列番号３９（Ｃｎｅ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣ
配列番号４０（Ｃｎｅ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧ
配列番号４１（ＰｙｃｃＡ（－Ｃｎｅ）－２）
ＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
配列番号３９（Ｃｎｅ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＣ
配列番号４０（Ｃｎｅ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＧ
配列番号４１（ＰｙｃｃＡ（－Ｃｎｅ）－２）
ＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
【0108】
このように組換えプラスミドを得て、ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｃｎｅと命名した。また、発現ベクターｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｃｎｅを野生型大腸菌Ｗ３１１０に導入し、前記遺伝子が発現する形質転換体であるＷ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｃｎｅを作製した。
【0109】
大腸菌菌株の遺伝子断片を確保するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４２と配列番号４３を用いてＰＣＲを行った。また、大腸菌Ｗ３１１０由来のｙｃｃＡプロモーターを確保するためにプライマー配列番号４４を用いたこと以外の全ての実行方法は、前記ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ菌株の遺伝子断片を確保するために用いたものと同一にした。
配列番号４２（Ｅｃｏ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣ
配列番号４３（Ｅｃｏ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＧＴＧＴＣＧＣＣ
配列番号４４（ＰｙｃｃＡ（－Ｅｃｏ）－２）
ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
配列番号４２（Ｅｃｏ－３）
ＡＴＡＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＡＣ
配列番号４３（Ｅｃｏ－４）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＴＡＡＣＣＡＣＧＡＣＧＴＧＴＣＧＣＣ
配列番号４４（ＰｙｃｃＡ（－Ｅｃｏ）－２）
ＴＴＴＴＴＧＴＣＧＴＧＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧ
【0110】
このように組換えプラスミドを得て、ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｅｃｏと命名した。また、発現ベクターｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｅｃｏを野生型大腸菌Ｗ３１１０に導入し、前記遺伝子が発現する形質転換体であるＷ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｅｃｏを作製した。
【実施例9】
【0111】
様々な微生物由来の膜タンパク質遺伝子を過剰発現する大腸菌のＭＩＣ測定
実施例８で作製した５種の遺伝子を過剰発現する大腸菌菌株Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｐｓｔ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ａｆａ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｃｎｅ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｅｃｏの耐性確認のために、トリプトファンとフェニルアラニンのアナログ（analogue）を用いた最小阻止濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）実験を行った。５種の遺伝子を過剰発現する大腸菌菌株は、５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（spectinomycin）を添加したＭ９最小液体培地において３７℃で１５時間培養し、その後１０４個及び１０５個の細胞に希釈してトリプトファンのアナログ又はフェニルアラニンのアナログを添加したＭ９グルコース最小固体培地（５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン添加）においてスポット（spotting）培養した。最小阻止濃度実験のために、２ｍｇ／ｍｌのパラフルオロフェニルアラニン（p’-fluoro-DL-phenylalanine）又は０．７ｕｇ／ｍｌの５’－フルオロトリプトファン（5-fluoro-DL-trytophan）をＭ９最小固体培地に添加し、４８時間後に細胞の成長を観察した（表３）。
実施例８で作製した５種の遺伝子を過剰発現する大腸菌菌株Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｐｓｔ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ａｆａ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｃｎｅ、Ｗ３１１０／ｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｅｃｏの耐性確認のために、トリプトファンとフェニルアラニンのアナログ（analogue）を用いた最小阻止濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）実験を行った。５種の遺伝子を過剰発現する大腸菌菌株は、５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン（spectinomycin）を添加したＭ９最小液体培地において３７℃で１５時間培養し、その後１０４個及び１０５個の細胞に希釈してトリプトファンのアナログ又はフェニルアラニンのアナログを添加したＭ９グルコース最小固体培地（５０ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン添加）においてスポット（spotting）培養した。最小阻止濃度実験のために、２ｍｇ／ｍｌのパラフルオロフェニルアラニン（p’-fluoro-DL-phenylalanine）又は０．７ｕｇ／ｍｌの５’－フルオロトリプトファン（5-fluoro-DL-trytophan）をＭ９最小固体培地に添加し、４８時間後に細胞の成長を観察した（表３）。
【0112】
