(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-12
(45)【発行日】2022-07-21
(54)【発明の名称】食用燕の巣抽出物および抽出方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/57 20150101AFI20220713BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20220713BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20220713BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20220713BHJP
A61K 31/727 20060101ALI20220713BHJP
A61K 31/737 20060101ALI20220713BHJP
A61K 31/718 20060101ALI20220713BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220713BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220713BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220713BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220713BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220713BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220713BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220713BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220713BHJP
A61P 5/00 20060101ALI20220713BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220713BHJP
C07K 14/465 20060101ALI20220713BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20220713BHJP
【ＦＩ】
A61K35/57
C12P21/00 A
C12P19/04 Z
A61K38/02
A61K31/727
A61K31/737
A61K31/718
A61P43/00 121
A61P17/00
A61P43/00 105
A61P29/00
A61P37/04
A61P3/00
A61P9/00
A61P25/28
A61P27/02
A61P5/00
A61P19/02
C07K14/465
C07K1/14
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2018567559
(86)(22)【出願日】2017-03-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-25
(86)【国際出願番号】 SG2017050117
(87)【国際公開番号】W WO2017155471
(87)【国際公開日】2017-09-14
【審査請求日】2020-01-15
(31)【優先権主張番号】10201601905R
(32)【優先日】2016-03-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(73)【特許権者】
【識別番号】518322300
【氏名又は名称】リム，カー メン
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126354
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 尚
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】リム，カー メン
【審査官】大島 彰公
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０４４９８５７２（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２３６２６３７（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２６２１３２９（ＣＮ，Ａ）
【文献】Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2012年，Vol. 2012, Article ID 797520，p. 1-11
【文献】Preliminary study on the enzyme digestion method for edible bird nest for invitro bioassay，Universiti Putra Malaysia，2016年03月03日，p.1-3，http://www.dvs.gov.my/dvs/resources/user_1/DVS%20pdf/Aneka%20Haiwan/poster%20papers/28_Careena_UPM.pdf
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ、Ｃ０７Ｋ、Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
燕の巣抽出物を調製する方法であって、前記抽出物が、食用燕の巣（ＥＢＮ）から得られた少なくとも１つの分子を含み、前記方法が、（ａ）未加工のＥＢＮを洗浄するステップと；
（ｂ）洗浄したＥＢＮをろ過するステップと；
（ｃ）前記ＥＢＮから前記分子を抽出するステップと
（ｄ）前記分子を単離するステップと
を含み、
前記分子を抽出するステップが、前記ろ過したＥＢＮを、
（ｉ）抗Ｎグリカン抗体および抗Ｏグリカン抗体を含む溶液；
（ｉｉ）抗ヘパラン硫酸抗体、抗コンドロイチン抗体、抗ケラタン抗体、および抗デルマタン抗体を含む溶液；ならびに
（ｉｉｉ）抗ロイシンジッパー抗体、抗ヘリックスターンヘリックス抗体、および抗ジンクフィンガー抗体を含む溶液
からなる群から選択される抽出溶液のいずれか１つに曝露することによって行われ、
前記分子を単離するステップが、第２の酵素溶液存在下で行われる、方法。
【請求項2】
洗浄するステップが、前記ＥＢＮを第１の酵素溶液に、室内温度で５分間曝露し、前記ＥＢＮおよび酵素溶液を水にさらに５分間浸漬することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１の酵素溶液が亜硝酸還元酵素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記抽出ステップの前に、前記洗浄したＥＢＮを１２１℃で１０分間滅菌することをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
各溶液中に存在する量が、（ａ）５０％抗Ｎグリカン抗体および５０％抗Ｏグリカン抗体；
（ｂ）２５％抗ヘパラン硫酸抗体、２５％抗コンドロイチン抗体、２５％抗ケラタン抗体、および２５％抗デルマタン抗体；ならびに
（ｃ）３７％抗ロイシンジッパー抗体、３３％抗ヘリックスターンヘリックス抗体、および３０％抗ジンクフィンガー抗体
である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記抽出ステップが酸存在下で行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
抽出が、２５℃から３７℃の間で２０～１２０分間行われる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の酵素溶液が、野菜または果物プロテアーゼを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記第２の酵素溶液の濃度が１０μｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記分子を単離する前記ステップが、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で６０分間行われる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
混合物を７０℃で５分間加熱して、前記第２の酵素溶液中の酵素を不活性化することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ステップ（ｃ）で抽出した生成物を脱水するステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記脱水ステップがフリーズドライである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法から得られた燕の巣抽出物。
【請求項15】
請求項１４に記載の抽出物を含む組成物。
【請求項16】
マルトデキストリンをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記組成物中に存在するマルトデキストリンの量が、３０ｗｔ％から７５ｗｔ％の間である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
医薬品の製造における、請求項１４に記載の抽出物の使用。
【請求項19】
状態および／または疾患を治療および／または予防するための医薬の製造における、請求項１４に記載の抽出物の使用。
【請求項20】
請求項１４に記載の抽出物および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、燕の巣抽出物を調製する方法、および前記方法から得られたさまざまな抽出物に関する。
【背景技術】
【0002】
食用燕の巣（ＥＢＮ）は、東南アジア地域で自然にみられるアナツバメの唾液から作られる巣である。空の巣は、野生またはアナツバメ用の特別な飼育用構築物から採取される。ＥＢＮはさまざまな生物活性および栄養価を示し、有糸分裂反応、表皮成長因子（ＥＧＦ）様活性、抗インフルエンザウィルス、血球凝集阻害活性、レクチン結合活性、骨強度および皮膚の厚さおよびホルモン含量の改善の可能性を含む。ＥＢＮの加工は用途によって異なる場合があることが報告されてきた。現在進行中の研究では、食用燕の巣の生物学的および医学的機能を解明することが行われている。
【0003】
現在のところ、ＥＢＮは、水中でＥＢＮを煮込むことによって、スープまたは他の飲料の形態で使用し、消費される。そのような場合におけるＥＢＮの分子は、巨大な生体高分子であり、それを消化吸収するのは身体にとって困難である。結果的に、そのような方法で調製されたＥＢＮの有益な構成成分のバイオアベイラビリティは低く、かつＥＢＮの有益な効果は最大限には高められない。
【0004】
しかし、未加工のＥＢＮを消費すると、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）介在性アナフィラキシーが生じる場合があり（Goh et al., 2001, J. Allergy Clin. Immun., 107(6), 1082-1088）、ＥＢＮは、子供の生命にかかわり得る食品誘発アナフィラキシーの最も一般的な原因と考えられている。
【0005】
粗製ＥＢＮに伴う他の問題は、自然による原因または加工中の意図的な添加のいずれかに起因する望ましくない化合物の存在である。ＥＢＮには通常、不純物が混和され、ＥＢＮの品質低下が生じる。使用される不純物としては、ブタ皮膚、寒天、紅藻およびカラヤゴムがある。不純物および老廃物をごまかすために、漂白剤が多くの場合添加される。
【0006】
特に懸念されるのは、亜硝酸塩の存在であり、これはアナツバメの排泄物に主に由来する。亜硝酸塩はまた、加工中に白色の燕の巣へ添加され、商業的により高価である赤色の燕の巣へ変えられることがある。過剰な亜硝酸塩の摂取は、癌と関連する（Bryan et al. Food Chem. Toxicol. 2012, 50 (10), 3646-3654）。
【0007】
野生でまたは工場での加工中に、ウィルス、細菌および真菌がＥＢＮを汚染することがある。野生の鳥におけるトリインフルエンザは未加工のＥＢＮ自体の輸入制限につながる場合があることが懸念される。
【0008】
その結果、ＥＢＮの加工を改良し、消費者にとっての品質全般および有益な特性を改善することが必要とされる。ＥＢＮから所望の化合物を抽出し、単離することによって、悪影響は取り除かれるか、最小限となると同時に、ＥＢＮの治療的利点は最大限となる。
【0009】
本明細書における以前に公開されたことが明らかな文献のリストまたは考察は、その文献が最新技術の一部である、または周知の一般的な知識であるという承認としてみなす必要は必ずしもない。
【0010】
本明細書において言及される任意の文献は、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれるものとする。
【発明の概要】
【0011】
本開示は、以下の［１］から［２２］を含む。
［１］燕の巣抽出物を調製する方法であって、上記抽出物が、食用燕の巣（ＥＢＮ）から得られた少なくとも１つの分子を含み、上記方法が、
（ａ）未加工のＥＢＮを洗浄するステップと；
（ｂ）洗浄したＥＢＮをろ過するステップと；
（ｃ）上記ＥＢＮから上記分子を抽出するステップと；
（ｄ）上記分子を単離するステップと
を含む方法。
［２］洗浄するステップが、上記ＥＢＮを第１の酵素溶液に、室内温度で約５分間曝露し、上記ＥＢＮおよび酵素溶液を水にさらに５分間浸漬することを含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記第１の酵素溶液が亜硝酸還元酵素を含む、上記［２］に記載の方法。
［４］上記抽出ステップの前に、上記洗浄したＥＢＮを１２１℃で約１０分間滅菌することをさらに含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］上記分子を抽出するステップが、上記洗浄したＥＢＮを、
（ａ）抗Ｎグリカンおよび抗Ｏグリカンを含む溶液；
（ｂ）抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液；ならびに
（ｃ）抗ロイシンジッパー、抗ヘリックスターンヘリックス、および抗ジンクフィンガーを含む溶液
を含む群から選択される抽出溶液のうちのいずれか１つに曝露することによって行われる、上記［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］各溶液中に存在する量が、
（ａ）５０％抗Ｎグリカンおよび５０％抗Ｏグリカン；
（ｂ）２５％抗ヘパラン硫酸、２５％抗コンドロイチン、２５％抗ケラタン、および２５％抗デルマタン；ならびに
（ｃ）３７％抗ロイシンジッパー、３３％抗ヘリックスターンヘリックス、および３０％抗ジンクフィンガー
である、上記［５］に記載の方法。
［７］上記抽出ステップが酸存在下で行われる、上記［５］に記載の方法。
［８］抽出が、２５℃から３７℃の間で約２０～１２０分間行われる、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］上記分子を単離するステップが、第２の酵素溶液存在下で行われる、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］上記第２の酵素溶液が、野菜または果物プロテアーゼを含む、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記第２の酵素溶液の濃度が１０μｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間である、上記［９］に記載の方法。
［１２］上記分子を単離する上記ステップが、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で６０分間行われる、上記［９］に記載の方法。
［１３］混合物を７０℃で５分間加熱して、上記第２の酵素溶液中の酵素を不活性化することをさらに含む、上記［９］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］抽出混合物を脱水するステップをさらに含む、上記［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］上記脱水ステップがフリーズドライである、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法から得られた燕の巣抽出物。
［１７］上記［１６］に記載の抽出物を含む組成物。
［１８］マルトデキストリンをさらに含む、上記［１７］に記載の組成物。
［１９］上記組成物中に存在するマルトデキストリンの量が、３０ｗｔ％から７５ｗｔ％の間である、上記［１８］に記載の組成物。
［２０］医薬品における、上記［１６］に記載の抽出物の使用。
［２１］状態および／または疾患を治療および／または予防するための医薬の製造における、上記［１６］に記載の抽出物の使用。
［２２］上記［１６］に記載の抽出物および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
本発明の第１の態様において、燕の巣抽出物を調製する方法であって、抽出物が食用燕の巣（ＥＢＮ）から得られた少なくとも１つの分子を含み、方法が、（ａ）未加工のＥＢＮを洗浄するステップと；（ｂ）洗浄したＥＢＮをろ過するステップと；（ｃ）ＥＢＮから分子を抽出するステップと；（ｄ）分子を単離するステップとを含む方法が提供される。
［１］燕の巣抽出物を調製する方法であって、上記抽出物が、食用燕の巣（ＥＢＮ）から得られた少なくとも１つの分子を含み、上記方法が、
（ａ）未加工のＥＢＮを洗浄するステップと；
（ｂ）洗浄したＥＢＮをろ過するステップと；
（ｃ）上記ＥＢＮから上記分子を抽出するステップと；
（ｄ）上記分子を単離するステップと
を含む方法。
［２］洗浄するステップが、上記ＥＢＮを第１の酵素溶液に、室内温度で約５分間曝露し、上記ＥＢＮおよび酵素溶液を水にさらに５分間浸漬することを含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記第１の酵素溶液が亜硝酸還元酵素を含む、上記［２］に記載の方法。
［４］上記抽出ステップの前に、上記洗浄したＥＢＮを１２１℃で約１０分間滅菌することをさらに含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］上記分子を抽出するステップが、上記洗浄したＥＢＮを、
（ａ）抗Ｎグリカンおよび抗Ｏグリカンを含む溶液；
（ｂ）抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液；ならびに
（ｃ）抗ロイシンジッパー、抗ヘリックスターンヘリックス、および抗ジンクフィンガーを含む溶液
を含む群から選択される抽出溶液のうちのいずれか１つに曝露することによって行われる、上記［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］各溶液中に存在する量が、
（ａ）５０％抗Ｎグリカンおよび５０％抗Ｏグリカン；
（ｂ）２５％抗ヘパラン硫酸、２５％抗コンドロイチン、２５％抗ケラタン、および２５％抗デルマタン；ならびに
（ｃ）３７％抗ロイシンジッパー、３３％抗ヘリックスターンヘリックス、および３０％抗ジンクフィンガー
である、上記［５］に記載の方法。
［７］上記抽出ステップが酸存在下で行われる、上記［５］に記載の方法。
［８］抽出が、２５℃から３７℃の間で約２０～１２０分間行われる、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］上記分子を単離するステップが、第２の酵素溶液存在下で行われる、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］上記第２の酵素溶液が、野菜または果物プロテアーゼを含む、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記第２の酵素溶液の濃度が１０μｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間である、上記［９］に記載の方法。
［１２］上記分子を単離する上記ステップが、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で６０分間行われる、上記［９］に記載の方法。
［１３］混合物を７０℃で５分間加熱して、上記第２の酵素溶液中の酵素を不活性化することをさらに含む、上記［９］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］抽出混合物を脱水するステップをさらに含む、上記［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］上記脱水ステップがフリーズドライである、上記［１４］に記載の方法。
［１６］上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法から得られた燕の巣抽出物。
［１７］上記［１６］に記載の抽出物を含む組成物。
［１８］マルトデキストリンをさらに含む、上記［１７］に記載の組成物。
［１９］上記組成物中に存在するマルトデキストリンの量が、３０ｗｔ％から７５ｗｔ％の間である、上記［１８］に記載の組成物。
［２０］医薬品における、上記［１６］に記載の抽出物の使用。
［２１］状態および／または疾患を治療および／または予防するための医薬の製造における、上記［１６］に記載の抽出物の使用。
［２２］上記［１６］に記載の抽出物および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
本発明の第１の態様において、燕の巣抽出物を調製する方法であって、抽出物が食用燕の巣（ＥＢＮ）から得られた少なくとも１つの分子を含み、方法が、（ａ）未加工のＥＢＮを洗浄するステップと；（ｂ）洗浄したＥＢＮをろ過するステップと；（ｃ）ＥＢＮから分子を抽出するステップと；（ｄ）分子を単離するステップとを含む方法が提供される。
