▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイトの特許一覧
特許7102012Ｒａｌ ＧＴＰアーゼを標的とする抗癌化合物及びそれを使用する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-08
(45)【発行日】2022-07-19
(54)【発明の名称】Ｒａｌ ＧＴＰアーゼを標的とする抗癌化合物及びそれを使用する方法
(51)【国際特許分類】
A61P 35/00 20060101AFI20220711BHJP
A61K 31/4162 20060101ALI20220711BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220711BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220711BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220711BHJP
C07D 491/052 20060101ALN20220711BHJP
【ＦＩ】
A61P35/00
A61K31/4162
A61P35/04
A61P43/00 111
A61K45/00
C07D491/052
【請求項の数】
16
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020036345
(22)【出願日】2020-03-04
(62)【分割の表示】P 2017500822の分割
【原出願日】2015-07-10
(65)【公開番号】P2020105195
(43)【公開日】2020-07-09
【審査請求日】2020-03-05
(31)【優先権主張番号】62/022,946
(32)【優先日】2014-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】509001010
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ コロラド，ア ボディ コーポレイト
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】セオドレスク ダン
(72)【発明者】
【氏名】ウェンペ マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ロス デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】ヤン チャオ
(72)【発明者】
【氏名】リーガン フィリップ
【審査官】東 裕子
(56)【参考文献】
【文献】特許第６６７２２５５（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】File REGISTRY [online]，CAS Registry No. 311326-67-7，6-Amino-1,4-dihydro-3-methyl-4-[4[(trifluoromethyl)phenyl]pyrano[2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile，STN International，Entered STN: 27 Dec 2000
【文献】File REGISTRY [online]，CAS Registry No. 309920-83-0，Pyrano [2,3-c]pyrazole-5-carbonitrile, 6-amino-1,4-dihydro-3-phenyl-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl)]-，STN International，Entered STN: 20 Dec 2000
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ
Ｃ０７Ｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学構造：【化1】
Ｒ１は、水素、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換されたＣ６～Ｃ１２アリール、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、Ｃ ６～Ｃ１２アリール、置換されたＣ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、－Ｏ－Ｒ８、－Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ３は、独立して、水素、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、イミダゾール、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換されたＣ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、－Ｏ－Ｒ８、－Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ４及びＲ７は、独立して、水素、ハロゲン、－ＯＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、イミダゾール、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換されたＣ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、置換されたＣ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、－Ｏ－Ｒ８、－Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択されるか、又は
Ｒ３及びＲ４は、共にシクロヘキサン又は１，４－ジオキサンを形成し、
Ｒ５及びＲ６は、独立して、水素及びアルコキシから選択され、
Ｒ８は、ハロゲン、酸素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキルであり、
但し、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ７の少なくとも１つは、ハロゲンで置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１～Ｃ１２アルコキシ、及びイミダゾールから選択されるか、又は、Ｒ３～Ｒ７の少なくとも３つは独立してハロゲン又はＣ１～Ｃ１２アルコキシである、
を有する化合物、又はその薬学的に許容可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体若しくは塩、及び少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤、
を含む医薬組成物。
【請求項2】
Ｒ３、Ｒ４、及びＲ７の少なくとも１つは、ハロゲンで置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル、ハロゲンで置換されたＣ１～Ｃ１２アルコキシである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
Ｒ３～Ｒ７の少なくとも３つは独立してハロゲンである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
Ｒ３、Ｒ４及びＲ７の少なくとも１つは、独立して－ＣＦ３又はＯＣＦ３である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
Ｒ３及びＲ４は、共にシクロヘキサン又は１，４－ジオキサンを形成する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
Ｒ３～Ｒ７の少なくとも３つはメトキシである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
Ｒ３～Ｒ７の少なくとも１つは水素である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
Ｒ３、Ｒ４及びＲ７の少なくとも１つは、イミダゾールである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
Ｒ３はイミダゾールである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記化合物が、【化2】
【請求項11】
癌の予防、治療、改善、又は癌の転移予防のための、請求項１～１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項12】
治療有効量の該化合物を含む単相医薬組成物である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
治療有効量の該化合物を含む、非経口投与に適した、請求項１～１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項14】
治療有効量の該化合物を含む、経口投与に適した、請求項１～１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記医薬組成物が、１つ以上のＩ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴアーゼ－Ｉ）阻害剤、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、又はそれらの組合せと併せて投与されることによって更に特徴付けられる、請求項１～１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項16】
癌の治療のための医薬の製造における請求項１～１５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［政府利益］
本発明は、米国立衛生研究所により付与された認可番号ＣＡ０９１８４６、ＣＡ０７５１１５及びＣＡ１０４１０６の下で政府による支援を受けている。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、米国立衛生研究所により付与された認可番号ＣＡ０９１８４６、ＣＡ０７５１１５及びＣＡ１０４１０６の下で政府による支援を受けている。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【0002】
本発明は、治療用化合物と、それを含有する医薬組成物と、癌の治療におけるそれらの使用とに関する。
【背景技術】
【0003】
Ｒａｓは、癌において任意の他の癌遺伝子よりも高頻度で突然変異している。このことから、合理的に設計された抗癌薬の開発の上でＲａｓが注目されているが、これまでのところ開発には成功していない。１９８９年に、幾つかのグループがＲａｓタンパク質のファルネシル脂質による翻訳後修飾がＲａｓ膜結合及び形質転換に必須であることを示した。続いてファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＴアーゼ）が精製され、特性決定されてその後間もなく、Ｒａｓをゲラニルゲラニル脂質で修飾する第２のプレニルトランスフェラーゼ、Ｉ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴアーゼ－Ｉ）が発見された。ＧＧＴアーゼ－Ｉ阻害剤（ＧＧＴＩ）が研究され、少なくとも１つのかかる阻害剤、ＧＧＴＩ－２４１７が、ＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏ成長及び生存を阻害することが分かっている。しかしながら、これらの阻害効果はあまり大きくなく、ＧＧＴＩによる臨床試験は行われていない。
【0004】
Ｒａｌ（Ｒａｓ様）ＧＴＰアーゼはＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーのメンバーであり、活性型ＧＴＰ結合状態及び不活性型ＧＤＰ結合状態の間を循環する分子スイッチとして機能し、ＲａｌからのＧＤＰの放出を促進し、ＧＴＰをその位置に結合させるＲａｌ特異的グアニンヌクレオチド交換因子（Ｒａｌ－ＧＥＦ）ファミリーの１つとの相互作用によって活性化される。Ｒａｌ－ＧＥＦはＲａｆ及びホスホイノシチド－３－キナーゼ（ＰＩ３－Ｋ）とともに、細胞内のＲａｓタンパク質との結合によって活性が調節される３つの既知のタンパク質群を構成する。Ｒａｌ－ＧＴＰアーゼはヒトＲａｓと４６％～５１％の同一性を有し、Ｒａｓシグナル伝達及びＲａｓ発癌の重要な構成要素であり、腫瘍中の突然変異Ｒａｓの重要なエフェクターである（非特許文献１）。Ｒａｌ ＧＴＰアーゼはまた、癌患者の主な死亡原因である腫瘍転移と高度に関与する。したがって、Ｒａｌタンパク質はＲａｓと同様、治療的介入にとって臨床的に重要な標的である。しかし、臨床的に有用なＲａｓ又は任意の他のＧＴＰアーゼの阻害剤が得られないことから、この標的ファミリーが治療上の課題であることが示唆される。この理由の１つは、グアニンヌクレオチドＧＤＰ／ＧＴＰとのそれらの高い親和性及び細胞内でこれらのヌクレオチドがミリモル濃度であることから、小Ｇタンパク質の活性部位を阻害のために直接標的化することができないことである。しかしながら、Ｒａｓ及び他のＧＴＰアーゼとは異なり、ヒト癌又は癌細胞株におけるＲａｌＡ又はＲａｌＢの突然変異は稀であり（１％未満）、Ｒａｌの標的化は効果的な抗癌治療法の開発に実行可能なアプローチである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Genes & Cancer 2011 2(3):275-287
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、Ｒａｌ ＧＴＰアーゼは固形腫瘍及びこれらの癌の転移の防止及び治療の強力な（compelling）治療標的であり、癌の治療に効果的なＲａｌ ＧＴＰアーゼ阻害方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明はＲａｌ ＧＴＰアーゼに結合して効果的に阻害する小分子と、それを使用する治療法とを提供する。本発明者らの発見は、活性型ではなく不活性型のタンパク質立体構造において、ヌクレオチド結合ポケットとは異なる利用可能な部位を同定するコンピューター分析に基づくものであった。このポケットへの小分子の分子ドッキングに続く実験的検証により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでそのエフェクターＲａｌＢＰ１へのＲａｌの結合、ネズミ線維芽細胞におけるＲａｌ媒介細胞拡散及びヒト癌細胞株の足場非依存性成長を阻害する少なくとも３つの化合物が得られた。２つの化学的に関連した化合物の送達から、ｉｎ
ｖｉｖｏで有利な薬物動態及び腫瘍薬物の取込みが示された。これらの化合物の誘導体の合成により本発明の化合物がもたらされ、そのＲａｌＢへの結合を表面プラズマ共鳴及び１５Ｎ－ＨＳＱＣ ＮＭＲによって確認した。これらの化合物は異種移植成長をｓｉＲＮＡ Ｒａｌ枯渇と同程度まで阻害する。
ｖｉｖｏで有利な薬物動態及び腫瘍薬物の取込みが示された。これらの化合物の誘導体の合成により本発明の化合物がもたらされ、そのＲａｌＢへの結合を表面プラズマ共鳴及び１５Ｎ－ＨＳＱＣ ＮＭＲによって確認した。これらの化合物は異種移植成長をｓｉＲＮＡ Ｒａｌ枯渇と同程度まで阻害する。
【0008】
本発明の化合物は、ヒト腫瘍異種移植片においてＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方の活性を同様に阻害する。腫瘍形成及び転移におけるＲａｌＡ及びＲａｌＢの異なる、場合によっては拮抗的な役割が提唱されているが、遺伝マウスモデルにより発生及び腫瘍形成の両方における相当な重複が明らかになった。これらの研究から、ＲａｌＡ及びＲａｌＢ ＧＴＰアーゼの両方を阻害する化合物の重要性及び臨床的有用性が支持される。
【0009】
本発明の化合物は僅かなオフターゲット効果でＲａｌに対して選択的であり、Ｒａｌ ｓｉＲＮＡによって誘導される成長阻害効果を模倣し、異種移植腫瘍サンプルにおいて密接に関連したＧＴＰアーゼＲａｓ又はＲｈｏＡではなく、ＲａｌＡ及びＲａｌＢの活性を阻害する。ＮＭＲ滴定実験により、これらの化合物がＲａｌＢ－ＧＴＰではなくＲａｌＢ－ＧＤＰのみと結合し、それによりＲａｌ特異的グアニンヌクレオチド交換因子（Ｒａｌ－ＧＥＦ）による活性化、及びその位置でのＧＴＰの結合を伴うＲａｌからのＧＤＰ放出を防止し、Ｒａｌ活性依存性表現型を阻害することが示された。
【0010】
この計算に基づくスクリーニングに続く生化学アッセイ、細胞アッセイ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイにより、癌療法における臨床用途のためのＲａｌタンパク質と結合し、その活性を効果的に阻害する本発明の小分子が同定された。このため、本発明はＲａｌ ＧＴＰアーゼを阻害することができる分子と、被験体における癌の成長及び転移を抑える又は遅らせるためのこれらの分子の治療的使用とを提供する。本発明はこれらの化合物を含有する医薬組成物、並びに癌を治療又は防止するのにこれらの化合物及び医薬組成物を使用する方法も提供する。
【0011】
本発明の一態様は、Ｒａｌ ＧＴＰアーゼ阻害活性を有するとともに、下記化学構造：
＊キラル中心
（ここで、
Ｒ１は水素、ハロゲン、－ＯＨ、－Ｏ－Ｒ８、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換Ｃ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ２は水素、ハロゲン、－ＯＨ、－Ｏ－Ｒ８、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換Ｃ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立して水素；ハロゲン；－ＯＨ；－Ｏ－Ｒ８；Ｃ１～Ｃ１２アルキル；Ｃ３～Ｃ１２アルケニル；Ｃ４～Ｃ１２ジエニル；Ｃ６～Ｃ１２トリエニル；Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル；イミダゾール；Ｃ６～Ｃ１２アリール；Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ；カルボキシ；シアノ；Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ；Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ；Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル；Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル；Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ；Ｓ－Ｒ８；－ＳＯ２－Ｒ８；－ＮＨＳＯ２－Ｒ８；－ＮＨＣＯ２－Ｒ８；ハロゲン、酸素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル；並びにハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ６～Ｃ１２アリールから選択されるか、又は、
Ｒ３及びＲ４がともにシクロヘキサン、１，４－ジオキサン若しくはフェニルを形成し、
Ｒ８はハロゲン、酸素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル；又はハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ６～Ｃ１２アリールである）、並びにその
薬学的に許容可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体及び塩、並びにその薬学的に許容可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体及び塩を有する本発明の化合物である。
【化1】
（ここで、
Ｒ１は水素、ハロゲン、－ＯＨ、－Ｏ－Ｒ８、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換Ｃ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ２は水素、ハロゲン、－ＯＨ、－Ｏ－Ｒ８、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ３～Ｃ１２アルケニル、Ｃ４～Ｃ１２ジエニル、Ｃ６～Ｃ１２トリエニル、Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル、Ｃ６～Ｃ１２アリール、置換Ｃ６～Ｃ１２アリール、Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ、カルボキシ、シアノ、Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル、Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル、Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ、Ｓ－Ｒ８、－ＳＯ２－Ｒ８、－ＮＨＳＯ２Ｒ８及び－ＮＨＣＯ２Ｒ８から選択され、
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は独立して水素；ハロゲン；－ＯＨ；－Ｏ－Ｒ８；Ｃ１～Ｃ１２アルキル；Ｃ３～Ｃ１２アルケニル；Ｃ４～Ｃ１２ジエニル；Ｃ６～Ｃ１２トリエニル；Ｃ８～Ｃ１２テトラエニル；イミダゾール；Ｃ６～Ｃ１２アリール；Ｃ１～Ｃ１２アルコキシ；カルボキシ；シアノ；Ｃ１～Ｃ１２アルカノイルオキシ；Ｃ１～Ｃ１２アルキルチオ；Ｃ１～Ｃ１２アルキルスルホニル；Ｃ２～Ｃ１２アルコキシカルボニル；Ｃ２～Ｃ１２アルカノイルアミノ；Ｓ－Ｒ８；－ＳＯ２－Ｒ８；－ＮＨＳＯ２－Ｒ８；－ＮＨＣＯ２－Ｒ８；ハロゲン、酸素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル；並びにハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ６～Ｃ１２アリールから選択されるか、又は、
Ｒ３及びＲ４がともにシクロヘキサン、１，４－ジオキサン若しくはフェニルを形成し、
Ｒ８はハロゲン、酸素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ１～Ｃ１２アルキル；又はハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で任意に置換されたＣ６～Ｃ１２アリールである）、並びにその
薬学的に許容可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体及び塩、並びにその薬学的に許容可能なエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体及び塩を有する本発明の化合物である。
【0012】
或る特定の実施の形態では、化合物のＲ１置換基は水素；メチル；フェニル；メチル－フェニル；メトキシ；ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で置換されたＣ６～Ｃ１２アリールから選択される。
【0013】
或る特定の実施の形態では、化合物のＲ２置換基は水素；メチル；フェニル；メチル－フェニル；メトキシ；ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で置換されたＣ６～Ｃ１２アリールから選択される。
【0014】
或る特定の実施の形態では、化合物のＲ３置換基は水素；ハロゲン；メトキシ；ハロゲンで任意に置換されたＣ１～Ｃ６アルキル；シアノ；イミダゾール；並びにハロゲン及びＣ１～Ｃ６アルコキシから選択される１つ～３つの基で置換されたＣ６～Ｃ１２アリールから選択される。
【0015】
特定の実施の形態では、化合物は、
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル、
６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－４－（４－（トリフルオロメトキシ）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル、
６－アミノ－４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル、及び、
６－アミノ－４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル、
から選択される化学構造を有する。
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
から選択される化学構造を有する。
【0016】
本発明の別の態様は、癌の治療を必要とする被験体に、Ｒａｌ ＧＴＰアーゼ酵素活性を阻害する化合物を治療に効果的な量投与することによって癌を治療する方法である。この実施の形態の一態様では、該化合物がＲａｌ ＧＴＰアーゼ（GTPAse）の少なくとも一方のパラログ（ＲａｌＡ又はＲａｌＢのいずれか）を阻害し、それにより癌の成長又は転移が阻害される。この実施の形態の好ましい態様では、該化合物はＲａｌＡパラログ及びＲａｌＢパラログの両方を阻害する。
【0017】
被験体において癌を治療又は防止するこれらの方法の特定の実施の形態において、上記化合物は本発明の医薬組成物内において被験体に投与される。
【0018】
そのため本発明の別の態様は、１つ又は複数の本発明の化合物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体とともに含有する医薬組成物である。
【0019】
本発明の別の実施の形態は、転移性癌の治療を必要とする又は癌若しくは癌の転移の疑いがある被験体に、治療に効果的な量の少なくとも１つの本発明の化合物を投与することによって、転移性癌、特に転移性の膵臓癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、皮膚癌及び／又は結腸癌を防止又は治療する方法である。
【0020】
本発明の別の実施の形態は、本発明の化合物の少なくとも１つと、１つ又は複数の他の既知の抗癌治療又は抗炎症治療との治療に効果的な組合せを施すことによって癌を治療する方法である。例えば、他の抗癌治療には、Ｉ型ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ＧＧＴアーゼ－Ｉ）阻害剤を含むプレニルトランスフェラーゼ阻害剤、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法又はそれらの組合せが含まれ得る。
【0021】
被験体において癌を防止、治療又は予防する方法であって、本発明の医薬組成物のいずれかを治療に効果的な量、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法も本明細書において提供される。
【0022】
被験体において癌の転移を防止する方法であって、例えば少なくとも１つの本発明の化合物を含有する医薬組成物を含む少なくとも１つの化合物を治療に効果的な量、被験体に投与することを含む、方法も本明細書において提供される。
【0023】
少なくとも１つの本発明の化合物を医薬組成物内に治療に効果的な量含む医薬パッケージも本明細書において提供される。医薬組成物は被験体において癌の防止、治療又は改善に使用される他の化合物又は治療薬と別々に、同時に又は連続して投与することができる。これらのパッケージには、処方情報及び／又は容器も含まれ得る。存在する場合、処方情報は、単独での又は被験体において癌の防止、治療若しくは改善に使用される他の治療薬と組み合わせたこれらの医薬組成物の投与及び／又は使用を説明するものであり得る。
【0024】
本発明の別の実施の形態は、被験体における成長阻害又は癌細胞数若しくは腫瘍体積の低減を示すＲａｌ ＧＴＰアーゼ活性の推定阻害剤の投与に対する被験体の応答を試験することによって、Ｒａｌ ＧＴＰアーゼ活性の推定阻害剤による治療に対する肺癌を患う被験体の感受性を試験する方法である。
【0025】
本発明の他の態様は、下記の実施形態の付随する記載において説明されるとともに、その記載から明らかとなり、又は本発明の実施によって認識することができる。しかしながら、下記の実施形態の記載は例示的に与えられているにすぎず、そのため本発明の趣旨及び範囲内での様々な変更及び修正が当業者にとって明らかとなり、本発明の範囲内に包含されることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１Ａ及び図１ＢはＲａｌタンパク質上の標的部位の分子モデリングを示す。リボン図（図１Ａ）又は表面図（図１Ｂ）でのＲａｌＡ－ＧＤＰの構造モデル。アロステリック結合部位はスイッチＩＩ、ヘリックスα２及びヘリックスα３によって形成される。（Ｃ及びＤ）ｅｘｏ８４と複合したＲａｌＡ－ＧＮＰ（図１Ｃ、ｅｘｏ８４は図示しない）、及びｓｅｃ５と複合したＲａｌＡ－ＧＮＰ（図１Ｄ、ｓｅｃ５は図示しない）の表面図。図１Ｂ及び図１Ｃでは、球／表面により結合空洞における水と接触可能な領域を示す。全てのモデルは、公表されている構造を用いてAccelrysのＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアで生成した。
【図2】図２Ａは化合物ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５の化学合成スキームを示す。図Ｓ３Ｂ～ＤはＲａｌへのＢＱＵ５７の結合の特性化を示す。図２Ｂは１００μＭのＢＱＵ５７の存在下でのＲａｌＢ－ＧＮＰ（１００μＭ）の化学シフト変化を示す。図２Ｃは、ＢＱＵ５７濃度の増大に伴うＲａｌＢ－ＧＤＰ中の選択残基の１Ｈ－１５Ｎ－ＨＳＱＣ ＮＭＲ化学シフト変化のプロットを示す。ＢＱＵ５７とＲａｌＢ－ＧＤＰとの間の結合のＫＤの表面プラズモン共鳴決定により、４．７μＭのＫＤ値をもたらす近似結合曲線が示された。
【図3】図３Ａ～図３ＥはＲａｌへの化合物の結合の特性化を示す。図３ＡはＲＢＣ８の誘導体であるＢＱＵ５７の構造を示す。図３Ｂは１００μＭ Ｒａｌ－ＧＤＰと１００μＭ ＢＱＵ５７の存在下の１００μＭ Ｒａｌ－ＧＤＰとの１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルの重ね合わせである。図３Ｃは、４０μＭ及び１００μＭでの漸増濃度のＢＱＵ５７の非存在下及び存在下のＲａｌＢ－ＧＤＰの選択残基を示す。図３Ｄは、ＲａｌＢ－ＧＤＰ単独（１００μＭ）と１００μＭ ＢＱＵ５７の存在下のＲａｌＢ－ＧＤＰとを比較する、残基数に応じた化学シフト変化のプロットを示す。図３Ｅは、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）を用いて決定されたＲａｌＢ－ＧＤＰへのＢＱＵ５７の結合を示す。
【図4】図４Ａ～４はヒト癌細胞株におけるＲａｌ阻害剤の成長阻害活性を示す。４つのヒト肺癌細胞株の足場非依存性成長に対するＢＵＱ５７（図４Ａ）及びＢＱＵ８５（図４Ｂ）処理の効果。細胞を様々な濃度の薬物を含有する軟寒天に播種し、軟寒天に形成されたコロニーを２週間～４週間後に計数した。Ｒａｌ ｓｉＲＮＡノックダウンに対して感受性を有する細胞株（Ｈ２１２２及びＨ３５８）に灰色を付け、Ｒａｌ ｓｉＲＮＡノックダウンに抵抗性を示す細胞株（Ｈ４６０及びＣａｌｕ６）に黒色を付ける。データは３回の独立実験の平均を表す。軟寒天における薬物誘導性成長阻害に対するＨ２１２２（図４Ｃ、図４Ｄ）及びＨ３５８（図４Ｅ、図４Ｆ）細胞中のＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方のｓｉＲＮＡノックダウンの効果。細胞を１０ｎＭ／３０ｎＭ／５０ｎＭのｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトし、採取し、軟寒天コロニー形成アッセイに供した。軟寒天コロニー数に対するｓｉＲＮＡ単独の効果を図４Ｃ（Ｈ２１２２）及び図４Ｅ（Ｈ３５８）に示し、コロニー形成に対するｓｉＲＮＡ＋薬物処理の効果をＤＭＳＯ処理対照に対するパーセントとして図４Ｄ（Ｈ２１２２）及び図４Ｆ（Ｈ３５８）に示す。軟寒天における薬物誘導性成長阻害に対するＨ２１２２（図４Ｇ、図４Ｈ）及びＨ３５８（図４Ｉ、図４Ｊ）細胞中の構成的に活性なＲａｌＡＧ２３Ｖ及びＲａｌＢＧ２３Ｖの過剰発現の効果。Ｈ２１２２細胞を、軟寒天コロニー形成アッセイ前にＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖで４８時間一過性にトランスフェクトした。Ｈ３５８細胞はＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖで安定にトランスフェクトした。過剰発現を免疫ブロット法によって確認し、図７Ｆに示した。示される全ての結果は３回の独立実験の平均±ＳＤを表す。＊は指定の群間の統計的有意差を意味する。
