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▶ ハルビン チェンバオ ファーマシューティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-07
(45)【発行日】2022-07-15
(54)【発明の名称】Ａｋｔ阻害剤としての塩形態及びその結晶形態
(51)【国際特許分類】
C07D 495/14 20060101AFI20220708BHJP
A61K 31/55 20060101ALI20220708BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220708BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220708BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220708BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220708BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220708BHJP
【ＦＩ】
C07D495/14 E CSP
A61K31/55
A61P3/10
A61P35/00
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P43/00 111
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020532703
(86)(22)【出願日】2018-12-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-03-04
(86)【国際出願番号】 CN2018120531
(87)【国際公開番号】W WO2019114741
(87)【国際公開日】2019-06-20
【審査請求日】2020-10-09
(31)【優先権主張番号】201711331448.1
(32)【優先日】2017-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】518045878
【氏名又は名称】ハルビン チェンバオ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】リ ガーン
(72)【発明者】
【氏名】ルー ルェン
(72)【発明者】
【氏名】ルー チンチン
(72)【発明者】
【氏名】フー リーホン
(72)【発明者】
【氏名】ディン チャールズ ズィー．
【審査官】池上 佳菜子
(56)【参考文献】
【文献】特許第６９００４０６（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２０１０－５１８１１０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ４９５／１４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式（Ｉ）の化合物。【化1】
【請求項2】
粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ値：１２．２５°±０．２°、１４．４６°±０．２°及び２１．８３°±０．２°において特徴的なピークを有する、式（Ｉ）化合物の結晶。【化1】
【請求項3】
粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ値：８．５０°±０．２°、１０．２０°±０．２°、１２．２５°±０．２°、１４．４６°±０．２°、１５．３０°±０．２°、２１．８３°±０．２°、２７．３１°±０．２°及び３１．４１°±０．２°において特徴的なピークを有する、請求項２に記載の式（Ｉ）化合物の結晶。
【請求項4】
粉末Ｘ線回折スペクトルの分析データが下記表１に示される通りである請求項２に記載の式（Ｉ）化合物の結晶。【表1】
【請求項5】
ＤＳＣ曲線は１９５．１０℃±３℃において一つの吸熱ピークの開始点を有し、且つ、２０９．２３℃±３℃において一つの放熱ピークの開始点を有する、請求項２～４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）化合物の結晶。
【請求項6】
ＴＧＡ曲線は１００．００℃±３℃の際に重量が０．２９５％減少する、請求項２～４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）化合物の結晶。
【請求項7】
赤外線吸収スペクトルが３３１６ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、３０７９ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、３０５８ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、３０１６ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９５４ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９３５ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９１５ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９０２ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２８６４ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、１７０４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１６３３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１６２３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１５８９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１５３０ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１５１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４８６ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４４５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４２９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４０８ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３９５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３７３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３５９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３４５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３３２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１２８２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１２４７ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１２１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１１７３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１１３５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１１１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１０５４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１０３０ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１０００ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、９５２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、９１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、９０２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８８３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８６１ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８３９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８２５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７８９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７６３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７３６ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７２０ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１ 及び ７０４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１において特徴的な吸収ピークを含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の式（Ｉ）化合物の結晶。
【請求項8】
悪性腫瘍、糖尿病又は関節リウマチの治療に用いる薬剤として使用するための請求項１に記載の式（Ｉ）化合物、又は請求項２～７のいずれか１項に記載の化合物（Ｉ）の結晶。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
【関連出願の相互参照】
【0002】
本出願は以下の優先権を要求する：ＣＮ２０１７１１３３１４４８．１、出願日：２０１７年１２月１３日。
【技術分野】
【0003】
本発明は、Ａｋｔ阻害剤としての塩形態及びその結晶形態に関し、具体的に、式（Ｉ）の化合物の塩形態及びその結晶形態に関し、更に、腫瘍、糖尿病及び関節リウマチを治療する薬物の製造における前記塩形態及び結晶形態の使用に関する。
【背景技術】
【0004】
プロテインキナーゼＢ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ、ＰＫＢ）とも呼ばれるＡｋｔは、分子量が約６０ ｋＤａのセリン／スレオニンプロテインキナーゼで、複数のシグナル伝達経路の重要な交差点にあり、サイトカイン、成長因子及び癌遺伝子Ｒａｓによって活性化される細胞生存シグナルを調節し、真核生物の調節ネットワークで普遍的に存在する。Ａｋｔシグナル伝達経路は、悪性腫瘍、糖尿病、関節リウマチなどの様々な疾患の発生と発症に密接に関連しているため、ますます注目を浴びている。近年、継続的な研究の深化により、人々はＡｋｔの生物学的役割をより深く理解するだけでなく、Ａｋｔシグナル伝達経路の調節機構の研究において多くの大きな進歩を遂げ、一部のヒト疾患におけるその特定の役割及びその分子調節機構は徐々に解明される。
【0005】
Ａｋｔは、Ｎ末端調節領域、中間酵素活性領域、Ｃ末端調節領域、及びＰＨ領域とキナーゼ活性領域を接続するヒンジ領域の４つの部分で構成される。Ｎ末端調節領域には血小板－白血球ｃ－キナーゼ相同領域、即ち、ＰＨ領域を有し、シグナル伝達中のその正確なメカニズムはまだ不明である。中間酵素活性領域は触媒セリン／スレオニン残基リン酸化活性を有し、その内、可変ペプチドループ（Ｔループ）のＴｈｒ３０８部位のリン酸化はＡｋｔ活性化に必要なものである。Ｃ末端にはプロリンリッチな疎水性ドメイン（ＨＭ）があり、それは、Ａｋｔの完全な活性化に必要な２番目のリン酸化部位であるＳｅｒ４７３を含む。近年、その各々のドメインが対応する結晶形態構造が連続的に解明され、主要なリン酸化部位、ＡＴＰ結合部位、及びタンパク質基質結合部位も対しても深く理解され、Ａｋｔ ／ ＰＫＢに特異的な小分子阻害剤の開発に基礎を築いた。
