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特許7111373両性解離型イオン交換媒体、並びに使用方法及び分離容量のキャリブレーション方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-25
(45)【発行日】2022-08-02
(54)【発明の名称】両性解離型イオン交換媒体、並びに使用方法及び分離容量のキャリブレーション方法
(51)【国際特許分類】
B01J 43/00 20060101AFI20220726BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20220726BHJP
B01J 47/014 20170101ALI20220726BHJP
B01J 49/50 20170101ALI20220726BHJP
G01N 21/27 20060101ALI20220726BHJP
G01N 30/02 20060101ALI20220726BHJP
B01J 20/285 20060101ALN20220726BHJP
【ＦＩ】
B01J43/00
B01J20/281 X
B01J47/014
B01J49/50
G01N21/27 Z
G01N30/02 B
B01J20/285 T
B01J20/285 Z
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2019530832
(86)(22)【出願日】2018-10-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-23
(86)【国際出願番号】 CN2018111536
(87)【国際公開番号】W WO2019080851
(87)【国際公開日】2019-05-02
【審査請求日】2019-06-06
【審判番号】
【審判請求日】2020-07-31
(31)【優先権主張番号】201711010305.0
(32)【優先日】2017-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】518396769
【氏名又は名称】重慶博藍鷹生物技術有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＱＩＮＧ ＢＯＬＡＮＹＩＮＧ （ＢＬＹ） ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110002468
【氏名又は名称】特許業務法人後藤特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】廖飛
(72)【発明者】
【氏名】竜高波
(72)【発明者】
【氏名】謝燕玲
(72)【発明者】
【氏名】黄銘通
(72)【発明者】
【氏名】謝万軍
【合議体】
【審判長】原 賢一
【審判官】三崎 仁
【審判官】金 公彦
(56)【参考文献】
【文献】特開２００６－７７０３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０００５２６５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開昭５０－６８９８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２９９３２２９（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開昭５８－７６１４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平３－５０１４４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第６４２０４３９（ＵＳ，Ｂ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
B01J43/00, B01J47/00-47/15, B01J20/00-20/34, B01D15/00-15/42
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
両性解離型イオン交換分離媒体であって、前記両性解離型イオン交換分離媒体の表面が両性解離共有結合修飾層であり、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼロであるときの環境ｐＨであってｐＩｍで示される等電点を有し、環境ｐＨが前記等電点ｐＩｍより低い場合、両性解離共有結合修飾層の表面の正味荷電が正であり、アニオン交換剤の性質を有し、環境ｐＨが前記等電点ｐＩｍより高い場合、両性解離共有結合修飾層の表面の正味荷電が負であり、カチオン交換剤の性質を有し、
前記両性解離型イオン交換分離媒体の表面の両性解離共有結合修飾層に、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより低いときに解離して正電荷を発生させる基とｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより高いときに解離して負電荷を発生させる基とを同時に含み、前記解離して負電荷を発生させる基は脂肪族カルボキシ基であり、前記解離して正電荷を発生させる基は脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせであり、
前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離基前駆体による分離媒体マトリックスの表面に対する共有結合修飾に由来し、
前記分離媒体マトリックスは、表面に長さが９個の原子を超える線状長直鎖を含まず、両性解離基前駆体と共有結合反応を行って前記両性解離共有結合修飾層を生成するための反応基を含み、前記反応基が脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基、脂肪族カルボキシ基、及びメルカプト基で置換されて分離媒体マトリックスの表面から離脱する小体積脱離基を含有するメルカプト反応性基のうちのいずれか１種であり、
前記両性解離基前駆体は、親水性で、分子量が５００ダルトン未満で、連続した５個超の炭素原子を持つ炭化水素鎖又は炭化水素環を含まない物質であり、且つすべてアルキルチオール基又は脂肪族一級アミン基を共有結合連結基として含むとともに、脂肪族カルボキシ基を解離して負電荷を発生させる基として含み及び脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせを解離して正電荷を発生させる基として含み、前記両性解離基前駆体は、前駆体Ａと前駆体Ｂの組み合わせ、前駆体Ａと前駆体Ｃの組み合わせ、前駆体Ｂと前駆体Ｃの組み合わせ、又は前駆体Ｃであり、
前駆体Ａが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基を含み、前記解離して正電荷を発生させる基を含まない両性解離基前駆体であり、前駆体Ｂが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して正電荷を発生させる基を含み、前記解離して負電荷を発生させる基を含まない両性解離基前駆体であり、前駆体Ｃが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基及び解離して正電荷を発生させる基を同時に含有する両性解離基前駆体であり、
前駆体Ｃは、リジン、ヒスチジン、システインから選ばれ、前駆体Ａは、メルカプト酢酸であり、前駆体Ｂは、メルカプトエチルアミン、２－メルカプトイミダゾールから選ばれ、
前記両性解離基前駆体は、前駆体Ｃを単独として用いる場合、リジン、ヒスチジン、又はシステインを用いるものであり、前駆体Ａと前駆体Ｂを用いる場合、メルカプト酢酸と２－メルカプトイミダゾールを用いるものであり、前駆体Ａと前駆体Ｃを用いる場合、メルカプト酢酸とシステインを用いるものであり、前駆体Ｂと前駆体Ｃを用いる場合、メルカプトエチルアミンとシステインを用いるものあり、
前記両性解離型イオン交換分離媒体は、カルボキシ磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨのカルボキシ基を活性化させてＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳとした後、
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳに（１）リジン溶液を修飾してＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢを得ること、
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳに（２）ヒスチジン溶液を修飾してＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＤを得ること、
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌに（５）システイン溶液、（７）メルカプト酢酸溶液を修飾してＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ１を得ること、
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌに（５）システイン溶液を修飾してＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ２を得ること、
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌに（５）システイン溶液、（６）メルカプトエチルアミン溶液を修飾してＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ３を得ること、
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌに（７）メルカプト酢酸溶液、（８）２－メルカプトイミダゾール溶液を修飾してＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ４を得ること、
を特徴とする両性解離型イオン交換分離媒体。
【請求項2】
請求項１に記載の両性解離型イオン交換分離媒体の使用方法であって、前記両性解離型イオン交換分離媒体は、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢであり、
対象物質を吸着する場合、環境ｐＨはｐＨ３．６であり、
対象物質を溶出する場合、溶出液のｐＨはｐＨ８．９であることを特徴とする、使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的活性物質を分離するイオン交換分離媒体に関し、具体的には両性解離
型イオン交換媒体、並びにその使用方法及びその分離容量のキャリブレーション方法に関
する。
型イオン交換媒体、並びにその使用方法及びその分離容量のキャリブレーション方法に関
する。
【背景技術】
【0002】
イオン交換分離媒体は、タンパク質／核酸などの生物分子の高速分離と再分析、タンパク
質／核酸の精製調製、解離性荷電物質のクロマトグラフィー定量分析に適用でき、このよ
うな用途では、イオン交換分離媒体に対して、高吸着容量、温和な条件での被吸着物質へ
の高溶出能力、分離容量キャリブレーションの正確性、妨害物質への低非特異的吸着、温
和な条件での高再生能力などの特徴が同時に求められる。従来のイオン交換分離媒体は、
上記要求を同時に満たすことができず、これら要求をできるだけ同時に満たす新規イオン
交換分離媒体を設計することは本発明が解決しようとする課題となっている。
質／核酸の精製調製、解離性荷電物質のクロマトグラフィー定量分析に適用でき、このよ
うな用途では、イオン交換分離媒体に対して、高吸着容量、温和な条件での被吸着物質へ
の高溶出能力、分離容量キャリブレーションの正確性、妨害物質への低非特異的吸着、温
和な条件での高再生能力などの特徴が同時に求められる。従来のイオン交換分離媒体は、
上記要求を同時に満たすことができず、これら要求をできるだけ同時に満たす新規イオン
交換分離媒体を設計することは本発明が解決しようとする課題となっている。
【0003】
分離媒体表面の基が所定ｐＨで解離して小体積の対イオンとともに静電吸引するイオン対
を形成し、次に、静電吸引及び競合的結合によって反対電荷を有する対象物質を吸着して
、それにより対象物質のオンラインクロマトグラフィー分析を行い、又は、さらにＮａＣ
ｌ、ＫＣｌなどの高濃度一価中性無機塩にて競合イオンを提供して、静電吸引及び競合的
結合によって吸着された対象物質を溶出し、このことはイオン交換と呼ばれ、使用される
分離媒体はイオン交換剤と呼ばれる。
を形成し、次に、静電吸引及び競合的結合によって反対電荷を有する対象物質を吸着して
、それにより対象物質のオンラインクロマトグラフィー分析を行い、又は、さらにＮａＣ
ｌ、ＫＣｌなどの高濃度一価中性無機塩にて競合イオンを提供して、静電吸引及び競合的
結合によって吸着された対象物質を溶出し、このことはイオン交換と呼ばれ、使用される
分離媒体はイオン交換剤と呼ばれる。
【0004】
生物分子のイオン交換分離に使用されるｐＨは一般的に５．０－８．０であり、通常、３
．０－１１．０に制限される。古典的なイオン交換精製／対象物質の抽出及び再分析には
、吸着及び溶出の２つの工程ともに対象物質、分離媒体の表面の荷電基、溶液におけるイ
オン間の静電吸引及び競合的結合による。古典的なイオン交換分離媒体の表面に存在可能
なイオン化可能基が通常１種しかなく、ｐＨ３．０－１１．０ではその表面の正味荷電が
２種のタイプしかなく、すなわち、その表面の正味荷電が正又はゼロであるが、負帯電状
態にならない場合は、アニオン交換剤と呼ばれ、その表面の正味荷電が負又はゼロである
が、正帯電状態にならない場合は、カチオン交換剤と呼ばれる。古典的なイオン交換剤は
、生物分子の精製調製、抽出濃縮再分析及びクロマトグラフィー分析に用いる場合、性能
には一定の欠点がある。まず、親水性にするために、古典的なイオン交換剤の表面に大量
のヒドロキシ基、アミドのような水素結合形成基を有するが、対象物質と大量の水素結合
を形成して非特異的吸着を発生させるため、古典的なイオン交換剤の吸着させたタンパク
質／核酸に対する溶出能力、分離選択性、分離容量及び再生能力を低下させ、クロマトグ
ラフィー分析の場合は、解像度が低いとともに、クロマトグラフィーカラムの耐用年数が
短い。次に、高濃度一価中性無機塩を用いた競合的結合によって対象物質の放出を促進す
るときに、優れた溶出効果を果たすのに高濃度無機塩でなければならず、その結果、後続