【図5】図５Ａ～図５Ｈは肺癌のヒト異種移植モデルに対するＲａｌ阻害剤の効果を示す。５０ｍｇ／Ｋｇの単回ｉ．ｐ．投与の３時間後のヌードマウスにおけるＲＢＣ８（図５Ａ）及びＢＱＵ５７（図５Ｂ）の組織分布。データは３匹のマウスの平均±ＳＤを表す。（図５Ｃ及び図５Ｄ）接種の２４時間後に開始した５０ｍｇ／ｋｇ／日のＲＢＣ８は、ヒト肺癌細胞株Ｈ２１２２の異種移植腫瘍成長を阻害した。データは６匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。処理群における腫瘍体積は、ダネット検定によって決定されるように対照とは統計的に異なっていた（＊ｐ＜０．０５）。典型的な腫瘍外観を図５Ｄに示す。図５Ｅは、ＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方のｓｉＲＮＡ枯渇がＨ２１２２細胞の異種移植腫瘍成長を阻害したことを示す。細胞をＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方に対するｓｉＲＮＡで２４時間一過性にトランスフェクトした。次いで、細胞をヌードマウスに接種した。腫瘍をモニタリングし、上記のように測定した。データは６匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。処理群における腫瘍体積は、ダネット検定によって決定されるように対照とは統計的に異なっていた（＊ｐ＜０．０５）。図５Ｆは、接種の２４時間後に開始したＢＱＵ５７処理（１０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日）がＨ２１２２細胞の異種移植腫瘍成長を阻害したことを示す。データは６匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。処理群における腫瘍体積は、ダネット検定によって決定されるように対照とは統計的に異なっていた（＊ｐ＜０．０５）。図５Ｇは５０ｍｇ／Ｋｇの単回ｉ．ｐ．投与の３時間後のヌードマウスにおけるＢＱＵ８５の組織分布を示す。データは３匹のマウスの平均±ＳＤを表す。図５Ｈは肺癌のヒト異種移植モデルに対するＢＱＵ８５処理の効果を示す。接種の２４時間後に開始したＢＱＵ８５処理（５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日）がＨ２１２２細胞の異種移植腫瘍成長を阻害した。データは６匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。
【図6】図６Ａ～図６Ｅはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲａｌ阻害剤の細胞取込みを示す。Ｈ２１２２ヒト肺癌細胞を１０μＭのＲＢＣ８（図６Ａ）、ＢＱＵ５７（図６Ｂ）、ＢＱＵ８５（図６Ｃ）及びＲＢＣ５（図６Ｄ）で処理した。細胞を異なる時点（１分、５分、１５分、３０分及び６０分）で採取し、細胞における薬物濃度をＬＣ／ＭＳ－ＭＳ法を用いて決定した（各時点についてｎ＝３）。図６ＥはＲＢＣ５、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７によるＨ２１２２及びＨ３５８細胞におけるＲａｌ活性の阻害を示す。細胞を足場非依存性条件下で成長させ、１０μＭの化合物で３時間処理した。次いで、細胞溶解物におけるＲａｌ活性をＲａｌＢＰ１アガロースビーズによるプルダウンアッセイを用いて決定した。データは３回の独立実験を表す。
【図7】図７Ａ～図７Ｆは、４つのヒト肺癌細胞株の足場非依存性成長に対するＫ－Ｒａｓ又はＲａｌノックダウン又は過剰発現の効果を示す。図７Ａは、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後のＨ２１２２、Ｈ３５８、Ｈ４６０及びＣａｌｕ６細胞株におけるＫ－ＲａｓのｓｉＲＮＡノックダウンの免疫ブロットを示す。図７Ｂは、４つ全ての株が軟寒天コロニー形成アッセイを用いたＫ－Ｒａｓノックダウンに対して感受性を有していたことを示す。４つのヒト肺癌細胞株の足場非依存性成長に対するＲａｌノックダウンの効果を、細胞をＲａｌＡ、ＲａｌＢ又はＲａｌＡ／Ｂに対するｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクトした後、細胞を軟寒天コロニー形成アッセイに供することによって調査した。図７Ｃは、細胞株Ｈ２１２２／Ｈ３５８がＲａｌノックダウンに対して感受性を有していたことを示す。図７Ｄは、細胞株Ｈ４６０／Ｃａｌｕ６がＲａｌノックダウンに対して感受性を有しなかったことを示す。図７Ｅは、様々な濃度のｓｉＲＮＡによる処理の４８時間後のＨ２１２２及びＨ３５８細胞株におけるＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方のノックダウンの免疫ブロットを示す。図７Ｆは、Ｈ２１２２及びＨ３５８細胞における構成的に活性なＲａｌＡＧ２３Ｖ及びＲａｌＢＧ２３Ｖの成功した過剰発現の免疫ブロットを示す。Ｈ２１２２細胞をＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ及びＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖで４８時間一過性にトランスフェクトした。ＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ及びＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖを安定に過剰発現するＨ３５８細胞をＧ４１８選択によって生成した。
【発明を実施するための形態】
【0027】
腫瘍の樹立及び転移におけるその強力な臨床的重要性に基づき、本発明者らは、分子標的としてＲａｌ ＧＴＰアーゼを特定し使用している。全てのＧＴＰアーゼと同様に、Ｒａｌの活性は不活性（ＧＤＰ結合）立体構造と活性（ＧＴＰ結合）立体構造との循環に応じたものである。活性Ｒａｌタンパク質は、Ｒａｌ結合タンパク質１（ＲａｌＢＰ１、ＲＬＩＰ７６又はＲＩＰ１（３７））、Ｓｅｃ５／Ｅｘｏ８５、フィラミン及びホスホリパーゼＤ１を含む自身のエフェクター群を介して下流のプロセスを媒介する。そのため、Ｒａｌ－ＧＤＰに結合し、Ｒａｌ－ＧＴＰとは結合しない化合物を用いて、エフェクター結合を立体的に阻害し、及び／又はＧＴＰ結合状態に伴って起こる立体構造の変化を防ぎ、それによりシグナル伝送を遮断し、結果としてＲａｌ依存性癌細胞の成長の低減及びアポトーシスをもたらすことができる。これらの化合物は、Ｒａｌ ＧＴＰアーゼ阻害剤の仮想スクリーニングと物理的スクリーニングとの併用によって特定された。
【0028】
上述のように、Ｒａｌは不活性（ＧＤＰ結合）型と活性（ＧＴＰ結合）型との間で循環する。Ｒａｌ－ＧＴＰ（活性型）よりもＲａｌ－ＧＤＰ（不活性型）に優先的に結合する化合物を発見し、それによりＲａｌを不活性状態に安定化することを目的に、本発明者らは活性型及び不活性型のＲａｌＡの三次元構造を調べた。この分析から、ヌクレオチド結合部位から近いが、それとは異なるポケットの形状の違いが明らかになった（図１）。こ
のポケット（アロステリック部位）は以前に記載のＣ３ｂｏｔ結合部位と同様であり、スイッチ－ＩＩ領域（Ｒａｌ７０～Ｒａｌ７７）、ヘリックスα２（Ｒａｌ７８～Ｒａｌ８５）及びヘリックスα３の一面により構成される（図１Ａ）。比較に使用される結晶構造は、ｅｘｏ８４（ＰＤＢコード１ＺＣ４、図１Ｃ）又はｓｅｃ５（ＰＤＢコード１ＵＡＤ、図１Ｄ）と複合したＲａｌＡ－ＧＤＰ（ＰＤＢコード２ＢＯＶ（図１Ｂ）及びＲａｌＡ－ＧＮＰ（非加水分解性形態のＧＴＰ）を含んでいた。各結合部位について算出された体積はＲａｌＡ－ＧＤＰでは１７５Å３（図１Ｂ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｅｘｏ８４では１５５Å３（図１Ｃ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｓｅｃ５では１１６Å３（図１Ｄ）であった。ＲａｌＢ－ＧＤＰ結晶構造は公表されていないが、ＲａｌＢ－ＧＮＰ構造（ＰＤＢコード２ＫＥ５、図１）では、この結合ポケットは殆ど存在しない。ＲａｌＡ－ＧＤＰのアロステリック部位に結合する小分子を同定するために構造に基づく仮想スクリーニングアプローチを用いて、５０００００個の化合物をＲａｌＡ－ＧＤＰポケットにドッキングさせた。タンパク質－リガンド複合体をスコアリングし、相互作用エネルギーの算出に続く上位候補の目視検査に基づいて選別することで、８８個の化合物が選択された。選択された８８個の化合物を、培養物中の生細胞におけるＲａｌＡ活性化を阻害するそれらの能力について、そのエフェクタータンパク質ＲａｌＢＰ１への活性型ＲａｌＡ－ＧＴＰの選択的結合に基づくＲａｌ活性についてのＥＬＩＳＡを用いて評価した。
のポケット（アロステリック部位）は以前に記載のＣ３ｂｏｔ結合部位と同様であり、スイッチ－ＩＩ領域（Ｒａｌ７０～Ｒａｌ７７）、ヘリックスα２（Ｒａｌ７８～Ｒａｌ８５）及びヘリックスα３の一面により構成される（図１Ａ）。比較に使用される結晶構造は、ｅｘｏ８４（ＰＤＢコード１ＺＣ４、図１Ｃ）又はｓｅｃ５（ＰＤＢコード１ＵＡＤ、図１Ｄ）と複合したＲａｌＡ－ＧＤＰ（ＰＤＢコード２ＢＯＶ（図１Ｂ）及びＲａｌＡ－ＧＮＰ（非加水分解性形態のＧＴＰ）を含んでいた。各結合部位について算出された体積はＲａｌＡ－ＧＤＰでは１７５Å３（図１Ｂ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｅｘｏ８４では１５５Å３（図１Ｃ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｓｅｃ５では１１６Å３（図１Ｄ）であった。ＲａｌＢ－ＧＤＰ結晶構造は公表されていないが、ＲａｌＢ－ＧＮＰ構造（ＰＤＢコード２ＫＥ５、図１）では、この結合ポケットは殆ど存在しない。ＲａｌＡ－ＧＤＰのアロステリック部位に結合する小分子を同定するために構造に基づく仮想スクリーニングアプローチを用いて、５０００００個の化合物をＲａｌＡ－ＧＤＰポケットにドッキングさせた。タンパク質－リガンド複合体をスコアリングし、相互作用エネルギーの算出に続く上位候補の目視検査に基づいて選別することで、８８個の化合物が選択された。選択された８８個の化合物を、培養物中の生細胞におけるＲａｌＡ活性化を阻害するそれらの能力について、そのエフェクタータンパク質ＲａｌＢＰ１への活性型ＲａｌＡ－ＧＴＰの選択的結合に基づくＲａｌ活性についてのＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【0029】
ＲａｌＡ活性を、フィブロネクチンコーティングカバースリップ上でのネズミ胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の拡散時の脂質ラフトエキソサイトーシスを測定することによっても独立してアッセイした。これらの細胞では、ＲａｌＡのｓｉＲＮＡ枯渇が拡散を阻害し、カベオリン（Ｃａｖ１）－／－ＭＥＦはＲａｌＡ枯渇に抵抗性を示す。
【0030】
ＴＲＯＳＹ １５Ｎ－ＨＳＱＣ（横緩和最適化異核種単一量子コヒーレンス：Transverse Relaxation-Optimized Heteronuclear Single Quantum Coherence）ＮＭＲを用いて、Ｒａｌ標的部位への化合物の直接結合を確認した。本発明者らは、ＧＮＰと複合したＲａｌＢのＮＭＲ構造（現時点で解明されている唯一の構造）に着目した。ＲａｌＢ－ＧＤＰ及びＲａｌＢ－ＧＮＰの１５Ｎ－ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを初めに決定し、化学シフト差を分析した。次いで、ＮＭＲスペクトルをＲＢＣ８又はＤＭＳＯ対照の存在下で記録した。タンパク質への小分子の結合を１５Ｎ－ＨＳＱＣタンパク質アミドピークの摂動によってモニタリングした。１００μＭ ＲＢＣ８の非存在下及び存在下におけるＲａｌＢ－ＧＤＰ（１００μＭ）の１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルにより、アロステリック部位に位置する代表的な残基のピーク位置の変化が示された。ＮＭＲスペクトルの最小化学シフト変化によって示されるように、ＲＢＣ８は同じ条件下でＲａｌＢ－ＧＮＰに結合しなかった。さらに、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおいて活性型Ｒａｌのレベルに影響を及ぼさなかったＲＢＣ５は、ＲａｌＢ－ＧＤＰにおいても化学シフト変化を誘導しなかったため、付加的な陰性対照とした。
【0031】
構造的特徴を含む全てのデータに基づき、一連のＲＢＣ８誘導体を合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合について試験した。ＲＢＣ８と比較して優れたその性能及びその薬らしい特性からＢＱＵ５７を更なる評価に選んだ。ＢＱＵ５７とＲａｌＢ－ＧＤＰとの間の結合の詳細なＮＭＲ分析を行った。配列に応じたＢＱＵ５７による化学シフト変化のプロットから、顕著な変化を示す残基がスイッチ－ＩＩ（アミノ酸残基７０～７７）及びヘリックスα２（アミノ酸残基７８～８５）領域に位置することが示された。ＲａｌＢ－ＧＤＰ結晶構造は利用可能でないため、ＲａｌＡ－ＧＤＰに対する類似性に基づいて相同性モデルを生成し、化合物に応答して化学シフト変化を示した残基をこのモデルにマップした。化学シフト変化の大部分は、モデリングに基づくこの部位へのＢＱＵ５７結合の帰属と一致してアロステリック部位に局在化していた。ＲＢＣ８による結果と同様、ＢＱＵ５７はＮＭＲスペクトルの最小化学シフト変化によって示されるようにＲａｌＢ－ＧＮＰ（１００μＭ）に結合しなかった。ＮＭＲ化学シフト滴定の分析から、ＢＱＵ５７の結合が薬物の
見掛けの溶解性の限界まで化学量論的であることが明らかになった。ＲａｌＢ－ＧＤＰへのＢＱＵ５７の結合を、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）を用いることによっても決定し、結果は表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）による結果と同様であった。
見掛けの溶解性の限界まで化学量論的であることが明らかになった。ＲａｌＢ－ＧＤＰへのＢＱＵ５７の結合を、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）を用いることによっても決定し、結果は表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）による結果と同様であった。
【0032】
ヒト肺癌細胞成長に対するＲＢＣ８及びＢＱＵ５７の効果を評価した。足場非依存性におけるＲａｌの役割は既知であるため、本発明者らは軟寒天における成長阻害アッセイを行った。ヒト肺癌細胞を薬物取込み、生物学的特異性及び効果を決定するための一連の実験で使用した。
【0033】
ＲＢＣ８、ＢＱＵ５７、ＢＱＵ８５及びＲＢＣ５の細胞取込みを検査し、全ての化合物が細胞に容易に入り込むことが見出された。全ての細胞株がＫ－Ｒａｓ ｓｉＲＮＡ枯渇に対して感受性を有することが見出されたが、Ｈ２１２２及びＨ３５８のみがＲａｌノックダウンに対して感受性を有していた。密接に関連したＧＴＰアーゼであるＲａｓと比較したＲａｌに対する化合物の特異性を決定するためにこの特徴を用いることで、本発明者らは軟寒天におけるコロニー形成の阻害を評価し、Ｒａｌ依存性株Ｈ２１２２及びＨ３５８が感受性を有することを見出した。付加的に、ＲａｌＢＰ１アガロースビーズを用いたＲａｌプルダウンアッセイにより、ＲＢＣ５ではなくＲＢＣ８及びＢＱＵ５７が、Ｈ２１２２及びＨ３５８細胞株の両方においてＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方の活性化を阻害することが示された。ケモゲノミクス実験を行い、Ｒａｌに対する薬物特異性を更に決定した。ＲＢＣ８又はＢＱＵ５７によるＲａｌＡ及びＲａｌＢのｓｉＲＮＡノックダウンを有するＨ２１２２及びＨ３５８細胞の処理は顕著な更なる阻害をもたらさなかった。まとめると、これらのデータからＲＢＣ８及びＢＱＵ５７がＲａｌ阻害により足場非依存性成長を低減することが実証された。
【0034】
ＲａｌのＧＴＰ型と比較したＧＤＰ型に対する化合物の特異性を、Ｈ２１２２及びＨ３５８細胞においてＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＲａｌＢＧ２３Ｖの活性型を構成的に過剰発現させることによって評価した。（Ｇ２３Ｖ突然変異はＧＴＰ加水分解のＲａｌＧＡＰ媒介活性化を防止し、したがってＲａｌをその活性状態にロックする。）ＲａｌＡＧ２３Ｖ及びＲａｌＢＧ２３Ｖの両方が、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７化合物の成長阻害効果をレスキューすることができた。
【0035】
Ｒａｌ活性及び腫瘍成長の阻害をヒト肺癌マウスモデルにおいて評価した。ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７の薬物動態を、初めにバイオアベイラビリティを試験するために、表１に示される良好な薬物候補を規定する有利な特性を示すＲＢＣ８及びＢＱＵ５７を用いてマウスにおいて分析した。
【0036】
【表1】
【0037】
化合物の腫瘍組織への侵入を決定したが、相当量の化合物が投与の３時間後に腫瘍組織において検出された。
【0038】
次いで、異種移植腫瘍成長に対するＲａｌ阻害剤の効果をヌードマウスにおいて試験した。ＲＢＣ８はＲａｌＡ及びＲａｌＢの二重ノックダウンと同じ程度（order of magnitude）で腫瘍成長を阻害し、二次肺癌株Ｈ３５８は同様の結果をもたらした。ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５もｉｎ ｖｉｖｏで試験し、用量依存的な成長阻害効果が観察された。
【0039】
Ｒａｌ ＧＴＰアーゼ活性をＨ２１２２異種移植片においてｉｎ ｖｉｖｏで評価した。Ｒａｌ活性のＲａｌＢＰ１プルダウン測定から、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７によるＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方の顕著な阻害が示された。重要なことには、Ｒａｌ活性のＢＱＵ５７により誘導される用量依存的な阻害は腫瘍成長の阻害と相関していた。付加的に、Ｒａｓ及びＲｈｏＡ活性をＢＱＵ５７処理腫瘍において測定したが、顕著な阻害は観察されず、本発明のＲａｌ阻害剤の選択性が更に実証された。
【0040】
したがって、本発明はＲａｌ ＧＴＰアーゼ阻害化合物を提供する。これらの化合物は不活性型のＲａｌタンパク質に結合し、ＧＥＦ誘導活性化又はＧＴＰ交換を防止することができ、Ｒａｌに対して僅かなオフターゲット効果で選択的である。このため、本開示のＲａｌ ＧＴＰアーゼ阻害剤は、ＧＴＰ結合時のＲａｌタンパク質の関連立体構造変化を妨げることにより、エフェクターの関与及び下流のシグナル伝達を防止するために使用することができる。
【0041】
したがって本発明は、被験体においてＲａｌ ＧＴＰアーゼを阻害することにより被験体における癌の成長及び／又は転移を阻害する方法も提供する。好ましい実施形態では、Ｒａｌ ＧＴＰアーゼは、ＲａｌＡパラログ及びＲａｌＢパラログの内の少なくとも一方である。「パラログ」という用語は、同じゲノムの異なる位置を占有するような重複が起こっている生物における遺伝子を示すのに本開示において使用される。
【0042】
別の態様において、本発明は少なくとも１つの本発明の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を被験体に投与することにより、被験体において癌の成長及び／又は転移を阻害する方法を提供する。
【0043】
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、単純な若しくは複雑な有機分子、ペプチド、タンパク質又はオリゴヌクレオチド等の化学分子又は生体分子を意味する。
【0044】
「薬学的に許容可能な」という語句は本明細書において、正しい医学的判断の範囲内において過度な毒性、炎症、アレルギー反応、又は合理的なベネフィット／リスク比に応じた他の問題若しくは合併症を伴わず、ヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適したそれらの化合物、材料、組成物及び／又は剤形を表すのに用いられる。
【0045】
「薬学的に許容可能な塩」は、親化合物がその酸塩又は塩基塩を生成することによって修飾されている開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容可能な塩の例としては、アミン等の塩基性残基の無機塩若しくは有機酸塩、又はカルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩若しくは有機塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な塩としては、例えば非毒性の無機酸又は有機酸から生成される親化合物の従来の非毒性塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。かかる従来の非毒性塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸に由来する塩と、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２－アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸等の有機酸から調製される塩とが挙げられる。薬学的に許容可能な塩は、過度な毒性、炎症、アレルギー反応、又は合理的なベネフィット／リスク比に応じた他の問題若しくは合併症を伴わ
ず、ヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適した化合物の形態である。
ず、ヒト及び動物の組織に接触させて使用するのに適した化合物の形態である。
【0046】
本明細書において提供される化合物の薬学的に許容可能な塩形態は、従来の化学的方法によって塩基性部分又は酸性部分を含有する本発明の化合物から合成される。一般的には、かかる塩は例えば、水若しくは有機溶媒、又はそれら２つの混合物（一般的にはエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい）において、これらの化合物の遊離酸形態又は遊離塩基形態を化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることによって調製される。好適な塩のリストは、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985
の１４１８頁に見られる。
の１４１８頁に見られる。
【0047】
「被験体」という用語はヒト又は霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン、ヒヒ、テナガザル及びチンパンジー等の哺乳動物を指す。「被験体」という用語は伴侶動物、例えばイヌ及びネコ；動物園の動物；ウマ科動物、例えばウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ及びヒツジ；並びに疾患モデル動物、例えばウサギ、マウス及びラットを指す場合もある。被験体はヒトであっても又は非ヒトであってもよい。被験体は任意の年齢であり得る。例えば幾つかの実施形態では、被験体はヒト乳児、すなわち出生後から約１歳まで；ヒト小児、すなわち約１歳～１２歳のヒト；思春期のヒト、すなわち約１２歳～１８歳のヒト；又は成人のヒト、すなわち約１８歳を超えるヒトであり得る。幾つかの実施形態では、被験体は成人の男性又は女性である。
【0048】
「治療に効果的な量」又は「治療量」の本発明の化合物という用語は、癌を患う被験体に投与した後に癌の形成又は進行を阻害するのに効果的な量を意味する。
【0049】
「溶媒和物」という用語は、溶媒と化合物との相互作用によって形成される化合物を指す。好適な溶媒和物は、一水和物及び半水和物を含む水和物等の薬学的に許容可能な溶媒和物である。
【0050】
キラル中心を有する本発明の化合物は、光学活性体及びラセミ体の形で存在し、単離することができることが当業者に理解されている。本発明の化合物は本明細書に記載の治療的に有用な特性を備える、任意のラセミ体、光学活性体、位置異性体若しくは立体異性体、又はそれらの混合物を包含することが理解される。本発明の化合物が少なくとも１つのキラル中心を有する場合、本発明の化合物はエナンチオマーとして存在し得る。本発明の化合物が２つ以上のキラル中心を有する場合、本発明の化合物は更にジアステレオマーとして存在し得る。本発明による化合物を調製する方法によって、立体異性体の混合物が得られる場合、これらの異性体を分取クロマトグラフィ等の従来法によって分離することができる。本発明の化合物を、立体特異的合成又は分割によってラセミ体で又は個々のエナンチオマー若しくはジアステレオマーとして調製することができる。本発明の化合物を例えば、光学活性酸、例えば（－）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｄ－酒石酸及び／又は（＋）－ジ－ｐ－トルオイル－Ｌ－酒石酸との塩形成による立体異性体対の形成、その後の分別晶出及び遊離塩基の再生等の標準法によってそれらの構成要素であるエナンチオマー又はジアステレオマーへと分割することができる。本発明の化合物を、立体異性体のエステル又はアミドの形成、その後のキラル補助基（chiral auxiliary）のクロマトグラフィ分離及び除去によっても分割することができる。代替的には本発明の化合物を、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割することができる。その全ての立体異性体、ラセミ混合物、ジアステレオマー及びエナンチオマーが本発明の範囲内に包含されることが理解される。
【0051】
光学活性体をどのように（例えば再結晶法、光学活性出発材料からの合成、キラル合成、又はキラル固定相を用いたクロマトグラフィ分離によるラセミ体の分割によって）調製するかは当該技術分野において既知である。また本発明の範囲には、存在し得る各種異性
体だけでなく、形成され得る異性体の各種混合物も包含されることが理解される。本発明の化合物、それらの出発材料及び／又は中間体の分割は、例えばfour volume compendium
Optical Resolution Procedures for Chemical Compounds: Optical Resolution Information Center, Manhattan College, Riverdale, N.Y.、及びEnantiomers, Racemates and
Resolutions, Jean Jacques, Andre Collet and Samuel H. Wilen; John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1981（これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）
に記載されるような既知の手法によって行うことができる。要するに、化合物の分割は鏡像異性的に純粋な部分の化学的又は酵素的な結合によるジアステレオマーの物理特性の差異に基づくものであり、これにより分別晶出、蒸留又はクロマトグラフィにより分離可能な形態が得られる。
体だけでなく、形成され得る異性体の各種混合物も包含されることが理解される。本発明の化合物、それらの出発材料及び／又は中間体の分割は、例えばfour volume compendium
Optical Resolution Procedures for Chemical Compounds: Optical Resolution Information Center, Manhattan College, Riverdale, N.Y.、及びEnantiomers, Racemates and
Resolutions, Jean Jacques, Andre Collet and Samuel H. Wilen; John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1981（これは引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）
に記載されるような既知の手法によって行うことができる。要するに、化合物の分割は鏡像異性的に純粋な部分の化学的又は酵素的な結合によるジアステレオマーの物理特性の差異に基づくものであり、これにより分別晶出、蒸留又はクロマトグラフィにより分離可能な形態が得られる。
【0052】
本発明の医薬組成物を作製するのに本発明の化合物と組み合わせて使用される化学物質は市販品を（commercially）購入することができる。これらの化合物の塩を含む本発明の化合物は、有機合成分野の当業者にとって既知の方法で調製することもできる。本発明の化合物は、用いられる試薬及び材料に適切であり、形質転換をもたらすのに好適な溶媒中で行われる反応を用いて調製することができる。分子の様々な箇所に存在する官能基が提唱される試薬及び反応に適合可能でなければならないことが有機合成分野の当業者に理解されている。反応条件に適合可能であるという置換基に対するこのような制限は、当業者にとって容易に明らかとなり、代替方法を使用しなければならない。
【0053】
本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の本発明の化合物と、動物、特に被験体への生物学的活性剤の送達に関して当該技術分野において一般的に許容される媒体である薬学的に許容可能な担体とを含有する。薬学的に許容可能な担体は、決定及び調整する上で十分当業者の範囲内にある多くの因子に従って配合される。これらとしては、配合される活性剤の種類及び性質；活性剤を含有する組成物を投与する被験体；組成物の目的とする投与経路；並びに標的となる治療指標が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能な担体には、水性液体媒体及び非水性液体培体の両方と、多様な固体剤形及び半固体剤形とが含まれる。このような担体は、活性剤に加えて多くの様々な成分及び添加剤を含むことができ、かかる付加的な成分は、当業者に既知の様々な理由、例えば活性剤の安定化のために配合物中に含まれる。好適な薬学的に許容可能な担体、及びその選択に関わる因子の記述は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985等の容易に入手可能な各種出典に見られる。
【0054】
本発明は更に、癌に冒された被験体を治療する又は被験体においてかかる癌の転移を防止する方法であって、被験体に本明細書で提供される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。かかる組成物は概して、治療に効果的な量の本発明の化合物を、癌を防止、改善、軽減又は阻害するのに効果的な量で含む。かかる量は典型的に、組成物が投与される被験体の体重１キログラム当たり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの化合物を含む。治療に効果的な量の組成物は当業者にとって良好な任意の投与計画に従って投与することができる。
【0055】
投与は例えば、様々な非経口手段によって行うことができる。非経口投与に適した医薬組成物としては、水性デキストロース及び生理食塩水溶液等の様々な水性媒体が挙げられる。グリコール溶液も有用な担体であり、活性成分の水溶性塩と、好適な安定剤と、必要に応じて緩衝剤とを含有するのが好ましい。重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸等の抗酸化剤は単独で又は組み合わせて、好適な安定剤であり、クエン酸及びその塩並びにＥＤＴＡも使用される。加えて、非経口溶液は塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン又はプロピルパラベン及びクロロブタノール等の防腐剤を含有していてもよい。
【0056】
代替的には、組成物はカプセル、錠剤及び粉末等の固体剤形、又はエリキシル、シロップ及び／又は懸濁剤等の液体形態で経口投与することができる。ゼラチンカプセルを、活性成分と、限定するものではないが、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はセルロース誘導体等の好適な担体とを含有させるのに使用することができる。同様の希釈剤を、圧縮錠を作製するのに使用することができる。錠剤及びカプセルはともに、経時的な薬剤の連続的放出をもたらす持続放出性製剤として製造することができる。圧縮錠は不快な風味をマスキングするために糖衣錠若しくはフィルムコート錠とすることができ、又は活性成分を環境から保護するのに使用することができ、又は胃腸管内で錠剤を選択的に崩壊させることができる。
【0057】
好ましい本発明の配合物は、治療に効果的な量の本発明の化合物と、薬学的に許容可能な担体とから本質的になる、癌を防止、治療又は予防するための非経口投与又は経口投与に適した単相医薬組成物である。
【0058】
本発明の医薬組成物に用いることができる好適な水性担体及び非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散液の場合は所望の粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【0059】
これらの組成物は湿潤剤、乳化剤及び分散剤等のアジュバントを含有することもできる。組成物に糖、塩化ナトリウム等の等張剤を含めることも望まれ得る。加えて、注射用医薬形態の持続的吸収はモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収を遅らせる作用物質の包含によってもたらされ得る。
【0060】
場合によっては、薬物の効果を延ばすために、皮下注射又は筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは水溶性が低い結晶質又は非晶質の液体懸濁液の使用によって達成することができる。薬物の吸収速度はその溶解速度に依存するものであり、溶解速度は結晶サイズ及び結晶形に依存するものであり得る。代替的には、非経口投与薬物の遅延吸収は薬物を油性ビヒクルに溶解又は懸濁することによって達成される。