【0006】
現在、哺乳類には少なくとも：Ａｋｔｌ（ＰＫＢα）、Ａｋｔ２（ＰＫＢβ）及びＡｋｔ３（ＰＫＢγ）と言った３つのＡｋｔサブタイプが見つかり、これらは、染色体１４ｑ３２、１９ｑ１３及び１ｑ４３の３つの異なる遺伝子コードに位置し、８５％の配列相同性を持ち、同じくＡＧＣプロテインキナーゼファミリーに属する。マウス胚性線維芽細胞に関する研究により、異なるＡｋｔサブタイプ欠損株は最終的には下記のように異なる表現型をもたらすことを発見した：Ａｋｔ１欠損症は胎盤ジストロフィー、成長遅延及び体重減少として現れ、Ａｋｔ２欠損症はインスリン及び血糖の異常として現れ、Ａｋｔ３欠損症は脳容積の減少として現れる。ヒトの疾患では、３つのＡｋｔサブタイプの発現及び影響も大きく異なる。
【0007】
Ａｋｔは、ホルモン、成長因子、サイトカイン、細胞間マトリックスなどのさまざまな細胞内物質によって活性化される。ＡｋｔはＰＩ３Ｋ ／ Ａｋｔ経路の中央部分にあり、ＰＩ３Ｋの直接的な標的遺伝子である。多くのサイトカイン、成長因子、及び物理的刺激等はＰＩ３Ｋを活性化することによりＡｋｔをリン酸化することができる。通常、Ａｋｔリン酸化は、ＰＩ３Ｋ活性を測定する指標とされる。
【0008】
Ａｋｔの生理学的機能の研究は、その基質の発見と不可分である。今までは、１００種を超えるＡｋｔ基質が発見された。Ａｋｔの３つのサブタイプとその多様な基質は、その複数の機能を発揮する構造的基盤である。活性化されたＡｋｔは、さまざまなシグナル伝達経路を通じて下流の一連のエフェクター分子の活性化状態に影響を与え、細胞内でアポトーシスの抑制、増殖の促進などの生物学的効果を発揮している。
【0009】
Ａｋｔ経路は多くの信号経路と相互的に交差して複雑な信号ネットワークを形成する。特定の状況下では、Ａｋｔ経路はＮＦ－κＢ生存促進シグナルを活性化、又はＪＮＫ ／ ｐ３８アポトーシスシグナルを阻害するが、ｐ３８とＡｋｔの間の作用方法に関してははまだ決定的な結論はない。ＰＩ３Ｋ ／ Ａｋｔ経路とＲａｓ ／ ＭＡＰＫ経路の間の相互作用は、異なる細胞タイプ、異なる細胞分化段階、異なる実験条件で、これら２つの経路の異なる段階で明らかに現れるが、Ａｋｔ経路がＲａｓ ／ ＭＡＰＫ経路に対して正の調節か負の調節か、及び特定の細胞でどの調節方法が支配的であるかはまだ完全には明らかにされていない。Ａｋｔシグナル伝達経路は、腫瘍、関節リウマチなどの疾患の発症と進行に密接に関連し、各経路の相互的な関連と影響は共に疾患の発生に重要な役割を果たす可能性がある。
【0010】
引用文献：ＷＯ／２００８／０９８１０４，ＷＯ２００９／１５８３７１Ａ１。
【0011】
医薬活性成分の異なる固体形態は、異なる特性を有する可能性がある。異なる固体形態の特性の変化は、例えば、合成または取り扱いに容易であり、安定性及び保存期限を改善する等、改良された配合を提供することができる。異なる固体形態によって引き起こされる特性の変化は、最終の剤形を改善することもできる。医薬活性成分の異なる固体状態形態は多結晶または他の結晶形態を生成することもでき、それにより、ある固体の活性医薬成分の特性の変化を評価するより多くの機会を提供する。
【技術効果】
【0012】
本発明の式（Ｉ）化合物の塩形態及び結晶形態の調製工程が簡単で、且つ、前記結晶形態は比較的安定で、熱及び湿度に受ける影響が少なく、製剤の調製が便利である。
【発明の概要】
【0013】
本発明の一つの方面において、本発明は式（Ｉ）の化合物を提供する、
【0014】
【化1】
【0015】
本発明のもう一つの方面において、結晶形態の粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ値：１２．２５°±０．２°、１４．４６°±０．２°及び２１．８３°±０．２°において特徴的なピークを有することを特徴とする、式（I）の化合物の結晶形態を提供する。
【0016】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の粉末Ｘ線回折スペクトルは以下の２θ値：８．５０°±０．２°、１０．２０°±０．２°、１２．２５°±０．２°、１４．４６°±０．２°、１５．３０°±０．２°、２１．８３°±０．２°、２７．３１°±０．２°及び３１．４１°±０．２°において特徴的なピークを有する。
【0017】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の粉末Ｘ線回折スペクトルは図１で示される通りである。
【0018】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の粉末Ｘ線回折スペクトルの解析データは表１に示す通りである。
【0019】
【表1】
【0020】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態のＤＳＣ曲線は１９５．１０℃ ± ３℃において一つの吸熱ピークの開始点を有し、且つ、２０９．２３℃ ± ３℃において一つの放熱ピークの開始点を有する。
【0021】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態のＤＳＣ曲線は図２で示される通りである。
【0022】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態のＴＧＡ曲線は１００．００℃±３℃の際に重量が０．２９５％減少する。
【0023】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態のＴＧＡ曲線は図３で示される通りである。
【0024】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の赤外線吸収スペクトルが３３１６ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、３０７９ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、３０５８ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、３０１６ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９５４ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９３５ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９１５ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２９０２ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、２８６４ ｃｍ－１ ± ５ ｃｍ－１、１７０４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１６３３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１６２３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１５８９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１５３０ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１５１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４８６ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４４５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４２９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１４０８ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３９５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３７３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３５９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３４５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１３３２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１２８２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１２４７ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１２１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１１７３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１１３５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１１１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１０５４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１０３０ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、１０００ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、９５２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、９１４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、９０２ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８８３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８６１ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８３９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、８２５ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７８９ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７６３ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７３６ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１、７２０ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１ 及び ７０４ ｃｍ－１ ± ２ ｃｍ－１において特徴的な吸収ピークを含む。
【0025】
本発明の幾つかの実施の態様において、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の赤外線吸収スペクトルは図４で示される通りである。
【定義及び説明】
【0026】
別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語及び連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語または用語は、特別に定義されない場合、不確定または不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品またはその活性成分を指す。
【0027】
本発明の中間体化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、ほかの化学合成方法と合わせた実施形態及び当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【0028】
本発明の具体的な実施形態の化学反応は適切な溶媒で完成され、前記の溶媒は本発明の化学変化及びそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を得るため、当業者が既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択することが必要であることもある。