フェニルアラニンのアナログを添加する条件にて、大腸菌菌株は、コリネグルタミカム菌株と同様に、大腸菌由来の遺伝子の過剰発現において卓越した成長を示し、アルカリゲネス・フェカリス由来の遺伝子の過剰発現においても大きな成長を可能にした。しかし、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ、シュードモナス・スタッツェリ、カプリアビダス・ネカトール由来の遺伝子の過剰発現においては、対照群であるＷ３１１０／ｐＣＬ１９２０と共に成長しなかった。それに対して、選択した５種の遺伝子の過剰発現において、トリプトファンのアナログを添加する条件にて全て成長を可能にした。それらのうち、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子の過剰発現が最も良好な成長を可能にし、アルカリゲネス・フェカリスと大腸菌由来の排出遺伝子の過剰発現がそれに次ぐ成長を示した。シュードモナス・スタッツェリとカプリアビダス・ネカトール由来の排出遺伝子の過剰発現は、僅かな成長を示した。
【0113】
大腸菌菌株における、選択した５種の遺伝子過剰発現は、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のＭＩＣ実験の結果と同様の様相を呈した。ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子は、コリネグルタミカム菌株と大腸菌の両方においてトリプトファン又はトリプトファンのアナログに特異的に卓越した耐性を示し、大腸菌由来の排出遺伝子は、トリプトファンに比べてフェニルアラニン及びそのアナログに対してより高い排出耐性を示した。よって、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子は、コリネグルタミカム菌株と大腸菌の両方においてトリプトファンに対して特異的に卓越した排出能を示すと判断される。
【0114】
【表3】
【0115】
参考例１：L－トリプトファンを生産するコリネバクテリウム属微生物の作製
Ｌ－トリプトファン生産菌株は、野生種のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９から開発した。野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムはＬ－トリプトファンを生産できないか、生産したとしても極微量のＬ－トリプトファンを生産するにすぎないので、生産に必須の生合成経路を強化した菌株を親株として用いることを試みた。具体的には、Ｌ－トリプトファン生合成遺伝子のオペロン（operon）におけてプロモーター強化により発現を向上させた。また、ＴｒｐＥタンパク質のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ｔｒｐＥの３８番目のアミノ酸であるセリン（Serine）をアルギニン（Arginine）に置換した（非特許文献８）。
Ｌ－トリプトファン生産菌株は、野生種のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９から開発した。野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムはＬ－トリプトファンを生産できないか、生産したとしても極微量のＬ－トリプトファンを生産するにすぎないので、生産に必須の生合成経路を強化した菌株を親株として用いることを試みた。具体的には、Ｌ－トリプトファン生合成遺伝子のオペロン（operon）におけてプロモーター強化により発現を向上させた。また、ＴｒｐＥタンパク質のフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ｔｒｐＥの３８番目のアミノ酸であるセリン（Serine）をアルギニン（Arginine）に置換した（非特許文献８）。
【0116】
このような遺伝子操作のために、まず染色体上の相同組換え（Homologous recombination）が生じるｔｒｐＥプロモーターの上流（Upstream）領域とｔｒｐＥの３８番目の変異の下流（Downsteam）領域を得た。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５と配列番号４６のプライマーを用いて、ｔｒｐＥプロモーターの上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号４７と配列番号４８のプライマーを用いて、ｔｒｐＥの３８番目の変異の下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
配列番号４５（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｌ－１）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＴＧＴＣ
配列番号４６（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｌ－２）
ＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣ
配列番号４７（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｒ－１）
ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡ
配列番号４８（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｒ－２）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＡＡＡＴＧ
配列番号４５（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｌ－１）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＴＧＴＣ
配列番号４６（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｌ－２）
ＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣ
配列番号４７（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｒ－１）
ＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡ
配列番号４８（Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）＿Ｒ－２）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＡＡＡＴＧ
【0117】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0118】
合成して作製したプロモーターＳＰＬ７（配列番号４９）を鋳型とし、配列番号５０と配列番号５１のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号５０（Ｐｓｐｌ７－１）
ＣＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡ
配列番号５１（Ｐｓｐｌ７－２）
ＧＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣ
配列番号５０（Ｐｓｐｌ７－１）
ＣＣＣＡＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡ
配列番号５１（Ｐｓｐｌ７－２）
ＧＧＧＡＴＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＧＡＴＡＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣ
【0119】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（SolGent co.）を用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0120】