の再分析／処理に脱塩を必要とし、効率を低下させるとともに、コストを増大する。した
がって、非特異的吸着を大幅に低下させるとともに、被吸着対象物質への溶出能力を高め
るイオン交換分離媒体の新しい設計原理を確立することが期待される。
．０－１１．０に制限される。古典的なイオン交換精製／対象物質の抽出及び再分析には
、吸着及び溶出の２つの工程ともに対象物質、分離媒体の表面の荷電基、溶液におけるイ
オン間の静電吸引及び競合的結合による。古典的なイオン交換分離媒体の表面に存在可能
なイオン化可能基が通常１種しかなく、ｐＨ３．０－１１．０ではその表面の正味荷電が
２種のタイプしかなく、すなわち、その表面の正味荷電が正又はゼロであるが、負帯電状
態にならない場合は、アニオン交換剤と呼ばれ、その表面の正味荷電が負又はゼロである
が、正帯電状態にならない場合は、カチオン交換剤と呼ばれる。古典的なイオン交換剤は
、生物分子の精製調製、抽出濃縮再分析及びクロマトグラフィー分析に用いる場合、性能
には一定の欠点がある。まず、親水性にするために、古典的なイオン交換剤の表面に大量
のヒドロキシ基、アミドのような水素結合形成基を有するが、対象物質と大量の水素結合
を形成して非特異的吸着を発生させるため、古典的なイオン交換剤の吸着させたタンパク
質／核酸に対する溶出能力、分離選択性、分離容量及び再生能力を低下させ、クロマトグ
ラフィー分析の場合は、解像度が低いとともに、クロマトグラフィーカラムの耐用年数が
短い。次に、高濃度一価中性無機塩を用いた競合的結合によって対象物質の放出を促進す
るときに、優れた溶出効果を果たすのに高濃度無機塩でなければならず、その結果、後続
の再分析／処理に脱塩を必要とし、効率を低下させるとともに、コストを増大する。した
がって、非特異的吸着を大幅に低下させるとともに、被吸着対象物質への溶出能力を高め
るイオン交換分離媒体の新しい設計原理を確立することが期待される。
【0005】
古典的なイオン交換は、低溶出能力のために、核酸の抽出濃縮再分析に向いていない。遺
伝物質としての核酸は、現在の臨床検査における感染症の感染の確診、法医学的証拠の検
査、遺伝子型判定、食品安全性試験、及び医薬原料の供給源の確認などの生物医学分析の
中心及び焦点である。生物サンプルにおける核酸含有量が低いので、通常、検出前にＰＣ
Ｒ増幅が必要とされる。しかしながら、サンプルには核酸のＰＣＲ増幅を妨害する非核酸
物質を大量含む場合が多い。サンプルにおける核酸を迅速に抽出すると同時に大部分の妨
害物質を除去した後にＰＣＲ増幅分析を行わなければならない。核酸は、リン酸ジエステ
ル結合を有し、ｐＨ２．０以上で解離して正味荷電が負のポリアニオンになり、理論的に
は、アニオン交換は核酸の抽出濃縮再分析に利用できる。一般的なアニオン交換剤は、核
酸への吸着容量が極めて高いものの、吸着された核酸をどのように溶出するかが技術的に
困難である。高濃度一価中性無機塩は吸着された核酸アニオンの溶出能力を高めることが
できるが、大量の無機塩を使用すると後続のＰＣＲ増幅の阻害となる。現在、サンプルに
おける核酸を迅速に抽出して再分析するときに、主にシラノールを基として水素結合によ
り結合されることによって、温和な条件での溶出能力を確保する。核酸抽出結果の再現性
を高めて核酸分析結果の再現性を確保するために、従来、ミクロン磁気ビーズを用いて高
速吸着分離を行った後に溶出するのが一般的である。しかしながら、シラノールは核酸結
合容量が低く且つ核酸に対する選択性が低いため、シラノール磁気ビーズの使用量を増大
して、さらにコストを高め、シラノール磁気ビーズの表面に高非特異的吸着を有するため
、それによって抽出された核酸に多くの不純物が含まれるため、ＰＣＲ反応が阻害されて
、核酸の高感度検出が妨害されてしまう。イオン交換は、タンパク質精製のために一般的
に使用される手段でもあり、しかし、使用時に易溶性の高濃度一価中性無機塩を用いても
、溶出される対象タンパク質の収率が低く、また、後続の操作又は分析に透析又は限外ろ
過により無機塩を除去しなければならず、それも操作効率を低下させて、コストを増大す
る。このため、核酸及びタンパク質の高速抽出／精製調製のいずれにおいても、低イオン
強度のバッファによる被吸着物質への溶出能力を向上させるために、新規イオン交換剤が
求められる。
伝物質としての核酸は、現在の臨床検査における感染症の感染の確診、法医学的証拠の検
査、遺伝子型判定、食品安全性試験、及び医薬原料の供給源の確認などの生物医学分析の
中心及び焦点である。生物サンプルにおける核酸含有量が低いので、通常、検出前にＰＣ
Ｒ増幅が必要とされる。しかしながら、サンプルには核酸のＰＣＲ増幅を妨害する非核酸
物質を大量含む場合が多い。サンプルにおける核酸を迅速に抽出すると同時に大部分の妨
害物質を除去した後にＰＣＲ増幅分析を行わなければならない。核酸は、リン酸ジエステ
ル結合を有し、ｐＨ２．０以上で解離して正味荷電が負のポリアニオンになり、理論的に
は、アニオン交換は核酸の抽出濃縮再分析に利用できる。一般的なアニオン交換剤は、核
酸への吸着容量が極めて高いものの、吸着された核酸をどのように溶出するかが技術的に
困難である。高濃度一価中性無機塩は吸着された核酸アニオンの溶出能力を高めることが
できるが、大量の無機塩を使用すると後続のＰＣＲ増幅の阻害となる。現在、サンプルに
おける核酸を迅速に抽出して再分析するときに、主にシラノールを基として水素結合によ
り結合されることによって、温和な条件での溶出能力を確保する。核酸抽出結果の再現性
を高めて核酸分析結果の再現性を確保するために、従来、ミクロン磁気ビーズを用いて高
速吸着分離を行った後に溶出するのが一般的である。しかしながら、シラノールは核酸結
合容量が低く且つ核酸に対する選択性が低いため、シラノール磁気ビーズの使用量を増大
して、さらにコストを高め、シラノール磁気ビーズの表面に高非特異的吸着を有するため
、それによって抽出された核酸に多くの不純物が含まれるため、ＰＣＲ反応が阻害されて
、核酸の高感度検出が妨害されてしまう。イオン交換は、タンパク質精製のために一般的
に使用される手段でもあり、しかし、使用時に易溶性の高濃度一価中性無機塩を用いても
、溶出される対象タンパク質の収率が低く、また、後続の操作又は分析に透析又は限外ろ
過により無機塩を除去しなければならず、それも操作効率を低下させて、コストを増大す
る。このため、核酸及びタンパク質の高速抽出／精製調製のいずれにおいても、低イオン
強度のバッファによる被吸着物質への溶出能力を向上させるために、新規イオン交換剤が
求められる。
【0006】
対象物質が静電吸引によってイオン交換媒体の表面に吸着された後、ｐＨが明らかに異な
る溶出液を用いて、イオン交換媒体の表面の正味荷電をゼロにすることによって、対象物
質の溶出能力を強くすることができるが、対象物質とイオン交換媒体の間の大量の水素結
合が溶出を妨害し、それに加えて、通常のイオン交換媒体による妨害小分子への非特異的
吸着が後続の分析を妨害する。被吸着対象物質とイオン交換媒体の間で静電反発作用を発
生させると、被吸着対象物質の溶出及び分離媒体の再生が確実に促進できる。吸着バッフ
ァのｐＨと明らかに異なる溶出液は、対象物質と分離媒体の表面の間で静電反発を発生さ
せる可能性がある。しかし、古典的なイオン交換剤の表面に１種の解離基しかないため、
ｐＨを変えることで、分離媒体の表面の正味荷電と対象物質の正味荷電を反対するものか
ら同じものに変更して静電反発作用を発生させることができない。
る溶出液を用いて、イオン交換媒体の表面の正味荷電をゼロにすることによって、対象物
質の溶出能力を強くすることができるが、対象物質とイオン交換媒体の間の大量の水素結
合が溶出を妨害し、それに加えて、通常のイオン交換媒体による妨害小分子への非特異的
吸着が後続の分析を妨害する。被吸着対象物質とイオン交換媒体の間で静電反発作用を発
生させると、被吸着対象物質の溶出及び分離媒体の再生が確実に促進できる。吸着バッフ
ァのｐＨと明らかに異なる溶出液は、対象物質と分離媒体の表面の間で静電反発を発生さ
せる可能性がある。しかし、古典的なイオン交換剤の表面に１種の解離基しかないため、
ｐＨを変えることで、分離媒体の表面の正味荷電と対象物質の正味荷電を反対するものか
ら同じものに変更して静電反発作用を発生させることができない。
【0007】
したがって、古典的なイオン交換分離媒体を生物分子分離に使用する場合の欠陥を解決す
るために、高吸着容量、温和な条件での被吸着イオンへの高溶出能力、分離容量キャリブ
レーションの正確性、非対象物質への低非特異的吸着、温和な条件での高再生能力などの
利点を同時に備える新規イオン交換媒体の開発が求められる。
るために、高吸着容量、温和な条件での被吸着イオンへの高溶出能力、分離容量キャリブ
レーションの正確性、非対象物質への低非特異的吸着、温和な条件での高再生能力などの
利点を同時に備える新規イオン交換媒体の開発が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
以上に鑑み、本発明は、高い吸着能力と溶出能力を兼ね備えるとともに、高吸着容量、温
和な条件での被吸着イオンへの効果的な溶出、分離容量キャリブレーションの正確性、非
対象物質への低非特異的吸着、温和な条件での高再生能力などの利点を有する新規イオン
交換媒体を提供する。
和な条件での被吸着イオンへの効果的な溶出、分離容量キャリブレーションの正確性、非
対象物質への低非特異的吸着、温和な条件での高再生能力などの利点を有する新規イオン
交換媒体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、両性解離型イオン交換分離媒体を提供し、前記両性解離型イオン交換分離媒体
の表面が両性解離共有結合修飾層であり、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離型イ
オン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼロであるときの環境ｐＨであってｐＩｍで示され
る等電点を有し、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより低い場合、両性解離共有結合修飾層の表
面の正味荷電が正であり、アニオン交換剤の性質を有し、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより
高い場合、両性解離共有結合修飾層の表面の正味荷電が負であり、カチオン交換剤の性質
を有する。
の表面が両性解離共有結合修飾層であり、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離型イ
オン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼロであるときの環境ｐＨであってｐＩｍで示され
る等電点を有し、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより低い場合、両性解離共有結合修飾層の表
面の正味荷電が正であり、アニオン交換剤の性質を有し、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより
高い場合、両性解離共有結合修飾層の表面の正味荷電が負であり、カチオン交換剤の性質
を有する。
【0010】
さらに、環境ｐＨが前記等電点ｐＩｍより低い場合、差値が増大するに伴い、両性解離共
有結合修飾層の表面の正電荷の数が徐々に増加し、環境ｐＨが前記等電点ｐＩｍより高い
場合、差値が増大するに伴い、両性解離共有結合修飾層の表面の負電荷の数が徐々に増加
し、前記環境ｐＨはいずれも分離対象物質と前記両性解離型イオン交換分離媒体の両方が
耐えられる範囲にある。
有結合修飾層の表面の正電荷の数が徐々に増加し、環境ｐＨが前記等電点ｐＩｍより高い
場合、差値が増大するに伴い、両性解離共有結合修飾層の表面の負電荷の数が徐々に増加
し、前記環境ｐＨはいずれも分離対象物質と前記両性解離型イオン交換分離媒体の両方が
耐えられる範囲にある。
【0011】
さらに、前記両性解離型イオン交換分離媒体の表面の両性解離共有結合修飾層に、ｐＨ値
が前記等電点ｐＩｍより低いときに解離して正電荷を発生させる基とｐＨ値が前記等電点
ｐＩｍより高いときに解離して負電荷を発生させる基とを同時に含み、前記解離して負電
荷を発生させる基は脂肪族カルボキシ基であり、解離して正電荷を発生させる基は脂肪族
一級、二級、三級アミン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせであ
る。
が前記等電点ｐＩｍより低いときに解離して正電荷を発生させる基とｐＨ値が前記等電点
ｐＩｍより高いときに解離して負電荷を発生させる基とを同時に含み、前記解離して負電
荷を発生させる基は脂肪族カルボキシ基であり、解離して正電荷を発生させる基は脂肪族
一級、二級、三級アミン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせであ
る。
【0012】
さらに、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離基前駆体による分離媒体マトリックス
の表面に対する共有結合修飾に由来し、
前記分離媒体マトリックスは、表面に長さが９個の原子を超える線状長直鎖を含まず、両
性解離基前駆体と共有結合反応を行って前記両性解離共有結合修飾層を生成するための反
応基を含み、前記反応基が脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基、脂肪族カ
ルボキシ基、及びメルカプト基で置換されて分離媒体マトリックスの表面から離脱する小
体積基を含有するメルカプト反応性基のうちのいずれか１種であり、
前記両性解離基前駆体は、親水性で、分子量が５００ダルトン未満で、連続した５個超の
炭素原子を持つ炭化水素鎖又は炭化水素環を含まない物質であり、且つすべてアルキルチ
オール基又は脂肪族一級アミン基を共有結合連結基として含むとともに、脂肪族カルボキ
シ基を解離して負電荷を発生させる基として含み及び／又は脂肪族一級、二級、三級アミ
ン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせを解離して正電荷を発生さ
せる基として含み、前記両性解離基前駆体は、前駆体Ａ、前駆体Ｂ及び前駆体Ｃを含み、
前駆体Ａが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基だけを含
む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｂが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して正
電荷を発生させる基だけを含む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｃが前記共有結合連結基