【0029】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の何らの制限にもならない。
【0030】
本発明に使用されたすべての溶媒は市販品で、さらに精製せずにそのままで使用してもよい。
【0031】
本発明に使用されたすべての溶媒は市販により得られる。
【0032】
本発明は下記略語を使用する：
ＴＢＴＵ：Ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート；ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＭｅＯＨ：メタノール；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２：［１、１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］二塩化パラジウム；Ｐｄ２（ｄｂａ）３：トリ（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム；ｘ－ＰＨＯＳ：２－ジシクロヘキシルホスホノ－２、４、６－トリイソプロピルビフェニル計器及び分析方法
１．１粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
計器の型番：ブルカーＤ８ａｄｖａｎｃｅＸ線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤの検出に用いる。
詳細なＸＲＰＤパラメータは下記の通りである：
Ｘ線管：Ｃｕ，ｋα，（λ＝１．５４０５６Å）．
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
センサスリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：３又は４～４０ｄｅｇ
ステップ角：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
サンプルパン回転数：１５ｒｐｍ
１．２示差熱分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
計器の型番：ＴＡ ＤＳＣ Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：サンプル（０．５～１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウム製坩堝に量り取って測定を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎＮ２条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温（２５℃）から３００℃又は３５０℃まで加熱する。
１．３熱重量分析（ＴｈｅｒｍａｌＧｒａｖｉｍｅｔｒｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
計器の型番：ＴＡＱ５０００熱重量分析計
測定方法：サンプル（２～５ｍｇ）をＴＧＡ白金坩堝に量り取り測定を行い、２５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｎ２条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温（２５℃）から３００℃、３５０℃まで、又は重量が２０％減少するまで加熱する。
１．４動的水蒸気吸着計（ＤＶＳ）
計器の型番：ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ－１ （ＳＭＳ）
測定方法：約１０～１５ｍｇのサンプルをＤＶＳの検出に用いる。
平行化 ｄｍ／ｄｔ：０．０１ ％／ｍｉｎ：（時間：１０ ｍｉｎ最大１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ＲＨ、１２０ｍｉｎ
ＲＨ （％）勾配の測定：１０％
ＲＨ （％）勾配の測定範囲：０％～９０％～０％
下記の表２は吸湿性の判定基準である：
ＴＢＴＵ：Ｏ－ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート；ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド；ＭｅＯＨ：メタノール；ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２：［１、１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］二塩化パラジウム；Ｐｄ２（ｄｂａ）３：トリ（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム；ｘ－ＰＨＯＳ：２－ジシクロヘキシルホスホノ－２、４、６－トリイソプロピルビフェニル計器及び分析方法
１．１粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）
計器の型番：ブルカーＤ８ａｄｖａｎｃｅＸ線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤの検出に用いる。
詳細なＸＲＰＤパラメータは下記の通りである：
Ｘ線管：Ｃｕ，ｋα，（λ＝１．５４０５６Å）．
管電圧：４０ｋＶ、管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
センサスリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：３又は４～４０ｄｅｇ
ステップ角：０．０２ｄｅｇ
ステップ幅：０．１２秒
サンプルパン回転数：１５ｒｐｍ
１．２示差熱分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
計器の型番：ＴＡ ＤＳＣ Ｑ２０００示差走査熱量計
測定方法：サンプル（０．５～１ｍｇ）をＤＳＣアルミニウム製坩堝に量り取って測定を行い、５０ｍＬ／ｍｉｎＮ２条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温（２５℃）から３００℃又は３５０℃まで加熱する。
１．３熱重量分析（ＴｈｅｒｍａｌＧｒａｖｉｍｅｔｒｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
計器の型番：ＴＡＱ５０００熱重量分析計
測定方法：サンプル（２～５ｍｇ）をＴＧＡ白金坩堝に量り取り測定を行い、２５ｍＬ／ｍｉｎ、Ｎ２条件で、１０℃／ｍｉｎの昇温速度で、サンプルを室温（２５℃）から３００℃、３５０℃まで、又は重量が２０％減少するまで加熱する。
１．４動的水蒸気吸着計（ＤＶＳ）
計器の型番：ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ－１ （ＳＭＳ）
測定方法：約１０～１５ｍｇのサンプルをＤＶＳの検出に用いる。
平行化 ｄｍ／ｄｔ：０．０１ ％／ｍｉｎ：（時間：１０ ｍｉｎ最大１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ＲＨ、１２０ｍｉｎ
ＲＨ （％）勾配の測定：１０％
ＲＨ （％）勾配の測定範囲：０％～９０％～０％
下記の表２は吸湿性の判定基準である：
【0033】
【表2】
【0034】
１．５高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ、ＨＰＬＣ）
計器の型番：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高速液体クロマトグラフィー
分析方法は以下の通りである：
計器の型番：Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高速液体クロマトグラフィー
分析方法は以下の通りである：
【0035】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】式（I）の化合物の結晶形態のＸＲＰＤスペクトルである。
【図2】式（I）の化合物の結晶形態のＤＳＣスペクトルである。
【図3】式（I）の化合物の結晶形態のＴＧＡスペクトルである。
【図4】式（I）の化合物の結晶形態の赤外線吸収スペクトルである。
【図5】式（I）の化合物の結晶形態の紫外線吸収スペクトルである。
【0037】
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下に具体的な実施例を参照しながら本発明をさらに説明するが、本発明の内容を制限するものではない。本文は本発明を詳細説明し、具体的な実施形態も開示したが、当業者は、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、本発明の具体的な実施形態に対して様々な変換又は改良することは自明なものである。
製造実施例
製造実施例
【0039】
【化2】
【0040】
工程１：中間体１－Ｂの合成
化合物１－Ａ（５．０ Ｋｇ、６０．９ ｍｏｌ）を無水トルエン（７ Ｌ）に溶解し、得られた溶液を５０ Ｌの反応釜に添加し、続いて、ジヒドロピラン（５．６ Ｋｇ、６０．９ ｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５０ ｍＬ）を順次に入れ、反応釜の外部温度を８０℃に設定し、一晩攪拌反応した。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、酢酸エチル（１０ Ｌ）、水（２ Ｌ）を添加し、攪拌後放置して液を分離し、有機相を水（１ Ｌ×２）で洗浄し、スピン乾燥して、中間体１－Ｂを得、淡黄色のオイル状液体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： １６７ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．６６－１．６７ （ｍ、３ Ｈ）、２．０２－２．０８ （ｍ、６ Ｈ）、３．６６－３．７２ （ｍ、１ Ｈ）、４．０３－４．０７ （ｍ、１ Ｈ）、５．３０－５．３３ （ｄｄ、Ｊ＝１０．０、２．８ Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７－７．３８ （ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、１Ｈ）。
工程２：中間体１－Ｃの合成
窒素ガスの保護下で、化合物１－Ｂ（２．０ Ｋｇ、１２．０３ ｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１２ Ｌ）に溶解し、得られた溶液を５０ Ｌの球形釜に添加し、－４０℃～－２０℃に温度を下げ、ｎ－ブチルリチウム（５．３ Ｌ、１３．２４ ｍｏｌ）を滴下し、滴下完了後、続いて当該温度下で１時間攪拌反応し、イソプロピルピナコールボレート（２．３５１ Ｋｇ、１２．６３ ｍｏｌ）を滴下し、滴下完了後、冷却浴を撤去し、続いて４０分間攪拌反応した。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、飽和塩化アンモニウム溶液（２ Ｌ）を滴下してクエンチした後、６Ｎ ＨＣｌを滴下してｐＨを５～６に調整し、２０ Ｌの水を入れ、酢酸エチル（５ Ｌ）を添加して１回抽出し、その後、再び酢酸エチル（３Ｌ）を添加して１回抽出し、有機相を合わせ、スピン乾燥して、中間体１－Ｃを得、黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２９３ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３５６ （ｓ、１２ Ｈ）、１．５４－１．５７ （ｍ、１Ｈ）、１．７０－１．７２ （ｍ、２ Ｈ）、１．９９－２．００ （ｍ、１ Ｈ）、２．０８－２．０９ （ｍ、１ Ｈ）、２．２３ （ｓ、３ Ｈ）、２．４５－２．５１ （ｍ、１ Ｈ）、３．６３－３．７０ （ｍ、１ Ｈ）、４．０２－４．０６ （ｍ、１ Ｈ）、５．８１－５．８４ （ｄｄ、Ｊ＝１０．０、２．４ Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０ （ｓ、１ Ｈ）。
工程３：中間体１－Ｄの合成
