特許 7109301 ヘパリン誘発性血小板減少症の診断用結合アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-07-21

(45)【発行日】2022-07-29

(54)【発明の名称】ヘパリン誘発性血小板減少症の診断用結合アッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20220722BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20220722BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20220722BHJP

   C07K 16/36 20060101ALN20220722BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

G01N33/53 D

G01N33/543 581U

G01N33/543 581A

G01N33/543 575

G01N33/545 B

C07K16/36

【請求項の数】 11

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2018144703

(22)【出願日】2018-08-01

(65)【公開番号】P2019039912

(43)【公開日】2019-03-14

【審査請求日】2021-07-15

(31)【優先権主張番号】17184389.9

(32)【優先日】2017-08-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】510259921

【氏名又は名称】シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス プロダクツ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ハーラルト・アルタウス

(72)【発明者】

【氏名】ヘルベルト・シュヴァルツ

(72)【発明者】

【氏名】ノルベルト・ツァンダー

【審査官】白形 優依

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５１６２００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３－５２３２０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５１７３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１１－２４２０３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０５－５０２１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平１０－５０６９８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５０８７３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００３７８２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】CUKER, A. et al.，Novel diagnostic assays for heparin-induced thrombocytopenia，BLOOD，2022年05月02日，Vol.121, No.18，pp.3727-3732

【文献】SACHAIS, B. S. et al.，Rational design and characterization of platelet factor 4 antagonists for the study of heparin-induced thrombocytopenia，BLOOD，2012年06月21日，Vol.119, No.25，pp.5955-5962

【文献】BAKCHOUL, T. et al.，Current insights into the laboratory diagnosis of HIT，International Journal of Laboratory Hematology，2014年，Vol.36，pp.296-305

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出する方法であって、
ｉ．サンプルを、
・ヘパリンもしくはＰＦ４結合非分枝状多糖もしくはＰＦ４結合多価陰イオンと一緒に、または
・ＰＦ４／ヘパリン複合体、もしくは非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体と一緒に、および
・粒子状固相と一緒に
混合することによって反応混合物を用意する工程；ならびに
ｉｉ．反応混合物中の粒子状固相の凝集を測定する工程；
ｉｉｉ．このようにして測定した反応混合物中の凝集を、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含有していないことが既知のドナーからの体液サンプルを含有する反応混合物中の凝集に関する所定の基準値と比較する工程；ならびに
ｉｖ．反応混合物中の定量された凝集が基準値を超える場合、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定する工程
を含み、
粒子状固相は、単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されており、
粒子状固相は、非細胞粒子である、前記方法。

【請求項2】

反応混合物中の粒子状固相の凝集は、測光法で測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

粒子状固相の第１の分画は、シグナル形成系の第１の成分に結合しており、粒子状固相の第２の分画は、シグナル形成系の第２の成分に結合しており、シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに非常に接近した場合、シグナル形成系の第１および第２の成分が相互作用して、検出可能なシグナルが形成されるようになり、形成されるシグナルに基づいて、反応混合物中の粒子状固相の凝集が測定される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

シグナル形成系の第１の成分は化学発光剤であり、シグナル形成系の第２の成分は光増
感剤であり、またはその逆であり、反応混合物中の化学発光が測定される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ヘパリン誘発性血小板減少症を診断するための方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法を使用して、患者からの体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を検出する、前記方法。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の方法を実行するためのアッセイキットであって、以下の成分：
ａ．ヘパリン、ＰＦ４結合非分枝状多糖、またはＰＦ４結合多価陰イオン、またはＰＦ４／ヘパリン複合体、または非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体を含有する第１の試薬；および
ｂ．単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている粒子状固相を含有する第２の試薬を含有し、
粒子状固相は、非細胞粒子である、前記アッセイキット。

【請求項7】

以下の成分：
ｃ．単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている粒子状固相を含有する第３の試薬をさらに含み、
第２の試薬の粒子状固相は、シグナル形成系の第１の成分に結合しており、第３の試薬の粒子状固相は、シグナル形成系の第２の成分に結合しており、シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに非常に接近した場合、シグナル形成系の第１および第２の成分は相互作用して、検出可能なシグナルが形成されるようになる、請求項６に記載のアッセイキット。