【0012】
好ましくは、洗浄ステップは、ＥＢＮを第１の酵素溶液に、室内温度で約５分間曝露し、ＥＢＮおよび酵素溶液を水にさらに５分間浸漬することを含む。さらに好ましくは、第１の酵素溶液は、亜硝酸還元酵素を含む。ある実施形態において、水は逆浸透法から得てもよい。
【0013】
洗浄ステップは、ＥＢＮを過酸化水素水で約１０分間洗浄し、続いて７０℃で約１２時間乾燥することを伴っていてもよい。
【0014】
好ましくは、本方法は、抽出ステップの前に、洗浄したＥＢＮを１２１℃で約１０分間滅菌することをさらに含む。あるいは、抽出プロセスは、約２０分間行ってもよい。
【0015】
抽出溶液は、抗Ｎグリカン、抗Ｏグリカン、抗シアル酸（特にシアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４）、抗ジンクフィンガー、抗パールカン、抗ヘリックスターンヘリックス、抗ヒアルロナン、抗デコリン、抗デルマタン、抗コンドロイチン、抗ルミカン、抗ケラタン、抗シンデカン、抗ロイシンジッパー、抗ヘパラン硫酸、抗ブレビカン、抗ニューロカン、抗バーシカンを含む群から選択されるいずれか１つを含んでいてもよい。
【0016】
「抗」は、目的の標的を選択的に標的化し、そこへ結合する任意の分子を指すことを意味し、すなわち、標的は、グリカン（ＮまたはＯグリカン）、シアル酸（特に抗シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４）、抗ジンクフィンガー、抗パールカン、抗ヘリックスターンヘリックス、抗ヒアルロナン、抗デコリン、抗デルマタン、抗コンドロイチン、抗ルミカン、抗ケラタン、抗シンデカン、抗ロイシンジッパー、抗ヘパラン硫酸、抗ブレビカン、抗ニューロカン、抗バーシカンなどである。
【0017】
したがって、本発明の抽出溶液によって、Ｎグリカン、Ｏグリカン、シアル酸（特にシアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４）、ジンクフィンガー、パールカン、ヘリックスターンヘリックス、ヒアルロナン、デコリン、デルマタン、コンドロイチン、ルミカン、ケラタン、シンデカン、ロイシンジッパー、ヘパラン硫酸、ブレビカン、ニューロカン、バーシカンの群から選択されるいずれか１つを含むＥＢＮ抽出物が得られることになる。これらは、抽出物中に任意の好適な量で存在していてもよい。さまざまな実施形態において、組成物は、以下のうちのいずれか１つを含んでいてもよい。
（ａ）ＥＢＮ抽出物１
２０％Ｎグリカン
３０％Ｏグリカン
５０％シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４
（ｂ）ＥＢＮ抽出物２
７０％ジンクフィンガー
１５％パールカン
１５％Ｎグリカン
（ｃ）ＥＢＮ抽出物３
１５％Ｎグリカン
２５％ヘリックスターンヘリックス
１５％ヒアルロナン
３５％デコリン
１０％デルマタン
（ｄ）ＥＢＮ抽出物４
１０％デルマタン
１５％コンドロイチン
５５％ヒアルロナン
２０％ルミカン
（ｅ）ＥＢＮ抽出物５
１０％ケラタン
２５％シンデカン
３５％コンドロイチン
３０％ヒアルロナン
（ｆ）ＥＢＮ抽出物６
３５％ロイシンジッパー
３０％デコリン
３５％ルミカン
（ｇ）ＥＢＮ抽出物７
２５％ヘパラン硫酸
１５％ブレビカン
２０％ニューロカン
２０％バーシカン
２０％デコリン
（ａ）ＥＢＮ抽出物１
２０％Ｎグリカン
３０％Ｏグリカン
５０％シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４
（ｂ）ＥＢＮ抽出物２
７０％ジンクフィンガー
１５％パールカン
１５％Ｎグリカン
（ｃ）ＥＢＮ抽出物３
１５％Ｎグリカン
２５％ヘリックスターンヘリックス
１５％ヒアルロナン
３５％デコリン
１０％デルマタン
（ｄ）ＥＢＮ抽出物４
１０％デルマタン
１５％コンドロイチン
５５％ヒアルロナン
２０％ルミカン
（ｅ）ＥＢＮ抽出物５
１０％ケラタン
２５％シンデカン
３５％コンドロイチン
３０％ヒアルロナン
（ｆ）ＥＢＮ抽出物６
３５％ロイシンジッパー
３０％デコリン
３５％ルミカン
（ｇ）ＥＢＮ抽出物７
２５％ヘパラン硫酸
１５％ブレビカン
２０％ニューロカン
２０％バーシカン
２０％デコリン
【0018】
これらの量百分率は、組成物全体の重量百分率またはそれ以外のものであってもよい。
【0019】
好ましくは、ある実施形態において、分子を抽出するステップは、洗浄したＥＢＮを、
（ａ）抗Ｎグリカンおよび抗Ｏグリカンを含む溶液；
（ｂ）抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液；ならびに
（ｃ）抗ロイシンジッパー、抗ヘリックスターンヘリックス、および抗ジンクフィンガーを含む溶液
を含む群から選択される抽出溶液のうちのいずれか１つに曝露することによって行われる。
（ａ）抗Ｎグリカンおよび抗Ｏグリカンを含む溶液；
（ｂ）抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液；ならびに
（ｃ）抗ロイシンジッパー、抗ヘリックスターンヘリックス、および抗ジンクフィンガーを含む溶液
を含む群から選択される抽出溶液のうちのいずれか１つに曝露することによって行われる。
【0020】
上記各溶液（ａ）～（ｃ）中に存在する量は、
（ａ）５０％抗Ｎグリカンおよび５０％抗Ｏグリカン；
（ｂ）２５％抗ヘパラン硫酸、２５％抗コンドロイチン、２５％抗ケラタン、および２５％抗デルマタン；ならびに
（ｃ）３７％抗ロイシンジッパー、３３％抗ヘリックスターンヘリックス、および３０％抗ジンクフィンガー
であってもよい。
（ａ）５０％抗Ｎグリカンおよび５０％抗Ｏグリカン；
（ｂ）２５％抗ヘパラン硫酸、２５％抗コンドロイチン、２５％抗ケラタン、および２５％抗デルマタン；ならびに
（ｃ）３７％抗ロイシンジッパー、３３％抗ヘリックスターンヘリックス、および３０％抗ジンクフィンガー
であってもよい。
【0021】
さらに、代替の実施形態において、抽出溶液の組成物は、以下から選択されるいずれか１つであってもよい。
（ａ）組成物１
２０％抗Ｎグリカン（分子量２０ｋＤａから１０００ｋＤａの間）
３０％抗Ｏグリカン（分子量３０ｋＤａから３０００ｋＤａの間）
５０％抗シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４（分子量２０ｋＤａから７００ｋＤａの間）；または
（ｂ）組成物２
７０％抗ジンクフィンガー（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
１５％抗パールカン（分子量５０ｋＤａから１００００ｋＤａの間）
１５％抗Ｎグリカン（分子量２０ｋＤａから７００ｋＤａの間）；または
（ｃ）組成物３
１５％抗Ｎグリカン（分子量２０ｋＤａから７００ｋＤａの間）
２５％抗ヘリックスターンヘリックス（分子量１０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
１５％抗ヒアルロナン（分子量１００ｋＤａから３０００ｋＤａの間）
３５％抗デコリン（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
１０％抗デルマタン（分子量５０ｋＤａから５００ｋＤａの間）；または
（ｄ）組成物４
１０％抗デルマタン（分子量５０ｋＤａから５００ｋＤａの間）
１５％抗コンドロイチン（分子量３０ｋＤａから７００ｋＤａの間）
５５％抗ヒアルロナン（分子量１００ｋＤａから３０００ｋＤａの間）
２０％抗ルミカン（分子量２０ｋＤａから２５０ｋＤａの間）；または
（ｅ）組成物５
１０％抗ケラタン（分子量２５ｋＤａから５００ｋＤａの間）
２５％抗シンデカン（分子量２０ｋＤａから１００ｋＤａの間）
３５％抗コンドロイチン（分子量３０ｋＤａから７００ｋＤａの間）
３０％抗ヒアルロナン（分子量１００ｋＤａから３０００ｋＤａの間）；または
（ｆ）組成物６
３５％抗ロイシンジッパー（分子量１０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
３０％抗デコリン（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
３５％抗ルミカン（分子量２０ｋＤａから２５０ｋＤａの間）；または
（ｇ）組成物７
２５％抗ヘパラン硫酸（分子量３０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
１５％抗ブレビカン（分子量１０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
２０％抗ニューロカン（分子量２０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
２０％抗バーシカン（分子量５０ｋＤａから５００ｋＤａの間）
２０％抗デコリン（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
（ａ）組成物１
２０％抗Ｎグリカン（分子量２０ｋＤａから１０００ｋＤａの間）
３０％抗Ｏグリカン（分子量３０ｋＤａから３０００ｋＤａの間）
５０％抗シアル酸結合Ｉｇ様レクチン１４（分子量２０ｋＤａから７００ｋＤａの間）；または
（ｂ）組成物２
７０％抗ジンクフィンガー（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
１５％抗パールカン（分子量５０ｋＤａから１００００ｋＤａの間）
１５％抗Ｎグリカン（分子量２０ｋＤａから７００ｋＤａの間）；または
（ｃ）組成物３
１５％抗Ｎグリカン（分子量２０ｋＤａから７００ｋＤａの間）
２５％抗ヘリックスターンヘリックス（分子量１０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
１５％抗ヒアルロナン（分子量１００ｋＤａから３０００ｋＤａの間）
３５％抗デコリン（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
１０％抗デルマタン（分子量５０ｋＤａから５００ｋＤａの間）；または
（ｄ）組成物４
１０％抗デルマタン（分子量５０ｋＤａから５００ｋＤａの間）
１５％抗コンドロイチン（分子量３０ｋＤａから７００ｋＤａの間）
５５％抗ヒアルロナン（分子量１００ｋＤａから３０００ｋＤａの間）
２０％抗ルミカン（分子量２０ｋＤａから２５０ｋＤａの間）；または
（ｅ）組成物５
１０％抗ケラタン（分子量２５ｋＤａから５００ｋＤａの間）
２５％抗シンデカン（分子量２０ｋＤａから１００ｋＤａの間）
３５％抗コンドロイチン（分子量３０ｋＤａから７００ｋＤａの間）
３０％抗ヒアルロナン（分子量１００ｋＤａから３０００ｋＤａの間）；または
（ｆ）組成物６
３５％抗ロイシンジッパー（分子量１０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
３０％抗デコリン（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
３５％抗ルミカン（分子量２０ｋＤａから２５０ｋＤａの間）；または
（ｇ）組成物７
２５％抗ヘパラン硫酸（分子量３０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
１５％抗ブレビカン（分子量１０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
２０％抗ニューロカン（分子量２０ｋＤａから３００ｋＤａの間）
２０％抗バーシカン（分子量５０ｋＤａから５００ｋＤａの間）
２０％抗デコリン（分子量１０ｋＤａから２００ｋＤａの間）
【0022】
各組成物は特異性および効果が異なっていてもよく、したがって使用が異なっていてもよい。各組成物の概要は以下のとおりである。
【0023】
組成物１
本特有の組成物は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に関してそれぞれ、最小濃度０．５ｇ／ｌおよび１ｇ／ｌで血球凝集を阻害することができるＥＢＮ抽出物を提供する。シアル酸のみを含む類似した抽出物は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に関して、それぞれ最小濃度５ｇ／ｌ～１６０ｇ／ｌのみで血球凝集を阻害することができた。
本特有の組成物は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に関してそれぞれ、最小濃度０．５ｇ／ｌおよび１ｇ／ｌで血球凝集を阻害することができるＥＢＮ抽出物を提供する。シアル酸のみを含む類似した抽出物は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に関して、それぞれ最小濃度５ｇ／ｌ～１６０ｇ／ｌのみで血球凝集を阻害することができた。
【0024】
第２に、インフルエンザＨ１Ｎ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの感染力に関しては、本組成物を０．０３から２ｇ／ｌの間の濃度で哺乳動物細胞へ添加すると、抽出物組成物が補充されていない培養物と比較して、得られたウィルス力価は少なくとも、１／２に減少したことが示される。シアル酸のみを含む類似した抽出物は、はるかに高濃度である１０～４６４ｇ／ｌの濃度のみで同様に減少させることができた。
【0025】
このことは、本抽出溶液が、インフルエンザウィルスの予防に効力があり、シアル酸または市販の化合物のどちらよりもはるかに強力な組成物（すなわちＥＢＮ抽出物）を抽出できることを示す。
【0026】
それはまた、最小濃度０．３３ｇ／ｌの存在下で、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２インフルエンザウィルスに感染してから１日後の哺乳動物細胞には、細胞変性効果が観察されなかったことを示す。
【0027】
他のコンペティター、すなわち、他の市販のＥＢＮ溶液でもインフルエンザＡを用いた血球凝集阻害アッセイで試験を行った。これらのＥＢＮ溶液には、細胞に対して細胞毒性を有すること、または検出可能な抗インフルエンザウィルス活性をまったく示さないことのいずれかが認められた。結論として、Ｇｅｎｅ Ｏａｓｉｓ専売（proprietary）ＥＢＮ抽出物は、インフルエンザウィルス感染の予防において強力でありかつ優れている。
【0028】
組成物２
本特有の組成物は、腎細胞成長を、本ＧＯ専売ＥＢＮ抽出物組成物を含まない対照と比較すると、濃度依存的様式で促進するＥＢＮ抽出物を提供する。３．３ｇ／ｌの本組成物存在下で、腎細胞は、コンフルエントな細胞密度に３日目で達し（～５×１０５個細胞／ｃｍ２）、対照よりも早い（４日目）。成長促進は、本特有のＥＢＮ抽出物で認められる活性分子の存在と関連し得る。
本特有の組成物は、腎細胞成長を、本ＧＯ専売ＥＢＮ抽出物組成物を含まない対照と比較すると、濃度依存的様式で促進するＥＢＮ抽出物を提供する。３．３ｇ／ｌの本組成物存在下で、腎細胞は、コンフルエントな細胞密度に３日目で達し（～５×１０５個細胞／ｃｍ２）、対照よりも早い（４日目）。成長促進は、本特有のＥＢＮ抽出物で認められる活性分子の存在と関連し得る。
【0029】
組成物３
本抽出物組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞増殖中のヒト幹細胞増殖における増加を誘発することができるＥＢＮ抽出物を提供する。
本抽出物組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞増殖中のヒト幹細胞増殖における増加を誘発することができるＥＢＮ抽出物を提供する。
【0030】
最も重要なことには、本抽出物をコンペティターＡ ＥＢＮとタンパク質量で比較すると、４．３９％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮは、培養の２日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＡ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（すべての日に関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐ値はグラフに示す）。同様に、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ＧＯＡ）をコンペティターＡ ＥＢＮと体積で比較すると、１０％本ＥＢＮ抽出物は、培養の２日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＡ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（ｐ値はグラフに示す）。（ｉ）細胞成長を促進し、かつコンペティターＡのもののような細胞死を引き起こさない点、および（ｉｉ）ＥＧＦに取って代わるその能力の点で、本ＥＢＮ抽出物がコンペティターＡ ＥＢＮよりも強力であることが示されるため、これは重要でありかつ新規である。
【0031】
最も重要なことには、本ＥＢＮ抽出物（ＧＯＢ）をコンペティターＢ ＥＢＮとタンパク質量で比較すると、３．３５％の本ＥＢＮ抽出物は、培養の４日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＢ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（４日目に関しては＊＊ｐ＜０．０１、および５日目に関しては＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐ値はグラフに示す）。同様に、本ＥＢＮ抽出物（ＧＯＢ）をコンペティターＢ ＥＢＮと体積で比較すると、１０％の本ＥＢＮ抽出物は、培養の２日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＡ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（４日目に関しては＊＊ｐ＜０．０１、および２日目および５日目に関しては＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐ値はグラフに示す）。（ｉ）細胞成長を促進する点、および（ｉｉ）特に細胞成長後期（培養４日目および５日目）でのＥＧＦに取って代わるその能力の点で、本ＥＢＮ抽出物がコンペティターＢ ＥＢＮよりも強力であることが示されるため、これは重要でありかつ新規である。
【0032】
組成物４
本組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで軟骨形成性分化の過程中のヒト幹細胞増殖において統計的に有意な増加を誘発することができるＥＢＮ抽出物を提供する。これは、ＤＮＡ（細胞増殖）において、増加だけではなく統計的に有意な増加も示す最初の研究であるため、新規である。
組成物５
本組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで軟骨形成性分化の過程中のヒト幹細胞増殖において統計的に有意な増加を誘発することができるＥＢＮ抽出物を提供する。これは、ＤＮＡ（細胞増殖）において、増加だけではなく統計的に有意な増加も示す最初の研究であるため、新規である。
組成物５
【0033】
本組成物は、ヒト幹細胞の軟骨形成性分化において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプロテオグリカン含量に関して増加を誘発するＥＢＮ抽出物を提供する。
【0034】
本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含量およびＧＡＧ／ＤＮＡ比率が、主に分化の１４日目から２８日目で増加する。１ペレットあたりのＧＡＧ含量における増加は、２．５％～５％を使用した分化の１４日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。ＧＡＧ／ＤＮＡ比率における増加は、５％のＥＢＮを使用した分化の１４日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。ＧＡＧは、軟骨組織で通常認められる主要なタイプのプロテオグリカンである。
【0035】
組成物６
本組成物は、１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量およびコラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率を、主に分化の２１日目から２８日目で増加させるＥＢＮ抽出物を提供する。１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量における増加は、１．２５％ＥＢＮに関しては分化の７日目から１４日目で、ならびに２．５％ＥＢＮに関しては２１日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率における増加は、１．２５％ＥＢＮを使用した分化の７日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンＩＩは、関節軟骨組織で通常認められる主要なタイプのコラーゲン分子または原線維である。１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能（functional output）の指標である。コラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのコラーゲンＩＩ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。点線は、ＥＢＮ抽出物が添加されなかったときの、１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ、およびコラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率を指す。
組成物７
