(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-08
(45)【発行日】2022-07-19
(54)【発明の名称】腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220711BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20220711BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220711BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
A61K35/74 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】
31
(21)【出願番号】P 2020513883
(86)(22)【出願日】2018-08-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-19
(86)【国際出願番号】 CN2018100424
(87)【国際公開番号】W WO2019047679
(87)【国際公開日】2019-03-14
【審査請求日】2021-05-26
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2017/101069
(32)【優先日】2017-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC NO.14577
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC NO.14578
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC NO.14579
【微生物の受託番号】CGMCC CGMCC NO.14580
(73)【特許権者】
【識別番号】520074631
【氏名又は名称】ニュー ポータル リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＷ ＰＯＲＴＡＬ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍｓ ２２０２－２２０３， ２２／Ｆ， Ｈａｒｂｏｕｒ Ｃｅｎｔｒｅ， ２５ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｒｏａｄ， Ｗａｎｃｈａｉ， Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ （ＣＮ）．
(74)【代理人】
【識別番号】110001494
【氏名又は名称】前田・鈴木国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ジン， イェ
【審査官】池上 京子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００９／０９８２４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Molecular Therapy，2014年，vol.22, no.7，p.1266-1274
【文献】Gene Therapy，2009年，vol.16，p.329-339
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸システムと、腫瘍細胞を死滅させる細胞毒素をコードする遺伝子とを含む、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌であって、
前記核酸システムは、
前記細菌を死滅させる毒素をコードする第１のＤＮＡ断片と、
前記毒素を無効にする解毒剤をコードし、腫瘍組織において転写されるが非腫瘍組織においては転写されない第２のＤＮＡ断片と、
前記第２のＤＮＡ断片に動作可能に連結され、前記解毒剤が前記腫瘍組織において発現されるが前記非腫瘍組織においては発現されないように、グルコースレベルの制御下で前記第２のＤＮＡ断片の転写を抑制する解毒剤遺伝子のプロモーターと、
前記第１のＤＮＡ断片に動作可能に連結され、前記毒素が前記腫瘍組織及び前記非腫瘍組織において発現されるように、前記第１のＤＮＡ断片の構成的転写を引き起こす毒素遺伝子の構成的プロモーターと、を含む、細菌。
【請求項2】
腫瘍細胞を死滅させる前記細胞毒素は、緑膿菌エキソリシン、セレウス菌非溶血性エンテロトキシン、コレラ菌溶血素Ａ及び大腸菌α溶血素からなる群から選択される、請求項１に記載の細菌。
【請求項3】
前記腫瘍組織は、０．４２４ｍＭよりも低いグルコース濃度を有し、前記解毒剤遺伝子のプロモーターは、前記グルコースレベルが０．４２４ｍＭよりも低いときに、前記第２のＤＮＡ断片の前記転写を開始する、請求項１～２のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項4】
前記非腫瘍組織は、１．２２ｍＭよりも高いグルコース濃度を有し、前記解毒剤遺伝子のプロモーターは、前記グルコースレベルが１．２２ｍＭよりも高いときに、前記第２のＤＮＡ断片の前記転写を抑制する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項5】
前記解毒剤遺伝子のプロモーターは、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１～４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項6】
前記毒素遺伝子の構成的プロモーターは、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１～５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項7】
前記解毒剤遺伝子のプロモーターは、ｌａｃプロモーター、ｇｌｔＡプロモーター、ｓｄｈＡＤＣプロモーター及びｔｎａＢプロモーターからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項8】
一対の前記毒素と前記解毒剤は、ＣｃｄＢ－ＣｃｄＡ対、ＡｖｒＲｘｏ１－Ａｒｃ１対、Ｈｈａ－ＴｏｍＢ対、及びＰａａＡ２－ＰａｒＥ２対からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項9】
前記第１のＤＮＡ断片は、配列番号１に示され、前記第２のＤＮＡ断片は、配列番号２に示される、請求項１～８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項10】
前記解毒剤遺伝子のプロモーターは、配列番号３に示される、請求項１～９のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項11】
５～６個のヌクレオチドからなり、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する前記細菌の元の５～６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列をさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項12】
前記ランダム配列は、ＧＣＣＴＴ又はＴＧＴＣＴである、請求項１１に記載の細菌。
【請求項13】
前記細菌は、クロラムフェニコール耐性カセットをコードする第３のＤＮＡ断片をさらに含み、前記第３のＤＮＡ断片は、配列番号４に示される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項14】
大腸菌、サルモネラ菌及び赤痢菌からなる群から選択される細菌株に由来する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項15】
大腸菌ＭＧ１６５５に由来する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項16】
前記核酸システムは、配列番号７又は配列番号８に示される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項17】
核酸システムと、腫瘍細胞を死滅させる細胞毒素をコードする遺伝子とを含む、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌であって、
前記核酸システムは、
前記細菌を死滅させる毒素をコードし、非腫瘍組織において転写されるが腫瘍組織においては転写されない第１のＤＮＡ断片と、
前記毒素を無効にする解毒剤をコードする第２のＤＮＡ断片と、
前記第２のＤＮＡ断片に動作可能に連結され、前記第２のＤＮＡ断片の構成的転写を引き起こす解毒剤遺伝子の構成的プロモーターと、
前記第１のＤＮＡ断片に動作可能に連結され、グルコースレベルの制御下で前記第１のＤＮＡ断片の転写を引き起こす毒素遺伝子のプロモーターと、を含み、
前記毒素の発現は、前記毒素が前記非腫瘍組織において前記細菌を死滅させるように、前記グルコースレベルの制御下で前記解毒剤の構成的発現よりも高い、細菌。
【請求項18】
前記腫瘍細胞を死滅させる前記細胞毒素は、緑膿菌エキソリシン、セレウス菌非溶血性エンテロトキシン、コレラ菌溶血素Ａ及び大腸菌α溶血素からなる群から選択される、請求項１７に記載の細菌。
【請求項19】
前記腫瘍組織は、０．４２４ｍＭよりも低いグルコース濃度を有し、前記毒素遺伝子のプロモーターは、前記グルコースレベルが０．４２４ｍＭよりも低いときに、前記第１のＤＮＡ断片の前記転写を抑制する、請求項１７～１８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項20】
前記非腫瘍組織は、１．２２ｍＭよりも高いグルコース濃度を有し、前記グルコースレベルが１．２２ｍＭよりも高いときに、前記毒素遺伝子のプロモーターは前記第１のＤＮＡ断片の前記転写を開始し、かつ前記毒素の発現は前記解毒剤の構成的発現よりも高い、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項21】
前記毒素遺伝子のプロモーターは、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項22】
前記解毒剤遺伝子の構成的プロモーターは、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項23】
前記毒素遺伝子のプロモーターは、ｐｔｓＧのプロモーター、ｆｒｕＢのプロモーター、及びａｃｋＡのプロモーターからなる群から選択される、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項24】
