特許7105304尿路上皮がんの治療における抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲートの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-13
(45)【発行日】2022-07-22
(54)【発明の名称】尿路上皮がんの治療における抗ＨＥＲ２抗体－薬物コンジュゲートの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20220714BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220714BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20220714BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220714BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61K39/395 T ZNA
A61K39/395 L
A61K38/07
A61P35/00
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2020529589
(86)(22)【出願日】2019-08-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-02-15
(86)【国際出願番号】 CN2019101283
(87)【国際公開番号】W WO2020042941
(87)【国際公開日】2020-03-05
【審査請求日】2020-06-01
(31)【優先権主張番号】201810998055.4
(32)【優先日】2018-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520087262
【氏名又は名称】レメゲン シーオー．，エルティーディー．
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＭＥＧＥＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｄｏｎｇ）Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔａｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｙａｎｔａｉ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ，Ｎｏ．５８ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】房 健民
【審査官】高橋 樹理
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２８９０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Bladder Cancer，2018年07月，Vol.4，p.247-259
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／６８
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＨＥＲ２抗体またはその機能的断片が細胞傷害性分子にカップリングした抗体－薬物コンジュゲート （ＡＤＣ）の、尿路上皮がんを治療するための薬物の調製における使用であって、前記抗体－薬物コンジュゲートは、一般式Ａｂ－（Ｌ－Ｕ）ｎ（式中、Ａｂは、前記抗体またはその機能的断片を表し、Ｌは、リンカーを表し、Ｕは、カップリングした細胞傷害性分子を表し、ｎは、１～８の整数であり、各抗体に結合した治療剤の分子数を表す）で表される構造を有し、
前記抗体またはその機能的断片は、以下のＣＤＲ（相補性決定領域）配列で限定される抗体と同じエピトープに競合的に結合し、前記ＣＤＲ配列で限定される抗体は、
（ｉ）３つのＣＤＲを含み、ここで、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び、
（ｉｉ）３つのＣＤＲを含み、ここで、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、
前記リンカーは、マレイミド－カプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシ（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏ－Ｃａｐｒｏｙｌ－Ｖａｌｉｎｅ－Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ－ｐ－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ，ｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢ）であり、
前記細胞傷害性分子は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である使用。
【請求項2】
前記抗体またはその機能的断片は、（ｉ）３つのＣＤＲを含み、ここで、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び、
（ｉｉ）３つのＣＤＲを含み、ここで、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記抗体またはその機能的断片は、マウス由来、キメラ又はヒト化のものである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項4】
前記抗体またはその機能的断片は、２０１３年０８月２２日に受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．８１０２で中国微生物菌種収集管理委員会の一般微生物学センターに寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗体に由来する、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項5】
前記抗体またはその機能的断片は、２０１３年１１月０６日に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１３１７０で中国典型培養物保蔵センターに寄託されたＣＨＯ細胞によって分泌される抗体に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項6】
前記尿路上皮がんは、外科的切除不能な局所進行性尿路上皮がん、局所進行性または転移性尿路上皮がん、ＨＥＲ２陽性の尿路上皮がん、および、ＨＥＲ２陽性の局所進行性または転移性尿路上皮がんからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項7】
前記薬物は、さらに、薬学的に許容される担体を含み、前記薬物は、好ましくは凍結乾燥剤又は液体製剤であり、前記担体は、安定剤、保護剤、緩衝液、凍結乾燥保護剤、活性保護剤、界面活性剤、吸着担体、および、吸収促進剤からなる群から選択される１つ又は複数である、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項8】
前記薬物は、鼻腔内、皮下、皮内、筋肉内又は静脈内に投与することができる、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項9】
前記尿路上皮がんは、外科的切除不能な局所進行性尿路上皮がんである、請求項６に記載の使用。
【請求項10】
前記尿路上皮がんは、局所進行性または転移性尿路上皮がんである、請求項６に記載の使用。
【請求項11】
前記尿路上皮がんは、ＨＥＲ２陽性の尿路上皮がんである、請求項６に記載の使用。
【請求項12】
前記尿路上皮がんは、ＨＥＲ２陽性の局所進行性または転移性尿路上皮がんである、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、尿路上皮がんの治療における抗ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体 ２、ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）抗体－薬物コンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
尿路上皮がん（Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＵＣ；移行上皮癌とも呼ばれ、Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＴＣＣ）は、腎臓、膀胱、及び尿管などの尿路系で通常見られる癌の一種である。それは、膀胱癌及び尿管、尿道または尿膜管の癌の中で最も一般的なタイプの癌である。また、腎癌の２番目に多いタイプであり、すべての原発性腎悪性腫瘍の５～１０％を占めている。
【0003】
尿路上皮（移行上皮とも呼ばれる）は、膀胱、尿管、尿道の内側及び腎盂（腎臓内の尿のたまるところ）の内層である。それは、尿路上皮細胞または移行細胞で構成される。これらの細胞は、がん細胞に発展する可能性があり、尿路上皮がん（または移行上皮がん）と呼ばれる。
【0004】
癌化細胞の浸潤性に応じて、尿路上皮がんは非浸潤性（膀胱の内層のみ）または浸潤性（膀胱壁の他の層への増殖）になることができる。そのうち、非浸潤性尿路上皮がんは膀胱子宮内膜にのみ存在し、膀胱壁でより深くまでは増殖しない。診断時に、５０％～６０％の尿路上皮がんの患者は非浸潤性である。非浸潤性尿路上皮がんの種類は、非浸潤性扁平上皮がん（上皮内癌とも呼ばれる）、高悪性度の非浸潤性乳頭尿状路上皮がん、低悪性度の非浸潤性乳頭尿状路上皮がんを含み、低悪性潜能を有する非浸潤性乳頭尿状路上皮腫瘍が浸潤性がんに進展する可能性が小さくなる。
【0005】
それと比較しては、浸潤性尿路上皮がんは、膀胱の内層から、結合組織（固有層と呼ばれ）及び筋肉層（筋層と呼ばれ）などの膀胱壁のより深い層に増殖する。診断時に、４０％～５０％の尿路上皮がん患者の腫瘍は、浸潤性である。
【0006】
理論的には、尿路上皮がんは、腎盂、尿管、膀胱及び尿道を含むがこれらに限定されない尿路の任意の部分から開始し得る。