本組成物は、１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量およびコラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率を、主に分化の２１日目から２８日目で増加させるＥＢＮ抽出物を提供する。１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量における増加は、１．２５％ＥＢＮに関しては分化の７日目から１４日目で、ならびに２．５％ＥＢＮに関しては２１日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率における増加は、１．２５％ＥＢＮを使用した分化の７日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンＩＩは、関節軟骨組織で通常認められる主要なタイプのコラーゲン分子または原線維である。１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能（functional output）の指標である。コラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのコラーゲンＩＩ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。点線は、ＥＢＮ抽出物が添加されなかったときの、１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ、およびコラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率を指す。
組成物７
【0036】
本抽出溶液組成物は、ｈＮＰＣの長期培養に有益であり得るＥＧＦ様構成成分を含むＥＢＮ抽出物を提供する。
【0037】
好ましくは、抽出ステップは、酸存在下で行われる。
【0038】
好ましくは、抽出は、２５℃から３７℃の間で約２０～１２０分間行われる。
【0039】
好ましくは、分子を単離するステップは、第２の酵素溶液存在下で行われる。さらに好ましくは、第２の酵素溶液は、野菜または果物プロテアーゼを含む。第２の酵素溶液の濃度は、１０μｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間であってもよい。さらに、分子を単離するステップは、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で６０分間行われる。
【0040】
好ましくは、単離ステップは、混合物を７０℃で５分間加熱して、第２の酵素溶液中の酵素を不活性化することをさらに含む。
【0041】
好ましくは、本方法は、抽出混合物を脱水するステップをさらに含む。さらに好ましくは、脱水ステップはフリーズドライである。
【0042】
本発明の第２の態様において、本発明の第１の態様による方法から得られた燕の巣抽出物が提供される。
【0043】
本発明の第３の態様において、本発明の第２の態様による抽出物を含む組成物が提供される。好ましくは、組成物はマルトデキストリンをさらに含む。ある実施形態において、組成物中に存在するマルトデキストリンの量は、３０ｗｔ％から７５ｗｔ％の間であってもよい。
【0044】
本発明のある実施形態において、抽出物は医薬品において使用してもよい。より具体的には、抽出物は、状態および／または疾患を治療および／または予防するための医薬の製造において使用してもよい。
【0045】
さらにより具体的には、抽出物は、皮膚の改善ならびにさまざまな皮膚病、脱水および炎症性皮膚の治療、免疫系の強化、老化の遅延、代謝の促進、ヒト視力の保護、血液循環の改善、血中コレステロールレベルの制御、心血管の健康状態の保護、細胞の賦活および再生、関節炎による不快感の緩和、ホルモンレベルの調整、炎症発生の低下、糖尿病の管理、変形性関節、皮膚退化（degenerative skin）、変性性神経系および変性性脳の治療、ならびに腎不全の保護のために使用してもよい。
【0046】
本発明の第４の態様において、本発明の第２の態様による抽出物、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。
【0047】
好ましくは、組成物または配合剤は、活性成分の１日用量もしくは単位、１日分割用量またはこれらの適切な一部を含む単位用量である。本発明の組成物は、経口でまたは任意の非経口経路によって、燕の巣抽出物を任意選択で非毒性の有機、または無機、酸、または塩基、付加塩の形態で含む医薬組成物の形態で、薬学的に許容される剤型で通常投与してもよい。治療する状態、障害および患者、ならびに投与経路によって、組成物はさまざまな用量で投与してもよい。
【0048】
ヒト治療法において、本発明の燕の巣抽出物または組成物は、単独で投与することができるが、一般的には、意図する投与経路および標準的な医薬使用の実施に関して選択された好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体との添加混合物として投与されることになる。これらは経口で（錠剤およびカプセル剤によって）または非経口で、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、胸骨内（intrastemally）、頭蓋内、筋肉内または皮下で投与してもよいか、注入技術によって投与してもよい。これらは、他の物質、例えば、血液と等張な溶液を作製するのに十分な塩またはグルコースを含み得る滅菌水性溶液の形態で最もよく使用される。水性溶液は、必要に応じて、好適に（好ましくはｐＨ３～９に）緩衝しなければならない。滅菌条件下での好適な非経口配合剤の調製は、当業者に周知の標準的な医薬技術によって容易に行われる。
【0049】
非経口投与に好適な組成物または配合剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および配合剤を対象とする受容者の血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液がある。配合剤は、単位用量用または分割用量用容器、例えば、密閉されたアンプルおよびバイアルに存在していてもよく、かつ使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管されていてもよい。用時調製（extemporaneous）注射液および懸濁液は前述の種類の滅菌粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製されてもよい。
【0050】
ヒト患者への経口および非経口投与に関しては、本発明の化合物の１日用量レベルは、通常１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇとなるはずである。したがって、例えば、本発明の化合物の錠剤またはカプセル剤は、単独でまたは２つ以上を同時に投与するための用量の活性化合物を必要に応じて含んでいてもよい。いずれにしても医師が、任意の個々の患者に関して最も好適であろう実用量を決定することになり、かつそれは年齢、体重および特定の患者の応答に伴って変化することになる。上記用量は平均的な場合の例示である。当然、高用量または低用量範囲で利点がある個々の場合が存在することがあり、それは本発明の範囲内である。
【0051】
あるいは、本発明の組成物は、坐剤またはペッサリーの形態で投与することができるか、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤または粉剤（dusting powder）の形態で局所的に適用することができる。本発明の組成物、特に燕の巣抽出物はまた、例えば、皮膚パッチの使用によって経皮投与されてもよい。これらはまた、特に眼疾患を治療するための眼球経路によって投与されてもよい。皮膚への局所適用に関して、本発明の化合物は、例えば、次のもの：鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水のうちの１つまたは複数との混合物に懸濁したまたは溶解した活性化合物を含む好適な軟膏剤として配合することができる。あるいはこれらは、例えば、次のもの：鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水のうちの１つまたは複数の混合物に懸濁したまたは溶解した好適なローション剤またはクリーム剤として配合することができる。
【0052】
一般的に、ヒトにおいて、本発明の組成物の経口または局所投与は、好ましい経路であり、最も簡便である。受容者が嚥下障害または経口投与後の薬物吸収不全に罹患している状況において、薬物は、非経口、例えば舌下、頬側、経粘膜または経皮的な手段で投与してもよい。
【0053】
現在のところ、関節軟骨の健康補助に広く使用される生物活性分子様コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）は、動物の一部または生物反応器中でクローン化された遺伝子操作微生物から主に抽出される。抽出物製品の純度および収率および安全面における整合性に関する基準は存在しない。
【0054】
これらの化合物を食用燕の巣（ＥＢＮ）の天然原料から抽出すると、ＥＢＮはこうした生物活性因子の非常に豊富なかつ十分な原料であるため、安全性および持続性の問題が解決される。
【0055】
コンドロイチン硫酸は、クリーム剤、カプセル剤および健康補助医薬品の形態で関節炎治療に使用される。ヒアルロン酸は、化粧品および医薬品業界で世界的に広く使用される。
【0056】
皮膚および関節包を介したまたは経口投与経路を介した、そのような水溶性因子（ＣＳ）、（ＫＳ）および（ＨＡ）に関する吸収は、皮膚または腸における疎水性膜または構造を介した透過性が低いために問題とされてきた。したがって、これらの化合物の最大限のかつ即時的な効果を、世界中の何百万もの関節炎および関節痛患者の身体の必要な部位へ送達するのは困難である。これは、持続可能なおよび長期の問題解決に対する大きな課題である。
【0057】
化合物ならびにコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、およびケラタン硫酸などのその加水分解製品を分離する方法を通して、高純度でかつ目的に適したさまざまな用量の化合物を供給するための経済的な方法が提供される。本方法で単離された製品は、使用者へさまざまな手段および方法で送達可能であり、化合物の作用部位への効果的なかつ迅速な送達を可能にする。特に、好適な配合剤を用いて、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、およびケラタン硫酸を、効果的なかつ有用な用量で疼痛および炎症の部位へ送達することができる。
【0058】
脂質形態で配合された本抽出物を使用し、経皮的であり、かつ安全なかつ持続可能な生物活性分子からなり、天然であるが十分な供給量のＥＢＮ再利用片から抽出された、初の経済的な市販製品を生成してもよい。
【0059】
本発明を十分に理解しかつ容易に実行に移す目的で、非限定的な例を用いて本発明の好ましい実施形態のみをここに記述し、添付の例示の図を参照しながら説明するものとする。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】本発明の実施形態による燕の巣抽出物を調製する方法を示すフローチャートである。
【図2】ＳＦ－ＥＢＮの、ベロ細胞成長に対する効果を示すグラフである。培養培地中にＳＦ－ＥＢＮが存在すると、細胞成長に有意な改善が示される（３日目に測定した）。
【図3】ＧｅｎｅＯａｓｉｓ製ＳＦ－ＥＢＮは、インフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１）介在性血球凝集を予防できることを示す写真である。ＷＨＯが推奨するウィルス濃度８ＨＡＵ／５０μｌに対して、血球凝集の予防は、０．５ｇ／ｌ（２６）のＳＦ－ＥＢＮで得られた。
【図4】ＧｅｎｅＯａｓｉｓ製ＳＦ－ＥＢＮの、インフルエンザウィルス（Ｈ３Ｎ２）介在性血球凝集の阻害効果に対する効果を示す写真である。ＷＨＯが推奨するウィルス濃度８ＨＡＵ／５０μｌに対して、血球凝集の予防は、１．０ｇ／ｌ（２５）のＳＦ－ＥＢＮ濃度で得られた。
【図5】ベロ細胞をＳＦ－ＥＢＮの存在下で感染させた後の、培養上澄みにおけるインフルエンザウィルス力価を測定するための血球凝集アッセイを示す写真である。アッセイは、０．００１のＭＯＩでＨ１Ｎ１に感染させてから２４時間後に行った。点線は、血球凝集を観察できる行中のウェルを分割する。
【図6】コンペティターＢ製ＳＦ－ＥＢＮの、インフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１）介在性血球凝集における評価を示す写真である。１６ＨＡＵ／５０μｌのＨ１Ｎ１ウィルス濃度を使用した。本発明のＳＦ－ＥＢＮを希釈し、コンペティターＢ製ＳＦ－ＥＢＮの可溶性タンパク質濃度と一致させた。
【図7】抗Ｎ－グリカンおよび／または抗ヘリックスターンヘリックスを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、細胞増殖中のヒト幹細胞増殖に対する効果を示すグラフである。図７のデータは、１０％ＥＢＮ抽出物および３成長因子の組合せが、４成長因子を使用した場合と同様のプラスの効果をヒト幹細胞増殖に対して有することを示す。１０％ＥＢＭのみが表皮成長因子（ＥＧＦ）と代わって、ＥＧＦの代替物として作用することができる。ＥＧＦは栄養補助食品として利用できず、かつＰａｎら（Environ. Health Perspect., DOI: 10.1289/ehpl409200）は、ヒトＥＧＦおよびパラベンは、乳がん細胞株の増殖を増加させる場合があることを示している。その結果、ＥＢＮ抽出物は、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）活性化および軟骨細胞への分化に必要とされる内因性ＥＧＦを生成しない個体のための実行可能な代替物となるはずである。
【図8】コンペティターＡおよびＢ製ＥＢＮ抽出物と比較した、抗Ｎ－グリカンおよび／または抗ヘリックスターンヘリックスを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、ヒト幹細胞増殖に対する効果を示すグラフである。ＥＧＦに代わるＥＢＮ抽出物の効果は、コンペティターＡおよびＢ製品の両方と比較したＥＢＮ抽出物に関して、よりいっそう有意である。
【図9】コンペティターＡおよびＢ製ＥＢＮ抽出物と比較した、抗Ｎ－グリカンおよび／または抗ヘリックスターンヘリックスを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、ヒト幹細胞増殖に対する効果を示すグラフである。ＥＧＦに代わるＥＢＮ抽出物の効果は、コンペティターＡおよびＢ製品の両方と比較したＥＢＮ抽出物に関して、よりいっそう有意である。
【図10A-B】ＥＢＮ抽出物の、ｈＮＰＣの増殖および分化に対する効果を示すグラフである。細胞成長（Ａ）、増殖に関する細胞マーカー（ｋｉ６７）および神経分化に関する細胞マーカー（ベータ－チューブリン）（Ｂ）を１週間培養した後に測定した。
【図11A-B】ＥＢＮ抽出物の、ｈＮＰＣの増殖および分化に対する長期効果を示すグラフである。ｈＮＰＣを、成長因子およびＥＢＮ抽出物の両方の存在下で、３週間連続的に培養した。その後、ｈＮＰＣを採取し、細胞成長研究用の新しいプレートに２０，０００個細胞／ウェルで播種した。細胞成長（Ａ）、増殖に関する細胞マーカー（ｋｉ６７）および神経分化に関する細胞マーカー（ベータ－チューブリン）（Ｂ）を１週間培養した後に測定した。
【図12】ＥＢＮ抽出物の、ＮＰＣ培養物の形態に対する効果を示す写真である。
【図13】１０％の本ＥＢＮ抽出物をＥＧＦに置き換え、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＭＳＣ増殖の同様の成長曲線を得られることを示すグラフである。二元配置ＡＮＯＶＡを用いた統計的分析により、３成長因子＋１０％ＥＢＮの細胞成長は３成長因子のみのものとは有意差があり、１０％ＥＢＮは、細胞培養の２日目から４日目の細胞成長が増加することによるプラスの効果を誘発することを示すことが明らかにされた。対照的に、二元配置ＡＮＯＶＡを用いた統計的分析により、３成長因子＋１０％ＥＢＮの細胞成長は４成長因子のものとは有意差がなく、１０％ＥＢＮをＥＧＦに置き換え、０日目から４日目までの細胞培養物と同様のｈＭＳＣ成長を得られることが明らかにされた。ｐ値、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図14】本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのＤＮＡ含量において、主に分化の７日目から１４日目で増加が生じ、７日目の２．５％～５％ＥＢＮが最も有意なかつ一貫した結果であることを示すグラフである。ＤＮＡ含量における増加は、細胞増殖の尺度として通常使用される。点線は、ＥＢＮ抽出物が添加されなかったときの１ペレットあたりのＤＮＡ含量を指す。数値は、０％のＥＢＮに対して誘発された倍率変化を指す。四角の囲みは１．０を超える倍率増加を有するものを強調する。
【図15】合計でｎ＝ペレット３個の第１の独立した実験に関して、本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのＤＮＡ含量において、分化の７日目から２８日目で統計的に有意な増加は生じないことを示すグラフである。これは、表示された各時点における同一条件のペレット間で観察されたＤＮＡ含量のばらつきにおそらく起因する。ＤＮＡ含量の増加は、細胞増殖の尺度として通常使用される。統計的分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて行った。青色の四角の囲みは、分析をより多数の試料で行うことができる場合、潜在的に有意であり得るものを強調する。赤色の四角の囲みは統計的に有意であるものを強調する。
【図16】合計でｎ＝ペレット４個の第２の独立した実験に関して、２．５％および１０％の本ＥＢＮ抽出物は、１ペレットあたりのＤＮＡ含量において、ＥＢＮ抽出物をまったく含まない（０％）対照条件と比較すると分化の７日目で統計的に有意な増加が生じたことを示すグラフである。これは、本ＥＢＮ抽出物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで軟骨形成性分化の過程中のヒト幹細胞増殖において統計的に有意な増加を誘発できることを示す。これは、ＤＮＡ（細胞増殖）において増加だけではなく統計的に有意な増加も示す最初の研究であるため、新規である。ＤＮＡ含量の増加は、細胞増殖の尺度として通常使用される。統計的分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて行った。青色の四角の囲みは、分析をより多数の試料で行うことができる場合、潜在的に有意であり得るものを強調する。赤色の四角の囲みは統計的に有意であるものを強調する。ｐ値、＊ｐ＜０．０５。
【図17】合計でｎ＝ペレット７個に組み合わせた結果に関して、２．５％の本ＥＢＮ抽出物は、１ペレットあたりのＤＮＡ含量において、ＥＢＮ抽出物をまったく含まない（０％）対照条件と比較すると分化の７日目で統計的に有意な増加が生じたことを示すグラフである。これは、本ＥＢＮ抽出物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで軟骨形成性分化の過程中のヒト幹細胞増殖において統計的に有意な増加を誘発できることを示す。これはＤＮＡ（細胞増殖）において増加だけではなく統計的に有意な増加も示す最初の研究であるため、新規である。ＤＮＡ含量の増加は、細胞増殖の尺度として通常使用される。統計的分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて行った。青色の四角の囲みは、分析をより多数の試料で行うことができる場合、潜在的に有意であり得るものを強調する。赤色の四角の囲みは統計的に有意であるものを強調する。ｐ値、＊ｐ＜０．０５。
【図18】本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含量およびＧＡＧ／ＤＮＡ比率が、主に分化の１４日目から２８日目で増加することを示すグラフである。１ペレットあたりのＧＡＧ含量における増加は、２．５％～５％を使用した分化の１４日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。ＧＡＧ／ＤＮＡ比率における増加は、５％のＥＢＮを使用した分化の１４日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。ＧＡＧは、軟骨組織で通常認められる主要なタイプのプロテオグリカンである。１ペレットあたりのＧＡＧ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能の指標である。ＧＡＧ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのＧＡＧ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。点線は、ＥＢＮ抽出物が添加されなかったときの１ペレットあたりのＧＡＧおよびＧＡＧ／ＤＮＡ比率を指す。数値は、０％のＥＢＮに対して誘発された倍率変化を指す。四角の囲みは、１．０を超える倍率増加を有するものを強調する。
【図19】合計でｎ＝ペレット３個の第１の独立した実験に関して、本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのＧＡＧ含量およびＧＡＧ／ＤＮＡ比率において、分化の７日目から２８日目で統計的に有意な増加は生じなかったことを示すグラフである。これは、表示された各時点における同一条件のペレット間で観察されたＧＡＧおよびＤＮＡ含量のばらつき（図１５を参照のこと）におそらく起因する。ＧＡＧは軟骨組織で通常認められる主要なタイプのプロテオグリカンである。１ペレットあたりのＧＡＧ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能の指標である。ＧＡＧ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのＧＡＧ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。統計的分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて行った。青色の四角の囲みは、分析をより多数の試料で行うことができる場合、潜在的に有意であり得るものを強調する。赤色の四角の囲みは統計的に有意であるものを強調する。
