特許 7109783 優れた免疫賦活能を有する新規の乳酸菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-07-22

(45)【発行日】2022-08-01

(54)【発明の名称】優れた免疫賦活能を有する新規の乳酸菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220725BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20220725BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220725BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220725BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A ZNA

A61K35/744

A61P35/00

A61P37/02

C12N1/20 C

C12N1/20 E

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2018210576

(22)【出願日】2018-11-08

(65)【公開番号】P2020074719

(43)【公開日】2020-05-21

【審査請求日】2021-08-05

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-02751

(73)【特許権者】

【識別番号】398055037

【氏名又は名称】株式会社井上天極堂

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100143638

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 真久

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】藤野 布久代

(72)【発明者】

【氏名】西尾 実紗

(72)【発明者】

【氏名】浅野 瑞季

【審査官】中山 基志

(56)【参考文献】

【文献】特開２００９－１４２２６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－０５７３４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】Database GenBank, Accession No. KR816162.1[online]，2015年11月03日，[検索日 2022.06.16], インターネット：<URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KR816162>

【文献】Database GenBank, Accession No. LC260032.1[online]，2017年04月25日，[検索日 2022.06.16], インターネット：<URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LC260032>

【文献】Database GenBank, Accession No. LC260033.1[online]，2017年04月25日，[検索日 2022.06.16], インターネット：<URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LC260033>

【文献】日本食品化学学会誌，2020年，Vol. 27, No. 1，pp. 22-27，https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjfcs/27/1/27_22/_pdf/-char/ja

【文献】奈良県産業振興総合センター研究報告，2019年，No. 45，pp. 13-19，https://www.pref.nara.jp/secure/217311/2019_4.pdf

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１／００－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）。

【請求項2】

Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有し、かつ、ＩＬ－１２産生誘導活性を有する、変異株。

【請求項3】

Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有し、かつ、ＩｇＥ抑制活性を有する、変異株。

【請求項4】

Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗がん活性を有する、変異株。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）またはその変異株を培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか一項に記載のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）またはその変異株を用いて製造された、乳酸菌加熱菌体。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか一項に記載のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）またはその変異株を、葛由来デキストリンを含む培地で培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法で製造された、乳酸菌加熱菌体。

【請求項9】

請求項６または８に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、ＩＬ－１２産生を誘導するための組成物。

【請求項10】

請求項６または８に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、ＩｇＥを抑制するための組成物。

【請求項11】

請求項６または８に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、癌を処置または予防するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、優れた免疫学的特性を有する新規の乳酸菌およびその使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

乳酸菌は、腸内細菌叢を良好な状態に保つことに寄与し、また、乳酸菌を用いて乳を発酵させて得られる乳酸発酵食品は、健康志向の飲食品として広く食されている。また、乳酸菌を加熱した菌体もまた、食品ないし食品添加物として有用である。乳酸菌の中には、ＯＫ４３２株（非特許文献１）のように、免疫賦活等の免疫学的特性や生理活性効果を有しているものが知られているが、その効果は十分ではない。

【0003】

リンパ球、マクロファージ等が産生するサイトカインのなかで、ＩＬ－１２は、ヘルパーＴ前駆細胞（Ｔｈ０）からヘルパーＴ細胞タイプ１（Ｔｈ１）への分化誘導やナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化等の作用を有する。ヘルパーＴ細胞には、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞があり、Ｔｈ１細胞は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ抗体の産生を抑制する）、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－３を産生することで、Ｔ細胞や単球等の貪食細胞の活性を高め、細菌等の感染に対する抵抗を高める。また、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、がん細胞やウイルス感染細胞等を特異的に殺傷する能力を有する。したがって、ＩＬ－１２の産生増強により、ウイルス感染への抵抗力増強やがんの予防等が期待できる。これらの作用は、白血球やリンパ球等の免疫細胞が直接病原体を殺傷、貪食するもので、細胞性免疫と呼ばれ、抗体産生による免疫作用（液性免疫）とは区別される。

【0004】

一方、細胞性免疫と液性免疫はバランス関係にあり、細胞性免疫が活性化すると液性免疫が抑制される現象がみられる。現代の人間は、抗体産生（液性免疫）側にバランスが傾いているといわれ、花粉症、アレルギーの増加の一因とされている。ＩＬ－１２の増強により、これらの症状の緩和も期待できる。したがって、ＩＬ－１２産生誘導活性が高い乳酸菌は多くの用途を有する。