【請求項8】

シグナル形成系の第１の成分は化学発光剤であり、シグナル形成系の第２の成分は光増感剤であり、またはその逆である、請求項７に記載のアッセイキット。

【請求項9】

粒子状固相はラテックス粒子である、請求項６～８のいずれか１項に記載のアッセイキット。

【請求項10】

第１の試薬中に存在するヘパリン、ＰＦ４結合非分枝状多糖、もしくはＰＦ４結合多価陰イオン、または第１の試薬中に存在するＰＦ４／ヘパリン複合体、または非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体は、さらなる粒子状固相に結合されている、請求項６～９のいずれか１項に記載のアッセイキット。

【請求項11】

前記さらなる粒子状固相がラテックス粒子である、請求項１０に記載のアッセイキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法の分野におけるものであり、ヘパリン誘発性血小板減少症を確定するための、ＦｃγＲＩＩａタンパク質被覆粒子を使用する容易に自動化可能な結合アッセイに関する。

【背景技術】

【0002】

ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）は血栓性疾患であり、この疾患はヘパリン療法中に生じる恐れがあり、生命を脅かす血栓塞栓性合併症を引き起こす恐れがある。罹患患者は、ヘパリンおよび血小板第四因子（ＰＦ４）から構成された複合体に結合する抗体、いわゆる、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を生成する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、抗体が結合したＰＦ４／ヘパリン複合体は、血小板表面に結合し、血小板の活性化を引き起こす。これは、血小板数の減少および血栓塞栓症のリスク増加をまねく。

【0003】

ＨＩＴ診断には、２種のアッセイ原理が主に使用される。第１のアッセイ原理は、患者からの体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の直接検出に基づくものである。この目的のため、サンプルを、ＰＦ４／ヘパリン複合体、またはＰＦ４および別の適切な多価陰イオン（例えば、ポリビニルスルホン酸塩）から構成された複合体と接触させ、サンプル中に存在する任意の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の結合を、従来の免疫学的アッセイ方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して検出する。しかし、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の検出は鋭敏であるが、特異度が十分ではないという欠点がある、すなわち、抗体の検出は陽性のＨＩＴ診断には不十分であるが、陰性の結果は適切確実にＨＩＴを除外する。したがって、第２のアッセイ原理に基づいた機能的アッセイによる確認が推奨されている。

【0004】

第２の機能的アッセイ原理は、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の血小板活性化作用の検出に基づいている。前記アッセイ原理では、１人またはそれ以上の正常なドナーからの洗浄済み血小板を、患者からの血漿または血清サンプルおよびヘパリンと一緒に混合し、例えば放出されたセロトニンの量（セロトニン放出アッセイ）に基づくような、または血小板の視覚的に識別可能な凝集反応（ＨＩＰＡアッセイ）に基づくような既知の活性化マーカーに基づいて、血小板活性化を測定する。患者のサンプルが抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含有している場合、正常なサンプル（このような抗体を含まない）と比較して血小板活性化が増大していることを確定することが可能である。

【0005】

血小板に基づいた機能的アッセイには、血小板を複雑な手作業による方法で製造しなければならず、かつその保存寿命が不十分なために製造したてのものしか使用することができないという欠点がある。さらに、個々の血小板製造間の生物学的ばらつきを補正して、ある一定の標準化を可能にするために、複数のドナーからの血小板の混合物を使用することが常に必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の一目的は、前述の欠点、特に血小板の使用を回避する、体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

サンプルをヘパリンまたはＰＦ４／ヘパリン複合体と一緒におよび粒子状固相と一緒に混合することにより得た反応混合物ならびにこの粒子状固相の凝集の定量において、この粒子状固相が単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている場合、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定できることを見出した。

【発明を実施するための形態】

【0008】

したがって、本発明は、体液サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出する方法を提供する。この方法は、
ｉ．サンプルを、
・ヘパリンもしくはＰＦ４結合非分枝状多糖もしくはＰＦ４結合多価陰イオンと一緒に、または
・ＰＦ４／ヘパリン複合体、もしくは非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体と一緒に、および
・粒子状固相と一緒に
混合することによって反応混合物を用意する工程；
ｉｉ．反応混合物中の粒子状固相の凝集を測定する工程；
ｉｉｉ．このようにして測定した反応混合物中の凝集を、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含有していないことが既知のドナーからの体液サンプルを含有する反応混合物中の凝集に関する所定の基準値と比較する工程；ならびに
ｉｖ．反応混合物中の定量された凝集が基準値を超える場合、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定する工程
を含み、
ここで、粒子状固相は、単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている。