【0007】
関連する腫瘍細胞から転移が起こる前に、外科的切除が最も好ましい治療計画である。転移した腫瘍を有する患者は、一般的に抗がん剤による治療を必要とし、現在の第一選択療法は、ゲムシタビンとシスプラチンの併用療法であるが、放射線療法は尿路上皮がんに理想的ではなく、一般に補助療法として使用される。腎盂／尿管上皮のガンを治療する場合に、ＢＣＧ注射療法（カテーテルによるマイコバクテリウムボビスの注射）を使用することができる。
【0008】
尿路上皮がんは、多中心性に発生し、再発しやすい特徴を有し、筋層に侵入する腫瘍を有する患者は、膀胱全摘術が最も好ましく、且つ手術後に厳密な再検査を必要とするため、治療の難易度は大きく、再発率は高い。（李学松、王剛、張騫編．泌尿器科病例精粹、北京大学医学出版社、２０１７）。一部の患者は、術後早期（２４時間以内）に１回投与量又は手術の数週後に６回投与量としてマイトマイシン（化学療法剤）を膀胱に投与することも選択されてもよい治療方法である。現在、シスプラチンベースの化学療法は、依然として転移性ＵＣ患者のゴールドスタンダードであり、シスプラチンベースの化学療法の全奏効率（ＯＲＲ）は６０～７０％であり、全生存期間（ＯＳ）は１４～１５ヶ月であり、５年生存率は１３～１５％であり、再発後のプラチナベースの化学療法では、ＯＲＲは約１５％であり、ＯＳの中央値は約７ヶ月である。
【0009】
ビンフルニンは、進行性尿上皮または転移性ＴＣＣ（Ｂｅｌｌｍｕｎｔ、Ｊ．ｅｔａｌ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２７（２７）：４４５４－４４６１（２００９））の治療のための使用がヨーロッパで承認されている。いくつかの薬剤は、単剤療法でテストされ、中等度の活動を示し、且つ生存期間中央値が５～１０ヶ月である（Ｙａｆｉ、Ｆ．Ａ．ｅｔａｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：ｅ２５－ｅ３４（２０１１））。転移例では、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）は救済オプションとして移行細胞癌患者に投与され（ＮＣＣＮ ２０１４）、且つ米国及びカナダ（Ｃａｎａｄａ）の医学界は、第II相臨床試験からの証拠に基づいて進行性疾患をドセタキセルで治療することを承認している（ＷＯ２０１６／０６４６４９Ａ１）。
【0010】
近年、尿路上皮がんの治療のための新薬は、主に以下の通りである。
１．ロシュ社のアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）は、２０１６年に販売が承認された最初のＰＤ－Ｌ１がん免疫療法薬であり、局所進行または転移性尿道膀胱癌に対するアテゾリズマブの最新の第III相臨床試験（ＩＭｖｉｇｏｒ２１１）による結果は、アテゾリズマブが第ＩＩＩ相ＩＭｖｉｇｏｒ２１１試験の主要な臨床エンドポイント、即ち、局所進行または転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）患者のセカンドライン治療の全生存率（ＯＳ）の改善を満たさないことを示している。合計２３４例の患者（アテゾリズマブ群１１６例、化学療法群１１８例）では、アテゾリズマブ群の全生存期間の中央値は１１．１ヶ月であり、化学療法群は１０．６ヶ月であり、それらの群のうちの評価可能な患者の確診客観的奏効率はそれぞれ２３％及び２２％であり、奏効持続期間の中央値はそれぞれ１５．９ヶ月及び８．３ヶ月である。
１．ロシュ社のアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）は、２０１６年に販売が承認された最初のＰＤ－Ｌ１がん免疫療法薬であり、局所進行または転移性尿道膀胱癌に対するアテゾリズマブの最新の第III相臨床試験（ＩＭｖｉｇｏｒ２１１）による結果は、アテゾリズマブが第ＩＩＩ相ＩＭｖｉｇｏｒ２１１試験の主要な臨床エンドポイント、即ち、局所進行または転移性尿路上皮癌（ｍＵＣ）患者のセカンドライン治療の全生存率（ＯＳ）の改善を満たさないことを示している。合計２３４例の患者（アテゾリズマブ群１１６例、化学療法群１１８例）では、アテゾリズマブ群の全生存期間の中央値は１１．１ヶ月であり、化学療法群は１０．６ヶ月であり、それらの群のうちの評価可能な患者の確診客観的奏効率はそれぞれ２３％及び２２％であり、奏効持続期間の中央値はそれぞれ１５．９ヶ月及び８．３ヶ月である。
【0011】
それらの群での無増悪生存期間の中央値は２．４ヶ月であり（対照は４．２ヶ月）、治療が意図される対象群への探索的分析では、１２ヶ月の全生存率データは、アテゾリズマブが３９．２％であり、化学療法が３２．４％であり、アテゾリズマブの全生存期間の中央値は８．３ヶ月であり、タキサンは７．５ヶ月であり、ビンフルニンは９．２ヶ月である。（Ｔｈｅ ＡＳＣＯ Ｐｏｓｔ，ＩＭｖｉｇｏｒ２１１ Ｔｒｉａｌ： Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ ｖｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ、 Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓｔｅｎｇｅｒ，９／１７／２０１８）
【0012】
さらに、米国データ監視委員会は、アテゾリズマブの単剤療法をプラチナベースの化学療法と比較して、ＰＤ－Ｌ１の低発現腫瘍患者の生存率が低下することを観察しているため、米国ＦＤＡは２０１８年６月にシスプラチンを含む化学療法に適する局所進行または転移性尿路上皮癌患者でのアテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）の使用に対する制限を発表している。アテゾリズマブの使用前に、ＰＤ－Ｌ１発現レベルを検出する必要がある。これは、尿路上皮がんの治療におけるアテゾリズマブの局限性をさらに示している。
【0013】
２．ブリストル・マイヤーズスクイブ社のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）は、局所進行または転移性尿路上皮がん患者に対して２０１７年にＦＤＡにより承認されている。ニボルマブは抗ＰＤ－１モノクローナル抗体であり、臨床データによると、ニボルマブの客観的奏効率（ＯＲＲ）は１９．６％であり、全生存率の中央値は８．７ヶ月であり、最も一般的な重篤な有害事象には、尿路感染症、敗血症、下痢、小腸閉塞、全身の健康状態の悪化などがある。最も一般的な副作用には、疲労、筋肉・骨の痛み、吐き気、食欲不振などがある。患者の１７％は、有害反応によりニボルマブ治療が中止され、患者の４６％は、有害反応により投与が遅れる。臨床開発では、３例患者は肺炎または心血管不全による治療関連の死亡になる。
【0014】
以上より、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１免疫療法の現在の臨床段階での主な問題は、不十分な治療効果であり、主に客観的奏効率（ＯＲＲ）及び全生存期間中央値などの治療データの点で理想的ではなく、もう１つの主な問題は、重篤な副作用の割合が比較的高く、例えば、ニボルマブは関連する臨床試験で３人の死者を出している。
３．ヤンセン（ジョンソン・エンド・ジョンソンの会社）のエルダフィチニブ（ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ）は、化学療法後の疾患進行及び腫瘍における特定の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）遺伝子変化の存在を伴う局所進行または転移性尿路の治療に用いられるために、２０１８年にＦＤＡより画期的な薬剤認定を受け、その薬物は線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤に属し、その第II相臨床試験（ＢＬＣ２００１、ＮＣＴ０２３６５５９７）の結果より、エルダフィチニブ治療の全奏効率は４０％であり（完全奏効率３％、部分奏効率３７％）、無増悪生存期間の中央値は５．５ヶ月であり、全生存期間の中央値は１３．８ヶ月であり、合計９９例の患者のうち、治療関連の有害事象による７例の患者の治療を中止する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｎｊ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ－ｃｅｎｔｅｒ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ－ｐｈａｓｅ－２－ｓｔｕｄｙ－ｒｅｓｕｌｔｓ－ｓｈｏｗ－ｐｒｏｍｉｓｅ－ｉｎ－ｔｈｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｏｆ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ－ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ－ｃａｎｃｅｒ）。この薬物の治療標的はＦＧＦＲであるため、特定のＦＧＦＲ遺伝子変異を有する尿路上皮がんの患者にのみ適するが、ＦＧＦＲは転移性尿路上皮がんの１５％～２０％及び非筋肉浸潤性膀胱がんの４０％～７０％で過剰発現になる（２０１８ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｗｉｔｈ ＦＧＦＲ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
現在の治療より、進行性尿路上皮癌は、悪性度が高く、予後が悪く、特に従来の化学療法の失敗後に治療手段が限定され、免疫療法は一部の患者のみに利益をもたらし、また、利用可能な免疫療法阻害剤の数は非常に限られ、客観的奏効率は高くなく、副作用は大きく、又は特定の遺伝的要件の使用が存在し、現在、患者が選択できる治療薬は多くないため、緊急の臨床ニーズを満たすようにより効果的で広く適用可能な治療薬を開発する必要がある。