一対の前記毒素と前記解毒剤は、ＣｃｄＢ－ＣｃｄＡ対、ＡｖｒＲｘｏ１－Ａｒｃ１対、Ｈｈａ－ＴｏｍＢ対、及びＰａａＡ２－ＰａｒＥ２対からなる群から選択される、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項25】
前記第１のＤＮＡ断片は、配列番号１に示され、前記第２のＤＮＡ断片は、配列番号２に示される、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項26】
５～６個のヌクレオチドからなり、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する前記細菌の元の５～６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列をさらに含む、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項27】
前記細菌は、クロラムフェニコール耐性カセットをコードする第３のＤＮＡ断片をさらに含み、前記第３のＤＮＡ断片は、配列番号４に示される、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項28】
大腸菌、サルモネラ菌及び赤痢菌からなる群から選択される細菌株に由来する、請求項１７～２７のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項29】
大腸菌ＭＧ１６５５に由来する、請求項１７～２８のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項30】
寄託番号Ｎｏ．１４５７７で中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された株ＪＹ１、寄託番号Ｎｏ．１４５７８でＣＧＭＣＣに寄託された株ＪＹ６、寄託番号Ｎｏ．１４５８０でＣＧＭＣＣに寄託された株ＳＨ１、又は寄託番号Ｎｏ．１４５７９でＣＧＭＣＣに寄託された株ＪＹＨ１に由来する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項31】
請求項１～３０のいずれか１項に記載の細菌を含む薬物送達組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌、薬物送達組成物、及び癌の治療などの用途でそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ほとんどの抗腫瘍薬は、活発に分裂するすべての細胞に対して作用し、深刻な、ひいては致死的な副作用さえもたらす。原発性腫瘍と播種性腫瘍の両方を治療するために、標的療法は、全身投与時に腫瘍と非腫瘍組織とを識別することができなければならない。
【0003】
以前の標的療法は、非生物学的薬物に依存してきた。全身的に送達されるとき、非生物学的薬物は血流中で激しく希釈され、腫瘍に利用できるのはわずかな部分のみである。さらに、非生物学的薬物は、送達が腫瘍血管系に依存するため、血管新生が不十分な低酸素腫瘍組織に効果的に拡散することができない。したがって、伝達後の繁殖が可能であり、血管新生が不十分な腫瘍組織を好む様々な偏性又は通気性嫌気性菌が、過去数十年間にわたって、腫瘍の標的化における安全性及び有効性について評価されてきた。しかしながら、癌の細菌療法への注目が高まっているにもかかわらず、その抗癌効果はこれまでは十分ではなかった。
【0004】
抗癌効果を高めるための要求に鑑みて、腫瘍をより特異的に標的とし、腫瘍を効果的に死滅させる、より多くの治療方法及び治療薬が望まれている。
【発明の概要】
【0005】
本発明の１つの例示的な実施形態は、腫瘍を標的とし癌を治療するための一連の細菌を提供する。各細菌は、核酸システムと、腫瘍細胞を死滅させるが細菌の生存率に影響を与えない細胞毒素をコードする遺伝子とを含む。核酸システムは、細菌を死滅させる毒素をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤をコードする第２のＤＮＡ断片と、解毒剤遺伝子のプロモーターと、毒素遺伝子の構成的プロモーターとを含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、細胞毒素をコードする遺伝子は相同遺伝子である。いくつかの実施形態では、細胞毒素をコードする遺伝子は異種遺伝子である。いくつかの実施形態では、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌は、遺伝子改変された細菌である。
【0007】
いくつかの実施形態では、細菌は、細胞毒素の構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、細胞毒素が腫瘍組織において発現されるが非腫瘍組織においてはサイレンシングされるように、細胞毒素の誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、細胞毒素が非腫瘍組織において抑制されるが腫瘍組織においては発現されるように、細胞毒素の抑制性プロモーターを含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、第２のＤＮＡ断片は、腫瘍組織において転写されるが、非腫瘍組織においては転写されない。第２のＤＮＡ断片に動作可能に連結された解毒剤遺伝子のプロモーターは、解毒剤が腫瘍組織において発現されるが非腫瘍組織においては発現されないように、グルコースレベルの制御下で第２のＤＮＡ断片の転写を抑制する。第１のＤＮＡ断片に動作可能に連結された毒素遺伝子の構成的プロモーターは、毒素が腫瘍組織及び非腫瘍組織において発現されるように、第１のＤＮＡ断片の構成的転写を引き起こす。
【0009】
いくつかの実施形態では、解毒剤遺伝子のプロモーターは、グルコースが解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、解毒剤遺伝子の転写を制御する。いくつかの実施形態では、毒素遺伝子の構成的プロモーターは、毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、非腫瘍組織において転写されるが、腫瘍組織においては転写されない。第２のＤＮＡ断片に動作可能に連結された解毒剤遺伝子の構成的プロモーターは、第２のＤＮＡ断片の構成的転写を引き起こす。第１のＤＮＡ断片に動作可能に連結された毒素遺伝子のプロモーターは、グルコースレベルの制御下で第１のＤＮＡ断片の転写を引き起こす。毒素の発現は、毒素が非腫瘍組織において細菌を死滅させるように、グルコースレベルの制御下で解毒剤の構成的発現よりも高い。
【0011】
いくつかの実施形態では、毒素遺伝子のプロモーターは、グルコースが毒素遺伝子の転写を誘導するように、毒素遺伝子の転写を制御する。いくつかの実施形態では、解毒剤遺伝子の構成的プロモーターは、解毒剤遺伝子の構成的発現を引き起こす。
【0012】
いくつかの実施形態では、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌は、腫瘍組織において増殖するが、非腫瘍組織においては増殖しない。
【0013】
別の例示的な実施形態は、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌を含む薬物送達組成物を提供する。別の例示的な実施形態は、細菌又は薬物送達組成物を投与することによって癌を治療する方法を提供する。
【0014】
いくつかの実施形態では、細胞毒素は、緑膿菌エキソリシン、セレウス菌非溶血性エンテロトキシン、コレラ菌溶血素Ａ及び大腸菌α溶血素からなる群から選択される。
【0015】
別の例示的な実施形態は、腫瘍標的化細菌に異種遺伝子を導入すること、又は腫瘍標的化細菌に相同遺伝子を過剰発現させることに関する。異種又は相同遺伝子は、腫瘍細胞を死滅させる細胞毒素をコードする。いくつかの実施形態では、異種遺伝子によってコードされる細胞毒素は、緑膿菌エキソリシン、セレウス菌非溶血性エンテロトキシン及びコレラ菌溶血素Ａからなる群から選択され、相同遺伝子によってコードされる細胞毒素は、大腸菌α溶血素である。腫瘍標的化細菌の例としては、低酸素、グルコース欠乏、酸性化などの腫瘍微小環境のシグナルを感知することによって、固形腫瘍において選択的にコロニー形成し、非腫瘍組織を無傷のままにし、それに応じてそれ自体の生存率を制御する細菌が含まれるが、これらに限定されない。これらの腫瘍標的化細菌は、天然又は遺伝子改変された細菌であり得る。
【0016】
他の例示的な実施形態は、本明細書で説明される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1A】例示的な実施形態に係る、細菌に低グルコース環境を標的とさせる毒素－解毒剤遺伝システムを示す。
【図1B】例示的な実施形態に係る、毒素としてＣｃｄＢを用いて、解毒剤としてＣｃｄＡを用いて、大腸菌に低グルコース環境を標的とさせる核酸システムを構築する概略図を示す。
【図1C】例示的な実施形態に係る、抗癌薬を固形腫瘍に送達する遺伝子操作された細菌を含む薬物送達組成物を示す。抗癌薬は、操作された細菌によって生成される抗癌分子又は化合物を含むが、これらに限定されない。
【図1D】例示的な実施形態に係る、グルコースの存在下で増殖しないがグルコースの非存在下では増殖するクローンを検索するために、０ｍＭ～４ｍＭの異なる濃度のグルコースを含むＭ６３寒天培地上にストリークされたクローンを示す。
【図2A】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から１５日後の、Ｂａｇｇ ａｌｂｉｎｏ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスのＣＴ２６（マウス結腸直腸癌細胞株）腫瘍における、遺伝子操作された細菌株ＪＹ１及びＪＹ６、ならびにＭＧ１６５５と命名された未修飾野生型大腸菌株のコロニー形成を示す。
【図2B】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から１５日後の、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓における細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５のコロニー形成を示す。
【図2C】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から１５日後の、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５によってコロニー形成された肝臓の割合を示す。