【0009】

体液サンプルは、好ましくはヒト由来である。好ましくは、体液サンプルは、実質上血小板を含まないものであり、特に、血漿または血清である。

【0010】

体液サンプルを、ＰＦ４結合非分枝状多糖と一緒に、またはＰＦ４結合多価陰イオンと一緒に混合することができる。ＰＦ４と共に、検出される抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体によって結合される複合体を形成する非常に多くのＰＦ４結合物質が既知である。適切な非分枝状多糖は、例えば、ヘパリン、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、分画ヘパリン（ＬＭＷＨ）、硫酸デキストラン、およびフコイダンである。適切な多価陰イオンは、例えば、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸塩、ポリビニルリン酸塩、ポリビニルホスホン酸塩、ポリスチレン硫酸塩、およびポリスチレンスルホン酸塩である。

【0011】

別法として、体液サンプルを、ＰＦ４／ヘパリン複合体と一緒に、または非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体と一緒に混合することができる。

【0012】

さらに、サンプルを、単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている粒子状固相と一緒に混合する。

【0013】

本発明において、用語「粒子状固相」とは、少なくとも２０ｎｍおよび２０μｍ以下、通常２００ｎｍ～３５０ｎｍ、好ましくは２５０～３２０ｎｍ、特に好ましくは２７０～２９０ｎｍ、特に非常に好ましくは２８０ｎｍの近似直径を有する非細胞粒子を意味することを理解されたい。微粒子は、規則的形状でも不規則的形状でもよい。それらは、球体、回転楕円体、ある程度大きな空隙または孔を有する球体であり得る。微粒子は、有機材料、無機材料、またはそれら２種の混合物もしくは組合せからなり得る。それらは、多孔性または無孔性の、膨潤性または非膨潤性の材料からなり得る。原理的に、微粒子はいずれの密度を有してもよいが、約０．７～約１．５ｇ／ｍｌのような水の密度に近い密度を有する粒子が好ましい。好ましい微粒子は、水溶液に懸濁可能であり、できるだけ長期間懸濁安定性を示す。それらは、透明でも、部分的に透明でも、または不透明でもよい。微粒子は、例えばコアおよび１つまたはそれ以上の外被層を含むいわゆる「コアおよびシェル」粒子のような複数層からなり得る。微粒子という用語は、例えば、染料結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、および磁性粒子を網羅する。好ましい微粒子は、水溶液に懸濁可能であり、かつ非水溶性ポリマー材料からなる、特に置換ポリエチレンからなる粒子である。例えば、ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリ酢酸ビニルアクリラート、ポリビニルピリジン、塩化ビニルアクリラートから構成されているラテックス粒子が、特に非常に好ましい。例えば、単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質を共有結合でラテックス粒子に結合させることができるカルボキシル、アミノ、またはアルデヒド基のような反応性基を表面上に有するラテックス粒子が特に重要である。本発明において、ヒト、動物、植物、もしくは真菌の細胞、または細菌は、用語「粒子状固相」に明らかに網羅されない。

【0014】

用語「単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質」とは、組換えもしくは合成により生成されたＦｃγＲＩＩａタンパク質、または天然の、すなわち天然源由来の、例えばヒト白血球から精製されたＦｃγＲＩＩａタンパク質を意味することを理解されたい。組換えＦｃγＲＩＩａタンパク質の生成に関しては、例えば、細菌（例えば、大腸菌）における発現、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））における発現、植物、動物、またはヒトの細胞培養における発現のような既知の原核生物または真核生物の発現系が適している。合成ＦｃγＲＩＩａタンパク質の生成に関しては、例えば固相合成（例えば、メリフィールド合成）のようなｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成のための既知の技術が適している。好ましくは、本発明による方法で使用するＦｃγＲＩＩａタンパク質は、ヒト細胞の培養において、好ましくはヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）の培養において生成された組換え生成ＦｃγＲＩＩａタンパク質である。