【図20】合計でｎ＝ペレット４個の第２の独立した実験に関して、本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのＧＡＧ含量およびＧＡＧ／ＤＮＡ比率において、分化の７日目から２８日目で統計的に有意な増加は生じなかったことを示すグラフである。これは、表示された各時点における同一条件のペレット間で観察されたＧＡＧおよびＤＮＡ含量のばらつき（図１５を参照のこと）におそらく起因する。しかし、２．５％および１０％の本ＥＢＮ抽出物は、１ペレットあたりのＧＡＧ含量において、ＥＢＮ抽出物をまったく含まない（０％）対照条件と比較すると、分化の７日目で統計的に有意な増加が潜在的に生じ得る。これは、ＧＡＧ／ＤＮＡ含量が未変化のままで、１ペレットあたりのＤＮＡ含量が統計的に有意に増加すること（図１６を参照のこと）に起因し得る。ＧＡＧは軟骨組織で通常認められる主要なタイプのプロテオグリカンである。１ペレットあたりのＧＡＧ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能の指標である。ＧＡＧ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのＧＡＧ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。統計的分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて行った。青色の四角の囲みは、分析をより多数の試料で行うことができる場合、潜在的に有意であり得るものを強調する。赤色の四角の囲みは統計的に有意であるものを強調する。
【図21】合計でｎ＝ペレット７個に組み合わせた結果に関して、本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのＧＡＧ含量およびＧＡＧ／ＤＮＡ比率において、分化の７日目から２８日目で統計的に有意な増加は生じないことを示すグラフである。これは、表示された各時点における同一条件のペレット間で観察されたＧＡＧおよびＤＮＡ含量のばらつき（図２．２．２を参照のこと）におそらく起因する。ＧＡＧは軟骨組織で通常認められる主要なタイプのプロテオグリカンである。１ペレットあたりのＧＡＧ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能の指標である。ＧＡＧ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのＧＡＧ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているたかの機能的指標として使用される。統計的分析を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定を用いて行った。青色の四角の囲みは、分析をより多数の試料で行うことができる場合、潜在的に有意であり得るものを強調する。赤色の四角の囲みは統計的に有意であるものを強調する。
【図22】本ＥＢＮ抽出物を添加すると、１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量およびコラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率が、主に分化の２１日目から２８日目で増加することを示すグラフである。１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量における増加は、１．２５％ＥＢＮに関しては分化の７日目から１４日目で、ならびに２．５％ＥＢＮに関しては２１日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率における増加は、１．２５％ＥＢＮを使用した分化の７日目から２８日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンＩＩは、関節軟骨組織で通常認められる主要なタイプのコラーゲン分子または原線維である。１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ含量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能の指標である。コラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率は、細胞１個あたりのコラーゲンＩＩ産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。点線は、ＥＢＮ抽出物が添加されなかったときの、１ペレットあたりのコラーゲンＩＩ、およびコラーゲンＩＩ／ＤＮＡ比率を指す。数値は、０％のＥＢＮに対して誘発された倍率変化を指す。四角の囲みは１．０を超える倍率増加を有するものを強調する。
【図23】４．３９％と１０％の両方の本ＥＢＮ抽出物は、１０％コンペティターＡ ＥＢＮよりも、培養２日目から５日目のｈＭＳ細胞成長の誘発において有意に優れていることを示すグラフである。驚くべきことに、３成長因子＋１０％コンペティターＡは、（ｉ）３成長因子のみのものとは有意差があり（２日目に関してはｐ＜０．０５、他のすべての日に関してはｐ＜０．００１）、（ｉｉ）４成長因子のものとは有意差があり（すべての日に関してｐ＜０．００１）、かつ（ｉｉｉ）成長因子なしでのものとは有意差がない（すべての日に関してｐ＞０．０５）細胞成長曲線を有する。これは、コンペティターＡ ＥＢＮが（ｉ）他の３成長因子の効果を無効にする阻害効果を有し、（ｉｉ）ＥＧＦに代わって、４成長因子と同様の成長曲線に達することができず、かつ（ｉｉｉ）細胞成長を誘発しないことを示し、このことはコンペティターＡ ＥＢＮがむしろ細胞死を起こしている場合があることも示唆する。この一連の結果に関する統計的分析は、グラフには示さず、個別に行う。最も重要なことには、本ＥＢＮ抽出物（ＧＯＡ）をコンペティターＡ ＥＢＮとタンパク質量で比較すると、４．３９％の本ＥＢＮ抽出物は、培養の２日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＡ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（すべての日に関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐ値はグラフに示す）。同様に、本ＥＢＮ抽出物（ＧＯＡ）をコンペティターＡ ＥＢＮと体積で比較すると、１０％本ＥＢＮ抽出物は、培養の２日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＡ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（ｐ値はグラフに示す）。（ｉ）細胞成長を促進しかつコンペティターＡのもののような細胞死を引き起こさない点、および（ｉｉ）ＥＧＦに取って代わるその能力の点で、本ＥＢＮ抽出物がコンペティターＡ ＥＢＮよりも強力であることが示されるため、これは重要でありかつ新規である。
【図24】３．３５％と１０％の両方の本ＥＢＮ抽出物は、１０％コンペティターＢ ＥＢＮよりも培養４日目から５日目および２日目から５日目のｈＭＳＣ細胞成長の誘発においてそれぞれ有意に優れていることを示すグラフである。驚くべきことに、３成長因子＋１０％コンペティターＢは（ｉ）３成長因子のみのものとは２日目から４日目まで有意差があり（２日目に関してはｐ＜０．０１、３日目に関してはｐ＜０．０５、４日目に関してはｐ＜０．００１）、（ｉｉ）４成長因子のものとは有意差があり（３日目に関してはｐ＜０．０１、４および５日目に関してはｐ＜０．００１）、かつ（ｉｉｉ）成長因子なしでのものと有意差がある（すべての日に関してｐ＜０．００１）細胞成長曲線を有する。これはコンペティターＢ ＥＢＮが（ｉ）３成長因子のみのものと比較すると、２日目から４日目でのみ有意なプラスの効果を細胞成長に対して有し、（ｉｉ）培養３日目から５日目まで、ＥＧＦに代わって４成長因子と同様の成長曲線に達することができず、かつ（ｉｉｉ）成長因子不含のものと比較して細胞死を誘発しないことを示す。この一連の結果に関する統計的分析はグラフには示さず、個別に行う。最も重要なことには、本ＥＢＮ抽出物（ＧＯＢ）をコンペティターＢ ＥＢＮとタンパク質量で比較すると、３．３５％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮは、培養の４日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＢ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（４日目に関しては＊＊ｐ＜０．０１および５日目に関しては＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐ値はグラフに示す）。同様に、本ＥＢＮ抽出物（ＧＯＢ）をコンペティターＢ ＥＢＮと体積で比較すると、１０％の本ＥＢＮ抽出物は、培養の２日目から始まり５日目までに１０％コンペティターＡ ＥＢＮとは統計的に有意差がある細胞成長曲線を導けることが示された（４日目に関しては＊＊ｐ＜０．０１ならびに２日目および５日目に関しては＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐ値はグラフに示す）。（ｉ）細胞成長を促進する点、および（ｉｉ）特に細胞成長の後期（培養の４日目および５日目）でのＥＧＦに取って代わるその能力の点で、本ＥＢＮ抽出物がコンペティターＢ ＥＢＮよりも強力であることが示されるため、これは重要でありかつ新規である。
【発明を実施するための形態】
【0061】
本発明において、活性栄養補助成分（ＡＮＩ）の低価格な原料としての、さらに活性医薬成分（ＡＰＩ）のような高い有効性を有するＥＢＮを利用する方法が提示される。
【0062】
室内温度または室温とは、２０～３０℃の範囲の温度を指す。
【0063】
Ｎ連結グリカンとは、配列Ａｓｎ－Ｘ－ＳｅｒまたはＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒにおけるアスパラギンの側鎖の窒素が、Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である場合、グリカンとグリコシド結合を形成する構造を指し、グリカンはＮ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖から構成されていてもよい（Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors, Essentials of Glycobiology, 2nd edition, Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009）。
【0064】
Ｏ連結グリカンとは、セリンまたはトレオニンの側鎖の酸素が、Ｎ－アセチルガラクトサミンとグリコシド結合を形成し、そのＮ－アセチルガラクトサミンがさらなる糖単糖と結合している構造を指す。
【0065】
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、二糖単位（ＧｌｃＮＡｃα１－４ＧｌｃＡβ１－４／ｌｄｏＡα１－４）ｎによって定義されるグリコサミノグリカンであり、Ｎ－およびＯ－スルフェートエステルをさまざまな位置に含み、典型的には、プロテオグリカンコアタンパク質へ共有結合していることが認められる。ヘパラン硫酸に存在する主要二糖単位の構造を以下に示す。
【0066】
【化1】
ＧｌｃＡ＝β－Ｄ－グルクロン酸
ＩｄｏＡ＝α－Ｌ－イズロン酸
ｌｄｏＡ（２Ｓ）＝２－Ｏ－スルホ－α－Ｌ－イズロン酸
ＧｌｃＮＡｃ＝２－デオキシ－２－アセトアミド－α－Ｄ－グルコピラノシル
ＧｌｃＮＳ＝２－デオキシ－２－スルファミド－α－Ｄ－グルコピラノシル
ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）＝２－デオキシ－２－スルファミド－α－Ｄ－グルコピラノシル－６－Ｏ－スルフェート
【0067】
ヘパラン硫酸内の最も一般的な二糖単位は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へ連結したＤ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）からなり、典型的には、全二糖単位の約５０％を占める。３－Ｏ－硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ（３Ｓ，６Ｓ）または遊離アミン基（ＧｌｃＮＨ３
＋）を含むまれな二糖は示していない。
【0068】
コンドロイチン硫酸は、一般構造式Ｉを有する二糖単位（ＧａｌＮＡｃβ１－４ＧｌｃＡβ１－３）ｎによって定義される硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、特定の位置においてエステル連結スルフェートで修飾されており、典型的には、プロテオグリカンコアタンパク質へ共有結合していることが認められる。コンドロイチン鎖は１００個を超える個々の糖を有することができ、これはそれぞれさまざまな位置および量で硫酸化され得る。
【0069】
【化2】
【0070】
デルマタンスルフェートは、硫酸化グリコサミノグリカン様コンドロイチン硫酸であり、ここでＤ－グルクロン酸はＬ－イズロン酸と置き換えられ、かつ二糖モノマーは一般構造式ＩＩに示される。
【0071】
【化3】
【0072】
ケラタン硫酸（ＫＳ）は、繰り返し二糖単位からなる直鎖状ポリサッカライドである。ケラタン硫酸はプロテオグリカン（ＰＧ）として存在し、その中でＫＳ鎖は細胞表面または細胞外マトリックスタンパク質へ結合している。ケラタン硫酸内の繰り返し二糖基本単位は（－３ガラクトースβ１－４－Ｎ－アセチルグルコサミンβ１－）である。これは、ＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃ単糖のいずれかまたは両方の６位の炭素位置（Ｃ６）で硫酸化することができる。しかし、特定のタイプのＫＳの詳述な主要構造は、３つの領域：その一端でＫＳ鎖がタンパク質へ連結している連結領域、－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－繰り返し二糖単位から構成される繰り返し領域、およびタンパク質連結領域に対してＫＳ鎖の反対端に存在する鎖キャッピング領域から構成されると考えるのが最善である。
【0073】
ヒアルロン酸は、結合組織、上皮組織、および神経組織にわたって広く分布しているアニオン性、非硫酸化グリコサミノグリカンである。それは、硫酸化されていないという点においてグリコサミノグリカンの中では特有であり、その分子量は非常に大きいことがあり、多くの場合、ｉｎ ｖｉｖｏで５～２０ｋＤａのサイズ範囲である。ヒアルロン酸は二糖のポリマーであり、Ｄ－グルクロン酸およびＤ－Ｎ－アセチルグルコサミンから構成され、β－１，４およびβ－１，３グリコシド結合によって交互に連結している。
【0074】
ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸は、糖部分がタンパク質にＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒの位置で接合しているので、ＮまたはＯグリカンのタイプである。
【0075】
ロイシンジッパーは、真核生物転写因子のｂＺＩＰ（基本領域ロイシンジッパー）クラスの二量化ドメインである。ｂＺＩＰドメインは６０～８０個の長さのアミノ酸であり、高度に保存されたＤＮＡ結合基本領域およびより多様なロイシンジッパー二量化領域を伴う。ロイシンジッパーは、タンパク質における一般的な３次元構造モチーフであり、二量化ドメインにおいて７つごとにアミノ酸がロイシンであるためにその名前を有する。
【0076】
タンパク質において、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）は、ＤＮＡに結合することができる主要な構造モチーフである。それは、アミノ酸短鎖によって接合された２つのαヘリックスからなり、かつ遺伝子発現を制御する多くのタンパク質で認められる。
【0077】
ジンクフィンガーは、小タンパク質構造モチーフであり、折り畳み構造を安定化するために１つまたは複数の亜鉛イオンに配位することによって特徴付けられる。一般的に、ジンクフィンガーは、システインおよびヒスチジン残基の組合せによって亜鉛イオンに配位している。本来は、これらの残基の番号および順序は、異なる種類のジンクフィンガー（例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｃｙｓ４、およびＣｙｓ６）を分類するのに使用された。最近になって、ジンクフィンガータンパク質を分類するために、より系統的な方法が代わりに使用されている。この方法はジンクフィンガータンパク質を、折り畳まれたドメイン中のタンパク質骨格の全体的な形状に基づいて「折り畳み構造グループ」に分類する。最も一般的なジンクフィンガーの「折り畳み構造グループ」は、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２様（「古典的なジンクフィンガー」）、ト音記号、および亜鉛リボンである（Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV, 2003, Nucleic Acids Research 31 (2), 532-50）。
【0078】
グリカン特異的抗体を除く天然に存在するグリカン結合タンパク質（ＧＢＰ）に関しては、ＧＢＰを２つの主要なグループであるレクチンおよびグリコサミノグリカン結合タンパク質に広く分類することが可能である。大部分のレクチンは、多くの場合、主要アミノ酸配列または３次元構造の特異的な特徴を保持する共通の祖先遺伝子から明らかに進化した、定義済みの「糖認識ドメイン」（ＣＲＤ）を有するファミリーのメンバーである。したがって、新規のファミリーメンバーは、タンパク質配列または構造データベースを検索することによって識別することができる。新規のＧＢＰを予測するこの能力にもかかわらず、単一のレクチンファミリーメンバーによって認識されたグリカン構造は非常に多様であり得る。多くのレクチンにおいて、単一部位結合親和性は低い（マイクロモル範囲のΚｄ値を有する）ようであるが、いくつかのレクチンはグリカンを極めて高い親和性（ナノモル範囲のΚｄ値を有する）で認識する。低親和性を有するそれらのレクチンに関しては、複数のＣＲＤと複数のグリカンとの間の多価相互作用は、多くの場合ｉｎ ｖｉｖｏで意味がある高アビディティ結合相互作用の生成に必要とされる。レクチンは、グリカン鎖の特異的末端の特徴を、浅いが比較的はっきりと区別された結合ポケット中にそれをフィットさせることによって認識する傾向がある。対照的に、硫酸化グリコサミノグリカンとのタンパク質相互作用には、伸長されたアニオン性グリコサミノグリカン鎖の内部領域に対して整列した正電荷のアミノ酸の表面クラスターが関与するようである。レクチンは、Ｒ型、Ｌ型、Ｐ型、Ｃ型、Ｉ型、およびガレクチンとしてさらに分類することができる。いくつかのレクチンによって認識されるＮ－グリカンの例の構造を示す。結合に必要な決定基を四角に囲まれた部分に示す。
【0079】
【化4】
【0080】
ＥＢＮからＡＮＩを抽出および単離するための一般的な方法は以下のとおりである（図１に示す）。
（ａ）ＥＢＮの汚れを落とし、混入物を除去する。
（ｂ）汚れを落としたＥＢＮをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかけた。
（ｃ）ＥＢＮ粉末を水に溶解し、少なくとも１つの抗体を含む溶液で処理した。
（ｄ）抗体および結合分子を分離してもよい。
（ｅ）結合分子を、酸溶液を用いて部分的に加水分解し、高分子量のペプチドを添加することによって結合分子を放出した。
（ｆ）放出された小分子を透析によって単離した。
（ｇ）単離した分画を酵素溶液で処理し、化合物をさらに破壊した。
（ｈ）酵素を変性させ、除去した後に、単離した分画を乾燥し、固体製品を得た。
（ａ）ＥＢＮの汚れを落とし、混入物を除去する。
（ｂ）汚れを落としたＥＢＮをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかけた。
（ｃ）ＥＢＮ粉末を水に溶解し、少なくとも１つの抗体を含む溶液で処理した。
（ｄ）抗体および結合分子を分離してもよい。
（ｅ）結合分子を、酸溶液を用いて部分的に加水分解し、高分子量のペプチドを添加することによって結合分子を放出した。
（ｆ）放出された小分子を透析によって単離した。
（ｇ）単離した分画を酵素溶液で処理し、化合物をさらに破壊した。
（ｈ）酵素を変性させ、除去した後に、単離した分画を乾燥し、固体製品を得た。
【0081】
粗製ＥＢＮ（１片は約１０～５０ｇ）を水中に浸漬することによって汚れを落とし、亜硝酸塩、ダニおよび他の混入物を除去した。除去される他の考えられる混入物としては、重金属、漂白剤および染料を含む他のわずかな破片があり得る。
【0082】
亜硝酸塩を除去する効果的な方法は、果物、植物および土壌から得られる亜硝酸還元酵素を含む溶液を使用することである。さらに、溶液は亜硝酸塩を生成する任意の付着細菌（accompanying bacteria）を不活性化する他の酵素を含んでいてもよい。ダニを除去するために、特殊な果物プロテアーゼを含む溶液を使用する。このような例としては、パパイヤ（パパイン）、キウイフルーツ（アクチニジン）、パイナップル（ブロメライン）、イチジク（フィシン）などから得られる任意のそのようなプロテアーゼがある。これらのプロテアーゼは、細菌の不活性化を可能にする任意の好適な濃度で使用してもよい。
【0083】
ＥＢＮ混合物を、各酵素溶液を用いて、室温から４０℃で少なくとも５分間、連続的に処置した。得られた酵素溶液中のＥＢＮ懸濁液にナノバブルを発砲すると（Nanobubbling）、細胞破片が分解され、水表面に浮かぶことになり、容易に除去することができる。その後、酵素溶液を固体ＥＢＮから除去する。固体ＥＢＮをさらに洗浄し、すべての残渣酵素および混入物を除去することができる。