【図2D】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から７日後の、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を有するヌードマウスの腫瘍における、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５のコロニー形成を示す。
【図2E】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から７日後の、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓における、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５のコロニー形成を示す。
【図2F】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から７日後の、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスにおける、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５によってコロニー形成された肝臓の割合を示す。
【図3A】例示的な実施形態に係る、皮下ＳＷ４８０（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を保有するヌードマウスの肝臓及び脾臓における細菌株ＪＹＨ１及びＳＨ１ ｈｌｙのコロニー形成を示す。
【図3B】例示的な実施形態に係る、皮下ＳＷ４８０腫瘍を保有するヌードマウスにおける細菌株ＪＹＨ１及びＳＨ１ ｈｌｙに感染した肝臓及び脾臓の割合を示す。
【図3C】例示的な実施形態に係る、細菌株ＳＨ１ ｈｌｙで処置されたマウスにおいて発現された肝膿瘍を示す。
【図3D】例示的な実施形態に係る、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＳＨ１ ｈｌｙ株、及びＪＹＨ１株で処置された皮下ＳＷ４８０腫瘍を保有するヌードマウスからのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色肝臓切片の顕微鏡画像を示す。
【図4】例示的な実施形態に係る、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍に対する静脈内注射株ＪＹＨ１の標的効力を示す。
【図5】例示的な実施形態に係る、グルコース欠乏領域において選択的に生存し増殖することによって固形腫瘍を標的とする遺伝子操作された細菌株を構築する方法を示す。
【図6A】例示的な実施形態に係る、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果を示す。
【図6B】例示的な実施形態に係る、ヌードマウスのＳＷ４８０腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果を示す。
【図6C】例示的な実施形態に係る、０～５５日齢のマウスにＰＢＳを静脈内注射して処置されたＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真を示す。
【図6D】例示的な実施形態に係る、０～９０日齢のマウスにＪＹＨ１を静脈内注射して処置されたＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真を示す。
【図7】ＥｘｌＡ、Ｎｈｅ、大腸菌α溶血素及びコレラ菌溶血素Ａといった細胞毒素のプラスミド由来の産生が癌細胞株Ｂ１６Ｆ１０に対して細胞毒性があることを示す、例示的な実施形態に係るインビトロ細胞毒性アッセイを示し、ここで、ｐＢＡＤは、陰性対照として機能する空のプラスミドであり、ｈｌｙＣＡＢＤは、大腸菌α溶血素及びその分泌システムをコードするオペロンであり、Ｖｈｌｙは、コレラ菌溶血素Ａをコードする遺伝子である。エラーバー、ＳＤ。
【図8】例示的な実施形態に係る、プラスミド由来の大腸菌α溶血素及びコレラ菌溶血素Ａの溶血活性を示す。ここで、ｈｌｙＣＡＢＤは、大腸菌α溶血素及びその分泌システムをコードするオペロンであり、Ｖｈｌｙは、コレラ菌溶血素Ａをコードする遺伝子である。すべてのプラスミドは、非病原性かつ非溶血性の大腸菌参照株ＴＯＰ１０に導入された。
【図9】細胞毒素が免疫適格性マウスにおいてマウス同系腫瘍に対する大腸菌の阻害能力を高めることを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスのマウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に、様々な細胞毒素を発現するか又は発現しない単回用量の大腸菌を注射した。（Ａ）経時的なマウスの体重。エラーバー、ＳＥＭ。（Ｂ）腫瘍増殖に対する腫瘍内注射細菌（５×１０７／マウス）の効果。空のプラスミドｐＢＡＤを保有する細菌で処理されたマウスとＰＢＳで処理されたマウス（陰性対照）を、過剰な腫瘍増殖による腫瘍測定後９日目に安楽死させた。エラーバー、ＳＥＭ。＊、ｐ＜０．０５。（Ｃ）９日目（すなわち、腫瘍チャレンジの９日後）に、試験された細胞毒素を発現する大腸菌又は空のベクターｐＢＡＤを保有する大腸菌を注射したＢ１６Ｆ１０腫瘍の代表的な写真。
【図10】染色体内のｈｌｙＣＡＢＤオペロンの単一コピーからの大腸菌α溶血素の産生が溶血性大腸菌の抗癌効果に必要ではないことを示す。単回用量の細菌（腫瘍当たり１×１０７ｃｆｕ）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスのマウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０腫瘍に注射した。ｈｌｙ＋は、染色体内のｈｌｙＣＡＢＤオペロンを保有する溶血性大腸菌株であり、ｈｌｙ－は、ｈｌｙＣＡＢＤオペロン全体が欠失している溶血性大腸菌株の同質遺伝子変異体である。エラーバー、ＳＥＭ。
【発明を実施するための形態】
【0018】
例示的な実施形態は、核酸システムに関する。核酸システムは、遺伝子操作された細菌株が固形腫瘍を標的とするが正常組織を無傷のままにするように、細菌株に導入される。遺伝子操作された細菌株は、腫瘍組織において増殖するが、非腫瘍組織においては死滅する。
【0019】
他の例示的な実施形態は、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌に関する。細菌は、腫瘍細胞を死滅させる細胞毒素をコードする異種又は相同遺伝子と核酸システムを含む。腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌を生成するために行われる遺伝子改変は、任意の順序で行うことができることを理解されたい。例えば、腫瘍細胞を死滅させるために、細菌への核酸システムの挿入を最初に実行し、続いて細胞毒素コード遺伝子の挿入を実行することができる。或いは、腫瘍細胞を死滅させる細胞毒素をコードする異種又は相同遺伝子の挿入を最初に実行し、続いて核酸システムの挿入を実行することができる。
【0020】
細胞毒素は、細菌が非腫瘍組織において生き延びない又は生存しないので、非腫瘍組織において発現できない。いくつかの実施形態では、細菌は、腫瘍組織において増殖するが、非腫瘍組織においては増殖しない。
【0021】
低酸素は、細菌を固形腫瘍に標的化する腫瘍微小環境の最も一般的に利用される特徴である。しかし、厳密に低酸素を標的とする偏性嫌気性菌は、固形腫瘍の壊死領域に限定され、一方、通気性嫌気性菌は、固形腫瘍全体にコロニーを形成するが、低酸素標的化の制御が緩やかであるため、正常組織に感染する。本発明に係る例示的な実施形態は、細菌のグルコース依存性の生存率を調節することによって細菌の腫瘍特異性を改善する核酸システムを細菌に導入することにより、これらの技術的課題を解決する。
【0022】
細菌は、様々なメカニズムで哺乳動物細胞を破壊する様々な細胞毒素を産生することができる。いくつかの細胞毒素は、ほとんどの上皮細胞及び内皮細胞を効果的に死滅させる。しかしながら、細菌を患者に投与すると、細菌によって発現される細胞毒素は、腫瘍細胞だけでなく正常細胞にも損傷を与える可能性がある。例示的な実施形態は、細胞毒素が腫瘍細胞のみを損傷するが正常細胞を無傷のまま維持するように、腫瘍特異性を有する遺伝子操作された細菌又は天然細菌に細胞毒素コード遺伝子を導入することにより、これらの技術的課題を解決する。或いは、細胞毒素による正常組織の損傷は、細胞毒素が腫瘍組織においてのみ発現するが非腫瘍組織においてはサイレンシングされるように、グルコース抑制プロモーターなどのいくつかの誘導性又は抑制性プロモーターの下で細胞毒素を誘導的に発現させることによって回避することもできる。さらに、細胞毒素コード遺伝子は、細菌に癌と戦うさらなる能力を与える。
【0023】
例示的な実施形態の細胞毒素は、緑膿菌エキソリシン、セレウス菌非溶血性エンテロトキシン、コレラ菌溶血素Ａ及び大腸菌α溶血素を含むが、これらに限定されない。
【0024】
エキソリシン（ＥｘｌＡ）は、緑膿菌によって排出される膜孔形成毒素である。ＥｘｌＡは、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞及びマクロファージなどのほとんどの細胞タイプに溶解能力を有するが、溶血性が低い。非溶血性エンテロトキシン（Ｎｈｅ）は、セレウス菌に見られる主要な毒素である。Ｎｈｅは、哺乳動物細胞の細胞膜での孔形成をトリガすることによって細胞溶解を誘発し、Ｇ０／Ｇ１期で細胞周期停止を誘発し、細胞アポトーシスを誘発するが、溶血を引き起こさない。コレラ菌溶血素Ａは、真核細胞膜に孔を形成することによって細胞溶解を引き起こす。ＥｘｌＡ及びＮｈｅとは対照的に、コレラ菌溶血素Ａは、細胞溶解性だけでなく溶血性もある。大腸菌α溶血素は、尿路病原性大腸菌によって産生される。コレラ菌溶血素Ａと同様に、大腸菌α溶血素は、細胞溶解性と溶血性の両方がある。これは、上皮細胞だけでなく、マクロファージ及びナチュラルキラー細胞に対しても細胞毒性があり、大腸菌に対する宿主防御に対抗する。
【0025】
別の実施形態は、腫瘍を標的とし癌を治療するための細菌を患者に投与するステップを含む、癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、発現された細胞毒素は、癌を治療するために腫瘍細胞溶解を引き起こす。いくつかの実施形態では、細菌は、手術、化学療法、放射線療法、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、又は幹細胞移植などの１つ以上のさらなる癌治療法と組み合わせて投与される。療法が別の療法と組み合わせて投与される場合、投与は連続的であってもよく、共投与であってもよい。１つの実施形態では、癌は黒色腫である。