【0015】

ＦｃγＲＩＩａタンパク質（別名：ＣＤ３２ａタンパク質）は、好ましくはヒトＦｃγＲＩＩａタンパク質である。用語「ＦｃγＲＩＩａタンパク質」は、完全ＦｃγＲＩＩａタンパク質だけでなく、ＰＦ４／ヘパリン複合体およびそれに結合した抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体から構成された免疫複合体に結合できる完全ＦｃγＲＩＩａタンパク質の断片も網羅する。用語「ＦｃγＲＩＩａタンパク質」はさらに、野生型ＦｃγＲＩＩａタンパク質またはその断片だけでなく、例えばヒトＦｃγＲＩＩａタンパク質の１３１位の既知の置換のような、ＰＦ４／ヘパリン複合体に結合できる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換基を有するＦｃγＲＩＩａタンパク質も網羅する。ＦｃγＲＩＩａタンパク質またはＦｃγＲＩＩａタンパク質断片は、Ｎ末端において異種シグナル配列と融合することができる、すなわち、ヒトＦｃγＲＩＩａタンパク質中に通常存在しないが、選択された発現系での組換え発現ＦｃγＲＩＩａタンパク質の発現および／または分泌に肯定的に影響するポリペプチドと融合することができる。さらに、ＦｃγＲＩＩａタンパク質またはＦｃγＲＩＩａタンパク質断片は、Ｃ末端において、例えば組換え発現タンパク質と親和性支持体の結合を可能にする１つまたはそれ以上の親和性タグと融合することができ、それによって、組換え発現ＦｃγＲＩＩａタンパク質の精製が可能になる。１２個以下のアミノ酸の長さを有する小さな親和性タグが好ましい。Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、およびＳｔｒｅｐタグからなる群からの親和性タグが特に好ましい。高親和性を有する親和性タグに結合する適切な親和性支持体は、例えば、特異的抗体、固定化陽イオン（例えば、Ｈｉｓタグへの親和性を有するＮｉ^２＋）、または他のタイプの結合相手（例えば、Ｓｔｒｅｐタグへの親和性を有するストレプトアビジン）である。

【0016】

体液サンプルが抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含有している場合、これらは反応混合物中でＰＦ４／ヘパリン複合体に結合する。形成された免疫複合体は、ＦｃγＲＩＩａタンパク質によって結合され、反応混合物中で粒子状固相の凝集を引き起こす。

【0017】

反応混合物中の粒子状固相の凝集の測定は、測光法、例えば濁度法または比濁法で行うことができる。粒子増強光散乱の原理に基づく結合アッセイは、およそ１９２０年から既知である（概要に関しては、Ｎｅｗｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９２年；２９：２２～４２頁を参照）。この場合、好ましくは０．１～０．５μｍの直径、特に好ましくは０．１５～０．３５μｍの直径を有するポリスチレン粒子が使用される。好ましくは、アミン、カルボキシル、またはアルデヒド官能基を有するポリスチレン粒子が使用される。さらに好ましくは、シェル／コア粒子が使用される。粒子の合成およびリガンドの共有結合カップリングは、例えば、Ｐｅｕｌａ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐｓ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９５年；６：７７９～７８５頁に記載されている。

【0018】

別法として、反応混合物中の粒子状固相の凝集の測定は、シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに非常に接近した場合にシグナル形成系によって生成されるシグナルを測定することによって行うことができる。この場合、粒子状固相の第１の分画は、シグナル形成系の第１の成分に結合しており、粒子状固相の第２の分画は、シグナル形成系の第２の成分に結合しており、シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに非常に接近した場合、シグナル形成系の第１および第２の成分が相互作用して、検出可能なシグナルが形成されるようになり、形成されるシグナルに基づいて、反応混合物中の粒子状固相の凝集が測定される。