０～２０℃で、攪拌下で１－Ｃ（３．７５ Ｋｇ、１０．６４ ｍｏｌ）を塩化水素メタノール溶液（４Ｎ、１６Ｌ、６４ ｍｏｌ）に添加し、２０℃左右の温度下で一晩攪拌反応した。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、反応液を溶剤がスチームアウトしないまで濃縮し、その中に４Ｌの石油エチルを添加し、攪拌し、静置した後、上澄み液を注ぎ出し、下部の残留物を少しスピン乾燥させ、固体が析出し、ろ過し、ケーキを１．５ Ｌの酢酸エチルでスラリー化し、ろ過し、ケーキを再び１．５ Ｌの酢酸エチルでスラリー化した。ケーキを集め、ろ過液を合わせた。液体は上記操作を繰り返し、再度ケーキを集め、ケーキを合わせ、減圧乾燥して中間体１－Ｄを得、白色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２０９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ １．２２－１．４２ （ｄ、１２Ｈ）、２．２７－２．３４ （ｄ、３Ｈ）、８．０３－７．１４ （ｄ、１Ｈ）。
工程４：中間体１－Ｆの合成
２０～２５℃下で、１－Ｅ（２５０２．０５ ｇ、１０．６４ ｍｏｌ）、ＤＭＦ（１２．５ Ｌ）、トリエチルアミン（２．２４ Ｌ、１６．０９ ｍｏｌ）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（８４．００ ｇ、０．１１５ ｍｏｌ）を順次に５０Ｌの反応釜に入れ、次に反応液に窒素ガスをバブリングし、バブリングは約１０分間し、プロピニルアルコール（９４３ ｍＬ、１５．９５ ｍｏｌ）を反応釜に滴下した。窒素保護下で６０℃に昇温し、保温しながら１時間反応させ、その後８０℃に昇温し、保温しながら約６．５時間反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、室温まで温度を下げ、酢酸エチル（２０Ｌ）及び塩酸（２Ｎ、１Ｌ）を添加し、攪拌した後、液を分け、水相を再び酢酸エチル（５ Ｌ）１回抽出し、合わせた有機相に水（５ Ｌ×２）を入れて洗浄し、有機相をスピン乾燥し、残留物をシリカゲルカラム（石油エーテルから石油エーテル／酢酸エチル＝ ３／１）で溶離し、溶離液をスピン乾燥して、中間体１－Ｆを得、黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２１１ （Ｍ＋１）； １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３９ （ｔ、Ｊ＝７．１５ Ｈｚ、３ Ｈ）、１．７８ － １．８８ （ｍ、１ Ｈ）、４．３０ － ４．４２ （ｍ、２ Ｈ）、４．５０ － ４．５９ （ｍ、２ Ｈ）、７．１３ － ７．２０ （ｍ、１ Ｈ）、７．６１ － ７．７０ （ｍ、１ Ｈ）。
工程５：中間体１－Ｇの合成
１－Ｆ（４０３９．５５ ｇ、１９．１ ｍｏｌ）を２４ Ｌのエタノール（質量分率９５％）に溶解し、トリエチルアミン（２０ ｍＬ、０．１４４ ｍｏｌ）を添加して均一に混合し、この混合物を２ Ｌの水素化ボトル２０本に均等に入れた。窒素ガスの保護下で湿ったパラジウム炭素（４１９．８９ ｇ、１０％）を前記水素化ボトルに均等に分配し、水素で２回交換し、水素圧力を５０ ＰＳＩ、温度を２５℃に設定し、約３時間反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、ろ過し、ろ過液を合わせ、スピン乾燥し、残留物に０．１Ｎ塩酸（３ Ｌ）及び酢酸エチル（６ Ｌ）を添加し、攪拌した後液を分けた。有機相に無水硫酸ナトリウムを入れて乾燥させ、ろ過し、有機相をスピン乾燥して中間体１－Ｇを得、黄色のオイル状液体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２１５ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３８ （ｔ、Ｊ＝７．１５ Ｈｚ、３ Ｈ）、１．９０ － ２．０６ （ｍ、２ Ｈ）、２．９７ （ｔ、Ｊ＝７．５９ Ｈｚ、２ Ｈ）、３．７３ （ｓ、２ Ｈ）、４．３４ （ｄ、Ｊ＝７．０３ Ｈｚ、２ Ｈ）、６．８１ － ６．８９ （ｍ、１ Ｈ）、７．６１ － ７．７０ （ｍ、１ Ｈ）。
工程６：中間体１－Ｈの合成
２０～２５℃下で、５０ Ｌの反応釜にジクロロメタン（１９．６ Ｌ）、１－Ｇ（３９１６．７３ ｇ、１８．３ ｍｏｌ）及び塩化鉄（ＩＩＩ）（２９６．８３ ｇ、１．８３ ｍｏｌ）を順次的に添加し、その後１０℃以下の温度で、液体臭素（１４１５ ｍＬ、２７．５ ｍｏｌ）を反応釜に滴下し、１５～２５℃で一晩反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、水（２０ Ｌ）を入れ、攪拌した後液体を分け、有機相に飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（２０ Ｌ）を入れ、攪拌した後、液体を分け、有機相に水（２０ Ｌ）を入れ、攪拌して液体を分け、有機相に再び水（２０ Ｌ）を入れ、攪拌して液体を分けた。有機相をスピン乾燥し、残留物をシリカゲルカラム（石油エーテルから石油エーテル／酢酸エチル＝ ３／１）で溶離し、溶離液をスピン乾燥して、中間体１－Ｈを得、黄色のオイル状液体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２９５ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３６ （ｔ、Ｊ＝７．１５ Ｈｚ、３ Ｈ）、１．８８ － ２．００ （ｍ、２ Ｈ）、２．９３ （ｔ、Ｊ＝７．５９ Ｈｚ、２ Ｈ）、３．６６ － ３．７９ （ｍ、２ Ｈ）、４．３３ （ｄ、Ｊ＝７．０３ Ｈｚ、２ Ｈ）、７．５７ － ７．６６ （ｓ、１ Ｈ）。
工程７：中間体１－Ｉの合成
２０～２５℃下で、５０ Ｌの反応釜に１、４－ジオキサン（２６ Ｌ）、水（５．２ Ｌ）、１－Ｈ（３２７７．７９ ｇ、１１．１８ ｍｏｌ）、１－Ｄ（３３００．００ ｇ、１３．５０ ｍｏｌ）及び無水炭酸水素ナトリウム（２７５１．１２ ｇ、３２．７５ ｍｏｌ）を順次に添加し、その後、窒素ガスを反応溶液にバブリングし、バブリングは約１５分間し、次にｘ－ＰＨＯＳ（１０４４．０７ ｇ、２．１９ ｍｏｌ）とＰｄ２（ｄｂａ）３（１０００．００ ｇ、１．０９ ｍｏｌ）を入れ、続いて窒素ガスを約２０分間バブリングし、窒素ガスの保護下で、１１０℃で一晩反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、室温まで温度を下げ、反応溶液をろ過し、ろ過液に酢酸エチル（２２ Ｌ）及び水（２２ Ｌ）を入れ、攪拌した後、液体を分け、水相を酢酸エチル（２０ Ｌ）で１回抽出し、合わせた有機相をスピン乾燥した。残留物にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ Ｌ）及び２Ｎ塩酸（２０ Ｌ）を添加し、攪拌して液体を分け、有機相に２Ｎ塩酸（２０ Ｌ）を添加し、攪拌して液体を分け、有機相を合わせてメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ Ｌ）と石油エーテル（２．５ Ｌ）の混合液で洗浄し、水相は１０～２０℃下で、飽和炭酸ナトリウムでｐＨを７～８に調整し、大量の固体が析出した。ろ過し、固体を収集し、固体をエタノール（５ Ｌ）に溶解し、活性炭（３００ ｇ）を添加し、３０分間加熱還流した。熱い内にろ過し、ろ過液を濃縮乾燥し、残留物に酢酸イソプロピル（２ Ｌ）を入れ、６０℃に加熱し、スラリー化し、室温に冷却した。ろ過し、固体を収集し、加圧乾燥して中間体１－Ｉを得、淡黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２９５ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３９－１．４２ （ｍ、３ Ｈ）、１．９８－２．０４ （ｍ、２Ｈ）、２．１７ （ｓ、２Ｈ）、３．１６－３．２０ （ｍ、２Ｈ）、３．６４－３．６７ （ｍ、２Ｈ）、４．３５－４．４１ （ｍ、２Ｈ）、７．４３ （ｓ、１Ｈ）、７．７９ （ｓ、１Ｈ）。
工程８：中間体１－Ｊの合成
２０～２５℃下で、５０ Ｌの反応釜にジクロロメタン（１８ Ｌ）、１－Ｉ（１８９０．２４ ｇ、６．４２ ｍｏｌ）、トリエチルアミン（２７００ ｍＬ、１９．２６ ｍｏｌ）及びメタンスルホニルクロリド（１２３８ ｍＬ、１６．０５ ｍｏｌ）を順次に添加し、約０．５時間攪拌反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、４．５ Ｌの飽和塩化アンモニウム溶液を添加し、攪拌して液体を分け、水相に４．５ Ｌのジクロロメタンを入れて抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、有機相をスピン乾燥させた。残留物を５０Ｌ反応釜に移し、無水エタノール（１８ Ｌ）、ヨウ化カリウム（２１３．３４ｇ、１．２８ ｍｏｌ）及びナトリウムメトキシド（１０４１．０１ｇ、１９．２８ ｍｏｌ）を添加し、９０℃に昇温して、一晩反応させた。 ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、温度を５０～６０℃に下げ、水（１８ Ｌ）と固体水酸化ナトリウム（７７１．１２ ｇ、１９．２８ ｍｏｌ）を入れ、約３０分間攪拌反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、約２０ Ｌに減圧濃縮し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（９ Ｌ）を添加し、攪拌して液体を分け、水相にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（９ Ｌ）を入れて液体を攪拌して分け、水相に濃塩酸を入れてｐＨを３～４に調整し、大量の固体が析出し、ろ過し、固体を収集し、ケーキを水（１ Ｌ×２）及びアセトン（２．２５ Ｌ×２）で順次に洗浄し、ろ過し、減圧乾燥して中間体１－Ｊを得、淡黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２４９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ２．１４ （ｓ、３Ｈ）、２．１７－２．２１ （ｍ、２Ｈ）、３．０７－３．１１ （ｍ、２Ｈ）、４．２３－４．２５ （ｍ、２Ｈ）、７．２８ （ｓ、１Ｈ） ７．８０ （ｓ、１Ｈ）。
工程９：中間体１－Ｌの合成
２０～２５℃下で、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１１．３ Ｌ）、１－Ｊ（１４１７．９２ ｇ、５．６９ ｍｏｌ）、１－Ｋ（２００７．２９ ｇ、５．９２ ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．４８７ Ｌ、１４．２４ ｍｏｌ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に順次に添加し、固体が完全に溶解するまで攪拌した。混合液を０～５℃に冷却し、ＴＢＴＵ（２２００．２３ｇ、６．８５ｍｏｌ）をバッチに添加し、添加時の温度は２０℃を超えないように控えた。添加完了後、２０～２５℃に昇温し、保温しながら２時間攪拌した。ＨＰＬＣによって検出し、１－Ｊ含有量が０．５％以下である時、反応を停止させた。攪拌下で、２０～２５℃で酢酸エチル（３ Ｌ）及び希塩酸（０．２５ Ｎ、３４ Ｌ）を順次に添加し、大量の固体が析出され、続いて保温しながら１０分間攪拌した。ろ過し、ケーキを水（７ Ｌ×２）で洗浄し、５０ Ｌの反応釜にケーキを入れ、メタノール（１４ Ｌ）を入れてスラリー化し、遠心分離機でろ過し、ケーキは３日間自然乾燥させた。ＨＰＬＣによってケーキをを検出し、純度が９８．０％以下である時、スラリー化を繰り返した。ケーキを５０ Ｌの反応器に入れ、メタノール（３０ Ｌ）を入れてスラリー化し、遠心分離機でろ過し、ケーキを真空乾燥して中間体１－Ｌを得、白色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５２９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ２．２１ （ｓ、３Ｈ）、２．２４－２．２８ （ｍ、２Ｈ）、２．９１－２．９３ （ｍ、１Ｈ）、２．９８－３．０２ （ｍ、２Ｈ）、３．０６－３．０７ （ｍ、１Ｈ）、３．７６－３．７８ （ｍ、１Ｈ）、３．８３－３．８４ （ｍ、１Ｈ）、４．２１－４．２４ （ｍ、２Ｈ）、４．５１－４．５２ （ｍ、１Ｈ）、６．８２－６．９３ （ｍ、２Ｈ）、６．９７－７．０１ （ｍ、１Ｈ）、７．０４－７．０８（ｍ、１Ｈ）、７．２１－７．２５ （ｍ、１Ｈ）、７．４８ （ｓ、１Ｈ）、７．６７－７．６８ （ｍ、２Ｈ）、７．７６－７．７８ （ｄｄ、Ｊ＝５．２、３．０ Ｈｚ、２Ｈ）。
工程１０：中間体１－Ｍの合成