【0026】
別の実施形態は、腫瘍を標的とし癌を治療する細菌を腫瘍細胞と接触させるステップを含む、腫瘍細胞を溶解する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、インビトロ方法である。他の実施形態では、この方法は、インビボ方法である。
【0027】
図１Ａは、構成的に発現される毒素コード遺伝子と、グルコースに抑制されるプロモーターの制御下での解毒剤コード遺伝子とを含む核酸システム１００を示す。例示的な実施形態に従って、核酸システムは、低グルコース環境を標的とする能力を細菌に与える。
【0028】
毒素－解毒剤遺伝システムは、細菌がグルコース欠乏環境で選択的に増殖するが、グルコースの存在下で死滅することを可能にする。グルコース欠乏は固形腫瘍微小環境の特徴であるため、核酸システムを備えた細菌は、全身に適用されるときに固形腫瘍を特異的に標的とすることができる。腫瘍細胞は、一般に、急速な細胞増殖、過剰なグルコース消費、及び不十分な血液供給のために、グルコースを奪われる。腫瘍組織のグルコース濃度は０．１２３～０．４２４ｍＭであり、正常組織のグルコース濃度は１．２２～１．２９ｍＭであり、１ｇの組織が１ｍｌであると仮定する。毒素－解毒剤核酸システムは、細菌が低グルコース環境下で選択的に増殖することを可能にする。
【0029】
核酸システムは、腫瘍微小環境の特徴である低グルコース条件下で選択的に増殖する能力を細菌に与える。大腸菌などの細菌は、腫瘍の微小環境において免疫が強く抑制されるため、固形腫瘍に優先的に増殖し、正常組織にあまりコロニーを形成しない固有の能力を有する。低グルコース環境を標的とする核酸システムは、腫瘍特異性が単独で使用するのに不十分な大腸菌などの細菌に高い腫瘍選択性を与え、細菌媒介腫瘍治療の安全性を改善する。
【0030】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化システムである核酸システムが細菌の染色体に組み込まれ、それによって細菌は腫瘍を標的とする固有の能力だけに依存せず、その結果、細菌の安全性が改善される。例示的な実施形態では、核酸システムは、プラスミドに挿入される。例示的な実施形態では、核酸システムは、グルコース感知システム又はモジュールである。
【0031】
例示的な実施形態では、核酸システムを保有する細菌は、低グルコース環境を標的とすることによって厳密に固形腫瘍においてコロニー形成する。
【0032】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素コード遺伝子と、解毒剤コード遺伝子と、解毒剤コード遺伝子の転写を制御するグルコースに抑制されるプロモーターと、毒素コード遺伝子の構成的発現を引き起こす構成的プロモーターとを含む。
【0033】
例示的な実施形態では、生理学的レベルのグルコースを有する環境では、毒素は構成的に発現され、一方、解毒剤の発現はグルコースに抑制されるプロモーターの制御下でグルコースによって抑制される。解毒剤が毒素を無効にするように発現されないため、核酸システムを保有する細菌は、生理学的レベルのグルコースを有する環境で増殖しない。低グルコース環境では、毒素と解毒剤の両方が発現される。解毒剤が毒素を無効にするため、核酸システムを保有する細菌は、低グルコース環境で増殖する。
【0034】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素コード遺伝子と、解毒剤コード遺伝子と、毒素コード遺伝子の転写を制御するグルコース誘導プロモーターと、解毒剤コード遺伝子の構成的発現を引き起こす構成的プロモーターとを含む。
【0035】
例示的な実施形態では、生理学的レベルのグルコースを有する環境では、解毒剤は構成的に発現され、一方、毒素の発現はグルコース誘導プロモーターの制御下でグルコースによって誘導される。毒素が解毒剤の発現よりも高いレベルで発現されることによって細菌を死滅させるため、核酸システムを保有する細菌は、生理学的レベルのグルコースを有する環境で増殖しない。低グルコース環境では、細菌が生存し増殖するように、毒素は発現されない。
【0036】
例示的な実施形態では、低グルコース環境は、０．４２４ｍＭよりも低い濃度のグルコースを含む。例示的な実施形態では、高グルコース環境は、１．２２ｍＭよりも高い濃度のグルコースを含む。例示的な実施形態では、低グルコース環境は、０．１２３～０．４２４ｍＭの濃度のグルコースを有する。例示的な実施形態では、高グルコース環境は、１．２２～１．２９ｍＭの濃度のグルコースを有する。
【0037】
例示的な実施形態では、固形腫瘍において、毒素の毒性が解毒剤によって拮抗されるように、発現された解毒剤のレベルは、発現された毒素のレベル以上である。
【0038】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、第１のプロモーター（すなわち、解毒剤遺伝子のプロモーター）と、第１の構成的プロモーター（すなわち、毒素遺伝子の構成的プロモーター）とを含む核酸システムである。第１の構成的プロモーターは、毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす。第１のプロモーターは、第２のＤＮＡ断片が低グルコース環境下又はグルコースの非存在下で転写されるが、グルコースの存在下又は高グルコース環境下では転写されないように、グルコース濃度の制御下で第２のＤＮＡ断片の転写を調節する。例示的な実施形態では、第２のＤＮＡ断片は、グルコースの非存在下で転写されるが、Ｍ６３培地中で濃度が１ｍＭ以上の高グルコース環境下では転写されない。
【0039】
例示的な実施形態では、第１のプロモーター（すなわち、解毒剤遺伝子のプロモーター）は、グルコースが解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、解毒剤遺伝子の転写を制御する。第２のＤＮＡ断片は、固形腫瘍において転写されるが、非腫瘍組織においては転写されない。
【0040】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、第２のプロモーター（すなわち、毒素遺伝子のプロモーター）と、第２の構成的プロモーター（すなわち、解毒剤遺伝子の構成的プロモーター）とを含む核酸システムである。第２の構成的プロモーターは、解毒剤遺伝子の構成的発現を引き起こす。第２のプロモーターは、第１のＤＮＡ断片が高グルコース環境下又は生理学的レベルのグルコースの存在下で転写されるが、グルコースの非存在下又は低グルコース環境下では転写されないように、グルコース濃度の制御下で第１のＤＮＡ断片の転写を調節する。例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、グルコースの非存在下で転写されないが、Ｍ６３培地中で濃度が１ｍＭ以上の高グルコース環境下では転写される。
【0041】
例示的な実施形態では、第２のプロモーターは、グルコースが毒素遺伝子の転写を誘導するように、毒素遺伝子の転写を制御する。第１のＤＮＡ断片は、非腫瘍組織において転写されるが、固形腫瘍においては転写されない。例示的な実施形態では、毒素の発現は、非腫瘍組織において解毒剤の構成的発現よりも高い。
【0042】
例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、配列番号１に示される。例示的な実施形態では、第２のＤＮＡ断片は、配列番号２に示される。
【0043】
例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、第２のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、第１のプロモーターの上流に位置する。例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、第２のＤＮＡ断片の下流に位置する。例示的な実施形態では、第２のプロモーターは、第１のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第１の構成的プロモーターは、第１のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第２の構成的プロモーターは、第２のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第１のプロモーターは、配列番号３に示される。
【0044】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５～６個のヌクレオチドからなり、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流かつ第１のプロモーターの下流に位置するランダム配列を含む。例示的な実施形態では、ランダム配列は、ＧＣＣＴＴ又はＴＧＴＣＴである。
【0045】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５～６個のヌクレオチドからなり、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流かつ第２のプロモーターの下流に位置するランダム配列を含む。
【0046】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５～６個のヌクレオチドからなり、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する細菌の元の又は天然の５～６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。
【0047】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５～６個のヌクレオチドからなり、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する細菌の元の又は天然の５～６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。
【0048】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５～６個のヌクレオチドからなり、第１のプロモーターの元の又は天然の５～６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、５～６個のヌクレオチドからなり、第２のプロモーターの元の又は天然の５～６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。