を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基及び解離して正電荷を発生させる基を同
時に含有する両性解離基前駆体であり、
前記両性解離基前駆体を分離媒体マトリックスの共有結合修飾に用いるとき、
ａ．前駆体Ｃを単独で使用し又は混合して使用し、混合して使用する場合、複数種の前駆
体Ｃを所定比率で混合して使用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結
合連結基を含有する方式と、
ｂ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｂとを所定比率で混合して使用
し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｃ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｄ．１種又は複数種の前駆体Ｂと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式との
うちの１種によって修飾する。
の表面に対する共有結合修飾に由来し、
前記分離媒体マトリックスは、表面に長さが９個の原子を超える線状長直鎖を含まず、両
性解離基前駆体と共有結合反応を行って前記両性解離共有結合修飾層を生成するための反
応基を含み、前記反応基が脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基、脂肪族カ
ルボキシ基、及びメルカプト基で置換されて分離媒体マトリックスの表面から離脱する小
体積基を含有するメルカプト反応性基のうちのいずれか１種であり、
前記両性解離基前駆体は、親水性で、分子量が５００ダルトン未満で、連続した５個超の
炭素原子を持つ炭化水素鎖又は炭化水素環を含まない物質であり、且つすべてアルキルチ
オール基又は脂肪族一級アミン基を共有結合連結基として含むとともに、脂肪族カルボキ
シ基を解離して負電荷を発生させる基として含み及び／又は脂肪族一級、二級、三級アミ
ン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせを解離して正電荷を発生さ
せる基として含み、前記両性解離基前駆体は、前駆体Ａ、前駆体Ｂ及び前駆体Ｃを含み、
前駆体Ａが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基だけを含
む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｂが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して正
電荷を発生させる基だけを含む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｃが前記共有結合連結基
を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基及び解離して正電荷を発生させる基を同
時に含有する両性解離基前駆体であり、
前記両性解離基前駆体を分離媒体マトリックスの共有結合修飾に用いるとき、
ａ．前駆体Ｃを単独で使用し又は混合して使用し、混合して使用する場合、複数種の前駆
体Ｃを所定比率で混合して使用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結
合連結基を含有する方式と、
ｂ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｂとを所定比率で混合して使用
し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｃ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｄ．１種又は複数種の前駆体Ｂと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式との
うちの１種によって修飾する。
【0013】
さらに、分離媒体マトリックスに対して共有結合修飾を行うとき、使用される両性解離基
前駆体において、脂肪族カルボキシ基の総モル量に対する脂肪族一級、二級、三級アミン
基及びイミダゾリル基の総モル量の比率が１：６－６：１の間に制限される。
前駆体において、脂肪族カルボキシ基の総モル量に対する脂肪族一級、二級、三級アミン
基及びイミダゾリル基の総モル量の比率が１：６－６：１の間に制限される。
【0014】
さらに、使用される両性解離基前駆体に脂肪族二級アミン及び／又は三級アミンを解離し
て正電荷を発生させる基として含む場合、前記脂肪族二級アミンと三級アミンの総モル量
の合計が脂肪族一級アミン及びイミダゾリル基の総モル量の合計の３０％以下である。
て正電荷を発生させる基として含む場合、前記脂肪族二級アミンと三級アミンの総モル量
の合計が脂肪族一級アミン及びイミダゾリル基の総モル量の合計の３０％以下である。
【0015】
さらに、前記両性解離型イオン交換分離媒体は、ｐＨが３である場合、その表面の正電荷
の数が最大値の９０％以上であり、ｐＨが１１である場合、その表面の負電荷の数が最大
値の９０％以上である。
の数が最大値の９０％以上であり、ｐＨが１１である場合、その表面の負電荷の数が最大
値の９０％以上である。
【0016】
本発明はさらに、前記両性解離型イオン交換分離媒体の使用方法を開示し、前記両性解離
型イオン交換分離媒体を使用して対象物質を吸着して分離するとき、対象物質が水素イオ
ンを放出する解離定数の常用対数をｐＩｓ又は対象物質の等電点をｐＩｓとし、使用過程
において、
ａ．そのｐＩｍと対象物質のｐＩｓの差が１．０以上である両性解離型イオン交換分離媒
体を選択する特徴と、
ｂ．対象物質を吸着する場合、対象物質のｐＩｓと両性解離型イオン交換分離媒体の等電
点ｐＩｍの間にあり且つ対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体のｐＩｍの
いずれとの差も０．３より大きい環境ｐＨを選択して、イオン交換分離媒体の表面の正味
荷電と対象物質の正味荷電を逆にして、静電吸引によって対象物質を吸着する特徴と、
ｃ．対象物質を溶出する場合、溶出液のｐＨが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐ
Ｉｍより低いとき、溶出液のｐＨが対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体
の等電点ｐＩｍのうち低い方よりも少なくとも０．３０低く、溶出液のｐＨが両性解離型
イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍより高いとき、溶出液のｐＨが対象物質のｐＩｓ及び
両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち高い方よりも少なくとも０．３０高
く、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味荷電と対象物質の正味荷電を同じにして
、静電反発によって対象物質を溶出し、水溶性一価中性無機塩を加えて、対象物質の溶出
を促進する特徴とを有する。
型イオン交換分離媒体を使用して対象物質を吸着して分離するとき、対象物質が水素イオ
ンを放出する解離定数の常用対数をｐＩｓ又は対象物質の等電点をｐＩｓとし、使用過程
において、
ａ．そのｐＩｍと対象物質のｐＩｓの差が１．０以上である両性解離型イオン交換分離媒
体を選択する特徴と、
ｂ．対象物質を吸着する場合、対象物質のｐＩｓと両性解離型イオン交換分離媒体の等電
点ｐＩｍの間にあり且つ対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体のｐＩｍの
いずれとの差も０．３より大きい環境ｐＨを選択して、イオン交換分離媒体の表面の正味
荷電と対象物質の正味荷電を逆にして、静電吸引によって対象物質を吸着する特徴と、
ｃ．対象物質を溶出する場合、溶出液のｐＨが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐ
Ｉｍより低いとき、溶出液のｐＨが対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体
の等電点ｐＩｍのうち低い方よりも少なくとも０．３０低く、溶出液のｐＨが両性解離型
イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍより高いとき、溶出液のｐＨが対象物質のｐＩｓ及び
両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち高い方よりも少なくとも０．３０高
く、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味荷電と対象物質の正味荷電を同じにして
、静電反発によって対象物質を溶出し、水溶性一価中性無機塩を加えて、対象物質の溶出
を促進する特徴とを有する。
【0017】
本発明は、前記両性解離型イオン交換分離媒体のキャリブレーション方法を開示し、
ａ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、解離
定数又は等電点がｐＫａであり、分子量が６００Ｄａｌｔｏｎ未満で、可視光吸収係数が
１４ｍＭ－１．ｃｍ－１より大きく、ｐＨ３．０－１１．０での溶解度が５．０μｍｏｌ
／Ｌ以上で且つｐＨ３．０－１１．０で解離した後の正味荷電が正又は負である有色有機
物を発色プローブとし、
ｂ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするときに、
ｂ１．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが４．０－６．０である場合、解離
定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも
２．０大きいカチオンプローブ、又は解離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換
分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも２．０小さいアニオンプローブを用いる形態と
、
ｂ２．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが６．０－１０．０である場合、解
離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくと
も２．０小さいアニオンプローブを用いる形態とを有し、
ｃ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、吸着
する場合、解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの
間にあり且つ両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍとの差が１．３以上であると
ともに発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａとの差が０．５以上である環境ｐＨに対
応したバッファを用いて、両性解離型イオン交換分離媒体に静電吸引によって発色プロー
ブを吸着させ、溶出する場合、発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イ
オン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち高い方よりも少なくとも１．３高く又は低い方よ
りも少なくとも１．３低い環境ｐＨに対応したバッファを用いて、両性解離型イオン交換
分離媒体の表面の正味荷電と発色プローブの正味荷電を同じにして静電反発によって発色
プローブを溶出し、溶出液での発色プローブの吸収を測定して、発色プローブに対する分
離容量を換算し、
ｐＨによる両性解離型イオン交換分離媒体の発色プローブに対する分離容量への影響を測
定した結果、解離後の正味荷電が負である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最
小ｐＨ、解離後の正味荷電が正である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最大ｐ
Ｈが、両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの近似値である。
ａ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、解離
定数又は等電点がｐＫａであり、分子量が６００Ｄａｌｔｏｎ未満で、可視光吸収係数が
１４ｍＭ－１．ｃｍ－１より大きく、ｐＨ３．０－１１．０での溶解度が５．０μｍｏｌ
／Ｌ以上で且つｐＨ３．０－１１．０で解離した後の正味荷電が正又は負である有色有機
物を発色プローブとし、
ｂ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするときに、
ｂ１．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが４．０－６．０である場合、解離
定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも
２．０大きいカチオンプローブ、又は解離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換
分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも２．０小さいアニオンプローブを用いる形態と
、
ｂ２．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが６．０－１０．０である場合、解
離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくと
も２．０小さいアニオンプローブを用いる形態とを有し、
ｃ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、吸着
する場合、解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの
間にあり且つ両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍとの差が１．３以上であると
ともに発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａとの差が０．５以上である環境ｐＨに対
