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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-13
(45)【発行日】2022-07-22
(54)【発明の名称】ミスフォールディングタンパク質の検出
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20220714BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20220714BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
C07K14/47
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021081274
(22)【出願日】2021-05-12
(62)【分割の表示】P 2017533721の分割
【原出願日】2015-09-11
(65)【公開番号】P2022000629
(43)【公開日】2022-01-04
【審査請求日】2021-06-10
(31)【優先権主張番号】62/049,306
(32)【優先日】2014-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517087336
【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム
(73)【特許権者】
【識別番号】517085310
【氏名又は名称】アムプリオン，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ジャラ，クラウディオ ソートー
(72)【発明者】
【氏名】シャーナワーズ，モハンマド
(72)【発明者】
【氏名】レボビッツ，ラッセル エム．
(72)【発明者】
【氏名】ボールラス，ベネディクト ケー．
【審査官】西浦 昌哉
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００８／０１１８９３８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５０６５１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２４１９８４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】HERVA, M.E. et al.，Anti-Amyloid Compounds Inhibit α-Synuclein Aggregation Induced by Protein Misfolding Cyclic Amplifi，Journal of Biological Chemistry，2014年04月25日，Vol.289/No.17，pp.11897-11905
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトの生体試料中のα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）凝集物の存在を検出するための方法であって、（Ａ）ヒトの生体試料を準備するステップと；
（Ｂ）プレインキュベーション混合物を準備するステップであって、前記プレインキュベーション混合物が、
（１）モノマーα－ｓｙｎタンパク質、
（２）約６～約７．４のｐＨを有する緩衝組成物、
（３）１μＭ～５００ｍＭの総濃度の塩組成物、および
（４）チオフラビンＴ（ＴｈＴ）
を含む、ステップと；
（Ｃ）前記ヒトの生体試料と前記プレインキュベーション混合物を混ぜ合わせてインキュベーション混合物を形成させるステップと；
（Ｄ）前記インキュベーション混合物を断続的な攪拌サイクルでインキュベートして、インキュベートされた混合物を形成させるステップと；
（Ｅ）前記インキュベートされた混合物を、前記ＴｈＴを励起する波長の光で照射するステップと；
（Ｆ）インキュベーション中の蛍光のレベルを決定するステップであって、前記蛍光のレベルの増加が、前記ヒトの生体試料中のα－ｓｙｎ凝集物の存在を示す、ステップと；
を含む方法。
【請求項2】
前記緩衝組成物が、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
インキュベート前の前記インキュベーション混合物における前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質の総濃度が１μＭ～２００μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
インキュベート前の前記インキュベーション混合物における前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質の総濃度が約６．５４μＭ～約６５．４μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、化学合成、組換え生成、または非組換え生体試料からの抽出、のうちの１つによって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質が、全長の１４０アミノ酸のα－ｓｙｎタンパク質またはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記インキュベートが２２℃～４２℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記蛍光のレベルの増加が、攪拌サイクル前のインキュベーション混合物の蛍光のレベルと比較して、最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光の標準偏差の少なくとも２倍の最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光レベルの増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記塩組成物が、ＮａＣｌおよびＫＣｌのうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ヒトの生体試料が、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ；乳；粘液；粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙液；および尿のうちの１種または複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記ヒトの生体試料が脳脊髄液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ヒトの生体試料が血液および／または血漿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ヒトの生体試料が皮膚を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
α－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）凝集物を調製するための方法であって、（Ａ）ミスフォールディングα－ｓｙｎタンパク質を含むヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を準備するステップと；
（Ｂ）プレインキュベーション混合物を準備するステップであって、前記プレインキュベーション混合物が、
（１）モノマーα－ｓｙｎタンパク質、
（２）約６～約７．４のｐＨを有する緩衝組成物、および
（３）約５００ｍＭの総濃度のＮａＣｌ
を含む、ステップと；
（Ｃ）前記ヒトＣＳＦ試料と前記プレインキュベーション混合物を混ぜ合わせてインキュベーション混合物を形成させるステップと；
（Ｄ）前記インキュベーション混合物を断続的な攪拌サイクルでインキュベートすることにより前記ミスフォールディングα－ｓｙｎタンパク質で前記モノマーα－ｓｙｎタンパク質の凝集を誘導して、α－ｓｙｎ凝集物を含むインキュベートされた混合物を形成させるステップと；
を含む方法。
【請求項15】
前記プレインキュベーション混合物がチオフラビンＴ（ＴｈＴ）をさらに含む、請求項１４に記載の方法であって、（Ａ）前記インキュベートされた混合物を、前記ＴｈＴを励起する波長の光で照射するステップと；
（Ｂ）インキュベーション中の蛍光のレベルを決定するステップであって、前記蛍光のレベルの増加が、前記ヒトＣＳＦ試料中のα－ｓｙｎ凝集物の存在を示す、ステップと；
をさらに含む、方法。
【請求項16】
前記インキュベートされた混合物を、前記ＴｈＴを励起する波長の光で照射するステップが、約４３５ｎｍで照射することを含み、前記決定するステップが、約４８５ｎｍでＴｈＴの蛍光をモニタリングすることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記蛍光のレベルの増加が、攪拌サイクル前のインキュベーション混合物の蛍光のレベルと比較して、最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光の標準偏差の少なくとも２倍の最大蛍光での前記インキュベートされた混合物の蛍光レベルの増加である、請求項１５に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１１日出願の米国特許仮出願第６２／０４９，３０６号の優先権を主張するものであり、その出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０１４年９月１１日出願の米国特許仮出願第６２／０４９，３０６号の優先権を主張するものであり、その出願の内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
背景
タンパク質ミスフォールディング病（ＰＭＤ）としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、２型糖尿病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、全身性アミロイドーシス、プリオン病などが挙げられる。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。
タンパク質ミスフォールディング病（ＰＭＤ）としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、２型糖尿病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、全身性アミロイドーシス、プリオン病などが挙げられる。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。
【0003】
例えばアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）は、脳変性疾患であり、効果的処置または正確な前臨床診断を有さない。これまでに得られた証拠によって、ＡＤにおいて、例えばアミロイドベータタンパク質（Ａβ）のミスフォールディング、凝集、および脳内沈着は、ＡＤの病態を惹起する因子であり得ることが示唆されている。Ａβ斑は元々、該疾患の特徴であると思われてきたが、現在の研究では、可溶性ＡβオリゴマーがＡＤの神経変性を誘発する重大なシナプス毒性種である可能性が示唆されている。脳は再生能力が低いため、ＰＭＤの初期診断が、不可逆的神経病理的変化を起こす前の介入を可能にするのに不可欠である。ミスフォールディングおよびオリゴマー化のプロセスが、臨床症状および実質的脳損傷の発生の数年または数十年前に開始し得ることが、複数のエビデンスで示されている。広く許容され、早期で感受性のある客観的検査室診断の欠如が、依然として、ＰＭＤに罹患する患者のケアに関する主要な問題である。
【0004】
本出願は、例えば関連疾患の診断のための、タンパク質ミスフォールディングの検出が、難解であるが興味をそそる試みになり得ることを認識している。
【発明の概要】
【0005】
概要
一実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該方法は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外され得る。
一実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該方法は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外され得る。
【0006】
別の実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料をチオフラビンＴおよびモル過剰のモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該モル過剰は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの量よりも大きくなり得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を振とうすることを含み得る。該方法はまた、可溶性ミスフォールディングタンパク質に対応するチオフラビンＴの蛍光を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外されている。
【0007】
一実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料から可溶性ミスフォールディングタンパク質を捕捉することを含み得る。該方法は、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質をモル過剰のモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該モル過剰は、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの量よりも大きくなり得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該方法はまた、可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質は、捕捉された可溶性ミスフォールディングモノマーおよび捕捉された可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外されている。
【0008】
別の実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するキットが、提供される。該キットは、既知量のモノマーフォールディングタンパク質と、既知量の可溶性ミスフォールディングタンパク質指示薬と、を含み得る。該キットは、取扱説明書を含み得る。該取扱説明書で、試料を、既知量のモノマーフォールディングタンパク質および既知量の可溶性ミスフォールディングタンパク質指示薬のうちの１つまたは複数と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することがユーザに指導され得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該取扱説明書で、可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することがユーザに指導され得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外され得る。
【0009】
試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するために本明細書に開示された方法およびキットは、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の非存在を判定するのに効果的になり得る。
【0010】
本明細書の一部に取り込まれ、それを構成する添付の図面は、例示的方法および結果を示しており、例示的実施形態を示すために用いられているに過ぎない。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】インキュベーションの０時間、５時間、１０時間、および２４時間目に撮影された電子顕微鏡写真を示す。
【図1B】可溶性オリゴマーＡβタンパク質凝集物のウェスタンブロットである。
【図2A】実施例１の様々な濃度の合成可溶性オリゴマーＡβタンパク質がシードとなった、時間の関数としてＴｈＴ蛍光によって測定された非増幅アミロイド形成を示すグラフである。
【図2B】実施例１の様々な濃度の合成可溶性オリゴマーＡβタンパク質がシードとなった、時間の関数としてＴｈＴ蛍光によって測定された増幅サイクル促進アミロイド形成を示すグラフである。
【図3A】ＡＤ、ＮＮＤ、およびＮＡＮＤ群から得られた代表的試料５つのＣＳＦがシードとなったＡβ凝集の平均反応速度を示す、ＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。
【図3B】ＡＤ、ＮＮＤ、およびＮＡＮＤ群から得られた試料の存在下でのＡβ凝集のための時間単位での誘導期時間のグラフである。
【図3C】ＡＤ、ＮＮＤ、およびＮＡＮＤ患者から得られたＣＳＦ試料の存在下での１８０Ａβ－ＰＭＣＡサイクル、即ち９０時間のインキュベーション（Ｐ９０）の後に得られたアミロイド形成の度合いを示すグラフである。
【図4D】図３Ｂに示された誘導期の値を利用した、異なるカットオフポイントでの偽陽性率（特異度）の関数としての真陽性率（感度）のプロットであり、図４Ａ～４Ｃの群比較の異なる組み合わせについての最も信頼できるカットオフポイントを推定している。
【図5】表１は、誘導期数を利用して計算されたＡβ－ＰＭＣＡテストの感度、特異度および予測値の推定を示す。
【図6】ＡＤおよび対照患者から得られたＣＳＦ試料の存在下での３００Ａβ－ＰＭＣＡサイクル、即ち１５０時間のインキュベーション（Ｐ９０）の後に得られた試料の時間単位での誘導期時間のグラフである。
【図7A】ヒトＣＳＦに添加された合成によって調製したＡβオリゴマーを用いた免疫枯渇の結果を示すウェスタンブロットである。
【図7B】対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料がシードとなったＡβ凝集の反応速度を示すグラフである。
【図7C】Ａ１１コンフォメーション抗体のみで枯渇された、対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料がシードとなったＡβ凝集の反応速度を示すグラフである。