３．ヤンセン（ジョンソン・エンド・ジョンソンの会社）のエルダフィチニブ（ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ）は、化学療法後の疾患進行及び腫瘍における特定の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）遺伝子変化の存在を伴う局所進行または転移性尿路の治療に用いられるために、２０１８年にＦＤＡより画期的な薬剤認定を受け、その薬物は線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤に属し、その第II相臨床試験（ＢＬＣ２００１、ＮＣＴ０２３６５５９７）の結果より、エルダフィチニブ治療の全奏効率は４０％であり（完全奏効率３％、部分奏効率３７％）、無増悪生存期間の中央値は５．５ヶ月であり、全生存期間の中央値は１３．８ヶ月であり、合計９９例の患者のうち、治療関連の有害事象による７例の患者の治療を中止する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｎｊ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ－ｃｅｎｔｅｒ／ｐｒｅｓｓ－ｒｅｌｅａｓｅｓ／ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ－ｐｈａｓｅ－２－ｓｔｕｄｙ－ｒｅｓｕｌｔｓ－ｓｈｏｗ－ｐｒｏｍｉｓｅ－ｉｎ－ｔｈｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－ｏｆ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ－ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ－ｃａｎｃｅｒ）。この薬物の治療標的はＦＧＦＲであるため、特定のＦＧＦＲ遺伝子変異を有する尿路上皮がんの患者にのみ適するが、ＦＧＦＲは転移性尿路上皮がんの１５％～２０％及び非筋肉浸潤性膀胱がんの４０％～７０％で過剰発現になる（２０１８ ＡＳＣＯ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｗｉｔｈ ＦＧＦＲ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）。
現在の治療より、進行性尿路上皮癌は、悪性度が高く、予後が悪く、特に従来の化学療法の失敗後に治療手段が限定され、免疫療法は一部の患者のみに利益をもたらし、また、利用可能な免疫療法阻害剤の数は非常に限られ、客観的奏効率は高くなく、副作用は大きく、又は特定の遺伝的要件の使用が存在し、現在、患者が選択できる治療薬は多くないため、緊急の臨床ニーズを満たすようにより効果的で広く適用可能な治療薬を開発する必要がある。
【発明の概要】
【0015】
本発明は、尿路上皮がんの治療方法を開示し、前記方法は、患者に有効量の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を注射し、前記ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲート細胞傷害性分子である。前記細胞傷害性分子は、チューブリン阻害剤又はＤＮＡ損傷剤を含むが、これらに限定されない。前記チューブリン阻害剤は、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）及びオーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）類細胞傷害性分子、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）類細胞傷害性分子を含むが、これらに限定されることなく、前記ＤＮＡ損傷剤は、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）類、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）類、アントラマイシン誘導体ＰＢＤ（ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ、ピロロベンゾジアゼピン）、カンプトテシン誘導体ＳＮ－３８を含むが、これらに限定されない。前記オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）類細胞傷害性分子は、モノメチルオーリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ；ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ；ＭＭＡＦ）、及びオーリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ；ＡＦ）又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されることなく、前記メイタンシン様細胞傷害性分子は、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない（抗体－薬物コンジュゲートの弾丸分子の研究進展、胡馨月など、中国医薬生物技術、２０１７年１２月、第１２卷第６期）（メイタンシン類抗体－薬物コンジュゲート 研究進展、周磊など、中国新薬雑誌２０１６年第２５卷第２２期、第２５２１～２５３０頁）。前記細胞傷害性分子は、アマニチン（ａｍａｎｉｔｉｎｓ）、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）、バッカチン（ｂａｃｃａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、セマドチン（ｃｅｍａｄｏｔｉｎｓ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅｓ）、コルカミン（ｃｏｌｃｉｍｉｄｓ）、コンブレタスタチン（ｃｏｍｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎｓ）、クリプトフィシン（ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎｓ）、ディスコデルモライド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅｓ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エキノマイシン（ｅｃｈｉｎｏｍｙｃｉｎｓ）、エリュテロビン（ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｂｉｎｓ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅｓ）、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ネトロプシン（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎｓ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎｓ）、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎｓ）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎｓ）、又はビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）であってもよい。前記細胞傷害性分子は、上記のタイプに限定されなく、ＡＤＣに使用できるすべての薬物を含んでもよい。
【0016】
本発明の他の側面は、膀胱癌を治療するための薬物の製造における抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の使用を提供する。前記抗体－薬物コンジュゲートは、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその機能的断片を含み、ここで、前記抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、（ｉ）前記重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ領域を含み、ここで、前記ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３で示されるアミノ酸配列を有し、（ｉｉ）前記軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲ領域を含み、ここで、前記ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６で示されるアミノ酸配列を有する。前記抗体は、同じまたは類似したエピトープに上記ＣＤＲで限定される抗体と競合的に結合する抗体であってもよい。
【0017】
本発明では、「抗体」という用語は、全長抗体、又はＨＥＲ２に結合するか、反応性に関連するか、複合体を形成する抗体断片を含むことができる。抗体は、治療的改変を求めている細胞集団の一部と結合、複合、または反応する任意のタンパク質、タンパク質様分子、又はポリペプチであってもよい。前記抗体は、キメラ抗体又はその機能的に活性な断片、ヒト化抗体又はその機能的に活性な断片、ヒト抗体又はその機能的に活性な断片であってもよい。上記以外の他の種の抗体又はその機能的に活性な断片、例えば、マウス抗体又はその機能的に活性な断片、ラット抗体又はその機能的に活性な断片、ヒツジ抗体又はその機能的に活性な断片、ウサギ抗体又はその機能的に活性な断片であってもよい。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。幾つかの実施例において、抗体は二重特異性抗体であってもよい。さらに、抗体は、機能的に活性な断片、抗体の誘導体や類似体であってもよい。「機能的」とは、前記断片、誘導体又は類似体が同じ抗原、抗原に由来する断片、誘導体又は類似体を認識する抗体を意味し、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片及び抗体の重鎖及び軽鎖二量体、又はＦｖｓや単鎖抗体（ＳＣＡｓ）のような任意の最小断片であるが、これらに限定されない。さらに、抗体の融合タンパク質であってもよい。抗体は、修飾または非修飾（即ち、任意の分子を介した共有結合）の類似体及び誘導体を含むこともでき、そのような共有結合により抗体がその抗原結合免疫特異性を保持できればよい。例えば、抗体の類似体及び誘導体、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、プロテアーゼ切断、細胞抗体ユニットまたは他のタンパク質への連結などの更なる修飾を含むが、これらに限定されない。既知の技術を使用して、任意の大きな化学修飾を達成することができ、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの存在下での代謝合成などを含むが、これらに限定されない。さらに、類似体又は誘導体は、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含むことができる。幾つかの実施例において、抗体は、Ｆｃ受容体と相互作用するアミノ酸残基に修飾（例えば、置換、欠失、または付加）有し得る。他の側面では、前記抗体－薬物コンジュゲートは、一般式Ａｂ－（Ｌ－Ｕ）ｎの構造を有し、ここで、Ａｂは、前記抗体またはその機能的断片を表し、Ｌは、リンカーを表し、Ｕは、カップリングした細胞傷害性分子を表し、ｎは１～８の整数であり、各抗体に結合した治療剤の分子量を表す。