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のｔｒｐＥの１番目のアミノ酸～３８番目の変異アミノ酸を含む前部の断片を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５２と配列番号５３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
配列番号５２（ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－１）
ＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴ
配列番号５３（ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－２）
ＧＴＧＧＴＧＡＴＡＴＣＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
配列番号５２（ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－１）
ＡＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＣＣＡＴＧＴ
配列番号５３（ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－２）
ＧＴＧＧＴＧＡＴＡＴＣＡＧＣＧＣＧＴＴＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＴＣ
【0121】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0122】
増幅したｔｒｐＥプロモーターの上流領域とｔｒｐＥの３８番目の変異の下流領域、ＳＰＬ７プロモーターとｔｒｐＥの前部の断片、及びＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－ＰＳＰＬ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0123】
作製したｐＤＺ－ＰＳＰＬ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）ベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でｔｒｐＥのプロモーターをより強いプロモーターであるＳＰＬ７プロモーターに置換し、ＴｒｐＥの３８番目のアミノ酸をセリンからアルギニンに置換した菌株を得た。遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域を増幅する配列番号５４と配列番号５５を用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＡ０４－８３２５と命名した。
配列番号５４（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－１）
ＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧ
配列番号５５（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－２）
ＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ
配列番号５４（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－１）
ＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＧ
配列番号５５（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｓｐｌ７－ｔｒｐＥ（Ｓ３８Ｒ）－２）
ＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ
【0124】
トリプトファン生産は芳香族アミノ酸代謝経路に起因し、その代謝経路はホスホエノールピルビン酸（Phosphoenolpyruvate）とエリトロース４－リン酸（Erythrose 4-phosphate）の縮合反応で始まる。よって、２種類の前駆体の円滑な供給はトリプトファンの生産向上に必須であり、相対的に不足することが知られているエリトロース４－リン酸の円滑な供給のために、ｔｋｔ遺伝子の過剰発現を行った。
【0125】
このような遺伝子操作のために、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマー配列番号５６と配列番号５７を用いて、ｔｋｔ遺伝子をさらに挿入する上流（Upstream）領域をＰＣＲにより得て、配列番号５８と配列番号５９を用いて、ｔｋｔ遺伝子をさらに挿入する下流（Downsteam）領域の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
配列番号５６（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｌ－１）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＧＴＧ
配列番号５７（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｌ－２）
ＴＣＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧ
配列番号５８（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｒ－１）
ＡＴＴＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＴＡＣ
配列番号５９（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｒ－２）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣ
配列番号５６（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｌ－１）
ＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＧＴＧ
配列番号５７（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｌ－２）
ＴＣＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧ
配列番号５８（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｒ－１）
ＡＴＴＡＡＣＧＧＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＡＣＴＡＣ
配列番号５９（Ｐｎ－ｔｋｔ＿Ｒ－２）
ＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＧＴＣ
【0126】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0127】
ｔｋｔ遺伝子とプロモーターを確保するために、野生種のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６０と配列番号６１を用いて、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子断片をＰＣＲにより得た。
配列番号６０（Ｐｎ－ｔｋｔ－１）
ＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＴＴ
配列番号６１（Ｐｎ－ｔｋｔ－２）
ＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＣＣＧＴＴＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣ
配列番号６０（Ｐｎ－ｔｋｔ－１）
ＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＡＧＴＴ
配列番号６１（Ｐｎ－ｔｋｔ－２）
ＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＧＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＣＣＧＴＴＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣ
【0128】
重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分２０秒間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
【0129】
増幅したｔｋｔ遺伝子をさらに挿入する上流領域とｔｋｔ遺伝子をさらに挿入する下流領域、ｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子、及びＳｍａＩ制限酵素で切断した染色体形質転換用ベクターｐＤＺは、ギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組換えプラスミドを得て、ｐＤＺ－Ｐｎ－ｔｋｔと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合し、その後５０℃で１時間保存することにより行った。
【0130】
作製したｐＤＺ－Ｐｎ－ｔｋｔベクターをＣＪ０４－８３２５菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上にｔｋｔプロモーターを含むｔｋｔ遺伝子を挿入した菌株を得た。当該遺伝子を挿入した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅するプライマー配列番号６２と配列番号６３を用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、それをＣＡ０４－８３５２と命名した。
配列番号６２（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｎ－ｔｋｔ－１）
ＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＡＴＴＴＴＣ
配列番号６３（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｎ－ｔｋｔ－２）
ＴＴＧＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧ
配列番号６２（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｎ－ｔｋｔ－１）
ＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＡＴＴＴＴＣ
配列番号６３（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｐｎ－ｔｋｔ－２）
ＴＴＧＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧ
【実施例10】
【0131】
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエと大腸菌由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム属微生物のトリプトファン生産
実施例７においてトリプトファンのアナログ（analogue）を用いた最小阻止濃度で優れた活性を示したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を、参考例１で作製したトリプトファン生産菌株であるＣＡ０４－８３５２に導入した。そのために、実施例２で作製したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子導入用ベクターｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈをトリプトファン生産菌株であるＣＡ０４－８３５２菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、実施例２と同様の過程を経て、トランスポゾン遺伝子の間に１コピーのヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を挿入した菌株を得た。これをＣＡ０４－８４０５と命名した。
実施例７においてトリプトファンのアナログ（analogue）を用いた最小阻止濃度で優れた活性を示したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を、参考例１で作製したトリプトファン生産菌株であるＣＡ０４－８３５２に導入した。そのために、実施例２で作製したヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子導入用ベクターｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｈｒｈをトリプトファン生産菌株であるＣＡ０４－８３５２菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、実施例２と同様の過程を経て、トランスポゾン遺伝子の間に１コピーのヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を挿入した菌株を得た。これをＣＡ０４－８４０５と命名した。
【0132】
また、大腸菌由来の遺伝子を対照群としてトリプトファン生産菌株ＣＡ０４－８３５２に導入した。実施例６で作製した大腸菌由来の遺伝子導入用ベクターｐＤＺＴｎ－ＰｇａｐＡ－Ｅｃｏをトリプトファン生産菌株であるＣＡ０４－８３５２菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、実施例６と同様の過程を経て、トランスポゾン遺伝子の間に１コピーの大腸菌由来の排出遺伝子を挿入した菌株を得た。これをＣＡ０４－８４０６と命名した。
【0133】
前記過程で作製したＣＡ０４－８４０５とＣＡ０４－８４０６は、参考例１で作製したＣＡ０４－８３５２を対照群として、トリプトファン生産量を確認するために次の方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００μｇ，チアミン塩酸塩４５００μｇ，パントテン酸カルシウム４５００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）。
種培地（ｐＨ７．０）
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース３０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １５ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，酵母抽出物５ｇ，ビオチン９００μｇ，チアミン塩酸塩４５００μｇ，パントテン酸カルシウム４５００μｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）。