【図8A】複合的生体試料に由来するＡβオリゴマーを捕捉するために用いられるＥＬＩＳＡ固相法の略図である。
【図8B】複合的生体試料に由来するＡβオリゴマーを捕捉するために用いられる磁気ビーズ固相法の略図である。
【図9】表２は、Ａβオリゴマーを捕捉する特異的抗体の能力を示す。
【図10】ヒト血漿に添加された異なる量の合成オリゴマーの存在によるＡβ凝集の促進を示すアミロイド形成対時間のグラフである。
【図11】ＡＤ患者および対照から得られた血漿試料の存在下でのＡβ－ＰＭＣＡアッセイにおいて５０％凝集に達するまでの時間を示すグラフである。
【図12】プロテアーゼ消化後のウェスタンブロットによってモニタリングされた異なる量の合成Ａβオリゴマーの存在下でのインキュベーション／超音波処理サイクルによるＡβ凝集の増幅結果を示すウェスタンブロットである。
【図13A】ＰＤ－ＰＭＣＡによるαＳシードの検出を示すチオフラビンＴ蛍光対時間のグラフである。
【図13B】示された量のαＳシードの関数としてプロットされた５０％凝集に達するまでの時間のグラフである。
【図14】アルツハイマー病（ＡＤ）または非神経変性疾患（ＮＮＤ）を有する対照に対する、ＰＤ－ＰＭＣＡによるヒトＰＤ患者から得られたＣＳＦ試料中のαＳシードの検出を示す。
【図15】表３は、αＳオリゴマーを捕捉する異なる配列またはコンフォメーション抗体の能力を実証する。
【図16A】αＳオリゴマーを捕捉するために用いられるＥＬＩＳＡ固相法の略図である。
【図16B】αＳオリゴマーを捕捉するために用いられる磁気ビーズ固相法の略図である。
【図17A】Ｎ－１９αＳ抗体を用いたヒト血漿に由来するαＳオリゴマーの免疫沈降／凝集の結果を示すグラフである。
【図17B】２１１αＳ抗体を用いたヒト血漿に由来するαＳオリゴマーの免疫沈降／凝集の結果を示すグラフである。
【図17C】Ｃ－２０αＳ抗体を用いたヒト血漿に由来するαＳオリゴマーの免疫沈降／凝集の結果を示すグラフである。
【図18A】ＣＳＦ試料中のαＳシードの検出のための対照試料における結果を示すグラフである。
【図18B】ＣＳＦ試料中のαＳシードの検出のためのＰＤ患者における結果を示すグラフである。
【図18C】ＣＳＦ試料中のαＳシードの検出のための多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者における結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
詳細な記載
タンパク質ミスフォールディング病（ＰＭＤ）の診断のためなど、試料中のミスフォールディングタンパク質の検出のための方法およびキットが提供される。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。例えばＰＭＤとしては、アルツハイマー病（ＡＤ）または全身性アミロイドーシスなどのアミロイドーシス；パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症などのシヌクレイン病；多系統萎縮症；シヌクレイン関連神経軸索ジストロフィー；２型糖尿病；ハンチントン病（ＨＤ）などのトリプレットリピート病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などを挙げることができる。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。
タンパク質ミスフォールディング病（ＰＭＤ）の診断のためなど、試料中のミスフォールディングタンパク質の検出のための方法およびキットが提供される。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。例えばＰＭＤとしては、アルツハイマー病（ＡＤ）または全身性アミロイドーシスなどのアミロイドーシス；パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症などのシヌクレイン病；多系統萎縮症；シヌクレイン関連神経軸索ジストロフィー；２型糖尿病；ハンチントン病（ＨＤ）などのトリプレットリピート病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などを挙げることができる。異なるタンパク質のミスフォールディング凝集物が、形成および蓄積される場合がある。ミスフォールディング凝集物は、数ある影響の中で、細胞機能不全および組織損傷を誘発し得る。
【0013】
幾つかの実施形態において、ＰＭＤには、感染性プリオン病、例えば伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）が除外され得る。そのような伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、ヒトおよび動物が罹患する感染性神経変性疾患の一群である。例えばヒトＴＳＥ病としては、クロイツフェルト・ヤコブ病およびその亜種（ＣＪＤ、ｖＣＪＤ）、クールー病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、ならびに致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）を挙げることができる。動物のＴＳＥ病としては、ヒツジおよびヤギ（スクレーピー）；ウシ（牛海綿状脳症、ＢＳＥ）；ヘラジカ、オジロジカ、ミュールジカおよびアカシカ（慢性ウェイスティング病、ＣＷＤ）；ミンク（伝達性ミンク脳症、ＴＭＥ）；ネコ（ネコ海綿状脳症、ＦＳＥ）；ニアラおよびより大きなクーズー（外来性有蹄類脳症、ＥＵＥ）などを挙げることができる。
【0014】
本明細書で用いられる「モノマータンパク質」および「可溶性ミスフォールディングタンパク質」は、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外されている。本明細書で用いられる「プリオン」は、ＴＳＥを誘発することが知られるミスフォールディングタンパク質である。プリオンタンパク質（ＰｒＰ）は、複数のアイソフォーム：正常型、一般的、または細胞性アイソフォーム（ＰｒＰＣ）；プロテアーゼ耐性アイソフォーム（ＰｒＰｒｅｓ）；感染性または「スクレーピー」アイソフォーム（ＰｒＰＳｃ）などに関連づけることができる。
【0015】
タンパク質ミスフォールディング循環増幅（ＰＭＣＡ）という方法は、インビトロでのミスフォールディングおよび凝集プロセスの人工的促進および増幅を通してミスフォールディング凝集物の超高感度な検出を提供し得る。ＰＭＣＡの基本的概念が、過去に開示された（それぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられる、Ｓｏｔｏ ｅｔ ａｌ， ＷＯ２００２／０４９５４号；Ｅｓｔｒａｄａ， ｅｔ ａｌ． 米国特許出願公開第２００８０１１８９３８号）。しかし本明細書の出願日より前に、ＰＭＤの診断のためなど、試料中のプリオン以外の可溶性ミスフォールディングタンパク質の増幅および検出のためのＰＣＭＡを可能にした特許出願はない。本明細書では、ＰＭＤ患者に見出され得る通り、可溶性ミスフォールディングタンパク質の検出のためのＰＭＣＡ技術を可能にする特定の実施例および詳細を開示する。
【0016】
様々な実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。本明細書に記載された通り、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法およびキットは、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の非存在を判定するのに効果的になり得る。本明細書に記載された可溶性ミスフォールディングタンパク質は、例えばＰＭＤに関連する様々な神経病変を誘発または誘導する、病原性タンパク質であり得る。該方法は、試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、例えばミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させること、を含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該方法は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外され得る。
【0017】
本明細書で用いられる「Ａβ」または「ベータアミロイド」は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の連続切断によって形成されたペプチドを指す。様々なＡβアイソフォームは、３８～４３アミノ酸残基を含み得る。Ａβタンパク質は、ＡＰＰが任意の組み合わせでβ－および／またはγ－セクレターゼによって処理されると、形成され得る。Ａβは、ＡＤに罹患した個体またはＡＤを有する疑いがある個体の脳におけるアミロイド斑の構成要素であり得る。様々なＡβアイソフォームが、包含され得、Ａベータ４０およびＡベータ４２に限定されない。様々なＡβペプチドが、ＡＤ関連の神経損傷に関連し得る。
【0018】
本明細書で用いられる「αＳ」または「アルファ－シヌクレイン」は、全長１４０アミノ酸のα－シヌクレインタンパク質、例えば「αＳ－１４０」を指す。他のアイソフォームまたは断片としては、「αＳ－１２６」、つまり例えばエクソン３の欠損により、残基４１～５４が欠如したアルファ－シヌクレイン－１２６；および「αＳ－１１２」、つまり例えばエクソン５の欠損により、残基１０３～１３０が欠如したアルファ－シヌクレイン－１１２を挙げることができる。αＳは、ＰＤに罹患した個体またはＰＤを有する疑いがある個体の脳内に存在し得る。様々なαＳアイソフォームが、包含され得、αＳ－１４０、αＳ－１２６、およびαＳ－１１２に限定されない。様々なαＳペプチドが、ＰＤ関連の神経損傷に関連し得る。
【0019】
本明細書で用いられる「タウ」は、単一遺伝子からの選択的スプライシングの産物、例えばヒトにおけるＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）であるタンパク質を指す。タウタンパク質は、タウのアイソフォームのいずれかの全長またはトランケート形態を包含する。様々なアイソフォームとしては、タウ遺伝子のエクソン２、３、および１０における選択的スライシングに対応するヒト脳組織内に存在することが知られる６つのタウアイソフォームが挙げられるが、これらに限定されない。３種のアイソフォームは、３つの結合ドメインを有し、他の３種は、４つの結合ドメインを有する。ミスフォールディングタウは、ＡＤに罹患した個体、またはＡＤもしくは他のタウパチーを有する疑いがある個体の脳内に存在し得る。
【0020】
本明細書で用いられる「ミスフォールディングタンパク質」は、生体系の典型的な非病的正常機能に関与する場合に存在するため、タンパク質の構造的コンフォメーションの全てまたは一部をもはや含まないタンパク質である。ミスフォールディングタンパク質は、凝集し得る。ミスフォールディングタンパク質は、タンパク質凝集物内に局在し得る。ミスフォールディングタンパク質は、非機能性タンパク質であり得る。ミスフォールディングタンパク質は、タンパク質の病原性配座異性体であり得る。モノマーフォールディングタンパク質組成物が、シードに関連するミスフォールディング、オリゴマー化、および凝集のための触媒活性を有さないネイティブの非病原的確認で提供され得る。モノマーフォールディングタンパク質組成物は、シード不含形態で提供され得る。
【0021】
本明細書で用いられる「モノマーフォールディングタンパク質」は、単一タンパク質分子を指す。「可溶性凝集ミスフォールディングタンパク質」は、溶液中に残存するモノマーミスフォールディングタンパク質の凝集を指す。可溶性ミスフォールディングタンパク質の例は、ミスフォールディングタンパク質が可溶性である限り、任意の数のタンパク質モノマーを含み得る。例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質は、モノマー、またはモノマータンパク質の２～約５０単位の凝集物を含み得る。
【0022】
モノマーおよび／または可溶性ミスフォールディングタンパク質は、凝集して、不溶性凝集物および／またはより高級オリゴマーを形成し得る。例えばＡβタンパク質の凝集は、プロトフィブリル、フィブリルを、そして最終的にはＡＤ対象において観察され得るアミロイド斑をもたらし得る。「シード」または「核」は、可溶性ミスフォールディングタンパク質または短い断片化フィブリル、特にさらなるミスフォールディング、オリゴマー化、および凝集のための触媒活性を有する可溶性ミスフォールディングタンパク質を指す。そのような核形成依存性凝集は、緩徐な誘導期を特徴とし得、その時期に凝集物が形成され得、その後さらなる凝集物およびより大きなポリマーの急速な形成を触媒し得る。誘導期は、あらかじめ形成された核またはシードの添加によって最小化または排除され得る。シードに関連するミスフォールディングおよび凝集の触媒活性を有さないモノマータンパク質組成物が、提供され得る。モノマータンパク質組成物は、シード不含形態で提供され得る。
【0023】
本明細書で用いられる「可溶性」種は、生理学的条件下の生体液中の溶液を形成し得るが、「不溶性」種は、生理学的条件下のそのような生体液中の沈殿物、フィブリル、沈着物、タングル、または他の非溶解形態として存在し得る。そのような生体液としては、例えば羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ；乳；粘液、例えば鼻分泌物；粘膜、例えば鼻粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙液；尿などのうちの１種または複数の流体、またはそれから搾出された流体を挙げることができる。不溶性種としては、例えばＡβ、αＳ、タウなどのフィブリルを挙げることができる。非生体液に溶解するが生理学的条件下での前述の生体液の１種には溶解しない種は、不溶性と見なされ得る。例えばＡβ、αＳ、タウなどのフィブリルは、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液などの界面活性剤の溶液に溶解され得るが、それでも生理学的条件下の上述の生体液の１種または複数には不溶性であり得る。
【0024】
幾つかの実施形態において、該試料には、Ａβ、αＳ、またはタウなどのミスフォールディングタンパク質の不溶性種が、生理学的条件下の上記生体液の１種または複数に不溶性になり得る沈殿物、フィブリル、沈着物、タングル、プラークまたは他の形態として除外され得る。
【0025】
例えば該試料には、フィブリル形態のαＳおよびタウが除外され得る。該試料には、不溶性形態のミスフォールディングＡβ、αＳおよび／またはタウタンパク質が除外され得、例えば該試料には、ミスフォールディングＡβ、αＳおよび／またはタウタンパク質が、沈殿物、フィブリル、沈着物、タングル、プラークまたは他の非溶解形態、例えばフィブリル形態として除外され得る。本明細書に記載された方法は、不溶性形態のミスフォールディングＡβおよびタウタンパク質を除外することによって、例えばミスフォールディングＡβおよびタウタンパク質を沈殿物、フィブリル、沈着物、タングル、プラークまたは他の非溶解形態、例えばフィブリル形態として除外することによって、試料を調製することを含み得る。本明細書に記載されたキットは、ミスフォールディングＡβ、αＳおよび／またはタウタンパク質を、沈殿物、フィブリル、沈着物、タングル、プラークまたは他の非溶解形態、例えばフィブリル形態として除外することによって試料を調製することがユーザに指導される取扱説明書を含み得る。試料からの、そのような不溶性形態の上記のミスフォールディングタンパク質の除外は、実質的または完全であり得る。
【0026】
本明細書で用いられる可溶性ミスフォールディングタンパク質の凝集物は、可溶性ミスフォールディングタンパク質をはじめとする非共有結合のタンパク質集合体を指す。可溶性ミスフォールディングタンパク質の凝集物は、「脱凝集」または破壊されて、可溶性ミスフォールディングタンパク質を分解または放出し得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質シードのコレクションの触媒活性は、少なくとも一部が混合物中のシード数に応じて規模を増減し得る。したがって、混合物中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の凝集物を破壊して可溶性ミスフォールディングタンパク質シードを放出することが、モノマータンパク質のオリゴマー化のための触媒活性を上昇させることになり得る。
【0027】
本明細書で用いられる「ミスフォールディングタンパク質」は、生体系の典型的な非病的正常機能に関与する場合に存在するため、タンパク質の構造的コンフォメーションの全てまたは一部をもはや含まないタンパク質である。ミスフォールディングタンパク質は、凝集し得る。ミスフォールディングタンパク質は、タンパク質凝集物内に局在し得る。ミスフォールディングタンパク質は、非機能性タンパク質であり得る。ミスフォールディングタンパク質は、病的アイソフォームであり得る。
【0028】
様々な実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料をチオフラビンＴおよびモル過剰のモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該モル過剰は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの量よりも大きくなり得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を振とうすることを含み得る。該方法はまた、可溶性ミスフォールディングタンパク質に対応するチオフラビンＴの蛍光を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質は、捕捉された可溶性ミスフォールディングモノマーおよび捕捉された可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。幾つかの実施形態において、モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外され得る。
【0029】