応したバッファを用いて、両性解離型イオン交換分離媒体に静電吸引によって発色プロー
ブを吸着させ、溶出する場合、発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イ
オン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち高い方よりも少なくとも１．３高く又は低い方よ
りも少なくとも１．３低い環境ｐＨに対応したバッファを用いて、両性解離型イオン交換
分離媒体の表面の正味荷電と発色プローブの正味荷電を同じにして静電反発によって発色
プローブを溶出し、溶出液での発色プローブの吸収を測定して、発色プローブに対する分
離容量を換算し、
ｐＨによる両性解離型イオン交換分離媒体の発色プローブに対する分離容量への影響を測
定した結果、解離後の正味荷電が負である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最
小ｐＨ、解離後の正味荷電が正である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最大ｐ
Ｈが、両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの近似値である。
【発明の効果】
【0018】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。本発明による両性解離型イオン交換分離媒体
は、共有結合修飾により媒体の表面に両性解離共有結合修飾層の構造を形成し、且つ修飾
される構造又は使用される両性解離基前駆体の比率の相違によって、特定の等電点ｐＩｍ
を形成し、等電点ｐＩｍを限界にして、所定の各種環境ｐＨでアニオン交換剤の性質又は
カチオン交換剤の性質となるような特殊な分離機能を有し、等電点ｐＩｍの両側でのｐＨ
変更によって、両性解離型イオン交換分離媒体のイオン交換性質を逆転させることができ
、荷電物質に対する吸着分離機能が、ｐＨが等電点ｐＩｍの両側のいずれにあるかによっ
て明らかなに異なる。本発明で製造される両性解離型イオン交換分離媒体は、バッファｐ
Ｈを調整することで分離媒体の表面の正味荷電と対象物質の正味荷電を同じにして静電反
発を発生させて対象物質を放出し、このように、溶出能力を高めるとともに、高濃度無機
イオンの使用による後続の問題を防止し、特に溶出速度がより高くなり、分離媒体の再生
が容易になり、溶出工程において、イオン間の競合的結合に依らなくなるが、イオン間の
競合的結合で溶出を促進できる。以上のように、本発明による両性解離型イオン交換分離
媒体は、静電作用による吸着及び静電作用による溶出機能を兼ね備えるとともに、高分離
容量、温和な条件での吸着イオンへの高溶出能力、分離容量キャリブレーションの正確性
、非対象物質への低非特異的吸着、温和な条件での高再生能力などの利点を有する。また
、本発明では、両性解離基前駆体で分離媒体マトリックスについて共有結合修飾を行う方
式により、所望の両性解離共有結合修飾層を生成することで、得られた分離媒体の表面に
両性解離性質を付与し、このような方式の有益な効果は以下の複数の点にある。まず、こ
のような技術案によれば、各種生物分子に適している様々なｐＩｍを取得するように、解
離によりカチオンを発生させる基に対する解離によりアニオンを発生させる基のモル比率
を容易に調整でき、勿論、重合反応の条件を調整することにより表面に両性解離基を有す
る分離媒体を直接調製する場合よりも、シンプルで実用的であり、且つ効率が高い。次に
、このような方式で両性解離型イオン交換分離媒体を調製するときに、セルロース類天然
重合体の分離媒体をマトリックスとするのが適しているが、現在のところ、表面に両性解
離基を有するセルロースを重合反応により直接調製するどころか、重合によりセルロース
を調製するための工業的技術もない。さらに、このような方式は、特定の要求を満たす分
離媒体をマトリックスとして共有結合修飾を行って両性解離表面とするのが容易であり、
重合時の荷電基間のサイズ排除による表面両性解離基の被覆度の減少を避けるのに寄与す
るので、表面の親水性基の高被覆率を確実に確保して、疎水性小分子の非特異的吸着を低
下させる。つまり、このような方式は、二重作用を同時に果たし、すなわち、表面に所望
の両性解離基を生成するとともに、表面による疎水性物質への非特異的吸着を低下させ、
したがって、本発明の前記両性解離型イオン交換分離媒体はより好適な使用効果を有する
ようになる。
は、共有結合修飾により媒体の表面に両性解離共有結合修飾層の構造を形成し、且つ修飾
される構造又は使用される両性解離基前駆体の比率の相違によって、特定の等電点ｐＩｍ
を形成し、等電点ｐＩｍを限界にして、所定の各種環境ｐＨでアニオン交換剤の性質又は
カチオン交換剤の性質となるような特殊な分離機能を有し、等電点ｐＩｍの両側でのｐＨ
変更によって、両性解離型イオン交換分離媒体のイオン交換性質を逆転させることができ
、荷電物質に対する吸着分離機能が、ｐＨが等電点ｐＩｍの両側のいずれにあるかによっ
て明らかなに異なる。本発明で製造される両性解離型イオン交換分離媒体は、バッファｐ
Ｈを調整することで分離媒体の表面の正味荷電と対象物質の正味荷電を同じにして静電反
発を発生させて対象物質を放出し、このように、溶出能力を高めるとともに、高濃度無機
イオンの使用による後続の問題を防止し、特に溶出速度がより高くなり、分離媒体の再生
が容易になり、溶出工程において、イオン間の競合的結合に依らなくなるが、イオン間の
競合的結合で溶出を促進できる。以上のように、本発明による両性解離型イオン交換分離
媒体は、静電作用による吸着及び静電作用による溶出機能を兼ね備えるとともに、高分離
容量、温和な条件での吸着イオンへの高溶出能力、分離容量キャリブレーションの正確性
、非対象物質への低非特異的吸着、温和な条件での高再生能力などの利点を有する。また
、本発明では、両性解離基前駆体で分離媒体マトリックスについて共有結合修飾を行う方
式により、所望の両性解離共有結合修飾層を生成することで、得られた分離媒体の表面に
両性解離性質を付与し、このような方式の有益な効果は以下の複数の点にある。まず、こ
のような技術案によれば、各種生物分子に適している様々なｐＩｍを取得するように、解
離によりカチオンを発生させる基に対する解離によりアニオンを発生させる基のモル比率
を容易に調整でき、勿論、重合反応の条件を調整することにより表面に両性解離基を有す
る分離媒体を直接調製する場合よりも、シンプルで実用的であり、且つ効率が高い。次に
、このような方式で両性解離型イオン交換分離媒体を調製するときに、セルロース類天然
重合体の分離媒体をマトリックスとするのが適しているが、現在のところ、表面に両性解
離基を有するセルロースを重合反応により直接調製するどころか、重合によりセルロース
を調製するための工業的技術もない。さらに、このような方式は、特定の要求を満たす分
離媒体をマトリックスとして共有結合修飾を行って両性解離表面とするのが容易であり、
重合時の荷電基間のサイズ排除による表面両性解離基の被覆度の減少を避けるのに寄与す
るので、表面の親水性基の高被覆率を確実に確保して、疎水性小分子の非特異的吸着を低
下させる。つまり、このような方式は、二重作用を同時に果たし、すなわち、表面に所望
の両性解離基を生成するとともに、表面による疎水性物質への非特異的吸着を低下させ、
したがって、本発明の前記両性解離型イオン交換分離媒体はより好適な使用効果を有する
ようになる。
【0019】
本発明はさらに、両性解離型イオン交換分離媒体の使用方法及び分離容量のキャリブレー
ション方法を開示し、使用方法は、シンプルであり、特定ｐＫａを有する発色プローブだ
けを必要とし、分離容量をキャリブレーションするときに、測定過程がシンプルで素早く
実施でき、吸収測定の標準化が容易になり且つ再現性に優れ、製品の品質キャリブレーシ
ョン及びトレーシング、及び前記両性解離型イオン交換分離媒体の両性解離性質のキャラ
クタリゼーションに適しており、イオン交換分離媒体の分離容量のキャリブレーション及
びその性質のキャラクタリゼーションを迅速で正確且つ精度よく実施できる。
ション方法を開示し、使用方法は、シンプルであり、特定ｐＫａを有する発色プローブだ
けを必要とし、分離容量をキャリブレーションするときに、測定過程がシンプルで素早く
実施でき、吸収測定の標準化が容易になり且つ再現性に優れ、製品の品質キャリブレーシ
ョン及びトレーシング、及び前記両性解離型イオン交換分離媒体の両性解離性質のキャラ
クタリゼーションに適しており、イオン交換分離媒体の分離容量のキャリブレーション及
びその性質のキャラクタリゼーションを迅速で正確且つ精度よく実施できる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
以下、図面及び実施例にて本発明をさらに説明する。
【図1】ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷの表面の正味荷電のｐＨに伴う変化を示す図である。
【図2】ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨの活性エステルへの転化過程の模式図である。
【図3】ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ活性エステルからアミド結合を介して両性解離共有結合修飾層を生成するときの模式図である。
【図4】ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ活性エステルからメルカプト反応性基に変換して両性解離修飾層を生成するときの模式図である。
【図5】アシッドレッド１３のｐＨ８．３での消光係数の測定である。
【図6】アシッドレッド１３の吸着分離量の反応系におけるＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡ用量に対する応答である。
【図7】アシッドレッド１３の吸着分離量の反応体におけるアシッドレッド１３濃度に対する応答である。
【図8】吸着反応ｐＨによる、３種の両性解離磁気ビーズのアシッドレッド１３分離容量への影響及びそのｐＩｍの推定である。
【図9】吸着反応系のプラスミド量による、磁気ビーズのプラスミド分離量への影響である。
【図10】プラスミドが過量の場合におけるプラスミド分離量の磁気ビーズ用量に対する応答である。
【図11】非過量のプラスミドを磁気ビーズで分離して回収した後のＰＣＲ能力の半定量的比較である。
【図12】ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢによるピキア・グイリエルモンディウリカーゼＲＭＧＵ精製効果のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。Ｍ：タンパク質分子量Ｍａｒｋｅｒ。１：天然ＭＧＵをＤＥＡＥ－セルロースで３回吸着して不純物を除去してタンパク質を精製し、５μｇ注入する。２：細胞溶解液、タンパク質の総注入量５μｇ。３：０．２０ｍｌの粗酵素の二次溶出液を凍結乾燥させて、５μｇ注入する。４：１．０ｍｌの粗酵素を用いて得られた二次溶出液を凍結乾燥させて、５μｇ注入する。５．４．０ｍｌの粗酵素を用いて得られた二次溶出液を凍結乾燥させて、５μｇ注入する。６：粗酵素、タンパク質の総注入量１５μｇ。７：粗酵素、タンパク質の総注入量４５μｇ。
【図13】空白磁気ビーズの妨害を検出し比較するための蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲの測定過程（プラスミドサンプルは使用実施例７参照）。
【図14】磁気ビーズにより抽出されたプラスミドを検出し比較するための蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲの測定過程（プラスミドサンプルは使用実施例７参照）。
【図15】蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲでＭＧＵ発現プラスミドを測定したときの応答曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本実施例による両性解離型イオン交換分離媒体は、表面が両性解離共有結合修飾層であり
、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼ
ロであるときの環境ｐＨであってｐＩｍで示される等電点を有し、環境ｐＨが前記等電点
ｐＩｍより低い場合、両性解離共有結合修飾層の表面の正味荷電が正であり、アニオン交
換剤の性質を有し、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより高い場合、両性解離共有結合修飾層の
表面の正味荷電が負であり、カチオン交換剤の性質を有する。解離して負電荷を生成する
基と解離して正電荷を生成する基を同時に含む物質は、両性解離物質と呼ばれ、ｐＨに明
らかな差異がある吸着バッファと溶出バッファを用いて、両性解離修飾層を表面とした分
離媒体と対象物質との間の静電吸引を静電反発にして、静電反発による効率的な溶出を実
現できる。対象物質も分離媒体も耐えられるｐＨ範囲内で、ｐＨを調整して分離媒体の表
面の正味荷電性質を変える一方、対象物質の正味荷電性質を一定に保持し、又は、対象物
質の正味荷電性質を変える一方、分離媒体の正味荷電性質を一定に保持することで、この
ような静電反発による新しい溶出方式を実現できる。生物学的活性物質が耐えられるｐＨ
範囲が限られるため、対象物質が両性解離物質ではないと、帯電する電荷を逆転できず、
それと分離媒体の表面との静電作用を相互吸引から相互反発に逆転させることができない
。両性解離対象物質にも非両性解離対象物質にも適用できるように、限られた範囲内でｐ
Ｈを調整するだけで正味荷電性質を変化できる新規イオン交換分離媒体、すなわち両性解
離修飾層を表面としたイオン交換分離媒体（図１）が必要とされる。
、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼ
ロであるときの環境ｐＨであってｐＩｍで示される等電点を有し、環境ｐＨが前記等電点
ｐＩｍより低い場合、両性解離共有結合修飾層の表面の正味荷電が正であり、アニオン交
換剤の性質を有し、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより高い場合、両性解離共有結合修飾層の
表面の正味荷電が負であり、カチオン交換剤の性質を有する。解離して負電荷を生成する
基と解離して正電荷を生成する基を同時に含む物質は、両性解離物質と呼ばれ、ｐＨに明
らかな差異がある吸着バッファと溶出バッファを用いて、両性解離修飾層を表面とした分
離媒体と対象物質との間の静電吸引を静電反発にして、静電反発による効率的な溶出を実
現できる。対象物質も分離媒体も耐えられるｐＨ範囲内で、ｐＨを調整して分離媒体の表