他の側面では、前記リンカーは、チオール基及び／又はアミノ基を介して前記抗体またはその機能的断片に連結され、前記細胞傷害性分子は、前記抗体に部位特異的または部位非特異的にカップリングされる。本発明のリンカーは、下表のリンカーから選ばれることができる。
他の側面では、前記リンカーは、チオール基及び／又はアミノ基を介して前記抗体またはその機能的断片に連結され、前記細胞傷害性分子は、前記抗体に部位特異的または部位非特異的にカップリングされる。本発明のリンカーは、下表のリンカーから選ばれることができる。
【0018】
【表1】
【0019】
本発明のリンカーは、マレイミド－カプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシ（マレイミド－Ｃａｐｒｏｙｌ－Ｖａｌｉｎｅ－Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ－ｐ－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ、 ｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢ）及びマレイミドカプロイル（Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ｍｃ）が好ましい。
本発明のリンカーは、トリグリシルペプチドリンカー（ｔｒｉｇｌｙｃｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）を選択してもよく、該リンカーは、近年開発された、ＡＤＣ薬物コンジュゲートに用いられる新たなリンカーである（Ｒａｊｅｅｖａ Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ、 Ａ Ｎｅｗ Ｔｒｉｇｌｙｃｙｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ （ＡＤＣｓ） ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ、 ＭＣＴ－１６－００２、 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ ２０１６．）。さらに、グルクロニドリンカー（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ－ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）を選択してもよい（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｊ． Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ、 Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＭＤＲ＋ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１８）。
本発明のリンカーは、トリグリシルペプチドリンカー（ｔｒｉｇｌｙｃｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒ）を選択してもよく、該リンカーは、近年開発された、ＡＤＣ薬物コンジュゲートに用いられる新たなリンカーである（Ｒａｊｅｅｖａ Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ、 Ａ Ｎｅｗ Ｔｒｉｇｌｙｃｙｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ （ＡＤＣｓ） ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ、 ＭＣＴ－１６－００２、 Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ ２０１６．）。さらに、グルクロニドリンカー（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ－ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）を選択してもよい（Ｐａｔｒｉｃｋ Ｊ． Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ、 Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ－ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＭＤＲ＋ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌｓ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１８）。
【0020】
他の側面では、前記抗体またはその機能的断片は、２０１３年０８月２２日に受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．８１０２で中国微生物菌種収集管理委員会の一般微生物学センターに寄託されたハイブリドーマによって分泌される抗体に由来する。
【0021】
他の側面では、前記抗体は、ヒト化抗体であり、好ましくは、前記抗体が２０１３年１１月０６日に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｃ２０１３１７０で中国典型培養物保蔵センターに寄託されたＣＨＯ細胞により分泌される抗体である。
【0022】
１つの実施例において、使用される抗体－薬物コンジュゲートの名称はＲＣ４８－ｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢ－ＭＭＡＥであり、一般式Ａｂ－（Ｌ－Ｕ）ｎの構造を満たし、ＲＣ４８（ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）は、リンカーｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢを介してＭＭＡＥにカップリングし、カップリングした個数は、１～８個などであり、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個カップリングしたものを含み、または、１～８個の数量が異なるＭＭＡＥをカップリングした抗体－薬物コンジュゲートの組み合わせである。
【0023】
本発明では、前記尿路上皮がんは、外科的切除不能な局所進行性尿路上皮がん、局所進行性または転移性尿路上皮がん、ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２、ＥｒｂＢ－２、ｃ－ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２／ｎｅｕと呼ばれる）陽性の尿路上皮がん、ＨＥＲ２陽性の局所進行性または転移性尿路上皮がんである。
【0024】
本発明に記載の薬物は、鼻腔内、皮下、皮内、筋肉内又は静脈内に投与することができる。
前記薬物は、薬学的に許容される担体も含み、前記薬物は、凍結乾燥剤又は液体製剤が好ましく、前記担体は、安定剤、保護剤、緩衝液、凍結乾燥保護剤、活性保護剤、界面活性剤、吸着担体、吸収促進剤の１つ又は複数を含む
前記薬物は、薬学的に許容される担体も含み、前記薬物は、凍結乾燥剤又は液体製剤が好ましく、前記担体は、安定剤、保護剤、緩衝液、凍結乾燥保護剤、活性保護剤、界面活性剤、吸着担体、吸収促進剤の１つ又は複数を含む
【図面の簡単な説明】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0034】
実施例１．マウスモノクローナル抗体ｍＲＣ４８の調製及びシーケンス分析
【0035】
１、ＨＥＲ２抗原の発現及び精製
【0036】
ＨＥＲ２－ＥＣＤ（アミノ酸Ｔｈｒ２３～Ｔｈｒ６５２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１１７３０）をコードするｃＤＮＡ断片は、ＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）発現ベクターにクローニングされた。
【0037】
具体的な方法は、ＨＥＲ２＋ＳＫＢＲ３細胞株（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ－３０）からＲＴ－ＰＣＲ法でＨＥＲ２－ＥＣＤコード領域のｃＤＮＡを取得した（キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ逆転写システムを使用する）。
【0038】