【0084】
汚れを落としたＥＢＮを、好ましくは７０℃で１２時間乾燥し、過剰な水を除去する。
【0085】
汚れを落としたＥＢＮをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかける。メッシュサイズは残された任意の大きな不純物を除去するのに十分でなければならず、好ましくは、２００～７００μｍのサイズである。最も好ましくは、メッシュサイズは６００μｍである。
【0086】
ＥＢＮ粉末を、水、好ましくは蒸留水または脱イオン水に、５℃で５時間入れる。好適な濃度は、水１０００ｍＬ中ＥＢＮ２５ｇである。必要に応じて、混合物を、１２１℃で１０分間さらに滅菌してもよい。
【0087】
ＥＢＮ混合物を、少なくとも１つの抗体を含む水性溶液を用いて、４～３７℃の温度範囲で少なくとも２０分間処理する。２５～３７℃の温度、２０～１２０分で十分である。４℃の温度で、抗体およびＥＢＮの混合物を少なくとも９時間維持する。一般的に、温度が低いほど、抗体溶液が標的化合物に完全に結合するにはより長い時間が必要とされる。
【0088】
抗体は以下から選択される。
１．抗Ｎ－グリカン
２．抗Ｏ－グリカン
３．抗ヘパラン硫酸
４．抗コンドロイチン硫酸
５．抗ケラタン硫酸
６．抗デルマタン硫酸
７．抗ロイシンジッパー
８．抗ヘリックスターンヘリックス
９．抗ジンクフィンガー
１０．ヒアルロン酸抗体
１．抗Ｎ－グリカン
２．抗Ｏ－グリカン
３．抗ヘパラン硫酸
４．抗コンドロイチン硫酸
５．抗ケラタン硫酸
６．抗デルマタン硫酸
７．抗ロイシンジッパー
８．抗ヘリックスターンヘリックス
９．抗ジンクフィンガー
１０．ヒアルロン酸抗体
【0089】
抗体および結合分子は、通常既知の方法のうちのいずれかによって混合物から分離することができる。これらの方法のうちのいくつかとしては、物理化学的画分、クラス特異的親和性および抗原特異的親和性がある。物理化学的画分としては、示差沈殿、サイズ排除もしくはサイズに基づく免疫グロブリンの固相結合、電荷または他の抗体の共通の化学的特徴がある。クラス特異的親和性としては、免疫グロブリンに特異的親和性を有する固定化された生物学的リガンドによる、特定の抗体クラス（例えばＩｇＧ）の固相結合がある。抗原特異的親和性としては、それらの特異的抗原結合ドメインを介して抗体を精製するための特異的抗原の使用がある。
【0090】
使用する抗体としては、天然に存在する抗体、または改変抗体、例えば、抗体の分離を促進することができる標識抗体があり得る。抗体に使用した標識のいくつかの一般的な例は、Ｈｉｓ標識およびＦＬＡＧ標識である。さらに、標的分子の抽出に使用される抗体は、固体支持体へ結合させてもよい。固体支持体は強磁性材料または従来の不活性支持体材料から作製してもよい。抗体は市販されており、かつそのようなものとして使用することができる。抗体の修飾が所望される場合、抗体を修飾し、所望の特徴を得るための文献で一般的に知られているように多数の方法が存在する。抗体の分離を通常「フィッシング」法で使用して、標的タンパク質を抽出する。
【0091】
前述のような時間で抗体を添加した後、混合物を酸溶液で処理し、１００℃に加熱し、標的化合物を部分的に加水分解する。酸は、好ましくは食品酸、例えば、クエン酸、リンゴ酸、酢酸、酒石酸、フマル酸、および乳酸である。混合物を室温に冷却し、ｐＨ７に中和する。
【0092】
抗体結合化合物は、過剰な巨大ペプチドの天然グリコアミノグリカンおよび細胞転写調節因子を添加することによって抗体から放出される。
【0093】
その後、放出された化合物を、添加したペプチド、酵素および抗体から透析バッグを使用することによって単離する。
【0094】
他の実施形態において、抗体溶液は、少なくとも２つの抗体を含んでいてもよい。例えば、抗Ｎ－グリカンおよび抗Ｏ－グリカンを含む溶液、抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液、抗ロイシンジッパー、抗ターンヘリックスターン、および抗ジンクフィンガーを含む溶液である。
【0095】
好ましくは、抗体溶液組成物は以下のとおりであり、ここで所与の百分率は、溶液中に存在する抗体の合計重量に対する抗体の重量百分率である。
１．５０％の抗Ｎ－グリカンおよび５０％の抗Ｏ－グリカン
２．２５％の抗ヘパラン硫酸、２５％の抗コンドロイチン、２５％の抗ケラタン、および２５％の抗デルマタン
３．３７％の抗ロイシンジッパー、３３％の抗ターンヘリックスターン、および３０％の抗ジンクフィンガー。
１．５０％の抗Ｎ－グリカンおよび５０％の抗Ｏ－グリカン
２．２５％の抗ヘパラン硫酸、２５％の抗コンドロイチン、２５％の抗ケラタン、および２５％の抗デルマタン
３．３７％の抗ロイシンジッパー、３３％の抗ターンヘリックスターン、および３０％の抗ジンクフィンガー。
【0096】
あるいは、ＥＢＮを含む混合物を、異なる抗体を含む溶液で連続的に処理し、分離し、所望の化合物を連続的に抽出することができる。
【0097】
単離された化合物は、野菜および食品プロテアーゼを用いて、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で１時間さらに加水分解することができる。使用する酵素の濃度は、効率的に加水分解するために、少なくとも１０μｇ／ｍＬでなくてはならない。好ましくは、酵素の濃度は最大１００μｇ／ｍＬであり、かつコーンまたはトウモロコシ末端プロテアーゼを使用する。酵素は、混合物を７０℃で５分間加熱することによって変性する。酵素は、５５℃超の温度で析出するため、混合物を５５℃超の温度でろ過し、所望の化合物をろ液中の溶液として得ることができる。
【0098】
所望の化合物の溶液を乾燥し、化合物を粉末状物として得る。好ましくは、化合物はフリーズドライまたはスプレードライによって乾燥する。フリーズドライは溶液を、－１８０から－７０℃の間の温度に、液体窒素またはドライアイスを用いて冷却することによって行い、凍結した混合物を真空に曝し、氷を昇華させる。フリーズドライは、乾燥粉末製品を得ることを必要とする場合、繰り返すことができる。
【0099】
乾燥粉末製品を他の添加物と混合し、食品または医薬品を得ることができる。あるいは、製品は他の添加物とともに水に溶解することができる。
【0100】
コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、およびケラタン硫酸などの製品ならびにその加水分解を分離する方法を通して、高純度でかつ目的に適するさまざまな用量の化合物を供給するための経済的な方法が提供される。本方法で単離された製品は、使用者へさまざまな手段および方法で送達可能であり、化合物の作用部位への効果的なかつ迅速な送達を可能にする。特に、好適な配合剤を用いて、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、およびケラタン硫酸を、効果的なかつ有用な用量で疼痛および炎症の部位へ送達することができる。
【0101】
いくつかの可能な配合剤の例が提供され、ここで所与の百分率は、製品の合計重量に対する構成成分の重量百分率である。２５～７０重量％のＥＢＮ抽出物を、残りを占める糖と混合し、１００％とする。好適な糖は、デキストリンまたはマルトデキストリンである。
【0102】
いくつかの可能な配合剤が以下のとおりに提供される。
１．７０％のＥＢＮ抽出物製品および３０％マルトデキストリン
２．６０％のＥＢＮ抽出物製品および４０％マルトデキストリン
３．５０％のＥＢＮ抽出物製品および５０％マルトデキストリン
４．２５％のＥＢＮ抽出物製品および７５％マルトデキストリン
１．７０％のＥＢＮ抽出物製品および３０％マルトデキストリン
２．６０％のＥＢＮ抽出物製品および４０％マルトデキストリン
３．５０％のＥＢＮ抽出物製品および５０％マルトデキストリン
４．２５％のＥＢＮ抽出物製品および７５％マルトデキストリン
【0103】
ＥＢＮから得た抽出物製品は、治療的または予防的利点を有し、医薬品にまたは予防対策として使用してもよい。抽出物は、皮膚の改善ならびにさまざまな皮膚病、脱水および炎症性皮膚の治療、免疫系の強化、老化の遅延、代謝の促進、ヒト視力の保護、血液循環の改善、血中コレステロールレベルの制御、心血管の健康状態の保護、細胞の賦活および再生、関節炎による不快感の緩和、ホルモンレベルの調整、炎症発生の低下、糖尿病の管理、変形性関節、皮膚退化、変性性神経系および脳の治療、ならびに腎不全の保護ために使用してもよい。
【0104】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイの結果
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ実験を行い、ＥＢＮから単離された製品の潜在的な治療効果を研究し、結果を本明細書でさらに検討した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイ実験を行い、ＥＢＮから単離された製品の潜在的な治療効果を研究し、結果を本明細書でさらに検討した。
【0105】
図２は、抗ジンクフィンガーを使用して述べた方法から得られた４種類の濃度のＥＢＮ抽出物製品の、ベロ細胞の成長に対する効果を示す。３日目に、ＥＢＮ抽出物もよって、ベロ細胞成長が用量依存的様式で促進されることが実証される。さらに、試験された最も高い濃度（３．３ｇ／ｌ）で、細胞成長は最大であり、かつＥＢＮ抽出物製品が添加されていない陰性対照よりも有意に高かった。これは、ＥＢＮ製品は、ベロ細胞成長を促進することを示す。
【0106】
抗Ｏ－グリカンを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、インフルエンザウィルスの表面に位置し、赤血球と相互作用する血球凝集素分子の能力に対する阻害効果を判定するために、血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを行った。図３は、インフルエンザウィルスのＨ１Ｎ１株に関するＨＡＩアッセイの結果を示す。インフルエンザウィルスと結合しない赤血球はウェルの底部に沈み、赤色ボタン様物質（button）として観察されることになる。インフルエンザウィルスへ結合した赤血球は格子を形成することになる。血球凝集は、試験された２つのウィルス濃度に関しては２７倍希釈まで観察されなかった（縦列１～６では、点線より左のすべての縦列のプレートのウェルに点を認めることができる）。その希釈に対応するＥＢＮ抽出物濃度は０．５ｇ／ｌである。言い換えれば、濃度０．５ｇ／ｌの本ＥＢＮ抽出物製品は、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスが赤血球へ結合するのを阻害することができる。
【0107】
図４は、Ｈ３Ｎ２ウィルス株を用いたＨＡＩアッセイを示す。ＥＢＮ抽出物製品の濃度は、１６および８ＨＡＵ／５０μｌのウィルス濃度で、それぞれ２．１ｇ／ｌおよび１．０ｇ／ｌである。
【0108】
図５は、抗Ｏ－グリカンを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、ベロ細胞のインフルエンザウィルス感染の阻害に対する効果を示す。図５は、ＨＡＩを使用したウィルス力価の定量化を示す。以下の表１は、ＥＢＮ抽出物製品が、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウィルスの、ベロ細胞に対する感染力を低下させることを示す。
【0109】
【表1】
【0110】
抗体－Ｏ－グリカンを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、Ｈ１Ｎ１ウィルス性活性阻害に対する効果を、２つの市販されているＥＢＮ溶液（コンペティターＡおよびＢ）と比較した。ＥＢＮ抽出溶液、コンペティターＡおよびＢの溶液中の可溶性タンパク質含量を、ＤＣ（商標）タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号５０００１１６）によって、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として用いて判定した。３つの溶液の可溶性タンパク質含量は、それぞれ２０２１μｇ／ｍＬ、８２３μｇ／ｍＬおよび６２８μｇ／ｍＬであると判定された（表３）。したがって、本方法から得られたＥＢＮ抽出溶液を、各コンペティター溶液と一致するように希釈した。しかし、コンペティターＡ ＥＢＮ溶液は細胞に対して細胞毒性が認められ、さらに試験を行わなかったが、コンペティターＢ ＥＢＮ溶液はＨ１Ｎ１ウィルス阻害を示さなかった。したがって図６は、本発明のＥＢＮ抽出溶液の、コンペティターＢのＥＢＮ溶液に対する比較を示す。
【0111】
【表2】
【0112】
図７は、抗Ｎ－グリカンおよび／または抗ヘリックスターンヘリックスを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、細胞増殖中のヒト幹細胞増殖に対する効果を示す。図７のデータは、１０％ＥＢＮ抽出物および３つの成長因子の組合せが、４成長因子を使用した場合と同様のプラスの効果をヒト幹細胞増殖に対して有することを示す。１０％ＥＢＭのみが表皮成長因子（ＥＧＦ）と代わって、ＥＧＦの代替物として作用することができる。ＥＧＦは栄養補助食品として利用できず、かつＰａｎら（Environ. Health Perspect., DOI: 10.1289/ehpl409200）は、ヒトＥＧＦおよびパラベンは、乳がん細胞株の増殖を増加させる場合があることを示している。その結果、ＥＢＮ抽出物は、ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）活性化および軟骨細胞への分化に必要とされる内因性ＥＧＦを生成しない個体のための実行可能な代替物となるはずである。
【0113】
図８および図９は、コンペティターＡおよびＢ製ＥＢＮ抽出物と比較した、抗Ｎ－グリカンおよび／または抗ヘリックスターンヘリックスを使用して述べた方法から得られたＥＢＮ抽出物製品の、ヒト幹細胞増殖に対する効果を示す。ＥＧＦに代わるＥＢＮ抽出物の効果は、コンペティターＡおよびＢ製品の両方と比較したＥＢＮ抽出物に関して、よりいっそう有意である。
【0114】
ＥＢＮ抽出物の、インフルエンザに対する効果
材料および方法
１．抽出方法
図１を参照して、重量１０～５０ｇのＥＢＮ片を酵素溶液で５分間洗浄し、ダニを除去し、溶液を除去した。燕の巣を、亜硝酸還元酵素を含む水性溶液で洗浄し、溶液を除去した。汚れを落としたＥＢＮを７０℃で１２時間乾燥した。乾燥しかつ汚れを落としたＥＢＮをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかけ（６００μｍ孔径）、羽および異物を除去した。すりつぶしたＥＢＮを蒸留水（２５ｇ／水１０００ｍｌ）中に５℃で５時間維持し、次いで、１２１℃で１０分間加熱滅菌した。
材料および方法
１．抽出方法
図１を参照して、重量１０～５０ｇのＥＢＮ片を酵素溶液で５分間洗浄し、ダニを除去し、溶液を除去した。燕の巣を、亜硝酸還元酵素を含む水性溶液で洗浄し、溶液を除去した。汚れを落としたＥＢＮを７０℃で１２時間乾燥した。乾燥しかつ汚れを落としたＥＢＮをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかけ（６００μｍ孔径）、羽および異物を除去した。すりつぶしたＥＢＮを蒸留水（２５ｇ／水１０００ｍｌ）中に５℃で５時間維持し、次いで、１２１℃で１０分間加熱滅菌した。
【0115】
懸濁液を、抗体を含む溶液２７０ｍｌと２０分間、続いて酸２００ｍｌと４℃で一晩混合した。抽出物をホモジナイザーでホモジネートし、１００℃において加熱した。室温に冷却後、溶液のｐＨを、攪拌しながらアルカリを滴加することによって７．０に調整した。抗体結合化合物を、過剰な巨大ペプチドの天然グリコアミノグリカンおよび細胞転写調節因子を添加することによって抗体から放出した。その後、放出された化合物を、添加したペプチド、酵素および抗体から透析バッグを使用することによって単離した。
【0116】
抽出物を、コーンまたはトウモロコシ末端プロテアーゼを用い、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で１時間処理した。懸濁液を７０℃で５分間加熱することによって、酵素を不活性化し、５５℃超の温度で沈殿した酵素をろ過除去した。ろ液中の単離された製品を少なくとも２４時間フリーズドライした。
【0117】
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ試験用に、個別のフリーズドライＥＢＮ粉末を蒸留水に溶解し、濃度３３．３ｇ／ｌの原液を調製し、ガンマ線によって２５ｋＧｒｙで１時間滅菌した。すべての不溶性物質を遠心分離によって８０００ＲＰＭで除去した。原液を、必要になるまで－２０℃で保管した。
【0118】
ＳＦ－ＥＢＮ中の可溶性タンパク質濃度を、ＤＣ（商標）タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号５０００１１６）によって判定し、タンパク質標準としてウシ血清アルブミンを使用した。オスモル濃度および濁度を、蒸気圧浸透圧計（ＶＡＰＲＯ）およびマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）によってそれぞれ測定した。
【0119】
代替方法において、燕の巣を１０分間洗浄し、７０℃で１２時間乾燥した。乾燥した燕の巣をすりつぶし、メッシュ（６００μｍ孔径）に通してふるいにかけ、羽および異物を除去した。すりつぶした燕の巣を、蒸留水（２５ｇ／水１０００ｍｌ）中に５℃で５時間維持し、次いで１２１℃で１０分間加熱（滅菌）した。懸濁液を、抽出溶液２７０ｍｌと２０分間、続いて酸２００ｍｌと４℃で一晩混合した。抽出物をホモジナイザーでホモジネートし、１００℃において加熱した。
【0120】
室温に冷却後、溶液のｐＨを、アルカリを攪拌しながら滴加することによって７．０に調整した。抽出物を、専売酵素（濃度は酵素規格による）を用い、ｐＨ６．５～９．０、４５℃で１時間処理した。その後、懸濁液を７０℃で５分間加熱することによって、酵素を不活性化した。処理した抽出物をフリーズドライした。Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ試験用に、フリーズドライＥＢＮ粉末を蒸留水に溶解し、濃度を３３．３ｇ／ｌとし、ガンマ線によって２５ｋＧｒｙで１時間滅菌した。不溶性ＥＢＮ抽出物を遠心分離によって８０００ＲＰＭで除去した。－２０℃で保管した可溶性分画（ＳＦ－ＥＢＮ）をインフルエンザ中和試験用に使用した。
【0121】
ＳＦ－ＥＢＮ中の可溶性タンパク質濃度を、ＤＣ（商標）タンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カタログ番号５０００１１６）によって判定し、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として使用した。オスモル濃度および濁度を蒸気圧浸透圧計（ＶＡＰＲＯ）およびマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）によってそれぞれ測定した。
【0122】
２．ベロ細胞バンクの増殖および作製
マスター細胞バンクから得た１２９代継代ベロ細胞（ＡＴＣ ＣＣＣＬ－８１）を解凍し、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５０３０１４９）が補充された無血清培地、ＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３０９－０１９）で増殖させ、作業用細胞バンクを１バイアルあたり２×１０６個細胞のバイアル２０個で得た。ベロ細胞をＳｔｅｍＰｒｏＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１１０５－０１）を使用して４日おきに継代して、細胞分離し、得られた単一の細胞を１．５×１０４個細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種した。
マスター細胞バンクから得た１２９代継代ベロ細胞（ＡＴＣ ＣＣＣＬ－８１）を解凍し、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５０３０１４９）が補充された無血清培地、ＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３０９－０１９）で増殖させ、作業用細胞バンクを１バイアルあたり２×１０６個細胞のバイアル２０個で得た。ベロ細胞をＳｔｅｍＰｒｏＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１１０５－０１）を使用して４日おきに継代して、細胞分離し、得られた単一の細胞を１．５×１０４個細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種した。
【0123】
３．ＥＢＮ抽出溶液のベロ細胞成長に対する効果
ＳＦ－ＥＢＮの、細胞成長に対する効果を試験するために、ベロ細胞を、３×１０４個細胞／ウェルで、２４ウェル組織培養プレートのＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地に播種した。播種してから１日後、ＳＦ－ＥＢＮ（３３．３ｇ／ｌ）を個別のウェルへ添加し、最終濃度を３．３ｇ／ｌ（１０％ｖ／ｖ）、１．６５ｇ／ｌ（５％ｖ／ｖ）、０．８３ｇ／ｌ（２．５％ｖ／ｖ）、および０．３３ｇ／ｌ（１％ｖ／ｖ）とした。細胞成長を４日にわたって毎日モニターした。細胞計数を、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｉｎｃ．）を使用し、推奨される手順に従って行った。
ＳＦ－ＥＢＮの、細胞成長に対する効果を試験するために、ベロ細胞を、３×１０４個細胞／ウェルで、２４ウェル組織培養プレートのＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地に播種した。播種してから１日後、ＳＦ－ＥＢＮ（３３．３ｇ／ｌ）を個別のウェルへ添加し、最終濃度を３．３ｇ／ｌ（１０％ｖ／ｖ）、１．６５ｇ／ｌ（５％ｖ／ｖ）、０．８３ｇ／ｌ（２．５％ｖ／ｖ）、および０．３３ｇ／ｌ（１％ｖ／ｖ）とした。細胞成長を４日にわたって毎日モニターした。細胞計数を、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｉｎｃ．）を使用し、推奨される手順に従って行った。