面の正味荷電性質を変える一方、対象物質の正味荷電性質を一定に保持し、又は、対象物
質の正味荷電性質を変える一方、分離媒体の正味荷電性質を一定に保持することで、この
ような静電反発による新しい溶出方式を実現できる。生物学的活性物質が耐えられるｐＨ
範囲が限られるため、対象物質が両性解離物質ではないと、帯電する電荷を逆転できず、
それと分離媒体の表面との静電作用を相互吸引から相互反発に逆転させることができない
。両性解離対象物質にも非両性解離対象物質にも適用できるように、限られた範囲内でｐ
Ｈを調整するだけで正味荷電性質を変化できる新規イオン交換分離媒体、すなわち両性解
離修飾層を表面としたイオン交換分離媒体（図１）が必要とされる。
【0022】
両性解離物質の荷電性質は、通常、その正味荷電がゼロであるときのｐＨ即ち等電点ｐＩ
によりキャラクタリゼーションされ、非両性解離物質の荷電性質は、通常、その解離定数
ｐＩｓによりキャラクタリゼーションされる。説明の便宜のために、両性解離対象物質の
等電点もｐＩｓと呼ばれ、イオン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼロであるときのｐＨ
即ちその等電点はｐＩｍと呼ばれる。イオン交換分離媒体は、表面の親水性が強いほど、
大部分の物質、特に非荷電疎水性物質に対する非特異的吸着が低くなり、これはこのよう
な分離媒体の再生能力及び分離選択性を向上させて、さらに後続分析の感度を向上させる
のに寄与する。しかし、ｐＨを変えることで対象物質の分離媒体表面への静電吸引による
効率的な吸着を静電反発による効率的な溶出に逆転させるために、前記両性解離型イオン
交換分離媒体のｐＩｍは下記条件を満たさなければならない。対象物質も分離媒体も耐え
られるｐＨ範囲内で、低ｐＨにより分離媒体の表面の正味荷電を正にし、高ｐＨによりそ
の表面の正味荷電を負に逆転させ、即ち、ｐＩｍは対象物質も分離媒体も耐えられるｐＨ
範囲の中央部にある。両性解離対象物質の場合、適切なイオン交換分離媒体ｐＩｍと対象
物質ｐＩｓとの十分な差異がさらに要求される。これら条件を満たせば、吸着バッファの
ｐＨを選択して、対象物質とイオン交換分離媒体の表面の正味荷電を逆にして静電吸着を
発生させ、吸着バッファで吸着対象物質の分離媒体を洗浄して、妨害物質の非特異的吸着
をできるだけ低下させ、次に、適切なｐＨを有するバッファで分離媒体と対象物質の正味
荷電を同じにして静電反発を発生させて、対象物質を効率的に溶出し、さらに水溶性一価
中性無機塩を添加して溶出を促進する。このイオン交換分離媒体は、荷電対象物質の抽出
濃縮に用いられる場合、最も優位性を有し、イオン交換クロマトグラフィーカラムの充填
材として用いられる場合、耐用年数が長いとともに分離能力がより高く、対象物質の調製
に用いられる場合、分離媒体の再生能力が高く、分離過程がシンプルで迅速であり、且つ
対象物質の収率が高い。
によりキャラクタリゼーションされ、非両性解離物質の荷電性質は、通常、その解離定数
ｐＩｓによりキャラクタリゼーションされる。説明の便宜のために、両性解離対象物質の
等電点もｐＩｓと呼ばれ、イオン交換分離媒体の表面の正味荷電がゼロであるときのｐＨ
即ちその等電点はｐＩｍと呼ばれる。イオン交換分離媒体は、表面の親水性が強いほど、
大部分の物質、特に非荷電疎水性物質に対する非特異的吸着が低くなり、これはこのよう
な分離媒体の再生能力及び分離選択性を向上させて、さらに後続分析の感度を向上させる
のに寄与する。しかし、ｐＨを変えることで対象物質の分離媒体表面への静電吸引による
効率的な吸着を静電反発による効率的な溶出に逆転させるために、前記両性解離型イオン
交換分離媒体のｐＩｍは下記条件を満たさなければならない。対象物質も分離媒体も耐え
られるｐＨ範囲内で、低ｐＨにより分離媒体の表面の正味荷電を正にし、高ｐＨによりそ
の表面の正味荷電を負に逆転させ、即ち、ｐＩｍは対象物質も分離媒体も耐えられるｐＨ
範囲の中央部にある。両性解離対象物質の場合、適切なイオン交換分離媒体ｐＩｍと対象
物質ｐＩｓとの十分な差異がさらに要求される。これら条件を満たせば、吸着バッファの
ｐＨを選択して、対象物質とイオン交換分離媒体の表面の正味荷電を逆にして静電吸着を
発生させ、吸着バッファで吸着対象物質の分離媒体を洗浄して、妨害物質の非特異的吸着
をできるだけ低下させ、次に、適切なｐＨを有するバッファで分離媒体と対象物質の正味
荷電を同じにして静電反発を発生させて、対象物質を効率的に溶出し、さらに水溶性一価
中性無機塩を添加して溶出を促進する。このイオン交換分離媒体は、荷電対象物質の抽出
濃縮に用いられる場合、最も優位性を有し、イオン交換クロマトグラフィーカラムの充填
材として用いられる場合、耐用年数が長いとともに分離能力がより高く、対象物質の調製
に用いられる場合、分離媒体の再生能力が高く、分離過程がシンプルで迅速であり、且つ
対象物質の収率が高い。
【0023】
イオン交換分離媒体を用いてｐＨ調整により対象物質のその表面での吸着・溶出をする場
合、溶出工程の原理が古典的なイオン交換原理と明らかに異なる。このようなイオン交換
分離媒体を使用するとき、ｐＨ調整により分離媒体の表面と対象物質の正味荷電を同じに
して静電反発を発生させて対象物質を放出し、このように、溶出能力を高めるとともに、
高濃度無機イオンの使用による後続の問題を防止し、特に溶出速度がより高くなり、溶出
工程において、イオン間の競合的結合に依らなくなるが、イオン間の競合的結合で溶出を
促進できる。前記両性解離型イオン交換分離媒体の荷電物質への吸着分離機能はｐＨがｐ
Ｉｍの両側のいずれにあるかによって明らかに異なり、ｐＨがｐＩｍより低いとき、アニ
オンを吸着させるためアニオン交換剤であり、ｐＨがｐＩｍより高くなると、カチオンを
吸着させるためカチオン交換剤である。勿論、古典的なイオン交換剤の荷電物質への吸着
機能はｐＨの変化により逆転することはない。
合、溶出工程の原理が古典的なイオン交換原理と明らかに異なる。このようなイオン交換
分離媒体を使用するとき、ｐＨ調整により分離媒体の表面と対象物質の正味荷電を同じに
して静電反発を発生させて対象物質を放出し、このように、溶出能力を高めるとともに、
高濃度無機イオンの使用による後続の問題を防止し、特に溶出速度がより高くなり、溶出
工程において、イオン間の競合的結合に依らなくなるが、イオン間の競合的結合で溶出を
促進できる。前記両性解離型イオン交換分離媒体の荷電物質への吸着分離機能はｐＨがｐ
Ｉｍの両側のいずれにあるかによって明らかに異なり、ｐＨがｐＩｍより低いとき、アニ
オンを吸着させるためアニオン交換剤であり、ｐＨがｐＩｍより高くなると、カチオンを
吸着させるためカチオン交換剤である。勿論、古典的なイオン交換剤の荷電物質への吸着
機能はｐＨの変化により逆転することはない。
【0024】
環境ｐＨが前記両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍより低い場合、環境ｐＨと
ｐＩｍの差値が増大するに伴い、両性解離共有結合修飾層の表面の正電荷の数が徐々に増
加し、環境ｐＨが前記等電点より高い場合、環境ｐＨとｐＩｍの差値が増大するに伴い、
両性解離共有結合修飾層の表面の負電荷の数が徐々に増加し、前記環境ｐＨはいずれも分
離対象物質と前記両性解離型イオン交換分離媒体の両方が耐えられる範囲にある。
ｐＩｍの差値が増大するに伴い、両性解離共有結合修飾層の表面の正電荷の数が徐々に増
加し、環境ｐＨが前記等電点より高い場合、環境ｐＨとｐＩｍの差値が増大するに伴い、
両性解離共有結合修飾層の表面の負電荷の数が徐々に増加し、前記環境ｐＨはいずれも分
離対象物質と前記両性解離型イオン交換分離媒体の両方が耐えられる範囲にある。
【0025】
本実施例において、前記両性解離型イオン交換分離媒体の表面の両性解離共有結合修飾層
に、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより低いときに解離して正電荷を発生させる基とｐＨ値が
前記等電点ｐＩｍより高いときに解離して負電荷を発生させる基とを同時に含み、前記解
離して負電荷を発生させる基は脂肪族カルボキシ基であり、解離して正電荷を発生させる
基は脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み
合わせである。
に、ｐＨ値が前記等電点ｐＩｍより低いときに解離して正電荷を発生させる基とｐＨ値が
前記等電点ｐＩｍより高いときに解離して負電荷を発生させる基とを同時に含み、前記解
離して負電荷を発生させる基は脂肪族カルボキシ基であり、解離して正電荷を発生させる
基は脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み
合わせである。
【0026】
本実施例において、前記両性解離共有結合修飾層は、両性解離基前駆体による分離媒体マ
トリックスに対する共有結合修飾に由来し、
前記分離媒体マトリックスは、表面に長さが９個の原子を超える線状長鎖を含まない任意
のサイズの粒子又は任意の厚みのフィルムであり、しかし、両性解離基前駆体と共有結合
反応を行って前記両性解離共有結合修飾層を生成するために、脂肪族一級アミン基及び／
又は脂肪族二級アミン基、脂肪族カルボキシ基、及びメルカプトで置換されて分離媒体マ
トリックスの表面から離脱する小体積基を含有するメルカプト反応性基のうちのいずれか
の基を反応基として含み、
前記両性解離基前駆体は、親水性で、分子量が５００ダルトン未満で、連続した５個超の
炭素原子を持つ炭化水素鎖又は炭化水素環を含まない物質であり、且つすべてアルキルチ
オール基又は脂肪族一級アミン基を共有結合連結基として含むとともに、脂肪族カルボキ
シ基を解離して負電荷を発生させる基として含み及び／又は脂肪族一級、二級、三級アミ
ン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせを解離して正電荷を発生さ
せる基として含み、前記両性解離基前駆体には、前駆体Ａ、前駆体Ｂ及び前駆体Ｃが含ま
れ、前駆体Ａが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基だけ
を含む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｂが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離し
て正電荷を発生させる基だけを含む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｃが前記共有結合連
結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基及び解離して正電荷を発生させる基
を同時に含有する両性解離基前駆体である。前駆体Ｃは、リジン、オルニチン、ヒスチジ
ン、Ｎ,Ｎ－ジカルボキシメチルエチレンジアミン、システイン、３－メルカプトヒスチ
ジン、３－メルカプトリジン、３－メルカプトグルタミン酸などを含み、前駆体Ａは、グ
ルタミン酸、３－メルカプト－１,５－グルタル酸、メルカプト酢酸、トリス－（カルボ
キシメチル）－アミノメタンを含み、前駆体Ｂは、メルカプトエチルアミン、３－メルカ
プト－２－ヒドロキシプロピルアミン、２－メルカプトイミダゾール、ジエチルトリアミ
ン、Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノエチレンジアミン、テトラ－（アミノメチル）－メタンを含
む。これら物質は、単独で使用してもよいし、解離して正電荷を発生させる基と解離して
負電荷を発生させる基との比率を調整して、各種ｐＩｍを有する両性解離型イオン交換分
離媒体を得るために２種及び複数種を組み合わせて使用してもよい。
トリックスに対する共有結合修飾に由来し、
前記分離媒体マトリックスは、表面に長さが９個の原子を超える線状長鎖を含まない任意
のサイズの粒子又は任意の厚みのフィルムであり、しかし、両性解離基前駆体と共有結合
反応を行って前記両性解離共有結合修飾層を生成するために、脂肪族一級アミン基及び／
又は脂肪族二級アミン基、脂肪族カルボキシ基、及びメルカプトで置換されて分離媒体マ
トリックスの表面から離脱する小体積基を含有するメルカプト反応性基のうちのいずれか
の基を反応基として含み、
前記両性解離基前駆体は、親水性で、分子量が５００ダルトン未満で、連続した５個超の
炭素原子を持つ炭化水素鎖又は炭化水素環を含まない物質であり、且つすべてアルキルチ
オール基又は脂肪族一級アミン基を共有結合連結基として含むとともに、脂肪族カルボキ
シ基を解離して負電荷を発生させる基として含み及び／又は脂肪族一級、二級、三級アミ
ン基及びイミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせを解離して正電荷を発生さ
せる基として含み、前記両性解離基前駆体には、前駆体Ａ、前駆体Ｂ及び前駆体Ｃが含ま
れ、前駆体Ａが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基だけ
を含む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｂが前記共有結合連結基を含む以外、前記解離し
て正電荷を発生させる基だけを含む両性解離基前駆体であり、前駆体Ｃが前記共有結合連
結基を含む以外、前記解離して負電荷を発生させる基及び解離して正電荷を発生させる基
を同時に含有する両性解離基前駆体である。前駆体Ｃは、リジン、オルニチン、ヒスチジ
ン、Ｎ,Ｎ－ジカルボキシメチルエチレンジアミン、システイン、３－メルカプトヒスチ
ジン、３－メルカプトリジン、３－メルカプトグルタミン酸などを含み、前駆体Ａは、グ
ルタミン酸、３－メルカプト－１,５－グルタル酸、メルカプト酢酸、トリス－（カルボ
キシメチル）－アミノメタンを含み、前駆体Ｂは、メルカプトエチルアミン、３－メルカ
プト－２－ヒドロキシプロピルアミン、２－メルカプトイミダゾール、ジエチルトリアミ
ン、Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノエチレンジアミン、テトラ－（アミノメチル）－メタンを含
む。これら物質は、単独で使用してもよいし、解離して正電荷を発生させる基と解離して
負電荷を発生させる基との比率を調整して、各種ｐＩｍを有する両性解離型イオン交換分
離媒体を得るために２種及び複数種を組み合わせて使用してもよい。
【0027】
前記両性解離基前駆体を分離媒体マトリックスの共有結合修飾に用いるとき、
ａ．前駆体Ｃを単独で使用し又は混合して使用し、混合して使用する場合、複数種の前駆
体Ｃを所定比率で混合して使用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結
合連結基を含有する方式と、
ｂ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｂとを所定比率で混合して使用