２０～２５℃下で、メタノール（２０ Ｌ）及び１－Ｌ（２２３３．２５ ｇ、４．１９ ｍｏｌ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に入れ、攪拌し、９８％のヒドラジン水和物（１０５０ ｍＬ、９８％、２４．５４ ｍｏｌ）を入れ、８０～９０℃に昇温し、１．７時間還流反応させ、大量の固体が析出した。ＨＰＬＣによって検出し、１－Ｌ含有量が０．５％以下である時、反応を停止させた。熱い内にろ過し、濾液を２０～２５℃に冷却して大量の固体が析出され、ろ過し、ケーキをメタノール（５ Ｌ）で洗浄した。濾液を元の容量の約１／５（約５ Ｌ）に濃縮した後、攪拌しながら２０ Ｌの水を前記濃縮液にゆっくりと注ぎ入れ、大量の固体が析出され、ろ過し、ケーキを水（５ Ｌ）で洗浄した。２０～２５℃で、希塩酸（１ Ｎ、２０ Ｌ）をケーキに追加し、攪拌し、ろ過し、ケーキを水（５ Ｌ）で洗浄した。ろ過液を５０ Ｌの液体セパレーターに移し、酢酸エチルとメタノールの混合溶剤（１０／１（ｖ ／ ｖ）、１１ Ｌ×２）で逆抽出した。水相を０～５℃に冷却し、攪拌しながら、炭酸水素ナトリウム固体でｐＨを８～９に調整し、大量の固体が析出し、ろ過し、ケーキを水（２ Ｌ）で洗浄し、真空乾燥させて中間体１－Ｍを得、白色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３９９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ ２．２３ （ｓ、３Ｈ）、２．２４－２．３４ （ｍ、２Ｈ）、２．８９－２．９８ （ｍ、４Ｈ）、３．０６－３．０９ （ｍ、２Ｈ）、４．２３－４．２５ （ｍ、２Ｈ）、４．２５－４．３５ （ｍ、１Ｈ）、６．９３－７．０２ （ｍ、１Ｈ）、７．０４－７．１１ （ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．２９ （ｍ、１Ｈ）、７．３３ （ｓ、１Ｈ）、７．８３ （ｓ、１Ｈ）。
工程１１：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の合成
２０～２５℃下で、メタノール（１３．２ Ｌ）と１－Ｍ（１６５４．３１ ｇ、３．９３ ｍｏｌ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に順次に入れ、８０～９０℃に昇温させ、保温しながら０．５時間攪拌した。熱い内にろ過し、濾液を再び５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に移し、８０～９０℃に昇温させ、マレイン酸メタノール溶液（５０５．９４ ｇのマレイン酸を１ Ｌのメタノールに溶解、４．３６ ｍｏｌ）に入れ、保温しながら１時間攪拌した。勾配冷却し、外部温度を６０～７０℃に保温しながら２時間攪拌し、固体が析出した。４０～５０℃で保温しながら１時間攪拌し、２０～２５℃で保温しながら１３．５時間攪拌した。ろ過し、メタノール（５００ｍＬ）でケーキを洗浄し、ケーキを真空乾燥させて、式（Ｉ）の粗生成物を得た。２０～２５℃下で、メタノール（１３ Ｌ）と式（Ｉ）の化合物（１６８０ ｇ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に入れ、保温しながら３時間攪拌し、ろ過し、ケーキをメタノール（２Ｌ）で洗浄し、真空乾燥して式（Ｉ）化合物の結晶形態を得、白色の粉末であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３９９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ ２．２３ （ｓ、３Ｈ）、２．２８－２．３９ （ｍ、２Ｈ）、２．９７－３．１３ （ｍ、４Ｈ）、３．１３－３．２９ （ｍ、２Ｈ）、４．２５ （ｂｒ ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、２Ｈ）、４．４７－４．５９ （ｍ、１Ｈ）、６．２５ （ｓ、２Ｈ）、６．９２－７．０２ （ｍ、１Ｈ）、７．０３－７．１８ （ｍ、２Ｈ）、７．３３ （ｓ、２Ｈ）、７．８０ （ｓ、１Ｈ）。
特定実施例
実施例１：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の安定性試験
１．１実験ステップ
式（Ｉ）の化合物の結晶形態を約１０ ｍｇ正確に計量し、清潔で乾燥したガラス瓶に入れ、薄層に広げ、正式の試験サンプルとした。加速試験条件（４０℃／ ７５％ＲＨ及び６０℃／ ７５％ＲＨ）に置き、サンプルを完全に露出するように置き、アルミホイルで覆い、刺して小さな穴を開けた。試験では、１０日目、１ヶ月目、２ヶ月目でサンプリングして分析した。結果は表４に示す通りであった。
１．２希釈剤及び移動相の調製
希釈剤：アセトニトリル：水（１：１）を希釈剤とした。
例えば：１００ ｍＬの純水と１００ ｍＬの純粋なアセトニトリルをガラス瓶の中で混合し、超音波で１０分間脱気し、室温まで冷却させた。
移動相Ａ：０．１％リン酸水溶液
例えば： ２．０ ｍＬのリン酸を量り取り、２０００ ｍＬの水に入れ、１０分間超音波処理し、よく混ぜ、室温になるまで放置して、移動相Ａとした。
移動相Ｂ：アセトニトリル
アセトニトリルを取り、移動相Ｂとした。
１．３対照品溶液の調製（０．２５ｍｇ／ｍＬ、遊離アルカリで計量）
０日目のサンプルを参照サンプルとして、１６ ｍＬの希釈剤を入れ、５分間超音波処理し、よく混合した。再び一倍希釈し、それぞれＳＴＤ－１及びＳＴＤ－２とマークした。
１．４感度サンプル溶液の調製
対照品溶液ＳＴＤ－１（０日目のサンプル）を取り、２０００倍に希釈して、ＬＯＱとマークした。
１．５サンプル溶液の調製（０．２５ｍｇ／ｍＬ、遊離アルカリで計量）
サンプルを取り出した後、室温に回復してから１６ｍＬの希釈剤を入れて溶解した。再び一倍を希釈して、関連物質の含有量を検出するサンプル溶液とした。
化合物１－Ａ（５．０ Ｋｇ、６０．９ ｍｏｌ）を無水トルエン（７ Ｌ）に溶解し、得られた溶液を５０ Ｌの反応釜に添加し、続いて、ジヒドロピラン（５．６ Ｋｇ、６０．９ ｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸（５０ ｍＬ）を順次に入れ、反応釜の外部温度を８０℃に設定し、一晩攪拌反応した。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、酢酸エチル（１０ Ｌ）、水（２ Ｌ）を添加し、攪拌後放置して液を分離し、有機相を水（１ Ｌ×２）で洗浄し、スピン乾燥して、中間体１－Ｂを得、淡黄色のオイル状液体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： １６７ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．６６－１．６７ （ｍ、３ Ｈ）、２．０２－２．０８ （ｍ、６ Ｈ）、３．６６－３．７２ （ｍ、１ Ｈ）、４．０３－４．０７ （ｍ、１ Ｈ）、５．３０－５．３３ （ｄｄ、Ｊ＝１０．０、２．８ Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７－７．３８ （ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、１Ｈ）。
工程２：中間体１－Ｃの合成
窒素ガスの保護下で、化合物１－Ｂ（２．０ Ｋｇ、１２．０３ ｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１２ Ｌ）に溶解し、得られた溶液を５０ Ｌの球形釜に添加し、－４０℃～－２０℃に温度を下げ、ｎ－ブチルリチウム（５．３ Ｌ、１３．２４ ｍｏｌ）を滴下し、滴下完了後、続いて当該温度下で１時間攪拌反応し、イソプロピルピナコールボレート（２．３５１ Ｋｇ、１２．６３ ｍｏｌ）を滴下し、滴下完了後、冷却浴を撤去し、続いて４０分間攪拌反応した。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、飽和塩化アンモニウム溶液（２ Ｌ）を滴下してクエンチした後、６Ｎ ＨＣｌを滴下してｐＨを５～６に調整し、２０ Ｌの水を入れ、酢酸エチル（５ Ｌ）を添加して１回抽出し、その後、再び酢酸エチル（３Ｌ）を添加して１回抽出し、有機相を合わせ、スピン乾燥して、中間体１－Ｃを得、黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２９３ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３５６ （ｓ、１２ Ｈ）、１．５４－１．５７ （ｍ、１Ｈ）、１．７０－１．７２ （ｍ、２ Ｈ）、１．９９－２．００ （ｍ、１ Ｈ）、２．０８－２．０９ （ｍ、１ Ｈ）、２．２３ （ｓ、３ Ｈ）、２．４５－２．５１ （ｍ、１ Ｈ）、３．６３－３．７０ （ｍ、１ Ｈ）、４．０２－４．０６ （ｍ、１ Ｈ）、５．８１－５．８４ （ｄｄ、Ｊ＝１０．０、２．４ Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０ （ｓ、１ Ｈ）。
工程３：中間体１－Ｄの合成
０～２０℃で、攪拌下で１－Ｃ（３．７５ Ｋｇ、１０．６４ ｍｏｌ）を塩化水素メタノール溶液（４Ｎ、１６Ｌ、６４ ｍｏｌ）に添加し、２０℃左右の温度下で一晩攪拌反応した。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、反応液を溶剤がスチームアウトしないまで濃縮し、その中に４Ｌの石油エチルを添加し、攪拌し、静置した後、上澄み液を注ぎ出し、下部の残留物を少しスピン乾燥させ、固体が析出し、ろ過し、ケーキを１．５ Ｌの酢酸エチルでスラリー化し、ろ過し、ケーキを再び１．５ Ｌの酢酸エチルでスラリー化した。ケーキを集め、ろ過液を合わせた。液体は上記操作を繰り返し、再度ケーキを集め、ケーキを合わせ、減圧乾燥して中間体１－Ｄを得、白色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２０９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ １．２２－１．４２ （ｄ、１２Ｈ）、２．２７－２．３４ （ｄ、３Ｈ）、８．０３－７．１４ （ｄ、１Ｈ）。
工程４：中間体１－Ｆの合成
２０～２５℃下で、１－Ｅ（２５０２．０５ ｇ、１０．６４ ｍｏｌ）、ＤＭＦ（１２．５ Ｌ）、トリエチルアミン（２．２４ Ｌ、１６．０９ ｍｏｌ）及びＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（８４．００ ｇ、０．１１５ ｍｏｌ）を順次に５０Ｌの反応釜に入れ、次に反応液に窒素ガスをバブリングし、バブリングは約１０分間し、プロピニルアルコール（９４３ ｍＬ、１５．９５ ｍｏｌ）を反応釜に滴下した。窒素保護下で６０℃に昇温し、保温しながら１時間反応させ、その後８０℃に昇温し、保温しながら約６．５時間反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、室温まで温度を下げ、酢酸エチル（２０Ｌ）及び塩酸（２Ｎ、１Ｌ）を添加し、攪拌した後、液を分け、水相を再び酢酸エチル（５ Ｌ）１回抽出し、合わせた有機相に水（５ Ｌ×２）を入れて洗浄し、有機相をスピン乾燥し、残留物をシリカゲルカラム（石油エーテルから石油エーテル／酢酸エチル＝ ３／１）で溶離し、溶離液をスピン乾燥して、中間体１－Ｆを得、黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２１１ （Ｍ＋１）； １Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３９ （ｔ、Ｊ＝７．１５ Ｈｚ、３ Ｈ）、１．７８ － １．８８ （ｍ、１ Ｈ）、４．３０ － ４．４２ （ｍ、２ Ｈ）、４．５０ － ４．５９ （ｍ、２ Ｈ）、７．１３ － ７．２０ （ｍ、１ Ｈ）、７．６１ － ７．７０ （ｍ、１ Ｈ）。
工程５：中間体１－Ｇの合成
１－Ｆ（４０３９．５５ ｇ、１９．１ ｍｏｌ）を２４ Ｌのエタノール（質量分率９５％）に溶解し、トリエチルアミン（２０ ｍＬ、０．１４４ ｍｏｌ）を添加して均一に混合し、この混合物を２ Ｌの水素化ボトル２０本に均等に入れた。窒素ガスの保護下で湿ったパラジウム炭素（４１９．８９ ｇ、１０％）を前記水素化ボトルに均等に分配し、水素で２回交換し、水素圧力を５０ ＰＳＩ、温度を２５℃に設定し、約３時間反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、ろ過し、ろ過液を合わせ、スピン乾燥し、残留物に０．１Ｎ塩酸（３ Ｌ）及び酢酸エチル（６ Ｌ）を添加し、攪拌した後液を分けた。有機相に無水硫酸ナトリウムを入れて乾燥させ、ろ過し、有機相をスピン乾燥して中間体１－Ｇを得、黄色のオイル状液体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２１５ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３８ （ｔ、Ｊ＝７．１５ Ｈｚ、３ Ｈ）、１．９０ － ２．０６ （ｍ、２ Ｈ）、２．９７ （ｔ、Ｊ＝７．５９ Ｈｚ、２ Ｈ）、３．７３ （ｓ、２ Ｈ）、４．３４ （ｄ、Ｊ＝７．０３ Ｈｚ、２ Ｈ）、６．８１ － ６．８９ （ｍ、１ Ｈ）、７．６１ － ７．７０ （ｍ、１ Ｈ）。