【0049】
例示的な実施形態では、ランダム配列は、第１のプロモーターの下流に位置する。例示的な実施形態では、ランダム配列は、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する。
【0050】
例示的な実施形態では、ランダム配列は、第２のプロモーターの下流に位置する。例示的な実施形態では、ランダム配列は、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する。
【0051】
例示的な実施形態では、核酸システムは、選択可能なマーカーをコードする第３のＤＮＡ断片を含む。例示的な実施形態では、マーカーは、クロラムフェニコール選択マーカー（ＣｍＲ）である。例示的な実施形態では、選択可能なマーカーは、クロラムフェニコール耐性カセットである。例示的な実施形態では、第３のＤＮＡ断片は、配列番号４に示される。
【0052】
例示的な実施形態では、第３のＤＮＡ断片は、第１のＤＮＡ断片の下流かつ第１のプロモーターの上流に位置する。例示的な実施形態では、第３の断片は、第２のＤＮＡ断片の下流かつ第２のプロモーターの上流に位置する。
【0053】
例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４を含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号５に示される、ｃｃｄＢの発現を駆動する構成的プロモーターを含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号６に示されるｒｒｎＢ転写終結領域を含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号７に示される。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号８に示される。
【0054】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素遺伝子と、解毒剤遺伝子と、解毒剤遺伝子の転写を制御する第１のプロモーターと、毒素遺伝子の構成的プロモーターとを含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素遺伝子と、解毒剤遺伝子と、毒素遺伝子の転写を制御する第２のプロモーターと、解毒剤遺伝子の構成的プロモーターとを含む。
【0055】
例示的な実施形態では、細菌株は、グラム陽性細菌株である。例示的な実施形態では、細菌株は、グラム陰性細菌株である。
【0056】
例示的な実施形態では、細菌株は、大腸菌である。例示的な実施形態では、細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５及び大腸菌ＳＨ１からなる群から選択される。
【0057】
図１Ｂは、例示的な実施形態に係る、大腸菌を低グルコース環境に標的化する核酸システムを構築する概略図１１０を示す。図１Ｂは、ランダム化されたグルコースに抑制されるラクトースプロモーター（Ｐｌａｃ）及びＣｃｄＡ／ＣｃｄＢ毒素－解毒剤対を使用して、大腸菌を低グルコース環境に標的とする核酸システムを構築することを示す。
【0058】
ＣｃｄＢは、宿主細菌を死滅させる毒素であり、ＣｃｄＡは、ＣｃｄＢに対抗する解毒剤である。腫瘍標的化核酸システムでは、ＣｃｄＢは、構成的に発現され、一方、ＣｃｄＡの発現は、グルコースに抑制されるラクトース（ｌａｃ）プロモーターの制御下でグルコースによって抑制される。低グルコース環境では、解毒剤ＣｃｄＡの抑制が解除され、ＣｃｄＢを無効にするため、この核酸システムを保有する細菌は良好に増殖する。生理学的レベルのグルコースの存在下で、細菌を死滅させるために、ＣｃｄＡの発現が停止し、ＣｃｄＢは解放される。
【0059】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムにおいて、ＣｃｄＡは、構成的に発現され、一方、ＣｃｄＢの発現は、グルコース誘導プロモーターの制御下でグルコースによって誘導される。低グルコース環境では、毒素ＣｃｄＢが抑制されるため、この核酸システムを保有する細菌は良好に増殖する。生理学的レベルのグルコースの存在下で、細菌を死滅させるために、ＣｃｄＢの発現が開始される。
【0060】
図１Ｂに示すように、５～６個のヌクレオチド（ｎｎｎｎｎ）からなるランダム化断片は、ｃｃｄＡ遺伝子の開始コドンのすぐ上流に位置する元の又は天然の５～６個のヌクレオチド（第２のＤＮＡ断片の一例）を置き換える。このランダム化断片内の異なる配列は、異なるレベルのｃｃｄＡの発現をもたらす。いくつかの配列では、腫瘍におけるグルコースレベルは、ＣｃｄＡの発現を活性化してＣｃｄＢの毒性に拮抗するのに十分に低く、正常組織におけるグルコースレベルは、ｌａｃプロモーターの制御下でＣｃｄＡの発現を遮断するのに十分に高い。クロラムフェニコール選択マーカー（ＣｍＲ）などの選択可能なマーカーも、図１Ｂの核酸システムに使用される。
【0061】
ランダム化断片内の異なる配列（核酸システム又はＤＮＡプールのランダムライブラリ）を有する核酸システムは、大腸菌の染色体に挿入され、そして、グルコースの存在下で増殖しないがグルコースの非存在下で増殖する細菌をスクリーニングするために、細菌は、グルコースを含む（Ｇｌｃ（＋））か、又はグルコースを含まない（Ｇｌｕ（－））溶原培地（ＬＢ）寒天プレート上にストリークされる。矢印１１２は、グルコース陰性培地で増殖するがグルコースを含む培地で増殖しないクローンを示す。例示的な実施形態では、ＬＢ寒天プレート上のグルコースの濃度は、０ｍＭ又は５ｍＭである。
【0062】
図１Ｃは、固形腫瘍を特異的に標的とするだけでなく、抗癌分子又は化合物を生成することによって抗癌薬１２４を固形腫瘍に送達する遺伝子操作された細菌１２２を含む薬物送達組成物１２０を示す。
【0063】
遺伝子操作された細菌１２２は、薬物１２４を固形腫瘍に送達し、腫瘍細胞を死滅させる。遺伝子操作された細菌１２２は、細菌が固形腫瘍において増殖するが非腫瘍組織においては増殖しないように、本明細書に記載の核酸システムを含む。
【0064】
以下の実施例は、様々な実施形態を示すように提供される。
【実施例1】
【0065】
材料及び方法
【0066】
低グルコース環境を標的とする操作された大腸菌のランダムライブラリの構築
【0067】
本実施例で設計された腫瘍標的化核酸システムは、構成的に発現されるｃｃｄＢ遺伝子と、ｌａｃプロモーターの制御下でグルコースに抑制されるｃｃｄＡ遺伝子とから構成された。解毒剤ＣｃｄＡは、生理学的レベルのグルコースの存在下で抑制され、その結果、毒素ＣｃｄＢが細菌を死滅させる。対照的に、ＣｃｄＡの発現の抑制が解除され、ＣｃｄＢの作用に対抗するため、細菌は低グルコース増殖条件下で生存している。低グルコース条件下でｌａｃプロモーターの制御下でＣｃｄＢに拮抗するＣｃｄＡの能力を改善するため、又はグルコースの存在下で細菌を死滅させるＣｃｄＢの能力を高めるために、ｃｃｄＡ遺伝子の開始コドンのすぐ上流に位置する５個のヌクレオチドをランダム化することによって、腫瘍標的化核酸システムのランダムライブラリを構築した。λ－Ｒｅｄ組換え技術により染色体の遺伝子操作を容易にするために、図１Ｂに示すように、選択可能なマーカー、すなわちクロラムフェニコール選択マーカー（ＣｍＲ）を腫瘍標的化核酸システムに含めた。
【0068】
具体的には、図１Ｂに示すように、構成的プロモーターの制御下でのｃｃｄＢ遺伝子と、選択可能なマーカー（ｌｏｘＰ－ｃａｔ－ｌｏｘＰカセットなど）と、５個のヌクレオチド（５ｎｔ）－ランダム化領域と、グルコースに抑制されるプロモーター（ｌａｃプロモーターなど）の制御下でのｃｃｄＡ遺伝子とを含む一組のＤＮＡ断片（つまり、腫瘍を標的とする核酸システム）を、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した。５ｎｔ－ランダム化領域は、核酸システムのランダムライブラリを生成することを可能にする。選択マーカーは、組み換えにより、細菌の染色体に核酸システムを挿入することを可能にする。そして、λ－Ｒｅｄ組換え技術を用いて、大腸菌の染色体に核酸システムのライブラリを挿入した。グルコース欠乏ＬＢで１時間回復した後、細菌培養物を、抗生物質（ｌｏｘＰ－ｃａｔ－ｌｏｘＰカセットを選択マーカーとして使用した場合、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールである）を補充したグルコース欠乏ＬＢ寒天に広げた。３２℃で一晩培養した後、寒天上に個々のコロニーを形成した。各コロニーは、低グルコース条件下で選択的に増殖する可能性を有する単一の大腸菌の複製に由来する。これらのコロニーは、推定腫瘍標的化細菌のランダムライブラリを形成した。ここで、ＣｃｄＢ－ＣｃｄＡ対を他の毒素－解毒剤対で置き換えることができる。
【0069】
グルコース欠乏環境を標的とする細菌のライブラリスクリーニング：
【0070】
グルコース欠乏ＬＢ培地を、低グルコース条件下で選択的に増殖する細菌のライブラリスクリーニングに使用した。ランダムライブラリをスクリーニングするために、各クローンをグルコース欠乏ＬＢ寒天及び５ｍＭのグルコース添加ＬＢ寒天の両方にストリークした。３７℃で一晩培養した後、グルコース欠乏ＬＢ寒天上で容易に増殖するがグルコース陽性ＬＢ寒天上では増殖しないことが判明したクローンを、最小Ｍ６３培地寒天を用いてさらに評価した。Ｍ６３寒天には、３０ｍＭグリセロールに加えて、増加する濃度のグルコースを補充した。ここで、大腸菌ＭＧ１６５５以外の細菌株は、同じストラテジーを使用して腫瘍標的化細菌のスクリーニングに使用することができる。
【0071】
操作された細菌の腫瘍標的効力のインビボ評価：
【0072】
６～８週齢のヌードマウスをヒト癌細胞株の腫瘍移植に使用し、６～８週齢の免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスをマウス由来細胞株の腫瘍移植に使用した。１×１０７の細菌を各マウスの尾静脈に注射した。細菌注射後３日ごとに、デジタルキャリパーを用いて腫瘍サイズを測定した。実験の終わりに、コロニー形成単位の決定のために、マウスを安楽死させ、それらの腫瘍及び臓器を除去した。具体的には、１グラムの組織を１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中で均質化した。得られた組織懸濁液を連続的に希釈し、平板培養し、希釈懸濁液のコロニー形成単位を計数した。希釈率に応じて各組織の細菌数を算出した。細菌は、腫瘍に存在するが臓器には存在しない場合、腫瘍を特異的に標的とすることができると見なされた。