【0061】
注射用デポー剤形は、ポリラクチド－ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製される。薬物とポリマーとの比及び用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としてはポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。注射用デポー配合物は、薬物を、体組織に適合するリポソーム又はマイクロエマルションに封入することによっても調製される。注射用材料は、例えば細菌保持フィルターによる濾過によって滅菌することができる。
【0062】
錠剤等の固体組成物を調製するために、主活性成分を医薬賦形剤と混合して、本発明の化合物の一様混合物を含有する固体予備配合組成物を形成する。これらの予備配合組成物を一様であると称する場合、これは組成物を錠剤、丸薬及びカプセル等の等しく効果的な単位剤形へと容易に細分することができるように活性成分が組成物全体に均等に分散されていることを意味する。次いでこの固体予備配合物を、例えば０．１ｍｇ～約５００ｍｇの本発明の治療用化合物を含有する上記のタイプの単位剤形へと細分する。
【0063】
経口投与に適した本発明の配合物は、それぞれが活性成分として所定量の本発明の化合物（単数又は複数）を含有する、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、粉末、細粒、又は水性若しくは非水性の液体の溶液若しくは懸濁液、又は水中油型若しくは油中水型の液体エ
マルション、又はエリキシル若しくはシロップ、又はトローチ（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤を使用する）等の形態であり得る。本発明の化合物（単数又は複数）を巨丸剤、舐剤又はペーストとしても投与することができる。
マルション、又はエリキシル若しくはシロップ、又はトローチ（ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤を使用する）等の形態であり得る。本発明の化合物（単数又は複数）を巨丸剤、舐剤又はペーストとしても投与することができる。
【0064】
経口投与用の本発明の固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、細粒等）では、活性成分を１つ若しくは複数の薬学的に許容可能な担体、例えばクエン酸ナトリウム若しくはリン酸二カルシウム、及び／又は下記のいずれかと混合する：（１）充填剤又は増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール及び／又はケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシア等；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天（agar-agar）、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタ
ピオカデンプン、アルギン酸、或る特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等；（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土；（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール固体、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物；並びに（１０）着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、医薬組成物は緩衝剤を含んでいてもよい。類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤と高分子量ポリエチレングリコール等とを用いて、軟ゼラチンカプセル及び硬ゼラチンカプセル内の充填剤として用いることができる。
ピオカデンプン、アルギン酸、或る特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム；（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール等；（８）吸収剤、例えばカオリン及びベントナイト粘土；（９）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール固体、ラウリル硫酸ナトリウム及びそれらの混合物；並びに（１０）着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、医薬組成物は緩衝剤を含んでいてもよい。類似のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖のような賦形剤と高分子量ポリエチレングリコール等とを用いて、軟ゼラチンカプセル及び硬ゼラチンカプセル内の充填剤として用いることができる。
【0065】
錠剤は任意に１つ又は複数の補助成分を用いて圧縮又は成形によって作製することができる。圧縮錠は、結合剤（例えばゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えばデンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤又は分散剤を用いて調製することができる。成形錠は好適な機械において不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状の化合物の混合物を成形することによって作製することができる。
【0066】
本発明の医薬組成物の錠剤、並びに糖衣錠、カプセル、丸薬及び細粒等の他の固体剤形は、任意に割線を入れるか（scored）又は腸溶コーティング及び医薬配合分野で既知の他のコーティング等のコーティング及びシェルを用いて調製することができる。それらは、例えば所望の放出プロファイルをもたらすのに様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソーム及び／又はミクロスフェアを用いて、その中の活性成分の徐放又は制御放出が起こるように配合することもできる。それらは、例えば細菌保持フィルターによる濾過によって滅菌することができる。これらの組成物は任意に不透明剤を含有していてもよく、活性成分のみを、又は任意に遅延して胃腸管の或る特定の部分に優先的に放出する組成を有してもよい。使用することのできる包埋組成物の例としては高分子物質及びワックスが挙げられる。活性成分はマイクロカプセル化形態であってもよい。
【0067】
本発明の錠剤又は丸薬を、持続作用の利点をもたらす剤形が得られるようにコーティング又はそれ以外の方法で調合することができる。例えば、錠剤又は丸薬は内側剤形構成要素と外側剤形構成要素とを備えていてもよく、外側剤形構成要素は内側剤形構成要素の上にエンベロープの形態で存在する。２つの構成要素は胃での崩壊を抑える働きがある腸溶層によって隔てられ、内側構成要素が無傷で十二指腸に入るか又は放出を遅延させることができる。多様な材料をこのような腸溶層又はコーティングに使用することができ、かかる材料としては、多くのポリマー酸、並びにポリマー酸とシェラック、セチルアルコール及び酢酸セルロースのような材料との混合物が挙げられる。
【0068】
本発明の化合物の経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容可能なエマルション、
マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水又は他の溶媒等、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含有することができる。
マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は当該技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水又は他の溶媒等、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含有することができる。
【0069】
不活性希釈剤の他にも、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤及び防腐剤等のアジュバントも含むことができる。
【0070】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（aluminum metahydroxide）、ベントナイト、寒天及びトラガカント、並びにそれらの混合物等の懸濁化剤を含有することができる。
【0071】
直腸投与又は膣内投与用の本発明の医薬組成物の配合物は坐剤として与えることができる。坐剤は１つ又は複数の本発明の化合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス又はサリチル酸塩を含む１つ又は複数の好適な非刺激性賦形剤又は担体と混合することによって調製することができ、室温では固体であるが、体温では液体であり、そのため直腸又は膣腔内で溶解して活性化合物を放出する。膣内投与に適した本発明の配合物には、当該技術分野において適切であることが知られているような担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡状物質又は噴霧配合物も含まれる。
【0072】
本発明の化合物の局所投与又は経皮投与用の剤形としては、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、溶液、パッチ、滴剤及び吸入剤が挙げられる。活性成分は滅菌条件下において薬学的に許容可能な担体、及び要求され得る任意の緩衝液又は高圧ガスと混合することができる。
【0073】
軟膏、ペースト、クリーム及びジェルは、活性成分に加えて、賦形剤、例えば動物性脂肪及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物を含有することができる。
【0074】
粉末及び噴霧剤は、活性成分に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末等の賦形剤、又はこれらの物質の混合物を含有することができる。噴霧剤はフロン（chlorofluorohydrocarbons）等の慣用の高圧ガス、並びに揮発性非置換炭化水素、例えばブタン及びプロパンを更に含有することができる。
【0075】
経皮パッチには本発明の化合物の身体への制御送達をもたらすという追加利点がある。かかる剤形は、１つ又は複数の本発明の化合物を適切な媒体、例えば弾性マトリクス材料に溶解、分散又はそれ以外の方法で組み込むことによって作製することができる。皮膚を介した化合物の流れを増大させるのに吸収促進剤を使用することもできる。このような流れの速度を、速度制御膜を設ける又は化合物をポリマーマトリクス若しくはゲルに分散させることによって制御することができる。
【0076】
医薬配合物は、吸入若しくは送気による投与又は鼻腔投与若しくは眼内投与に適したも
のを含む。吸入による上気道（鼻腔）又は下気道への投与のために、本発明の化合物は送気器（insufflator）、ネブライザ若しくは加圧パック、又はエアロゾル噴霧剤を送達す
る他の簡便な手段から簡便に送達される。加圧パックには、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガス等の好適な高圧ガスが含まれ得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は決まった量（metered amount）を送達するバルブを設けることによって決定することができる。
のを含む。吸入による上気道（鼻腔）又は下気道への投与のために、本発明の化合物は送気器（insufflator）、ネブライザ若しくは加圧パック、又はエアロゾル噴霧剤を送達す
る他の簡便な手段から簡便に送達される。加圧パックには、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガス等の好適な高圧ガスが含まれ得る。加圧エアロゾルの場合、投与単位は決まった量（metered amount）を送達するバルブを設けることによって決定することができる。
【0077】
代替的には、吸入又は送気による投与のために、組成物は乾燥粉末、例えば１つ又は複数の本発明の抗癌化合物と好適な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンとの粉末混合物の形態をとることができる。粉末組成物は単位剤形、例えばカプセル若しくはカートリッジ、又は例えば吸入器、送気器若しくは定量吸入具を用いて粉末を投与することができるゼラチン若しくはブリスターパックで与えられ得る。
【0078】
鼻内投与のために、本発明の化合物は点鼻薬又は液体噴霧剤を用いて、例えばプラスチックボトル噴霧器又は定量吸入具を用いて投与することができる。典型的な噴霧器はＭｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Wintrop）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Riker）である。
【0079】
滴剤、例えば点眼薬又は点鼻薬を、１つ又は複数の分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤を更に含む、水性又は非水性基剤を用いて配合することができる。液体噴霧剤は加圧パックから簡便に送達される。滴剤は単純な点眼器である蓋の閉まったボトルを用いて又は特別な形状のクロージャ（closure）によって液体内容物を液滴として送達させるように適合さ
れたプラスチックボトルを用いて送達することができる。
れたプラスチックボトルを用いて送達することができる。
【0080】
配合物は単回用量又は複数回用量の封止容器、例えばアンプル及びバイアル内に与えられ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい凍結乾燥条件で保管することができる。即時注射溶液及び懸濁液を上記のタイプの滅菌粉末、細粒及び錠剤から調製することができる。
【0081】
本発明によって提供される投与配合物は、本発明の治療用化合物を、単独で又は他の治療的に活性な成分及び薬学的に許容可能な不活性賦形剤と組み合わせて含有することができる。「薬学的に許容可能な不活性賦形剤」という用語は、希釈剤、結合剤、潤滑剤／滑剤、着色剤及び放出調節ポリマーの内の少なくとも１つを含む。
【0082】
好適な抗酸化剤は当該技術分野において知られる１つ又は複数の薬学的に許容可能な抗酸化剤の中から選択され得る。薬学的に許容可能な抗酸化剤の例としては、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、亜硫酸ナトリウム、クエン酸、リンゴ酸及びアスコルビン酸が挙げられる。抗酸化剤は投与配合物の約０．００１重量％～約５重量％の濃度で本発明の投与配合物に存在し得る。
【0083】
好適なキレート剤は当該技術分野において知られる１つ又は複数のキレート剤の中から選択され得る。好適なキレート剤の例としては、エデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、エデト酸、クエン酸及びそれらの組合せが挙げられる。キレート剤は投与配合物の約０．００１重量％～約５重量％の濃度で存在し得る。
【0084】
剤形は、典型的に約２０重量％～約８０重量％の範囲内の量で１つ又は複数の希釈剤、例えばラクトース、糖、コーンスターチ、加工コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、及び／又は木材セルロース及び微結晶性セルロース等のセルロース誘導体を含むことができる。
【0085】
剤形は最大約６０％（ｗ／ｗ）の量で１つ又は複数の結合剤を含むことができる。好適な結合剤の例としては、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、オイドラギット、エチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリビニルアルコール、プルラン、カルボマー、アルファ化デンプン、寒天、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、微結晶性セルロース等が挙げられる。
【0086】
好適な崩壊剤の例としては、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。濃度は剤形の０．１重量％～１５重量％と様々であり得る。
【0087】
潤滑剤／滑剤の例としては、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、硬化ヒマシ油、脂肪酸のスクロースエステル、微結晶性ワックス、黄蝋、白蝋等が挙げられる。濃度は剤形の０．１重量％～１５重量％と様々であり得る。
【0088】
放出調節ポリマーは、本発明の治療用化合物を含有する長期放出配合物を形成するのに使用することができる。放出調節ポリマーは水溶性ポリマー又は水不溶性ポリマーのいずれであってもよい。水溶性ポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸ビニルコポリマー、ポリエチレンオキシド、多糖類（例えばアルギン酸塩、キサンタンガム等）、メチルセルロース、及びそれらの混合物が挙げられる。水不溶性ポリマーの例としては、メタクリレート、アクリル酸コポリマー等のアクリレート；エチルセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレン、及び高分子量ポリビニルアルコールが挙げられる。
【0089】
Ｒａｌ ＧＴＰアーゼを阻害することによって肺癌の転移を防止、治療又は阻害することができる潜在的な治療剤をスクリーニングする方法であって、（ａ）Ｒａｌ ＧＴＰアーゼと潜在的な治療用化合物とを相互作用する条件下において組み合わせることと、（ｂ）Ｒａｌ ＧＴＰアーゼの酵素活性をモニタリングすることとを含み、潜在的な治療用化合物が添加されていない対照サンプルと比較して酵素活性が阻害されている場合、潜在的な治療用化合物を更なる研究のために選択する、方法も本発明に包含される。一実施形態では、潜在的な治療用化合物は、医薬品、サイトカイン、小分子薬、細胞透過性小分子薬、ホルモン、インターロイキンの組合せ、レクチン、二重特異性抗体、及びペプチド模倣薬からなる群から選択される。
【0090】
本発明の一実施形態は、被験体における癌又は癌の転移の治療又は防止に使用される本発明の化合物に関する。本発明の関連の実施形態は、被験体における癌又は癌の転移の治療又は防止に使用される本発明の組成物に関する。
【0091】
本発明の別の実施形態は、被験体における癌の成長又は転移を阻害する薬剤の調製への本発明の化合物又は組成物のいずれかの使用に関する。
【0092】
本明細書に言及される刊行物又は特許はそれぞれその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【実施例】
【0093】
下記実施例は本開示の或る特定の態様、実施形態及び構成を説明するために与えられており、添付の特許請求の範囲に記載されるような本開示を限定するものとは解釈されない。
【0094】
実施例１－Ｒａｌ阻害剤の分子モデリング
分子モデリングを、かかる分子が不活性状態を安定化することを期待してＲａｌ－ＧＴＰ（活性型）よりもＲａｌ－ＧＤＰ（不活性型）に優先的に結合する化合物を発見するために用いた。活性型及び不活性型のＲａｌＡの三次元構造の検査により、ヌクレオチド結合部位から近いが、それとは異なるポケットの形状の違いが明らかになった（図１）。このポケット（アロステリック部位）は以前に記載のＣ３ｂｏｔ結合部位と同様であり、スイッチ－ＩＩ領域（Ｒａｌ７０～Ｒａｌ７７）、ヘリックスα２（Ｒａｌ７８～Ｒａｌ８５）及びヘリックスα３の一面により構成される（図１Ａ）。比較に使用される結晶構造は、ｅｘｏ８４（ＰＤＢコード１ＺＣ４、図１Ｃ）又はｓｅｃ５（ＰＤＢコード１ＵＡＤ、図１Ｄ）と複合したＲａｌＡ－ＧＤＰ（ＰＤＢコード２ＢＯＶ、図１Ｂ）及びＲａｌＡ－ＧＮＰ（非加水分解性形態のＧＴＰ）を含んでいた。各結合部位について算出された体積はＲａｌＡ－ＧＤＰでは１７５Å３（図１Ｂ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｅｘｏ８４では１５５Å３（図１Ｃ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｓｅｃ５では１１６Å３（図１Ｄ）であった。ＲａｌＢ－ＧＤＰ結晶構造は公表されていないが、ＲａｌＢ－ＧＮＰ構造（ＰＤＢコード２ＫＥ５、図１）では、この結合ポケットは殆ど存在しない。
分子モデリングを、かかる分子が不活性状態を安定化することを期待してＲａｌ－ＧＴＰ（活性型）よりもＲａｌ－ＧＤＰ（不活性型）に優先的に結合する化合物を発見するために用いた。活性型及び不活性型のＲａｌＡの三次元構造の検査により、ヌクレオチド結合部位から近いが、それとは異なるポケットの形状の違いが明らかになった（図１）。このポケット（アロステリック部位）は以前に記載のＣ３ｂｏｔ結合部位と同様であり、スイッチ－ＩＩ領域（Ｒａｌ７０～Ｒａｌ７７）、ヘリックスα２（Ｒａｌ７８～Ｒａｌ８５）及びヘリックスα３の一面により構成される（図１Ａ）。比較に使用される結晶構造は、ｅｘｏ８４（ＰＤＢコード１ＺＣ４、図１Ｃ）又はｓｅｃ５（ＰＤＢコード１ＵＡＤ、図１Ｄ）と複合したＲａｌＡ－ＧＤＰ（ＰＤＢコード２ＢＯＶ、図１Ｂ）及びＲａｌＡ－ＧＮＰ（非加水分解性形態のＧＴＰ）を含んでいた。各結合部位について算出された体積はＲａｌＡ－ＧＤＰでは１７５Å３（図１Ｂ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｅｘｏ８４では１５５Å３（図１Ｃ）、ＲａｌＡ－ＧＮＰ－ｓｅｃ５では１１６Å３（図１Ｄ）であった。ＲａｌＢ－ＧＤＰ結晶構造は公表されていないが、ＲａｌＢ－ＧＮＰ構造（ＰＤＢコード２ＫＥ５、図１）では、この結合ポケットは殆ど存在しない。
【0095】
構造に基づく仮想スクリーニングアプローチを行い、ＲａｌＡ－ＧＤＰのアロステリック部位に結合する小分子を同定した。２．６６ÅのヒトＲａｌＡ－ＧＤＰ（ＰＤＢ：２ＢＯＶ）、ｅｘｏ８４と複合したＲａｌＡ－ＧＮＰ（ＰＤＢ：１ＺＣ４）、ｓｅｃ５と複合したＲａｌＡ－ＧＮＰ（ＰＤＢ：１ＵＡＤ）結晶構造の結晶学的座標はＲＣＳＢタンパク質データバンク（rcsb.org）から取得した。ＡｕｔｏＤｏｃｋ４を初期ライブラリースクリーニングに用いた。ＣｈｅｍＤｉｖライブラリー［ｖ２００６．５、反応基を保有するものを除外した５０００００個の化合物、既知のＡＤＭＥ／毒性、物理化学的特性はｐＨ７での「薬らしさ」パラメーター（リピンスキーの５の法則及びＶｅｂｅｒの２の法則）の範囲外である］はＺＩＮＣデータベースからダウンロードし、剛体ドッキング（rigid docking）プロトコルを用いてＲａｌＡ－ＧＤＰ上の同定された部位にドッキングさせた
。リガンド分子に、ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓで提供されるＧａｓｔｅｉｇｅｒ電荷及び極性水素原子をリガンド調製モジュールによって帰属させた。ＡｕｔｏＤｏｃｋ４のＬａｍａｒｃｋｉａｎ遺伝的アルゴリズムを用いて、立体構造探索空間全体にわたるリガンド結合エネルギーを評価した。タンパク質－リガンド複合体をスコアリングし、相互作用エネルギーの算出に続く上位候補の目視検査に基づいて選別することで、８８個の化合物が選択された。
。リガンド分子に、ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓで提供されるＧａｓｔｅｉｇｅｒ電荷及び極性水素原子をリガンド調製モジュールによって帰属させた。ＡｕｔｏＤｏｃｋ４のＬａｍａｒｃｋｉａｎ遺伝的アルゴリズムを用いて、立体構造探索空間全体にわたるリガンド結合エネルギーを評価した。タンパク質－リガンド複合体をスコアリングし、相互作用エネルギーの算出に続く上位候補の目視検査に基づいて選別することで、８８個の化合物が選択された。
【0096】
実施例２－細胞ベースの機能アッセイ
選択された８８個の化合物を、培養物中の生細胞におけるＲａｌＡ活性化を阻害するそれらの能力について評価した。
選択された８８個の化合物を、培養物中の生細胞におけるＲａｌＡ活性化を阻害するそれらの能力について評価した。
【0097】
ヒト膀胱癌細胞株Ｊ８２、並びに肺癌細胞株Ｈ２１２２、Ｈ３５８、Ｈ４６０及びＣａｌｕ６はATCCから入手した。使用される抗体はヒトＲａｌＡ（BD Biosciences、＃６１０２２２）、ＲａｌＢ（Millipore ＃０４－０３７）及びＦＬＡＧタグ（Novagen ＃７１０９７）に対するものである。Ｒａｓ（＃ＢＫ００８）及びＲｈｏＡ（＃ＢＫ０３６）の活性アッセイキットはCytoskeleton（Denver，CO）から入手した。そのエフェクタータンパク質ＲａｌＢＰ１への活性型ＲａｌＡ－ＧＴＰの選択的結合に基づくＲａｌ活性についてのＥＬＩＳＡを用いた。
【0098】
ＦＬＡＧ－ＲａｌＡを安定に過剰発現するＪ８２細胞を６ウェルプレートに１ウェル当たり８０００００細胞プレーティングし、１６時間インキュベートした。細胞を、試験化合物（５０μＭ）又はＤＭＳＯ対照（１時間；３７℃）を含有する５００μｌの新鮮培地で処理した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、氷冷溶解バッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ ｃａ－６３０、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２及びプロテアーゼ阻害剤を含有する７５０μｌ）に採取した。溶解物を遠心分離によって清澄化した後、上清を急速冷凍し、試験するまで－８０℃で保管した。ＥＬＩＳＡアッセイのために、ＨｉｓＧｒａｂニッケルコーティング９６ウェルプレートストリップ（Pierce、＃１５１４２）をＥＬＩＳＡバッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる２００μｌ）で３回洗浄した。次いで、ＲａｌＢＰ１（０．５μｇ／１００μｌ）をウェルに添加し、振動させながらインキュベートした（室温で２時間）。次いで、プレートを２００μｌのＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。プレートを氷上に置き、溶解物又は溶解バッファー対照（１００μｌ）をウェルに四連で添加した。次いで、プレートを振動させながら４℃で一晩インキュベートし、続いて氷冷ＥＬＩＳＡバッファーで２回洗浄した。次いで、マウス抗ＦＬＡＧ（Sigma、Ｆ１８０４）抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中で
２００００倍）を１ウェル当たり１００μｌ添加し、インキュベートした（１時間、４℃）。３回洗浄した後、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（Pierce、＃３１４３０）（２５００倍）を１ウェル当たり１００μｌ添加し、インキュベートした（１時間、４℃）。３回洗浄した後にＨＲＰ基質（Vector Laboratories、＃ＳＫ－４４００）を
各ウェルに１００μｌ添加し、１時間室温でインキュベートした。硫酸（１００μｌ、２Ｎ）を添加することによって反応を停止させた。吸光度をＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ
Ｈ１プレートリーダー（BioTek Instruments, Inc.，Winooski，VT）においてＯＤ４５０で読み取った。ＯＤ５４０での同じウェルについての読み取り値を減算することによって、吸光度をバックグラウンド吸光度に対して補正した。
ＭｇＣｌ２及びプロテアーゼ阻害剤を含有する７５０μｌ）に採取した。溶解物を遠心分離によって清澄化した後、上清を急速冷凍し、試験するまで－８０℃で保管した。ＥＬＩＳＡアッセイのために、ＨｉｓＧｒａｂニッケルコーティング９６ウェルプレートストリップ（Pierce、＃１５１４２）をＥＬＩＳＡバッファー（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２からなる２００μｌ）で３回洗浄した。次いで、ＲａｌＢＰ１（０．５μｇ／１００μｌ）をウェルに添加し、振動させながらインキュベートした（室温で２時間）。次いで、プレートを２００μｌのＥＬＩＳＡバッファーで３回洗浄した。プレートを氷上に置き、溶解物又は溶解バッファー対照（１００μｌ）をウェルに四連で添加した。次いで、プレートを振動させながら４℃で一晩インキュベートし、続いて氷冷ＥＬＩＳＡバッファーで２回洗浄した。次いで、マウス抗ＦＬＡＧ（Sigma、Ｆ１８０４）抗体（ＥＬＩＳＡバッファー中で
２００００倍）を１ウェル当たり１００μｌ添加し、インキュベートした（１時間、４℃）。３回洗浄した後、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体（Pierce、＃３１４３０）（２５００倍）を１ウェル当たり１００μｌ添加し、インキュベートした（１時間、４℃）。３回洗浄した後にＨＲＰ基質（Vector Laboratories、＃ＳＫ－４４００）を
各ウェルに１００μｌ添加し、１時間室温でインキュベートした。硫酸（１００μｌ、２Ｎ）を添加することによって反応を停止させた。吸光度をＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ
Ｈ１プレートリーダー（BioTek Instruments, Inc.，Winooski，VT）においてＯＤ４５０で読み取った。ＯＤ５４０での同じウェルについての読み取り値を減算することによって、吸光度をバックグラウンド吸光度に対して補正した。
【0099】
ＦＬＡＧタグ付きＲａｌＡを安定に発現するＪ８２ヒト膀胱癌細胞により、抗Ｒａｌ抗体によってもたらされるよりもタンパク質検出が改善された。これによりアッセイに対するダイナミックレンジの増強が得られた。結合したＲａｌＡの量は相対活性化状態に比例していた。
【0100】
独立アプローチを用いて、フィブロネクチンコーティングカバースリップ上のネズミ胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の拡散時に脂質ラフトエキソサイトーシスに必要とされるＲａｌＡ活性を評定した。簡潔に述べると、野生型又はカベオリン－／－マウス胎児線維芽細胞を２４時間飢餓状態にし、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Innovative Cell Technologies Inc.，San
Diego，CA）を用いて培養プレートから剥離し、０．２％血清及び０．５％メチルセルロースを含むＤＭＥＭに再懸濁し、懸濁液中に保持した（９０分間、３７℃）。懸濁液中で細胞を阻害剤（５０μＭ又はＤＭＳＯ対照、１時間）で処理した。処理の後、細胞を０．２％血清を含有するＤＭＥＭで１回リンスし、全ての処理による同数の細胞を、一晩コーティングした（４℃、２μｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン）２４ウェルプレートに添加した。細胞を３０分間拡散させた後、標準プロトコルを用いてホルムアルデヒドで固定した。可視化を可能にするために、細胞をＬａｖａ Ｃｅｌｌ（Active Motif）で標識し、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００蛍光顕微鏡で可視化した。各ウェルの３つの異なる領域を撮像し、ＩｍａｇｅＪ（NIH）を用いて細胞拡散領域を定量化した。
Diego，CA）を用いて培養プレートから剥離し、０．２％血清及び０．５％メチルセルロースを含むＤＭＥＭに再懸濁し、懸濁液中に保持した（９０分間、３７℃）。懸濁液中で細胞を阻害剤（５０μＭ又はＤＭＳＯ対照、１時間）で処理した。処理の後、細胞を０．２％血清を含有するＤＭＥＭで１回リンスし、全ての処理による同数の細胞を、一晩コーティングした（４℃、２μｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン）２４ウェルプレートに添加した。細胞を３０分間拡散させた後、標準プロトコルを用いてホルムアルデヒドで固定した。可視化を可能にするために、細胞をＬａｖａ Ｃｅｌｌ（Active Motif）で標識し、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ３００蛍光顕微鏡で可視化した。各ウェルの３つの異なる領域を撮像し、ＩｍａｇｅＪ（NIH）を用いて細胞拡散領域を定量化した。
【0101】
これらの細胞においては、ＲａｌＡのｓｉＲＮＡ枯渇により拡散が阻害される一方で、カベオリン（Ｃａｖ１）－／－ＭＥＦはＲａｌＡ枯渇に抵抗性を示す。ヒトＲａｌＡ及びＲａｌＢ又はその両方に対するｓｉＲＮＡは、公表されている配列を用いてDharmacon（Boulder，CO）から入手した。
【0102】
実施例３－ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
標的への化合物の直接結合を確認するために、ＴＲＯＳＹ １５Ｎ－ＨＳＱＣ（横緩和最適化異核種単一量子コヒーレンス）ＮＭＲを用いた。ｐＥＴ１６ｂ（Novagen）プラス
ミド中のＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ突然変異体）は、Darerca Owen博士（ケンブリッジ大学）の好意により提供された。ＲａｌＢを、ＧＤＰ又は非加水分解性形態のＧＴＰ、ＧＭＰＮＰ