プライマーは、Ｐ１：５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、Ｐ２：５’ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、下線が引かれた配列は、それぞれ組み込まれたＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ制限酵素切断部位であり、ＰＣＲ増幅は、逆転写ＨＥＲ２－ＥＣＤのｃＤＮＡをテンプレートとして上記プライマーを使用して行い、増幅条件は、９４℃で３０ｓ変性し、６０℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で１分間伸長し、３０サイクルを行い、最後、７２℃で１０分間伸長する。その後、ＰＣＲ断片を回収し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素（ＮＥＢ）によって切断し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに連結した。精製を容易にするために、ＨＥＲ２－ＥＣＤのＣ末端に１つのポリヒスチジンタグを付いた。構築されたＤＮＡ発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、米国）をトランスフェクションし、Ｈｉｓ標識可溶性タンパク質ＨＥＲ２－ＥＣＤをＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）により細胞培養液から精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシーブリリアントブルー染色により、精製されたＨＥＲ２－ＥＣＤタンパク質が９５％以上の同質性であることを示した結果を図１に示した。可溶性ＨＥＲ２－ＥＣＤは、相対分子量が約７５ｋＤａであるモノマーとして発見され、計算された分子量（７１ｋＤａ）よりわずかに大きく、ＨＥＫ２９３細胞でタンパク質がグリコシル化していることを示した。精製されたＨＥＲ２－ＥＣＤタンパク質をさらに濃縮し、ｐＨ７．４の滅菌ＰＢＳ緩衝液に移し、その後のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に用いられた。
【0039】
２、ハイブリドーマ細胞の作製及びスクリーニング
【0040】
上記のように調製されたＨＥＲ２－ＥＣＤを抗原としてマウスを免疫し、モノクローナル抗体を調製した。免疫応答、ハイブリドーマ細胞融合、及び予備スクリーニングは、いずれも標準的な手順（参照文献：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．８２２、１９９２ Ａｎｎｅｘ ３）に従って実行された。０．２５ｍｌ ＨＥＲ２－ＥＣＤタンパク質（５０～１００μｇ）と０．２５ｍｌ完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ）を同体積で均一に混合した後、４匹のＢａｌｂ／ｃマウス（上海斯莱克実験動物有限責任公司から購入した）を免疫し、２週間後に２回目の注射を行い、不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ）を使用し、抗原量は２５～５０μｇ／０．５ｍｌ／１匹のマウスであり、３週間後に２回目と同じ注射量で３回目の注射を行い、３回目の注射後１０日に採血した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりマウスの血清を検出し、血清中の抗ＨＥＲ２抗体価が最も高い２匹のマウスの脾臓を摘出し、次に、骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８０）と融合させた。融合細胞を１０個の９６ウェルプレートに希釈し、ＨＥＲ２－ＥＣＤとの結合能に応じてＥＬＩＳＡ法により予備スクリーニングを行った。典型的なＥＬＩＳＡ実験では、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレートをＨＥＲ２－ＥＣＤ（０．２～１μｇ／ｍｌ）でコーティングした後、マウス血清又はハイブリドーマ上清液の勾配希釈液（１００μＬ）でインキュベートした。マウス由来抗ＨＥＲ２抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギＦ（ａｂ′）２抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的な二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）で検出された。
【0041】
４００個のハイブリドーマ細胞株の上清は、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングされ、そのうちの３６個は強いＨＥＲ２－ＥＣＤ結合能を示した。最も強いＨＥＲ２結合能を持つ１０個のハイブリドーマ細胞株を選択し、サブクローン化されたハイブリドーマ細胞株を限界希釈法によってスクリーニングした。サブクローン化されたハイブリドーマ細胞株を懸濁液として培養し、タンパク質の精製を経由し、ＥＬＩＳＡ法にてＨＥＲ２の結合親和性を特定し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）によってヒト乳癌細胞株の表面に自然に発現するＨＥＲ２に対する上記抗体の結合能をさらに測定した（より詳細な説明については、実施例４を参照）。最終的に、強いＨＥＲ２結合能を持つハイブリドーマ細胞株ｍＲＣ４８（マウス由来ＩｇＧ１ｋ）をシーケンス分析により特定した。前記ハイブリドーマ細胞株ｍＲＣ４８は、２０１３年０８月２２日に受託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．８１０２で中国微生物菌種収集管理委員会の一般微生物学センターに寄託された（ブダペスト条約に基づく寄託日は２０１３年１０月２９日である）。
【0042】
３、抗ＨＥＲ２ハイブリドーマ細胞クローンｍＲＣ４８のシーケンス分析
【0043】
上記ハイブリドーマ細胞クローンｍＲＣ４８の重鎖及び軽鎖の可変領域は、説明書に従って市販のキットＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して５’末端を迅速に増幅し、配列決定した。
【0044】
ＲＮＡｐｕｒｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（北京康威世紀生物科技有限公司）を使用してハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して全ＲＮＡの逆転写を行い、全ＲＮＡをテンプレートとし、キットにおけるプライマーを利用し、逆転写酵素ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを加え、キットで提供される手順に従って逆転写を行い、ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙの第１鎖ｃＤＮＡを取得し、その後、２ラウンドのＰＣＲを行い、第１ラウンドのＰＣＲは、得られたｃＤＮＡをテンプレートとし、キットに付属するＵＰＭは５’端プライマーであり、３’端プライマーはｍＲＣ４８－ＶＬ－１／ｍＲＣ４８－ＶＨ－１である。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、増幅を２５サイクル（９４℃で３０ｓ変性し、６８℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で２ｍｉｎ伸長する）行い、最後に、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。
【0045】
第２ラウンドのＰＣＲは、第１ラウンドのＰＣＲ産物をテンプレートとし、キットに付属するＮＵＰは５’端プライマーであり、３’端プライマーはｍＲＣ４８－ＶＬ－２／ｍＲＣ４８－ＶＨ－２であり、ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５ｍｉｎ予備変性し、増幅を２５サイクル（９４℃で３０ｓ変性し、６８℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で２ｍｉｎ伸長する）行い、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。このようにして、上記ハイブリドーマ細胞クローンｍＲＣ４８重鎖及び軽鎖可変領域を得た。
【0046】
具体的なプライマーの配列は、以下の通りである。
ｍＲＣ４８－ＶＬ－１：５’－ＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧＴＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
ｍＲＣ４８－ＶＬ－２：５’－ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
ｍＲＣ４８－ＶＨ－１：５’－ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ－ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
ｍＲＣ４８－ＶＨ－２：５’－ＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧ － ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
ｍＲＣ４８－ＶＬ－１：５’－ＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧＴＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
ｍＲＣ４８－ＶＬ－２：５’－ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣ－３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
ｍＲＣ４８－ＶＨ－１：５’－ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ－ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
ｍＲＣ４８－ＶＨ－２：５’－ＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＧ － ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