【0019】

本発明による方法のこの実施形態では、シグナル形成系は、相互作用する少なくとも１つの第１の成分および少なくとも１つの第２の成分を含み、それにより、それらが互いに非常に接近し、その結果互いに相互作用することができた場合、検出可能なシグナルが形成されるようになる。成分間の相互作用とは、特にエネルギー転移、すなわち、例えば光線または電子線による、また、例えば短命な一重項酸素のような反応性化学分子による成分間の直接的なエネルギー転移を意味することを理解されたい。エネルギー転移はある成分から別の成分へ起こり得るが、異なる物質のカスケードによりエネルギー転移を起こすことも可能である。例えば、成分は、例えば、光増感剤および化学発光剤（欧州特許出願公開第０５１５１９４号、ＬＯＣＩ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）または光増感剤および発蛍光団（国際公開第９５／０６８７７号パンフレット）または放射性ヨウ素＜１２５＞および発蛍光団（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：８６７２～８６７６頁）または発蛍光団および蛍光消光剤（米国特許第３，９９６，３４５号）のようなエネルギー供与体およびエネルギー受容体から構成される対とすることができる。特に好ましくは、シグナル形成系の第１の成分は化学発光剤であり、シグナル形成系の第２の成分は光増感剤であり、またはその逆であり、反応混合物中の化学発光が測定される。

【0020】

反応混合物中の凝集を（例えば、反応混合物の吸収の最大変化を定量することによって）測定した後、このようにして測定した凝集を所定の基準値と比較する。適切な基準値は、同方法を用いて測定される（または事前測定された）、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含有していないことが既知のドナーからの体液サンプルを含有する反応混合物中の凝集のものである。通常、基準値を定量するために、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を有していないことが既知の健常ドナーからの多数のサンプルにおける凝集を測定し、次いで、ＨＩＴに罹患しておりかつ抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を有しているドナーからの多数のサンプルの凝集と比較する。次いで、基準値は、例えば、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含むサンプルと含まないサンプルの区別を可能にする閾値とすることができる。反応混合物中で測定された凝集が基準値を超える場合、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を確定することが可能となる。対照的に、反応混合物中で測定された凝集が基準値に達しない場合、サンプル中の抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の不在を確定することが可能となる。

【0021】

本発明はさらに、ヘパリン誘発性血小板減少症を診断する方法であって、本発明による方法を使用して、患者からの体液サンプル中に抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体が存在するかどうかを検出する、方法を提供する。

【0022】

また、本発明はさらに、本発明による方法を実行するためのアッセイキットを提供する。アッセイキットは、少なくとも以下の成分：
ａ．ヘパリン、ＰＦ４結合非分枝状多糖、またはＰＦ４結合多価陰イオン、またはＰＦ４／ヘパリン複合体、または非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体を含有する第１の試薬；および
ｂ．単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている粒子状固相を含有する第２の試薬を含有する。

【0023】

第１の試薬は、
・好ましくは、ヘパリン、未分画ヘパリン、分画ヘパリン、硫酸デキストラン、およびフコイダンからなる群からのＰＦ４結合非分枝状多糖；または
・好ましくは、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸塩、ポリビニルリン酸塩、ポリビニルホスホン酸塩、ポリスチレン硫酸塩、およびポリスチレンスルホン酸塩からなる群からのＰＦ４結合多価陰イオン；または
・ＰＦ４／ヘパリン複合体；または
・非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体
を含有することができる。

【0024】

第１および第２の試薬は、体液サンプルと一緒にした反応混合物の用意を意図している。

【0025】

好ましいアッセイキットでは、第２の試薬中に存在する粒子状固相はラテックス粒子からなる。このようなアッセイキットは、測光法による凝集の測定に適している。

【0026】

アッセイキットの別の一実施形態は、第１および第２の試薬のほかに、単離ＦｃγＲＩＩａタンパク質で被覆されている粒子状固相を同様に含有する第３の試薬をさらに含有する。この場合、第２の試薬の粒子状固相は、シグナル形成系の第１の成分に結合しており、第３の試薬の粒子状固相は、シグナル形成系の第２の成分に結合しており、シグナル形成系の第１および第２の成分が互いに非常に接近した場合、シグナル形成系の第１および第２の成分は相互作用して、検出可能なシグナルが形成されるようになる。好ましくは、シグナル形成系の第１の成分は化学発光剤であり、シグナル形成系の第２の成分は光増感剤であり、またはその逆である。そのようなアッセイキットは、化学発光測定による凝集の測定に適している。