Ｐ（ＧＮＰ、Sigma-Aldrich）をローディングする付加的な工程により精製した。均一１
３Ｃ１５Ｎ二重標識タンパク質を、１５Ｎ－ＮＨ４Ｃｌ及び１３Ｃ－グルコースを添加したＭ９培地中で作製した。サンプルをＮＭＲのために５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２中で調製した。全てのＮＭＲ実験をＡｇｉｌｅｎｔ ９００ＭＨｚシステムにおいて２５℃で記録した。ＲａｌＢ－ＧＮＰ複合体についての共鳴帰属（Resonance assignments）は、生体分子磁気共鳴データバン
ク（ＢＭＲＢ、コード：１５２３０）に寄託された以前に公表された研究から得られた。ＲａｌＢ－ＧＤＰ複合体の化学シフト帰属は、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ及びＣＯＣＮＨ－ＴＯＣＳＹ実験を用いて独立して得られた。全てのＮＭＲデータをＮＭＲＰｉｐｅを用いて処理し、ＣＣＰＮＭＲ分析プログラムを用いて分析した。帰属はＰＩＮＥに続く手動検証を用いる自動化帰属によって得られた。１５Ｎ－ＨＳＱＣ実験を用いてＲａｌＢタンパク質（１００μＭ）からのアミドシフトをモニタリングし、続いて重水素化ＤＭＳＯ中で再構成した化合物を添加した。最終サンプル中のＤＭＳＯ濃度は０．５％又は１％であった。対照サンプルは０．５％又は１％重水素化ＤＭＳＯから作製し、化合物を含有する全てのサンプルをそれらの対応するＤＭＳＯ対照と比較した。
標的への化合物の直接結合を確認するために、ＴＲＯＳＹ １５Ｎ－ＨＳＱＣ（横緩和最適化異核種単一量子コヒーレンス）ＮＭＲを用いた。ｐＥＴ１６ｂ（Novagen）プラス
ミド中のＲａｌＢ（Ｑ７２Ｌ突然変異体）は、Darerca Owen博士（ケンブリッジ大学）の好意により提供された。ＲａｌＢを、ＧＤＰ又は非加水分解性形態のＧＴＰ、ＧＭＰＮＰ
Ｐ（ＧＮＰ、Sigma-Aldrich）をローディングする付加的な工程により精製した。均一１
３Ｃ１５Ｎ二重標識タンパク質を、１５Ｎ－ＮＨ４Ｃｌ及び１３Ｃ－グルコースを添加したＭ９培地中で作製した。サンプルをＮＭＲのために５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２中で調製した。全てのＮＭＲ実験をＡｇｉｌｅｎｔ ９００ＭＨｚシステムにおいて２５℃で記録した。ＲａｌＢ－ＧＮＰ複合体についての共鳴帰属（Resonance assignments）は、生体分子磁気共鳴データバン
ク（ＢＭＲＢ、コード：１５２３０）に寄託された以前に公表された研究から得られた。ＲａｌＢ－ＧＤＰ複合体の化学シフト帰属は、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ及びＣＯＣＮＨ－ＴＯＣＳＹ実験を用いて独立して得られた。全てのＮＭＲデータをＮＭＲＰｉｐｅを用いて処理し、ＣＣＰＮＭＲ分析プログラムを用いて分析した。帰属はＰＩＮＥに続く手動検証を用いる自動化帰属によって得られた。１５Ｎ－ＨＳＱＣ実験を用いてＲａｌＢタンパク質（１００μＭ）からのアミドシフトをモニタリングし、続いて重水素化ＤＭＳＯ中で再構成した化合物を添加した。最終サンプル中のＤＭＳＯ濃度は０．５％又は１％であった。対照サンプルは０．５％又は１％重水素化ＤＭＳＯから作製し、化合物を含有する全てのサンプルをそれらの対応するＤＭＳＯ対照と比較した。
【0103】
ＧＮＰと複合したＲａｌＢのＮＭＲ構造のみが解明されていることから（ＰＤＢコード２ＫＥ５、ＢＭＲＢエントリ１５２３０）、このアイソフォームに着目した。ＲａｌＢ－ＧＤＰ及びＲａｌＢ－ＧＮＰの１５Ｎ－ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルを初めに決定し、化学シフト差を分析した。次いで、ＮＭＲスペクトルをＲＢＣ８又はＤＭＳＯ対照の存在下で記録した。タンパク質への小分子の結合を１５Ｎ－ＨＳＱＣタンパク質アミドピークの摂動によってモニタリングした。１００μＭ ＲＢＣ８の非存在下及び存在下におけるＲａｌＢ－ＧＤＰ（１００μＭ）の１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルにより、アロステリック部位に位置する代表的な残基のピーク位置の変化が示された。一方で、ＮＭＲスペクトルの最小化学シフト変化によって示されるように、ＲＢＣ８は同じ条件下でＲａｌＢ－ＧＮＰに結合しなかった。
【0104】
構造的特徴を含む全てのデータに基づき、一連のＲＢＣ８誘導体を合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合について試験した。ＲＢＣ８と比較して優れたその性能及び薬らしい特性からＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５を更なる評価に選んだ（図３Ａ、図２）。
【0105】
化合物ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５の合成スキームを図２Ａに示す。
【0106】
Ａ．６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（ＢＱＵ５７）：
エタノール（１０ｍＬ）中の４－（トリフルオロメチル）ベンズアルデヒド（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４００μＬｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を１．０分間撹拌し、その後１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（３２１ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、蓋をし、室温で（２２時間）撹拌した後、濃縮し、クロマトグラフィ（ＳｉＯ２；塩化メチレン中２％ＭｅＯＨ）によって精製して、ＢＱＵ５７（４４５ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、収率４６％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ－Ｄ６：７．２８（ｓ，４Ｈ）、７．１０（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ－Ｄ６：１６０．１、１４７．６、１４４．７、１４３．９、１４２．９、１２９．９、１２２．３、１２１．４、１２０．６、９６．２、５８．２、３６．８、３３．９、１２．８。
エタノール（１０ｍＬ）中の４－（トリフルオロメチル）ベンズアルデヒド（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４００μＬｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）を１．０分間撹拌し、その後１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（３２１ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加し、蓋をし、室温で（２２時間）撹拌した後、濃縮し、クロマトグラフィ（ＳｉＯ２；塩化メチレン中２％ＭｅＯＨ）によって精製して、ＢＱＵ５７（４４５ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、収率４６％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ－Ｄ６：７．２８（ｓ，４Ｈ）、７．１０（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ－Ｄ６：１６０．１、１４７．６、１４４．７、１４３．９、１４２．９、１２９．９、１２２．３、１２１．４、１２０．６、９６．２、５８．２、３６．８、３３．９、１２．８。
【0107】
Ｂ．６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－４－（４－（トリフルオロメトキシ）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（ＢＱＵ０８５）： エタノール（６．０ｍＬ）中の４－（トリフルオロメトキシ）ベンズアル
デヒド（０．３２７ｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を１０分間撹拌し、その後１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン中の２％メタノール）によって精製して、ＢＱＵ＿０３＿８５（１７４ｍｇ、０．４２１ｍｍｏｌ、２５％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４７～７．４５（ｄ，２Ｈ）、７．２６～７．２４（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１４（ｍ，７Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．３、１４７．４、１４６．０、１４４．７、１４４．１、１３３．１、１２９．８、１２８．６、１２８．０、１２６．５、１２１．７、１２１．２、１２０．４、９５．３、５９．３、３７．４、３４．５。
デヒド（０．３２７ｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を１０分間撹拌し、その後１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン中の２％メタノール）によって精製して、ＢＱＵ＿０３＿８５（１７４ｍｇ、０．４２１ｍｍｏｌ、２５％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４７～７．４５（ｄ，２Ｈ）、７．２６～７．２４（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１４（ｍ，７Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．３、１４７．４、１４６．０、１４４．７、１４４．１、１３３．１、１２９．８、１２８．６、１２８．０、１２６．５、１２１．７、１２１．２、１２０．４、９５．３、５９．３、３７．４、３４．５。
【0108】
ＢＱＵ５７とＲａｌＢ－ＧＤＰとの間の結合の詳細なＮＭＲ滴定を行った。１００μＭ
ＢＱＵ５７の非存在下（黒色）及び存在下（赤紫色）のＲａｌＢ－ＧＤＰ（１００μＭ）のＮＭＲスペクトルを図３Ｂに示す。用量依存的な化学シフト変化を受ける代表的な残基を図３Ｃに示す。１００μＭのＢＱＵ５７による化学シフト変化マップを生成したが（図３Ｄ）、顕著な化学シフト変化を示す残基の大半（強調表示バー）はスイッチ－ＩＩ（ａａ７０～７７）及びヘリックスα２（ａａ７８～８５）領域に位置していた。ＲａｌＢ－ＧＤＰの結晶構造の非存在下で、ＲａｌＡ－ＧＤＰに対する配列類似性に基づいて相同性モデルを生成し、薬物の存在下で化学シフト変化を受けた残基をこのモデルにマップした（図３Ｅ）。これにより、化学シフト変化の大部分がアロステリック部位に局在化していたことが示され、ＢＱＵ５７が予測部位に結合していることが確認される。ＲＢＣ８と同様、ＢＱＵ５７（１００μＭ）はＮＭＲスペクトルの最小化学シフト変化によって示されるようにＲａｌＢ－ＧＮＰ（１００μＭ）に結合しなかった（図２Ｂ）。
ＢＱＵ５７の非存在下（黒色）及び存在下（赤紫色）のＲａｌＢ－ＧＤＰ（１００μＭ）のＮＭＲスペクトルを図３Ｂに示す。用量依存的な化学シフト変化を受ける代表的な残基を図３Ｃに示す。１００μＭのＢＱＵ５７による化学シフト変化マップを生成したが（図３Ｄ）、顕著な化学シフト変化を示す残基の大半（強調表示バー）はスイッチ－ＩＩ（ａａ７０～７７）及びヘリックスα２（ａａ７８～８５）領域に位置していた。ＲａｌＢ－ＧＤＰの結晶構造の非存在下で、ＲａｌＡ－ＧＤＰに対する配列類似性に基づいて相同性モデルを生成し、薬物の存在下で化学シフト変化を受けた残基をこのモデルにマップした（図３Ｅ）。これにより、化学シフト変化の大部分がアロステリック部位に局在化していたことが示され、ＢＱＵ５７が予測部位に結合していることが確認される。ＲＢＣ８と同様、ＢＱＵ５７（１００μＭ）はＮＭＲスペクトルの最小化学シフト変化によって示されるようにＲａｌＢ－ＧＮＰ（１００μＭ）に結合しなかった（図２Ｂ）。
【0109】
ＮＭＲ化学シフト滴定の分析から、ＢＱＵ５７の結合が薬物の見掛けの溶解性の限界（タンパク質を用いない対照実験においておよそ７５μＭと推定される）まで化学量論的であることが明らかになった（図２Ｃ）。したがって、ＲａｌＢ－ＧＤＰへのＢＱＵ５７の結合を次いで等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）を用いて決定した。ＩＴＣ実験はＭｉｃｒｏＣａｌ ｉＴＣ２００システムを用いて行った。タンパク質及び薬物の両方を５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２中で調製した。最終ＤＭＳＯ濃度を１％に調整した。ＲａｌＢ－ＧＤＰタンパク質（５００μＭ）をシリンジに充填し、薬物（２５μＭ）又は対照としてのバッファー単独に滴定した。全ての実験を２５℃で行った。ＩＴＣによりＫＤ＝７．７±０．６μＭが得られた（図３Ｆ）。この結果を表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によって確認した。ＳＰＲ実験はＢｉａｃｏｒｅ ３０００システムを用いて行った。泳動バッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１μＭ ＧＤＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、３％ＤＭＳＯ。再生バッファー：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１μＭ ＧＤＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２。ＲａｌＢタンパク質をＣＭ５チップに固定化し、泳動バッファー中の化合物ＢＱＵ５７のサンプルを３０μＬ／分で６０秒の接触時間にわたって注入し、続いて５分間再生した。アッセイの感度の低さにもかかわらずＳＰＲにより４．７±１．５μＭのＫＤが得られた。
【0110】
示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）を用いて化合物とＲａｌＢ－ＧＤＰとの間の結合を評価した。タンパク質の疎水性領域に結合するＳＹＰＲＯオレンジの増大をモニタリングすることによって融解温度を測定した。２０ｍＭトリス（ＰＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１ｍＭ ＤＴＴバッファー中に１０μＭ ＲａｌＢ－ＧＤＰ及び１０μＭ ＲａｌＢ－ＧＰＮＰＰ、４×ＳＹＰＲＯオレンジを含有するプレートを作製することによってＤＳＦを行った。試験化合物を各ウェルに添加し、ＤＭＳＯの最終濃度が全てのサンプルにわたって１％であることを確実にした。熱融解曲線をＬｉｇｈｔ
ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Roche）で得た。曲線を正規化し、遷移曲線の中点の温度を得
ることによって融解温度を得た。ＤＳＦによりＢＱＵ５７とＲａｌＢ－ＧＤＰとの間の用量依存的結合が確認され、ヌクレオチド依存性も実証された。
ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Roche）で得た。曲線を正規化し、遷移曲線の中点の温度を得
ることによって融解温度を得た。ＤＳＦによりＢＱＵ５７とＲａｌＢ－ＧＤＰとの間の用量依存的結合が確認され、ヌクレオチド依存性も実証された。
【0111】
実施例４－ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト癌細胞成長に対する効果
ヒト肺癌細胞成長に対するＲＢＣ８及びＢＱＵ５７の効果を評価した。足場非依存性におけるＲａｌの役割は既知であるため、軟寒天における成長阻害アッセイを行った。４つのヒト肺癌細胞Ｈ２１２２、Ｈ３５８、Ｈ４６０及びＣａｌｕ６を薬物取込み、生物学的特異性及び効果を決定するために一連の実験で使用した。軟寒天における足場非依存性条件下のヒト肺癌細胞の成長阻害を測定するために、様々な濃度の薬物を含有する３ｍｌの０．４％低融点アガロース中の細胞を６ウェルプレート（２ｍｌの１％低融点アガロースで作られる基層でコーティングした）に１ウェル当たり１５０００細胞播種した。（細胞株に応じて）インキュベーションの２週間～４週間後に、細胞を１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴで染色し、コロニーを顕微鏡下で計数した。ＩＣ５０値は、ＤＭＳＯ処理対照と比較してコロニー数の５０％の低減をもたらす薬物の濃度として規定した。
ヒト肺癌細胞成長に対するＲＢＣ８及びＢＱＵ５７の効果を評価した。足場非依存性におけるＲａｌの役割は既知であるため、軟寒天における成長阻害アッセイを行った。４つのヒト肺癌細胞Ｈ２１２２、Ｈ３５８、Ｈ４６０及びＣａｌｕ６を薬物取込み、生物学的特異性及び効果を決定するために一連の実験で使用した。軟寒天における足場非依存性条件下のヒト肺癌細胞の成長阻害を測定するために、様々な濃度の薬物を含有する３ｍｌの０．４％低融点アガロース中の細胞を６ウェルプレート（２ｍｌの１％低融点アガロースで作られる基層でコーティングした）に１ウェル当たり１５０００細胞播種した。（細胞株に応じて）インキュベーションの２週間～４週間後に、細胞を１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴで染色し、コロニーを顕微鏡下で計数した。ＩＣ５０値は、ＤＭＳＯ処理対照と比較してコロニー数の５０％の低減をもたらす薬物の濃度として規定した。
【0112】
ｓｉＲＮＡ処理によって誘導される成長効果については、細胞を記載の方法及び配列を用いてＲａｌＡ、ＲａｌＢ又はその両方（ＲａｌＡ／Ｂ）に対する５０ｎＭ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。７２時間後、細胞を軟寒天コロニー形成アッセイに供した。
【0113】
化学遺伝学実験のために、ｓｉＲＮＡ処理細胞を様々な濃度の薬物の存在下で軟寒天に播種した。過剰発現実験のために、ＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖを安定に過剰発現するＨ３５８細胞を生成し、細胞を薬物の存在下で軟寒天コロニー形成アッセイに供した。Ｈ２１２２細胞においてＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖを安定に過剰発現する試みは失敗に終わり、Ｈ２１２２を用いたレスキュー実験をＦＬＡＧ、ＦＬＡＧ－ＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＦＬＡＧ－ＲａｌＢＧ２３Ｖの一過性トランスフェクションの７２時間後に薬物の存在下で軟寒天コロニー形成アッセイを用いて行った。
【0114】
試験化合物がどの程度細胞に入り込むかを定量化するために、Ｈ２１２２ヒト肺癌細胞を６ウェルプレートに１ウェル当たり３×１０５細胞播種し、１６時間静置した。化合物（１０μＭ）を個別に三連で投与した。次いで、細胞を５００μｌの氷冷ＡＣＮ：ＭｅＯＨ：Ｈ２０（１：１：１）に異なる時点（１分、５分、１５分、３０分及び６０分）で採取した。次いで、細胞溶解物中の薬物濃度をマウスにおける薬物動態研究及び薬力学研究に関して記載され、下記実施例５に詳細に説明されるＬＣ／ＭＳ－ＭＳ法を用いて決定した。
【0115】
ＲＢＣ８、ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５の細胞取込みを試験することにより、全ての薬物が細胞に容易に入り込むことが示された（図６）。薬物処理によりＲａｌ活性がＨ２１２２及びＨ３５８細胞において阻害されることを確認するために、Ｒａｌ活性プルダウンアッセイを行った。細胞を薬物で３時間処理し、採取し、Ｒａｌ活性をＲａｌＢＰ１プルダウンアッセイキット（Millipore ＃１４－４１５）を用いて測定した。ＲＢＣ５ではな
く、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７が両方の細胞株においてＲａｌＡ及びＲａｌＢ活性の両方を阻害した（図６Ｅ）。
く、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７が両方の細胞株においてＲａｌＡ及びＲａｌＢ活性の両方を阻害した（図６Ｅ）。
【0116】
付加的に、全ての株がＫ－Ｒａｓ ｓｉＲＮＡ枯渇に対して感受性を有することが見出されたが（図７Ａ、図７Ｂ）、Ｈ２１２２及びＨ３５８のみがＲａｌノックダウンに対して感受性を有していた（図７Ｃ、図７Ｄ）。この特徴を用いて、密接に関連したＧＴＰアーゼであるＲａｓと比較したＲａｌに対する化合物の特異性を決定することで、軟寒天におけるコロニー形成の阻害を評価し、Ｈ４６０又はＣａｌｕ６細胞ではなくＲａｌ依存性
株Ｈ２１２２及びＨ３５８が感受性を有することに気付いた（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｋ）。ＲＢＣ８に対するＩＣ５０はＨ２１２２では３．５μＭ、Ｈ３５８では３．４μＭ、ＢＱＵ５７に対するＩＣ５０はＨ２１２２では２．０μＭ、Ｈ３５８では１．３μＭであった。次に、ケモゲノミクス実験を行い、Ｒａｌに対する薬物特異性を更に決定した。ＲＢＣ８又はＢＱＵ５７によるＲａｌＡ及びＲａｌＢのｓｉＲＮＡノックダウンを有するＨ２１２２及びＨ３５８細胞の処理は顕著な更なる阻害をもたらさなかった（図４Ｃ～図４Ｆ、図７Ｅ）。まとめると、このデータからＲＢＣ８、ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５がＲａｌ阻害により足場非依存性成長を低減することが示唆される。
株Ｈ２１２２及びＨ３５８が感受性を有することに気付いた（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｋ）。ＲＢＣ８に対するＩＣ５０はＨ２１２２では３．５μＭ、Ｈ３５８では３．４μＭ、ＢＱＵ５７に対するＩＣ５０はＨ２１２２では２．０μＭ、Ｈ３５８では１．３μＭであった。次に、ケモゲノミクス実験を行い、Ｒａｌに対する薬物特異性を更に決定した。ＲＢＣ８又はＢＱＵ５７によるＲａｌＡ及びＲａｌＢのｓｉＲＮＡノックダウンを有するＨ２１２２及びＨ３５８細胞の処理は顕著な更なる阻害をもたらさなかった（図４Ｃ～図４Ｆ、図７Ｅ）。まとめると、このデータからＲＢＣ８、ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５がＲａｌ阻害により足場非依存性成長を低減することが示唆される。
【0117】
ＲａｌのＧＴＰ型と比較したＧＤＰ型に対する化合物の特異性に対処するために、Ｈ２１２２及びＨ３５８細胞において活性型のＲａｌＡＧ２３Ｖ又はＲａｌＢＧ２３Ｖを構成的に過剰発現させた。Ｇ２３Ｖ突然変異はＧＴＰ加水分解のＲａｌＧＡＰ媒介活性化を防止し、したがってＲａｌをその活性状態にロックする。ＲａｌＡＧ２３Ｖ及びＲａｌＢＧ２３Ｖの両方が、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７化合物の成長阻害効果をレスキューし得ることが見出された（図４Ｇ～図４Ｊ、図７Ｆ）。
【0118】
実施例５－ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態、薬力学及び腫瘍成長
Ｒａｌ活性及び腫瘍成長の阻害をヒト肺癌マウスモデルにおいて評価した。ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７の薬物動態（ＰＫ）をヌードマウスにおいて初めに分析し、バイオアベイラビリティを試験した。単回腹腔内注射（５０ｍｇ／Ｋｇ）の後、血液サンプルを投与後０～５時間の時間間隔（９つの時点）で採取した。曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ及びｔ１／２を含む薬物動態パラメーターをＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるノンコンパートメント法を用いて推定し、良好な薬物候補を規定する有利な特性が示された（上掲の表１を参照されたい）。
Ｒａｌ活性及び腫瘍成長の阻害をヒト肺癌マウスモデルにおいて評価した。ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７の薬物動態（ＰＫ）をヌードマウスにおいて初めに分析し、バイオアベイラビリティを試験した。単回腹腔内注射（５０ｍｇ／Ｋｇ）の後、血液サンプルを投与後０～５時間の時間間隔（９つの時点）で採取した。曲線下面積（ＡＵＣ）、Ｃｍａｘ及びｔ１／２を含む薬物動態パラメーターをＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるノンコンパートメント法を用いて推定し、良好な薬物候補を規定する有利な特性が示された（上掲の表１を参照されたい）。
【0119】
次に腫瘍組織への化合物の侵入を決定した。そのために、無胸腺ヌードマウス（Ｎｃｒ
ｎｕ／ｎｕ；National Cancer Institute，Fredrick，MD）を５週齢～６週齢で入手し
、一定の温度及び湿度の滅菌マイクロアイソレーターケージにおいて２週間順応させた。マウスに食餌及び水を自由摂取させた。対数増殖期のＨ２１２２細胞を使用日に採取した。細胞を無添加ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、０．１ｍＬ（２×１０５細胞）を１匹のマウス当たり４つの部位にｓ．ｃ．注射した。Ｈ３５８異種移植片については、細胞（５×１０６）をマトリゲル（最終濃度２０％）と混合し、１つの部位当たり０．１ｍＬをｓ．ｃ．接種した。細胞接種の後、マウスを毎日モニタリングし、週２回体重を量り、腫瘍が認識された時点でキャリパー測定を始めた。腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２（ここで、Ｌはより長い腫瘍測定値であり、Ｗはより小さい腫瘍測定値である）によって算出した。薬物処理を接種の翌日に開始した。化合物をＤＭＳＯに溶解し、週末を除いて毎日１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．注射した。腫瘍サイズを考慮して対照と薬物処理動物との間の体重の差によって評定されるように、対照（ＤＭＳＯ）又は薬物処理動物において明白な毒性は観察されなかった。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｇに示されるように、相当量の化合物が投与の３時間後に腫瘍組織において検出された。次いで、異種移植腫瘍成長に対するＲａｌ阻害剤の効果をヌードマウスにおいて試験した。マウスにＨ２１２２ヒト肺癌細胞を皮下接種し、接種の２４時間後に５０ｍｇ／ｋｇ／日（週末を除く）のＲＢＣ８で腹腔内処理した。ＲＢＣ８はＲａｌＡ及びＲａｌＢの二重ノックダウン（図５Ｅ）と同じ程度で腫瘍成長を阻害し（図５Ｃ及び図５Ｄ）、二次肺癌株Ｈ３５８は同様の結果をもたらした。ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５をｉｎ ｖｉｖｏでも幾つかの異なる用量（５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日及び５０ｍｇ／ｋｇ／日）で試験したが、用量依存的な成長阻害効果が観察された（図５Ｆ、図５Ｈ）。
ｎｕ／ｎｕ；National Cancer Institute，Fredrick，MD）を５週齢～６週齢で入手し
、一定の温度及び湿度の滅菌マイクロアイソレーターケージにおいて２週間順応させた。マウスに食餌及び水を自由摂取させた。対数増殖期のＨ２１２２細胞を使用日に採取した。細胞を無添加ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、０．１ｍＬ（２×１０５細胞）を１匹のマウス当たり４つの部位にｓ．ｃ．注射した。Ｈ３５８異種移植片については、細胞（５×１０６）をマトリゲル（最終濃度２０％）と混合し、１つの部位当たり０．１ｍＬをｓ．ｃ．接種した。細胞接種の後、マウスを毎日モニタリングし、週２回体重を量り、腫瘍が認識された時点でキャリパー測定を始めた。腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２（ここで、Ｌはより長い腫瘍測定値であり、Ｗはより小さい腫瘍測定値である）によって算出した。薬物処理を接種の翌日に開始した。化合物をＤＭＳＯに溶解し、週末を除いて毎日１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．注射した。腫瘍サイズを考慮して対照と薬物処理動物との間の体重の差によって評定されるように、対照（ＤＭＳＯ）又は薬物処理動物において明白な毒性は観察されなかった。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｇに示されるように、相当量の化合物が投与の３時間後に腫瘍組織において検出された。次いで、異種移植腫瘍成長に対するＲａｌ阻害剤の効果をヌードマウスにおいて試験した。マウスにＨ２１２２ヒト肺癌細胞を皮下接種し、接種の２４時間後に５０ｍｇ／ｋｇ／日（週末を除く）のＲＢＣ８で腹腔内処理した。ＲＢＣ８はＲａｌＡ及びＲａｌＢの二重ノックダウン（図５Ｅ）と同じ程度で腫瘍成長を阻害し（図５Ｃ及び図５Ｄ）、二次肺癌株Ｈ３５８は同様の結果をもたらした。ＢＱＵ５７及びＢＱＵ８５をｉｎ ｖｉｖｏでも幾つかの異なる用量（５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日及び５０ｍｇ／ｋｇ／日）で試験したが、用量依存的な成長阻害効果が観察された（図５Ｆ、図５Ｈ）。
【0120】
最後に、Ｈ２１２２異種移植片においてｉｎ ｖｉｖｏでのＲａｌ ＧＴＰアーゼ活性を評価した。ヌードマウスに５×１０６細胞のＨ２１２２細胞を１匹のマウス当たり４つ
の部位にｓ．ｃ．接種した。腫瘍サイズは１０日間で平均２５０ｍｍ３に達し、その時点でマウスにＲＢＣ８又はＢＱＵ５７の単回ｉ．ｐ．投与を様々な濃度で行った。次いで、腫瘍をＲＢＣ８又はＢＱＵ５７注射の３時間後に採取した。次いで、腫瘍サンプルにおけるＲａｌＡ及びＲａｌＢ活性をＲａｌＢＰ１プルダウンアッセイキット（Millipore ＃
１４－４１５）を用いて測定した。腫瘍サンプルにおけるＲａｓ及びＲｈｏＡ活性を、それぞれのプルダウンアッセイキットを用いて測定した。全ての活性アッセイにウエスタンブロット法を最終読取りとして用いた。免疫ブロットの定量化のために、各ブロットのバンドを初めにそれらのそれぞれの内部対照（最終レーンで泳動した１０ｎｇの組換えＲａｌ、Ｒａｓ又はＲａｌタンパク質）に対して正規化した後、数を各々が１つの処理条件を代表する異なるブロットで比較した。Ｈ２１２２腫瘍（中央サイズ２５０ｍｍ３）を担持するマウスにＲＢＣ８（５０ｍｇ／ｋｇ）又はＢＱＵ５７（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内投与を行い、腫瘍を投与の３時間後に採取した。Ｒａｌ活性のＲａｌＢＰ１プルダウン測定から、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７によるＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方の顕著な阻害が示された。重要なことには、ＢＱＵ５７により誘導される用量依存的なＲａｌ活性の阻害は腫瘍成長の阻害と相関し、Ｒａｓ及びＲｈｏＡ活性がＢＱＵ５７処理腫瘍においても測定され、顕著な阻害は観察されず、これらのＲａｌ阻害剤の選択性が更に実証された。
の部位にｓ．ｃ．接種した。腫瘍サイズは１０日間で平均２５０ｍｍ３に達し、その時点でマウスにＲＢＣ８又はＢＱＵ５７の単回ｉ．ｐ．投与を様々な濃度で行った。次いで、腫瘍をＲＢＣ８又はＢＱＵ５７注射の３時間後に採取した。次いで、腫瘍サンプルにおけるＲａｌＡ及びＲａｌＢ活性をＲａｌＢＰ１プルダウンアッセイキット（Millipore ＃
１４－４１５）を用いて測定した。腫瘍サンプルにおけるＲａｓ及びＲｈｏＡ活性を、それぞれのプルダウンアッセイキットを用いて測定した。全ての活性アッセイにウエスタンブロット法を最終読取りとして用いた。免疫ブロットの定量化のために、各ブロットのバンドを初めにそれらのそれぞれの内部対照（最終レーンで泳動した１０ｎｇの組換えＲａｌ、Ｒａｓ又はＲａｌタンパク質）に対して正規化した後、数を各々が１つの処理条件を代表する異なるブロットで比較した。Ｈ２１２２腫瘍（中央サイズ２５０ｍｍ３）を担持するマウスにＲＢＣ８（５０ｍｇ／ｋｇ）又はＢＱＵ５７（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）の単回腹腔内投与を行い、腫瘍を投与の３時間後に採取した。Ｒａｌ活性のＲａｌＢＰ１プルダウン測定から、ＲＢＣ８及びＢＱＵ５７によるＲａｌＡ及びＲａｌＢの両方の顕著な阻害が示された。重要なことには、ＢＱＵ５７により誘導される用量依存的なＲａｌ活性の阻害は腫瘍成長の阻害と相関し、Ｒａｓ及びＲｈｏＡ活性がＢＱＵ５７処理腫瘍においても測定され、顕著な阻害は観察されず、これらのＲａｌ阻害剤の選択性が更に実証された。
【0121】
実施例６－本発明の化合物の合成
本発明の化合物を以下の合成スキーム及び材料に従って合成した。
本発明の化合物を以下の合成スキーム及び材料に従って合成した。
【0122】
化合物合成スキーム