工程６：中間体１－Ｈの合成
２０～２５℃下で、５０ Ｌの反応釜にジクロロメタン（１９．６ Ｌ）、１－Ｇ（３９１６．７３ ｇ、１８．３ ｍｏｌ）及び塩化鉄（ＩＩＩ）（２９６．８３ ｇ、１．８３ ｍｏｌ）を順次的に添加し、その後１０℃以下の温度で、液体臭素（１４１５ ｍＬ、２７．５ ｍｏｌ）を反応釜に滴下し、１５～２５℃で一晩反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、水（２０ Ｌ）を入れ、攪拌した後液体を分け、有機相に飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（２０ Ｌ）を入れ、攪拌した後、液体を分け、有機相に水（２０ Ｌ）を入れ、攪拌して液体を分け、有機相に再び水（２０ Ｌ）を入れ、攪拌して液体を分けた。有機相をスピン乾燥し、残留物をシリカゲルカラム（石油エーテルから石油エーテル／酢酸エチル＝ ３／１）で溶離し、溶離液をスピン乾燥して、中間体１－Ｈを得、黄色のオイル状液体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２９５ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３６ （ｔ、Ｊ＝７．１５ Ｈｚ、３ Ｈ）、１．８８ － ２．００ （ｍ、２ Ｈ）、２．９３ （ｔ、Ｊ＝７．５９ Ｈｚ、２ Ｈ）、３．６６ － ３．７９ （ｍ、２ Ｈ）、４．３３ （ｄ、Ｊ＝７．０３ Ｈｚ、２ Ｈ）、７．５７ － ７．６６ （ｓ、１ Ｈ）。
工程７：中間体１－Ｉの合成
２０～２５℃下で、５０ Ｌの反応釜に１、４－ジオキサン（２６ Ｌ）、水（５．２ Ｌ）、１－Ｈ（３２７７．７９ ｇ、１１．１８ ｍｏｌ）、１－Ｄ（３３００．００ ｇ、１３．５０ ｍｏｌ）及び無水炭酸水素ナトリウム（２７５１．１２ ｇ、３２．７５ ｍｏｌ）を順次に添加し、その後、窒素ガスを反応溶液にバブリングし、バブリングは約１５分間し、次にｘ－ＰＨＯＳ（１０４４．０７ ｇ、２．１９ ｍｏｌ）とＰｄ２（ｄｂａ）３（１０００．００ ｇ、１．０９ ｍｏｌ）を入れ、続いて窒素ガスを約２０分間バブリングし、窒素ガスの保護下で、１１０℃で一晩反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、室温まで温度を下げ、反応溶液をろ過し、ろ過液に酢酸エチル（２２ Ｌ）及び水（２２ Ｌ）を入れ、攪拌した後、液体を分け、水相を酢酸エチル（２０ Ｌ）で１回抽出し、合わせた有機相をスピン乾燥した。残留物にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２０ Ｌ）及び２Ｎ塩酸（２０ Ｌ）を添加し、攪拌して液体を分け、有機相に２Ｎ塩酸（２０ Ｌ）を添加し、攪拌して液体を分け、有機相を合わせてメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５ Ｌ）と石油エーテル（２．５ Ｌ）の混合液で洗浄し、水相は１０～２０℃下で、飽和炭酸ナトリウムでｐＨを７～８に調整し、大量の固体が析出した。ろ過し、固体を収集し、固体をエタノール（５ Ｌ）に溶解し、活性炭（３００ ｇ）を添加し、３０分間加熱還流した。熱い内にろ過し、ろ過液を濃縮乾燥し、残留物に酢酸イソプロピル（２ Ｌ）を入れ、６０℃に加熱し、スラリー化し、室温に冷却した。ろ過し、固体を収集し、加圧乾燥して中間体１－Ｉを得、淡黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２９５ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ １．３９－１．４２ （ｍ、３ Ｈ）、１．９８－２．０４ （ｍ、２Ｈ）、２．１７ （ｓ、２Ｈ）、３．１６－３．２０ （ｍ、２Ｈ）、３．６４－３．６７ （ｍ、２Ｈ）、４．３５－４．４１ （ｍ、２Ｈ）、７．４３ （ｓ、１Ｈ）、７．７９ （ｓ、１Ｈ）。
工程８：中間体１－Ｊの合成
２０～２５℃下で、５０ Ｌの反応釜にジクロロメタン（１８ Ｌ）、１－Ｉ（１８９０．２４ ｇ、６．４２ ｍｏｌ）、トリエチルアミン（２７００ ｍＬ、１９．２６ ｍｏｌ）及びメタンスルホニルクロリド（１２３８ ｍＬ、１６．０５ ｍｏｌ）を順次に添加し、約０．５時間攪拌反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、４．５ Ｌの飽和塩化アンモニウム溶液を添加し、攪拌して液体を分け、水相に４．５ Ｌのジクロロメタンを入れて抽出し、有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、有機相をスピン乾燥させた。残留物を５０Ｌ反応釜に移し、無水エタノール（１８ Ｌ）、ヨウ化カリウム（２１３．３４ｇ、１．２８ ｍｏｌ）及びナトリウムメトキシド（１０４１．０１ｇ、１９．２８ ｍｏｌ）を添加し、９０℃に昇温して、一晩反応させた。 ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、温度を５０～６０℃に下げ、水（１８ Ｌ）と固体水酸化ナトリウム（７７１．１２ ｇ、１９．２８ ｍｏｌ）を入れ、約３０分間攪拌反応させた。ＨＰＬＣによって反応が完了したことを検出し、約２０ Ｌに減圧濃縮し、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（９ Ｌ）を添加し、攪拌して液体を分け、水相にメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（９ Ｌ）を入れて液体を攪拌して分け、水相に濃塩酸を入れてｐＨを３～４に調整し、大量の固体が析出し、ろ過し、固体を収集し、ケーキを水（１ Ｌ×２）及びアセトン（２．２５ Ｌ×２）で順次に洗浄し、ろ過し、減圧乾燥して中間体１－Ｊを得、淡黄色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ２４９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）： δ ｐｐｍ ２．１４ （ｓ、３Ｈ）、２．１７－２．２１ （ｍ、２Ｈ）、３．０７－３．１１ （ｍ、２Ｈ）、４．２３－４．２５ （ｍ、２Ｈ）、７．２８ （ｓ、１Ｈ） ７．８０ （ｓ、１Ｈ）。
工程９：中間体１－Ｌの合成
２０～２５℃下で、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１１．３ Ｌ）、１－Ｊ（１４１７．９２ ｇ、５．６９ ｍｏｌ）、１－Ｋ（２００７．２９ ｇ、５．９２ ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．４８７ Ｌ、１４．２４ ｍｏｌ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に順次に添加し、固体が完全に溶解するまで攪拌した。混合液を０～５℃に冷却し、ＴＢＴＵ（２２００．２３ｇ、６．８５ｍｏｌ）をバッチに添加し、添加時の温度は２０℃を超えないように控えた。添加完了後、２０～２５℃に昇温し、保温しながら２時間攪拌した。ＨＰＬＣによって検出し、１－Ｊ含有量が０．５％以下である時、反応を停止させた。攪拌下で、２０～２５℃で酢酸エチル（３ Ｌ）及び希塩酸（０．２５ Ｎ、３４ Ｌ）を順次に添加し、大量の固体が析出され、続いて保温しながら１０分間攪拌した。ろ過し、ケーキを水（７ Ｌ×２）で洗浄し、５０ Ｌの反応釜にケーキを入れ、メタノール（１４ Ｌ）を入れてスラリー化し、遠心分離機でろ過し、ケーキは３日間自然乾燥させた。ＨＰＬＣによってケーキをを検出し、純度が９８．０％以下である時、スラリー化を繰り返した。ケーキを５０ Ｌの反応器に入れ、メタノール（３０ Ｌ）を入れてスラリー化し、遠心分離機でろ過し、ケーキを真空乾燥して中間体１－Ｌを得、白色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ５２９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）： δ ｐｐｍ ２．２１ （ｓ、３Ｈ）、２．２４－２．２８ （ｍ、２Ｈ）、２．９１－２．９３ （ｍ、１Ｈ）、２．９８－３．０２ （ｍ、２Ｈ）、３．０６－３．０７ （ｍ、１Ｈ）、３．７６－３．７８ （ｍ、１Ｈ）、３．８３－３．８４ （ｍ、１Ｈ）、４．２１－４．２４ （ｍ、２Ｈ）、４．５１－４．５２ （ｍ、１Ｈ）、６．８２－６．９３ （ｍ、２Ｈ）、６．９７－７．０１ （ｍ、１Ｈ）、７．０４－７．０８（ｍ、１Ｈ）、７．２１－７．２５ （ｍ、１Ｈ）、７．４８ （ｓ、１Ｈ）、７．６７－７．６８ （ｍ、２Ｈ）、７．７６－７．７８ （ｄｄ、Ｊ＝５．２、３．０ Ｈｚ、２Ｈ）。
工程１０：中間体１－Ｍの合成
２０～２５℃下で、メタノール（２０ Ｌ）及び１－Ｌ（２２３３．２５ ｇ、４．１９ ｍｏｌ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に入れ、攪拌し、９８％のヒドラジン水和物（１０５０ ｍＬ、９８％、２４．５４ ｍｏｌ）を入れ、８０～９０℃に昇温し、１．７時間還流反応させ、大量の固体が析出した。ＨＰＬＣによって検出し、１－Ｌ含有量が０．５％以下である時、反応を停止させた。熱い内にろ過し、濾液を２０～２５℃に冷却して大量の固体が析出され、ろ過し、ケーキをメタノール（５ Ｌ）で洗浄した。濾液を元の容量の約１／５（約５ Ｌ）に濃縮した後、攪拌しながら２０ Ｌの水を前記濃縮液にゆっくりと注ぎ入れ、大量の固体が析出され、ろ過し、ケーキを水（５ Ｌ）で洗浄した。２０～２５℃で、希塩酸（１ Ｎ、２０ Ｌ）をケーキに追加し、攪拌し、ろ過し、ケーキを水（５ Ｌ）で洗浄した。ろ過液を５０ Ｌの液体セパレーターに移し、酢酸エチルとメタノールの混合溶剤（１０／１（ｖ ／ ｖ）、１１ Ｌ×２）で逆抽出した。水相を０～５℃に冷却し、攪拌しながら、炭酸水素ナトリウム固体でｐＨを８～９に調整し、大量の固体が析出し、ろ過し、ケーキを水（２ Ｌ）で洗浄し、真空乾燥させて中間体１－Ｍを得、白色の固体であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３９９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ ２．２３ （ｓ、３Ｈ）、２．２４－２．３４ （ｍ、２Ｈ）、２．８９－２．９８ （ｍ、４Ｈ）、３．０６－３．０９ （ｍ、２Ｈ）、４．２３－４．２５ （ｍ、２Ｈ）、４．２５－４．３５ （ｍ、１Ｈ）、６．９３－７．０２ （ｍ、１Ｈ）、７．０４－７．１１ （ｍ、２Ｈ）、７．２７－７．２９ （ｍ、１Ｈ）、７．３３ （ｓ、１Ｈ）、７．８３ （ｓ、１Ｈ）。
工程１１：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の合成
２０～２５℃下で、メタノール（１３．２ Ｌ）と１－Ｍ（１６５４．３１ ｇ、３．９３ ｍｏｌ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に順次に入れ、８０～９０℃に昇温させ、保温しながら０．５時間攪拌した。熱い内にろ過し、濾液を再び５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に移し、８０～９０℃に昇温させ、マレイン酸メタノール溶液（５０５．９４ ｇのマレイン酸を１ Ｌのメタノールに溶解、４．３６ ｍｏｌ）に入れ、保温しながら１時間攪拌した。勾配冷却し、外部温度を６０～７０℃に保温しながら２時間攪拌し、固体が析出した。４０～５０℃で保温しながら１時間攪拌し、２０～２５℃で保温しながら１３．５時間攪拌した。ろ過し、メタノール（５００ｍＬ）でケーキを洗浄し、ケーキを真空乾燥させて、式（Ｉ）の粗生成物を得た。２０～２５℃下で、メタノール（１３ Ｌ）と式（Ｉ）の化合物（１６８０ ｇ）を５０ Ｌの高温及び低温の反応釜に入れ、保温しながら３時間攪拌し、ろ過し、ケーキをメタノール（２Ｌ）で洗浄し、真空乾燥して式（Ｉ）化合物の結晶形態を得、白色の粉末であった。ＬＣＭＳ （ＥＳＩ） ｍ／ｚ： ３９９ （Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤ３ＯＤ）： δ ｐｐｍ ２．２３ （ｓ、３Ｈ）、２．２８－２．３９ （ｍ、２Ｈ）、２．９７－３．１３ （ｍ、４Ｈ）、３．１３－３．２９ （ｍ、２Ｈ）、４．２５ （ｂｒ ｄ、Ｊ＝６．０ Ｈｚ、２Ｈ）、４．４７－４．５９ （ｍ、１Ｈ）、６．２５ （ｓ、２Ｈ）、６．９２－７．０２ （ｍ、１Ｈ）、７．０３－７．１８ （ｍ、２Ｈ）、７．３３ （ｓ、２Ｈ）、７．８０ （ｓ、１Ｈ）。