【0073】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、構成的に発現されるｃｃｄＢ遺伝子、ＣｍＲカセット、及び開始コドンのすぐ上流に位置する５ｎｔ－ランダム配列を有するｌａｃプロモーター制御ｃｃｄＡからなる。これらの要素は、必ずしも図１Ｂに示す順序で配置されるわけではない。例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、構成的に発現されるｃｃｄＡ遺伝子、ＣｍＲカセット、及び開始コドンのすぐ上流に位置する５ｎｔ－ランダム配列を備えたグルコース誘導プロモーター制御ｃｃｄＢからなる。ｃｃｄＢ－ｃｃｄＡ対は、他の毒素－解毒剤対で置き換えることができる。ＣｍＲは、他の選択可能なマーカーで置き換えることができる。ランダム配列中のヌクレオチドの数は５に限定されない。
【0074】
遺伝子クローニング：
【0075】
緑膿菌ＥｘｌＡ、セレウス菌Ｎｈｅ、コレラ菌溶血素Ａ及び大腸菌α溶血素といった細胞毒素をコードする遺伝子を合成し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによるＣｌｏｎｅＥＺシームレスクローニング技術を用いてｐＢＡＤプラスミドにおいてクローニングした。すべての組換えプラスミドを配列決定分析により確認した。
【0076】
インビトロ細胞毒性アッセイ：
【0077】
試験された各細胞株を、適切な増殖培地中で１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。細胞が８０％コンフルエントに増殖したとき、細胞を、ｍｏｉ１００（すなわち、細胞当たり１００個の細菌）で試験された大腸菌株と共培養した。対照として、細胞をＰＢＳ単独でも共培養した。抗生物質を含まない培地中で４～１２時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１％クリスタルバイオレットで５分間染色した。死細胞は洗浄によって除去されているので、生存細胞のみが染色された。染色した細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄し、次に９５％エタノールで脱染した。脱染溶液における、生存可能な癌細胞の量を反映するクリスタルバイオレット染色の量を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて５９５ｎｍで測定した。共培養された細菌によって死滅させた細胞の割合を、式：（対照－処置）／対照×１００を用いて算出した。すべての実験を、２つの独立した状況で４回ずつ実施した。
【0078】
溶血アッセイ：
【0079】
ヒツジの血液を補充したＬＢ寒天上に細菌の一晩培養物を滴下し、次に３７℃で８～１０時間インキュベートした。寒天の除去により、赤血球の破壊による溶血が明らかになった。
【0080】
腫瘍に対する操作された大腸菌の有効性のインビボ評価：
【0081】
６～８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスをヒト又はマウスの癌細胞株の皮下腫瘍移植に使用した。試験された細胞株の１０５～１０６個の細胞を各マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍の平均体積が約１５０～３００ｍｍ３に達した、細胞株注射の１０～１５日後に、１０７個の細菌を各マウスの尾静脈に注射又は５×１０７個の細菌を各腫瘍に直接注射した。細菌注射後、３日ごとに腫瘍体積及び体重を測定した。腫瘍体積は、式（最長直径）×（最短直径）２×０．５２を用いて計算した。腫瘍重量を含まない体重は、体重から推定腫瘍重量を差し引くことによって計算した（１０００ｍｍ３の腫瘍組織が１ｇであると仮定した）。
【実施例2】
【0082】
この実施例では、大腸菌ＭＧ１６５５を使用した。構成的に発現されるＣｃｄＢ、ｌａｃプロモーター制御ＣｃｄＡ、ｌａｃプロモーター、及びＣｍＲを用いて、腫瘍標的化核酸システムを構築した。ｃｃｄＢ遺伝子は、ｌａｃプロモーターの上流に位置するＣｍＲカセットの上流に位置した。ｃｃｄＡ遺伝子のすぐ上流のｌａｃプロモーターにランダム化断片（この例では５個のヌクレオチド）を挿入することによって、推定腫瘍標的化細菌のランダムライブラリを生成した。ランダムライブラリを大腸菌株ＭＧ１６５５で染色体内に確立した。このランダムライブラリでは、各大腸菌ＭＧ１６５５変異体は、ランダム化されたドメインにおいて独特の５個のヌクレオチド配列を有するｌａｃプロモーター変異体を染色体内に保有していた。ランダムライブラリをスクリーニングして、低グルコース条件下で選択的に増殖する細菌クローンを検索した。具体的には、グルコースが枯渇したＬＢ寒天上にライブラリを構築した。次に、得られた大腸菌クローンを、５ｍＭのグルコースを含むＬＢ寒天とグルコースを含まないＬＢ寒天の両方に個々にストリークして、グルコースの存在下で増殖しなかったがグルコースの非存在下では増殖した大腸菌クローンをスクリーニングした。約１５００個のクローンがスクリーニングされ、６個のクローンがグルコース陰性培地で優先的に増殖することが判明した。
【0083】
図１Ｄは、最小培地Ｍ６３寒天上のグルコースに対する６個の大腸菌クローンの感受性についての図面１３０を示す。６個のクローンを精製し、一晩インキュベートし、連続希釈した。１０μｌの各希釈懸濁液を、０ｍＭのグルコース（Ｇｌｕ）から４ｍＭのＧｌｕに増加する濃度のＧｌｕを補充した最小培地Ｍ６３に滴下して、その表現型を確認した。６個のクローンのうち、１番目及び６番目のクローンは、グルコース陰性培地寒天上でよく増殖したが、グルコースの存在下ではあまり増殖しなかった。対照的に、２番目、３番目、４番目及び５番目のクローンは、グルコース陰性及びグルコース陽性培地寒天の両方でかなりの増殖を示した。これを考慮すると、１番目及び６番目のクローン（図１Ｄの枠内）は、腫瘍標的化細菌の候補であり、それぞれＪＹ１及びＪＹ６（ＪＹ８とも命名される）と命名された。より多くのライブラリスクリーニングを実施した場合、より多くのグルコース感知クローンを特定することができる。
【0084】
クローンＪＹ１の染色体におけるｃｃｄＡ遺伝子の上流のランダム配列は、ＧＣＣＴＴである。ＪＹ１のヌクレオチド配列は、配列番号５に示される配列を含む。クローンＪＹ６の染色体におけるｃｃｄＡ遺伝子の上流のランダム配列は、ＴＧＴＣＴである。
【0085】
株ＪＹ１は、寄託番号Ｎｏ．１４５７７で寄託日２０１７年８月３０日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された。株ＪＹ６は、寄託番号Ｎｏ．１４５７８で寄託日２０１７年８月３０日にＣＧＭＣＣに寄託された。
【実施例3】
【0086】
操作された大腸菌変異体ＪＹ１及びＪＹ６は、グルコースに敏感であり、インビトロでグルコースの存在下で増殖しなかった。この実施例は、腫瘍内のグルコースレベルがＪＹ１及びＪＹ６が生存し増殖するのに十分に低いことを示すインビボ実験及びデータを提供する。ＪＹ１及びＪＹ６を、ＣＴ２６（マウス結腸直腸癌細胞株）腫瘍（１０７ｃｆｕ／マウス）を有する免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に別々に注射した。親株ＭＧ１６５５を対照として使用した。尾静脈注射の１５日後、腫瘍及び肝臓における細菌の分布について分析した。肝臓は、他の臓器よりも細菌感染に対して脆弱であるため、分析のために選択された。
【0087】
図２Ａ～２Ｆは、マウスの腫瘍を特異的に標的とした大腸菌ＪＹ１及びＪＹ６を示す。エラーバー、ＳＥＭ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0088】
図２Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）２００を示す。図２Ａに示すように、ＪＹ１、ＪＹ６、及びＭＧ１６５５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍に同等にコロニーを形成し、腫瘍におけるそれらのレベルは、１０８ｃｆｕ／ｇを超えていた。これらのデータは、ＪＹ１及びＪＹ６の両方が、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスによって保有されるＣＴ２６腫瘍内の良好なコロニー形成因子であることを示した。
【0089】
図２Ｂは、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓１グラム当たりのＣＦＵ２１０を示す。図２Ｂに示すように、ＪＹ１は、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓にコロニーを形成しなかった。ＪＹ６は、ＭＧ１６５５よりも小さい範囲にＣＴ２６を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓にコロニーを形成した。図２Ｃは、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＪＹ１、ＪＹ６及びＭＧ１６５５がコロニー形成された肝臓の割合２２０を示す。図２Ｃに示すように、ＪＹ６はＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの２０％（５匹中１匹）の肝臓で検出され、ＪＹ１はどのマウスの肝臓でも検出されなかったが、ＭＧ１６５５のコロニー形成はマウスの６０％（５匹中３匹）の肝臓で発生した。これらは、ＪＹ１及びＪＹ６がＭＧ１６５５よりも腫瘍に特異的であり、ＪＹ１がＪＹ６よりも腫瘍に特異的であることを示した。
【0090】
さらなるプレーティング分析は、ＪＹ１が免疫適格性マウスの血液、及び脾臓、心臓、肺、腎臓などを含む臓器にも存在しなかったことを示した。ＪＹ１及びＪＹ６はＣＴ２６腫瘍にコロニーを形成する能力を示したが、ＪＹ１は、免疫適格性マウスにおいてＪＹ６よりも腫瘍の特異的標的化において優れていた。
【0091】