様々な実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定する方法が、提供される。該方法は、試料から可溶性ミスフォールディングタンパク質を捕捉することを含み得る。該方法は、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質をモル過剰のモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることを含み得る。該モル過剰は、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの量よりも大きくなり得る。該方法は、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することを含み得る。各インキュベーションサイクルは、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該方法はまた、可溶性ミスフォールディングタンパク質の少なくとも一部を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングモノマーおよび可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質は、捕捉された可溶性ミスフォールディングモノマーおよび捕捉された可溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、可溶性ミスフォールディングモノマーの増幅部分、可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数を含み得る。幾つかの実施形態において、モノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）およびそのアイソフォームが除外され得る。
【0030】
本明細書で用いられる可溶性ミスフォールディングタンパク質の言及は、試料、インキュベーション混合物などの中に分散された可溶性ミスフォールディングタンパク質の任意の形態を包含し得る。例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質の言及は、可溶性ミスフォールディングタンパク質、例えばＰＭＤに罹患した対象から得られた試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質を包含し得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質の言及は、例えば（例えばインキュベーション混合物中の）ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を包含し得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質の言及は、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質に特異的な抗体を用いて試料から捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を包含し得る。
【0031】
幾つかの実施形態において、該方法は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬をインキュベーション混合物に接触させることを含み得る。該可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下での指示状態、および可溶性ミスフォールディングタンパク質の非存在下での非指示状態を特徴とし得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬の指示状態を検出することを包含し得る。指示薬の指示状態および指示薬の非指示状態は、蛍光の差を特徴とし得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在の判定は、蛍光の差を検出することを含み得る。
【0032】
複数の実施形態において、該方法は、モル過剰の、可溶性ミスフォールディングタンパク質指示薬を、インキュベーション混合物に接触させることを含み得る。該モル過剰は、インキュベーション混合物中のモノマーフォールディングタンパク質および可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの総モル量よりも大きくなり得る。
【0033】
様々な実施形態において、可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬としては、チオフラビンＴ、コンゴーレッド、ｍ－Ｉ－スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ－２２７、Ｘ－３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ－Ｘ－０４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ－４、発光コンジュゲートポリチオフェン、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質との融合物、それらの誘導体などのうちの１種または複数を挙げることができる。
【0034】
幾つかの実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することは、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を測定することを含み得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量は、対照試料と比較して測定され得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％のうちの少なくとも約１つまたは複数の感度で検出され得る。検出された試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量は、１００ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、３ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、１００ａｔｔｏｍｏｌ、１０ａｔｔｏｍｏｌ、および１ａｔｔｏｍｏｌのうちの約１つまたは複数より少なくなり得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量は、試料によって含まれるモノマーフォールディングタンパク質に対するモル比で検出され得る。該モル比は、１：１００、１：１０，０００、１：１００，０００および１：１，０００，０００の約１つまたは複数より小さくなり得る。
【0035】
様々な実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％のうちの少なくとも約１つまたは複数の特異度で検出され得る。
【0036】
幾つかの実施形態において、該インキュベーション混合物は、約１ｎＭ～約２ｍＭ；約１０ｎＭ～約２００μＭ；約１００ｎＭ～約２０μＭ；または約１μＭ～約１０μＭ；および約２μＭのうちの１つまたは複数の濃度、または濃度範囲のモノマーフォールディングタンパク質を含み得る。
【0037】
幾つかの実施形態において、該インキュベーション混合物は、緩衝組成物を含み得る。該緩衝組成物は、本明細書に記載されたインキュベーション混合物のｐＨ、例えばｐＨ５～ｐＨ９を調製または保持するのに効果的になり得る。該緩衝組成物は、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、およびＨＥＰＥＳなどのうちの１つまたは複数を含み得る。該緩衝剤の濃度は、約１μｍ～約１Ｍの総濃度であり得る。例えば該緩衝剤は、０．１Ｍ濃度のＴｒｉｓ－ＨＣｌであり得る。
【0038】
様々な実施形態において、該インキュベーション混合物は、塩組成物を含み得る。該塩組成物は、インキュベーション混合物のイオン強度を上昇させるのに効果的になり得る。該塩組成物は、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどのうちの１つまたは複数を含み得る。該インキュベーション混合物は、約１μｍ～約５００ｍＭの総濃度の塩組成物を含み得る
【0039】
幾つかの実施形態において、該インキュベーション混合物は、約５～約９、約６～約８．５、約７～約８、および約７．４のうちの１つまたは複数のｐＨ値もしくはｐＨ範囲を特徴とし得る、そのｐＨ値もしくはｐＨ範囲で調整され得る、またはそのｐＨ値もしくはｐＨ範囲を保持され得る。
【0040】
幾つかの実施形態において、該インキュベーション混合物は、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４５、５０、５５、および６０のうちの約１つもしくは複数の温度℃、例えば約２２℃、または前記値の任意の２つの間の温度範囲、例えば約４℃～約６０℃、約４℃～約３５℃、約８℃～約５０℃、約１２℃～約４０℃、約１８℃～約３０℃、約１８℃～約２６℃などのうちの１つまたは複数の温度範囲でインキュベートされ得る。
【0041】
複数の実施形態において、可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することは、ウェスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、チオフラビンＴ結合アッセイ、コンゴーレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡測定、原子間力顕微鏡測定、表面プラズモン共鳴、および分光法のうちの１つまたは複数を含み得る。ＥＬＩＳＡは、両側サンドウィッチＥＬＩＳＡ（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）を包含し得る。分光法は、準光散乱分光法、マルチスペクトル紫外分光法、共焦点二色蛍光相関分光法、フーリエ変換赤外分光法、分光法検出によるキャピラリー電気泳動法、電子スピン共鳴分光法、核磁気共鳴分光法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分光法のうちの１つまたは複数を包含し得る。
【0042】
様々な実施形態において、可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することは、インキュベーション混合物をプロテアーゼと接触させることを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、ウェスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、およびＥＬＩＳＡのうちの１つまたは複数において、抗ミスフォールディングタンパク質抗体を利用して検出され得る。
【0043】
幾つかの実施形態において、該方法は、標識された形態のモノマーフォールディングタンパク質を提供することを含み得る。標識された形態の該モノマーフォールディングタンパク質は、共有結合により取り込まれた放射性アミノ酸、共有結合により取り込まれた同位体標識アミノ酸、および共有結合により取り込まれたフルオロフォアのうちの１つまたは複数を含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することは、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分に取り込まれた、標識された形態のモノマーフォールディングタンパク質を検出することを含む。
【0044】
複数の実施形態において、該試料は、対象から採取され得る。該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在に従って対象のＰＭＤの存在を判定または診断することを含み得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在は、対照群の対象から採取された対照試料に比較して判定され得る。
【0045】
幾つかの実施形態において、ＰＭＤは、アミロイドーシス；シヌクレイン病；トリプレットリピート病；または筋萎縮性側索硬化症のうちの少なくとも１つを包含し得る。ＰＭＤとしては、アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病または全身性アミロイドーシスのうちの少なくとも１つを挙げることができる。ＰＭＤとしては、シヌクレイン病、例えばパーキンソン病、レビー小体型認知症；多系統萎縮症；またはシヌクレイン関連神経軸索ジストロフィーのうちの少なくとも１つを挙げることができる。ＰＭＤとしては、ハンチントン病を挙げることができる。
【0046】
様々な実施形態において、該検出することは、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を検出することを含み得る。該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を、所定の閾値量に比較することによって、対象のＰＭＤの存在を判定または診断することを含み得る。
【0047】
複数の実施形態において、該試料は、認知テストに従って認知症の臨床徴候を示さなかった対象から採取され得る。該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在に従って対象のＰＭＤの存在を判定または診断することを含み得る。
【0048】
幾つかの実施形態において、該試料は、アミロイドベータのコントラスト画像に従って皮質斑またはタングルを示さなかった対象から採取され得る。該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在に従って対象のＰＭＤの存在を判定または診断することをさらに含み得る。
【0049】
様々な実施形態において、該試料は、認知症テストに従って認知症の臨床徴候を示した対象から採取され得る。該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在に従って対象の認知症の臨床徴候への寄与因子として、ＰＭＤの存在を判定または診断することをさらに含み得る。
【0050】
幾つかの実施形態において、該試料は、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ；乳；粘液、例えば鼻分泌物；粘膜、例えば鼻粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙液；尿などのうちの１種または複数を挙げることができる。
【0051】
複数の実施形態において、該方法は、対象から試料を得ることを含み得る。該対象は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、シカ、ヘラジカ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、または非ヒト霊長類のうちの１つであり得る。非ヒト動物は、野生または家畜であり得る。該対象は、ＰＭＤのリスクがある、ＰＭＤを有する、ＰＭＤの処置を受けている、ミスフォールディングタンパク質の調節不能、ミスフォールディング、凝集または素因に関連する疾患を有するリスクがある、ミスフォールディングタンパク質の調節不能、ミスフォールディング、凝集または素因に関連する疾患を有する、ミスフォールディングタンパク質の調節不能、ミスフォールディング、凝集または素因に関連する疾患のための処置を受けている、のうちの１つまたは複数であり得る。
【0052】
様々な実施形態において、該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を、試料と異なる時間に対象から採取された比較試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量に比較することによって、対象のＰＭＤの進行または恒常性を測定または診断することを含み得る。様々な実施形態において、該試料は、ＰＭＤのための治療を受けている患者から採取され得る。ＰＭＣＡアッセイを利用して、どの患者が治療によって処置され得るかを決定することができる。
【0053】
例えば、様々なメカニズムを通してＡβ恒常性をターゲットとする複数の新規治療薬が、現在、開発途中である。ＡβオリゴマーのためのＰＭＣＡアッセイを利用して、どの患者がＰＭＤ疾患改善療法で処置され得るかを決定することができる。ＰＭＣＡ法による検出で、Ａβオリゴマーのレベルの変化、例えば低下または上昇を示す患者を、Ａβ調整療法への「応答者」として分類することができ、Ａβオリゴマーのレベルを低下する治療薬で処置することができる。異常なＡβ恒常性を欠く患者を、「非応答者」として分類することができ、処置しなくてもよい。こうして、Ａβ恒常性の調整を目的とした治療により利益を享受し得る患者が、同定され得る。
【0054】
同じく、例えば様々なメカニズムを通してαＳ恒常性を標的とする複数の新規治療薬が、現在、開発途中である。αＳ恒常性を標的とする治療的アプローチは、ＰＤ０１Ａ＋もしくはＰＤ０３Ａ＋などの能動免疫化、またはＰＲＸ００２などの受動免疫化を含み得る。αＳオリゴマーのためのＰＭＣＡアッセイを用いて、どの患者がαＳ調節療法で処置され得るかを決定することができる。ＰＭＣＡ法による検出で、αＳオリゴマーのレベルの変化、例えば低下または上昇を示す患者を、αＳ調整療法への「応答者」として分類することができ、αＳオリゴマーのレベルを低下する治療薬で処置することができる。異常なαＳ恒常性を欠く患者を、「非応答者」として分類することができ、処置しなくてもよい。こうして、αＳ恒常性の調整を目的とした治療により利益を享受し得る患者が、同定され得る。
【0055】
さらに、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を、ＰＭＣＡを用いて患者から得られた試料で測定することができる。可溶性ミスフォールディングタンパク質の測定値が高い患者は、可溶性ミスフォールディングタンパク質恒常性を調整する治療薬で処置することができる。可溶性ミスフォールディングタンパク質の測定値が正常な患者は、処置しなくてもよい。可溶性ミスフォールディングタンパク質の恒常性の調整を目的とした治療薬への患者の応答を、追跡することができる。例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質レベルを、治療的介入の開始時の患者試料で測定することができる。臨床上有意義な期間の患者の治療に続いて、追加の患者試料を得ることができ、可溶性ミスフォールディングタンパク質レベルを測定することができる。治療的介入の後、可溶性ミスフォールディングタンパク質レベルの変化を示した患者は、処置に応答すると見なされ得る。不変の可溶性ミスフォールディングタンパク質レベルを示した患者は、非応答と見なされ得る。該方法は、ＰＭＣＡ反応と干渉し得る成分を含有する患者試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質凝集物の検出を含み得る。
【0056】