１，３－二置換－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン
２－（置換）－ベンジリデンマロノニトリル
６－アミノ－１，３－二置換－４－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル
【化6】
２－（置換）－ベンジリデンマロノニトリル
６－アミノ－１，３－二置換－４－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル
【0123】
【表2】
【0124】
材料及び方法
アニスアルデヒド、ベンズアルデヒド、１，４－ベンゾジオキサン－６－カルボキサルデヒド、ベンジル－ヒドラジン、６－ブロモ－２－ピリジンカルボキサルデヒド、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、３，５－ジフルオロベンズアルデヒド、アセト酢酸エチル、ベンゾイル酢酸エチル、３，４－ジメトキシベンゾイル酢酸エチル、エチル－ヒドロクプレイン塩酸塩、４－メトキシベンゾイル酢酸エチル、４－フルオロベンズアルデヒド、３－フルオロ－４－メトキシベンズアルデヒド、４－ホルミルベンゾニトリル、４－イソプロピルベンズアルデヒド、４－
（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ベンズアルデヒド、マロノニトリル、メチル－ヒドラジン、フェニル－ヒドラジン、３－ピリジンカルボキサルデヒド、ナトリウムエトキシド、トリメチルアミン（ＴＥＡ）、２，４，６－トリメトキシベンズアルデヒド及び４－（トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒドはSigma-Aldrich Chemical Company（St. Louis，MO）から購入した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ＨＰＬＣグレードメタノール（Ｍｅ
ＯＨ）、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル（ＡＣＮ）、ＨＰＬＣグレード水（Ｈ２Ｏ）、ギ酸、酢酸アンモニウム、ヘキサン及び塩化メチレン（ＤＣＭ）はFisher Scientific（Pittsburgh，PA）から入手した。エタノールはDecon Laboratories, Inc.（King of Prussia，PA）から購入した。シリカゲル６０Å ４０μｍ～６３μｍはSorbent Technologies（Norcross，GA）から購入した。
アニスアルデヒド、ベンズアルデヒド、１，４－ベンゾジオキサン－６－カルボキサルデヒド、ベンジル－ヒドラジン、６－ブロモ－２－ピリジンカルボキサルデヒド、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、３，５－ジフルオロベンズアルデヒド、アセト酢酸エチル、ベンゾイル酢酸エチル、３，４－ジメトキシベンゾイル酢酸エチル、エチル－ヒドロクプレイン塩酸塩、４－メトキシベンゾイル酢酸エチル、４－フルオロベンズアルデヒド、３－フルオロ－４－メトキシベンズアルデヒド、４－ホルミルベンゾニトリル、４－イソプロピルベンズアルデヒド、４－
（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ベンズアルデヒド、マロノニトリル、メチル－ヒドラジン、フェニル－ヒドラジン、３－ピリジンカルボキサルデヒド、ナトリウムエトキシド、トリメチルアミン（ＴＥＡ）、２，４，６－トリメトキシベンズアルデヒド及び４－（トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒドはSigma-Aldrich Chemical Company（St. Louis，MO）から購入した。酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、ＨＰＬＣグレードメタノール（Ｍｅ
ＯＨ）、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル（ＡＣＮ）、ＨＰＬＣグレード水（Ｈ２Ｏ）、ギ酸、酢酸アンモニウム、ヘキサン及び塩化メチレン（ＤＣＭ）はFisher Scientific（Pittsburgh，PA）から入手した。エタノールはDecon Laboratories, Inc.（King of Prussia，PA）から購入した。シリカゲル６０Å ４０μｍ～６３μｍはSorbent Technologies（Norcross，GA）から購入した。
【0125】
１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは４００ＭＨｚ Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ、Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００を用いて記録した。化学シフトはｐｐｍで報告する。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ（Shimadzu Scientific Instruments, Inc.；Columbia，MD）及びＬｅａ
ｐオートサンプラー（LEAP Technologies；Carrboro，NC）を備えるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｃｉｅｘ ４０００（Applied Biosystems；Foster City，CA）
を使用した。液体クロマトグラフィにはAgilent TechnologiesのＺｏｒｂａｘ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｃ１８ ５０×４．６ｍｍ、５ミクロンカラムを４０℃、０．４ｍＬ／分の流量で用いた。移動相はＡ：Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭ（ＮＨ４ＯＡｃ）、０．１％ギ酸及びＢ：５０：５０のＡＣＮ：ＭｅＯＨからなるものであった。用いたクロマトグラフィ法は１．０分間の９５％Ａ；３．０分時点で９５％Ｂまで増加させ、４．５分間保持し、最後に８．５分時点で９５％Ａに戻し、１．０分間保持することであった（総実行時間９．５分）。合成された化合物を、以下の条件を用いたエレクトロスプレーイオン化陽イオンモード（ＥＳＩ＋）によってモニタリングした：ｉ）５５００Ｖのイオンスプレー電圧；ｉｉ）４５０℃の温度；ｉｉｉ）カーテンガス（ＣＵＲ；１０に設定）及び衝突活性化解離（ＣＡＤ；５に設定）ガスは窒素とした；ｉｖ）イオン源ガス１（ＧＳ１）及び２（ＧＳ２）；ｖ）入口電位を１０Ｖに設定した；ｖｉ）四重極１（Ｑ１）及び（Ｑ３）を単位分解能で設定した；ｖｉｉ）滞留時間を２００ミリ秒に設定した；並びにｖｉｉｉ）デクラスタリング電位（ＤＰ）、衝突エネルギー（ＣＥ）及び衝突セル出口電位（ＣＸＰ）を電圧（Ｖ）とする。サンプル（１０μＬ）をＬＣ／ＭＳ－ＭＳによって分析した。ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析によって判断されるように、精製された全ての化合物は純度が９７％超であった。
ｐオートサンプラー（LEAP Technologies；Carrboro，NC）を備えるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｃｉｅｘ ４０００（Applied Biosystems；Foster City，CA）
を使用した。液体クロマトグラフィにはAgilent TechnologiesのＺｏｒｂａｘ ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｃ１８ ５０×４．６ｍｍ、５ミクロンカラムを４０℃、０．４ｍＬ／分の流量で用いた。移動相はＡ：Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭ（ＮＨ４ＯＡｃ）、０．１％ギ酸及びＢ：５０：５０のＡＣＮ：ＭｅＯＨからなるものであった。用いたクロマトグラフィ法は１．０分間の９５％Ａ；３．０分時点で９５％Ｂまで増加させ、４．５分間保持し、最後に８．５分時点で９５％Ａに戻し、１．０分間保持することであった（総実行時間９．５分）。合成された化合物を、以下の条件を用いたエレクトロスプレーイオン化陽イオンモード（ＥＳＩ＋）によってモニタリングした：ｉ）５５００Ｖのイオンスプレー電圧；ｉｉ）４５０℃の温度；ｉｉｉ）カーテンガス（ＣＵＲ；１０に設定）及び衝突活性化解離（ＣＡＤ；５に設定）ガスは窒素とした；ｉｖ）イオン源ガス１（ＧＳ１）及び２（ＧＳ２）；ｖ）入口電位を１０Ｖに設定した；ｖｉ）四重極１（Ｑ１）及び（Ｑ３）を単位分解能で設定した；ｖｉｉ）滞留時間を２００ミリ秒に設定した；並びにｖｉｉｉ）デクラスタリング電位（ＤＰ）、衝突エネルギー（ＣＥ）及び衝突セル出口電位（ＣＸＰ）を電圧（Ｖ）とする。サンプル（１０μＬ）をＬＣ／ＭＳ－ＭＳによって分析した。ＮＭＲ及びＬＣ／ＭＳ－ＭＳ分析によって判断されるように、精製された全ての化合物は純度が９７％超であった。
【0126】
合成：
３－メチル－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（１）： アセト酢酸エチル（９．０２ｍＬ、７１．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ溶液（１３０ｍＬ）を、０℃においてフェニル－ヒドラジン（７．００ｇ、６４．７ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温した後、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって精製して、１（７．６０ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、収率６７％）を明黄色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．８７～７．８５（ｄ，２Ｈ）、７．４１～７．３７（ｔ，２Ｈ）、７．１９～７．１６（ｔ，１Ｈ）、３．４２（ｓ，２Ｈ）、２．１９（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７０．５、１５６．２、１３８．０、１２８．８、１２５．０、１１８．８、４３．０、１７．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：１７５．０→７７．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝２５、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝３．５２分。
３－メチル－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（１）： アセト酢酸エチル（９．０２ｍＬ、７１．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ溶液（１３０ｍＬ）を、０℃においてフェニル－ヒドラジン（７．００ｇ、６４．７ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温した後、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって精製して、１（７．６０ｇ、４３．６ｍｍｏｌ、収率６７％）を明黄色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．８７～７．８５（ｄ，２Ｈ）、７．４１～７．３７（ｔ，２Ｈ）、７．１９～７．１６（ｔ，１Ｈ）、３．４２（ｓ，２Ｈ）、２．１９（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７０．５、１５６．２、１３８．０、１２８．８、１２５．０、１１８．８、４３．０、１７．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：１７５．０→７７．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝２５、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝３．５２分。
【0127】
１，３－ジメチル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（２）： ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）中のアセト酢酸エチル（１５．１ｍＬ、１１９ｍｍｏｌ）を、０℃においてメチル－ヒドラジン（５．００ｇ、１０９ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加
温した後、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって精製して、結晶化（ＤＣＭ及びヘキサン）による精製後に２（８．０２ｇ、７１．５ｍｍｏｌ、収率６６％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：３．２５（ｓ，３Ｈ）、３．１６（ｓ，２Ｈ）、２．０８（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７２．２、１５５．４、１３８．０、４１．３、３１．０、１６．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：１１３．２→８２．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝２５、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝２．９分。
温した後、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって精製して、結晶化（ＤＣＭ及びヘキサン）による精製後に２（８．０２ｇ、７１．５ｍｍｏｌ、収率６６％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：３．２５（ｓ，３Ｈ）、３．１６（ｓ，２Ｈ）、２．０８（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７２．２、１５５．４、１３８．０、４１．３、３１．０、１６．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：１１３．２→８２．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝２５、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝２．９分。
【0128】
１－メチル－３－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（３）： ＥｔＯＨ（１８０ｍＬ）中のベンゾイル酢酸エチル（１８．４ｍＬ、９５．５ｍｍｏｌ）を、０℃においてメチル－ヒドラジン（４．５７ｍＬ、８６．８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温した後、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって精製して、結晶化（エタノール）による精製後に３（１１．０ｇ、６３．１ｍｍｏｌ、収率７３％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．６７～７．６５（ｍ，２Ｈ）、７．４２～７．４１（ｍ，３Ｈ）、３．６０（ｓ，２Ｈ）、３．４１（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７１．８、１５４．２、１３１．０、１３０．３、１２８．８、１２５．６、３７．９、３１．４。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：１７５．０→７７．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝４３、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝３．４５分。
【0129】
１，３－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（４）： ＥｔＯＨ（１３０ｍＬ）中のベンゾイル酢酸エチル（１２．２ｍＬ、７１．２ｍｍｏｌ）を、０℃においてフェニル－ヒドラジン（７．００ｇ、７１．２ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温し、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：４）及び結晶化（ＥｔＯＨ）によって精製して、４をオフホワイト色の固体（６．７５ｇ、２８．６ｍｍｏｌ、収率４４％）として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１１．８（ｓ，１Ｈ）、７．８４～７．８２（ｄ，４Ｈ）、７．５０～７．４０（ｍ，４Ｈ）、７．３４～７．２７（ｍ，２Ｈ）、６．０２（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５４．２、１５０．０、１３９．３、１３３．８、１２９．３、１２９．０、１２８．２、１２６．１、１２５．５、１２１．５、８５．５；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２３７．０→７７．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８１、ＣＥ＝６８、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝４．１５分。
【0130】
１－ベンジル－３－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（５）： ベンゾイル酢酸エチル（４．８０ｍＬ、２８．２ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ溶液（６０ｍＬ）を、０℃においてベンジル－ヒドラジン（５．００ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温して、６０℃に加熱した（１６時間）。反応混合物を濃縮して、ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）で希釈した後、３．０ｇのナトリウムエトキシドを添加し、撹拌した（４０時間）。固体を瀘別し溶媒を真空除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（４：１ ヘキサン：ＥｔＯＡｃ→１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製して、５（２５．５ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、収率４％）を明橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１１．２（ｓ，１Ｈ）、７．７１～７．７０（ｄ，２Ｈ）、７．３７～７．３１（ｍ，４Ｈ）、７．２７～７．２０（ｍ，４Ｈ）、５．８５（ｓ，１Ｈ）、５．１３（ｓ，２Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５３．６、１４８．６、１３８．３、１３４．４、１２８．８、１２８．７、１２７．６、１２７．５、１２５．１、８３．７、５０．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２５１．１→９１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝２、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝１４、ｔＲ＝４．０１分
。
。
【0131】
３－（３，４－ジメトキシフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（６）： ＥｔＯＨ（６０ｍＬ）中の３，４－ジメトキシベンゾイル酢酸エチル（５．００ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）を、０℃においてメチル－ヒドラジン（０．９５ｍＬ、１９．８ｍｍｏｌ、１．０当量）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温し、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；４：１→１：１）によって精製して、６（１．８６ｇ、７．９４ｍｍｏｌ、収率４４％）を明黄色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．３５～７．３５（ｄ，１Ｈ）、７．０６～７．０４（ｄｄ，１Ｈ）、６．８７～６．８５（ｄ，１Ｈ）、３．９４（ｓ，３Ｈ）、３．９２（ｓ，３Ｈ）、３．５７（ｓ，２Ｈ）、３．３９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７１．６、１５４．１、１５１．１、１４９．４、１２４．１、１１９．６、１１０．７、１０７．３、５５．９、５５．９、３８．０、３１．３；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２３５．１→２１９．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝１４、ｔＲ＝３．２６分。
【0132】
３－（３，４－ジメトキシフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン：（７）： ＥｔＯＨ（６０ｍＬ）中の３，４－ジメトキシベンゾイル酢酸エチル（３．００ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を、０℃においてフェニル－ヒドラジン（１．１７ｍＬ、１０．８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温し、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；４：１→１：１）によって精製して、結晶化（ＥｔＯＨ）による精製後に７（９２０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ、収率２２％）を黄色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：８．００～７．９７（ｄ，１Ｈ）、７．４８～７．４２（ｍ，３Ｈ）、７．２５～７．２１（ｔ，１Ｈ）、７．１７～７．１４（ｄｄ，１Ｈ）、６．９１～６．８９（ｄ，１Ｈ）、３．９８（ｓ，３Ｈ）、３．９５（ｓ，３Ｈ）、３．８３（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７０．１、１５４．４、１５１．４、１４９．４、１３８．１、１２８．８、１２５．２、１２３．８、１２０．１、１１９．１、１１０．７、１０７．６、５６．０、５６．０、３９．７；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２９７．０→２１８．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝９６、ＣＥ＝３７、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝３．９８分。
【0133】
３－（４－メトキシフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（８）： ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中の４－メトキシベンゾイル酢酸エチル（７．００ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を、０℃においてフェニル－ヒドラジン（２．５０ｍＬ、２５．３ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温し、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；４：１→１：１）によって精製して、結晶化（ＥｔＯＨ）後に３－（４－メトキシフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（８；５．２１ｇ、１９．６ｍｍｏｌ、収率７８％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．９９～７．９７（ｄ，１Ｈ）、７．６６～７．６４（ｄ，２Ｈ）、７．４４～７．４０（ｔ，２Ｈ）、７．２２～７．１８（ｔ，１Ｈ）、６．９４～６．９２（ｄ，２Ｈ）、３．８２（ｓ，３Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１７０．１、１６１．５、１５４．４、１３８．２、１２８．８、１２７．５、１２５．０、１２３．５、１１８．８、１１４．２、５５．３、３９．６；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２６７．０→７７．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８１、ＣＥ＝６５、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝４．１５分。
【0134】
３－（４－メトキシフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン（９
）： ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中の４－メトキシベンゾイル酢酸エチル（７．００ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を、０℃においてメチル－ヒドラジン（１．３０ｍＬ、２５．２ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温し、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；４：１→１：１）によって精製して、ＥｔＯＨからの結晶化後に９（３．００ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、収率５８％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１０．９（ｓ，１Ｈ）、７．６３～７．６０（ｄ，２Ｈ）、６．９２～６．９０（ｄ，２Ｈ）、５．７０（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）、３．５４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１６１．１、１５３．４、１４７．９、１２６．３、１１４．６、１１４．４、８３．１、５９．７、３１．３；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２０５．０→１９０．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５１、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝３．４４分。
）： ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中の４－メトキシベンゾイル酢酸エチル（７．００ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を、０℃においてメチル－ヒドラジン（１．３０ｍＬ、２５．２ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を常温へとゆっくりと加温し、６０℃に加熱した（３時間）。溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；４：１→１：１）によって精製して、ＥｔＯＨからの結晶化後に９（３．００ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、収率５８％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１０．９（ｓ，１Ｈ）、７．６３～７．６０（ｄ，２Ｈ）、６．９２～６．９０（ｄ，２Ｈ）、５．７０（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）、３．５４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１６１．１、１５３．４、１４７．９、１２６．３、１１４．６、１１４．４、８３．１、５９．７、３１．３；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２０５．０→１９０．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５１、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝３．４４分。
【0135】
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１０）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（２９０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後２（３２２ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１９時間後に濃縮して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄した。粗物質をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ヘキサン中、２５％ＥｔＯＡｃから１００％ＥｔＯＡｃまで増加させる）によって精製した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、１０（２６３ｍｇ、０．９８８ｍｍｏｌ、収率３４％）を黄色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．３４～７．３２（ｍ，２Ｈ）、７．２５～７．２３（ｔ，１Ｈ）、７．１９～７．１７（ｄ，２Ｈ）、７．０５（ｓ，２Ｈ）、４．５７（ｓ，１Ｈ）、３．６０（ｓ，３Ｈ）、１．６６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．９、１４４．６、１４４．４、１４２．９、１２８．８、１２８．０、１２７．３、１２０．６、９６．５、５８．７、３７．５、３３．８、１２．８；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２６７．０→２０１．３ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝３．７４分。
【0136】
６－アミノ－１－メチル－３，４－ジフェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１１）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（２９０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）からなる混合物を１．０分間撹拌し、その後３（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２１時間後に濃縮して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄した。ＥｔＯＨから再結晶化して、１１（２８２ｍｇ、８．５８ｍｍｏｌ、収率３０％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４１～７．３８（ｍ，２Ｈ）、７．２８～７．２４（ｍ，２Ｈ）、７．２１～７．１８（ｍ，６Ｈ）、４．８８（ｓ，１Ｈ）、４．７７（ｓ，２Ｈ）、３．８３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５８．１、１４６．０、１４４．８、１４４．６、１３３．２、１２８．７、１２８．５、１２７．９、１２７．８、１２７．１、１２６．４、１２０．５、９５．７、５９．９、３８．２、３４．５；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３２９．１→２６３．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．００分。
【0137】
６－アミノ－３－メチル－１，４－ジフェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１２）： ベンズアルデヒド（２９０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及び１（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ撹拌溶液（６０ｍＬ）に、無水Ｎａ２ＳＯ４（４０７ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びエチル－ヒドロクプレイン塩酸塩（４６ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で撹拌した（２５時間）。濾過及びＤＣＭによる洗