【0124】
４．ベロ細胞におけるインフルエンザウィルス増殖
２．５×１０４個細胞／ｃｍ２で播種し、培養の２日後にサブコンフルエンスを得たベロ細胞に、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウィルス（ＩＶＲ－１１６、ＮＩＢＳＣコード０６／１０８）およびＨ３Ｎ２ウィルス（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５ＨＧＲ、ＮＩＢＳＣコード０６／１１２））を０．００１～０．０１のＭＯＩ（感染多重度）で感染させた。インフルエンザウィルスの活性化に使用するためのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ５２６６、１５００ＢＡＥＥ単位／ｍｇ）を、脱イオン水および滅菌フィルターを用いて調製し、原液濃度を５ｍｇ／ｍｌとした。ウィルス増幅中、トリプシンを、ウィルスを接種してから３０分後に添加し、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。ウィルスを含む培養上澄みを、２～３日後に採取し（８０％細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたときに）、遠心分離し、細胞残屑を除去した。ウィルス原液（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）を、－８０℃で保管した。そのウィルス力価を、以下で述べるような血球凝集および組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイを使用して定量化した。
２．５×１０４個細胞／ｃｍ２で播種し、培養の２日後にサブコンフルエンスを得たベロ細胞に、インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウィルス（ＩＶＲ－１１６、ＮＩＢＳＣコード０６／１０８）およびＨ３Ｎ２ウィルス（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５ＨＧＲ、ＮＩＢＳＣコード０６／１１２））を０．００１～０．０１のＭＯＩ（感染多重度）で感染させた。インフルエンザウィルスの活性化に使用するためのブタトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ５２６６、１５００ＢＡＥＥ単位／ｍｇ）を、脱イオン水および滅菌フィルターを用いて調製し、原液濃度を５ｍｇ／ｍｌとした。ウィルス増幅中、トリプシンを、ウィルスを接種してから３０分後に添加し、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。ウィルスを含む培養上澄みを、２～３日後に採取し（８０％細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されたときに）、遠心分離し、細胞残屑を除去した。ウィルス原液（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）を、－８０℃で保管した。そのウィルス力価を、以下で述べるような血球凝集および組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイを使用して定量化した。
【0125】
５．インフルエンザウィルス力価の定量化
ウィルス力価を、Ｃｈｅｎら（BMC Biotechnol.、2011、11-81）に記載のような血球凝集アッセイおよび組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイを使用して定量化した。血球凝集アッセイに関しては、４％ヒト赤血球（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０－２５０）で希釈し、０．７５％細胞懸濁液を得た。次いで、希釈した赤血球懸濁液を、２倍連続希釈のウィルスおよび対照試料に添加した。赤血球の完全な血球凝集をもたらすウィルスの最大希釈を、ＨＡ滴定終点とみなす。ＨＡ力価（ＨＡＵ／５０μｌ）は完全な血球凝集を含む最後のウェルのウィルス希釈の逆数である（例えば、２７の希釈は血球凝集単位（ＨＡＵ／５０μｌ）１２８となる）。
ウィルス力価を、Ｃｈｅｎら（BMC Biotechnol.、2011、11-81）に記載のような血球凝集アッセイおよび組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイを使用して定量化した。血球凝集アッセイに関しては、４％ヒト赤血球（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０－２５０）で希釈し、０．７５％細胞懸濁液を得た。次いで、希釈した赤血球懸濁液を、２倍連続希釈のウィルスおよび対照試料に添加した。赤血球の完全な血球凝集をもたらすウィルスの最大希釈を、ＨＡ滴定終点とみなす。ＨＡ力価（ＨＡＵ／５０μｌ）は完全な血球凝集を含む最後のウェルのウィルス希釈の逆数である（例えば、２７の希釈は血球凝集単位（ＨＡＵ／５０μｌ）１２８となる）。
【0126】
ＴＣＩＤ５０アッセイを、１０倍連続希釈ウィルス試料を、９６ウェルプレートで培養されたベロ細胞へ、５μｇ／ｍｌのブタトリプシンが補充されたＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地を使用して添加することによって３回行った。プレートを５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で３日間インキュベートし、次いで、培養物を、光顕微鏡下で細胞変性効果に関して確認した。培養物の５０％（組織培養感染用量の中央値、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）に細胞変性効果をもたらす懸濁液の希釈を、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）の式に従って計算した。
【0127】
６．血球凝集阻害アッセイ
血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを、既に記載されているように（Guo et al., 2006, Antiviral Res., 70, 140-146）９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して行った。Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含むＤＰＢＳを希釈緩衝液として使用した。ヒト赤血球を指標細胞として使用した。ウィルス懸濁液（それぞれＤＰＢＳ０．０５ｍｌ中、８ＨＡＵ／５０μｌおよびＤＰＢＳ０．０５ｍｌ中、１６ＨＡＵ／５０μｌ）を、希釈緩衝液で２倍連続希釈したＥＢＮ溶液を含む各ウェルへ添加した。ＤＰＢＳ中の０．７５％（ｖ／ｖ）ヒトＯ型赤血球０．０５ｍｌを、プレートへ添加し、４℃で１時間インキュベートした。完全な血球凝集阻害を示す試料の最大希釈をＥＢＮ溶液のＨＡＩ力価として定義した。
血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを、既に記載されているように（Guo et al., 2006, Antiviral Res., 70, 140-146）９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して行った。Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含むＤＰＢＳを希釈緩衝液として使用した。ヒト赤血球を指標細胞として使用した。ウィルス懸濁液（それぞれＤＰＢＳ０．０５ｍｌ中、８ＨＡＵ／５０μｌおよびＤＰＢＳ０．０５ｍｌ中、１６ＨＡＵ／５０μｌ）を、希釈緩衝液で２倍連続希釈したＥＢＮ溶液を含む各ウェルへ添加した。ＤＰＢＳ中の０．７５％（ｖ／ｖ）ヒトＯ型赤血球０．０５ｍｌを、プレートへ添加し、４℃で１時間インキュベートした。完全な血球凝集阻害を示す試料の最大希釈をＥＢＮ溶液のＨＡＩ力価として定義した。
【0128】
７．ＥＢＮのインフルエンザウィルス複製阻害に対する効果
ベロ細胞を、Ｔ２５フラスコのＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地で、３×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で播種して培養した。細胞培養物が９０％培養密度に達したときに、培養物を、インフルエンザウィルスに０．００１のＭＯＩで感染させた。次いで、ＳＦ－ＥＢＮを添加し、最終濃度を２ｇ／ｌ（６．２５％ｖ／ｖ）、０．２６ｇ／ｌ（０．７８％ｖ／ｖ）および０．０３ｇ／ｌ（０．１０％ｖ／ｖ）とした。２時間後、ＳＦ－ＥＢＮ含有培養培地を除去した。細胞をＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地で３回洗浄した。ブタトリプシンを添加し、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。２４時間後、培養物上澄みを収集した。ＳＦ－ＥＢＮ抗インフルエンザ効果を、血球凝集およびＴＣＩＤ５０アッセイによって検証した。
ベロ細胞を、Ｔ２５フラスコのＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地で、３×１０４個細胞／ｃｍ２の密度で播種して培養した。細胞培養物が９０％培養密度に達したときに、培養物を、インフルエンザウィルスに０．００１のＭＯＩで感染させた。次いで、ＳＦ－ＥＢＮを添加し、最終濃度を２ｇ／ｌ（６．２５％ｖ／ｖ）、０．２６ｇ／ｌ（０．７８％ｖ／ｖ）および０．０３ｇ／ｌ（０．１０％ｖ／ｖ）とした。２時間後、ＳＦ－ＥＢＮ含有培養培地を除去した。細胞をＯｐｔｉＰｒｏ無血清培地で３回洗浄した。ブタトリプシンを添加し、最終濃度を５μｇ／ｍｌとした。２４時間後、培養物上澄みを収集した。ＳＦ－ＥＢＮ抗インフルエンザ効果を、血球凝集およびＴＣＩＤ５０アッセイによって検証した。
【0129】
８．ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）細胞培養物
ｈＭＳＣ（８～９代継代）を、２４００～２８００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｔ１７５ｃｍ２細胞培養フラスコまたはＮｕｎｃ（商標）ＥａｓｙＦｉｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍのいずれかの、最小必須培地α、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ製）からなるＭＳＣ成長培地に蒔いた。培地を２～３日おきに交換した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で５分間使用して採取した場合、ｈＭＳＣは約７０％の培養密度で継代された。自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて生存率および細胞計数アッセイを行った。すべての培養物を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。
ｈＭＳＣ（８～９代継代）を、２４００～２８００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｔ１７５ｃｍ２細胞培養フラスコまたはＮｕｎｃ（商標）ＥａｓｙＦｉｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍのいずれかの、最小必須培地α、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ製）からなるＭＳＣ成長培地に蒔いた。培地を２～３日おきに交換した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で５分間使用して採取した場合、ｈＭＳＣは約７０％の培養密度で継代された。自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて生存率および細胞計数アッセイを行った。すべての培養物を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。
【0130】
９．細胞成長曲線用のｈＭＳＣ細胞増殖
ｈＭＳＣを、１０００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ２４ウェルプレートに蒔いた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、４日間培養した。ｈＭＳＣは、いずれの成長因子も含まないＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地のみで成長させ、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物を陰性対照として使用し、それは「成長因子不含」として既知であった。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣをまた、陰性対照として使用し、また「３成長因子」と称した。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣを、陽性対照として使用し、また「４成長因子」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む無血清ＭＳＣ成長培地で成長した、ｈＭＳＣを試験し、それを「３成長因子＋１０％ＥＢＮ」と称した。１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を１日目に添加した。細胞計数アッセイを、各条件に関して、自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて毎日３回行った。すべての培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。
ｈＭＳＣを、１０００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ２４ウェルプレートに蒔いた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、４日間培養した。ｈＭＳＣは、いずれの成長因子も含まないＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地のみで成長させ、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物を陰性対照として使用し、それは「成長因子不含」として既知であった。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣをまた、陰性対照として使用し、また「３成長因子」と称した。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣを、陽性対照として使用し、また「４成長因子」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む無血清ＭＳＣ成長培地で成長した、ｈＭＳＣを試験し、それを「３成長因子＋１０％ＥＢＮ」と称した。１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を１日目に添加した。細胞計数アッセイを、各条件に関して、自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて毎日３回行った。すべての培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。
【0131】
１０．軟骨形成性分化
ｈＭＳＣを、透明丸底超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、軟骨形成性分化用にマイクロマスペレットとして成長させた。ペレットを、１０００ｒｐｍの遠心分離によって、室温（ｒｔ）で５分間、１ウェルあたり１ペレットあたり２×１０５ｈＭＳＣを使用して形成した。これらを、ＤＭＥＭ－高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎΜデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１％ＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ－プロリン（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む軟骨形成性分化培地で培養した。ＥＢＮ抽出物を含まない軟骨形成性分化培地のみで成長したペレットを陰性対照として使用した。異なる濃度（１．２５％、２．５％、５％および１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＥＢＮを含む軟骨形成性分化培地で成長したペレットの試験を行った。１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２が補充された軟骨形成性分化培地で成長したペレットを陽性対照として使用した。補充されたまたは補充されていない軟骨形成性培地を２～３日おきに交換した。
ｈＭＳＣを、透明丸底超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、軟骨形成性分化用にマイクロマスペレットとして成長させた。ペレットを、１０００ｒｐｍの遠心分離によって、室温（ｒｔ）で５分間、１ウェルあたり１ペレットあたり２×１０５ｈＭＳＣを使用して形成した。これらを、ＤＭＥＭ－高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎΜデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１％ＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ－プロリン（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む軟骨形成性分化培地で培養した。ＥＢＮ抽出物を含まない軟骨形成性分化培地のみで成長したペレットを陰性対照として使用した。異なる濃度（１．２５％、２．５％、５％および１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＥＢＮを含む軟骨形成性分化培地で成長したペレットの試験を行った。１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２が補充された軟骨形成性分化培地で成長したペレットを陽性対照として使用した。補充されたまたは補充されていない軟骨形成性培地を２～３日おきに交換した。
【0132】
１１．ＤＮＡ、ＧＡＧおよびコラーゲンＩＩ含量の評価
ペレット（１時点あたり１条件あたり少なくとも３個）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回すすいでから、すぐに－８０℃で保管した。解凍後、ペレットを、ＤＮＡおよびＧＡＧ定量化の場合は０．１２５ｍｇ／ｍｌパパインを用いて６５℃で一晩消化するか、コラーゲンＩＩ評価の場合は、０．１ｍｇ／ｍｌペプシンを用いて４℃で２晩消化し、続いて０．１ｍｇ／ｍｌエラスターゼによって４℃で一晩消化するかのいずれかを行った。ＤＮＡ定量化を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙを使用して行い、ＧＡＧ測定を、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して行い、かつコラーゲンＩＩ定量化をＥＬＩＳＡによってＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）に対して行い、すべて製造業者の取扱説明書に従った。すべての蛍光および可視光の読み取りはＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００を用いて行った。
ペレット（１時点あたり１条件あたり少なくとも３個）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回すすいでから、すぐに－８０℃で保管した。解凍後、ペレットを、ＤＮＡおよびＧＡＧ定量化の場合は０．１２５ｍｇ／ｍｌパパインを用いて６５℃で一晩消化するか、コラーゲンＩＩ評価の場合は、０．１ｍｇ／ｍｌペプシンを用いて４℃で２晩消化し、続いて０．１ｍｇ／ｍｌエラスターゼによって４℃で一晩消化するかのいずれかを行った。ＤＮＡ定量化を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙを使用して行い、ＧＡＧ測定を、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して行い、かつコラーゲンＩＩ定量化をＥＬＩＳＡによってＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）に対して行い、すべて製造業者の取扱説明書に従った。すべての蛍光および可視光の読み取りはＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００を用いて行った。
【0133】
１２．統計的分析
データを、統計ソフトウェアＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析した。異なる条件間での多重比較を、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、テューキーの多重比較検定を用いて統計的に比較した。すべての統計的検定に関して、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