幾つかの実施形態において、該対象は、ＰＭＤ調整療法で処置され得る。該方法は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を、比較試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量に比較することを含み得る。試料および比較試料は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の調整療法を受けている期間の異なる時点で対象から採取され得る。該方法は、対象がその期間の可溶性ミスフォールディングタンパク質の変化に従って可溶性ミスフォールディングタンパク質の調整療法に応答する、またはその期間の可溶性ミスフォールディングタンパク質の恒常性に従って可溶性ミスフォールディングタンパク質の調整療法に応答しない、の一方であることを判定または診断することを含み得る。該方法は、可溶性ミスフォールディングタンパク質の調整療法で、可溶性ミスフォールディングタンパク質の調整療法に応答すると判定された対象を処置することを含み得る。例えばＡＤの場合、ＰＭＤ調整療法は、ＢＡＣＥ１（ベータセクレターゼ１）の阻害剤；γ－セクレターゼの阻害剤；およびＡβ恒常性の調整剤、例えばＡβ恒常性の免疫療法調整剤、のうちの１つまたは複数の投与を含み得る。Ａβ調整療法は、Ｅ２６０９；ＭＫ－８９３１；ＬＹ２８８６７２１；ＡＺＤ３２９３；セマガセスタット（ＬＹ－４５０１３９）；アバガセスタット（ＢＭＳ－７０８１６３）；ソラネズマブ；クレネズマブ；バピネオズマブ；ＢＩＩＢ０３７；ＣＡＤ１０６；８Ｆ５もしくは５５９８、またはＡβグロブロマーに対して増加する他の抗体、例えば全体の教示が参照により本明細書に組み入れられるＢａｒｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ， “Ｇｌｏｂｕｌａｒ ａｍｙｌｏｉｄ β－ｐｅｐｔｉｄｅ１－４２ ｏｌｉｇｏｍｅｒ――ａ ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ” Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ２００５， ９５， ８３４－８４７に記載されたもの；ＡＣＣ－００１；Ｖ９５０；Ａｆｆｉｔｏｐｅ ＡＤ０２などのうちの１つまたは複数の投与を含み得る。
【0057】
ＰＤの場合、例えばＰＭＤ調整療法は、ＰＤ０１Ａ＋もしくはＰＤ０３Ａ＋などの能動免疫化、ＰＲＸ００２などの受動免疫化などを含み得る。該ＰＭＤ調整療法はまた、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、イノシン、カルシウムチャネルブロッカー、具体的にはイスラジピンなどのＣａｖ１．３チャネルブロッカー、ニコチンおよびニコチン受容体アゴニスト、ＧＭ－ＣＳＦ、グルタチオン、ピオグリタゾンなどのＰＰＡＲガンマアゴニスト、ならびにＤ２／Ｄ３ドーパミン受容体アゴニストおよびＬＲＲＫ２（ロイシンリッチリピートキナーゼ２）阻害剤をはじめとするドーパミン受容体アゴニストでの処置を含み得る。
【0058】
複数の実施形態において、ミスフォールディングタンパク質の量を、ＰＭＣＡを利用して患者から得られた試料で測定することができる。ミスフォールディングタンパク質の測定値が増加した患者は、ＰＭＤのための疾患修飾療法で処置することができる。ミスフォールディングタンパク質の測定値が正常な患者は、処置されなくてもよい。疾患修飾療法への患者の応答を、追跡することができる。例えばミスフォールディングタンパク質レベルを、治療的介入の開始時の患者試料で測定することができる。臨床上有意義な期間の患者の治療に続いて、追加の患者試料を得ることができ、可溶性ミスフォールディングタンパク質レベルを測定することができる。治療的介入の後、ミスフォールディングタンパク質レベルの変化を示した患者は、処置に応答すると見なされ得る。不変のミスフォールディングタンパク質レベルを示した患者は、非応答と見なされ得る。該方法は、ＰＭＣＡ反応と干渉し得る成分を含有する患者試料中のミスフォールディングタンパク質凝集物の検出を含み得る。
【0059】
複数の実施形態において、該方法は、試料およびインキュベーション混合物の１つまたは複数の中で可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮することは、インキュベーション混合物を形成させる前に試料を前処置することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮することは、インキュベーション混合物をインキュベートする前にインキュベーション混合物を前処置することを含み得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮することは、１種または複数の特異的抗体を可溶性ミスフォールディングタンパク質に接触させて、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を形成させることを含み得る。
【0060】
例えばＡＤの場合、１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、６Ｅ１０、４Ｇ８、８２Ｅ１、Ａ１１、Ｘ－４０／４２、１６ＡＤＶなどのうちの１つまたは複数を含み得る。そのような抗体は、以下の通り入手することができる：６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ、ニュージャージー州プリンストン所在）；８２Ｅ１（ＩＢＬ Ａｍｅｒｉｃａ、ミネソタ州ミネアポリス所在）；Ａ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド所在）；Ｘ－４０／４２（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ所在）；および１６ＡＤＶ（Ａｃｕｍｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，カリフォルニア州リバモア所在）。
【0061】
さらにＰＤの場合、例えば１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、α／β－シヌクレインＮ－１９；α－シヌクレインＣ－２０－Ｒ；α－シヌクレイン２１１；α－シヌクレインＳｙｎ２０４；α－シヌクレイン２Ｂ２Ｄ１；α－シヌクレインＬＢ５０９；α－シヌクレインＳＰＭ４５１；α－シヌクレイン３Ｇ２８２；α－シヌクレイン３Ｈ２８９７；α／β－シヌクレインＳｙｎ２０２；α／β－シヌクレイン３Ｂ６；α／β／γ－シヌクレインＦＬ－１４０などのうちの１つまたは複数をはじめとするＰＤ特異的抗体を包含し得る。幾つかの実施形態において、１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、α／β－シヌクレインＮ－１９；α－シヌクレインＣ－２０－Ｒ；α－シヌクレイン２１１；α－シヌクレインＳｙｎ２０４などのうちの１つまたは複数を含み得る。そのような抗体は、以下の通り入手され得る：α／β－シヌクレインＮ－１９（ｃａｔ． Ｎｏ．ＳＣ－７０１２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、テキサス州ダラス所在）；α－シヌクレインＣ－２０－Ｒ（ＳＣ－７０１１－Ｒ）；α－シヌクレイン２１１（ＳＣ－１２７６７）；α－シヌクレインＳｙｎ２０４（ＳＣ－３２２８０）；α－シヌクレイン２Ｂ２Ｄ１（ＳＣ－５３９５５）；α－シヌクレインＬＢ５０９（ＳＣ－５８４８０）；α－シヌクレインＳＰＭ４５１（ＳＣ－５２９７９）；α－シヌクレイン３Ｇ２８２（ＳＣ－６９９７８）；α－シヌクレイン３Ｈ２８９７（ＳＣ－６９９７７）；α／β－シヌクレインＳｙｎ２０２（ＳＣ－３２２８１）；α／β－シヌクレイン３Ｂ６（ＳＣ－６９６９９）；またはα／β／γ－シヌクレインＦＬ－１４０（ＳＣ－１０７１７）。
【0062】
さらに、該１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、可溶性ミスフォールディングタンパク質のアミノ酸配列に特異的な抗体、または可溶性ミスフォールディングタンパク質のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つまたは複数を包含し得る。該１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、固相に連結され得る。該固相は、磁気ビーズおよびマルチウェルプレートのうちの１つまたは複数を包含し得る。
【0063】
例えばＥＬＩＳＡプレートは、患者の試料に由来する可溶性ミスフォールディングタンパク質を捕捉するのに用いられる抗体でコーティングされ得る。抗体コーティングＥＬＩＳＡプレートを患者試料と共にインキュベートすることができ、非結合材料を洗い流すことができ、ＰＭＣＡ反応を実施することができる。抗体をビーズに連結させることもできる。ビーズを患者の試料と共にインキュベートし、それを用いて可溶性ミスフォールディングタンパク質－抗体複合体を、患者試料の残りと分離することができる。
【0064】
様々な実施形態において、該試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることは、モル過剰のモノマーフォールディングタンパク質を、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を含む試料に接触させることを含み得る。モノマーフォールディングタンパク質の該モル過剰は、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの総モル量よりも大きくなり得る。インキュベーション混合物をインキュベートすることは、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、該モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発して、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になり得る。
【0065】
幾つかの実施形態において、該タンパク質凝集物は、モノマータンパク質、可溶性ミスフォールディングタンパク質、および可溶性ミスフォールディングタンパク質の捕捉形態のうちの１つまたは複数を含み得る。
【0066】
複数の実施形態において、インキュベーション混合物を物理的に破壊することは、音波処理、撹拌、振とう、凍結／解凍、レーザ照射、オートクレーブインキュベーション、高圧、ホモジネーションなどのうちの１つまたは複数を含み得る。例えば振とうは、周期的撹拌を含み得る。該周期的撹拌は、約５０回転／分（ＲＰＭ）～１０，０００ＲＰＭで実施され得る。該周期的撹拌は、約２００ＲＰＭ～２０００ＲＰＭで実施され得る。該周期的撹拌は、約５００ＲＰＭで実施され得る。
【0067】
様々な実施形態において、インキュベーション混合物を物理的に破壊することは、約５秒～約１０分、約３０秒～約１分、約４５秒～約１分、約１分間などの各インキュベーションサイクルで実施され得る。例えば、該インキュベーション混合物を物理的に破壊することは、約５秒～約１０分、約３０秒～約１分、約４５秒～約１分、約１分間などのうちの１つまたは複数の間、振とうすることにより各インキュベーションサイクルで実施され得る。インキュベーション混合物をインキュベートすることは、独立して、約５分～約５時間、約１０分～約２時間、約１５分～約１時間、約２５分～約４５分などの時間、各インキュベーションサイクルで実施され得る。各インキュベーションサイクルは、独立して、約５分～約５時間インキュベートすることおよび約５秒～約１０分間物理的に破壊すること；約１０分～約２時間インキュベートすることおよび約３０秒～約１分間物理的に破壊すること；約１５分～約１時間インキュベートすることおよび約４５秒～約１分間物理的に破壊すること；約２５分～約４５分インキュベートすることおよび約４５秒～約１分間物理的に破壊すること；ならびに約１分間インキュベートすることおよび約１分間物理的に破壊すること、のうちの１つまたは複数の間、インキュベーション混合物をインキュベートすることおよび物理的に破壊することを含み得る。
【0068】
インキュベーションサイクルを実施することは、約２回～約１０００回、約５回～約５００回、約５０回～約５００回、約１５０回～約２５０回など、反復され得る。インキュベーション混合物をインキュベートすることは、独立して、各インキュベーションサイクルで、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０℃の温度、または前記値の任意の２つの間の範囲、例えば約１５℃～約５０℃で実施される。
【0069】
複数の実施形態において、試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることは、生理的条件下で実施され得る。試料をモノマーフォールディングタンパク質と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることは、試料をモル過剰のモノマータンパク質と接触させることを含み得る。モル過剰は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質に含まれるタンパク質モノマーの総モル量よりも大きくなり得る。モノマーフォールディングタンパク質におよび／または可溶性ミスフォールディングタンパク質は、例えばモノマーフォールディングタンパク質および／または可溶性ミスフォールディングタンパク質のタンパク質分解切断によって形成された、１つまたは複数のペプチドを含み得る。例えばＡＤの場合、モノマーフォールディングタンパク質および／または可溶性ミスフォールディングタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質のβ－またはγ－セクレターゼ切断を介して形成された１つまたは複数のペプチドを含み得る。例えばＡＤの場合、モノマーフォールディングタンパク質および／または可溶性ミスフォールディングタンパク質は、Ａベータ４０およびＡベータ４２のうちの１つまたは複数を含み得る。さらに例えばＰＤの場合、モノマーフォールディングタンパク質および／または可溶性ミスフォールディングタンパク質は、αＳ－１４０のタンパク質分解切断を介して形成された１つまたは複数のペプチドを含み得る。モノマーαＳタンパク質および／または可溶性オリゴマーαＳタンパク質は、αＳ－１４０、αＳ－１２６、αＳ－１１２などのうちの１つまたは複数を含み得る。本明細書で用いられる「αＳ－１４０」は、全長１４０アミノ酸α－シヌクレインタンパク質を指す。他のアイソフォームとしては、「αＳ－１２６」、つまり例えばエクソン３の欠損により、残基４１～５４が欠如したアルファ－シヌクレイン－１２６；および「αＳ－１１２」、つまり例えばエクソン５の欠損により、残基１０３～１３０が欠如したアルファ－シヌクレイン－１１２を挙げることができる。
【0070】
様々な実施形態において、該モノマーフォールディングタンパク質は、化学合成、組換え生成、または非組換え生体試料からの抽出のうちの１つによって生成され得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、実質的に可溶性ミスフォールディング凝集物であり得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、実質的に可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数であり得る。
【0071】
様々な実施形態において、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定するキットが、提供される。該キットは、既知量のモノマーフォールディングタンパク質と、既知量の可溶性ミスフォールディングタンパク質指示薬と、を含み得る。該キットは、取扱説明書を含み得る。該取扱説明書で、本明細書に記載された方法のいずれかを実施するようにユーザに指導され得る。例えば該取扱説明書で、試料を、既知量のモノマーフォールディングタンパク質および既知量の可溶性ミスフォールディングタンパク質指示薬のうちの１つまたは複数と接触させて、インキュベーション混合物を形成させることがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させるのに効果的になるように２回以上のインキュベーションサイクルを実施することがユーザに指導され得る。各インキュベーションサイクルは、可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在下で、モノマーフォールディングタンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を誘発するのに効果的になるようにインキュベーション混合物をインキュベートして、ミスフォールディングタンパク質の増幅部分を形成させることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、例えば可溶性ミスフォールディングタンパク質を放出するために、存在する任意のタンパク質凝集物の少なくとも一部を分解するのに効果的になるようにインキュベーション混合物を物理的に破壊することを含み得る。該取扱説明書で、可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することによって、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を判定することがユーザに指導され得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、可溶性ミスフォールディングタンパク質およびミスフォールディングタンパク質の増幅部分を含み得る。
【0072】
様々な実施形態において、該キットは、既知量のモノマーフォールディングタンパク質と、既知量の可溶性ミスフォールディングタンパク質指示薬と、を含み得る。該キットは、個々のプレートまたは装置の１つまたは複数として、組み合わせた装置としてなどで含まれる、マルチウェルマイクロタイタープレート（ｍｕｌｔｉｗａｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅ）；マイクロ流体プレート；振とう装置；インキュベーション装置；および蛍光測定装置のうちの１つまたは複数を含み得る。例えば振とうマイクロプレートリーダを用いて、インキュベーションおよび振とうのサイクルを実施して、実験過程のＴｈＴ蛍光発光を自動測定することができる（例えば、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ、ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ Ｉｎｃ．，ノースカロライナ州カリー所在）。