し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｃ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｄ．１種又は複数種の前駆体Ｂと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式との
うちの１種によって修飾し、
分離媒体マトリックスに対して共有結合修飾を行うとき、使用される両性解離基前駆体に
おいて、脂肪族カルボキシ基の総モル量に対する脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイ
ミダゾリル基の総モル量の比率が１：６－６：１の間に制限される。使用される両性解離
基前駆体に脂肪族二級アミン及び／又は三級アミンを解離して正電荷を発生させる基とし
て含む場合、前記脂肪族二級アミンと三級アミンの総モル量の合計が脂肪族一級アミン及
びイミダゾリル基の総モル量の合計の３０％以下であり、
共有結合反応には、脂肪族アミン基と脂肪族カルボキシ基によるアミド生成と、アルキル
チオールによる脱離基の置換との２種がある。
ａ．前駆体Ｃを単独で使用し又は混合して使用し、混合して使用する場合、複数種の前駆
体Ｃを所定比率で混合して使用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結
合連結基を含有する方式と、
ｂ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｂとを所定比率で混合して使用
し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｃ．１種又は複数種の前駆体Ａと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式と、
ｄ．１種又は複数種の前駆体Ｂと１種又は複数種の前駆体Ｃだけを所定比率で混合して使
用し、且つ混合して使用する前駆体のいずれにも同じ共有結合連結基を含有する方式との
うちの１種によって修飾し、
分離媒体マトリックスに対して共有結合修飾を行うとき、使用される両性解離基前駆体に
おいて、脂肪族カルボキシ基の総モル量に対する脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイ
ミダゾリル基の総モル量の比率が１：６－６：１の間に制限される。使用される両性解離
基前駆体に脂肪族二級アミン及び／又は三級アミンを解離して正電荷を発生させる基とし
て含む場合、前記脂肪族二級アミンと三級アミンの総モル量の合計が脂肪族一級アミン及
びイミダゾリル基の総モル量の合計の３０％以下であり、
共有結合反応には、脂肪族アミン基と脂肪族カルボキシ基によるアミド生成と、アルキル
チオールによる脱離基の置換との２種がある。
【0028】
分離媒体マトリックスの表面に両性解離共有結合修飾層も、９個の原子を超える長直鎖基
もない。両性解離共有結合修飾層のない分離媒体をマトリックスとすると、その表面に含
まれる反応基は脂肪族カルボキシ基、脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基
、メルカプトで求核置換されて分離媒体の表面から離脱しやすい小体積脱離基を含有する
メルカプト反応性基のうちの１種であり、このような小体積脱離基には、ハロゲンイオン
、ｐ－トルエンスルホン酸根、トリフルオロ酢酸根が含まれる。両性解離共有結合修飾層
のない分離媒体の表面に上記反応基がないとき、適切な誘導反応で上記反応基を取得して
分離媒体マトリックスとし、次に両性解離基前駆体で修飾して、前記両性解離型イオン交
換分離媒体とする。セルロース、表面にヒドロキシ基を含む親水性マクロポーラス樹脂を
分離媒体として、無水コハク酸又はクロロ酢酸無水物で誘導修飾を行うことで、所望の反
応基を得ると、両性解離共有結合修飾層を生成するためのマトリックスとして適している
。
もない。両性解離共有結合修飾層のない分離媒体をマトリックスとすると、その表面に含
まれる反応基は脂肪族カルボキシ基、脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基
、メルカプトで求核置換されて分離媒体の表面から離脱しやすい小体積脱離基を含有する
メルカプト反応性基のうちの１種であり、このような小体積脱離基には、ハロゲンイオン
、ｐ－トルエンスルホン酸根、トリフルオロ酢酸根が含まれる。両性解離共有結合修飾層
のない分離媒体の表面に上記反応基がないとき、適切な誘導反応で上記反応基を取得して
分離媒体マトリックスとし、次に両性解離基前駆体で修飾して、前記両性解離型イオン交
換分離媒体とする。セルロース、表面にヒドロキシ基を含む親水性マクロポーラス樹脂を
分離媒体として、無水コハク酸又はクロロ酢酸無水物で誘導修飾を行うことで、所望の反
応基を得ると、両性解離共有結合修飾層を生成するためのマトリックスとして適している
。
【0029】
両性解離共有結合修飾層のない分離媒体をマトリックスとして、その表面に脂肪族一級ア
ミン基及び／又は脂肪族二級アミン基を共有結合する反応基とする場合、そのアミン基と
ハロゲン化無水酢酸又はハロゲン化酢酸活性エステルが反応した後、メルカプトを含有す
る両性解離基前駆体と反応し、又はブロモ酢酸又はヨード酢酸におけるハロゲンと置換反
応して置換グリシンを生成し、又は無水コハク酸又は無水コハク酸と無水酢酸の混合物を
、無水物の総モル量が過量でない条件で、分離媒体の表面におけるアミン基と反応させて
、両性解離基からなる共有結合修飾層を生成する。
ミン基及び／又は脂肪族二級アミン基を共有結合する反応基とする場合、そのアミン基と
ハロゲン化無水酢酸又はハロゲン化酢酸活性エステルが反応した後、メルカプトを含有す
る両性解離基前駆体と反応し、又はブロモ酢酸又はヨード酢酸におけるハロゲンと置換反
応して置換グリシンを生成し、又は無水コハク酸又は無水コハク酸と無水酢酸の混合物を
、無水物の総モル量が過量でない条件で、分離媒体の表面におけるアミン基と反応させて
、両性解離基からなる共有結合修飾層を生成する。
【0030】
本実施例において、前記両性解離型イオン交換分離媒体は、ｐＨが３である場合、その表
面の正電荷の数が最大値の９０％以上であり、ｐＨが１１である場合、その表面の負電荷
の数が最大値の９０％以上である。
面の正電荷の数が最大値の９０％以上であり、ｐＨが１１である場合、その表面の負電荷
の数が最大値の９０％以上である。
【0031】
イオン交換分離媒体を用いてｐＨ調整により対象物質を吸着又は溶出する場合、このイオ
ン交換媒体の表面を両性解離修飾層とする必要があり、これは古典的なイオン交換媒体の
表面構造と明らかに異なる。対象物質も分離媒体も耐えられるｐＨ範囲の両側の境界でイ
オン交換分離媒体の表面の正電荷と負電荷の数をそれぞれ最大に近くすることによってし
か、その分離性能を最大化させることができない。イオン交換分離媒体の表面の正味荷電
の数が最大値の９０％以上であると、その分離性能が最大に近い。親水性基は前記両性解
離型イオン交換分離媒体の調製に適するが、芳香物質は両性解離基前駆体として適してい
ない。イオン化して負電荷を発生させるための基として一般的に使用されている基には、
リン酸モノエステル及びリン酸ジエステル、有機スルホン酸及び脂肪族カルボン酸が含ま
れる。リン酸モノエステル、リン酸ジエステル及び有機スルホン酸のｐＩｓが１．７未満
であり、酢酸などの単一カルボキシ基のｐＩｓが４．８に近い。イミダゾールのｐＩｓが
６．０に近く且つ親水性である。親水性置換基を有する単一一級アミン、たとえばトリメ
チロールアミノメタンのｐＩｓが８．０に近く、メチルアミン及びジメチルアミンのｐＩ
ｓが１０．７に近く、トリメチルアミンのｐＩｓが１０．０に近く、エチルアミン、ジエ
チルアミン及びトリエチルアミンのいずれのｐＩｓも１１．０に近い。一方、両性解離修
飾層において解離基が空間的に隣接することは、それぞれの解離定数に明らかな影響を与
える。たとえば、酢酸のｐＩｓが４．８に近く、それに対してエチルアミンのｐＩｓが１
１．０に近く、トリメチロールアミノメタンには、中性基がアミン基に隣接するため、そ
のｐＩｓが８．０に近く、エチルアミンの１１．０より遥かに小さく、グリシン、アラニ
ンは隣接する脂肪族カルボキシ基と一級アミン基を等モルで含むため、そのｐＩｓが６．
０に近く、エチルアミン及び酢酸ｐＩｓの中央値７．８よりもはるかに小さい。しかしな
がら、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡにおいて同じカルボキシ基のｐＩｓの差が大きく、エチレン
ジアミンでも２つのアミン基のｐＩｓに大きな差がある。両性解離共有結合修飾層におい
て解離して正電荷を発生させる基と解離して負電荷を発生させる基が均等な間隔を空けて
ランダムに分布していれば、２種の解離基のｐＩｓは単独した状態よりも遥かに低下し、
そうではないと相当し、解離して正電荷を発生させる基又は解離して負電荷を発生させる
基がいずれもクラスターとして分布していれば、すべてイオン化して対応した見かけｐＩ
ｓがより高くなる。解離して正電荷を発生させる基は、ｐＨがｐＩｓより１．０単位高い
とき、解離度が１０％より低く、解離して負電荷を発生させる基は、環境ｐＨがそのｐＩ
ｓより１．０単位低いとき、解離度が１０％より低い。本発明の前記両性解離型イオン交
換分離媒体を調製するための簡単な汎用手段は、ｐＨ４．０の場合のイオン化度ができる
だけ１０％より低い解離して負電荷を発生させる基、及び、ｐＨ１０．０の場合のイオン
化度ができるだけ１０％より低い解離して正電荷を発生させる基を用いることであり、こ
の場合、ｐＨ３．０－１１．０ではその分離性能を最大化させることができる。それによ
れば、解離して負電荷を発生させる基のｐＩｓができるだけ４．０より大きいものとして
、脂肪族カルボン酸しかなく、そして、好ましくは、すべてイオン化して対応した見かけ
ｐＩｓをより高くするために空間的に隣接する複数のカルボキシ基を有する。解離して正
電荷を発生させる基のｐＩｓができるだけ９．０より小さいものとして、イミダゾリル基
、及び空間的に隣接して解離して負電荷になり又は中性の親水性置換基を有する脂肪族一
級アミン基しか、要求を満たすものがなく、そして、これら脂肪族一級アミンは、そのｐ
Ｉｓを低下させるためにできるだけ脂肪族カルボキシ基で離間されるべきである。エチル
基及びより大きなアルキルで置換された二級アミン及び三級アミンは、ｐＩｓが高すぎる
とともに、疎水性が強いため、好適ではなく、ｐＩｍを調整するためにメチル置換脂肪族
二級アミン及び三級アミンを使用しても、その脂肪族一級アミン及びイミダゾリル基の総
モル量に対する比率をできるだけ低くすべきである。上記両性解離基から表面共有結合修
飾を構成すると、理論的には、ｐＨ３．０－１１．０では分離性能を最大化させることが
可能である。
ン交換媒体の表面を両性解離修飾層とする必要があり、これは古典的なイオン交換媒体の
表面構造と明らかに異なる。対象物質も分離媒体も耐えられるｐＨ範囲の両側の境界でイ
オン交換分離媒体の表面の正電荷と負電荷の数をそれぞれ最大に近くすることによってし
か、その分離性能を最大化させることができない。イオン交換分離媒体の表面の正味荷電
の数が最大値の９０％以上であると、その分離性能が最大に近い。親水性基は前記両性解
離型イオン交換分離媒体の調製に適するが、芳香物質は両性解離基前駆体として適してい
ない。イオン化して負電荷を発生させるための基として一般的に使用されている基には、
リン酸モノエステル及びリン酸ジエステル、有機スルホン酸及び脂肪族カルボン酸が含ま
れる。リン酸モノエステル、リン酸ジエステル及び有機スルホン酸のｐＩｓが１．７未満
であり、酢酸などの単一カルボキシ基のｐＩｓが４．８に近い。イミダゾールのｐＩｓが
６．０に近く且つ親水性である。親水性置換基を有する単一一級アミン、たとえばトリメ
チロールアミノメタンのｐＩｓが８．０に近く、メチルアミン及びジメチルアミンのｐＩ
ｓが１０．７に近く、トリメチルアミンのｐＩｓが１０．０に近く、エチルアミン、ジエ
チルアミン及びトリエチルアミンのいずれのｐＩｓも１１．０に近い。一方、両性解離修
飾層において解離基が空間的に隣接することは、それぞれの解離定数に明らかな影響を与
える。たとえば、酢酸のｐＩｓが４．８に近く、それに対してエチルアミンのｐＩｓが１
１．０に近く、トリメチロールアミノメタンには、中性基がアミン基に隣接するため、そ
のｐＩｓが８．０に近く、エチルアミンの１１．０より遥かに小さく、グリシン、アラニ
ンは隣接する脂肪族カルボキシ基と一級アミン基を等モルで含むため、そのｐＩｓが６．
０に近く、エチルアミン及び酢酸ｐＩｓの中央値７．８よりもはるかに小さい。しかしな
がら、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡにおいて同じカルボキシ基のｐＩｓの差が大きく、エチレン
ジアミンでも２つのアミン基のｐＩｓに大きな差がある。両性解離共有結合修飾層におい
て解離して正電荷を発生させる基と解離して負電荷を発生させる基が均等な間隔を空けて
ランダムに分布していれば、２種の解離基のｐＩｓは単独した状態よりも遥かに低下し、
そうではないと相当し、解離して正電荷を発生させる基又は解離して負電荷を発生させる
基がいずれもクラスターとして分布していれば、すべてイオン化して対応した見かけｐＩ
ｓがより高くなる。解離して正電荷を発生させる基は、ｐＨがｐＩｓより１．０単位高い
とき、解離度が１０％より低く、解離して負電荷を発生させる基は、環境ｐＨがそのｐＩ
ｓより１．０単位低いとき、解離度が１０％より低い。本発明の前記両性解離型イオン交
換分離媒体を調製するための簡単な汎用手段は、ｐＨ４．０の場合のイオン化度ができる
だけ１０％より低い解離して負電荷を発生させる基、及び、ｐＨ１０．０の場合のイオン
化度ができるだけ１０％より低い解離して正電荷を発生させる基を用いることであり、こ
の場合、ｐＨ３．０－１１．０ではその分離性能を最大化させることができる。それによ
れば、解離して負電荷を発生させる基のｐＩｓができるだけ４．０より大きいものとして
、脂肪族カルボン酸しかなく、そして、好ましくは、すべてイオン化して対応した見かけ
ｐＩｓをより高くするために空間的に隣接する複数のカルボキシ基を有する。解離して正
電荷を発生させる基のｐＩｓができるだけ９．０より小さいものとして、イミダゾリル基
、及び空間的に隣接して解離して負電荷になり又は中性の親水性置換基を有する脂肪族一
級アミン基しか、要求を満たすものがなく、そして、これら脂肪族一級アミンは、そのｐ
Ｉｓを低下させるためにできるだけ脂肪族カルボキシ基で離間されるべきである。エチル
基及びより大きなアルキルで置換された二級アミン及び三級アミンは、ｐＩｓが高すぎる
とともに、疎水性が強いため、好適ではなく、ｐＩｍを調整するためにメチル置換脂肪族