【0134】
【表4】
【0135】
ＣＡ０４－８３５２、ＣＡ０４－８４０５、ＣＡ０４－８４０６における培地中のＬ－トリプトファン生産の結果を表４に示す。
【0136】
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入したＣＡ０４－８４０５菌株は、フラスコ培養において最終的に１．５２ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを生産した。これは、対照群であるＣＡ０４－８３５２菌株に比べて約５倍に向上した数値である。これは、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子がコリネバクテリウム・グルタミカム菌株においてＬ－トリプトファン生産を大幅に向上させることを意味するものである。それに対して、大腸菌由来の遺伝子を導入したＣＡ０４－８４０６菌株のトリプトファン生産量は０．２３ｇ／Ｌであり、親株であるＣＡ０４－８３５２菌株のトリプトファン生産量とほぼ同じであった。実施例７及び９における、トリプトファンとフェニルアラニンのアナログ（analogue）を用いた最小阻止濃度実験において確認されたように、大腸菌由来の遺伝子はトリプトファンよりフェニルアラニンに特異性を示す排出遺伝子であると判断される。
【0137】
前記菌株ＣＡ０４－８４０５は、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１７年８月２１日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２０９９Ｐ（ＣＡ０４－８４０５）として国際寄託した。
【実施例11】
【0138】
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムにおける細胞内トリプトファン代謝体の分析
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムトリプトファン生産菌株ＣＡ０４－８４０５においてトリプトファン排出能が向上することにより細胞内のトリプトファン濃度が低下するかを明確に確認するために、ＣＡ０４－８４０５と親株ＣＡ０４－８３５２を対象として、有機溶媒を用いた抽出方法により細胞内のトリプトファン濃度を測定した。
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入したコリネバクテリウム・グルタミカムトリプトファン生産菌株ＣＡ０４－８４０５においてトリプトファン排出能が向上することにより細胞内のトリプトファン濃度が低下するかを明確に確認するために、ＣＡ０４－８４０５と親株ＣＡ０４－８３５２を対象として、有機溶媒を用いた抽出方法により細胞内のトリプトファン濃度を測定した。
【0139】
細胞内代謝物（intracellular metabolite）の分析は、文献（非特許文献９）に記載されている方法により行った。
【0140】
まず、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＣＡ０４－８３５２及びＣＡ０４－８４０５は、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。細胞内のトリプトファン濃度は糖消費量に応じて全３段階で確認し、各段階の培養細胞は急速真空濾過（rapid vacuum filtration, Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA）により培養液から細胞を分離した。細胞が吸着したフィルターを１０ｍｌの精製水で２回洗浄し、その後５ｕＭモルホリノエタンスルホン酸（morpholine ethanesulfonic acid）及び５ｕＭメチオニンスルホン（methionine sulfone）を含有するメタノールに１０分間浸漬した。こうして得られた１．６ｍｌの細胞抽出物に１．６ｍｌのクロロホルムと０．６４ｕｌの精製水を混ぜ合わせ、その後水相（aqueous phase）のみスピンカラム（spin column）にかけてタンパク質汚染物を除去した。濾過した抽出液をキャピラリー電気泳動質量分析計（capillary electrophoresis mass spectrometry）で分析した。その結果を図１に示す。
【0141】
図１に示すように、ＣＡ０４－８４０５は、親株ＣＡ０４－８３５２と比較して細胞内のトリプトファン濃度が３３～４１％のレベルに減少することが確認された。これは、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子が発現し、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株の細胞内で生成されたトリプトファンが細胞外に円滑に排出されることにより、ＣＡ０４－８４０５菌株の細胞内トリプトファン濃度が低下したものと判断される。よって、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子は、トリプトファンに特異的な排出能を有する膜タンパク質をコードする遺伝子であることが確認された。
【0142】
参考例２：Ｌ－トリプトファンを生産するエシェリキア属微生物の作製
エシェリキア属Ｌ－トリプトファン生産菌株は、野生型の大腸菌Ｗ３１１０から開発した。Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変することによりＬ－トリプトファンの生産量が画期的に増加するかを確認するために、Ｌ－トリプトファンを生産するように作製した菌株を親株として用いた。具体的には、コリスメート（Chorismate）からのＬ－トリプトファン生産に関与するＬ－トリプトファン生合成遺伝子の（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）発現は、ＴｒｐＲにより抑制される。よって、それをコードするｔｒｐＲ遺伝子を除去した。また、Ｌ－トリプトファン生産向上に伴うＴｒｐＥポリペプチドのフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ＴｒｐＥのＮ末端から２１番目のアミノ酸であるプロリン（Proline）をセリン（Serine）に置換した（非特許文献１０）。
エシェリキア属Ｌ－トリプトファン生産菌株は、野生型の大腸菌Ｗ３１１０から開発した。Ｌ－トリプトファン排出活性を有するタンパク質が発現するように改変することによりＬ－トリプトファンの生産量が画期的に増加するかを確認するために、Ｌ－トリプトファンを生産するように作製した菌株を親株として用いた。具体的には、コリスメート（Chorismate）からのＬ－トリプトファン生産に関与するＬ－トリプトファン生合成遺伝子の（ｔｒｐＥＤＣＢＡ）発現は、ＴｒｐＲにより抑制される。よって、それをコードするｔｒｐＲ遺伝子を除去した。また、Ｌ－トリプトファン生産向上に伴うＴｒｐＥポリペプチドのフィードバック阻害（feedback inhibition）を解消するために、ＴｒｐＥのＮ末端から２１番目のアミノ酸であるプロリン（Proline）をセリン（Serine）に置換した（非特許文献１０）。
【0143】
Ｍｔｒ膜タンパク質は細胞の外部のＬ－トリプトファンを細胞内に流入させる役割を果たし、ＴｎａＡタンパク質は細胞内のＬ－トリプトファンと水分子をインドール（Indole）、ピルビン酸（pyruvate）、アンモニア（ＮＨ３）に分解する役割を果たす。よって、Ｌ－トリプトファン生産を阻害して分解するｍｔｒとｔｎａＡ遺伝子を除去した。
【0144】