皮下ＨＣＴ１１６（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を保有する免疫不全ヌードマウスにおいて同様の実験を実施した。細菌（１０７ｃｆｕ／マウス）の尾静脈注射後の７日後、腫瘍及び肝臓における細菌の分布について分析した。図２Ｄは、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍１グラム当たりのＣＦＵ２３０を示す。図２Ｄに示すように、ＪＹ１、ＪＹ６、及びＭＧ１６５５は、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍にコロニーを形成した。図２Ｅは、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓１グラム当たりのＣＦＵ２４０を示す。図２Ｅに示すように、ＪＹ１は、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓にコロニーを形成しなかった。ＪＹ６は、ＭＧ１６５５よりも小さい範囲にＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓にコロニーを形成した。図２Ｆは、ＨＣＴ１１６を有するヌードマウスにおける、ＪＹ１、ＪＹ６及びＭＧ１６５５がコロニー形成された肝臓の割合２５０を示す。図２Ｆに示すように、ＪＹ６及びＭＧ１６５５は、それぞれヌードマウスの２８．５７％（７匹中２匹）及び８５．７１％（７匹中６匹）の肝臓で検出された。再び、ＪＹ１はどのマウスの肝臓にも存在しなかった（ｎ＝６）。これらは、ＪＹ１及びＪＹ６がＭＧ１６５５よりも免疫不全マウスの腫瘍に特異的であり、ＪＹ１がＪＹ６よりも免疫不全マウスの腫瘍に特異的であることを示した。
【0092】
ＪＹ１が正常組織に感染しなかったことを確認するために、細菌処理群の各マウスの血液と脾臓、心臓、肺、腎臓の均質化懸濁液をさらに検査した。これらのすべては、ＪＹ１が除去された。ＪＹ１は、臓器への感染を回避したが、ＨＣＴ１１６腫瘍に容易にコロニーを形成し、腫瘍におけるそのレベルは３．７９×１０７ｃｆｕ／ｇに達した（図２Ｄ）。まとめると、インビボデータは、細菌ＪＹ１及びＪＹ６によって保有される腫瘍標的化核酸システムが、免疫適格性マウスと免疫不全マウスの両方の固形腫瘍を特異的に標的とすることを可能にし、ＪＹ１が固形腫瘍を標的とする能力においてＪＹ６よりも優れていることを実証する。
【実施例4】
【0093】
次に、ＪＹ１によって保有されるグルコース標的化核酸システムを大腸菌ＳＨ１の染色体に移植し、この核酸システムが特定の細菌株に限定されないことを示した。
【0094】
健康な女性ボランティアによって提供された糞便試料から大腸菌ＳＨ１を分離した。糞便試料をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及びＸ－ｇａｌ（０．０６ｍｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天上に広げた。大腸菌は、青色コロニーを形成し、他の細菌種とは区別された。ＳＨ１は、糞便大腸菌分離株の１つである。株ＳＨ１は、寄託番号Ｎｏ．１４５８０で寄託日２０１７年８月３０日にＣＧＭＣＣに寄託された。
【0095】
得られた組換え大腸菌株をＪＹＨ１と称した。株ＪＹＨ１は、寄託番号Ｎｏ．１４５７９で寄託日２０１７年８月３０日にＣＧＭＣＣに寄託された。
【0096】
その後、皮下ＳＷ４８０（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を保有するヌードマウスにＪＹＨ１を静脈内注射した。細菌の静脈内注射の９０日後に、腫瘍及び臓器における細菌のコロニー形成についてマウスを分析した。４匹のＪＹＨ１処置マウスの腫瘍が完全に治癒したため、この群では２つの腫瘍のみが分析に利用できた。ＪＹＨ１は、２つの腫瘍のうち１つから検出され、１グラム当たり１．８×１０８ｃｆｕに達した。
【0097】
それは、モジュール又はヌクレオチドシステムが大腸菌ＳＨ１に導入されると、得られる株は腫瘍を標的とするだけでなく、腫瘍を治療できることを示している。
【0098】
図３Ａ及び３Ｂは、大腸菌ＪＹＨ１がＳＷ４８０腫瘍を特異的に標的とし、ヌードマウスの正常組織にコロニーを形成しなかったが、腫瘍標的化ヌクレオチドシステムによって操作されていなかった同系株ＳＨ１ ｈｌｙは、腫瘍と正常組織の両方にコロニーを形成したことを示す。＊Ｐ＜０．０５。エラーバー、ＳＥＭ。
【0099】
図３Ａは、ＳＷ４８０を有するヌードマウスの肝臓及び脾臓組織１グラム当たりのＣＦＵ３００を示す。図３Ｂは、ＪＹＨ１及びＳＨ１ ｈｌｙに感染した肝臓及び脾臓の割合３１０を示す。図３Ａ及び３Ｂに示すように、ＪＹＨ１は、肝臓又は脾臓にコロニーを形成しなかった。すべてのＪＹＨ１処置ヌードマウスの肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓は、ＪＹＨ１が除去されたが、これは、グルコース感知モジュールがＪＹＨ１を腫瘍に限定することができ、それが離れた臓器に拡散するのを長時間防ぐことができることを示した。ＪＹＨ１とは対照的に、グルコース感知モジュールを備えていないその同系株ＳＨ１ ｈｌｙは、腫瘍（９．３５×１０８±５．９７×１０８ｃｆｕ／ｇ、平均±ＳＥＭ）だけでなく臓器にもコロニーを形成した。ＳＨ１ ｈｌｙ処置マウス４匹（８０％、５匹中４匹）の肝臓（６．０×１０１０±６．０×１０１０ｃｆｕ／ｇ、平均±ＳＥＭ）及び脾臓（１．８５×１０５±９．７４×１０４ｃｆｕ／ｇ、平均±ＳＥＭ）は、８２日目に分析したときにＳＨ１ ｈｌｙに感染していた。
【0100】
図３Ｃに示すように、感染したマウスのうち、１匹のマウスが肝膿瘍を発症した。分析のためにマウスを安楽死させた８２日目に、写真３２０を撮影した。
【0101】
ＪＹＨ１の腫瘍特異性及びグルコース感知、腫瘍標的化核酸システムの要件も、肝臓切片３３０のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって確認され、肝臓切片３３０は、図３Ｄ（スケールバー、２００μｍ）に示すように、ＪＹＨ１処置マウスの肝臓が正常であったが、ＳＨ１ ｈｌｙ処置マウスの肝臓で大量の炎症性浸潤と膿瘍が発生したことを示した。まとめると、これらのデータは、グルコース感知腫瘍標的化核酸システムがヌードマウスにおいてＪＹＨ１の腫瘍特異性を最適化することを実証している。
【実施例5】
【0102】
免疫適格性マウスの腫瘍に特異的にコロニーを形成するＪＹＨ１の能力を試験した。ＣＴ２６腫瘍を保有する免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにＪＹＨ１を静脈内投与した。細菌注射の１４日後に、過剰な腫瘍増殖によりすべてのマウスを安楽死させた。図４は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの正常組織及びＣＴ２６腫瘍１グラム当たりのＣＦＵ４００を示す。均質化組織のプレーティング分析は、静脈内注射されたＪＹＨ１が、１４日齢の免疫適格性マウスの、肝臓、脾臓、心臓、肺、及び腎臓を含む試験された任意の臓器にコロニーを形成しなかったことを示した。対照的に、図４に示すように、腫瘍におけるＪＹＨ１のレベルは１グラム当たり４．６７×１０７ｃｆｕ（±１．６２×１０７ｃｆｕ／ｇ）に達した。これらは、ヌードマウスからのデータと一緒に、ＪＹＨ１が免疫システムの完全性にかかわらず固形腫瘍を特異的に標的とすることを実証している。
【0103】
図５は、グルコース欠乏環境において選択的に増殖することによって固形腫瘍を標的とする遺伝子操作された細菌株を構築する方法５００を示す。
【0104】
ブロック５１０は、核酸システムのランダムライブラリを細菌株に挿入することを示す。
【0105】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤をコードする第２のＤＮＡ断片とを含む。核酸システムはさらに、第２のＤＮＡ断片の転写を制御する第１のプロモーターを含む。核酸システムはさらに、第１のＤＮＡ断片の構成的発現を引き起こす第１の構成的プロモーターを含む。
【0106】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤をコードする第２のＤＮＡ断片とを含む。核酸システムはさらに、第１のＤＮＡ断片の転写を制御する第２のプロモーターを含む。核酸システムはさらに、第２のＤＮＡ断片の構成的発現を引き起こす第２の構成的プロモーターを含む。
【0107】
例示的な実施形態では、毒素－解毒剤対は、ＣｃｄＢ－ＣｃｄＡ対を含むが、これに限定されない。ＡｖｒＲｘｏ１－Ａｒｃ１、Ｈｈａ－ＴｏｍＢ、ＰａａＡ２－ＰａｒＥ２のような他の毒素－解毒剤対を使用して、ＣｃｄＢ－ＣｃｄＡ対を置き換えることができる。例示的な実施形態では、第１のプロモーターは、ｌａｃプロモーターを含むが、これに限定されない。ｌａｃプロモーターは、ｇｌｔＡ、ｓｄｈＡＤＣ、又はｔｎａＢのプロモーターのような他のグルコースに抑制されるプロモーターに置き換えることができる。例示的な実施形態では、第２のプロモーターは、ｐｓｔＧのプロモーター、ｆｒｕＢのプロモーター、及びａｃｋＡのプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【0108】
例示的な実施形態では、５～６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、ｃｃｄＡ遺伝子の開始コドンのすぐ上流かつ第１のプロモーターの下流に位置する天然の５～６個のヌクレオチドを置き換える。
【0109】
例示的な実施形態では、５～６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、ｃｃｄＢ遺伝子の開始コドンのすぐ上流かつ第２のプロモーターの下流に位置する天然の５～６個のヌクレオチドを置き換える。
【0110】
ブロック５１２は、遺伝子操作された細菌株のクローンのランダムライブラリを培養することを示す。
【0111】
例示的な実施形態では、核酸システムは、細菌株の染色体に移植される。例示的な実施形態では、核酸システムはプラスミドに移植され、プラスミドは細菌株に挿入される。例示的な実施形態では、細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５を含むが、これに限定されない。ＤＨ５αやＣＦＴ０７３などの他の大腸菌株、及びサルモネラ菌や赤痢菌などの他のグラム陰性細菌種を使用して、ＭＧ１６５５を置き換えることができる。例示的な実施形態では、核酸システムを含む細菌株のクローンは、グルコースを含むか又は含まないＬＢ寒天上で培養される。
【0112】
ブロック５１４は、グルコースの非存在下で増殖するがグルコースの存在下では増殖しない前記クローンを選択することにより、前記腫瘍を標的とする前記遺伝子操作された細菌株を取得することを示す。
【0113】
例示的な実施形態では、グルコースを含まないＬＢ寒天で増殖するが５ｍＭのグルコースを含むＬＢ寒天では増殖しないクローンは、腫瘍標的化細菌の潜在的候補として選択され特定される。
【0114】
例示的な実施形態では、グルコースを含まないＭ６３寒天で増殖するが１～４ｍＭのグルコース濃度では増殖しないクローンは、腫瘍標的化細菌の潜在的候補として確認される。
【0115】
例示的な実施形態では、この方法は、核酸システムが第１のプロモーターを含む場合、５～６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する天然ヌクレオチドを置き換えることによって、核酸システムのランダムライブラリを生成することをさらに含む。