データを、統計ソフトウェアＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析した。異なる条件間での多重比較を、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、テューキーの多重比較検定を用いて統計的に比較した。すべての統計的検定に関して、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【0134】
１３．ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮのコンペティターＡ ＥＢＮおよびコンペティターＢ ＥＢＮとの比較
ｈＭＳＣを、第９項で詳述されたような同様の方法で成長させた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、５日間培養した。２つのタイプのＥＢＮ抽出物の比較をコンペティターＡ ＥＢＮまたはコンペティターＢ ＥＢＮのいずれかに対して行った。片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮをＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮに対して、タンパク質含量に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ対照は、各コンペティターのものと同じタンパク質量を有することになる）。測定されたように、１０％のコンペティターＡ ＥＢＮは、４．３９％のＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮと同等であった。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、４．３９％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＡ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＡ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＡ」と称した。コンペティターＢに関しても同様に、１０％のコンペティターＢ ＥＢＮは、３．３５％のＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮと同等であった。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、３．３５％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＢ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＢ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＢ」と称した。もう片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮをＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮと、体積に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち、１０％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮを、１０％のコンペティターＥＢＮと体積で比較することになる）。関連実験を実施し、かつデータ分析する間は、研究者にはコンペティターＡおよびＢの識別について知らせなかった。
ｈＭＳＣを、第９項で詳述されたような同様の方法で成長させた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、５日間培養した。２つのタイプのＥＢＮ抽出物の比較をコンペティターＡ ＥＢＮまたはコンペティターＢ ＥＢＮのいずれかに対して行った。片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮをＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮに対して、タンパク質含量に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ対照は、各コンペティターのものと同じタンパク質量を有することになる）。測定されたように、１０％のコンペティターＡ ＥＢＮは、４．３９％のＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮと同等であった。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、４．３９％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＡ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＡ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＡ」と称した。コンペティターＢに関しても同様に、１０％のコンペティターＢ ＥＢＮは、３．３５％のＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮと同等であった。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、３．３５％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＢ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＢ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＢ」と称した。もう片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮをＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮと、体積に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち、１０％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮを、１０％のコンペティターＥＢＮと体積で比較することになる）。関連実験を実施し、かつデータ分析する間は、研究者にはコンペティターＡおよびＢの識別について知らせなかった。
【0135】
要約すると、新規なＥＢＮ抽出方法が述べられ、かつ本発明のＥＢＮ抽出物は、ヒト赤血球に対するインフルエンザＡの血球凝集を阻害し、かつベロ細胞において感染力を低下できることが認められた。ＥＢＮ抽出物（ＳＦ－ＥＢＮ）の可溶性の分画を使用して、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２に関してそれぞれ最小濃度が０．５ｇ／ｌおよび１ｇ／ＬのＥＢＮが血球凝集を阻害できることが示された。インフルエンザＨ１Ｎ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ感染力に関しては、ＳＦ－ＥＢＮを０．０３から２ｇ／ｌの間の濃度でベロ細胞培養物へ添加すると、ＳＦ－ＥＢＮが補充されていない培養物と比較したときに、得られたウィルス力価が少なくとも、１／２に減少したことが示される。市販のＥＢＮ溶液でも、インフルエンザＡを用いた血球凝集阻害アッセイで試験を行った。これらのＥＢＮ溶液には、細胞に対して細胞毒性を有すること、または検出可能な抗インフルエンザウィルス活性をまったく示さないことのいずれかが認められた。結論として、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ専売ＥＢＮ抽出物は、インフルエンザウィルス感染の予防において強力でありかつ優れている。
【0136】
結果
ＳＦ－ＥＢＮの、細胞およびインフルエンザウィルス複製に対する効果を試験する前に、以下の表１で示すように、標準としてウシ血清を用いた可溶性タンパク質アッセイを行った。これにより、さまざまな原料とＥＢＮ抽出方法との間のその後の比較に関する基準点が与えられることになる。
ＳＦ－ＥＢＮの、細胞およびインフルエンザウィルス複製に対する効果を試験する前に、以下の表１で示すように、標準としてウシ血清を用いた可溶性タンパク質アッセイを行った。これにより、さまざまな原料とＥＢＮ抽出方法との間のその後の比較に関する基準点が与えられることになる。
【0137】
【表3】
【0138】
ＥＢＮのベロ細胞成長に対する効果
４つのＳＦ－ＥＢＮ濃度（３．３ｇ／ｌ（１０％ｖ／ｖ）、１．６５ｇ／ｌ（５％ｖ／ｖ）、０．８３ｇ／ｌ（２．５％ｖ／ｖ）、および０．３３ｇ／ｌ（１％ｖ／ｖ））の、組織培養プレートのベロ細胞成長に対するそれらの効果に関して試験を行った。図２で示すように、ＳＦ－ＥＢＮは、ＳＦ－ＥＢＮを含まない対照と比較したときにベロ細胞成長を濃度依存的様式で促進した。３．３ｇ／ｌ ＳＦ－ＥＢＮの存在下で、ベロ細胞は、３日目にコンフルエントな細胞密度（約５×ｌ０５個細胞／ｃｍ２）に達し、対照よりも早かった（４日目）。ＥＧＦが、ベロ細胞が成長に必要とする既知の必須成長因子である場合、成長促進は、ＥＢＮ抽出物に認められるＥＧＦ様分子の存在と関連し得る。
４つのＳＦ－ＥＢＮ濃度（３．３ｇ／ｌ（１０％ｖ／ｖ）、１．６５ｇ／ｌ（５％ｖ／ｖ）、０．８３ｇ／ｌ（２．５％ｖ／ｖ）、および０．３３ｇ／ｌ（１％ｖ／ｖ））の、組織培養プレートのベロ細胞成長に対するそれらの効果に関して試験を行った。図２で示すように、ＳＦ－ＥＢＮは、ＳＦ－ＥＢＮを含まない対照と比較したときにベロ細胞成長を濃度依存的様式で促進した。３．３ｇ／ｌ ＳＦ－ＥＢＮの存在下で、ベロ細胞は、３日目にコンフルエントな細胞密度（約５×ｌ０５個細胞／ｃｍ２）に達し、対照よりも早かった（４日目）。ＥＧＦが、ベロ細胞が成長に必要とする既知の必須成長因子である場合、成長促進は、ＥＢＮ抽出物に認められるＥＧＦ様分子の存在と関連し得る。
【0139】
ＥＢＮ抽出物の、インフルエンザウィルス感染に対する阻害効果
ＳＦ－ＥＢＮの、インフルエンザウィルスの表面に位置し、赤血球と相互作用する血球凝集素分子の能力に対する阻害効果を判定するために、インフルエンザウィルスの濃度を定量化するために通常使用されるアッセイである、血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを行った。１６および８ＨＡＵ／５０μｌの２つのウィルス濃度を調製した（８ＨＡＵ／５０μｌは、ＷＨＯ検査手順（WHO laboratory procedure）に記載されているインフルエンザウィルスの血清学的検出のための推奨濃度である）。図３で示すように、２倍連続希釈のＳＦ－ＥＢＮ（縦列２～１２）をヒト赤血球と混合してから、インフルエンザウィルスを、１６および８ΗΑＵ／５０μｌ（上述の）の２つの濃度で９６ウェルプレートに添加した。インフルエンザウィルスと結合しない赤血球はウェルの底部に沈み、赤色ボタン様物質が形成されることになる。ウィルスが赤血球へ結合する場合、格子が形成された。血球凝集は、試験された２つのインフルエンザウィルス濃度に関しては２７倍希釈まで観察されなかった。その希釈に対応するＳＦ－ＥＢＮ濃度は０．５ｇ／ｌである。これは、この濃度０．５ｇ／ｌ（低くはないが）で、ＥＢＮが血球凝集を阻止することを示す。実験は、図４で示すように、インフルエンザＨ３Ｎ２を使用して繰り返した。高ＳＦ－ＥＢＮ濃度の２．１ｇ／Ｌおよび１．０ｇ／Ｌがそれぞれ、濃度１６および８ＨＡＵ／５０μｌのＨ３Ｎ２ウィルスの存在下で、血球凝集を阻止するのに必要であった。これらの結果は、ＥＢＮ抽出物はウィルス性血球凝集素分子と競合し（ヒト赤血球の血球凝集によって測定される）、インフルエンザウィルス感染力を低下させることができる（特異的抗血清の活性と同様である）ことを実証する。
ＳＦ－ＥＢＮの、インフルエンザウィルスの表面に位置し、赤血球と相互作用する血球凝集素分子の能力に対する阻害効果を判定するために、インフルエンザウィルスの濃度を定量化するために通常使用されるアッセイである、血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを行った。１６および８ＨＡＵ／５０μｌの２つのウィルス濃度を調製した（８ＨＡＵ／５０μｌは、ＷＨＯ検査手順（WHO laboratory procedure）に記載されているインフルエンザウィルスの血清学的検出のための推奨濃度である）。図３で示すように、２倍連続希釈のＳＦ－ＥＢＮ（縦列２～１２）をヒト赤血球と混合してから、インフルエンザウィルスを、１６および８ΗΑＵ／５０μｌ（上述の）の２つの濃度で９６ウェルプレートに添加した。インフルエンザウィルスと結合しない赤血球はウェルの底部に沈み、赤色ボタン様物質が形成されることになる。ウィルスが赤血球へ結合する場合、格子が形成された。血球凝集は、試験された２つのインフルエンザウィルス濃度に関しては２７倍希釈まで観察されなかった。その希釈に対応するＳＦ－ＥＢＮ濃度は０．５ｇ／ｌである。これは、この濃度０．５ｇ／ｌ（低くはないが）で、ＥＢＮが血球凝集を阻止することを示す。実験は、図４で示すように、インフルエンザＨ３Ｎ２を使用して繰り返した。高ＳＦ－ＥＢＮ濃度の２．１ｇ／Ｌおよび１．０ｇ／Ｌがそれぞれ、濃度１６および８ＨＡＵ／５０μｌのＨ３Ｎ２ウィルスの存在下で、血球凝集を阻止するのに必要であった。これらの結果は、ＥＢＮ抽出物はウィルス性血球凝集素分子と競合し（ヒト赤血球の血球凝集によって測定される）、インフルエンザウィルス感染力を低下させることができる（特異的抗血清の活性と同様である）ことを実証する。
【0140】
また、ＳＦ－ＥＢＮの、ベロ細胞のインフルエンザウィルス感染の阻害に対する効果を調べた。コンフルエントなベロ細胞に、インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１（０．００１のＭＯＩ）を、２ｇ／ｌ、０．２６ｇ／ｌおよび０．０３ｇ／ｌのＳＦ－ＥＢＮの存在下で感染させた。感染してから２４時間後、培養物上澄みを収集して、血球凝集アッセイを使用し、ウィルス力価を定量化した。以下の表２で示すように、０．０３から２ｇ／ｌの間のＳＦ－ＥＢＮ濃度は、Ｈ１Ｎ１ウィルス力価において約１／２までの減少を示した。これは、ＥＢＮ抽出物が、インフルエンザウィルスの感染力（ベロ細胞を使用した）を低下させることができることを示す。
【0141】
【表4】
【0142】
コンペティター製ＳＦ－ＥＢＮの抗ウィルス効果に関する評価
２つの市販されているＥＢＮ溶液（コンペティターＡおよびＢ）を抗ウィルス活性判定用に選択した。以下の表３で示すように、これらの市販のＥＢＮ溶液は、ＳＦ－ＥＢＮよりも低い可溶性タンパク質濃度およびオスモル濃度を示した。
２つの市販されているＥＢＮ溶液（コンペティターＡおよびＢ）を抗ウィルス活性判定用に選択した。以下の表３で示すように、これらの市販のＥＢＮ溶液は、ＳＦ－ＥＢＮよりも低い可溶性タンパク質濃度およびオスモル濃度を示した。
【0143】
【表5】
【0144】
したがって、ＳＦ－ＥＢＮを水で希釈し、血球凝集アッセイ用の市販のＥＢＮ溶液の可溶性タンパク質濃度と一致させた。細胞に対して細胞毒性が認められたために、コンペティターＡ ＥＢＮ溶液をアッセイから除外したが、もう一方のＥＢＮ溶液（コンペティターＢ）は成長阻害効果を示さなかった。血球凝集アッセイの結果を図６に示す。市販のＥＢＮ溶液（コンペティターＢ）は、赤血球のＨ１Ｎ１ウィルス介在性血球凝集の予防に活性をまったく示さないことが認められた。これはこの市販のＥＢＮ溶液が、ＳＦ－ＥＢＮで示されるような抗ウィルス特性を有さないことを示す。ＥＢＮが抗インフルエンザウィルス活性を有することは既知であるため、ＥＢＮを抽出する新規な方法が、抗ウィルス特性の予防において優れた特質によって開発されたことを結論づけることができる。
【0145】
ＥＢＮ抽出物の、ヒト神経前駆細胞成長および分化に対する効果
１．材料および方法
１．１ヒト神経前駆物質の誘導および維持
ヒト神経前駆物質（ｈＮＰＣ）を、微小担体懸濁培養物を使用することによって、ヒト胚幹細胞株（ｈＥＳＣ）ＨＥＳ－３から得た。その後、次いでｈＮＰＣをｇｅｌｔｒｅｘ被覆プレートで成長させ、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＮＰＣ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、１×ＮＥＡＡ、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×Ｎ２、ビタミンＡ不含１×Ｂ２７、すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を加えた。
１．材料および方法
１．１ヒト神経前駆物質の誘導および維持
ヒト神経前駆物質（ｈＮＰＣ）を、微小担体懸濁培養物を使用することによって、ヒト胚幹細胞株（ｈＥＳＣ）ＨＥＳ－３から得た。その後、次いでｈＮＰＣをｇｅｌｔｒｅｘ被覆プレートで成長させ、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補充されたＮＰＣ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、１×ＮＥＡＡ、１×ペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×Ｎ２、ビタミンＡ不含１×Ｂ２７、すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を加えた。
【0146】
培地を１日おきに交換した。細胞が約８０～９０％の培養密度に達したときに、ｈＮＰＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して継代した。
【0147】
１．２ヒト神経前駆物質の細胞成長および細胞計数
ｈＮＰＣを、２０００個細胞／ウェルの密度で、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆４８ウェルプレートに蒔き、１週間成長させた。ｈＮＰＣに、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ）およびＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物の異なる組合せが補充されたＮＰＣ培地を加えた。次いで、細胞を溶解して、すべてのかつ生存可能な細胞を、ＤＡＰＩを用いた核計数方法で、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）によって、製造業者の取扱説明書に従って計数した。
ｈＮＰＣを、２０００個細胞／ウェルの密度で、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆４８ウェルプレートに蒔き、１週間成長させた。ｈＮＰＣに、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ）およびＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物の異なる組合せが補充されたＮＰＣ培地を加えた。次いで、細胞を溶解して、すべてのかつ生存可能な細胞を、ＤＡＰＩを用いた核計数方法で、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）によって、製造業者の取扱説明書に従って計数した。
【0148】
１．３ヒト神経前駆物質の細胞増殖および分化
ｈＮＰＣを、１５０，０００個細胞／ウェルの密度で、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆６ウェルプレートに蒔き、１週間および３週間成長させた。ｈＮＰＣに、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ）およびＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物の異なる組合せが補充されたＮＰＣ培地を加えた。培養期間中、細胞が８０％の培養密度に達したときに、ｈＮＰＣを継代した。タイムポイント（１週目および３週目）で、Ｔｒｙｐｌｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｈＮＰＣを単一細胞に解離した。その後、細胞を固定し、透過性にし、細胞増殖用の一次抗体、Ａｎｔｉ－Ｋｉ－６７（１：２００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および神経分化評価用の抗チューブリンβ３（１：１０００、Ｃｏｖａｎｃｅ）とインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（登録商標）ヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を二次抗体として使用した。すべてのインキュベートを４℃で２０分間行った。蛍光測定を、フローサイトメーター（ＧＵＡＶＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。
ｈＮＰＣを、１５０，０００個細胞／ウェルの密度で、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆６ウェルプレートに蒔き、１週間および３週間成長させた。ｈＮＰＣに、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ）およびＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物の異なる組合せが補充されたＮＰＣ培地を加えた。培養期間中、細胞が８０％の培養密度に達したときに、ｈＮＰＣを継代した。タイムポイント（１週目および３週目）で、Ｔｒｙｐｌｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｈＮＰＣを単一細胞に解離した。その後、細胞を固定し、透過性にし、細胞増殖用の一次抗体、Ａｎｔｉ－Ｋｉ－６７（１：２００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および神経分化評価用の抗チューブリンβ３（１：１０００、Ｃｏｖａｎｃｅ）とインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（登録商標）ヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を二次抗体として使用した。すべてのインキュベートを４℃で２０分間行った。蛍光測定を、フローサイトメーター（ＧＵＡＶＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。