特定実施例
実施例１：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の安定性試験
１．１実験ステップ
式（Ｉ）の化合物の結晶形態を約１０ ｍｇ正確に計量し、清潔で乾燥したガラス瓶に入れ、薄層に広げ、正式の試験サンプルとした。加速試験条件（４０℃／ ７５％ＲＨ及び６０℃／ ７５％ＲＨ）に置き、サンプルを完全に露出するように置き、アルミホイルで覆い、刺して小さな穴を開けた。試験では、１０日目、１ヶ月目、２ヶ月目でサンプリングして分析した。結果は表４に示す通りであった。
１．２希釈剤及び移動相の調製
希釈剤：アセトニトリル：水（１：１）を希釈剤とした。
例えば：１００ ｍＬの純水と１００ ｍＬの純粋なアセトニトリルをガラス瓶の中で混合し、超音波で１０分間脱気し、室温まで冷却させた。
移動相Ａ：０．１％リン酸水溶液
例えば： ２．０ ｍＬのリン酸を量り取り、２０００ ｍＬの水に入れ、１０分間超音波処理し、よく混ぜ、室温になるまで放置して、移動相Ａとした。
移動相Ｂ：アセトニトリル
アセトニトリルを取り、移動相Ｂとした。
１．３対照品溶液の調製（０．２５ｍｇ／ｍＬ、遊離アルカリで計量）
０日目のサンプルを参照サンプルとして、１６ ｍＬの希釈剤を入れ、５分間超音波処理し、よく混合した。再び一倍希釈し、それぞれＳＴＤ－１及びＳＴＤ－２とマークした。
１．４感度サンプル溶液の調製
対照品溶液ＳＴＤ－１（０日目のサンプル）を取り、２０００倍に希釈して、ＬＯＱとマークした。
１．５サンプル溶液の調製（０．２５ｍｇ／ｍＬ、遊離アルカリで計量）
サンプルを取り出した後、室温に回復してから１６ｍＬの希釈剤を入れて溶解した。再び一倍を希釈して、関連物質の含有量を検出するサンプル溶液とした。
【0041】
【表4】
【0042】
実験結果から、式（Ｉ）の化合物の結晶形態は高温高湿条件下で安定で、不純物含有量には基本的に変化がないことが分かった。
実施例２：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の溶解度実験
２．１実験ステップ
式（Ｉ）の化合物の結晶形態１０ ｍｇを正確に量り取ってガラス瓶に入れ、１ ｍＬの溶剤を添加し、２５±２℃で５分ごとに３０秒間激しく振とうし、３０分以内の溶解を観察した。対応するデータを記録した。
実施例２：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の溶解度実験
２．１実験ステップ
式（Ｉ）の化合物の結晶形態１０ ｍｇを正確に量り取ってガラス瓶に入れ、１ ｍＬの溶剤を添加し、２５±２℃で５分ごとに３０秒間激しく振とうし、３０分以内の溶解を観察した。対応するデータを記録した。
【0043】
ステップ２．１で溶性しなかったサンプル１ ｍｇを正確に量り取ってガラス瓶に入れ、適切な溶媒をいれ、２５±２℃で５分ごとに３０秒間激しく振とうし、３０分以内の溶解を観察した。対応するデータを記録した。
【0044】
【表5】
【0045】
【表6】
【0046】
実験結果から、式（Ｉ）の化合物の結晶形態は、ジメチルスルホキシドまたはＮ－メチルピロリドンでは溶けやすく、メタノールではやや溶けにくく、アセトニトリルまたは水ではほとんど溶けないか、不溶で； ０．１Ｎ塩酸または、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液ではほとんど溶けないか、不溶であることが分かった。
実施例３：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の吸湿性試験
実験プロセス
３つのストッパー付き乾燥ガラス製計量ボトル（外径５０ ｍｍ、高さ３０ ｍｍ）を取り、下部に塩化アンモニウムの飽和溶液を入れた乾燥機に置き、計量ボトルを開口して置き、乾燥機カーバを覆い、その後、乾燥機を２５℃の恒温器に入れ、一晩放置した。
実施例３：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の吸湿性試験
実験プロセス
３つのストッパー付き乾燥ガラス製計量ボトル（外径５０ ｍｍ、高さ３０ ｍｍ）を取り、下部に塩化アンモニウムの飽和溶液を入れた乾燥機に置き、計量ボトルを開口して置き、乾燥機カーバを覆い、その後、乾燥機を２５℃の恒温器に入れ、一晩放置した。
【0047】
計量ボトルを一晩放置した後、取り出して重量を正確に計量し、それぞれｍ１１、ｍ１２、ｍ１３とした。
【0048】
適量の式（Ｉ）の化合物の結晶形態を取り出し、既に重量を正確に計量した計量ボトルに平らに敷き（サンプルの厚さは約１ｍｍ）、次に重量を正確に量り、それぞれｍ２１、ｍ２２、ｍ２３とした。
【0049】
計量ボトルを開口して、蓋と一緒に底に塩化アンモニウム飽和溶液を入れた乾燥機に入れ、計量ボトルを開口して置き、乾燥機カーバを覆い、その後、乾燥機を２５℃の恒温器に入れ、２４時間放置した。
【0050】
２４時間放置した後、計量ボトルの蓋をよく締め、その後取り出して重量を正確に計量し、それぞれｍ３１、ｍ３２、ｍ３３とマークした。
【0051】
吸湿重量増加を計算し、計算式は以下の通りであった：
重量増加率＝１００％×（ｍ３－ｍ２）／（ｍ２－ｍ１）
重量増加率＝１００％×（ｍ３－ｍ２）／（ｍ２－ｍ１）
【0052】
【表7】
【0053】
吸湿性試験の結果によると、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の吸湿平均値は０．０７％＜０．２％であり、その故、式（Ｉ）の化合物の結晶形態は吸湿性がないか、ほとんどない。
【0054】
実施例４：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の赤外線吸収試験
計器：Ｎｉｃｏｌｅｔ ６７００ ＦＴ－ＩＲ型赤外線分光計
方法：ＡＴＲ全反射減衰法
式（Ｉ）の化合物の結晶形態サンプルの赤外線吸収スペクトルは図４を参照する。
計器：Ｎｉｃｏｌｅｔ ６７００ ＦＴ－ＩＲ型赤外線分光計
方法：ＡＴＲ全反射減衰法
式（Ｉ）の化合物の結晶形態サンプルの赤外線吸収スペクトルは図４を参照する。
【0055】
【表8】
【0056】
赤外線スペクトル分析：
１） ３３１６ ｃｍ－１：Ｎ－Ｈ伸縮振動；１７０４～１６２３ ｃｍ－１：Ｃ＝Ｏ伸縮振動；１３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｎ伸縮振動；９５２～７０４ ｃｍ－１：Ｎ－Ｈ面外変角振動；本製品の構造にアミドが含まれていることを証明した；
２） ３０７９，３０５８，３０１６ ｃｍ－１：＝Ｃ－Ｈ伸縮振動；１７０４～１４４５ ｃｍ－１： Ｃ＝Ｃ及びＣ＝Ｎ 伸縮振動；１３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｈ面内変角振動；９５２～７０４ ｃｍ－１：＝Ｃ－Ｈ面外変角振動；本製品の構造にベンゼン環、芳香族複素環、アルケニル基が含まれていることを証明した；
３） ２９５４～２８６４ ｃｍ－１：Ｃ－Ｈ対称及び非対称の伸縮振動；１４８６～１３７３ ｃｍ－１：Ｃ－Ｈ変角振動；本製品の構造に－ＣＨ－、－ＣＨ２－和－ＣＨ３構造が含まれていることを証明した；
４） ３３１６～２８６４ ｃｍ－１：ＮＨ３ ＋の伸縮振動；１３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｎ伸縮振動；９５２～７０４ ｃｍ－１：Ｎ－Ｈ伸縮振動；本製品の構造にアミン塩が含まれていることを証明した；１６３３～１５３０ ｃｍ－１：カルボン酸塩の逆対称伸縮振動；１４４５～１３９５ ｃｍ－１：カルボン酸塩の対称伸縮振動；本製品の構造にカルボン酸塩が含まれていた；
５） １３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｆ伸縮振動；本製品の構造にＣ－Ｆ結合が含まれていることを証明した；
エラー範囲は《中国薬局方》の規定を満たした、即ち、３０００ ｃｍ－１の付近に±５ ｃｍ－１の許容誤差が存在することができ、１０００ ｃｍ－１の付近に±２の許容誤差が存在することができた。
１） ３３１６ ｃｍ－１：Ｎ－Ｈ伸縮振動；１７０４～１６２３ ｃｍ－１：Ｃ＝Ｏ伸縮振動；１３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｎ伸縮振動；９５２～７０４ ｃｍ－１：Ｎ－Ｈ面外変角振動；本製品の構造にアミドが含まれていることを証明した；
２） ３０７９，３０５８，３０１６ ｃｍ－１：＝Ｃ－Ｈ伸縮振動；１７０４～１４４５ ｃｍ－１： Ｃ＝Ｃ及びＣ＝Ｎ 伸縮振動；１３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｈ面内変角振動；９５２～７０４ ｃｍ－１：＝Ｃ－Ｈ面外変角振動；本製品の構造にベンゼン環、芳香族複素環、アルケニル基が含まれていることを証明した；
３） ２９５４～２８６４ ｃｍ－１：Ｃ－Ｈ対称及び非対称の伸縮振動；１４８６～１３７３ ｃｍ－１：Ｃ－Ｈ変角振動；本製品の構造に－ＣＨ－、－ＣＨ２－和－ＣＨ３構造が含まれていることを証明した；
４） ３３１６～２８６４ ｃｍ－１：ＮＨ３ ＋の伸縮振動；１３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｎ伸縮振動；９５２～７０４ ｃｍ－１：Ｎ－Ｈ伸縮振動；本製品の構造にアミン塩が含まれていることを証明した；１６３３～１５３０ ｃｍ－１：カルボン酸塩の逆対称伸縮振動；１４４５～１３９５ ｃｍ－１：カルボン酸塩の対称伸縮振動；本製品の構造にカルボン酸塩が含まれていた；
５） １３５９～１０００ ｃｍ－１：Ｃ－Ｆ伸縮振動；本製品の構造にＣ－Ｆ結合が含まれていることを証明した；
エラー範囲は《中国薬局方》の規定を満たした、即ち、３０００ ｃｍ－１の付近に±５ ｃｍ－１の許容誤差が存在することができ、１０００ ｃｍ－１の付近に±２の許容誤差が存在することができた。
【0057】
赤外スペクトルにより、本製品の構造には、アミド、ベンゼン環、芳香族複素環、アルケニル基、－ＣＨ－、－ＣＨ２－、－ＣＨ３、アミン塩、カルボン酸塩、及びＣ－Ｆ結合構造が含まれていることが分かった。前記ＩＲスペクトルの結果は、式（Ｉ）の化合物の結晶形態の構造と一致した。
実施例５：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の紫外線吸収試験
計器：Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外可視分光光度計
溶剤： メタノール／純水＝１／１（ｖ／ｖ）
母液： １０．１９８ ｍｇの式（Ｉ）の化合物の結晶形態サンプルを量り取り、１００ ｍＬのメスフラスコに入れ、希釈剤（メタノール／純水＝ １／１（ｖ ／ ｖ））で完全に溶解し、マークしたところまで希釈し、よく振った。
実施例５：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の紫外線吸収試験
計器：Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３紫外可視分光光度計
溶剤： メタノール／純水＝１／１（ｖ／ｖ）
母液： １０．１９８ ｍｇの式（Ｉ）の化合物の結晶形態サンプルを量り取り、１００ ｍＬのメスフラスコに入れ、希釈剤（メタノール／純水＝ １／１（ｖ ／ ｖ））で完全に溶解し、マークしたところまで希釈し、よく振った。
【0058】
サンプル溶液：２．２ ｍＬの母液を量り取り、１０ ｍＬのメスフラスコに入れ、希釈液（メタノール／純水＝ １／１（ｖ ／ ｖ））でマークしたところまで希釈し、よく振って、４．３６０１×１０－５ ｍｏｌ ／ Ｌ濃度のサンプル溶液を得た。
【0059】
測定波長：２００～７００ ｎｍ
メタノールにおけるサンプルの紫外スペクトルは図５に示した。
メタノールにおけるサンプルの紫外スペクトルは図５に示した。
【0060】
【表9】
【0061】
メタノール溶液において、λｍａｘ＝ ２０８ ｎｍは芳香族複素環のＥバンドの特徴吸収で、λｍａｘ＝ ２４８ ｎｍは芳香環のＢバンドの特徴吸収で、λｍａｘ＝ ３００ ｎｍは芳香環のＫバンドの特徴吸収であった。
活性テスト
実施例１：式（Ｉ）の化合物の結晶形態のＡＫＴ酵素活性テスト
ＡＫＴは、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれ、セリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼで、主にＡＫＴ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３を含む。ＡＫＴシグナル伝達経路は、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖転写及び細胞移動などのさまざまな細胞プロセスで重要な役割を果たす。本研究は、ＡＫＴファミリーメンバーのキナーゼ活性に対する式（Ｉ）の化合物の結晶形態の阻害効果を分析することを目標とした。