二級アミン及び三級アミンを使用しても、その脂肪族一級アミン及びイミダゾリル基の総
モル量に対する比率をできるだけ低くすべきである。上記両性解離基から表面共有結合修
飾を構成すると、理論的には、ｐＨ３．０－１１．０では分離性能を最大化させることが
可能である。
【0032】
勿論、解離して負電荷を発生させる基と解離して正電荷を発生させる基とのモル比は、ｐ
Ｈ１１．０の場合、正帯電脂肪族一級アミン／イミダゾリル基の、ほぼ完全にイオン化し
た脂肪族カルボキシ基に対する比率を決めるとともに、ｐＨ３．０の場合、負帯電脂肪族
カルボキシ基の、ほぼ完全にイオン化した脂肪族一級アミン／イミダゾリル基に対する比
率を決め、つまり、このｐＨ範囲の境界では、分離媒体の表面の正味荷電が最大に近くて
その分離性能を最大にしているかを決定する。勿論、本発明の前記両性解離分離媒体の表
面における２種の解離基の比率を最適化させる必要がある。ｐＨが酸性解離基ｐＩｓより
３つのｐＨ単位小さく又は塩基性解離基ｐＩｓより３つのｐＨ単位より大きい場合、この
ような基の解離度／イオン化度はいずれも０．１％未満である。したがって、空間的に隣
接する脂肪族カルボキシ基と脂肪族一級アミン基のｐＩｓの差が２．５よりもはるかに大
きいと考えられる。ｐＨが上記解離して正電荷を発生させる基のｐＩｓより１．０単位高
い場合に、脂肪族カルボキシ基は負電荷を発生させて解離度が９９％を超え、一方、解離
して正電荷を発生させる基はイオン化度が１０％未満であり、ｐＨが解離して負電荷を発
生させる基のｐＩｓより１．０単位低い場合に、脂肪族カルボキシ基は、負電荷を発生さ
せて解離度が１０％未満であり、一方、上記解離して正電荷を発生させる基の解離度は９
９％を超える。ｐＨ３．０では、本発明の前記両性解離分離媒体の表面の脂肪族カルボキ
シ基の見かけｐＩｓが４．８に近く、解離して負電荷を発生させる基のイオン化度が２％
未満であり、ｐＨ１１．０では、親水性脂肪族置換基を有する一級アミンのｐＩｓが９．
０未満で且つ脂肪族二級アミン／三級アミンの含有量が無視できるため、解離して正電荷
を発生させる基のイオン化度が１％未満であると仮定すれば、脂肪族一級アミン基とイミ
ダゾリル基の総量に対する脂肪族カルボキシ基のモル比が３：１以下且つ１：６より大き
いときにのみ、ｐＨ３．０－１１．０では、その分離性能が最大に近い。表面の脂肪族カ
ルボキシ基の密度が高いとき、隣接するカルボキシ基が多くなることにより、カルボキシ
基のｐＩｓを高くして、カルボキシ基とアミン基が隣接することにより、アミン基のｐＩ
ｓを低下させる知見に基づいて、本発明では、脂肪族カルボキシ基に対する、前記両性解
離型イオン交換分離媒体の表面の共有結合修飾層における脂肪族一級アミン基（解離して
正電荷を発生させるすべての基に対する二級アミン／三級アミンの総量の比率が３０％以
下である）の比率を１：６－６：１に制限することによって、ｐＨ３．０－１１．０では
その分離性能を最大化させ、このような比率の制御は、修飾するときに前記解離して正電
荷を発生させる基と解離して負電荷を発生させる基とを含む２種の前駆体の混合物を使用
する、又は前駆体Ｃをうまく設計することによって行われ得る。
Ｈ１１．０の場合、正帯電脂肪族一級アミン／イミダゾリル基の、ほぼ完全にイオン化し
た脂肪族カルボキシ基に対する比率を決めるとともに、ｐＨ３．０の場合、負帯電脂肪族
カルボキシ基の、ほぼ完全にイオン化した脂肪族一級アミン／イミダゾリル基に対する比
率を決め、つまり、このｐＨ範囲の境界では、分離媒体の表面の正味荷電が最大に近くて
その分離性能を最大にしているかを決定する。勿論、本発明の前記両性解離分離媒体の表
面における２種の解離基の比率を最適化させる必要がある。ｐＨが酸性解離基ｐＩｓより
３つのｐＨ単位小さく又は塩基性解離基ｐＩｓより３つのｐＨ単位より大きい場合、この
ような基の解離度／イオン化度はいずれも０．１％未満である。したがって、空間的に隣
接する脂肪族カルボキシ基と脂肪族一級アミン基のｐＩｓの差が２．５よりもはるかに大
きいと考えられる。ｐＨが上記解離して正電荷を発生させる基のｐＩｓより１．０単位高
い場合に、脂肪族カルボキシ基は負電荷を発生させて解離度が９９％を超え、一方、解離
して正電荷を発生させる基はイオン化度が１０％未満であり、ｐＨが解離して負電荷を発
生させる基のｐＩｓより１．０単位低い場合に、脂肪族カルボキシ基は、負電荷を発生さ
せて解離度が１０％未満であり、一方、上記解離して正電荷を発生させる基の解離度は９
９％を超える。ｐＨ３．０では、本発明の前記両性解離分離媒体の表面の脂肪族カルボキ
シ基の見かけｐＩｓが４．８に近く、解離して負電荷を発生させる基のイオン化度が２％
未満であり、ｐＨ１１．０では、親水性脂肪族置換基を有する一級アミンのｐＩｓが９．
０未満で且つ脂肪族二級アミン／三級アミンの含有量が無視できるため、解離して正電荷
を発生させる基のイオン化度が１％未満であると仮定すれば、脂肪族一級アミン基とイミ
ダゾリル基の総量に対する脂肪族カルボキシ基のモル比が３：１以下且つ１：６より大き
いときにのみ、ｐＨ３．０－１１．０では、その分離性能が最大に近い。表面の脂肪族カ
ルボキシ基の密度が高いとき、隣接するカルボキシ基が多くなることにより、カルボキシ
基のｐＩｓを高くして、カルボキシ基とアミン基が隣接することにより、アミン基のｐＩ
ｓを低下させる知見に基づいて、本発明では、脂肪族カルボキシ基に対する、前記両性解
離型イオン交換分離媒体の表面の共有結合修飾層における脂肪族一級アミン基（解離して
正電荷を発生させるすべての基に対する二級アミン／三級アミンの総量の比率が３０％以
下である）の比率を１：６－６：１に制限することによって、ｐＨ３．０－１１．０では
その分離性能を最大化させ、このような比率の制御は、修飾するときに前記解離して正電
荷を発生させる基と解離して負電荷を発生させる基とを含む２種の前駆体の混合物を使用
する、又は前駆体Ｃをうまく設計することによって行われ得る。
【0033】
実用するときに、静電吸引を発生させるｐＨでは、分離媒体の表面の正味荷電が多いほど
、対象物質への吸着容量が大きくなり、静電反発を発生させるｐＨでは、分離媒体の表面
の正味荷電と対象物質の正味荷電が同じで且つ数が十分であれば、被吸着物質を効率的に
溶出できる。理論的には、表面に両性解離共有結合修飾層のない分離媒体をマトリックス
として表面修飾を行う場合、修飾対象媒体の表面における反応基の数／密度が限られるの
で、共有結合修飾により表面において生成可能な、解離して負電荷を発生させる基と解離
して正電荷を発生させる基との総モル量が限られる。解離して負電荷を発生させる基と解
離して正電荷を発生させる基とのモル比が異なると、対応した両性解離分離媒体のｐＩｍ
が異なる。各対象物質ごとに、分離性能及び対象物質の収率を最大化させるために、異な
るｐＩｍの両性解離型イオン交換分離媒体を使用しなければならない。それに対応して、
負帯電対象物質を吸着する両性解離型イオン交換分離媒体では、その正電荷の絶対値をよ
り大きくするために、その表面における脂肪族カルボキシ基をより少なくするのが好まし
い。正帯電対象物質を吸着する両性解離型イオン交換分離媒体では、その負電荷の絶対値
をより大きくするために、その表面における脂肪族一級アミン基／イミダゾリルをより少
なくするのが好ましい。したがって、脂肪族カルボキシ基のモル量に対する、両性解離型
イオン交換分離媒体の表面における脂肪族一級アミン基／イミダゾリル基の総モル量の比
値の範囲を広げることができ、それに対応して、両性解離型イオン交換分離媒体ｐＩｍの
範囲が広くなる。両性解離型イオン交換分離媒体は、アニオン分離に用いられる場合、ｐ
Ｈ３．０では、その表面の正電荷の数が最大値の９０％以上であり、カチオン分離に用い
られる場合、ｐＨ１１．０では、その表面の負電荷の数が最大値の９０％以上であること
が要求される。
、対象物質への吸着容量が大きくなり、静電反発を発生させるｐＨでは、分離媒体の表面
の正味荷電と対象物質の正味荷電が同じで且つ数が十分であれば、被吸着物質を効率的に
溶出できる。理論的には、表面に両性解離共有結合修飾層のない分離媒体をマトリックス
として表面修飾を行う場合、修飾対象媒体の表面における反応基の数／密度が限られるの
で、共有結合修飾により表面において生成可能な、解離して負電荷を発生させる基と解離
して正電荷を発生させる基との総モル量が限られる。解離して負電荷を発生させる基と解
離して正電荷を発生させる基とのモル比が異なると、対応した両性解離分離媒体のｐＩｍ
が異なる。各対象物質ごとに、分離性能及び対象物質の収率を最大化させるために、異な
るｐＩｍの両性解離型イオン交換分離媒体を使用しなければならない。それに対応して、
負帯電対象物質を吸着する両性解離型イオン交換分離媒体では、その正電荷の絶対値をよ
り大きくするために、その表面における脂肪族カルボキシ基をより少なくするのが好まし
い。正帯電対象物質を吸着する両性解離型イオン交換分離媒体では、その負電荷の絶対値
をより大きくするために、その表面における脂肪族一級アミン基／イミダゾリルをより少
なくするのが好ましい。したがって、脂肪族カルボキシ基のモル量に対する、両性解離型
イオン交換分離媒体の表面における脂肪族一級アミン基／イミダゾリル基の総モル量の比
値の範囲を広げることができ、それに対応して、両性解離型イオン交換分離媒体ｐＩｍの
範囲が広くなる。両性解離型イオン交換分離媒体は、アニオン分離に用いられる場合、ｐ
Ｈ３．０では、その表面の正電荷の数が最大値の９０％以上であり、カチオン分離に用い
られる場合、ｐＨ１１．０では、その表面の負電荷の数が最大値の９０％以上であること
が要求される。
【0034】
前記両性解離型イオン交換分離媒体を調製するための汎用方法としては、表面に反応基を
有し両性解離修飾層のない分離媒体をマトリックスとして、対応した所望の共有結合連結
基を有する両性解離基前駆体と直接又は間接的な共有結合反応を行って、所望の両性解離
共有結合修飾層を生成する。ＰＣＲ増幅検出を必要とする核酸を抽出するとき、抽出され
る核酸におけるＰＣＲを阻害する妨害不純物の含有量を減少させるために、使用される両
性解離型イオン交換分離媒体については小分子物質に対して十分に低い非特異的吸着が求
められる。ポリエチレングリコールは中性親水性重合体でありながら、一般的に使用され
る抗タンパク質非特異的吸着性を有する修飾剤である。しかし、ポリエチレングリコール
は本質的には界面活性剤であり、クロロホルムでの溶解度が極めて高く、疎水性小分子物
質に対する非特異的吸着が強い。このため、ポリエチレングリコール誘導体を用いて修飾
を行い又は重合して直接調製した分離媒体は、本発明の前記両性解離型イオン交換媒体を
調製するためのマトリックスとして適しておらず、ポリエチレングリコールに対応したカ
ルボキシ基及び一級アミン基誘導体も本発明の前記両性解離基前駆体として好適ではない
。特に、ポリエチレングリコールの分子が線状直鎖であり、互いのサイズ排除が高いため
、両性解離基の修飾度を向上させるのに役立てず、さらに得られた両性解離分離媒体の分
離容量を向上させにくく、また修飾度を確保することで疎水性小分子に対する非特異的吸
着を低下させることも不可能になる。このため、ポリエチレングリコール誘導体を直接重
合して、表面に両性解離基を有するイオン交換分離媒体を調製し、又はポリエチレングリ
コール誘導体で修飾することにより得られた両性解離基を有するイオン交換分離媒体は、
核酸の抽出やタンパク質の分離に向いていない。したがって、本発明の前記共有結合修飾
による両性解離型イオン交換分離媒体の調製手段は、表面に直鎖状高分子重合体を有する
が、両性解離基がない分離媒体マトリックスに適用できない。直鎖状高分子を重合して得
られた分離媒体は、ｐＨ３．０～１１．０で表面に両性解離基を有するとしても、本発明
の前記両性解離型イオン交換分離媒体ではない。
有し両性解離修飾層のない分離媒体をマトリックスとして、対応した所望の共有結合連結
基を有する両性解離基前駆体と直接又は間接的な共有結合反応を行って、所望の両性解離
共有結合修飾層を生成する。ＰＣＲ増幅検出を必要とする核酸を抽出するとき、抽出され
る核酸におけるＰＣＲを阻害する妨害不純物の含有量を減少させるために、使用される両
性解離型イオン交換分離媒体については小分子物質に対して十分に低い非特異的吸着が求
められる。ポリエチレングリコールは中性親水性重合体でありながら、一般的に使用され
る抗タンパク質非特異的吸着性を有する修飾剤である。しかし、ポリエチレングリコール
は本質的には界面活性剤であり、クロロホルムでの溶解度が極めて高く、疎水性小分子物
質に対する非特異的吸着が強い。このため、ポリエチレングリコール誘導体を用いて修飾
を行い又は重合して直接調製した分離媒体は、本発明の前記両性解離型イオン交換媒体を
調製するためのマトリックスとして適しておらず、ポリエチレングリコールに対応したカ
ルボキシ基及び一級アミン基誘導体も本発明の前記両性解離基前駆体として好適ではない
。特に、ポリエチレングリコールの分子が線状直鎖であり、互いのサイズ排除が高いため
、両性解離基の修飾度を向上させるのに役立てず、さらに得られた両性解離分離媒体の分
離容量を向上させにくく、また修飾度を確保することで疎水性小分子に対する非特異的吸
着を低下させることも不可能になる。このため、ポリエチレングリコール誘導体を直接重
合して、表面に両性解離基を有するイオン交換分離媒体を調製し、又はポリエチレングリ
コール誘導体で修飾することにより得られた両性解離基を有するイオン交換分離媒体は、
核酸の抽出やタンパク質の分離に向いていない。したがって、本発明の前記共有結合修飾
による両性解離型イオン交換分離媒体の調製手段は、表面に直鎖状高分子重合体を有する
が、両性解離基がない分離媒体マトリックスに適用できない。直鎖状高分子を重合して得
られた分離媒体は、ｐＨ３．０～１１．０で表面に両性解離基を有するとしても、本発明
の前記両性解離型イオン交換分離媒体ではない。
【0035】
勿論、高密度の両性解離修飾層を生成することで、疎水性小分子への非特異的吸着を低下
させるとともに分離容量を増大するために、小分子両性解離基前駆体、及び室温下での収
率が高いライゲーション反応が必要である。高密度修飾層を形成して疎水性物質への非特
異的吸着を低下させるために、修飾用の両性解離基前駆体について分子量を５００Ｄａｌ
ｔｏｎ以下に制御し且つ疎水性の大体積置換基をなくする。アミド形成反応及びメルカプ
ト置換反応は、無酸素・無水のような苛酷な反応条件を必要としないため、修飾にとって
好適なライゲーション反応である。両性解離修飾層のない分離媒体であるマトリックスの
表面に両性解離修飾層を生成するとき、修飾対象の分離媒体のマトリックスの表面におけ
る脂肪族カルボキシ基、脂肪族一級アミン基／二級アミン基、メルカプト反応性基を反応
基とするのが適しており、それに対応して、両性解離基前駆体は、脂肪族一級アミン、脂
肪族メルカプトを共有結合連結基とする必要がある。前記のとおり、両性解離共有結合修
飾層のない分離媒体をマトリックスとすると、その表面に含まれる反応基は、脂肪族カル