【0116】
例示的な実施形態では、この方法は、核酸システムが第２のプロモーターを含む場合、５～６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する天然ヌクレオチドを置き換えることによって、核酸システムのランダムライブラリを生成することをさらに含む。
【実施例6】
【0117】
本実施例では、インビボでの腫瘍増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果が評価された。
【0118】
図６Ａは、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果７００を示す。ＪＹＨ１の静脈内注射は、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍の増殖を抑制した。対照的に、ＪＹ１は、ＰＢＳ対照と比較して、腫瘍増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。ＪＹ１処置マウスのＨＣＴ１１６腫瘍はＰＢＳ処置対照の腫瘍と同様に増殖し、一方、ＪＹＨ１処置マウスのＨＣＴ１１６腫瘍は比較的ゆっくりと増殖し、かつそれらの５０％（１０匹中５匹）は細菌の静脈注射（１０７／マウス）の１８－２６日後に退縮し始めた。ＪＹＨ１は、１００％の試験されたマウス（ｎ＝１０）のＨＣＴ１１６腫瘍増殖に阻害効果を示し、ＪＹ１よりも著しく優れた抗腫瘍効果を示した（フィッシャーの正確確率検定、ｐ＜０．０００１）。
【0119】
図６Ｂは、ヌードマウスのＳＷ４８０腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果の分析７０２を示す。図６Ｃは、０～５５日齢のＰＢＳ処置マウスのＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真７０４を示す。図６Ｄは、０～９０日齢のＪＹＨ１処置マウスのＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真７０６を示す。ＳＷ４８０腫瘍の増殖を９０日間にわたって監視した。ＪＹＨ１処置マウス（ｎ＝６）の腫瘍は、ＪＹＨ１の静脈内注射の２６～５２日後に退縮し、有効率は１００％であった。これらのうち、６６．７％のマウス（６匹中４匹）の腫瘍は消失し、実験の終わりまで再発しなかった。残りの２匹のマウスのうち、１匹のマウスの腫瘍は治癒しなかったが、静止状態を維持した。１匹のマウスの腫瘍のみが再発した（１６．６７％、６匹中１匹）。対照的に、ＰＢＳ処置腫瘍はいずれも退縮も消失もしなかった。これらのデータは、ＪＹＨ１がインビボでの腫瘍増殖に著しい抑制効果を有することをさらに示した。
【0120】
したがって、例示的な実施形態では、腫瘍細胞及び正常組織細胞の両方に対して毒性がある細菌は、腫瘍標的化核酸システムを備える場合、腫瘍に特異的になり、正常組織に影響を及ぼすことなく腫瘍増殖を抑制することができる。
【実施例7】
【0121】
この実施例では、細胞毒素コード遺伝子（すなわち、細胞毒素をコードする遺伝子）をｐＢＡＤプラスミドにおいてクローニングする。各細胞毒素をコードする遺伝子を個別にｐＢＡＤプラスミドにクローニングした。緑膿菌のｅｘｌＡ、セレウス菌のｎｈｅ及びコレラ菌のｈｌｙＡ（以下、ＶｈｌｙＡという）の場合、コードされた細胞毒素の排出を可能にするために、ｐｅｌＢリーダー配列を標的遺伝子の上流にインフレームで融合した。構成的プロモーターを使用して、融合ＤＮＡの転写を駆動した。大腸菌α溶血素をコードするｈｌｙＣＡＢＤオペロン（以下、ｈｌｙＣＡＢＤという）の場合、オペロン全体をｐＢＡＤベクターにクローニングした。ｐｅｌＢリーダー配列は、オペロンの産物がｈｌｙＡ溶血素だけでなく、溶血素の分泌に必要な分泌システムも含むという点で、ｈｌｙＣＡＢＤオペロンに用いられなかった。得られた組換えプラスミドの配列決定分析は、４つの遺伝子のすべてが正しくクローニングされたことを確認した。
【0122】
１つの例示的な実施形態では、ｐｅｌＢリーダー配列は、配列番号９に示される。ｐｅｌＢリーダーを有するｅｘｌＡの配列は、配列番号１０に示される。ｐｅｌＢリーダーを有するＮｈｅの配列は、配列番号１１に示される。ｐｅｌＢリーダーを有するコレラ菌のｈｌｙＡの配列は、配列番号１２に示される。大腸菌のｈｌｙＢＡＣＤオペロンの配列は、配列番号１３に示される。
【実施例8】
【0123】
この実施例では、実施例７のクローニングされた遺伝子は、インビトロアッセイにおいて機能的な細胞毒素を産生し、癌細胞を死滅させることが示された。
【0124】
各組換えプラスミドを大腸菌参照株ＴＯＰ１０に導入した。この株自体が細胞溶解を引き起こさないため、任意の殺滅作用は、この株が保有するプラスミドからの毒素産生に起因するものでなければならない。マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０をインビトロ細胞毒性アッセイに使用した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、ｍｏｉ１００（すなわち、細胞当たり１００個の細菌）で４つの組換えプラスミドのそれぞれを保有する大腸菌ＴＯＰ１０と共培養した。対照として、細胞を、空のＰＢＡＤプラスミドを保有するＴＯＰＯ１０又はＰＢＳと共培養した。１２時間の共インキュベーション後、図７に示すように、毒素コード遺伝子を有する組換えプラスミドを保持するＴＯＰ１０は、Ｂ１６Ｆ１０細胞に対して顕著な細胞毒性効果を示したが、空のプラスミドを有するＴＯＰ１０は、細胞生存率にほとんど効果がなかった。
【0125】
これらのインビトロデータは、ｐＢＡＤプラスミドにクローニングされた遺伝子が細胞毒素の産生に成功し、癌細胞を死滅させたことを確認した。４つの細胞毒素のうち、２つの溶血素は溶血性があるが、他の２つの毒素は溶血性がない。これと一致して、ｐＢＡＤ－ｈｌｙＣＡＢＤを有するＴＯＰ１０とｐＢＡＤ－ＶｈｌｙＡを有するＴＯＰ１０は血液寒天上で溶血を引き起こしたが、ｐＢＡＤ－ｅｘｌＡ又はｐＢＡＤ－ｎｈｅを保有するＴＯＰ１０は溶血を引き起こさなかった（図８に示す）。溶血アッセイは、プラスミドにおいてクローニングされた遺伝子の機能性を確認した。
【実施例9】
【0126】
この実施例では、細胞毒素は、インビボでの細菌の抗癌効果を高めることが示されている。
【0127】
上記細胞毒素のそれぞれを過剰発現するために形質転換された細菌の抗癌能力を評価した。ＪＹＨ１は、腫瘍増殖を適度に抑制する固有の能力を有する大腸菌株である。４つの組換えプラスミドのそれぞれをＪＹＨ１に個別に導入して、それらのいずれかがＪＹＨ１の抗癌効果を高めたかどうかを分析した。
【0128】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスにおいて、４つの細胞毒素のいずれかを過剰発現するＪＹＨ１を腫瘍内注射した皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍は、空のプラスミドを保有するＪＹＨ１よりもはるかにゆっくり増殖した（すべてｐ＜０．０５）。細胞毒素で処理された腫瘍は処理後の最初の６日間又は９日間に退縮したが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は空のプラスミドを保有するＪＹＨ１で処理された腫瘍は、退縮することなく容易に増殖した（図９に示す）。
【0129】
４つの細胞毒素のうち、α溶血素は、いくつかの大腸菌株によって自然に産生される。α溶血素をコードする染色体遺伝子の欠失は、腫瘍増殖を抑制する大腸菌の能力を損なわなかった（図１０に示す）。これは、ＪＹＨ１などの溶血性大腸菌株の固有の抗癌作用は、染色体からのα溶血素の自然な産生に依存しないことを示す。しかしながら、α溶血素のプラスミド由来の過剰産生は、これらの細菌の抗癌効果を高める。図９に示すように、染色体中のオペロンの単一コピーから産生されるα溶血素は、腫瘍抑制に不十分であるが、そのマルチコピープラスミドからの過剰産生は、細胞毒素が腫瘍増殖を著しく抑制するのに十分である。
【0130】
緑膿菌エキソリシン、セレウス菌非溶血性エンテロトキシン及びコレラ菌溶血素Ａといった細胞毒素は、大腸菌によって自然に産生されないが、これらの細胞毒素を産生するために大腸菌を操作すると、大腸菌の抗癌効果が高まる。
【0131】
例示的な実施形態では、大腸菌は、細胞毒素をコードする遺伝子を保有するプラスミドを大腸菌に導入することによって、非大腸菌由来の細胞毒素を産生するために作られた。例示的な実施形態では、細胞毒素コード遺伝子は、抗癌効果を高めるために、大腸菌の染色体に挿入される。例示的な実施形態では、細胞毒素は、大腸菌以外の細菌の抗癌効果を改善する。
【0132】
本明細書で使用する場合、「処置」、「処理」又は「治療」という用語は、疾患又は疾病の症状を緩和、軽減又は改善する方法、さらなる症状を予防する方法、症状の原因となる代謝を改善又は予防する方法、疾患又は疾病を阻害する方法、疾患又は疾病の発症を阻止する方法、疾患又は疾病を緩和する方法、疾患又は疾病の退縮を引き起こす方法、疾患又は疾病によって起きる状態を緩和する方法、又は、疾患又は疾病の症状を予防的及び／又は治療的に停止する方法を指す。
【0133】
本明細書で使用する場合、「すぐ」、「すぐ上流」、又は「すぐ下流」は、あるＤＮＡ断片と別のＤＮＡ断片との間に他のヌクレオチドがないことを意味する。
【0134】
本明細書で使用する場合、「システム」は、毒素遺伝子、解毒剤遺伝子、及びそれらのそれぞれのプロモーターを含む組み合わせ又は遺伝子回路を指す。システムの毒素遺伝子及び解毒剤遺伝子は、任意の順序で配置することができる。システムの毒素遺伝子及び解毒剤遺伝子は、同じ分子内に、又は異なる分子内に位置することができる。例示的な実施形態では、毒素遺伝子及び解毒剤遺伝子の一方は細菌の染色体中にあってよく、他方の遺伝子は同じ細菌のプラスミド中にあってよい。
【0135】
本明細書で使用する場合、「腫瘍組織において」は、「腫瘍組織内に」、「腫瘍部位において」、「腫瘍内部において」、「腫瘍組織の領域において」などの用語と交換することができる。これらの用語は、腫瘍細胞が存在し、かつ局所環境内のグルコースが腫瘍細胞の生存をサポートするのに十分に低い領域に位置することを指す。
【符号の説明】
【0136】
１００：核酸システム
１１２：矢印
１２０：薬物送達組成物
１２２：細菌
１２４：抗癌薬
３３０：肝臓切片
１１２：矢印
１２０：薬物送達組成物
１２２：細菌
１２４：抗癌薬
３３０：肝臓切片
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】