このような遺伝子の除去のために、ラムダレッド組換え（λ-red recombination, 非特許文献１１）方法を用いた。ｍｔｒ遺伝子の除去のために、ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号６４と配列番号６５のプライマーを用いて、ＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅと染色体上の相同組換えが生じるｍｔｒ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された遺伝子断片（１５８０ｂｐ）をＰＣＲにより得た。ｐＫＤ４ベクターのカナマイシン抗生剤マーカーは、ターゲット遺伝子の除去及び抗生剤遺伝子挿入の確認のために用いた。ＦＲＴ部位は、ターゲット遺伝子を除去した後に抗生剤マーカーを除去する役割を果たす。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号６４（△ｍｔｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
配列番号６５（△ｍｔｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ－２）
ＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号６４（△ｍｔｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
配列番号６５（△ｍｔｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ－２）
ＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡＧＴＣＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴ
【0145】
ラムダレッドリコンビナーゼ（gam, bet, exo）を発現するｐＫＤ４６ベクターを大腸菌Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。ｐＫＤ４６ベクターの形質転換が確認された大腸菌Ｗ３１１０菌株は、３０℃でＯＤ６００が約０．１になったときに１０ｍＭのＬ－アラビノース（L-arabinose）添加により組換え酵素発現を誘導し、ＯＤ６００が約０．６になったときにコンピテントセルとして準備され、その後前記過程で得られたＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅとｍｔｒ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された線形遺伝子断片をエレクトロポレーションにより形質転換した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で生育したコロニーは、配列番号６６と配列番号６７を用いてコロニーＰＣＲを行い、７８２ｂｐの遺伝子断片が作製されるコロニーを選択した。
配列番号６６（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣ
配列番号６７（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿△ｍｔｒ－２）
ＡＡＡＴＧＴＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧ
配列番号６６（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿Ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣ
配列番号６７（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿△ｍｔｒ－２）
ＡＡＡＴＧＴＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧ
【0146】
相同組換えが生じてｍｔｒ遺伝子が除去された菌株は、カナマイシン抗生剤マーカーの除去のためにコンピテントセルとして準備され、その後ｐＣＰ２０ベクターを用いてエレクトロポレーションにより形質転換した。ｐＣＰ２０ベクターは、ＦＬＰタンパク質を発現し、カナマイシン抗生剤の両側のＦＲＴ部位を認識して染色体上に結合することにより、ＦＲＴ部位間の抗生剤マーカーを除去する。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ampicillin）と２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）を含むＬＢ固体培地で成長したｐＣＰ２０ベクター形質転換菌株を３０℃のＬＢ液体培地で１時間培養し、その後４２℃で１５時間追加培養してＬＢ固体培地に塗抹した。生育したコロニーは、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン（Ampicillin）と２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）を含むＬＢ固体培地、１２．５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地、抗生剤を含まないＬＢ固体培地に培養し、抗生剤を含まないＬＢ固体培地でのみ生育したコロニーを選択した。ゲノムシーケンシングによりｍｔｒ遺伝子の除去を最終確認し、これをＣＡ０４－９３００と命名した。
【0147】
ｔｎａＡ遺伝子の除去のために、前記方法と同様に遺伝子操作を行った。ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号６８と配列番号６９を用いて、ＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅと染色体上の相同組換えが生じるｔｎａＡ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された遺伝子断片（１５８０ｂｐ）をＰＣＲにより得た。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号６８（△ｔｎａＡ ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
配列番号６９（△ｔｎａＡ ｃａｓｓｅｔｔｅ－２）
ＴＧＴＡＧＧＧＴＡＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号６８（△ｔｎａＡ ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＴＧＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
配列番号６９（△ｔｎａＡ ｃａｓｓｅｔｔｅ－２）
ＴＧＴＡＧＧＧＴＡＡＧＡＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴ
【0148】
ｐＫＤ４６ベクターがＣＡ０４－９３００に形質転換されたことを確認し、１０ｍＭのＬ－アラビノース添加により組換え酵素を発現するＣＡ０４－９３００菌株は、エレクトロポレーションにより前記過程で得られたＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅとｔｎａＡ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された線形遺伝子断片を形質変換した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で生育したコロニーは、配列番号６６と配列番号７０を用いてコロニーＰＣＲを行い、７８７ｂｐの遺伝子断片が作製されるコロニーを選択した。