【0005】

また、望まれる免疫学的特性を有しつつ、かつ、抗ＩｇＥを低下することができれば、抗炎症という点においてさらに有用であることが予測される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】日本口腔科学会雑誌、２００３年５２巻２号ｐ．５１－６２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来の乳酸菌と比較して、免疫学的性質が優れた（例えば、より高いＩＬ－１２産生誘導活性、ＩｇＥ産生抑制活性、および／または、抗がん活性を有する）新規の乳酸菌を提供することを課題とする。さらに、本発明は、そのような新規の乳酸菌を利用する方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の発明者らは、新規の乳酸菌であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する「つる５」株を提供することによって、上記課題を解決した。このつる５株は、図１に示す核酸配列を含む１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（配列番号１）を有する。このＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する「つる５」株は、２０１８年７月１１日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）。

【0009】

例えば、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）。
（項目２）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有し、かつ、ＩＬ－１２産生誘導活性を有する、変異株。
（項目３）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有し、かつ、ＩｇＥ抑制活性を有する、変異株。
（項目４）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）の変異株であって、該変異株は、配列番号１に示される核酸配列からなる１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子を有し、かつ、抗がん活性を有する、変異株。
（項目５）
項目１～４のいずれか一項に記載のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）またはその変異株を培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。
（項目６）
項目１～４のいずれか一項に記載のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）またはその変異株を用いて製造された、乳酸菌加熱菌体。
（項目７）
項目１～４のいずれか一項に記載のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）またはその変異株を、葛由来デキストリンを含む培地で培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。
（項目８）
項目７に記載の方法で製造された、乳酸菌加熱菌体。
（項目９）
項目６または８に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、ＩＬ－１２産生を誘導するための組成物。
（項目１０）
項目６または８に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、ＩｇＥを抑制するための組成物。
（項目１１）
項目６または８に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、癌を処置または予防するための組成物。

【0010】

（菌学的特徴）
本発明のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する新規のつる５株（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに特徴的な以下の菌学的特徴を有し、ザワークラウトなどの発酵食品に用いられる。この菌は、以下の菌学的特徴を備えていた。
・グラム陽性の球菌で連鎖状ないし双球菌の形態である。
・糖を分解して乳酸菌と乳酸菌以外の短鎖脂肪酸の酢酸、エタノール、ＣＯ_２などを生成するヘテロ乳酸菌に分類される。

【0011】

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

【0012】

本明細書において使用される用語「加熱菌体」とは、培養後に加熱殺菌した菌体をいう。限定されることはないが、代表的には、２０～４０℃で１０～４０時間培養した後に、７０～１２１℃で１０～６０分間加熱殺菌した菌体をいう。

【0013】

本明細書において使用される用語「抗がん活性」とは、無秩序な細胞成長の阻止(部分的もしくは全体的)または抑止、および/あるいは本明細書において定義されるがんの阻止(部分的もしくは全体的)または抑止をいう。抗がん活性には、例えば、遺伝子損傷を低減、抑止もしくは修復する能力、望ましくない細胞増殖を調節する能力、細胞死の誤制御を調節する能力、または転移の機構(例えば、移動能)を調節する能力が含まれる。本発明が対象とするがんは、限定されることはないが、例えば、転移性脳腫瘍、神経内分泌腫瘍、黒色腫、前立腺癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、泌尿生殖器癌、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、絨毛腫、膵臓癌、網膜芽腫、多発性骨髄腫、および他の種類の癌を包含する。

【発明の効果】

【0014】

本発明は、免疫学的性質が優れた新規の乳酸菌、特に、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する乳酸菌を提供する。本発明の乳酸菌は、例えば、より高いＩＬ－１２産生誘導活性、ＩｇＥ産生抑制活性、および／または、抗がん活性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の核酸配列を示す。

【図2-1】図２は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（上段のＳＩＩＤ２３１４９－０１の配列）と比較対象であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するＲＩＢ．９１８６株（酒類総合研究所より入手、下段のＳＩＩＤ２３１４９－０２の配列）とを比較したアラインメントである。１２４３番目の核酸は、ＳＩＩＤ２３１４９－０１では「Ｇ」であるのに対して、ＳＩＩＤ２３１４９－０２では「Ａ」である。

【図2-2】図２は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（上段のＳＩＩＤ２３１４９－０１の配列）と比較対象であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するＲＩＢ．９１８６株（酒類総合研究所より入手、下段のＳＩＩＤ２３１４９－０２の配列）とを比較したアラインメントである。１２４３番目の核酸は、ＳＩＩＤ２３１４９－０１では「Ｇ」であるのに対して、ＳＩＩＤ２３１４９－０２では「Ａ」である。