【0047】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯクローンベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。ＰＣＲにより、１０個の独立してクローン化したプラスミドＤＮＡを得、さらに、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを使用して配列決定した。ＤＮＡシーケンス分析により、これらの１０個のクローンはいずれも同じＶＨ又はＶＬポリペプチをコードするｃＤＮＡを有することが示された。相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔコーディングテーブルによって定義され、表２に示した。シーケンス比較分析により、抗ＨＥＲ２ ｍＲＣ４８のＣＤＲは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）を含む既知のＨＥＲ２抗体と有意に異なることを示した。
【0048】
【表2】
【0049】
実施例２．抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ｍＲＣ４８のヒト化（ＣＮ１０５００８３９８Ａの対応する方法に由来）
【0050】
軽鎖又は重鎖のＣＤＲをヒトＩｇＧ１κフレームワーク領域に移植することにより、マウス抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ｍＲＣ４８をヒト化した。
【0051】
ヒト化ＲＣ４８抗体の軽鎖可変領域（ＲＣ４８－ＶＬ）、及びヒト化ＲＣ４８抗体の重鎖可変領域（ＲＣ４８－ＶＨ）を設計することにより、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体であるＲＣ４８として組み合わせた。ＲＣ４８－ＶＨの配列全体と、ヒトＩｇＧ１ＶＨ遺伝子との類似性は８４％である。ＲＣ４８抗体は、軽鎖可変領域ＲＣ４８－ＶＬ及び重鎖可変領域ＲＣ４８－ＶＨを含む。
【0052】
ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ＲＣ４８は、ＣＤＲ移植により得られた。重鎖又は軽鎖可変領域は、南京金斯瑞生物科技有限公司により直接合成され、合成された可変領域は、コザック配列、開始コドン、重鎖又は軽鎖シグナルペプチド、ヒトフレームワーク領域及びマウスＣＤＲを含み、可変領域及びヒトＩｇＧ１ｋ定常領域は、重複伸長ＰＣＲ法により完全な断片に連結された。
【0053】
重複伸長ＰＣＲのプライマーは、以下の通りである。
【0054】
重鎖ＶＨ１：５ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴ３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
【0055】
ＶＨ２：５ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＧＴＧＴＴ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
【0056】
ＣＨ１：５ ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣ ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
【0057】
ＣＨ２：５ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡ ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
【0058】
軽鎖：ＶＬ１：５ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴ ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
【0059】
ＶＬ２：５ ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＡＣＧＣＴＴＴＡＴＣＴＣＡＡＣＴＴＴＴＧ Ｔ ３
【0060】
ＡＣ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
【0061】
ＣＬ１：５ ＣＧＴＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴ ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）
【0062】
ＣＬ２：５ ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣ ３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
【0063】
重鎖の増幅については、まず、合成された可変領域をテンプレートとし、ＶＨ１及びＶＨ２をプライマーとし、ヒトＩｇＧ１κ重鎖定常領域をテンプレートとし、ＣＨ１及びＣＨ２をプライマーとし、重鎖の可変領域、定常領域を増幅させ、増幅条件は、いずれも、９４℃で３０ｓ変性し、６０℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で１分間伸長し、３０サイクルを行い、最後に７２℃で１０分間伸長した。さらに２回のＰＣＲ産物をテンプレートとし、ＶＨ１及びＣＨ２をプライマーとし、ＲＣ４８の重鎖配列を増幅させた。増幅条件は、いずれも、９４℃で３０ｓ変性し、６０℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で２分間伸長し、３０サイクルを行い、最後に７２℃で１０分間伸長した。
【0064】
軽鎖の増幅については、まず、合成された可変領域をテンプレートとし、ＶＬ１及びＶＬ２をプライマーとし、ヒトＩｇＧ１κ軽鎖定常領域をテンプレートとし、ＣＬ１及びＣＬ２をプライマーとし、軽鎖の可変領域、定常領域をそれぞれ増幅し、増幅条件は、いずれも、９４℃で３０ｓ変性し、６０℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で１分間伸長し、３０サイクルを行い、最後に７２℃で１０分間伸長した。さらに、２回のＰＣＲ産物をテンプレートとし、ＶＬ１及びＣＬ２をプライマーとし、軽鎖配列を増幅させた。増幅条件は、いずれも、９４℃で３０ｓ変性し、６０℃で３０ｓアニーリングし、７２℃で２分間伸長し、３０サイクルを行い、最後に７２℃で１０分間伸長した。
【0065】
従って、ヒトＩｇＧ１κ重鎖定常領域及び重鎖可変領域ＲＣ４８－ＶＨ、並びにヒトＩｇＧ１κ軽鎖定常領域及び軽鎖可変領域ＲＣ４８－ＶＬを含むヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ＲＣ４８を得た。
【0066】
ヒト－マウスキメラ抗体ｃＲＣ４８も同じ方法で取得され、マウスの可変領域及びヒトＩｇＧ１ｋ定常領域を、重複伸長ＰＣＲ法により完全な断片に連結した。
【0067】
上記増幅された各断片を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．０にそれぞれサブクローニングした。構築された異なるプラスミドを懸濁ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションし、異なる組換え抗体を生成し、プロテインＡで精製及び次の特徴分析を行った。キメラ抗－ＨＥＲ２ ＲＣ４８（ｃＲＣ４８と呼ばれる）は、マウス－ヒトキメラｃＲＣ４８重鎖及び軽鎖からなる。ＲＣ４８は、ヒト化重鎖ＲＣ４８－ＶＨ及びヒト化軽鎖ＲＣ４８－ＶＬを含む。ｃＲＣ４８及びＲＣ４８は、いずれも発現されることができ、ＣＨＯ細胞上清から前記抗体を収集し、プロテインＡで精製し、還元及び非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（図２を参照）。前記ＲＣ４８抗体を分泌するＣＨＯ細胞（即ち、ヒトＩｇＧ１κ重鎖定常領域及び重鎖可変領域ＲＣ４８－ＶＨ、並びにヒトＩｇＧ１κ軽鎖定常領域及び軽鎖可変領域ＲＣ４８－ＶＬをトランスフェクションしたＣＨＯ細胞）は、２０１３年１１月０６日に受託番号Ｃ２０１３１７０で中国典型培養物保蔵センターに寄託された。
【0068】
実施例３．抗ＨＥＲ２ ＲＣ４８抗体の特徴分析
【0069】
ＥＬＩＳＡ法により、ｃＲＣ４８（キメラ抗体）及びＲＣ４８抗体（ヒト化抗体）のＨＥＲ２－結合親和性定数（Ｋｄ）を測定し、具体的な方法は実施例１を参照し、即ち、可溶性ＨＥＲ２－ＥＣＤタンパク質を９６ウェルプレートにコーティングした後、希釈された抗体（コントロールとしてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ及びキメラｃＲＣ４８）とともにインキュベートし、ＨＥＲ２－ＥＣＤ関連抗体（全部の形態のヒトＩｇＧ１κ）を、ＨＲＰ－結合ヒツジＦ（ａｂ’）２抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ－特異的な二次抗体で検出した（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。結合曲線を描き、さらに単一部位特異的結合非線形方程式（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２７０：１５５～１６２、２００２）を使用し、各抗ＨＥＲ２抗体の表面結合親和性定数（Ｋｄ）値を計算した（図３は、３つの独立したＥＬＩＳＡ実験から得られた典型的なＨＥＲ２－結合曲線を示している）。ＥＬＩＳＡの結果は図３に示した。
【0070】
３つの独立した測定試験により、ｃＲＣ４８（平均親和定数７７ｐＭ）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（平均親和定数９７ｐＭ）よりも、ＲＣ４８（ヒト化抗体）は、有意に改善されたＨＥＲ２－ＥＣＤ結合親和性を持ち、平均親和定数が４４ｐＭであり、結果は表３に示した。
【0071】
【表3】
【0072】
実施例４．ＲＣ４８（ヒト化抗体）のＨＥＲ２に対する結合能力
【0073】
１）ＲＣ４８抗体のＨＥＲ２に対する結合親和性試験
【0074】