【0073】
該キットの複数の実施形態において、可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬の指示状態および非指示状態は、蛍光の差を特徴とし得る。該取扱説明書で、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在を蛍光分光法によって判定することがユーザに指導され得る。
【0074】
該キットの幾つかの実施形態において、可溶性ミスフォールディングタンパク質の指示薬としては、チオフラビンＴ、コンゴーレッド、ｍ－Ｉ－スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ－２２７、Ｘ－３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ－Ｘ－０４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ－４、発光コンジュゲートポリチオフェン、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質との融合物、それらの誘導体などのうちの１種または複数を挙げることができる。該モノマーフォールディングタンパク質は、共有結合により取り込まれた放射性アミノ酸、共有結合により取り込まれた同位体標識アミノ酸、および共有結合により取り込まれたフルオロフォアのうちの１つまたは複数を含み得る。
【0075】
該キットの様々な実施形態において、該取扱説明書で、本明細書に記載された方法のいずれかを実施することがユーザに指導され得る。例えば該取扱説明書は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を測定するためのユーザへの指導を含み得る。該取扱説明書で、ウェスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、チオフラビンＴ結合アッセイ、コンゴーレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡測定、原子間力顕微鏡測定、表面プラズモン共鳴、および分光法などのうちの１つまたは複数を実施することによって可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することがユーザに指導され得る。
【0076】
該取扱説明書で、インキュベーション混合物をプロテアーゼと接触させること、ならびにウェスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、およびＥＬＩＳＡのうちの１つまたは複数において、抗ミスフォールディングタンパク質抗体を利用して可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出すること、によって可溶性ミスフォールディングタンパク質を検出することがユーザに指導され得る。
【0077】
該キットの複数の実施形態において、該取扱説明書で、対象から試料を採取することがユーザに指導され得る。該取扱説明書は、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在に従って対象のＰＭＤの存在を判定するためのユーザへの指導を含み得る。試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の存在は、対照群の対象から採取された対照試料に比較して判定され得る。該取扱説明書で、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を、所定の閾値量に比較することによって、対象のＰＭＤの存在を判定することがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ；乳；粘液、例えば鼻分泌物；粘膜、例えば鼻粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙液；尿などのうちの１種または複数を含む試料を得ることがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量を、試料と異なる時間に対象から採取された比較試料中の可溶性ミスフォールディングタンパク質の量に比較することによって、対象のＰＭＤの進行または恒常性を測定することがユーザに指導され得る。
【0078】
該取扱説明書で、試料およびインキュベーション混合物の１つまたは複数の中で可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮することがユーザに指導され得る。例えば該キットは、可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮または捕捉するように構成された１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体を含み得る。該１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、可溶性ミスフォールディングタンパク質のアミノ酸配列に特異的な抗体、および可溶性ミスフォールディングタンパク質のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つまたは複数を含み得る。該取扱説明書で、該１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体を、可溶性ミスフォールディングタンパク質に接触させて、捕捉された可溶性ミスフォールディングタンパク質を形成させることによって、可溶性ミスフォールディングタンパク質を選択的に濃縮することがユーザに指導され得る。該１種または複数の可溶性ミスフォールディングタンパク質の特異的抗体は、提供されて固相に連結され得る。該固相は、磁気ビーズおよびマルチウェルプレートのうちの１つまたは複数を含み得る。
【0079】
該キットの様々な実施形態において、インキュベーション混合物を物理的に破壊するための取扱説明書で、音波処理、撹拌、振とう、凍結／解凍、レーザ照射、オートクレーブインキュベーション、高圧、ホモジネーションなどのうちの１つまたは複数を利用することがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、本明細書に記載された任意のＲＰＭ範囲に従って、例えば約５０ＲＰＭ～１０，０００ＲＰＭで周期的撹拌を実施することがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、各インキュベーションサイクルで本明細書に記載された任意の時間範囲に従って、例えば約５秒～１０分間、物理的破壊を実施することがユーザに指導され得る。該取扱説明書で、各インキュベーションサイクルで本明細書に記載された任意の時間範囲に従って、例えば約５分～５時間、インキュベーション混合物をインキュベートすることがユーザに指導され得る。該インキュベーションサイクルを実施するための取扱説明書で、本明細書に記載された任意の反復回数、例えば約２回～約１０００回、インキュベーションサイクルを実施することがユーザに指導され得る。該インキュベーションサイクルを実施するための取扱説明書は、約１５℃～約５０℃の温度でインキュベートするためのユーザへの指導を含み得る。
【0080】
該キットの様々な実施形態において、該モノマーフォールディングタンパク質は、化学合成、組換え生成、または非組換え生体試料からの抽出のうちの１つによって生成され得る。可溶性ミスフォールディングタンパク質は、実質的に可溶性ミスフォールディング凝集物であり得る。ミスフォールディングタンパク質の増幅部分は、実質的に可溶性ミスフォールディング凝集物の増幅部分、および不溶性ミスフォールディング凝集物のうちの１つまたは複数であり得る。
【0081】
実施例
実施例１：合成Ａβオリゴマーの調製
Ａβ１－４２を、Ｙａｌｅ大学Ｗ．Ｋｅｃｋ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて固相Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルの化学作用を利用して合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。最終生成物を凍結乾燥し、アミノ酸分析および質量分析によって特徴づけた。凝集されたミスフォールディングＡβタンパク質を含まない原液を調製するために、凝集物を高ｐＨに溶解し、３０ｋＤａカットオフフィルターでろ過して、残留する凝集物を除去した。異なるタイプの凝集物を調製するために、シード不含のＡβ１－４２の溶液（１０μＭ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中、２５℃で異なる時間、撹拌しながらインキュベートした。この調製物は、インキュベーション時間に応じて異なる割合で、Ａβモノマー、そしてフィブリル、プロトフィブリルおよび可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の混合物を含有した。凝集の度合いを、ＴｈＴ蛍光発光、ネガティブ染色後の電子顕微鏡、Ａ１１コンフォメーション抗体を用いたドットブロット試験および４Ｇ８抗Ａβ抗体を用いたゲル電気泳動後のウェスタンブロットによって特徴づけた。
実施例１：合成Ａβオリゴマーの調製
Ａβ１－４２を、Ｙａｌｅ大学Ｗ．Ｋｅｃｋ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて固相Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルの化学作用を利用して合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。最終生成物を凍結乾燥し、アミノ酸分析および質量分析によって特徴づけた。凝集されたミスフォールディングＡβタンパク質を含まない原液を調製するために、凝集物を高ｐＨに溶解し、３０ｋＤａカットオフフィルターでろ過して、残留する凝集物を除去した。異なるタイプの凝集物を調製するために、シード不含のＡβ１－４２の溶液（１０μＭ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中、２５℃で異なる時間、撹拌しながらインキュベートした。この調製物は、インキュベーション時間に応じて異なる割合で、Ａβモノマー、そしてフィブリル、プロトフィブリルおよび可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の混合物を含有した。凝集の度合いを、ＴｈＴ蛍光発光、ネガティブ染色後の電子顕微鏡、Ａ１１コンフォメーション抗体を用いたドットブロット試験および４Ｇ８抗Ａβ抗体を用いたゲル電気泳動後のウェスタンブロットによって特徴づけた。
【0082】
異なるサイズのＡβオリゴマーの混合物を、フィブリル形成の過程で作製した。具体的には、可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を、モノマー合成Ａβ１－４２（１０μＭ）を撹拌しながら２５℃でインキュベートすることよって調製した。５時間のインキュベーション後に、多量の可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の球状の外観が、ネガティブ染色後の電子顕微鏡測定によって観察され、少量のみのプロトフィブリルおよびフィブリルも観察された。１０時間目にプロトフィブリルが主に観察され、２４時間目に、長いフィブリルが多量に観察された。図１Ａは、インキュベーションの０時間目、５時間目、１０時間目、および２４時間目に撮影された電子顕微鏡写真を示している。
【0083】
可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質凝集物を、Ｋａｙｅｄ， ｅｔ ａｌ． “Ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｍｐｌｉｅｓ ｃｏｍｍｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３， ３００， ４８６－４８９の方法に従ってＡ１１抗オリゴマー特異的抗体を利用して陽性とテストされた。１０時間および２４時間のさらなるインキュベーションの後、プロトフィブリルおよびフィブリル構造を観察した。凝集物のサイズを、定義された孔径のフィルターでのろ過およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離後のウェスタンブロットによって測定した。５時間のインキュベーションによって形成された可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質は、３０ｋＤａカットオフのフィルター中に保持され、１０００ｋＤａカットオフのフィルターを通過した。図１Ｂは、可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質凝集物のウェスタンブロットである。この可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の電気泳動分離から、該材料の大部分が約１７０ｋＤａのＳＤＳ耐性凝集物として移動し、１７ｋＤａに小さなバンドを有することが示された。
【0084】
実施例２：Ａβ－ＰＭＣＡは合成Ａβオリゴマーを検出する
実施例２Ａ．Ａβ凝集のシーディングを、異なる量の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質（対照（Ａβオリゴマー不含）；または合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質３、８０、３００、および８４００フェムトモル）を含み、または含まずに、チオフラビンＴの存在下でシード不含Ａβ１－４２の溶液をインキュベーションすることによって試験した。Ａβ－ＰＭＣＡの一般的手順：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の２μＭ凝集物不含Ａβ１－４２の溶液（総量２００μＬ）を、不透明９６ウェルプレートに入れ、単独で、または合成Ａβ凝集物（実施例１に記載された通り５時間インキュベートすることにより調製）もしくはＣＳＦアリコット４０μＬの存在下でインキュベートした。試料を５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下でインキュベートし、２２℃の一定温度でＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを利用して周期的攪拌に供した（５００ｒｐｍで１分間、その後、振とうせずに２９分間）。様々な時点で、ＴｈＴ蛍光をプレート内で、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍで測定した。図２Ａは、示されたフェムトモル濃度の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質シードを用いた、チオフラビンＴの蛍光による測定でのアミロイド形成（循環増幅を含まない）対時間のグラフである。緩衝液のペプチド濃度、温度およびｐＨをモニタリングして、誘導期の度合いおよび実験間の再現性を制御した。これらの条件下では、自然なＡβ凝集物は、実験が実施された時間（１２５時間）では検出されなかった。モノマーＡβ１－４２タンパク質の凝集が、０．３～８．４ｆｍｏｌの実施例１の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の存在下で観察された。
実施例２Ａ．Ａβ凝集のシーディングを、異なる量の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質（対照（Ａβオリゴマー不含）；または合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質３、８０、３００、および８４００フェムトモル）を含み、または含まずに、チオフラビンＴの存在下でシード不含Ａβ１－４２の溶液をインキュベーションすることによって試験した。Ａβ－ＰＭＣＡの一般的手順：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の２μＭ凝集物不含Ａβ１－４２の溶液（総量２００μＬ）を、不透明９６ウェルプレートに入れ、単独で、または合成Ａβ凝集物（実施例１に記載された通り５時間インキュベートすることにより調製）もしくはＣＳＦアリコット４０μＬの存在下でインキュベートした。試料を５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下でインキュベートし、２２℃の一定温度でＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを利用して周期的攪拌に供した（５００ｒｐｍで１分間、その後、振とうせずに２９分間）。様々な時点で、ＴｈＴ蛍光をプレート内で、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍで測定した。図２Ａは、示されたフェムトモル濃度の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質シードを用いた、チオフラビンＴの蛍光による測定でのアミロイド形成（循環増幅を含まない）対時間のグラフである。緩衝液のペプチド濃度、温度およびｐＨをモニタリングして、誘導期の度合いおよび実験間の再現性を制御した。これらの条件下では、自然なＡβ凝集物は、実験が実施された時間（１２５時間）では検出されなかった。モノマーＡβ１－４２タンパク質の凝集が、０．３～８．４ｆｍｏｌの実施例１の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の存在下で観察された。
【0085】
実施例２Ｂ：インキュベーションと物理的破壊の組み合わせ期である増幅サイクルを用いた。図２Ａと同じ試料を、周期的撹拌（５００ｒｐｍで１分間撹拌した後、振とうせずに２９分間）を行いながらインキュベートした。凝集を、プレート分光蛍光計（励起４３５；発光４８５）を用いて、アミロイドフィブリルへのチオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合によって経時的に測定した。グラフは、三重測定の平均および標準誤差を示す。Ａβオリゴマーの濃度は、平均分子量１７０ｋＤａと仮定して推定した。図２Ｂは、様々な濃度の実施例１の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質に関する時間の関数として、ＴｈＴ蛍光によって測定された増幅周期促進アミロイド形成を示すグラフである。これらの条件下では、８４００、３００、８０および３ｆｍｏｌの合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質によって誘導されたモノマーＡβ１－４２タンパク質の凝集が、明らかにより急速であり、合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の非存在下で観察されたものとより容易に識別された。この結果から、これらの条件下での検出限界が、所与の試料中では３ｆｍｏｌ以下の可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質であることが示される。