浄後、溶媒を減圧除去した。粗混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；１：１）に供して、１２（２７０ｍｇ、０．８２２ｍｍｏｌ、収率２９％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．６９～７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．５０～７．４６（ｔ，２Ｈ）、７．３９～７．２６（ｍ，６Ｈ）、４．６８（ｓ，１Ｈ）、４．６７（ｓ，２Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５８．１、１４６．４、１４３．８、１４１．９、１３７．５、１２９．２、１２８．８、１２７．８、１２７．５、１２６．７、１２１．２、１１９．０、９８．３、６４．０、３７．４、１２．８；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３２９．１→２６３．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．１８分。
浄後、溶媒を減圧除去した。粗混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ；１：１）に供して、１２（２７０ｍｇ、０．８２２ｍｍｏｌ、収率２９％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．６９～７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．５０～７．４６（ｔ，２Ｈ）、７．３９～７．２６（ｍ，６Ｈ）、４．６８（ｓ，１Ｈ）、４．６７（ｓ，２Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５８．１、１４６．４、１４３．８、１４１．９、１３７．５、１２９．２、１２８．８、１２７．８、１２７．５、１２６．７、１２１．２、１１９．０、９８．３、６４．０、３７．４、１２．８；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３２９．１→２６３．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．１８分。
【0138】
６－アミノ－１，３，４－トリフェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１３）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（２９０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後４（６７８ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。析出物を濾別し、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、１３（３３０ｍｇ、０．８４５ｍｍｏｌ、収率２９％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．８２～７．８０（ｄ，２Ｈ）、７．５５～７．５０（ｍ，４Ｈ）、７．４１～７．３７（ｔ，１Ｈ）、７．３２～７．２２（ｍ，８Ｈ）、４．９６（ｓ，１Ｈ）、４．６８（ｓ，２Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５７．５、１４７．７、１４４．９、１４２．６、１３７．５、１３２．２、１２９．３、１２８．８、１２８．２、１２８．１、１２７．５、１２７．４、１２７．１、１２６．９、１２１．６、１１８．９、９７．５、６４．８、３８．２；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３９１．１→３２５．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝９１、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝４．３３分。
【0139】
６－アミノ－３－（４－メトキシフェニル）－１，４－ジフェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１４）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（２９０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を１．０分間撹拌し、その後８（７６４ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１９時間後に濃縮して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、１４（６９５ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、収率５８％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．９４～７．９２（ｄ，２Ｈ）、７．５８～７．５３（ｍ，４Ｈ）、７．４１～７．３７（ｔ，１Ｈ）、７．２７～７．１６（ｍ，７Ｈ）、６．８３～６．８１（ｄ，２Ｈ）、５．０４（ｓ，１Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．５、１５９．０、１４６．６、１４５．６、１４４．５、１３７．９、１２９．８、１２８．９、１２８．３、１２８．０、１２７．３、１２７．１、１２５．１、１２１．１、１２０．３、１１４．１、９７．５、５９．８、５５．５、３７．９；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４２１．２→３５５．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．３分。
【0140】
６－アミノ－３－（４－メトキシフェニル）－１－メチル－４－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１５）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（２９０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を１．０分間撹拌し、その後９（５８３ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中、２５％ＥｔＯＡｃから１００％ＥｔＯＡｃまで増加させる）によ
って精製した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、１５（８０．９ｍｇ、収率８％、０．２２６ｍｍｏｌ）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４２～７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．２３～７．２１（ｍ，２Ｈ）、７．１５～７．１３（ｄ，３Ｈ）、７．０６（ｓ，２Ｈ）、６．７７～６．７５（ｄ，２Ｈ）、４．９３（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．１、１５９．０、１４５．９、１４４．８、１４４．５、１２８．８、１２７．８、１２７．７、１２７．１、１２５．８、１２０．５、１１３．９、９５．０、５９．９、５５．４、３８．２、３４．４；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５９．１→２９３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．０分。
って精製した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、１５（８０．９ｍｇ、収率８％、０．２２６ｍｍｏｌ）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４２～７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．２３～７．２１（ｍ，２Ｈ）、７．１５～７．１３（ｄ，３Ｈ）、７．０６（ｓ，２Ｈ）、６．７７～６．７５（ｄ，２Ｈ）、４．９３（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．１、１５９．０、１４５．９、１４４．８、１４４．５、１２８．８、１２７．８、１２７．７、１２７．１、１２５．８、１２０．５、１１３．９、９５．０、５９．９、５５．４、３８．２、３４．４；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５９．１→２９３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．０分。
【0141】
６－アミノ－３－（３，４－ジメトキシフェニル）－１－メチル－４－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１６）： ＥｔＯＨ（５．０ｍＬ）中のベンズアルデヒド（１４５μＬ、１．４４ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（９０．０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（２００μＬ、１．４４ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後６（３３６ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮した。粗物質をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中、２５％ＥｔＯＡｃから１００％ＥｔＯＡｃまで増加させる）によって精製した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、１６（４８．５ｍｇ、収率９％、０．１２４ｍｍｏｌ）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．２９～７．２８（ｄ，２Ｈ）、７．２３～７．２１（ｄ，２Ｈ）、７．００～６．９８（ｄ，１Ｈ）、６．８８（ｓ，１Ｈ）、６．７２～６．７０（ｄ，２Ｈ）、４．８４（ｓ，１Ｈ）、４．７５（ｓ，２Ｈ）、３．８２（ｓ，６Ｈ）、３．６０（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５７．６、１４８．７、１４８．６、１４６．１、１４５．７、１４３．１、１２８．９、１２７．５、１２７．４、１２５．６、１１９．３、１１９．２、１１０．９、１０９．７、９４．７、６４．４、５５．７、５５．６、３８．３、３４．１；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３８９．１→３２３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝３．８２分。
【0142】
６－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１７）： ＥｔＯＨ（８．０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後２（３２２ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、１７（３３５ｍｇ、収率４１％、１．１７ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．２３～７．２０（ｍ，２Ｈ）、７．１６～７．１２（ｍ，２Ｈ）、７．０７（ｓ，２Ｈ）、４．６１（ｓ，１Ｈ）、３．６０（ｓ，３Ｈ）、１．６７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．７、１５９．９（ｄ）、１４４．６、１４２．９、１４０．７、１２９．９、１２０．６、１１５．５（ｄ）、９６．３、５６．４、３６．７、３３．８、１２．８；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２８５．１→２１９．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝２７、ＣＸＰ＝１４、ｔＲ＝３．８分。
【0143】
６－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－３－メチル－１－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１８）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３５６ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後１（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間後に濃縮して、析出物を濾過し、ＥｔＯＨから再結晶
化して、１８（８５．０ｍｇ、０．２４５ｍｍｏｌ、収率９％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．６８～７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．５０～７．４６（ｔ，２Ｈ）、７．３４～７．３２（ｔ，１Ｈ）、７．２８～７．２２（ｍ，２Ｈ）７．０８～７．０４（ｔ，２Ｈ）、４．６８（ｓ，３Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５８．０、１４６．２、１４３．７、１３７．８、１３７．５、１２９．４、１２９．２、１２６．８、１２１．２、１１８．８、１１５．８、１１５．６、９８．１、６３．８、３６．７、１２．８；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３４７．１→２８１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝１１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．１６分。
化して、１８（８５．０ｍｇ、０．２４５ｍｍｏｌ、収率９％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．６８～７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．５０～７．４６（ｔ，２Ｈ）、７．３４～７．３２（ｔ，１Ｈ）、７．２８～７．２２（ｍ，２Ｈ）７．０８～７．０４（ｔ，２Ｈ）、４．６８（ｓ，３Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５８．０、１４６．２、１４３．７、１３７．８、１３７．５、１２９．４、１２９．２、１２６．８、１２１．２、１１８．８、１１５．８、１１５．６、９８．１、６３．８、３６．７、１２．８；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３４７．１→２８１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝１１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．１６分。
【0144】
６－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（１９）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後３（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０時間後に真空濃縮して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、１９（１８２ｍｇ、０．５２５ｍｍｏｌ、収率１８％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．５０～７．４８（ｄ，２Ｈ）、７．２２～７．１８（ｍ，５Ｈ）、７．１１（ｓ，２Ｈ）、７．０５～６．９８（ｔ，２Ｈ）５．０４（ｓ，１Ｈ）、３．７８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．５、１５９．１、１４６．０、１４４．６、１４０．９、１３３．１、１２９．８（ｄ）、１２８．５、１２７．９、１２６．５、１２０．４、１１５．４（ｄ）、９５．５、５９．７、３７．４、３４．５；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３４７．１→２８１．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１４、ｔＲ＝４．０分。
【0145】
６－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－１，３－ジフェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２０）： エタノール（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後４（６７８ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。１８時間後に形成された析出物を瀘別して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２０（２４０ｍｇ、０．５８８ｍｍｏｌ、収率２０％）を白色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．９４～７．９２（ｄ，２Ｈ）、７．６１～７．５５（ｍ，４Ｈ）、７．４２～７．３８（ｔ，１Ｈ）、７．２８～７．２４（ｍ，７Ｈ）、７．０６～７．０２（ｔ，２Ｈ）、５．１５（ｓ，１Ｈ）、１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．６、１５９．０、１４６．８、１４５．６、１４０．６、１３７．８、１３２．５、１３０．０、１２９．９（ｄ）、１２８．６、１２８．６、１２７．３、１２７．０、１２１．３、１２０．２、１１５．５（ｄ）、９７．９、５９．６、３７．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４１０．４→２４２．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝２１、ＣＥ＝４７、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝４．６分。
【0146】
６－アミノ－３－（３，４－ジメトキシフェニル）－４－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２１）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後６（６７２ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。１７時間後に形成された析出物を瀘別して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２１（７８２ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ、収率６７％）を白色の粉末として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：
７．２０～７．１８（ｍ，２Ｈ）、７．０９～７．０３（ｍ，５Ｈ）、６．９６～６．９５（ｄ，１Ｈ）、６．８０～６．７８（ｄ，１Ｈ）、５．０２（ｓ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、３．６２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．６、１５９．０、１４８．７、１４６．０、１４４．６、１４１．０、１２９．８、１２９．７、１２５．９、１２０．４、１１９．０、１１５．７、１１５．４、１１１．８、１０９．８、９４．７、５５．８、５５．７、３７．３、３４．４；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４０７．１→３４１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝３．９分。
７．２０～７．１８（ｍ，２Ｈ）、７．０９～７．０３（ｍ，５Ｈ）、６．９６～６．９５（ｄ，１Ｈ）、６．８０～６．７８（ｄ，１Ｈ）、５．０２（ｓ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、３．６２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．６、１５９．０、１４８．７、１４６．０、１４４．６、１４１．０、１２９．８、１２９．７、１２５．９、１２０．４、１１９．０、１１５．７、１１５．４、１１１．８、１０９．８、９４．７、５５．８、５５．７、３７．３、３４．４；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４０７．１→３４１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝３．９分。
【0147】
６－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－３－（４－メトキシフェニル）－１－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２２）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を１．０分間撹拌し、その後８（７６４ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。１７時間後に形成された析出物を瀘別して、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２２（８００ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ、収率６４％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．９３～７．９１（ｄ，２Ｈ）、７．５５～７．５３（ｍ，４Ｈ）、７．４１～７．３７（ｔ，１Ｈ）、７．２６～７．２３（ｍ，４Ｈ）、７．０７～７．０５（ｔ，２Ｈ）、６．８４～６．８２（ｄ，２Ｈ）、５．１１（ｓ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．６、１５９．０、１４６．６、１４５．５、１４０．７、１４０．６、１３７．９、１３０．０、１２９．９（ｄ）、１２８．３、１２７．１、１２５．０、１２１．１、１２０．２、１１５．５（ｄ）、１１４．１、９７．３、５９．６、５５．５、３７．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４３９．２→３７３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝３５、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．３分。
【0148】
６－アミノ－３－（３，４－ジメトキシフェニル）－４－（４－フルオロフェニル）－１－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２３）： ＥｔＯＨ（３．０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（７０．０μＬ、０．６７５ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（４５．０ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（９０．０μＬ、０．６７５ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後７（２００ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１９時間後に濃縮して、粗物質をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中、２５％ＥｔＯＡｃから１００％ＥｔＯＡｃまで増加させる）によって精製した。黄色の固体をＥｔＯＨからの再結晶化によって更に精製して、２３（１６４ｍｇ、０．３５０ｍｍｏｌ、収率１２％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．８０～７．７８（ｄ，２Ｈ）、７．５２～７．４８（ｔ，２Ｈ）、７．３８～７．３５（ｔ，１Ｈ）、７．２５～７．２１（ｍ，２Ｈ）、７．０５～６．９５（ｍ，４Ｈ）、６．７５～６．７３（ｄ，１Ｈ）、４．９１（ｓ，１Ｈ）、４．８４（ｓ，２Ｈ）、３．８４（ｓ，３Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１６３．２、１５７．８、１４９．２、１４８．７、１４７．５、１４４．９、１３８．６、１３７．４、１２９．３、１２９．１（ｄ）、１２７．１、１２５．０、１２１．５、１１９．８、１１９．０、１１５．８（ｄ）、１１０．８、１０９．９、９６．６、６４．０、５５．８、５５．７、３７．５；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４６９．３→４０３．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６、ＣＥ＝３５、ＣＸＰ＝２６、ｔＲ＝４．２分。
【0149】
６－アミノ－４－（４－フルオロフェニル）－３－（４－メトキシフェニル）－１－メチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２４）：
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍ
ｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後９（５８６ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１９時間後に濃縮して、形成された析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２４（３５０ｍｇ、０．９３０ｍｍｏｌ、収率３２％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４３～７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１６（ｍ，２Ｈ）、７．１０（ｓ，２Ｈ）、７．０６～７．０２（ｔ，２Ｈ）、６．７８～６．７６（ｄ，２Ｈ）、４．９９（ｓ，１Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．５、１５９．１、１４５．８、１４４．６、１４１．０、１４１．０、１２９．８（ｄ）、１２７．８、１２５．７、１２０．５、１１５．５（ｄ）、１１３．９、９４．９、５９．７、５５．４、３７．４、３４．４；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３７７．１→３１１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．０分。
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－フルオロベンズアルデヒド（３００μＬ、２．８７ｍｍ
ｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後９（５８６ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１９時間後に濃縮して、形成された析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２４（３５０ｍｇ、０．９３０ｍｍｏｌ、収率３２％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４３～７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１６（ｍ，２Ｈ）、７．１０（ｓ，２Ｈ）、７．０６～７．０２（ｔ，２Ｈ）、６．７８～６．７６（ｄ，２Ｈ）、４．９９（ｓ，１Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６２．５、１５９．１、１４５．８、１４４．６、１４１．０、１４１．０、１２９．８（ｄ）、１２７．８、１２５．７、１２０．５、１１５．５（ｄ）、１１３．９、９４．９、５９．７、５５．４、３７．４、３４．４；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３７７．１→３１１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．０分。
【0150】
６－アミノ－４－（３，５－ジフルオロフェニル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２５）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の３，５－ジフルオロベンズアルデヒド（０．４０８ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を５分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３時間後に濃縮して、粗物質をＥｔＯＨから再結晶化し、ＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンで洗浄して、２５（２９１ｍｇ、０．９６３ｍｍｏｌ、収率３４％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．１５（ｂｒ－ｓ，２Ｈ）、７．０９～７．０５（ｔ，１Ｈ）、６．９２～６．８９（ｍ，２Ｈ）、４．６６（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６３．９（ｄ，ＣＦ）、１６３．８（ｄ，ＣＦ）、１６０．２、１４９．２（ｔ）、１４４．８、１４２．９、１２０．４、１１１．２（ｍ）、１０２．９（ｔ）、９５．４、５７．５、３７．１、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３０３．９→２３６．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝１１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝４．１９分。
【0151】
６－アミノ－４－（３，５－ジフルオロフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２６）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の３，５－ジフルオロベンズアルデヒド（０．４０８ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．５００ｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を２３時間後に濃縮し、粗物質をＥｔＯＨから再結晶化して、２６（２８２ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、収率２７％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４８～７．４７（ｄ，２Ｈ）、７．２４～７．１７（ｍ，５Ｈ）、６．９７～６．９２（ｍ，１Ｈ）、６．８７～６．８５（ｄ，２Ｈ）、５．１１（ｓ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６３．５（ｄ，ＣＦ）、１６３．５（ｄ，ＣＦ）、１５９．５、１４６．１、１４４．７、１３３．０、１２８．６、１２８．１、１２６．６、１２６．５、１２０．２、１１１．３（ｄ）、１０２．８、９５．５、５８．５、３７．６、３４．６。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３６５．１→２９９．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８６、ＣＥ＝２７、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．３８分。
【0152】