フローサイトメーターを使用し、ヒト乳癌細胞の内因的に発現したＨＥＲ２のヒト化抗ＨＥＲ２抗体ＲＣ４８に対する結合能力を検出し、結果は、図３に示した。それぞれ６μｇの対照群のヒトＩｇＧ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｃＲＣ４８、ＲＣ４８を２種のＨＥＲ２＋細胞であるヒト乳癌細胞ＳＫ－ＢＲ－３、ＢＴ４７４及びＨＥＲ２－細胞ＭＤＡ－ＭＢ４６８（２×１０7個の細胞）とともにインキュベートし、氷上で３０～４５分間インキュベートした。冷ＰＢＳ４ｍｌで十分に２回洗浄した後、細胞表面に結合した抗体は、Ｒ－ＰＥとカップリングしたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（１５μｌ、２５μｇ／ｍＬ）特異的な二次抗体により検出され、次いで、フローサイトメーター（ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を使用して分析した。対照群のヒトＩｇＧ１は、上記３種の癌細胞に対する結合を検出していない。それと比較しては、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｃＲＣ４８、及びＲＣ４８は、２種のＨＥＲ２陽性細胞に強く結合しているが、ＨＥＲ２陰性細胞に結合していなく、これは、このような結合はＨＥＲ２に特異的なものであることを示した（図４ａを参照）。同種の対照群の平均蛍光強度を比較することにより、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びｃＲＣ４８よりも、ＲＣ４８はより高い結合親和性を示したことを分かった。抗ＨＥＲ２抗体の濃度、及びフローサイトメトリーで分析した細胞数を滴定することにより、細胞に基づく抗ＨＥＲ２抗体の細胞表面ＨＥＲ２に対する結合曲線が得られ、結果を図４ｂに示した。ヒト化抗ＨＥＲ２抗体ＲＣ４８は、明らかな結合親和性を示し、ＢＴ４７４細胞表面ＨＥＲ２への結合親和性Ｋｄは４ｎＭであり、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｃＲＣ４８はそれぞれ１０ｎＭ及び５ｎＭであり、結果を表４に示した。
【0075】
【表4】
【0076】
２）抗原の結合特異性試験
【0077】
Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｃＲＣ４８、及びＲＣ４８が異なる表面抗原ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４に結合する能力は、ＥＬＩＳＡ法により測定された。ＥＬＩＳＡ法は、実施例１に記載された。９６ウェルプレートを抗原ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４でそれぞれコーティングし、１ウェルあたりのサンプルアプライ量は２０ｎｇであり、異なる抗ＨＥＲ２抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｃＲＣ４８、ＲＣ４８抗体でインキュベートし、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼとカップリングしたヒツジＦ（ａｂ′）２抗マウスＩｇＧ Ｆｃ特異的な二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて検出した。結果を図５に示し、結果は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ｃＲＣ４８、ＲＣ４８抗体が、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４にほとんど結合していないが、ＨＥＲ２に強く結合していることを示し、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＲＣ４８はＨＥＲ２への結合に高い特異性を持つことを示した。
【0078】
実施例５．抗体コンジュゲートの調製
【0079】
１）モノクローナル抗体ＲＣ４８の精製
【0080】
ＣＨＯ細胞培養液からプロテインＡを介してＲＣ４８のモノクローナル抗体を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びＳＥＣ分析により純度は９５％以上であった。３０ＫＤ限外ろ過膜により得られた抗体タンパク質をＰＢＳ緩衝液に透析ろ過し、濃縮し、ＵＶ吸光度計で濃度を決定し、後のカップリング反応に用いられた。
【0081】
２）薬物分子に対するモノクローナル抗体ＲＣ４８のカップリング
【0082】
それぞれＰＢＳ緩衝液で調製された還元剤及び保護剤は、１～２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＣＥＰ（トリス－２－カルボキシエチルホスフィン）、１～２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）母液であり、還元剤の用量は、所望のカップリング率に応じて一定の濃度範囲で添加し、一定の体積比（例えば１：１）に従って一定の濃度のモノクローナル抗体（例えば、５～３０ｍｇ／ｍｌ）と混合することができ、ＴＣＥＰと抗体の最終的なモル濃度比は０．５～６．０：１であり、２５℃で２ｈ撹拌して反応させた。遊離チオール基濃度をＤＴＮＢ法により４１２ｎｍで検出し、遊離チオールの数は、抗体に対するモル比により計算された。ＴＣＥＰの還元は再現性が高く、還元後の遊離チオールの数は１．０～８．０に達することができる。
【0083】
ＴＣＥＰ還元後、抗体は、直接に後のカップリングを行うことができる。一定濃度（１０ｍＭ）の薬物（ｖｃ－ＭＭＡＥ、ｖｃ－ＭＭＡＦ、ｍｃ－ＭＭＡＦ）（上海皓元化学科技有限公司から購入）を２５％ ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ジメチルスルホキシド）に溶解させたものを調製し、薬物とチオール基のモル比が０．３～２．８：１で徐々に加え、２５℃で２ｈ撹拌して反応させた。ＤＴＮＢ法により４１２ｎｍで遊離チオール基の濃度（０に近い）を検出し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５により精製して残留未反応薬物及びＤＭＳＯなどの遊離小分子を除去し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動、逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒ－ＨＰＬＣ）、疎水高速液体クロマトグラフィー疏水高效液相（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）によりカップリングを検出した。
【0084】
実施例６．抗体－薬物コンジュゲートの親和性の測定
【0085】
ＥＬＩＳＡ法による親和性の測定
【0086】
組換えタンパク質ＨＥＲ２－ＥＣＤ（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）でＥＬＩＳＡ用プレートをコーティングし、２℃～８℃で一晩放置した。プレート用ウォッシャーで３回洗浄した。３％ＢＳＡ－ＰＢＳＴ溶液で３７℃、２ｈブロッキングした。プレート用ウォッシャーで３回洗浄した。サンプルのローディングは、ＰＢＳＴ溶液でベースラインを１０００ｎｇ／ｍｌから希釈して、１００μｌ／ウェル、３７℃、２ｈで１１点段階希釈した。サンプルのローディング：１０００ｎｇ／ｍＬから開始する標準をPBSTバッファーで希釈して、１００μL/ウェルの１１の希釈ポイントを得、３７℃で２時間インキュベートした。プレート用ウォッシャーで３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ）をＰＢＳＴ溶液で５０００倍希釈した。ＴＭＢ溶液を加えて発色し、室温で暗闇中で８～１０分間発色した。２Ｍ Ｈ2ＳＯ4で試験を終了し、マイクロプレートリーダーにより４５０／６５５ｎｍでデータを読み取った。結果は表５に示した。
【0087】
【表5】
【0088】
結果よりわかるように、ＲＣ４８－ＶＣ－ＭＭＡＥ（即ち、ＲＣ４８－ｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢ－ＭＭＡＥ）、ＲＣ４８－ＶＣ－ＭＭＡＦ、ＲＣ４８－ＭＣ－ＭＭＡＦのＨＥＲ２－ＥＣＤに対する親和性は、Ｔ－ＤＭ１と同等することを示した。
【0089】
実施例７．ＨＥＲ２陽性の局所進行性または転移性尿路上皮がんに対する単独療法の有効性及び安全性実験
【0090】
本実験の目的は、ＨＥＲ２陽性の局所進行性または転移性尿路上皮がんに対する単剤療法の有効性及び安全性を評価することである。使用される抗体－薬物コンジュゲートは、ＲＣ４８－ｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢ－ＭＭＡＥであり、ＲＣ４８はリンカーであるｍｃ－ｖｃ－ｐＡＢを介してＭＭＡＥに結合され、カップリングの数は１から８まで変化した。
【0091】
ここで、被験者の選択基準は、以下の通りである。
年齢：１８歳（最低年齢）乃至８０歳（最高年齢）
その選択基準は、以下の通りである。
１．研究への参加に同意し、インフォームドコンセントに署名すること；
２．１８歳以上６０歳未満の男性又は女性；
３．予想される生存期間は１２週間以上であること；
４．病理学的診断に基づく手術で完全に除去できない局所進行性または転移性膀胱尿路上皮がん；
５．被験者は、手術では切除できない局所進行または転移性疾患と診断された後、少なくとも一次全身化学療法を受けた後に疾患の進行または不耐性を示すこと；
６．少なくともＲＥＣＩＳＴ １．１標準で規定された測定可能な病変があること；
７．中央検査室によって確認されたＨＥＲ２陽性；
８．ＥＣＯＧの身体状態は０又は１であること；
９．十分な心臓、骨髄、肝臓、腎臓の機能；
１０．女性被験者は、外科的避妊手術を受けた、閉経後の患者であるか、又は治療期間中及び治療後６ヶ月以内に少なくとも１つの医学的に承認された避妊手段（例えば、子宮内避妊具、避妊薬、コンドーム）を使用することに同意し、男性被験者は、治療期間中及び治療終了後６ヶ月以内に、少なくとも１つの医学的に承認された避妊手段（例えば、コンドーム、禁欲など）を使用することに同意する必要があること；
１１．試験及びフォローアップ手順に同意しながら従うことができること。
年齢：１８歳（最低年齢）乃至８０歳（最高年齢）
その選択基準は、以下の通りである。
１．研究への参加に同意し、インフォームドコンセントに署名すること；
２．１８歳以上６０歳未満の男性又は女性；
３．予想される生存期間は１２週間以上であること；
４．病理学的診断に基づく手術で完全に除去できない局所進行性または転移性膀胱尿路上皮がん；
５．被験者は、手術では切除できない局所進行または転移性疾患と診断された後、少なくとも一次全身化学療法を受けた後に疾患の進行または不耐性を示すこと；
６．少なくともＲＥＣＩＳＴ １．１標準で規定された測定可能な病変があること；
７．中央検査室によって確認されたＨＥＲ２陽性；
８．ＥＣＯＧの身体状態は０又は１であること；
９．十分な心臓、骨髄、肝臓、腎臓の機能；