【0086】
実施例３：Ａβ－ＰＭＣＡは、ＡＤ患者の脳脊髄液中のミスフォールディングＡβを検出する
ＣＳＦのアリコットを、ＡＤ患者５０名、非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した認知的に正常な個体３９名、および他の形態の認知症をはじめとする非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＮＤ）に罹患した個体３７名から得た。テストＣＳＦ試料を、ＤＳＭ－ＩＶおよびＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＡ指針（ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４）による定義と、様々なテスト、例えば日常的医学検査、神経学的評価、神経心理学的評定、磁気共鳴画像、ならびにＡβ１－４２、総タウおよびホスホタウのＣＳＦレベルの測定などを利用した測定と、によりおそらくＡＤであると診断された患者５０名から得た。試料採取時のＡＤ患者の平均年齢は、７１．０±８．１歳（範囲４９～８４歳）であった。対照ＣＳＦ試料を、正常圧水頭症の症例１２名、末梢神経傷害の患者７名、種々の形態の脳腫瘍の患者７名、ＩＣＴＵＳ患者２名、重度頭痛の患者１名、脳炎患者３名、高血圧患者１名、および潰瘍診断の６名からなる非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した患者３９名から得た。ＣＳＦ試料がこの患者群から採取された時の平均年齢は、６４．６±１４．７歳（範囲３１～８３歳）であった。対照ＣＳＦ試料はまた、前頭側頭型認知症１０名（行動障害型５名および言語障害型５名）、パーキンソン病の患者６名（認知症関連４名および運動ニューロン疾患１名）、進行性核上性麻痺患者６名、脊髄小脳失調６名（認知症関連１名）、筋萎縮性側索硬化症４名、ハンチントン病２名、ＭＥＬＡＳ１名、レビー小体型認知症１名、および血管型認知症１名からなる非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＮＤ）に罹患した個体３７名から採取した。この群の試料採取時の平均年齢は、６３．８±１１．１歳（範囲４１～８０歳）であった。ＣＳＦ試料は、一夜絶食後に非外傷性針によるＬ４／Ｌ５間またはＬ３／Ｌ４間の腰部穿刺によってポリプロピレン試験管に採取した。試料を４℃および３，０００ｇで３分間遠心分離し、分取して、分析まで－８０℃で貯蔵した。ＣＳＦ細胞カウント、グルコースおよびタンパク質濃度を測定した。アルブミンを、レートネフェロメトリーによって測定した。血液脳関門の統合性および髄腔内ＩｇＧ産生を評価するために、アルブミン比率（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）×１０３およびＩｇＧ指数（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）（ＣＳＦ ＩｇＧ／血清ＩｇＧ）を計算した。この試験は、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎの条項にしたがって実施され、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可された。
ＣＳＦのアリコットを、ＡＤ患者５０名、非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した認知的に正常な個体３９名、および他の形態の認知症をはじめとする非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＮＤ）に罹患した個体３７名から得た。テストＣＳＦ試料を、ＤＳＭ－ＩＶおよびＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＡ指針（ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４）による定義と、様々なテスト、例えば日常的医学検査、神経学的評価、神経心理学的評定、磁気共鳴画像、ならびにＡβ１－４２、総タウおよびホスホタウのＣＳＦレベルの測定などを利用した測定と、によりおそらくＡＤであると診断された患者５０名から得た。試料採取時のＡＤ患者の平均年齢は、７１．０±８．１歳（範囲４９～８４歳）であった。対照ＣＳＦ試料を、正常圧水頭症の症例１２名、末梢神経傷害の患者７名、種々の形態の脳腫瘍の患者７名、ＩＣＴＵＳ患者２名、重度頭痛の患者１名、脳炎患者３名、高血圧患者１名、および潰瘍診断の６名からなる非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した患者３９名から得た。ＣＳＦ試料がこの患者群から採取された時の平均年齢は、６４．６±１４．７歳（範囲３１～８３歳）であった。対照ＣＳＦ試料はまた、前頭側頭型認知症１０名（行動障害型５名および言語障害型５名）、パーキンソン病の患者６名（認知症関連４名および運動ニューロン疾患１名）、進行性核上性麻痺患者６名、脊髄小脳失調６名（認知症関連１名）、筋萎縮性側索硬化症４名、ハンチントン病２名、ＭＥＬＡＳ１名、レビー小体型認知症１名、および血管型認知症１名からなる非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＮＤ）に罹患した個体３７名から採取した。この群の試料採取時の平均年齢は、６３．８±１１．１歳（範囲４１～８０歳）であった。ＣＳＦ試料は、一夜絶食後に非外傷性針によるＬ４／Ｌ５間またはＬ３／Ｌ４間の腰部穿刺によってポリプロピレン試験管に採取した。試料を４℃および３，０００ｇで３分間遠心分離し、分取して、分析まで－８０℃で貯蔵した。ＣＳＦ細胞カウント、グルコースおよびタンパク質濃度を測定した。アルブミンを、レートネフェロメトリーによって測定した。血液脳関門の統合性および髄腔内ＩｇＧ産生を評価するために、アルブミン比率（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）×１０３およびＩｇＧ指数（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）（ＣＳＦ ＩｇＧ／血清ＩｇＧ）を計算した。この試験は、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎの条項にしたがって実施され、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可された。
【0087】
実験と分析の開始部分は、盲検で実施した。図３Ａは、ＡＤ、ＮＮＤ、およびＮＡＮＤ群から得られた代表的試料５つのＡβ凝集の平均反応速度を示すＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。
【0088】
結果から、ＡＤ患者からのＣＳＦが対照ＣＳＦに比較してＡβ凝集を有意に促進することが示される（Ｐ＜０．００１）。ヒトＣＳＦ試料の存在下でのＡβ凝集反応速度における差の有意性は、一元配置分散分析と、それに続くテューキー多重比較事後検定によって解析した。有意水準は、Ｐ＜０．０５に設定した。ＡＤと他の２群の試料との差は、Ｐ＜０．００１（＊＊＊）で高い有意性があった。
【0089】
図３Ｂは、ＡＤ、ＮＮＤおよびＮＡＮＤ群から得られた試料についての時間単位での誘導期時間のグラフである。Ａβ凝集に及ぼす個々の試料の影響を測定するために、誘導期を推定して、対照緩衝液試料を差し引いた後の４０任意単位よりも大きなＴｈＴ蛍光までの時間として定義した。この値は、対照緩衝液試料の測定値のおよそ５倍に対応することを考慮して選択された。
【0090】
図３Ｃは、１８０Ａβ－ＰＭＣＡサイクル、即ち９０時間インキュベーション（Ｐ９０）の後に得られたアミロイド形成の度合いを示すグラフである。実験群の間での誘導期およびＰ９０の比較から、ＡＤと、非変性神経疾患または非ＡＤ神経変性疾患の個体から得られた対照試料との有意差が明らかである。さらに、凝集パラメータとＡＤ患者の年齢との間に相関が検出されず、マーカのレベルが、患者の年齢ではなく患者のＣＳＦにおける凝集Ａβタンパク質に対応することが示される。
【0091】
図５の表１は、誘導期数を利用して計算されたＡβ－ＰＭＣＡテストの感度、特異度および予測値の推定を示す。
【0092】
再現性を試験するために、図３Ａ～Ｃに示されたものと類似の実験を、独立して、異なる試料、試薬、およびＡβ－ＰＭＣＡの基質としてのＡβペプチドの新しいバッチを用いて実施した。３００Ａβ－ＰＭＣＡサイクル、即ち１５０時間インキュベーション（Ｐ１５０）の後に得られたアミロイド形成の度合いを、各患者で測定した。対照群には、他の神経変性疾患に罹患したヒトおよび非神経病の患者の両者が含まれる。各試料のデータは、二重測定の平均を表す。統計学的差を、スチューデントｔ検定により解析した。図６は、３００Ａβ－ＰＭＣＡサイクル、即ち１５０時間インキュベーション（Ｐ９０）の後に得られた試料の時間単位での誘導期時間のグラフである。
【0093】
試験過程で、４番目の位置に由来するＣＳＦ試料の全組み合わせは、高濃度の合成オリゴマーを添加した後でも全く凝集しなかった。試料採取時の試薬汚染が、アッセイを妨害したと予測される。
【0094】
異なる試料間の凝集反応速度の差を、誘導期、Ａ５０およびＰ９０をはじめとする様々な異なる反応速度パラメータの推定によって評価した。誘導期は、緩衝液単独のバックグランド値の５倍よりも高いＴｈＴ蛍光に達するのに必要となる時間と定義される。Ａ５０は、最大凝集の５０％に達する時間に対応する。Ｐ９０は、９０時間目の凝集（ＴｈＴ蛍光として測定）の度合いに対応する。感度、特異度および予測値は、このデータを用いて測定し、カットオフ閾値は、ＭｅｄＣａｌｃソフトウェア（ＭｅｄＣａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ベルギーのオステンド所在）を用いた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析によって測定した。
【0095】
実施例４：ＣＳＦ中のＡＤのＡβ－ＰＭＣＡ検出のためのミスフォールディングＡβの閾値の測定
図５、表１の裏づけとして、感度、特異度および予測値を、誘導期データを用いて測定し、カットオフ閾値は、ＭｅｄＣａｌｃソフトウェア（バーション１２．２．１．０、ＭｅｄＣａｌｃ、ベルギー所在）を用いた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析によって測定した。図５、表１に示される通り、９０．０％感度および８４．２％特異度が、非変性神経疾患を有する年齢が一致した個体からなる対照群について推定された。反対に、他の形態の認知症をはじめとする他の神経変性疾患からのＡＤの臨床的により関連した識別では、１００％感度および９４．６％特異度が推定された。ＡＤを他の形態の神経変性疾患と区別するためのＡβ－ＰＭＣＡのこの能力は、臨床的に有意である。全ての対照個体を考慮した全体的感度および特異度は、それぞれ９０％および９２％であった。
図５、表１の裏づけとして、感度、特異度および予測値を、誘導期データを用いて測定し、カットオフ閾値は、ＭｅｄＣａｌｃソフトウェア（バーション１２．２．１．０、ＭｅｄＣａｌｃ、ベルギー所在）を用いた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析によって測定した。図５、表１に示される通り、９０．０％感度および８４．２％特異度が、非変性神経疾患を有する年齢が一致した個体からなる対照群について推定された。反対に、他の形態の認知症をはじめとする他の神経変性疾患からのＡＤの臨床的により関連した識別では、１００％感度および９４．６％特異度が推定された。ＡＤを他の形態の神経変性疾患と区別するためのＡβ－ＰＭＣＡのこの能力は、臨床的に有意である。全ての対照個体を考慮した全体的感度および特異度は、それぞれ９０％および９２％であった。
【0096】
Ａβ－ＰＭＣＡテストの性能を評価してＡＤ患者を対照と区別するために、真陽性率（感度）を、異なるカットオフポイントの偽陽性率（特異度）の関数としてプロットした。この解析では、ＡＤ対ＮＡＮＤ（図４Ａ）、ＡＤ対ＮＮＤ（図４Ｂ）、およびＡＤ対全ての対照試料（図４Ｃ）の誘導期の値を用いた。曲線下面積で推定されたテストの性能は、ＡＤに対して、ＮＡＮＤ、ＮＮＤおよび全ての対照と比較して、それぞれ０．９９６±０．００３３、０．９５±０．０２０および０．９７±０．０１１であった。統計解析を、ＭｅｄＣａｌｅ ＲＯＣ曲線解析ソフトウエア（バージョン１２．２．１．０）を用いて実施し、結果から、Ｐ＜０．０００１で該テストがＡＤを対照と区別し得ることが示された。異なる組み合わせでの群比較について最も信頼性のあるカットオフポイントを推定するために、感度（青色線）および特異度（赤色線）を、各カットオフ値についてプロットした（図４Ｄ）。グラフは、ＡＤ対全ての対照試料（ＮＡＮＤおよびＮＮＤ群を含む）の曲線および９５％信頼区間を示す。これらのカットオフ値を用いて、図５、表１の感度、特異度および予測値を推定した。
【0097】
実施例５：Ａβオリゴマー免疫枯渇はヒト脳脊髄液におけるＡβシードを除去し、Ａβ－ＰＭＣＡによるＡＤ ＣＳＦ中の可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の検出が確認される
免疫枯渇実験を実施して、Ａβ－ＰＭＣＡがＣＳＦ中に存在する可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質に関連するシーディング活性を検出することを確認した。可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の効率的免疫枯渇の方法論を最初に、合成的に調製された可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を用いることによって最適化した。免疫枯渇は、Ａβの配列を特異的に認識する抗体（４Ｇ８）とコンフォメーション抗体（Ａ１１）との混合物でコンジュゲートされたＤｙｎａｂｅａｄｓと共にインキュベートすることによって実施した。図７Ａは、ヒトＣＳＦに添加された合成的に調製されたＡβオリゴマーを用いた免疫枯渇の結果を示すウェスタンブロットである。可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質は、この免疫枯渇によって効率的に除去された。
免疫枯渇実験を実施して、Ａβ－ＰＭＣＡがＣＳＦ中に存在する可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質に関連するシーディング活性を検出することを確認した。可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の効率的免疫枯渇の方法論を最初に、合成的に調製された可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を用いることによって最適化した。免疫枯渇は、Ａβの配列を特異的に認識する抗体（４Ｇ８）とコンフォメーション抗体（Ａ１１）との混合物でコンジュゲートされたＤｙｎａｂｅａｄｓと共にインキュベートすることによって実施した。図７Ａは、ヒトＣＳＦに添加された合成的に調製されたＡβオリゴマーを用いた免疫枯渇の結果を示すウェスタンブロットである。可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質は、この免疫枯渇によって効率的に除去された。
【0098】
図７Ａおよび７Ｂは、チオフラビンＴ蛍光により測定された、アミロイド形成対時間のグラフであり、ＡＤ ＣＳＦ中のシーティング活性が可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質免疫枯渇によって除去されたことが実証される。４Ｇ８およびＡ１１抗体での免疫枯渇前または後のＡＤ ＣＳＦの試料を用いて、Ａβ－ＰＭＣＡアッセイにおいてＡβ凝集のシードにした。免疫枯渇を、３つのＡＤ ＣＳＦに適用した。図７Ｂは、対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料の反応速度を示すグラフである。図７Ｂは、免疫枯渇ＡＤ ＣＳＦの場合にＡβ－ＰＭＣＡ反応でのＡβ凝集の反応速度が対照ＣＳＦ試料で観察されたものと同等で、両者とも免疫枯渇前のＡＤ ＣＳＦで観察された凝集と有意に異なったことを示している。図７Ｃは、対照、およびＡβ－ＰＭＣＡアッセイによってモニタリングされたＡ１１コンフォメーション抗体および凝集のみが枯渇された免疫枯渇ＣＳＦ試料の反応速度を示すグラフである。図７Ｃは、ミスフォールディングＡβを特異的に認識するＡ１１コンフォメーション抗体を用いて免疫枯渇されたＡＤ ＣＳＦを用いて得られた類似の結果を示す。これらの結果から、Ａβ－ＰＭＣＡがＡＤ ＣＳＦ中の可溶性ミスフォールディングβタンパク質を検出することが確認される。
【0099】
実施例６：固相免疫捕捉
図８Ａおよび８Ｂは、血漿などの複合試料から可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を捕捉するために用いられる２つの固相法の略図である。方策１は、ＥＬＩＳＡプレート上の固相に結合された特異的抗体でプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いた。プレートを洗浄した後、Ａβ－ＰＭＣＡ反応を、同じプレートで実施した。方策２は、特異的抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを用いた。このアプローチは、試料の濃度を提供した。
図８Ａおよび８Ｂは、血漿などの複合試料から可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を捕捉するために用いられる２つの固相法の略図である。方策１は、ＥＬＩＳＡプレート上の固相に結合された特異的抗体でプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いた。プレートを洗浄した後、Ａβ－ＰＭＣＡ反応を、同じプレートで実施した。方策２は、特異的抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを用いた。このアプローチは、試料の濃度を提供した。