配列番号７０（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿△ｔｎａＡ－２）
ＡＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧ
配列番号７０（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿△ｔｎａＡ－２）
ＡＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧ
【0149】
相同組換えが生じてｔｎａＡ遺伝子が除去された菌株は、カナマイシン抗生剤マーカーの除去のためにコンピテントセルとして準備され、その後ｐＣＰ２０ベクターを形質転換し、ＦＬＰタンパク質の発現によりカナマイシン抗生剤マーカーが除去された菌株を作製した。ゲノムシーケンシングによりｔｎａＡ遺伝子の除去を最終確認し、これをＣＡ０４－９３０１と命名した。
【0150】
ｔｒｐＲ遺伝子の除去のために、ｐＫＤ４ベクターを鋳型とし、配列番号７１と配列番号７２のプライマーを用いて、ＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅと染色体上の相同組換えが生じるｔｒｐＲ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された遺伝子断片（１５８０ｂｐ）をＰＣＲにより得た。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号７１（△ｔｒｐＲ ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＴＡＣＡＡＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＴＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
配列番号７２（△ｔｒｐＲ ｃａｓｓｅｔｔｅ－２）
ＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴ
配列番号７１（△ｔｒｐＲ ｃａｓｓｅｔｔｅ－１）
ＴＡＣＡＡＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＴＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ
配列番号７２（△ｔｒｐＲ ｃａｓｓｅｔｔｅ－２）
ＧＣＡＴＴＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＡＣＧＴＣＴＴＡＴＣＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴ
【0151】
ｐＫＤ４６ベクターがＣＡ０４－９３０１に形質転換されたことを確認し、１０ｍＭのＬ－アラビノース添加により組換え酵素を発現するＣＡ０４－９３０１菌株は、エレクトロポレーションにより前記過程で得られたＦＲＴ－ｋａｎａｍｙｃｉｎ－ＦＲＴ ｃａｓｓｅｔｔｅとｔｒｐＲ遺伝子の両側の相同な５０ｂｐの塩基対が結合された線形遺伝子断片を形質転換した。２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ固体培地で生育したコロニーは、配列番号６６と配列番号７３のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、８３８ｂｐの遺伝子断片が作製されるコロニーを選択した。
配列番号７３（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿△ｔｒｐＲ－２）
ＡＧＧＡＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＴＴＣＡＣ
配列番号７３（Ｃｏｎｆｉｒｍ＿△ｔｒｐＲ－２）
ＡＧＧＡＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＴＴＣＡＣ
【0152】
相同組換えが生じてｔｒｐＲ遺伝子が除去された菌株は、カナマイシン抗生剤マーカーの除去のためにコンピテントセルとして準備され、その後ｐＣＰ２０ベクターを形質転換し、ＦＬＰタンパク質の発現によりカナマイシン抗生剤マーカーが除去された菌株を作製した。ゲノムシーケンシングによりｔｒｐＲ遺伝子の除去を最終確認し、これをＣＡ０４－９３０７と命名した。
【0153】
前記ＣＡ０４－９３０７菌株において、ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｒｐＥ形質を持たせるために、大腸菌Ｗ３１１０ ｇＤＮＡを鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩを含む配列番号７４、配列番号７５を用いて、ＥｃｏＲＩ配列を含むｔｒｐＥ遺伝子断片（１５７５ｂｐ）をＰＣＲにより得た。重合酵素としてはＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で２分間の変性後、９５℃で２０秒間の変性、６２℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２７サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
配列番号７４（ｔｒｐＥ－１）
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣ
配列番号７５（ｔｒｐＥ－２）
ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡ
配列番号７４（ｔｒｐＥ－１）
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＧＡＣ
配列番号７５（ｔｒｐＥ－２）
ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡ
【0154】
前記方法で得たｔｒｐＥ遺伝子及びｐＳＧ７６－Ｃプラスミド（非特許文献１２）をそれぞれＥｃｏＲＩ制限酵素で処理してクローニングした。クローニングしたプラスミドを大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーションにより形質転換し、クロラムフェニコール（chlororamphenocol）２５μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートから形質転換された大腸菌ＤＨ５αを選択してｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥプラスミドを得た。
【0155】
前述したように得たｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥプラスミドを用いて、ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Stratagene, 米国）方法により配列番号７６、配列番号７７のプライマーでｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）を作製した。
配列番号７６（ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）－１）
ＣＧＣＴＴＡＴＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧ
配列番号７７（ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）－２）
ＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＡＡＧＣＧ
配列番号７６（ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）－１）
ＣＧＣＴＴＡＴＣＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧ
配列番号７７（ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）－２）
ＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧＣＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＡＡＧＣＧ
【0156】
ＣＡ０４－９３０７菌株に前記ｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）プラスミドを形質転換してＬＢ－Ｃｍ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ｃｈｌｏｒｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ２５ｕｇ／Ｌ）培地で培養し、その後クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選択した。選択した形質転換体は、ｐＳＧ７６－Ｃ－ｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）プラスミドがゲノム内のｔｒｐＥ部分に１次挿入された菌株である。確保したｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）遺伝子を挿入した菌株に、ｐＳＧ７６－Ｃプラスミド内に存在するＩ－ＳｃｅＩ部分を切断する制限酵素Ｉ－ＳｃｅＩを発現するプラスミドであるｐＡＳｃｅｐ（非特許文献１２）を形質転換し、ＬＢ－Ａｐ（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ／Ｌ，Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ １００ｕｇ／Ｌ）で生長する菌株を選択した。選択した菌株において、配列番号７４、配列番号７５のプライマーを用いてｔｒｐＥ遺伝子を増幅し、増幅した遺伝子は、シーケンシングによりｔｒｐＥ（Ｐ２１Ｓ）に交換されたことを確認した。このように作製した菌株をＣＡ０４－４３０３と命名した。
【実施例12】
【0157】
ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入したエシェリキア属微生物のＬ－トリプトファン生産
実施例８で作製したｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈを参照例２で作製したＣＡ０４－４３０３に導入し、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子が過剰発現する形質転換体であるＣＡ０４－４３０６を作製した。また、対照群としてｐＣＬ１９２０ベクターをＣＡ０４－４３０３に形質転換した。この２つの菌株ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０、ＣＡ０４－４３０６のＬ－トリプトファン生産量を確認するために、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン（Spectinomycin）を含むＬＢ液体培地に１２時間培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに初期ＯＤ６００値が０．０１になるように接種し、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
実施例８で作製したｐＣＬ１９２０－ＰｙｃｃＡ－Ｈｒｈを参照例２で作製したＣＡ０４－４３０３に導入し、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子が過剰発現する形質転換体であるＣＡ０４－４３０６を作製した。また、対照群としてｐＣＬ１９２０ベクターをＣＡ０４－４３０３に形質転換した。この２つの菌株ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０、ＣＡ０４－４３０６のＬ－トリプトファン生産量を確認するために、５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン（Spectinomycin）を含むＬＢ液体培地に１２時間培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに初期ＯＤ６００値が０．０１になるように接種し、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－トリプトファンの生産量を測定した。
【0158】
ＣＡ０４－４３０３／ｐＣＬ１９２０とＣＡ０４－４３０６における培地中のＬ－トリプトファン生産の結果を表５に示す。ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子を導入して過剰発現したＣＡ０４－４３０６は、フラスコ培養において最終的に２．１ｇ／ＬのＬ－トリプトファンを生産した。これは、対照群に比べて約５０％向上した数値である。これは、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の排出遺伝子が大腸菌菌株においてもＬ－トリプトファンを排出し、生産を大幅に向上させることを意味するものである。
生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース７０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，酵母抽出物２．５ｇ，Ｎａ－ｃｉｔｒａｔｅ ５ｇ，ＮａＣｌ １ｇ，ＣａＣＯ３ ４０ｇ（蒸留水１リットル中）。
生産培地（ｐＨ７．０）
グルコース７０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ，ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ，酵母抽出物２．５ｇ，Ｎａ－ｃｉｔｒａｔｅ ５ｇ，ＮａＣｌ １ｇ，ＣａＣＯ３ ４０ｇ（蒸留水１リットル中）。
【0159】
【表5】
【0160】
よって、実施例７及び９の結果から分かるように、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子は、Ｌ－トリプトファン及びそのアナログに特異的に卓越した耐性を示し、実施例１０及び１２の結果から分かるように、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株と大腸菌菌株の両方においてＬ－トリプトファン生産を向上させた。また、実施例１１においては、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子が実質的に細胞の外部にトリプトファンを排出することが示された。よって、ヘルバスピリラム・リゾスファエラエ由来の遺伝子をトリプトファンエクスポーター（Tryptophan (W) exporter, wex）と命名した。
【0161】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0162】
【表6】
【図1】
【配列表】