１０．女性被験者は、外科的避妊手術を受けた、閉経後の患者であるか、又は治療期間中及び治療後６ヶ月以内に少なくとも１つの医学的に承認された避妊手段（例えば、子宮内避妊具、避妊薬、コンドーム）を使用することに同意し、男性被験者は、治療期間中及び治療終了後６ヶ月以内に、少なくとも１つの医学的に承認された避妊手段（例えば、コンドーム、禁欲など）を使用することに同意する必要があること；
１１．試験及びフォローアップ手順に同意しながら従うことができること。
【0092】
同時に、除外基準は、以下の通りである。
１．組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲート及びその成分にアレルギーがあることが知られていること；
２．試験治療開始前４週間以内に他の抗腫瘍治療を受けたこと；
３．以前に組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートを受けたこと；
４．試験投与開始前４週間以内に大手術が行われ、完全に回復しなかったこと；
５．試験投与開始前４週間以内に生ワクチンを接種したか、試験期間中にワクチンを接種する予定すること；
６．プロトコルのコンプライアンスに影響を及ぼしたり、結果の解釈を妨げたりする可能性のあるその他の重度で制御不能なコンパニオン疾患；
７．試験投与開始前５年以内に他の悪性腫瘍があること；
８．中枢神経系の転移及び／又は癌性髄膜炎を患っていること；
９．過去２年間以内に全身治療が必要な活動性の自己免疫疾患があること；
１０．以前に同種造血幹細胞移植または固形臓器移植を受けたこと；
１１．臨床症状を伴う、または対症療法を必要とする大量の胸水または腹水；
１２．妊娠中または授乳中の女性；
１３．ＨＩＶ検査の結果は陽性であること；
１４．活動性Ｂ型またはＣ型肝炎の患者；
１５．活動性結核の歴史；
１６．研究者の判断によれば、他の病気、異常な代謝、身体検査の異常な結果、または異常な臨床検査に苦しんでいる被験者は、研究薬物を使用するのに適さない特定の疾患または状態を持っているか、または研究結果の解釈に影響を及ぼすと疑うのは合理的であり、または、患者を高リスクに置くこと；
１７．この臨床研究に対する患者のアドヒアランスが不十分と推定すること。
１．組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲート及びその成分にアレルギーがあることが知られていること；
２．試験治療開始前４週間以内に他の抗腫瘍治療を受けたこと；
３．以前に組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートを受けたこと；
４．試験投与開始前４週間以内に大手術が行われ、完全に回復しなかったこと；
５．試験投与開始前４週間以内に生ワクチンを接種したか、試験期間中にワクチンを接種する予定すること；
６．プロトコルのコンプライアンスに影響を及ぼしたり、結果の解釈を妨げたりする可能性のあるその他の重度で制御不能なコンパニオン疾患；
７．試験投与開始前５年以内に他の悪性腫瘍があること；
８．中枢神経系の転移及び／又は癌性髄膜炎を患っていること；
９．過去２年間以内に全身治療が必要な活動性の自己免疫疾患があること；
１０．以前に同種造血幹細胞移植または固形臓器移植を受けたこと；
１１．臨床症状を伴う、または対症療法を必要とする大量の胸水または腹水；
１２．妊娠中または授乳中の女性；
１３．ＨＩＶ検査の結果は陽性であること；
１４．活動性Ｂ型またはＣ型肝炎の患者；
１５．活動性結核の歴史；
１６．研究者の判断によれば、他の病気、異常な代謝、身体検査の異常な結果、または異常な臨床検査に苦しんでいる被験者は、研究薬物を使用するのに適さない特定の疾患または状態を持っているか、または研究結果の解釈に影響を及ぼすと疑うのは合理的であり、または、患者を高リスクに置くこと；
１７．この臨床研究に対する患者のアドヒアランスが不十分と推定すること。
【0093】
具体的な実験方法は、以下の通りである：
【0094】
本研究は、少なくとも一次全身化学療法に以前に失敗または、耐えられない測定可能な病変、一般的な身体状態及び臓器機能を有する局所進行性または転移性尿路上皮がんの被験者を含む。すべての被験者は、腫瘍組織病理切片を中央検査室に提出し、ＨＥＲ２発現陽性を確認し、その陽性は、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイのスコアが２＋又は３＋であることを定義された（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション［ＦＩＳＨ］検出の結果に関係なく）。
【0095】
本研究では、免疫組織化学（ＩＨＣ）のＨＥＲ２の結果判定は、「乳癌ＨＥＲ２の検出ガイドライン（２０１４版、中国）」に記載のＨＥＲ２解釈の基準に従った。詳細を表６に示す。
【0096】
【表6】
【0097】
すべての基準を満たす被験者は、ＲＣ４８－ＡＤＣ治療を受け（２．０ｍｇ／ｋｇ、静脈内注入、２週間１回）、疾患が進行して耐えられない毒性が生じるか被験者が脱落するまで６週間ごとに有効性を評価した。この研究の主要評価項目は、独立して評価される客観的奏効率（ＯＲＲ）であり、副次評価項目は、無増悪生存期間、全生存期間、治療の安全性であった。
【0098】
研究結果は、以下の通りである。
【0099】
この研究は２０１７年１２月から開始され、２０１８年７月３１日まで男性１５人、女性３人である合計１８人の被験者が治療を受け、年齢中央値６３歳である。原発巣は、膀胱（５０．０％）、腎盂（２７．８％）及び尿管（２２．２％）を含み、主な転移部位は肺、肝臓、リンパ節であった。１６人の患者（８８．９％）は、以前にプラチナ製剤の第一選択療法を受けた。被験者の腫瘍ＨＥＲ２発現の中央実験室によって確認された免疫組織化（ＩＨＣ）の結果は１１例（６１．１％）ＩＨＣ２＋、７例（３８．９％）ＩＨＣ３＋であった。
【0100】
有効性評価は、１８例の被験者のうち、１３例で実施され、１０例は部分奏効（ＰＲ）を有した（４例はＰＲを確認した（２回の連続したＰＲ評価は確認済みＰＲと呼ばれる）。ＲＥＣＩＳＴ基準によると、「各被験者が部分奏効または完全奏効の基準を満たし、且つ、その後の時点（通常４週間後）で有効性が再度確認されると、完全または部分的奏効がと見なす」、即ち、被験者が２回連続してＰＲと評価されると、確認済みＰＲと呼ばれた。他の６例は、有効性を確認する時点に達しておらず、現在、確認は１つしか完了しなかった）、客観的奏効率（ＯＲＲ）は７６．９％であり（１０／１３）、疾患制御率（ＤＣＲ）（有効性評価の対象の１３例のうちの１０例はＰＲであり、２例は安定な疾患（ＳＤ）である）は９２．３％（１２／１３）である。現在、被験者の最長治療時間は７ヶ月であった。奏効に達した被験者のうち、７例（５３．８％）は、タキサン治療を受け、４例（３０．８％）はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療を受けた。
【0101】
被験者の１８例のうち、１６例は、安全性評価を受けた。安全性評価で最も一般的な治療関連副作用（ＴＲＡＥｓ）は、ＡＬＴ上昇（５０．０％、グレード１～２）、知覚異常（５０．０％、グレード１～２）及び白血球数の減少（５０．０％、グレード１～２）であり、≧３グレードのＴＲＡＥは、好中球数の減少（１２．５％、グレード３）である。薬物関連の重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、発生しなかった。
【0102】
以下、いくつかの症例の視認可能な治療効果を説明する。
【0103】
１．患者０１００１：女性、５７歳、右腎盂癌手術後の複数の肺転移。病理診断は、尿路上皮がん、ＨＥＲ２ ＩＨＣ ３＋である。
【0104】
図６からわかるように、１２週間の治療後、右肺の下葉の腫瘍病巣は、６週間、１２週間の治療後に、５４×３１ｍｍから３７×２３ｍｍに縮小し、４９％縮小した。
【0105】
２．患者０１００３、女性、４５歳、右腎盂癌手術後に腹部リンパ節に転移した。病理診断は尿路上皮がん、ＨＥＲ２ ＩＨＣ ３＋；
【0106】
図７からわかるように、６週間の治療後、右大腰筋の横にある腫瘍病巣は、５６×４８ｍｍから３３×２２ｍｍに縮小し、７２．９％縮小した。
【0107】
３．患者０１００７、男性、６３歳、膀胱癌手術後、右腎盂癌手術後、肺転移、肝転移、頸部リンパ節転移、縦隔転移、多発骨転移である。病理診断は、尿路上皮がん、ＨＥＲ２ ＩＨＣ ３＋ である。
【0108】
図８からわかるように、６週間の治療後、左上葉に位置する腫瘍病巣、肝転移及び縦隔リンパ節の腫瘍病巣が有意に縮小した。左上葉に位置する腫瘍病巣は、４５×３６ｍｍから２８×２２ｍｍに縮小し、６１．９％縮小し、肝転移が３８×３２ｍｍから２５×２１ｍｍに縮小し、５６．８％縮小し、縦隔リンパ節の腫瘍病巣は２９×１５ｍｍから１８×７ｍｍに縮小し、７１．０３％縮小した。
【0109】
上記の臨床データ及び直接視認の病理学的検査は、いずれも本発明の抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートが非常に有意な治療効果を有することを示した。現在市販されている薬物と比較して、欧州連合及び米国によって承認された現在の類似の薬剤よりもはるかに優れていることがわかり、例えば、ロシュ社のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ ＯＲＲは６３％であり、ブリストル-マイヤーズスクイブ社のＮｉｖｏｌｕｍａｂのＯＲＲは１９．６％だけであり、ヤンセン社のｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂのＯＲＲは４２％であが、本発明の組換えヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体－ＭＭＡＥコンジュゲートのＯＲＲは７６．９％であり、疾患制御率（ＤＣＲ）は９２．３％であり、現在市販されている類似した薬物よりも著しく優れ、且つ副作用も類似した薬物よりも大幅に少なく、いずれの重篤な有害事象（ＳＡＥ）も発生せず、より広範な患者を対象とし、緊急治療を必要とする尿路上皮がん患者に別の選択肢を提供する。以上のように、本発明の抗ＨＥＲ２抗体コンジュゲートは、尿路上皮がんの治療において優れた応用見通しを有し、患者の疾患発症・進展を効果的に改善する又は逆転させることができ、予想外の技術的効果をもたらす。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】