６－アミノ－４－（４－メトキシフェニル）－３－メチル－１－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２７）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のアニスアルデヒド（３５０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１
．０分間撹拌し、その後１（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２７（８００ｍｇ、収率７８％、２．２３ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．８０～７．７８（ｄ，２Ｈ）、７．５１～７．４７（ｔ，２Ｈ）、７．３２～７．２８（ｔ，１Ｈ）、７．１８～７．１６（ｍ，４Ｈ）、６．９１～６．８９（ｄ，２Ｈ）、４．６２（ｓ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，３Ｈ）、１．７９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．７、１５８．６、１４５．７、１４４．２、１３８．０、１３６．０、１２９．７、１２９．２、１２６．５、１２０．５、１２０．３、１１４．３、９９．３、５９．０、５５．４、３６．４、１３．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５９．２→２９３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．１４分。
．０分間撹拌し、その後１（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２７（８００ｍｇ、収率７８％、２．２３ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．８０～７．７８（ｄ，２Ｈ）、７．５１～７．４７（ｔ，２Ｈ）、７．３２～７．２８（ｔ，１Ｈ）、７．１８～７．１６（ｍ，４Ｈ）、６．９１～６．８９（ｄ，２Ｈ）、４．６２（ｓ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，３Ｈ）、１．７９（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．７、１５８．６、１４５．７、１４４．２、１３８．０、１３６．０、１２９．７、１２９．２、１２６．５、１２０．５、１２０．３、１１４．３、９９．３、５９．０、５５．４、３６．４、１３．０；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５９．２→２９３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．１４分。
【0153】
６－アミノ－４－（４－メトキシフェニル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２８）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のアニスアルデヒド（３５０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後２（３２１ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、粗物質をカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中、２５％ＥｔＯＡｃから１００％ＥｔＯＡｃまで増加させる）によって精製した。黄色の固体をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、２８（３７０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ、収率４４％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：７．１２～７．１０（ｄ，２Ｈ）、６．８５～６．８３（ｄ，２Ｈ）、４．６１（ｓ，２Ｈ）、４．５５（ｓ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，３Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、１．８０（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＣＤＣｌ３：１５８．８、１５７．９、１４４．５、１４４．４、１３４．５、１２８．８、１１９．３、１１４．０、９６．４、６４．２、５５．２、３６．７、３３．７、１２．７；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２９７．０→２３１．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝２７、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝３．７１分。
【0154】
６－アミノ－４－（４－メトキシフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（２９）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のアニスアルデヒド（３５０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後３（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄し、生成物をＥｔＯＨから再結晶化して、２９（２１０ｍｇ、収率２０％、０．５８６ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．５０～７．４８（ｄ，２Ｈ）、７．２１～７．１７（ｍ，３Ｈ）、７．０５～７．０２（ｍ，４Ｈ）、６．７６～６．７４（ｄ，２Ｈ）、４．９１（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）、３．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５８．９、１５８．３、１４６．０、１４４．６、１３６．９、１３３．２、１２８．９、１２８．５、１２７．８、１２６．４、１２０．６、１１４．１、９５．９、６０．３、５５．３、３７．５、３４．５；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５９．２→２９３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝３．９８分。
【0155】
６－アミノ－４－（４－メトキシフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３０）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のアニスアルデヒド（３５０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後４（６７８ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を
２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄した。生成物をＥｔＯＨから再結晶化して、３０（１．０５ｇ、収率８７％、２．５０ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．９４～７．９２（ｄ，２Ｈ）、７．６３～７．６１（ｄ，２Ｈ）、７．５７～７．５３（ｔ，２Ｈ）、７．４０～７．３６（ｔ，１Ｈ）、７．２９～７．２３（ｍ，３Ｈ）７．１５（ｓ，２Ｈ）、７．１３～７．１１（ｄ，２Ｈ）、６．７８～６．７６（ｄ，２Ｈ）、５．０２（ｓ，１Ｈ）、３．６５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５８．９、１５８．４、１４６．７、１４５．６、１３７．９、１３６．５、１３２．６、１２９．８、１２９．０、１２８．７、１２８．５、１２７．２、１２７．０、１２１．２、１２０．３、１１４．２、９８．３、６０．２、５５．３、３７．１；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４２１．２→３５５．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８１、ＣＥ＝３５、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．３２分。
２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄した。生成物をＥｔＯＨから再結晶化して、３０（１．０５ｇ、収率８７％、２．５０ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．９４～７．９２（ｄ，２Ｈ）、７．６３～７．６１（ｄ，２Ｈ）、７．５７～７．５３（ｔ，２Ｈ）、７．４０～７．３６（ｔ，１Ｈ）、７．２９～７．２３（ｍ，３Ｈ）７．１５（ｓ，２Ｈ）、７．１３～７．１１（ｄ，２Ｈ）、６．７８～６．７６（ｄ，２Ｈ）、５．０２（ｓ，１Ｈ）、３．６５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５８．９、１５８．４、１４６．７、１４５．６、１３７．９、１３６．５、１３２．６、１２９．８、１２９．０、１２８．７、１２８．５、１２７．２、１２７．０、１２１．２、１２０．３、１１４．２、９８．３、６０．２、５５．３、３７．１；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４２１．２→３５５．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８１、ＣＥ＝３５、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．３２分。
【0156】
６－アミノ－３，４－ビス（４－メトキシフェニル）－１－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３１）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中のアニスアルデヒド（３５０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物を１．０分間撹拌し、その後８（７６４ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、３１（１．０６ｇ、２．３５ｍｍｏｌ、収率８２％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．９３～７．９１（ｄ，２Ｈ）、７．５６～７．５２（ｍ，４Ｈ）、７．３８～７．３５（ｔ，１Ｈ）、７．１５～７．１１（ｍ，４Ｈ）、６．８３～６．７８（ｍ，４Ｈ）、４．９８（ｓ，１Ｈ）、３．７０（ｓ，３Ｈ）、３．６６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．５、１５８．９、１５８．４、１４６．６、１４５．５、１３７．９、１３６．６、１２９．８、１２９．０、１２８．３、１２７．０、１２５．２、１２１．０、１２０．４、１１４．２、１１４．１、９７．７、６０．３、５５．５、５５．３、３７．１；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４５２．３→８９．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝３６、ＣＥ＝３９、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝３．４７分。
【0157】
６－アミノ－３，４－ビス（４－メトキシフェニル）－１－メチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３２）： エタノール（１０ｍＬ）中のアニスアルデヒド（３５０μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１９０ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（４００μＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後９（６８９ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間後に濃縮して、析出物をＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、３２（６９０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ、収率６２％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４２～７．４０（ｄ，２Ｈ）、７．０５～７．０３（ｄ，２Ｈ）、７．００（ｓ，２Ｈ）、６．７８～６．７５（ｄｄ，４Ｈ）、４．８６（ｓ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，３Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）、３．６６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．０、１５８．９、１５８．３、１４５．９、１４４．５、１３６．９、１２８．９、１２７．７、１２５．９、１２０．６、１１４．１、１１３．９、９５．３、６０．３、５５．４、５５．３、３７．５、３４．３；ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３８９．２→３２３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝３．９４分。
【0158】
６－アミノ－４－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３３）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の３－フルオロ－４－メトキシベンズアルデヒド（０．４４２ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４
０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を５分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間後に濃縮して、粗物質をＥｔＯＨから再結晶化し、固体をＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンで洗浄して、３１（４７５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率５３％）を明橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．１０～７．０４（ｍ，３Ｈ）、６．９５～６．９３（ｍ，２Ｈ）、４．５３（ｓ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，３Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．９、１５３．０（ｄ，ＣＦ）、１４６．４（ｄ）、１４４．６、１４２．９、１３７．６（ｄ）、１２４．１、１２０．６、１１５．４（ｄ）、１１４．０、９６．２、５８．５、５６．４、３６．６、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３１５．０→２４８．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２７、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝４．０５分。
０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を５分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間後に濃縮して、粗物質をＥｔＯＨから再結晶化し、固体をＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンで洗浄して、３１（４７５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率５３％）を明橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．１０～７．０４（ｍ，３Ｈ）、６．９５～６．９３（ｍ，２Ｈ）、４．５３（ｓ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，３Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．９、１５３．０（ｄ，ＣＦ）、１４６．４（ｄ）、１４４．６、１４２．９、１３７．６（ｄ）、１２４．１、１２０．６、１１５．４（ｄ）、１１４．０、９６．２、５８．５、５６．４、３６．６、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３１５．０→２４８．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２７、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝４．０５分。
【0159】
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（２，４，６－トリメトキシフェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３４）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の２，４，６－トリメトキシベンズアルデヒド（０．５６３ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２６時間後に濃縮した。粗物質をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製した。黄色の固体をＥｔＯＨから再結晶化し、ＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンで洗浄して、３４（６０ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ、収率６％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：６．７２（ｓ，２Ｈ）、６．２０（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．９７（ｓ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．５３（ｓ，６Ｈ）、１．６５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６１．３、１６０．１、１４５．４、１４２．１、１２１．３、１１１．７、９６．５、９３．１、９１．２、５７．０、５６．６、５５．５、３３．７、２６．１、１２．２。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５７．１→１８９．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝４．０７分。
【0160】
６－アミノ－４－（３－フルオロ－４－メトキシフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３５）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の３－フルオロ－４－メトキシベンズアルデヒド（０．４４２ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．５００ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間後に濃縮し、粗物質をＥｔＯＨから再結晶化して、３５（３４８ｍｇ、０．９２７ｍｍｏｌ、収率３３％）を明白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．５０～４８（ｄ，２Ｈ）、７．２２～７．１５（ｍ，３Ｈ）、７．０７（ｂｒｓ，２Ｈ）、６．９７～６．８９（ｍ，３Ｈ）、４．９６（ｓ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，３Ｈ）、３．７１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．１、１５２、８（ｄ，ＣＦ）、１４６．１（ｄ）、１４６．０、１４４．６、１３７．９（ｄ）、１３３．２、１２８．６、１２７．９、１２６．５、１２４．０、１２０．５、１１５．２（ｄ）、１１３．９、９５．４、５９．７、５６．３、３７．２、３４．５。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３７７．１→３１１．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．２７分。
【0161】
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３６）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－（トリフルオロメチル）ベンズアルデヒド（０．５００ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．
８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製し、３６（４４５ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、収率４６％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．２８（ｓ，４Ｈ）、７．１０（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．１、１４７．６、１４４．７、１４３．９、１４２．９、１２９．９、１２２．３、１２１．４、１２０．６、９６．２、５８．２、３６．８、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３３７．２→５９．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝２６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１０、ｔＲ＝５．１０分。
８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製し、３６（４４５ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ、収率４６％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．２８（ｓ，４Ｈ）、７．１０（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．６４（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．１、１４７．６、１４４．７、１４３．９、１４２．９、１２９．９、１２２．３、１２１．４、１２０．６、９６．２、５８．２、３６．８、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３３７．２→５９．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝２６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１０、ｔＲ＝５．１０分。
【0162】
６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３７）： ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の４－（トリフルオロメチル）ベンズアルデヒド（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後３（３００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ、次いでＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：１））によって２回精製して、３７（１２０ｍｇ、０．３０１ｍｍｏｌ、収率１８％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．５８～７．５６（ｄ，２Ｈ）、７．４９～７．４７（ｄ，２Ｈ）、７．３７～７．３５（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１７（ｍ，５Ｈ）、５．１７（ｓ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．４、１４９．３、１４６．１、１４４．７、１３３．０、１２８．８、１２８．６、１２８．０、１２６．４、１２６．０、１２５．７（ｄ）、１２３．３、１２０．３、９４．９、５９．０、３７．９、３４．６。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３９７．１→３３１．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝９６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝４．４４分。
【0163】
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（４－（トリフルオロメトキシ）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３８）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－（トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒド（０．５４６ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、３８（３５９ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、収率３６％）を橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．６８～７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．４０～７．３８（ｄ，２Ｈ）、７．１４（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．７１（ｓ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．２、１４９．２、１４４．７、１４２．９、１２９．０、１２７．２、１２５．９、１２４．１、１２０．５、９５．８、５７．８、３７．２、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５２．０→３３５．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝２６、ＣＥ＝９、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．３１分。
【0164】
６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－４－（４－（トリフルオロメトキシ）フェニル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（３９）：
ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の４－（トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒド（０．３２７ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（３００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、３９（１７４ｍｇ
、０．４２１ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４７～７．４５（ｄ，２Ｈ）、７．２６～７．２４（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１４（ｍ，７Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．３、１４７．４、１４６．０、１４４．７、１４４．１、１３３．１、１２９．８、１２８．６、１２８．０、１２６．５、１２１．７、１２１．２、１２０．４、９５．３、５９．３、３７．４、３４．５。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４１３．１→３４６．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．４９分。
ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の４－（トリフルオロメトキシ）ベンズアルデヒド（０．３２７ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（３００ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、３９（１７４ｍｇ
、０．４２１ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．４７～７．４５（ｄ，２Ｈ）、７．２６～７．２４（ｄ，２Ｈ）、７．２０～７．１４（ｍ，７Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．３、１４７．４、１４６．０、１４４．７、１４４．１、１３３．１、１２９．８、１２８．６、１２８．０、１２６．５、１２１．７、１２１．２、１２０．４、９５．３、５９．３、３７．４、３４．５。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４１３．１→３４６．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２４、ｔＲ＝４．４９分。
【0165】
６－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４０）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－ホルミルベンゾニトリル（０．３７６ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間後に濃縮して、粗物質をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製した。黄色の固体をＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンで洗浄し、ＥｔＯＨから再結晶化して、４０（４８４ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、収率５８％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．７８～７．７６（ｄ，２Ｈ）、７．３８～７．３６（ｄ，２Ｈ）、７．１７（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．７０（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６３（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．２、１５０．１、１４４．７、１４２．９、１３３．０、１２９．２、１２０．４、１１９．２、１１０．２、９５．６、５７．５、３７．４、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２９２．０→２２６．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１４、ｔＲ＝３．９０分。
【0166】