【0027】

アッセイキットのさらに別の一実施形態では、第１の試薬中に存在するヘパリン、ＰＦ４結合非分枝状多糖、もしくはＰＦ４結合多価陰イオン、または第１の試薬中に存在するＰＦ４／ヘパリン複合体、または非分枝状多糖もしくは多価陰イオンと共にＰＦ４から構成された複合体は、さらなる粒子状固相、好ましくはラテックス粒子に結合されている。

【0028】

本発明によるアッセイキットの試薬は、液体または凍結乾燥された形態で提供することができる。アッセイキットのいくつかまたはすべての試薬が凍結乾燥物として存在する場合、アッセイキットは、例えば蒸留水または適切な緩衝液のような、凍結乾燥物の溶解に必要な溶媒をさらに含有することができる。

【0029】

以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、限定するものとして理解すべきではない。

【実施例1】

【0030】

抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を検出するための均一結合アッセイ
試薬１は、ヒト血小板濃縮物から単離したＰＦ４タンパク質を未分画ヘパリン（ＵＦＨ）と緩衝液中においてＰＦ４タンパク質１０μｇ：０．２Ｕ／ｍＬ（ＵＦＨ）の比で混合することによって製造した。別法として、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）（０．２Ｕ／ｍＬ）のみを含有する試薬１を使用した。

【0031】

試薬２は、ヒトＦｃγＲＩＩａタンパク質約１ｍｇをポリスチレンラテックス粒子（５０ｍｇ／ｍＬ、粒子直径０．２～０．３μｍ）１ｍＬと緩衝液中において混合し、インキュベートすることによって製造した。粒子を繰り返し洗浄した後、粒子を緩衝液５０ｍＬに再懸濁させた。

【0032】

ヒト血清サンプル２０μＬを、ＰＦ４／ヘパリン複合体を含有する試薬１の２０μＬおよびＦｃγＲＩＩａタンパク質被覆ラテックス粒子を含有する試薬２の８０μＬと混合して、反応混合物を形成し、３７℃でインキュベートした。

【0033】

反応混合物の光学濃度（ＯＤ）を、ＢＣＳ ＸＰ分析計（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＧｍｂＨ）において５７０ｎｍの波長で６分間測定し、１分間あたりの光学濃度の平均変化（ΔＯＤ／分）を測定結果として確認した。

【0034】

本発明による凝集アッセイを使用して、５人のＨＩＴ患者からの血清サンプルを測定した。彼らは、ＨＩＴを臨床基準（４Ｔスコア、血栓性事象を伴ういくつかの症状において）に基づいて診断されており、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体の存在を２種の独立した市販のイムノアッセイ（ＨｅｍｏｓＩＬ（登録商標）ＡｃｕＳｔａｒ ＨＩＴ－Ａｂ（ＰＦ４－Ｈ）、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、およびＡｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＨＰＩＡ－ＩｇＧ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ）を使用して確定した。

【0035】

さらに、４人の健常ドナー（臨床的ＨＩＴ基準を有さず、また、抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を有していない）からの血清サンプルおよび正常な血漿プール（約２０人の健常ドナーからの血漿から、「ＦＮＰ」）を測定した。

【0036】

負の対照として緩衝液を使用した。

【0037】

アッセイの結果を表１にまとめる。ＰＦ４／ヘパリン複合体を含有する試薬１（ＰＦ４／ヘパリン）またはヘパリンのみを含有する試薬１（ヘパリン）を使用したアッセイの結果の間には違いがある。

【0038】

【表1】

【0039】

本発明による２種の凝集アッセイの結果から、健常なＨＩＴ陰性血液ドナーとＨＩＴ陽性患者の区別が可能になることが分かる。ＨＩＴ患者サンプルを含有するすべての反応混合物において、健常ドナーと比較して有意に増大している凝集を測定することが可能である。抗ＰＦ４／ヘパリン複合体抗体を含有するサンプルと含有しないサンプルを区別する閾値（カットオフ）として、２種の本アッセイ系においてΔＯＤ／分［５７０ｎｍ］に０．１を選択することが可能であろう。

【0040】

しかし、カットオフ値を統計的にもっと正確に定義するためには、疑いようもないほどのより多数のサンプル測定が必要である。