【0100】
実施例７：免疫捕捉の特異度
図９は、Ａβオリゴマーを捕捉する特異的抗体の能力を実証する表２を示す。上のパネルは、この試験で用いられた種々の配列の抗体のＡβタンパク質上のエピトープ認識部位の略図を示す。図９の表２は、Ａβオリゴマーを捕捉するための異なる配列およびコンフォメーション抗体の効率を実証している。オリゴマーを捕捉する能力を、健常なヒト血漿における合成Ａβオリゴマーの添加およびＡβ－ＰＭＣＡでの検出によって測定した。記号は、異なる抗体を用いた検出限界が＜１２ｆｍｏｌ（＋＋＋）；１０～１００ｆｍｏｌ（＋＋）；＞１ｐｍｏｌ（＋）、および捕捉試薬なし（－）よりも有意に高くない、を示している。
図９は、Ａβオリゴマーを捕捉する特異的抗体の能力を実証する表２を示す。上のパネルは、この試験で用いられた種々の配列の抗体のＡβタンパク質上のエピトープ認識部位の略図を示す。図９の表２は、Ａβオリゴマーを捕捉するための異なる配列およびコンフォメーション抗体の効率を実証している。オリゴマーを捕捉する能力を、健常なヒト血漿における合成Ａβオリゴマーの添加およびＡβ－ＰＭＣＡでの検出によって測定した。記号は、異なる抗体を用いた検出限界が＜１２ｆｍｏｌ（＋＋＋）；１０～１００ｆｍｏｌ（＋＋）；＞１ｐｍｏｌ（＋）、および捕捉試薬なし（－）よりも有意に高くない、を示している。
【0101】
実施例８：ヒト血漿に添加されたＡβオリゴマーの検出
図１０は、ヒト血漿に添加された可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の検出を示すチオフラビンＴ蛍光によって測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。プロテインＧでプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、抗コンフォメーション抗体（Ａｃｕｍｅｎの１６ＡＤＶ）でコーティングした。それゆえ、プレートを、そのままのヒト血漿（対照）（１００μｌ）または異なる濃度の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を添加されたヒト血漿（１００μｌ）と共にインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを、Ａβ４０モノマー（２μＭ）およびＴｈＴ（５μＭ）の存在下でＡβ－ＰＭＣＡに供した（２９分間インキュベーションおよび３０秒間振とう）。アミロイド形成を、チオフラビン蛍光によって測定した。図１０は、同様に働く３種の異なる抗体で実施された複数の実験の代表例である。
図１０は、ヒト血漿に添加された可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質の検出を示すチオフラビンＴ蛍光によって測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。プロテインＧでプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、抗コンフォメーション抗体（Ａｃｕｍｅｎの１６ＡＤＶ）でコーティングした。それゆえ、プレートを、そのままのヒト血漿（対照）（１００μｌ）または異なる濃度の合成可溶性ミスフォールディングＡβタンパク質を添加されたヒト血漿（１００μｌ）と共にインキュベートした。インキュベーション後に、プレートを、Ａβ４０モノマー（２μＭ）およびＴｈＴ（５μＭ）の存在下でＡβ－ＰＭＣＡに供した（２９分間インキュベーションおよび３０秒間振とう）。アミロイド形成を、チオフラビン蛍光によって測定した。図１０は、同様に働く３種の異なる抗体で実施された複数の実験の代表例である。
【0102】
実施例９：ＡＤ患者試料対対照による、それらからの可溶性ミスフォールディングＡβの捕捉
図１１は、ＡＤ患者および対照からの血漿試料中のＡβ－ＰＭＣＡアッセイにおいて５０％凝集に達するまでの時間を示すグラフである。ＡＤに罹患した患者、非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＤ）に罹患した患者および健常対照の血漿試料を、抗Ａβ抗体（８２Ｅ１）コーティングビーズと共にインキュベートした。Ａβ－ＰＭＣＡを、実施例２に記載された通り実施した。５０％凝集に達するのに必要となる時間を、各群の個々の患者で記録した。差は、一元配置分散分析と、それに続くテューキー多重比較事後検定によって解析した。このデータのＲＯＣ解析は、対照からＡＤ患者を正しく同定することに関して８２％の感度および１００％の特異度を示した。
図１１は、ＡＤ患者および対照からの血漿試料中のＡβ－ＰＭＣＡアッセイにおいて５０％凝集に達するまでの時間を示すグラフである。ＡＤに罹患した患者、非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＤ）に罹患した患者および健常対照の血漿試料を、抗Ａβ抗体（８２Ｅ１）コーティングビーズと共にインキュベートした。Ａβ－ＰＭＣＡを、実施例２に記載された通り実施した。５０％凝集に達するのに必要となる時間を、各群の個々の患者で記録した。差は、一元配置分散分析と、それに続くテューキー多重比較事後検定によって解析した。このデータのＲＯＣ解析は、対照からＡＤ患者を正しく同定することに関して８２％の感度および１００％の特異度を示した。
【0103】
実施例１０：音波処理および振とうは様々な検出方法で効果的になる
図１２は、凝集を断片化する手段として振とうの代わりに音波処理を利用することによるＡβ凝集の増幅の結果を示すウェスタンブロットである。実験は、異なる量の合成Ａβオリゴマーの存在下で実施した。１０μｇ／ｍｌシード不含モノマーＡβ１－４２の試料を、単独（レーン１）で、または３００（レーン２）ｆｍｏｌ、３０（レーン３）ｆｍｏｌおよび３（レーン４）ｆｍｏｌのミスフォールディングＡβと共にインキュベートした。試料は、増幅せずに凍結するか（非増幅）、または９６ＰＭＣＡサイクルに供し（増幅）、それぞれには３０分間のインキュベーションと、その後の２０秒間の音波処理が含まれた。凝集Ａβを、プロテアーゼＫ（ＰＫ）での試料の処置後の抗Ａβ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。本発明者らの実験では、チオフラビンＴ蛍光を用いた検出が音波処理と適合性がなく、物理的破壊法としての振とうによって非常にうまくいくことが観察された。図１２は、Ａβ凝集物のための異なる検出法、この場合、ウェスタンブロットを用いると、音波処理が振とうと同様にうまく働くことを示している。
図１２は、凝集を断片化する手段として振とうの代わりに音波処理を利用することによるＡβ凝集の増幅の結果を示すウェスタンブロットである。実験は、異なる量の合成Ａβオリゴマーの存在下で実施した。１０μｇ／ｍｌシード不含モノマーＡβ１－４２の試料を、単独（レーン１）で、または３００（レーン２）ｆｍｏｌ、３０（レーン３）ｆｍｏｌおよび３（レーン４）ｆｍｏｌのミスフォールディングＡβと共にインキュベートした。試料は、増幅せずに凍結するか（非増幅）、または９６ＰＭＣＡサイクルに供し（増幅）、それぞれには３０分間のインキュベーションと、その後の２０秒間の音波処理が含まれた。凝集Ａβを、プロテアーゼＫ（ＰＫ）での試料の処置後の抗Ａβ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。本発明者らの実験では、チオフラビンＴ蛍光を用いた検出が音波処理と適合性がなく、物理的破壊法としての振とうによって非常にうまくいくことが観察された。図１２は、Ａβ凝集物のための異なる検出法、この場合、ウェスタンブロットを用いると、音波処理が振とうと同様にうまく働くことを示している。
【0104】
実施例１１：ＰＭＣＡ基質としてのモノマーＡβの生成
シード不含モノマーＡβを、サイズ排除クロマトグラフィーによって得た。手短に述べると、ジメチルスルホキシド中で調製された１ｍｇ／ｍＬペプチド溶液のアリコットを、ｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸ナトリウムで０．５ｍＬ／分で溶出されるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いて分画した。ピークは、２２０ｎｍのＵＶ吸収によって検出される。Ａβのモノマー／ダイマーを含む４～１０ｋＤａ分子量に対応するピークを回収して、アミノ酸分析によって濃度を測定した。試料を貯蔵して、－８０℃で凍結乾燥した。
シード不含モノマーＡβを、サイズ排除クロマトグラフィーによって得た。手短に述べると、ジメチルスルホキシド中で調製された１ｍｇ／ｍＬペプチド溶液のアリコットを、ｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸ナトリウムで０．５ｍＬ／分で溶出されるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いて分画した。ピークは、２２０ｎｍのＵＶ吸収によって検出される。Ａβのモノマー／ダイマーを含む４～１０ｋＤａ分子量に対応するピークを回収して、アミノ酸分析によって濃度を測定した。試料を貯蔵して、－８０℃で凍結乾燥した。
【0105】
実施例１２：Ａβの生成および精製
ｐＥＴ２８ ＧｒｏＥＳ－Ｕｂ－Ａβ４２プラスミドを含む大腸菌細胞を、３７℃のルリアブロス（ＬＢ）培地で増殖させて、発現を０．４ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。４時間後に、細胞を採取して、溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ β－メルカプトエタノール）に溶解し、１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。封入小体を、６Ｍ尿素を含有する再懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁させた。不溶性タンパク質を、１８，０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離によって除去した。ＧｒｏＥＳ－Ｕｂ－Ａβ４２融合タンパク質を含む上清が回収される。融合タンパク質からＡβ４２を切除するために、融合タンパク質を再懸濁緩衝液で２倍希釈し、１：１００の酵素対基質モル比の組換え脱ユビキチン化酵素（Ｕｓｐ２ｃｃ）により３７℃で２時間処理した。その後、試料をＣ１８カラム（２５ｍｍ×２５０ｍｍ、米国のＧｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ）にロードした。Ａβ４２を、溶媒系緩衝液１（３０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ１０）、２％アセトニトリル）および緩衝液２（７０％アセトニトリル）で、緩衝液２の２０～４０％直線勾配を利用して、流速１０ｍｌ／分で３５分間にわたり精製した。精製されたＡβ４２を凍結乾燥して、使用まで－８０℃で貯蔵した。
ｐＥＴ２８ ＧｒｏＥＳ－Ｕｂ－Ａβ４２プラスミドを含む大腸菌細胞を、３７℃のルリアブロス（ＬＢ）培地で増殖させて、発現を０．４ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。４時間後に、細胞を採取して、溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ β－メルカプトエタノール）に溶解し、１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。封入小体を、６Ｍ尿素を含有する再懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁させた。不溶性タンパク質を、１８，０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離によって除去した。ＧｒｏＥＳ－Ｕｂ－Ａβ４２融合タンパク質を含む上清が回収される。融合タンパク質からＡβ４２を切除するために、融合タンパク質を再懸濁緩衝液で２倍希釈し、１：１００の酵素対基質モル比の組換え脱ユビキチン化酵素（Ｕｓｐ２ｃｃ）により３７℃で２時間処理した。その後、試料をＣ１８カラム（２５ｍｍ×２５０ｍｍ、米国のＧｒａｃｅ Ｖｙｄａｃ）にロードした。Ａβ４２を、溶媒系緩衝液１（３０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ１０）、２％アセトニトリル）および緩衝液２（７０％アセトニトリル）で、緩衝液２の２０～４０％直線勾配を利用して、流速１０ｍｌ／分で３５分間にわたり精製した。精製されたＡβ４２を凍結乾燥して、使用まで－８０℃で貯蔵した。
【0106】
実施例１３：ＰＤ－ＰＭＣＡによるαＳシードの検出
実施例１３Ａ：αＳ凝集物のシーディングを、異なる量の合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質：対照（αＳオリゴマー不含）；または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、および１μｇ／ｍＬ合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質シードを含み、または含まずに、チオフラビンＴの存在下でシード不含αＳの溶液をインキュベーションすることによって試験した。αＳ－ＰＭＣＡの一般的手順：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００μｇ／ｍＬαＳシード不含αＳの溶液（総量２００μＬ）を、不透明９６ウェルプレートに入れ、単独で、または示された濃度の合成αＳ凝集物もしくはＣＳＦアリコット４０μＬの存在下でインキュベートした。試料を５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下でインキュベートし、２２℃の一定温度でＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを利用して周期的攪拌に供した（５００ｒｐｍで１分間、その後、振とうせずに２９分間）。様々な時点で、ＴｈＴ蛍光をプレート内で、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍで測定した。図１３Ａは、示された濃度の合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質シードを用いた、ＰＤ－ＰＭＣＡによるαＳシードの検出を示す、時間の関数としてのチオフラビンＴ蛍光のグラフである。緩衝液のペプチド濃度、温度およびｐＨをモニタリングして、誘導期の度合いおよび実験間の再現性を制御した。モノマーαＳタンパク質の凝集が、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質シードのαＳの存在下で観察された。
実施例１３Ａ：αＳ凝集物のシーディングを、異なる量の合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質：対照（αＳオリゴマー不含）；または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、および１μｇ／ｍＬ合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質シードを含み、または含まずに、チオフラビンＴの存在下でシード不含αＳの溶液をインキュベーションすることによって試験した。αＳ－ＰＭＣＡの一般的手順：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１００μｇ／ｍＬαＳシード不含αＳの溶液（総量２００μＬ）を、不透明９６ウェルプレートに入れ、単独で、または示された濃度の合成αＳ凝集物もしくはＣＳＦアリコット４０μＬの存在下でインキュベートした。試料を５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下でインキュベートし、２２℃の一定温度でＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを利用して周期的攪拌に供した（５００ｒｐｍで１分間、その後、振とうせずに２９分間）。様々な時点で、ＴｈＴ蛍光をプレート内で、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍで測定した。図１３Ａは、示された濃度の合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質シードを用いた、ＰＤ－ＰＭＣＡによるαＳシードの検出を示す、時間の関数としてのチオフラビンＴ蛍光のグラフである。緩衝液のペプチド濃度、温度およびｐＨをモニタリングして、誘導期の度合いおよび実験間の再現性を制御した。モノマーαＳタンパク質の凝集が、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質シードのαＳの存在下で観察された。
【0107】
実施例１３Ｂ：添加されたαＳシードの量の関数としての５０％凝集に達するまでの時間を、実施例１Ａの試料を用いて測定した。図１３Ｂは、添加されたαＳシードの量の関数としてプロットされた５０％凝集に達するまでの時間を示すグラフである。
【0108】
実施例１４：αＳ－ＰＭＣＡはＰＤ患者の脳脊髄液中のオリゴマーαＳを検出する
対照およびＰＤ患者から得られたヒトＣＳＦ試料中のシーディング活性の検出を、ＰＤ－ＰＭＣＡによって実施した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の精製されたシード不含アルファ－シヌクレイン（１００μｇ／ｍＬ）を、確認されたＰＤ、ＡＤまたは非神経変性神経病（ＮＮＤ）を有するヒト患者から得られたＣＳＦの存在下、５００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で凝集させた。凝集の度合いを、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍのチオフラビン蛍光によってモニタリングした。