【0149】
２．結果
本研究において、ＥＢＮ抽出物が、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）由来のｈＮＰＣの増殖を維持できるかどうかを調べた。図１０で示すように、ＦＧＦ－２およびＥＧＦの存在下で培養されたｈＮＰＣは、７日後に最も高い細胞収率を示した。成長因子ＦＧＦ－２と組み合わせたＥＢＮ抽出物は、ＦＧＦ－２＋ＥＧＦおよびＦＧＦ－２単独の条件でのものに匹敵する細胞成長プロファイルに達した。ＦＧＦ－２を含まないＥＢＮを添加すると、より低い細胞成長となっている。結果より、ＥＢＮ抽出物は、ｈＮＰＣ増殖に関して最も重要な成長因子であるＦＧＦ２の代わりにはなれないことが示唆された。一方、ＥＢＮは、ＥＢＮ抽出物の無血清培地におけるヒト間葉幹細胞の増殖に対する効果を記載した報告で示されているＥＧＦ様活性を含んでいたが、ＦＧＦ－２の存在下、ｈＮＰＣの短期間の増殖においてＥＢＮ抽出物の有益な効果は観察されなかった。
本研究において、ＥＢＮ抽出物が、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）由来のｈＮＰＣの増殖を維持できるかどうかを調べた。図１０で示すように、ＦＧＦ－２およびＥＧＦの存在下で培養されたｈＮＰＣは、７日後に最も高い細胞収率を示した。成長因子ＦＧＦ－２と組み合わせたＥＢＮ抽出物は、ＦＧＦ－２＋ＥＧＦおよびＦＧＦ－２単独の条件でのものに匹敵する細胞成長プロファイルに達した。ＦＧＦ－２を含まないＥＢＮを添加すると、より低い細胞成長となっている。結果より、ＥＢＮ抽出物は、ｈＮＰＣ増殖に関して最も重要な成長因子であるＦＧＦ２の代わりにはなれないことが示唆された。一方、ＥＢＮは、ＥＢＮ抽出物の無血清培地におけるヒト間葉幹細胞の増殖に対する効果を記載した報告で示されているＥＧＦ様活性を含んでいたが、ＦＧＦ－２の存在下、ｈＮＰＣの短期間の増殖においてＥＢＮ抽出物の有益な効果は観察されなかった。
【0150】
増殖したｈＮＰＣのさらなる分析を行った。図１０Ｂで示すように、ＦＧＦ－２およびＥＢＮ抽出物を含むＮＰＣ培養物は、細胞増殖マーカー、ｋｉ６７および神経分化マーカー、ベータ－チューブリンを発現する同様の細胞集団を示した。ＦＧＦ－２を含まないＥＢＮ抽出物添加培養物は、低値のｋｉ６７および高値のベータ－チューブリン細胞集団を示した。ｋｉ６７の傾向は、ＥＢＮ抽出物が、ＦＧＦ－２なしでＮＰＣ成長を維持できなかった細胞成長研究と一致した。低値のｋｉ６７発現レベルは、神経分化の発生時に細胞増殖の減少が生じるという既に報告されている現象と一致する。
【0151】
研究を３週間延長した。図１１で示すように、ＦＧＦ－２と組み合わせたＥＢＮ抽出物は、ＦＧＦ－２のみを含む培養物よりも高収率を示すようであった。細胞増殖マーカーｋｉ６７の発現は、すべての条件下で、初期培養物と同様であった。しかし、神経分化マーカー（ベータ－チューブリン）は、ＥＢＮ抽出物が補充され、ＦＧＦ－２を含まないｈＮＰＣ培養物で有意に増加し、ＥＧＦおよびＦＧＦ－２の両方を含まない培養物と同様のレベルに到達したことが認められた。増加したベータチューブリン陽性細胞集団は神経細胞の発達を示した。これは、神経細胞形態（軸索伸張）が、高ベータ－チューブリン発現を伴う培養物で顕著となった図１２に示す細胞形態画像と一致した。ｈＮＰＣは、１０％ＥＢＮ抽出物＋ＦＧＦの条件で成長したときに、その典型的な形態を維持した。
【0152】
最後に、本ＥＢＮ抽出物はＥＧＦ様構成成分を含み、これがｈＮＰＣの長期培養に有益であり得ることができることが本発明者らの研究によって示される。考えられ得るさらなる研究のうちの１つは、ＥＢＮ抽出物を画分し、ＥＧＦ様構成成分をさらなる特性評価用に単離することである。
【0153】
ＥＢＮ抽出物の、細胞培養物、細胞成長および軟骨形成性アッセイに対する効果
１．２．１．ｈＭＳＣ細胞培養
ｈＭＳＣ（８～９代継代）を、２４００～２８００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｔ１７５ｃｍ２細胞培養フラスコまたはＮｕｎｃ（商標）ＥａｓｙＦｉｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍのいずれかの、最小必須培地α、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ製）からなるＭＳＣ成長培地に蒔いた。培地を２～３日おきに交換した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で５分間使用して採取した場合、ｈＭＳＣは約７０％培養密度で継代された。自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて生存率および細胞計数アッセイを行った。すべての培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。ウェルプレート設計を示す以下の表を参照されたい。
１．２．１．ｈＭＳＣ細胞培養
ｈＭＳＣ（８～９代継代）を、２４００～２８００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｔ１７５ｃｍ２細胞培養フラスコまたはＮｕｎｃ（商標）ＥａｓｙＦｉｌｌ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍのいずれかの、最小必須培地α、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（すべてＧｉｂｃｏ製）からなるＭＳＣ成長培地に蒔いた。培地を２～３日おきに交換した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を３７℃で５分間使用して採取した場合、ｈＭＳＣは約７０％培養密度で継代された。自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて生存率および細胞計数アッセイを行った。すべての培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。ウェルプレート設計を示す以下の表を参照されたい。
【0154】
【表6】
【0155】
１．２．２．細胞成長曲線用のｈＭＳＣ細胞増殖
ｈＭＳＣを、１０００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ２４ウェルプレートに蒔いた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、４日間培養した。ｈＭＳＣは、いずれの成長因子も含まないＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地のみで成長させ、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物を陰性対照として使用し、それは「成長因子不含」として既知であった。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣをまた、陰性対照として使用し、また「３成長因子」と称した。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣを、陽性対照として使用し、また「４成長因子」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣを試験し、それを「３成長因子＋１０％ＥＢＮ」と称した。１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を１日目に添加した。細胞計数アッセイを、各条件に関して、自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて毎日３回行った。すべての培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。
ｈＭＳＣを、１０００個細胞／ｃｍ２の密度で、Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）Ｄｅｌｔａ Ｓｕｒｆａｃｅ２４ウェルプレートに蒔いた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、４日間培養した。ｈＭＳＣは、いずれの成長因子も含まないＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地のみで成長させ、ＧｅｎｅＯａｓｉｓ Ｐｔｅ Ｌｔｄ ＥＢＮ抽出物を陰性対照として使用し、それは「成長因子不含」として既知であった。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣをまた、陰性対照として使用し、また「３成長因子」と称した。１０ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ－１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦβ（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＢＴＩ専売無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣを、陽性対照として使用し、また「４成長因子」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む無血清ＭＳＣ成長培地で成長したｈＭＳＣを試験し、それを「３成長因子＋１０％ＥＢＮ」と称した。１０％ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を１日目に添加した。細胞計数アッセイを、各条件に関して、自動ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ－３０００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を用いて毎日３回行った。すべての培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃で維持した。
【0156】
１．２．３．軟骨形成性分化
ｈＭＳＣを、透明丸底超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、軟骨形成性分化用にマイクロマスペレットとして成長させた。ペレットを、１０００ｒｐｍの遠心分離によって、室温（ｒｔｍ）で５分間、１ウェルあたり１ペレットあたり２×１０５ｈＭＳＣを使用して形成した。これらを、ＤＭＥＭ－高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎΜデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１％ＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ－プロリン（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む軟骨形成性分化培地で培養した。本発明の抽出物を含まない軟骨形成性分化培地のみで成長したペレットを陰性対照として使用した。異なる濃度（１．２５％、２．５％、５％および１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＥＢＮを含む軟骨形成性分化培地で成長したペレットの試験を行った。１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２が補充された軟骨形成性分化培地で成長したペレットを陽性対照として使用した。補充されたまたは補充されていない軟骨形成性培地を２～３日おきに交換した。
ｈＭＳＣを、透明丸底超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、軟骨形成性分化用にマイクロマスペレットとして成長させた。ペレットを、１０００ｒｐｍの遠心分離によって、室温（ｒｔｍ）で５分間、１ウェルあたり１ペレットあたり２×１０５ｈＭＳＣを使用して形成した。これらを、ＤＭＥＭ－高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎΜデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ｍＭ Ｌ－アスコルビン酸－２－ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、１％ＩＴＳ＋１（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ－プロリン（Ｓｉｇｍａ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含む軟骨形成性分化培地で培養した。本発明の抽出物を含まない軟骨形成性分化培地のみで成長したペレットを陰性対照として使用した。異なる濃度（１．２５％、２．５％、５％および１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＥＢＮを含む軟骨形成性分化培地で成長したペレットの試験を行った。１００ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ２が補充された軟骨形成性分化培地で成長したペレットを陽性対照として使用した。補充されたまたは補充されていない軟骨形成性培地を２～３日おきに交換した。
【0157】
１．２．４．ＤＮＡ、ＧＡＧおよびコラーゲンＩＩ含量の評価
ペレット（１時点あたり１条件あたり少なくとも３個）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回すすいでから、すぐに－８０℃で保管した。解凍後、ペレットを、ＤＮＡおよびＧＡＧ定量化の場合は０．１２５ｍｇ／ｍｌパパインを用いて６５℃で一晩消化するか、コラーゲンＩＩ評価の場合は、０．１ｍｇ／ｍｌペプシンを用いて４℃で２晩消化し、続いて０．１ｍｇ／ｍｌエラスターゼによって４℃で一晩消化するかのいずれかを行った。ＤＮＡ定量化を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙを使用して行い、ＧＡＧ測定を、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して行い、かつコラーゲンＩＩ定量化をＥＬＩＳＡによってＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）に対して行い、すべて製造業者の取扱説明書に従った。すべての蛍光および可視光の読み取りはＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００を用いて行った。
１．２．５．統計的分析
ペレット（１時点あたり１条件あたり少なくとも３個）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回すすいでから、すぐに－８０℃で保管した。解凍後、ペレットを、ＤＮＡおよびＧＡＧ定量化の場合は０．１２５ｍｇ／ｍｌパパインを用いて６５℃で一晩消化するか、コラーゲンＩＩ評価の場合は、０．１ｍｇ／ｍｌペプシンを用いて４℃で２晩消化し、続いて０．１ｍｇ／ｍｌエラスターゼによって４℃で一晩消化するかのいずれかを行った。ＤＮＡ定量化を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙを使用して行い、ＧＡＧ測定を、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ）を使用して行い、かつコラーゲンＩＩ定量化をＥＬＩＳＡによってＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）に対して行い、すべて製造業者の取扱説明書に従った。すべての蛍光および可視光の読み取りはＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００を用いて行った。
１．２．５．統計的分析
【0158】
データを、統計ソフトウェアＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて分析した。異なる条件間での多重比較を、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、テューキーの多重比較検定を用いて統計的に比較した。すべての統計的検定に関して、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【0159】
１．２．６．本ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮのコンペティターＡ ＥＢＮおよびコンペティターＢ ＥＢＮとの比較
ｈＭＳＣを、１．２．２．で詳述されたような同様の方法で成長させた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、５日間培養した。２つのタイプの本ＥＢＮ抽出物の比較をコンペティターＡ ＥＢＮまたはコンペティターＢ ＥＢＮのいずれかに対して行った。片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮを本ＥＢＮ抽出物に対して、タンパク質含量に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち本ＥＢＮ抽出物対照は、各コンペティターのものと同じタンパク質量を有することになる）。測定されたように、１０％のコンペティターＡ ＥＢＮは、４．３９％の本ＥＢＮ抽出物と同等である。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、４．３９％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＡ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＡ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＡ」と称した。
ｈＭＳＣを、１．２．２．で詳述されたような同様の方法で成長させた。ｈＭＳＣを０日目に播種し、５日間培養した。２つのタイプの本ＥＢＮ抽出物の比較をコンペティターＡ ＥＢＮまたはコンペティターＢ ＥＢＮのいずれかに対して行った。片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮを本ＥＢＮ抽出物に対して、タンパク質含量に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち本ＥＢＮ抽出物対照は、各コンペティターのものと同じタンパク質量を有することになる）。測定されたように、１０％のコンペティターＡ ＥＢＮは、４．３９％の本ＥＢＮ抽出物と同等である。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、４．３９％ＧｅｎｅＯａｓｉｓ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＡ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＡ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＡ」と称した。
【0160】
コンペティターＢに関しても同様に、１０％のコンペティターＢ ＥＢＮは、３．３５％の本ＥＢＮ抽出物と同等である。したがって、３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、３．３５％の本ＥＢＮ抽出物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「ＧＯＢ」と称した。３成長因子（ＥＧＦを除く）が補充され、１０％コンペティターＢ ＥＢＮ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むＭＳＣ成長培地を試験し、それを「３成長因子＋１０％コンペティターＢ」と称した。もう片方のタイプの比較は、１０％のコンペティターＥＢＮを本ＥＢＮ抽出物と、体積に関して正規化または対照化することによって比較することであった（すなわち、１０％の本ＥＢＮ抽出物を、１０％のコンペティターＥＢＮと体積で比較することになる）。関連実験を実施し、かつデータ分析する間は、研究者にはコンペティターＡおよびＢの識別について知らせない。
【0161】
以下の表は、本ＥＢＮ抽出物を、コンペティターＡ ＥＢＮまたはコンペティターＢのいずれかと比較する方法の要約である。
【0162】
【表7】
【0163】
２．結果
本ＥＢＮ抽出物は、図１３～２４で示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞増殖中のヒト幹細胞増殖における増加を誘発することができる。
本ＥＢＮ抽出物は、図１３～２４で示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞増殖中のヒト幹細胞増殖における増加を誘発することができる。
【0164】
前述の発明を実施するための形態で述べたが、設計または構造の詳述に多くの変形または改良を、本発明から逸脱することなく行ってもよいことは関連技術における当業者であれば理解するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-B】
【図11A-B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