【図2-3】図２は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（上段のＳＩＩＤ２３１４９－０１の配列）と比較対象であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するＲＩＢ．９１８６株（酒類総合研究所より入手、下段のＳＩＩＤ２３１４９－０２の配列）とを比較したアラインメントである。１２４３番目の核酸は、ＳＩＩＤ２３１４９－０１では「Ｇ」であるのに対して、ＳＩＩＤ２３１４９－０２では「Ａ」である。

【図3】図３は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の核酸配列に基づく簡易分子系統樹である。

【図4】図４は、「つる５」株とＯＫ４３２株のＩＬ－１２産生誘導活性を比較したグラフである。

【図5】図５は、葛由来デキストリンを用いて培養した「つる５」株による優れたＩＬ－１２産生誘導活性を示したグラフである。

【図6】図６は、異なる濃度の葛由来デキストリンを用いて培養した「つる５」株による優れたＩＬ－１２産生誘導活性を示したグラフである。

【図7】図７は、「つる５」株を用いた場合（被験物質投与群）と用いない場合（無処置群）での腫瘍重量を比較したグラフである。

【図8】図８は、加熱菌体の作製のための代表的なスキームを示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

（１．「つる５」株の培養法）
「つる５」株の代表的な培養条件は、ＭＲＳ培地にて静置培養２５～３７℃で２４～４８時間であるが、これに限定されない。

【0017】

（２．変異株の作製）
前記変異株は、例えば、一般的な突然変異処理を施すこと、又は経代培養による適応若しくは自然変異により作製される。

【0018】

前記突然変異処理は、一般的な変異原を用いて行われ得る。変異原としては、例えば、変異原作用を有する薬剤、紫外線などが挙げられる。変異原作用を有する薬剤としては、例えば、ストレプトマイシン、オフロキサシン、エチルメタンスルホネート、Ｎ－メチル－Ｎ′－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、ブロモウラシル等のヌクレオチド塩基類似体、又は、アクリジン類などが挙げられる。

【0019】

本発明の変異株は、好ましくは、「つる５」株と同程度のＩＬ－１２産生誘導活性を有する。例えば、本発明の変異株は、「つる５」株と比較して７０％～１３０％、８０％～１２０％、または、９０％～１１０％のＩＬ－１２産生誘導活性を有する。本発明の変異株は、ＯＫ４３２株（例えば、「ピシバニール」として中外製薬株式会社から市販されているストレプトコックス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株ペニシリン処理凍結乾燥粉末）よりも優れたＩＬ－１２産生誘導活性、少なくとも１．２倍の、少なくとも１．３倍の、少なくとも１．４倍の、少なくとも１．５倍の、少なくとも１．６倍の、または、少なくとも１．７倍のＩＬ－１２産生誘導活性を有する。

【0020】

本発明の変異株は、好ましくは、「つる５」株と同様にＩｇＥ抑制活性を有する。本発明の変異株は、好ましくは、「つる５」株と同様に抗がん活性を有する。

【0021】

（３．葛由来デキストリンの調製方法）
葛由来デキストリンの製造には、植物からデキストリンを調製する任意の方法を使用することができる。代表的な好ましい葛由来デキストリンの製造工程は、以下のとおりである。
・葛根を粉砕→もみだし→さらし布で濾す→不純物除去→沈殿→乾燥→０．１％～０．３％酵素を添加し炊き上げと同時に液化（液化条件：ｐＨ５．０～７．０、５０～７５℃）→滅菌（９０～１１２℃、１０～６０分）→乾燥を行う。

【実施例】

【0022】

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。

【0023】

（実施例１：「つる５」株の単離）
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する「つる５」株を、以下の手順で単離した。
・クズの蔓を、抗生物質を添加した乳酸菌用の液体培地にて２５℃～３７℃で２４～４８時間集積培養
・得られた培養液をＢＣＰ加プレートカウントアガール培地に塗抹培養して、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する新規のつる５株を選択した。

【0024】

上記のようにして得られたＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する「つる５」株は、２０１８年７月１１日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）。

【0025】

（実施例２：「つる５」株の特徴付け（１） １６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子解析）
単離した「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を決定した。その結果を図１に示す（配列番号１）。図２は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子（上段のＳＩＩＤ２３１４９－０１、配列番号１）と比較対象であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するＲＩＢ．９１８６株（酒類総合研究所より入手、下段のＳＩＩＤ２３１４９－０２、配列番号２）とを比較したアラインメントである。