対照およびＰＤ患者から得られたヒトＣＳＦ試料中のシーディング活性の検出を、ＰＤ－ＰＭＣＡによって実施した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の精製されたシード不含アルファ－シヌクレイン（１００μｇ／ｍＬ）を、確認されたＰＤ、ＡＤまたは非神経変性神経病（ＮＮＤ）を有するヒト患者から得られたＣＳＦの存在下、５００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で凝集させた。凝集の度合いを、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍのチオフラビン蛍光によってモニタリングした。
【0109】
ＣＳＦのアリコットを、ＰＤ患者、非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した認知的に正常な個体、およびアルツハイマー病（ＡＤ）に罹患した患者から得た。テストＣＳＦ試料を、ＤＳＭ－ＩＶによる定義と、様々なテスト、例えば日常的医学検査、神経学的評価、神経心理学的評定、および磁気共鳴画像などを利用した測定と、によりおそらくＰＤであると診断された患者から得た。ＣＳＦ試料は、一夜絶食後に非外傷性針によるＬ４／Ｌ５間またはＬ３／Ｌ４間の腰部穿刺によってポリプロピレン試験管に採取した。試料を４℃および３，０００ｇで３分間遠心分離し、分取して、分析まで－８０℃で貯蔵した。ＣＳＦ細胞カウント、グルコースおよびタンパク質濃度を測定した。アルブミンを、レートネフェロメトリーによって測定した。血液脳関門の統合性および髄腔内ＩｇＧ産生を評価するために、アルブミン比率（ＣＳＦ アルブミン／血清アルブミン）×１０３およびＩｇＧ指数（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）（ＣＳＦ ＩｇＧ／血清ＩｇＧ）を計算した。この試験は、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎの条項にしたがって実施され、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可された。
【0110】
実験と分析の開始部分は、盲検で実施した。図１４は、ＰＤ、ＡＤおよびＮＮＤ群から得られた代表的試料のαＳ凝集の平均反応速度を示すＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたαＳオリゴマー化対時間のグラフである。
【0111】
結果から、ＰＤ患者からのＣＳＦが対照ＣＳＦに比較してαＳ凝集を有意に促進することが示される（Ｐ＜０．００１）。ヒトＣＳＦ試料の存在下でのαＳ凝集反応速度における差の有意性は、一元配置分散分析と、それに続くテューキー多重比較事後検定によって解析した。有意水準は、Ｐ＜０．０５に設定した。ＰＤと他の２群の試料との差は、Ｐ＜０．００１（＊＊＊）で高い有意性があった。
【0112】
実施例１５：免疫捕捉の特異度
図１５は、αＳオリゴマーを捕捉する異なる配列またはコンフォメーション抗体の能力を実証する表３を示す。オリゴマーを捕捉する能力は、健常ヒト血漿に合成αＳオリゴマーを添加し、αＳ－ＰＭＣＡで検出することによって測定される。最初の欄は、テストされた様々な抗体および対応する商業的供給元を示す。二番目の欄は、この試験で用いられた種々の配列の抗体のαＳタンパク質上のエピトープ認識部位の列挙である。三番目の欄は、αＳオリゴマーを捕捉するための特異的抗体の観察された能力を示す。記号は、異なる抗体を用いた検出限界が＜１２ｆｍｏｌ（＋＋＋）；１０～１００ｆｍｏｌ（＋＋）；＞１ｐｍｏｌ（＋）、および捕捉試薬なし（－）よりも有意に高くない、を示している。アルファ／ベータ－シヌクレイン抗体Ｎ－１９（Ｎ－末端エピトープ）およびアルファ－シヌクレイン抗体Ｃ－２０－Ｒ（Ｃ末端エピトープ）は最良の結果を示し、アルファ－シヌクレイン抗体２１１（エピトープ：アミノ酸１２１～１２５）は、非常に良好な結果を示し、アルファ－シヌクレイン抗体２０４（エピトープ：断片１～１３０）は、良好な結果を示し、１６ＡＤＶマウスＩｇＧ１（コンフォメーションエピトープ）は、結果を示さなかった。
図１５は、αＳオリゴマーを捕捉する異なる配列またはコンフォメーション抗体の能力を実証する表３を示す。オリゴマーを捕捉する能力は、健常ヒト血漿に合成αＳオリゴマーを添加し、αＳ－ＰＭＣＡで検出することによって測定される。最初の欄は、テストされた様々な抗体および対応する商業的供給元を示す。二番目の欄は、この試験で用いられた種々の配列の抗体のαＳタンパク質上のエピトープ認識部位の列挙である。三番目の欄は、αＳオリゴマーを捕捉するための特異的抗体の観察された能力を示す。記号は、異なる抗体を用いた検出限界が＜１２ｆｍｏｌ（＋＋＋）；１０～１００ｆｍｏｌ（＋＋）；＞１ｐｍｏｌ（＋）、および捕捉試薬なし（－）よりも有意に高くない、を示している。アルファ／ベータ－シヌクレイン抗体Ｎ－１９（Ｎ－末端エピトープ）およびアルファ－シヌクレイン抗体Ｃ－２０－Ｒ（Ｃ末端エピトープ）は最良の結果を示し、アルファ－シヌクレイン抗体２１１（エピトープ：アミノ酸１２１～１２５）は、非常に良好な結果を示し、アルファ－シヌクレイン抗体２０４（エピトープ：断片１～１３０）は、良好な結果を示し、１６ＡＤＶマウスＩｇＧ１（コンフォメーションエピトープ）は、結果を示さなかった。
【0113】
実施例１６：固相免疫捕捉
図１６Ａおよび１６Ｂは、血漿などの複合試料から可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を捕捉するために用いられる２つの固相法の略図である。方策１は、ＥＬＩＳＡプレート上の固相に結合された特異的抗体でプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いた。プレートを洗浄した後、αＳ－ＰＭＣＡ反応を、同じプレートで実施した。方策２は、特異的抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを用いた。このアプローチは、試料の濃度を提供した。
図１６Ａおよび１６Ｂは、血漿などの複合試料から可溶性ミスフォールディングαＳタンパク質を捕捉するために用いられる２つの固相法の略図である。方策１は、ＥＬＩＳＡプレート上の固相に結合された特異的抗体でプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いた。プレートを洗浄した後、αＳ－ＰＭＣＡ反応を、同じプレートで実施した。方策２は、特異的抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを用いた。このアプローチは、試料の濃度を提供した。
【0114】
実施例１７：ヒト血漿に添加されたα－シヌクレインオリゴマーの検出のためのαＳ－ＰＭＣＡ
ヒト血漿からのα－シヌクレインオリゴマーの免疫沈降を、抗α－シヌクレイン抗体でコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、および検出のためにチオフラビン－Ｔと共にシーディング基質としてα－シヌクレインモノマーを用いるシーディング凝集アッセイによって実施した。抗α－シヌクレイン抗体でコーティングされたビーズ（１×１０７個）を、α－シヌクレインシード（＋０．２μｇシード）を含み、またはα－シヌクレインシードを含まずに（－シード）、ヒト血漿（５００μＬ）と共にインキュベートした。免疫沈降後に、ビーズを反応緩衝液２０μＬに再懸濁させて（１×ＰＢＳ）、ビーズ１０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。凝集アッセイを、α－シヌクレインモノマー（２００μｇ／ｍＬ）およびチオフラビン－Ｔ（５μＭ）を添加することにより実施した。蛍光の増加を、４３５ｎｍでの励起および４８５ｎｍでの発光を利用した蛍光光度計によってモニタリングした。図１７Ａは、シードを含む、または含まない、血漿中のＮ－１９抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。図１７Ｂは、シードを含む、または含まない、血漿中の２１１抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。図１７Ｃは、シードを含む、または含まない、血漿中のＣ－２０抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。
ヒト血漿からのα－シヌクレインオリゴマーの免疫沈降を、抗α－シヌクレイン抗体でコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）、および検出のためにチオフラビン－Ｔと共にシーディング基質としてα－シヌクレインモノマーを用いるシーディング凝集アッセイによって実施した。抗α－シヌクレイン抗体でコーティングされたビーズ（１×１０７個）を、α－シヌクレインシード（＋０．２μｇシード）を含み、またはα－シヌクレインシードを含まずに（－シード）、ヒト血漿（５００μＬ）と共にインキュベートした。免疫沈降後に、ビーズを反応緩衝液２０μＬに再懸濁させて（１×ＰＢＳ）、ビーズ１０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。凝集アッセイを、α－シヌクレインモノマー（２００μｇ／ｍＬ）およびチオフラビン－Ｔ（５μＭ）を添加することにより実施した。蛍光の増加を、４３５ｎｍでの励起および４８５ｎｍでの発光を利用した蛍光光度計によってモニタリングした。図１７Ａは、シードを含む、または含まない、血漿中のＮ－１９抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。図１７Ｂは、シードを含む、または含まない、血漿中の２１１抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。図１７Ｃは、シードを含む、または含まない、血漿中のＣ－２０抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。
【0115】
実施例１８：αＳ－ＰＭＣＡはＰＤおよび多系統萎縮症に罹患した患者の脳脊髄液中のオリゴマーαＳを高い感度および特異度で検出する
ＰＤおよび関連のα－シヌクレイン病、例えば多系統萎縮症（ＭＳＡ）の生化学的診断のためのαＳ－ＰＭＣＡの効率を試験するために、テストを、これらの疾患に罹患した多くの患者および他の疾患に罹患した対照からのＣＳＦで実施した。図１８Ａ、１８Ｂ、および１８Ｃは、αＳ－ＰＭＣＡを用いた、それぞれ対照、ならびにＰＤおよびＭＳＡに罹患した患者のヒトＣＳＦ試料中のシーディング活性の検出を示している。緩衝液ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中の精製されたシード不含アルファ－シヌクレイン（１００μｇ／ｍＬ）を、ヒト患者および対照からのＣＳＦの存在下、５００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で凝集させた。凝集の度合いを、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍのチオフラビン蛍光によってモニタリングした。
ＰＤおよび関連のα－シヌクレイン病、例えば多系統萎縮症（ＭＳＡ）の生化学的診断のためのαＳ－ＰＭＣＡの効率を試験するために、テストを、これらの疾患に罹患した多くの患者および他の疾患に罹患した対照からのＣＳＦで実施した。図１８Ａ、１８Ｂ、および１８Ｃは、αＳ－ＰＭＣＡを用いた、それぞれ対照、ならびにＰＤおよびＭＳＡに罹患した患者のヒトＣＳＦ試料中のシーディング活性の検出を示している。緩衝液ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中の精製されたシード不含アルファ－シヌクレイン（１００μｇ／ｍＬ）を、ヒト患者および対照からのＣＳＦの存在下、５００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で凝集させた。凝集の度合いを、プレート分光蛍光計を用いて４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍのチオフラビン蛍光によってモニタリングした。
【0116】
テストＣＳＦ試料を、ＤＳＭ－ＩＶによる定義と、様々なテスト、例えば日常的医学検査、神経学的評価、神経心理学的評定、および磁気共鳴画像などを利用した測定と、によりおそらくＰＤおよびＭＳＡであると診断された患者から得た。ＣＳＦ試料は、一夜絶食後に非外傷性針によるＬ４／Ｌ５間またはＬ３／Ｌ４間の腰部穿刺によってポリプロピレン試験管に採取した。試料を４℃および３，０００ｇで３分間遠心分離し、分取して、分析まで－８０℃で貯蔵した。ＣＳＦ細胞カウント、グルコースおよびタンパク質濃度を測定した。アルブミンを、レートネフェロメトリーによって測定した。この試験は、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎの条項にしたがって実施され、Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可された。
【0117】
実験と分析の開始部分は、盲検で実施した。図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃは、それぞれ対照と、ＰＤおよびＭＳＡ群から得られた２つの代表的試料と、のαＳ凝集の平均反応速度を示すＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたαＳ凝集対時間のグラフである。
【0118】
結果から、ＰＤ患者からのＣＳＦが対照ＣＳＦに比較してαＳ凝集を有意に促進することが示される（Ｐ＜０．００１）。ヒトＣＳＦ試料の存在下でのαＳ凝集反応速度における差の有意性は、一元配置分散分析と、それに続くテューキー多重比較事後検定によって解析した。有意水準は、Ｐ＜０．０５に設定した。ＰＤと他の２群の試料との差は、Ｐ＜０．００１（＊＊＊）で高い有意性があった。
【0119】
２９のＰＤまたはＭＳＡ試料と、４１の対照との全組の結果は、２９のＰＤまたはＭＳＡ試料のうち２６が陽性であったが、４１の対照試料では３つが陽性であり、９０％感度および９３％特異度に対応した。
【0120】
用語「包含する」または「包含している」が、本明細書または特許請求の範囲で用いられる限りにおいて、それは、過渡的言語として用いられる場合に解釈される用語「含んでいる」と類似の手法で包括的とする。さらに用語「または」が用いられる限りにおいて（例えば、ＡまたはＢ）、それは、「ＡもしくはＢまたはその両方」を意味するものとする。本出願者らが、「ＡまたはＢのみであって両方ではないこと」を示す場合、用語「ＡまたはＢであり両方でない」が用いられよう。したがって本明細書における用語「または」の使用は、包括的使用であり、排他的使用ではない。Ｂｒｙａｎ Ａ． Ｇａｒｎｅｒ， Ａ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｌｅｇａｌ Ｕｓａｇｅ ６２４ （２ｄ． Ｅｄ． １９９５）を参照されたい。同じく、用語「の中の」または「の中へ」が本明細書または特許請求の範囲で用いられる限りにおいて、それは、追加的に「の上で」または「の上へ」を意味する。用語「選択的に」が本明細書または特許請求の範囲で用いられる限りにおいて、それは、装置のユーザが装置使用において必要となるまたは望む構成要素の特色または機能を活性化または脱活性化し得るような構成要素の条件を指す。用語「動作可能に連結された」が本明細書または特許請求の範囲で用いられる限りにおいて、それは、識別された構成要素が指定された機能を実施する方法で連結されていることを意味するものとする。用語「実質的に」が本明細書または特許請求の範囲で用いられる限りにおいて、それは、識別された構成要素が対象となる業界で許容され得る誤差の度合いで示される関係または性能を有することを意味するものとする。
【0121】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その単数形が明記しない限りは複数を含むものとする。例えば「ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」は、２つ以上の化合物の混合物および単一化合物を含み得る。
【0122】
本明細書で数値と共に用いられる用語「約」は、その通史の±１０％を含むものとする。言い換えれば「約１０」は、９～１１を意味し得る。
【0123】
本明細書で用いられる用語「場合による」および「場合により」は、次に記載される状況が、起こる場合、または起こらない場合があり、そのためその記載は、その状況が起こる例と、起こらない例を含む。
【0124】
加えて、本開示の特色または態様が、マーカッシュ群に関して記載されている場合、本開示がそれによってマーカッシュ群の任意の各構成要素または構成要素の下位群に関しても記載されることは、当業者に認識されるであろう。当業者に理解される通り、記載された説明を提供することに関してなど、あらゆる目的で、本明細書に開示された全ての範囲も、あらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲を十分に記載し、少なくとも均等な半量、三分の一、四分の一、五分の一に分割することができるものと容易に認識することができる。非限定的例として、本明細書で議論された各範囲は、下部三分の一、中部三分の一および上部三分の一などに即座に分割され得る。同じく当業者に理解される通り、「まで」、「少なくとも」、「を超える」、「未満」などの全ての言語が、列挙された数値を含み、先に議論された通り次に下位範囲に分割され得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるであろうが、範囲は個々の構成要素を含む。例えば１～３個のセルを有する群は、１、２、または３個のセルを有する群を指す。同様に１～５個のセルを有する群は、１、２、３、４、または５個のセルを有する群を指す、などとなる。様々な態様および実施形態が、本明細書に開示されたが、他の態様および実施形態が、当業者に自明となろう。
【0125】
先に述べられた通り、本出願は、その実施形態の記述によって例示されており、その実施形態は、かなり詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲をそのような詳細に制限または限定することが本出願者の意図ではない。本出願の利益を有するさらなる利点および改良が、当業者に即座に明らかとなろう。それゆえ本出願は、より広範囲の態様において、特定の詳細、示された例示的実施例、または参照された任意の装置に限定されない。本発明の一般的概念の主旨および範囲を逸脱することなく、そのような詳細、実施例、および装置から逸脱することができる。
【0126】
本明細書に開示された様々な態様および実施形態は、例示を目的としており、限定ではなく、真の範囲および主旨は、以下の特許請求の範囲に示されている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18A】
【図18B】
【図18C】