６－アミノ－４－（４－シアノフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４１）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－ホルミルベンゾニトリル（０．３７６ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１８時間後に濃縮し、粗物質をＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンからの再結晶化によって精製して、４１（１６０ｍｇ、０．４５３ｍｍｏｌ、収率１６％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．６８～７．６６（ｄ，２Ｈ）、７．４８～７．４６（ｄ，２Ｈ）、７．３５～７．３３（ｄ，２Ｈ）、７．２２～７．１９（ｍ，５Ｈ）、５．１７（ｓ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．４、１５０．２、１４６．１、１４４．７、１３３．０、１３２．８、１２９．１、１２８．７、１２８．１、１２６．５、１２０．２、１１９．１、１１０．０、９４．７、５８．６、３８．０、３４．６。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５４．２→２８８．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３３、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．２１分。
【0167】
６－アミノ－４－（４－イソプロピルフェニル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４２）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－イソプロピルベンズアルデヒド（０．４２５ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、析出物を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄して、４２（１６３ｍｇ、０．５２８ｍｍｏｌ、収率１８％）を明黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．１６～７．１４（ｄ，２Ｈ）、７．０５～７．０３（ｄ，２Ｈ）、６．９９（ｓ，２Ｈ）、４．５０（ｓ，１Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、
２．８５～２．７９（ｍ，１Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）、１．１７～１．１５（ｄ，６Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．０、１４７．２、１４４．６、１４２．９、１４１．９、１２７．９、１２６．７、１２０．８、９６．７、５８．８、３７．１、３３．９、３３．４、２４．３、１２．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３０９．１→２４３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝４．４４分。
２．８５～２．７９（ｍ，１Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）、１．１７～１．１５（ｄ，６Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．０、１４７．２、１４４．６、１４２．９、１４１．９、１２７．９、１２６．７、１２０．８、９６．７、５８．８、３７．１、３３．９、３３．４、２４．３、１２．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３０９．１→２４３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１６、ｔＲ＝４．４４分。
【0168】
６－アミノ－４－（４－イソプロピルフェニル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４３）： エタノール（６ｍＬ）中の４－イソプロピルベンズアルデヒド（０．２５４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中２％ＭｅＯＨ、次いでＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって２回精製して、４３（２０７ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ、収率３３％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．５０～７．４８（ｄ，２Ｈ）、７．２２～７．１６（ｍ，３Ｈ）、７．０９～７．０２（ｍ，６Ｈ）、４．９２（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）、２．８０～２．７３（ｍ，１Ｈ）、１．１２～１．１０（ｄ，６Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．２、１４７．１、１４６．１、１４４．５、１４２．３、１３３．３、１２８．６、１２７．９、１２７．７、１２６．７、１２６．４、１２０．７、９５．９、６０．１、３７．９、３４．５、３３．３、２４．２。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３７１．１→３０５．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝１０６、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝２０、ｔＲ＝４．６０分。
【0169】
６－アミノ－４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４４）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の１，４－ベンゾジオキサン－６－カルボキサルデヒド（０．４７１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を５分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３時間後に濃縮して、粗物質をＥｔＯＨから再結晶化し、ＥｔＯＨ及びｎ－ヘキサンで洗浄して、４４（１３１ｍｇ、０．４０４ｍｍｏｌ、収率１４％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：６．９８（ｂｒｓ，２Ｈ）、６．７６～６．７４（ｄ，１Ｈ）、６．５９～６．５７（ｍ，２Ｈ）、４．４３（ｓ，１Ｈ）、４．１８（ｓ，４Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、１．６７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．９、１４４．６、１４３．５、１４３．０、１４２．６、１３７．７、１２０．７、１２０．７、１１７．３、１１６．５、９６．６、６４．５、６４．４、５８．９、３６．８、３３．９、１２．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３２５．０→２５９．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５１、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝３．９８分。
【0170】
６－アミノ－４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４５）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の１，４－ベンゾジオキサン－６－カルボキサルデヒド（０．４７１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．５００ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２３時間後に濃縮して、粗物質をＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製した後、ＥｔＯＨから再結晶化して、４５（９３ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、収率８％）を黄色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．
５３～７．５１（ｄ，２Ｈ）、７．２５～７．１８（ｍ，３Ｈ）、７．０３（ｂｒｓ，２Ｈ）、６．９８～６．６６（ｄ，１Ｈ）、６．６０～６．５７（ｍ，２Ｈ）、４．８６（ｓ，１Ｈ）、４．１３（ｓ，４Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．１、１４６．０、１４４．５、１４３．５、１４２．５、１３８．１、１３３．３、１２８．７、１２７．９、１２６．５、１２０．６、１２０．５、１１７．２、１１６．３、９５．８、６４．４、６４．３、６０．２、３７．５、３４．５。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３８７．１→３２１．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝４．２５分。
５３～７．５１（ｄ，２Ｈ）、７．２５～７．１８（ｍ，３Ｈ）、７．０３（ｂｒｓ，２Ｈ）、６．９８～６．６６（ｄ，１Ｈ）、６．６０～６．５７（ｍ，２Ｈ）、４．８６（ｓ，１Ｈ）、４．１３（ｓ，４Ｈ）、３．７５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．１、１４６．０、１４４．５、１４３．５、１４２．５、１３８．１、１３３．３、１２８．７、１２７．９、１２６．５、１２０．６、１２０．５、１１７．２、１１６．３、９５．８、６４．４、６４．３、６０．２、３７．５、３４．５。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３８７．１→３２１．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝４．２５分。
【0171】
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（ピリジン－４－イル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４６）： エタノール（１０ｍＬ）中の３－ピリジンカルボキサルデヒド（０．３０７ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製し、ＥｔＯＨで洗浄して、４６（１３２ｍｇ、０．４９３ｍｍｏｌ、収率１７％）を明橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．４９～８．４８（ｄ，２Ｈ）、７．１８～７．１８（ｍ，４Ｈ）、４．６１（ｓ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、１．６６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．４、１５２．９、１５０．３、１４４．８、１４２．９、１２３．４、１２０．４、９５．２、５７．１、３６．８、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２６８．０→１８９．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝２５、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝３．３８分。
【0172】
６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－４－（ピリジン－４－イル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４７）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の３－ピリジンカルボキサルデヒド（０．３０７ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（５００ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。２２時間後に析出物を濾別し、ＥｔＯＨ及びヘキサンで洗浄して、４７（３４０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．３８～８．３６（ｄｄ，２Ｈ）、７．４８～７．４６（ｄ，２Ｈ）、７．２２～７．１３（ｍ，７Ｈ）、５．０８（ｓ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．６、１５３．０、１５０．１、１４６．１、１４４．７、１３３．０、１２８．７、１２８．１、１２６．５、１２３．２、１２０．２、９４．３、５８．２、３７．４、３４．６。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３３０．１→８０．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７６、ＣＥ＝６３、ＣＸＰ＝４、ｔＲ＝３．９４分。
【0173】
６－アミノ－１，３－ジメチル－４－（ピリジン－３－イル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４８）： エタノール（１０ｍＬ）中の３－ピリジンカルボキサルデヒド（０．３０７ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を５分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮して、析出物を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄して、４８（４６３ｍｇ、１．７３ｍｍｏｌ、収率６０％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．４３～８．４３（ｄ，２Ｈ）、７．５３～７．５１（ｄ，１Ｈ）、７．３４～７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．１４（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．６３（ｓ，１Ｈ）、３．５７（ｓ，３Ｈ）、１．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．２、１４９．４、１４８．８、１４４．８、１４２．８、１３９．７、１
３５．８、１２４．２、１２０．５、９５．７、５７．８、３５．０、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２６８．０→１８９．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３４、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝３．５分。
３５．８、１２４．２、１２０．５、９５．７、５７．８、３５．０、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：２６８．０→１８９．２ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝７１、ＣＥ＝３４、ＣＸＰ＝１２、ｔＲ＝３．５分。
【0174】
６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－４－（ピリジン－３－イル）－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（４９）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の３－ピリジンカルボキサルデヒド（０．３０７ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（５００ｍｇｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。白色の析出物が形成され、２２時間後に濾別した。形成された析出物をＥｔＯＨで再結晶化して、４９（３８９ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ、収率４１％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．４１～８．４０（ｄ，１Ｈ）、８．３０～８．２９（ｄｄ，１Ｈ）、７．４９～７．４７（ｄ，３Ｈ）、７．２３～７．１６（ｍ，６Ｈ）、５．１２（ｓ，１Ｈ）、３．７７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．４、１４９．３、１４８．５、１４６．１、１４４．７、１３９．９、１３５．６、１３３．０、１２８．６、１２８．０、１２６．５、１２４．０、１２０．４、９４．８、５８．９、３５．６、３４．６。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３３０．１→８０．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝５６、ＣＥ＝５７、ＣＸＰ＝１４、ｔＲ＝３．９６分。
【0175】
６－アミノ－４－（６－ブロモピリジン－２－イル）－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５０）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の６－ブロモ－２－ピリジンカルボキサルデヒド（０．３０７ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濾過し、析出物を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄して、５０（４２７ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、収率４３％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．７３～７．６９（ｔ，１Ｈ）、７．５０～７．４８（ｄ，１Ｈ）、７．３２～７．３０（ｄ，１Ｈ）、７．１９（ｂｒｓ，２Ｈ）、４．６９（ｓ，１Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６４．４、１６０．７、１４４．７、１４２．９、１４１．４、１４０．８、１２７．０、１２２．０、１２０．５、９５．３、５６．３、３９．３、３３．９、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３４８．０→２８３．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２５、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．００分。
【0176】
６－アミノ－４－（６－ブロモピリジン－２－イル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５１）： ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の６－ブロモ－２－ピリジンカルボキサルデヒド（０．３０７ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（５００ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濾過し、析出物を濾別し、ＥｔＯＨで洗浄して、５１（９７１ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ、収率８３％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．５９～７．５３（ｔ，１Ｈ）、７．５２～７．５０（ｄ，２Ｈ）、７．３８～７．３５（ｄ，１Ｈ）、７．３０～７．２６（ｄ，１Ｈ）、７．２４～７．２１（ｍ，５Ｈ）、５．１２（ｓ，１Ｈ）、３．７６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６４．４、１６０．０、１４６．０、１４４．７、１４１．２、１４０．５、１３３．０、１２８．６、１２８．１、１２６．９、１２６．４、１２２．２、１２０．２、９４．６、５７．５、３９．３、３４．５。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４０８．０→１７５．１ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８６、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝１０、ｔＲ＝４．２８分。
【0177】
４－（４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）フェニル）－６－アミノ－１，３－ジメチル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５２）：
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ベンズアルデヒド（０．４９４ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、５２（３２２ｍｇ、０．９６７ｍｍｏｌ、収率３４％）を明褐色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．２０（ｓ，１Ｈ）、７．６９（ｓ，１Ｈ）、７．５８～７．５６（ｄ，２Ｈ）、７．２９～７．２７（ｄ，２Ｈ）、７．０９～７．０７（ｄ，３Ｈ）、４．６４（ｓ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．１、１４４．７、１４３．２、１４３．０、１３６．１、１３６．０、１３０．３、１２９．５、１２１．０、１２０．７、１１８．５、９５．３、５８．４、３６．９、３３．９、１２．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３３３．３→２６６．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝４１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝３．４分。
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ベンズアルデヒド（０．４９４ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１．０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、５２（３２２ｍｇ、０．９６７ｍｍｏｌ、収率３４％）を明褐色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．２０（ｓ，１Ｈ）、７．６９（ｓ，１Ｈ）、７．５８～７．５６（ｄ，２Ｈ）、７．２９～７．２７（ｄ，２Ｈ）、７．０９～７．０７（ｄ，３Ｈ）、４．６４（ｓ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１６０．１、１４４．７、１４３．２、１４３．０、１３６．１、１３６．０、１３０．３、１２９．５、１２１．０、１２０．７、１１８．５、９５．３、５８．４、３６．９、３３．９、１２．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３３３．３→２６６．９ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６１、ＣＥ＝４１、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝３．４分。
【0178】
４－（４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）フェニル）－６－アミノ－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５３）： ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の４－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ベンズアルデヒド（０．２９６ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、５３（３０８ｍｇ、０．７８０ｍｍｏｌ、収率４５％）をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：８．１５（ｓ，１Ｈ）、７．６４（ｓ，１Ｈ）、７．５４～７．５２（ｄ，２Ｈ）、７．４９～７．４７（ｄ，２Ｈ）、７．２８～７．１３（ｍ，７Ｈ）、７．０４（ｓ，１Ｈ）、５．０９（ｓ，１Ｈ）、３．７８（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．２ １４５．１、１４４．６、１４３．５、１３５．９、１３５．９、１３３．２、１３０．２、１２９．３、１２８．７、１２８．０、１２６．５、１２０．７、１２０．５、１１８．４、９５．４、５９．６、３７．６、３４．６。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３９５．２→１４４．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝１０１、ＣＥ＝５９、ＣＸＰ＝８、ｔＲ＝３．８９分。
【0179】
化合物５４
化学式：Ｃ１３Ｈ１１ＢｒＮ４ＯＳ
分子量：３５１．２２
６－アミノ－４－（５－ブロモチオフェン－２－イル）－１，３－ジメチル－１，４－ジ
ヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５４）： エタノール（１０ｍＬ）中の５－ブロモチオフェン－２－カルバルデヒド（０．５４８ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濾過し、析出物をエタノールで再結晶化して、５４（２２１ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ、収率２２％）を明橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．１８（ｓ，２Ｈ）、７．０２～７．０２（ｄ，１Ｈ）、６．８６～６．８５（ｄ，１Ｈ）、４．９３（ｓ，１Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、１．８１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．９、１５１．９、１４４．２、１４３．１、１３０．３、１２６．０、１２０．３、１１０．８、９５．８、５８．３、３３．９、３３．２、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５２．９→２８７．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．３分。
【化7】
分子量：３５１．２２
６－アミノ－４－（５－ブロモチオフェン－２－イル）－１，３－ジメチル－１，４－ジ
ヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５４）： エタノール（１０ｍＬ）中の５－ブロモチオフェン－２－カルバルデヒド（０．５４８ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１９０ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．４０ｍＬ、２．８７ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後２（０．３２１ｇ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濾過し、析出物をエタノールで再結晶化して、５４（２２１ｍｇ、０．６２８ｍｍｏｌ、収率２２％）を明橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．１８（ｓ，２Ｈ）、７．０２～７．０２（ｄ，１Ｈ）、６．８６～６．８５（ｄ，１Ｈ）、４．９３（ｓ，１Ｈ）、３．５６（ｓ，３Ｈ）、１．８１（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．９、１５１．９、１４４．２、１４３．１、１３０．３、１２６．０、１２０．３、１１０．８、９５．８、５８．３、３３．９、３３．２、１２．８。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：３５２．９→２８７．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝６６、ＣＥ＝２９、ＣＸＰ＝１８、ｔＲ＝４．３分。
【0180】
化合物５５
化学式：Ｃ１８Ｈ１３ＢｒＮ４ＯＳ
分子量：４１３．２９
６－アミノ－４－（５－ブロモチオフェン－２－イル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５５）： エタノール（６ｍＬ）中の５－ブロモチオフェン－２－カルバルデヒド（０．３２８ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、５５（８０ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ、収率１１％）を橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．６１～７．５９（ｄ，２Ｈ）、７．３０～７．２３（ｍ，５Ｈ）、６．９２～６．９１（ｄ，１Ｈ）、６．７８～６．７７（ｄ，１Ｈ）、５．４１（ｓ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．３、１５１．９、１４５．４、１４４．８、１３３．０、１３０．３、１２８．８、１２８．２、１２６．６、１２５．８、１２０．２、１１０．４、９５．２、５９．１、３４．５、３３．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４１５．１→３４８．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝４．５分。
【化8】
分子量：４１３．２９
６－アミノ－４－（５－ブロモチオフェン－２－イル）－１－メチル－３－フェニル－１，４－ジヒドロピラノ［２，３－ｃ］ピラゾール－５－カルボニトリル（５５）： エタノール（６ｍＬ）中の５－ブロモチオフェン－２－カルバルデヒド（０．３２８ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（０．１１４ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２４０ｍＬ、１．７２ｍｍｏｌ）の混合物を１０分間撹拌し、その後３（０．３００ｇ、１．７２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２２時間後に濃縮し、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ中、２％ＭｅＯＨ）によって精製して、５５（８０ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ、収率１１％）を橙色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：７．６１～７．５９（ｄ，２Ｈ）、７．３０～７．２３（ｍ，５Ｈ）、６．９２～６．９１（ｄ，１Ｈ）、６．７８～６．７７（ｄ，１Ｈ）、５．４１（ｓ，１Ｈ）、３．７４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）ＤＭＳＯ：１５９．３、１５１．９、１４５．４、１４４．８、１３３．０、１３０．３、１２８．８、１２８．２、１２６．６、１２５．８、１２０．２、１１０．４、９５．２、５９．１、３４．５、３３．９。ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ：４１５．１→３４８．０ｍ／ｚ；３０のＧＳ１及びＧＳ２、ＤＰ＝８１、ＣＥ＝３１、ＣＸＰ＝２２、ｔＲ＝４．５分。
【0181】
本発明の上記実施例は例示及び説明目的で提示されている。さらに、これらの実施例は本発明を本明細書に開示される形態に限定することを意図していない。結果として、本明細書の教示に応じた変更及び修正、並びに関連分野の技術又は知識が本発明の範囲内となる。本明細書で与えられる実施例に記載される特定の実施形態は、本発明を実施するのに知られるベストモードを更に説明するものであり、当業者がかかる又は他の実施形態において本発明の特定用途又は使用に要求される様々な変更を加えて本発明を利用することが
可能であることを意図している。添付の特許請求の範囲は従来技術によって許容される程度に代替的な実施形態を包含するように解釈されることを意図している。
可能であることを意図している。添付の特許請求の範囲は従来技術によって許容される程度に代替的な実施形態を包含するように解釈されることを意図している。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図4J】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