【0026】

図３は、「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の核酸配列に基づく簡易分子系統樹である。左上の線はスケールバーであり、系統枝の分岐に位置する数値はブーストラップ値であり、株名の末尾の「Ｔ」はその種の基準株（Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）を示す。

【0027】

（実施例３：「つる５」株の特徴付け（２） ＩＬ－１２産生誘導活性）
ＢＡＬＢ／ｃマウスより脾臓細胞を調製し、２．５×１０^６／ｍｌの濃度の細胞培養液に被験乳酸菌の重量濃度が１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌになるように乾燥した乳酸菌を加え、９６穴培養プレートに２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、５％ ＣＯ_２、３７℃下で２日間培養後、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により培養液中のＩＬ－１２濃度を測定した。なお、使用したＢＡＬＢ／ｃマウスの週齢は１１週齢であり、脾臓細胞培養液は１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）－ＲＰＭＩ１６４０＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン＋１００Ｕ／ｍｌペニシリン＋５０μＭ ２－メルカプトエタノールを用いた。１サンプルおよび１濃度について６ｗｅｌｌを使用した。統計学的解析は一元配置の分散分析を行い、陽性対照との比較はＤｕｎｎｅｔｔの検定を行い、各サンプル間の対比較はＴｕｋｅｙの検定を行い、有意差の有無を検定した。また、個々のサンプルの１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの比較はＷｅｌｃｈのｔ－ｔｅｓｔにより検定した。

【0028】

乳酸菌を中和培養し、集菌し、洗浄後加熱殺菌した後にサンプルとして用い、ＯＫ４３２の結果と比較した。

【0029】

ＩＬ－１２の測定は、特異抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行った。一次抗体および二次抗体ともに、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．のラット抗マウスモノクローナル抗体を用いた。

【0030】

結果を図４に示す。この結果は、本発明の「つる５」株のＩＬ－１２産生誘導活性が、ＯＫ４３２株と比較して著しく優れていることを示す。

【0031】

（実施例４：「つる５」株の特徴付け（３） 葛由来デキストリンを用いた培養）
本発明の「つる５」株の培養培地（ＭＲＳ培地）中のグルコースを葛由来デキストリンに代えて、「つる５」株を培養し、脾臓細胞におけるＩＬ－１２産生誘導活性を試験した。

【0032】

葛由来デキストリンは、以下の手順で作製した。
・葛根を粉砕→もみだし→さらし布で濾す→不純物除去→沈殿→乾燥→０．１％～０．３％酵素を添加し炊き上げと同時に液化（液化条件：ｐＨ５．０～７．０、５０～７５℃）→滅菌（９０～１１２℃、１０～６０分）→乾燥。

【0033】

この実施例４では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを起源とする液化酵素Ｔ（エイチビィアイ株式会社）を使用する酵素として選択した。使用する酵素としては、例えば、α－アミラーゼのようなアミラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。また、β－アミラーゼおよびグルコアミラーゼもまた使用可能である。代表的には、ノボザイムズジャパン株式会社の「ＢＡＮ」、天野エンザイム株式会社の「クライスターゼＥ５ＣＣ」、ナガセケムテックス株式会社の「スピターゼＣＰ４０－ＦＧ」、および、ヤクルト薬品工業株式会社の「ユニアーゼＢＭ８」が挙げられるがこれらに限定されない。酵素の添加量は、当業者が適宜選択することができ、例えば、０．００３～１％の酵素濃度で使用することができる。酵素反応条件は、限定されることはないが、代表的には、ｐＨ５．０～７．０であり、５０～７５℃である。

【0034】

実施例３と同様の条件でグルコース（５％）を用い「つる５」株を培養し、実施例３と同様に細胞培養培地１ｍｌあたり１μｇの乳酸菌を添加した細胞培養培地を用いてＩＬ－１２産生誘導活性を試験した。さらに、この試験で使用した乳酸菌の培養において使用した培養培地（ＭＲＳ培地）中のグルコース（５％）を上記方法で調製した葛由来デキストリン（５％）に代えた培養培地を用いて乳酸菌を増殖させ、その菌体懸濁液を用いて、実施例３と同様の実験を行った。葛由来デキストリンを乳酸菌の培養に用いると不溶性残渣が多くなる。そのため、脾臓細胞培養液に添加する乳酸菌としては、乳酸菌培養培地全体を加熱後に撹拌した直後の懸濁液を用いた場合（図５に「葛由来デキストリン（全体）」として示した）、あるいは、乳酸菌培養培地での培養が完了し加熱した後にしばらく静置して上清にある菌体層のみを用いた場合（図５に「葛由来デキストリン（菌体）」として示した）を比較した。また、比較対象として、グルコースを含む培養培地で培養したＯＫ４３２株を用いた結果も図５に示した。