活性テスト
実施例１：式（Ｉ）の化合物の結晶形態のＡＫＴ酵素活性テスト
ＡＫＴは、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれ、セリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼで、主にＡＫＴ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３を含む。ＡＫＴシグナル伝達経路は、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖転写及び細胞移動などのさまざまな細胞プロセスで重要な役割を果たす。本研究は、ＡＫＴファミリーメンバーのキナーゼ活性に対する式（Ｉ）の化合物の結晶形態の阻害効果を分析することを目標とした。
【0062】
試薬及び消耗品：
ＵＬｉｇｈｔ－ＣＲＥＢｔｉｄｅ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴＲＦ０１０７－Ｍ、ロット：２０３５７００）
Ｅｕｒｏｐｉｕｍ－Ａｎｔｉ－Ｐ－ＣＲＥＢ（Ｓｅｒ－１３３）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴＲＦ０２００－Ｍ、ロット：２００２３９１）
ＬＡＮＣＥ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、１０＊ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＣＲ９７－１００）
ＡＴＰ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＶ３２２７）
Ａｋｔ１ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、ロット：１１６２９９２８Ｃ）
Ａｋｔ２ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、ロット：２８８７０ＧＧ）
Ａｋｔ３ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、ロット：１７１５０５０Ｂ）
３８４ヴェルプレート＿検出プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００７２９９）
実験原理：
本実験では、ホモジニアスな時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＬＡＮＣＥ ＴＲ－ＦＲＥＴ（登録商標））方法を使用して、検出プレートで酵素、ビオチン標識のペプチド基質、及び検出化合物を混合し、ＡＴＰを添加して反応を開始し、インキュベーションした。反応後、ＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、同時に、Ｅｕ標識抗体を添加して反応させ、検出を行った。検出プレートはＰＥ社のＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して分析し、分析モードはＴＲ－ＦＲＥＴで、データはそれぞれ６６５ ｎｍと６１５ ｎｍの蛍光シグナルの読み取り値で表した。ここで、６６５ ｎｍ ／ ６１５ ｎｍの高い比率は高い活性を示し、６６５ ｎｍ ／ ６１５ ｎｍの低い比率は活性が抑制されていることを示した。
ＵＬｉｇｈｔ－ＣＲＥＢｔｉｄｅ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴＲＦ０１０７－Ｍ、ロット：２０３５７００）
Ｅｕｒｏｐｉｕｍ－Ａｎｔｉ－Ｐ－ＣＲＥＢ（Ｓｅｒ－１３３）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＴＲＦ０２００－Ｍ、ロット：２００２３９１）
ＬＡＮＣＥ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、１０＊ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＣＲ９７－１００）
ＡＴＰ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＶ３２２７）
Ａｋｔ１ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、ロット：１１６２９９２８Ｃ）
Ａｋｔ２ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、ロット：２８８７０ＧＧ）
Ａｋｔ３ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、ロット：１７１５０５０Ｂ）
３８４ヴェルプレート＿検出プレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ６００７２９９）
実験原理：
本実験では、ホモジニアスな時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＬＡＮＣＥ ＴＲ－ＦＲＥＴ（登録商標））方法を使用して、検出プレートで酵素、ビオチン標識のペプチド基質、及び検出化合物を混合し、ＡＴＰを添加して反応を開始し、インキュベーションした。反応後、ＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、同時に、Ｅｕ標識抗体を添加して反応させ、検出を行った。検出プレートはＰＥ社のＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して分析し、分析モードはＴＲ－ＦＲＥＴで、データはそれぞれ６６５ ｎｍと６１５ ｎｍの蛍光シグナルの読み取り値で表した。ここで、６６５ ｎｍ ／ ６１５ ｎｍの高い比率は高い活性を示し、６６５ ｎｍ ／ ６１５ ｎｍの低い比率は活性が抑制されていることを示した。
【0063】
実験方法：
化合物の調製：試験化合物及び参照化合物を１００％ＤＭＳＯで希釈し、化合物の開始濃度は１０μＭで、３倍の勾配で１０個の濃度に希釈した。化合物を細胞プレートに移し、二つの繰り返し実験を設置した。
化合物の調製：試験化合物及び参照化合物を１００％ＤＭＳＯで希釈し、化合物の開始濃度は１０μＭで、３倍の勾配で１０個の濃度に希釈した。化合物を細胞プレートに移し、二つの繰り返し実験を設置した。
【0064】
キナーゼの検出：酵素と基質をあらかじめ調製した異なる濃度の化合物と混合し、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３キナーゼの最終濃度はそれぞれ１．２５ ｎＭ、２ ｎＭ、２ ｎＭであった。室温で１５分間放置し、各濃度当たり二つの繰り返し実験を設置した。ＡＴＰをＡｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３キナーゼ反応に添加し、最終濃度は、それぞれ３６μＭ、３６０μＭ、及び１６０μＭで、室温で９０分間反応させた（ここで、陰陽性対照を設定）。反応終了後、抗体を添加して検出し、室温で６０分間インキュベーションした後、Ｅｖｎｖｉｓｉｏｎで検出し、データを収集した。＊Ｌｆｉｔ５ソフトウェアに基づき、データ分析と描画を実行した。
【0065】
実験結果：表１０を参考。
【0066】
【表10】
【0067】
本実験の結果は、式（Ｉ）の化合物の結晶形態はＡＫＴ１、ＡＫＴ２及びＡＫＴ３キナーゼ活性に対していずれも強い阻害効果を有し、その中で阻害効果が最も有意なのはＡＫＴ１キナーゼ活性に対する阻害であることを示した。
実施例２：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の細胞活性テスト
この実験は、式（Ｉ）の化合物の結晶形態が、ＡＫＴを過剰発現する前立腺癌細胞ＬＮＣａＰに対する阻害効果を研究することを目的とした。
実施例２：式（Ｉ）の化合物の結晶形態の細胞活性テスト
この実験は、式（Ｉ）の化合物の結晶形態が、ＡＫＴを過剰発現する前立腺癌細胞ＬＮＣａＰに対する阻害効果を研究することを目的とした。
【0068】
試薬及び消耗品：
１． 細胞培養：ＲＰＭＩ－１６４０培地、ウシ胎児血清、Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＤＰＢＳ
２． 細胞株：ＬＮＣａＰ
３． 検出試薬：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ生細胞検出キット
４． その他の主な消耗品と試薬：化合物希釈プレート、中間プレート、検出プレート、ＤＭＳＯ
実験原理：
ＡＴＰの含有量は細胞の数及び状態を直接反映し、ＡＴＰを定量測定することにより生細胞数を検出することができる。生細胞検出キットにはルシフェラーゼとその基質が含まれ、ＡＴＰの参与を通じて、ルシフェラーゼは基質を触媒作用を及ぼし、安定した光信号を発することができ、信号の強度を検出することにより、細胞内のＡＴＰ量を検出する。ここで、光信号は細胞内のＡＴＰの量に正比例し、また、ＡＴＰは生細胞数に正の相関があるため、細胞の増殖状況を検出することができる。検出プレートは、ＰＥ会社のＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して分析した。
１． 細胞培養：ＲＰＭＩ－１６４０培地、ウシ胎児血清、Ａｃｃｕｔａｓｅ、ＤＰＢＳ
２． 細胞株：ＬＮＣａＰ
３． 検出試薬：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ生細胞検出キット
４． その他の主な消耗品と試薬：化合物希釈プレート、中間プレート、検出プレート、ＤＭＳＯ
実験原理：
ＡＴＰの含有量は細胞の数及び状態を直接反映し、ＡＴＰを定量測定することにより生細胞数を検出することができる。生細胞検出キットにはルシフェラーゼとその基質が含まれ、ＡＴＰの参与を通じて、ルシフェラーゼは基質を触媒作用を及ぼし、安定した光信号を発することができ、信号の強度を検出することにより、細胞内のＡＴＰ量を検出する。ここで、光信号は細胞内のＡＴＰの量に正比例し、また、ＡＴＰは生細胞数に正の相関があるため、細胞の増殖状況を検出することができる。検出プレートは、ＰＥ会社のＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して分析した。
【0069】
実験方法：
１．細胞プレートの製造
各ウェルに１０００個の細胞が含まれるように、ＬＮＣａＰ細胞を３８４ウェルプレートに接種した。細胞プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、一晩培養した。
１．細胞プレートの製造
各ウェルに１０００個の細胞が含まれるように、ＬＮＣａＰ細胞を３８４ウェルプレートに接種した。細胞プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、一晩培養した。
【0070】
２．化合物の準備
Ｂｒａｖｏを利用して３倍の勾配で１０個の濃度に希釈し、二つの繰り返し実験を設置した。
Ｂｒａｖｏを利用して３倍の勾配で１０個の濃度に希釈し、二つの繰り返し実験を設置した。
【0071】
３．細胞を化合物で処理
化合物を細胞プレートに移し、化合物の開始濃度は１０μＭのであった。細胞プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、３日間インキュベートした。
化合物を細胞プレートに移し、化合物の開始濃度は１０μＭのであった。細胞プレートを二酸化炭素インキュベーターに入れ、３日間インキュベートした。
【0072】
４．検出
細胞プレートにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を添加し、室温で１０分間培養して、発光シグナルを安定化させた。 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルアナライザーを利用してデータを読み取った。
細胞プレートにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を添加し、室温で１０分間培養して、発光シグナルを安定化させた。 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎマルチラベルアナライザーを利用してデータを読み取った。
【0073】
実験結果：表１１を参照する。
【0074】
【表11】
【0075】
本実験は以下の結果を示した。即ち、式（Ｉ）の化合物の結晶形態はＡＫＴ過剰発現の細胞ＬＮＣａＰの成長に有意な抑制効果を有した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】