【0035】

図５の結果から明らかなように、グルコースの代わりに葛由来のデキストリンを用いた場合には、さらに、ＩＬ－１２産生誘導活性が上昇した。この上昇は、菌体以外の培養培地中の成分に起因するというよりもむしろ乳酸菌の加熱菌体に起因することも明らかとなった。

【0036】

上記の実験を、使用する乳酸菌の重量濃度を変えて行った結果を図６に示す。脾臓細胞培養培地１ｍｌあたりの菌体懸濁液量を１０μｇ／ｍｌとした場合に、ＯＫ４３２株と比較した「つる５」株のＩＬ－１２産生誘導活性の増強効果が一層顕著になり、グルコースに代えて葛由来デキストリンを使用した場合には、「つる５」株のＩＬ－１２産生誘導活性の増強効果がさらに一層優れたものとなった。

【0037】

（実施例５：「つる５」株の特徴付け（４） ＩｇＥ抑制活性）
『レビス（登録商標）ＩｇＥ－ＥＬＩＳＡキット（マウス）』（(株)シバヤギ）を用い測定検体中のＩｇＥを測定した。マイクロプレート分光光度計はＢｉｏ－ｒａｄ社製品を用い、標準曲線は３次多項式を用い測定値を算出した。なお、測定は１検体あたり２点測定し平均値を採用した。統計処理は、Ｆ検定により分散の検定を行ない、等分散の場合はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ、不等分散の場合はＷｅｌｃｈ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔにより比較を行なった。

【0038】

マウスの各々の種における「つる５」株の非投与と投与における血漿中のＩｇＥを表１す。

【0039】

【表1】

【0040】

いずれのマウス種においても「つる５」株投与でやや低下傾向を示した。また、マウス種に注目すると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスが他のマウス種に対し有意に低値であった。

【0041】

（実施例６：「つる５」株の特徴付け（５） 抗がん活性）
マウス乳がん４Ｔ１細胞株を皮下に移植した担癌マウスモデルに、被験物質を移植の７日前から２８日間経口投与した場合の抗腫瘍効果を、腫瘍体積及び腫瘍重量を指標にして検討した。本試験は、株式会社ケー・エー・シーの動物実験規程、動物実験委員会規定及び動物実験承認規定を遵守して適正に実施した（承認番号：１７－１１０７）。

【0042】

腫瘍表面の状態について、無処置群及び被験物質投与群において、Ｄａｙ１８に痂皮形成が各群１例で認められた。Ｄａｙ２０以降、全ての動物で痂皮形成が認められた。体重について、群分け日からサンプリング日まで各群ともに増加した。腫瘍体積について、Ｄａｙ１７及びＤａｙ２４において、無処置群に対して被験物質投与群は有意な低値を示した。腫瘍重量について、無処置群における平均腫瘍重量は１．３４１ｇであるのに対して、被験物質投与群における平均腫瘍重量は１．０１４ｇと有意な低値を示した。肺重量について、無処置群は０．２０２ｇであるのに対して、被験物質投与群は０．１８６ｇであり、有意な差は認められなかった。結果を以下の表２に示す。

【0043】

【表2】

【0044】

図７は腫瘍重量を示すグラフである。

【0045】

以上の結果より、平均腫瘍体積及び平均腫瘍重量において、被験物質投与群が無処置群よりも低値を示す傾向が認められたことから、被験物質を移植７日前から２８日間経口投与することで抗腫瘍効果を有することが示された。

【0046】

（実施例７：加熱菌体の作製）
加熱菌体の作製は、代表的には、図８のスキームに従う。具体的には、２０～４０℃で１０～４０時間培養した後に、７０～１２１℃で１０～６０分間加熱殺菌した。本発明の加熱菌体は、免疫賦活能を有する組成物、癌を処置および／または予防するための組成物の有効成分として利用可能である。

【産業上の利用可能性】

【0047】

従来の乳酸菌と比較して、免疫学的特性が優れた（例えば、より高いＩＬ－１２産生誘導活性、ＩｇＥ産生抑制活性、および／または、抗がん活性を有する）新規の乳酸菌を提供する。

【受託番号】

【0048】

Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属する「つる５」株は、２０１８年７月１１日に独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）に寄託された（受託番号 ＮＩＴＥ Ｐ－０２７５１）。

【配列表フリーテキスト】

【0049】

配列番号１：「つる５」株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の核酸配列
配列番号２：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属するＲＩＢ．９１８６株の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の核酸配列

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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