ボキシ基、脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基、メルカプトで求核置換さ
れて分離媒体の表面から離脱しやすい小体積脱離基を含有するメルカプト反応性基のうち
の１種であり、このような小体積脱離基としては、ハロゲンイオン、ｐ－トルエンスルホ
ン酸根が含まれる。両性解離共有結合修飾層のない分離媒体の表面に反応基がない場合、
誘導反応により上記反応基を取得した後、マトリックスとして共有結合修飾に用いる。
させるとともに分離容量を増大するために、小分子両性解離基前駆体、及び室温下での収
率が高いライゲーション反応が必要である。高密度修飾層を形成して疎水性物質への非特
異的吸着を低下させるために、修飾用の両性解離基前駆体について分子量を５００Ｄａｌ
ｔｏｎ以下に制御し且つ疎水性の大体積置換基をなくする。アミド形成反応及びメルカプ
ト置換反応は、無酸素・無水のような苛酷な反応条件を必要としないため、修飾にとって
好適なライゲーション反応である。両性解離修飾層のない分離媒体であるマトリックスの
表面に両性解離修飾層を生成するとき、修飾対象の分離媒体のマトリックスの表面におけ
る脂肪族カルボキシ基、脂肪族一級アミン基／二級アミン基、メルカプト反応性基を反応
基とするのが適しており、それに対応して、両性解離基前駆体は、脂肪族一級アミン、脂
肪族メルカプトを共有結合連結基とする必要がある。前記のとおり、両性解離共有結合修
飾層のない分離媒体をマトリックスとすると、その表面に含まれる反応基は、脂肪族カル
ボキシ基、脂肪族一級アミン基及び／又は脂肪族二級アミン基、メルカプトで求核置換さ
れて分離媒体の表面から離脱しやすい小体積脱離基を含有するメルカプト反応性基のうち
の１種であり、このような小体積脱離基としては、ハロゲンイオン、ｐ－トルエンスルホ
ン酸根が含まれる。両性解離共有結合修飾層のない分離媒体の表面に反応基がない場合、
誘導反応により上記反応基を取得した後、マトリックスとして共有結合修飾に用いる。
【0036】
四級アミン及びスルホン酸からなる両性イオン対で表面を修飾して、表面が親水性である分離媒体を調製する特許技術（中国発明特許ＺＬ２０１６１０９６３７６４．Ｘ）によって得られた製品ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ（中国発明特許ＺＬ２０１６１０９６３７６４．Ｘでは、「ＭＳＰ－ＺＷ－ＺＷ－ＣＯＯＨ」と記載。製品名の変更により、現在の製品名は「ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ」である）はミクロン磁気ビーズであり、その表面には、ほかの物質をカップリングするための脂肪族カルボキシ基が官能基として機能する以外、残りが四級アミン及び隣接するスルホン酸からなるｐＨ２．０－１３．０で両性解離を示さないので正味荷電がゼロである両性イオン対修飾基であり、その表面の疎水性物質及びタンパク質への非特異的吸着がすべて低く、本発明の前記両性解離型イオン交換分離媒体を調製するのに必要な、両性解離修飾層のない分離媒体マトリックスである。それに対応して、この分離媒体の表面における脂肪族カルボキシ基を活性化させ（図２）、次に、さらに誘導して、各種ｐＩｍを有する両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズのシリーズを調製している（ 図３ 、図４ ） 。これらイオン交換分離媒体は、弱酸性ｐＨでは表面の正電荷による対象物質の静電吸引により核酸を吸着させ、弱アルカリ性ｐＨでは静電反発により被吸着核酸を効率的に放出し、もしくは、適切な中性及びアルカリ性のｐＨでは塩基性タンパク質を吸着させる一方、弱酸又は強アルカリ性の条件で吸着されたタンパク質を放出し、これは、溶解しにくいタンパク質にとって好適なイオン交換精製方法である。この新規イオン交換分離媒体は、核酸に対してより高い選択性を有し、核酸に対する分離容量がサーモエレクトロン株式会社製のＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙｏｎｅＳｉｌａｎｅシラノール磁気ビーズの１０倍より高く、分離選択性がさらに高いため、抽出される核酸における阻害性不純物が減少し、ＰＣＲテンプレートとしての能力がシラノール磁気ビーズによる核酸より高い。このミクロン磁気ビーズは、ｐＩｓが９．０に近いが、中性時に難溶性になるピキア・グイリエルモンディウリカーゼの高速精製にも適用でき、結合酵素の活性溶出率が８０％に近く、古典的なカチオン交換剤よりもはるかに優れている。しかし、両性解離型イオン交換分離媒体をタンパク質の分離に用いる場合、タンパク質の飽和吸着によって分離媒体の表面の両性解離基の解離状態での溶出液ｐＨへの応答に悪影響を与えるため、溶出能力を確保するのに、大量の溶出液を用いてバッチ式で溶出しなければならない。
【0037】
また、両性解離型イオン交換分離媒体を生産する過程に、製品の分離容量を正確にキャリ
ブレーションして製品の品質を制御する必要がある。このようなイオン交換分離媒体の核
酸類対象物質に対する分離容量のキャリブレーションは、核酸の抽出濃縮後に高感度分析
を行うときに試験再現性を確実にするために必要な前提条件である。本発明の前記両性解
離型イオン交換分離媒体の性質であるｐＩｍを確認するために、荷電対象物質に対する分
離容量及び溶出能力の吸着ｐＨに伴う変化を測定するための簡単な方法が必要とされる。
このような製品による吸着分離により得られた核酸の定量的測定はその吸着分離容量をキ
ャリブレーションするための最も直接的な方法である。核酸の定量化のために蛍光定量的
ＰＣＲすなわちｑＰＣＲが必要であり、測定させた所定信号に達する最小サイクル数がテ
ンプレート核酸の量の対数に反比例するが、測定精度が低く、コストが高く、分析に時間
がかかり、このため、生産過程における品質制御に適用できないし、本発明の前記新型イ
オン交換分離媒体のｐＩｍなどの特性のキャラクタリゼーションにも向いていない。分光
光度法は簡単且つ迅速に測定でき、吸収測定の標準化が容易であり且つ再現性に優れ、製
品の品質キャリブレーション及びトレーシング、本発明の前記両性解離型イオン交換分離
媒体の両性解離性質のキャラクタリゼーションに適している。核酸が強い紫外線吸収を有
するが、通常、吸着核酸の溶出過程に各種不純物が紫外吸収測定を妨害する上に、核酸を
プローブとするとコストが高く且つ安定性が低い。発色プローブは分光光度法により容易
に測定可能で安定的に荷電した有色小分子有機物であり、イオン交換分離媒体の分離容量
のキャリブレーション及びそのｐＩｍ性質のキャラクタリゼーションを迅速且つ簡単に実
施できる。本発明では、可視光の吸収が強く且つ解離しやすい水溶性芳香有機物を発色プ
ローブとして、室温下でｐＨを調整することによって、プローブを効率的に吸着又は溶出
し、溶出液におけるプローブの可視光への強吸収により、イオン交換分離媒体の吸着分離
容量を迅速に精度よくキャリブレーションし、製品の品質制御、及び本発明の前記両性解
離型イオン交換分離媒体のｐＩｍ性質（表１）のキャラクタリゼーションに用いたところ
、得られた両性解離型イオン交換分離媒体の特別な両性解離性質及び溶出能力が確認され
た。
ブレーションして製品の品質を制御する必要がある。このようなイオン交換分離媒体の核
酸類対象物質に対する分離容量のキャリブレーションは、核酸の抽出濃縮後に高感度分析
を行うときに試験再現性を確実にするために必要な前提条件である。本発明の前記両性解
離型イオン交換分離媒体の性質であるｐＩｍを確認するために、荷電対象物質に対する分
離容量及び溶出能力の吸着ｐＨに伴う変化を測定するための簡単な方法が必要とされる。
このような製品による吸着分離により得られた核酸の定量的測定はその吸着分離容量をキ
ャリブレーションするための最も直接的な方法である。核酸の定量化のために蛍光定量的
ＰＣＲすなわちｑＰＣＲが必要であり、測定させた所定信号に達する最小サイクル数がテ
ンプレート核酸の量の対数に反比例するが、測定精度が低く、コストが高く、分析に時間
がかかり、このため、生産過程における品質制御に適用できないし、本発明の前記新型イ
オン交換分離媒体のｐＩｍなどの特性のキャラクタリゼーションにも向いていない。分光
光度法は簡単且つ迅速に測定でき、吸収測定の標準化が容易であり且つ再現性に優れ、製
品の品質キャリブレーション及びトレーシング、本発明の前記両性解離型イオン交換分離
媒体の両性解離性質のキャラクタリゼーションに適している。核酸が強い紫外線吸収を有
するが、通常、吸着核酸の溶出過程に各種不純物が紫外吸収測定を妨害する上に、核酸を
プローブとするとコストが高く且つ安定性が低い。発色プローブは分光光度法により容易
に測定可能で安定的に荷電した有色小分子有機物であり、イオン交換分離媒体の分離容量
のキャリブレーション及びそのｐＩｍ性質のキャラクタリゼーションを迅速且つ簡単に実
施できる。本発明では、可視光の吸収が強く且つ解離しやすい水溶性芳香有機物を発色プ
ローブとして、室温下でｐＨを調整することによって、プローブを効率的に吸着又は溶出
し、溶出液におけるプローブの可視光への強吸収により、イオン交換分離媒体の吸着分離
容量を迅速に精度よくキャリブレーションし、製品の品質制御、及び本発明の前記両性解
離型イオン交換分離媒体のｐＩｍ性質（表１）のキャラクタリゼーションに用いたところ
、得られた両性解離型イオン交換分離媒体の特別な両性解離性質及び溶出能力が確認され
た。
【0038】
本発明はさらに、両性解離型イオン交換分離媒体の使用方法を開示し、
前記両性解離型イオン交換分離媒体を使用して対象物質を吸着して分離するとき、対象物
質が水素イオンを放出する解離定数の常用対数をｐＩｓ又は対象物質の等電点をｐＩｓと
し、使用過程において、
ａ．その等電点ｐＩｍと対象物質のｐＩｓの差が１．０以上である両性解離型イオン交換
分離媒体を選択する特徴と、
ｂ．対象物質を吸着する場合、対象物質のｐＩｓと両性解離型イオン交換分離媒体の等電
点ｐＩｍの間にあり且つ対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体のｐＩｍの
いずれとの差も０．３より大きい環境ｐＨを選択して、イオン交換分離媒体の表面の正味
荷電と対象物質の正味荷電を逆にして、静電吸引によって対象物質を吸着する特徴と、
ｃ．対象物質を溶出する場合、溶出液の（環境）ｐＨが等電点ｐＩｍより低いとき、環境
ｐＨを、対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち低い
方よりも少なくとも０．３０低くし、溶出環境が等電点ｐＩｍより高いとき、溶出液の（
環境）ｐＨを、対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのう
ち高い方よりも少なくとも０．３０高くし、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味
荷電と対象物質の正味荷電を同じにして、静電反発によって対象物質を溶出し、水溶性一
価中性無機塩を加えて溶出を促進する特徴とを有する。
前記両性解離型イオン交換分離媒体を使用して対象物質を吸着して分離するとき、対象物
質が水素イオンを放出する解離定数の常用対数をｐＩｓ又は対象物質の等電点をｐＩｓと
し、使用過程において、
ａ．その等電点ｐＩｍと対象物質のｐＩｓの差が１．０以上である両性解離型イオン交換
分離媒体を選択する特徴と、
ｂ．対象物質を吸着する場合、対象物質のｐＩｓと両性解離型イオン交換分離媒体の等電
点ｐＩｍの間にあり且つ対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体のｐＩｍの
いずれとの差も０．３より大きい環境ｐＨを選択して、イオン交換分離媒体の表面の正味
荷電と対象物質の正味荷電を逆にして、静電吸引によって対象物質を吸着する特徴と、
ｃ．対象物質を溶出する場合、溶出液の（環境）ｐＨが等電点ｐＩｍより低いとき、環境
ｐＨを、対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち低い
方よりも少なくとも０．３０低くし、溶出環境が等電点ｐＩｍより高いとき、溶出液の（
環境）ｐＨを、対象物質のｐＩｓ及び両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのう
ち高い方よりも少なくとも０．３０高くし、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の正味
荷電と対象物質の正味荷電を同じにして、静電反発によって対象物質を溶出し、水溶性一
価中性無機塩を加えて溶出を促進する特徴とを有する。
【0039】
本発明はさらに、両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量のキャリブレーション方法を
開示し、
ａ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、解離
定数又は等電点がｐＫａであり、分子量が６００Ｄａｌｔｏｎ未満で、可視光吸収ピーク
での吸収係数が１４ｍＭ－１．ｃｍ－１より大きく、ｐＨ３．０－１１．０での溶解度が
５．０μｍｏｌ／Ｌ以上で且つｐＨ３．０－１１．０で解離した後の正味荷電が正又は負
である有色有機物を発色プローブとし、
ｂ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするときに、
ｂ１．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが４．０－６．０である場合、解離
定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも
２．０大きいカチオンプローブ、又は解離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換
分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも２．０小さいアニオンプローブを用いる形態と
、
ｂ２．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが６．０－１０．０である場合、解
離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくと
も２．０小さいアニオンプローブを用いる形態とを有し、
ｃ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、吸着
する場合、解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの
間にあり且つ両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍとの差が１．３以上であると
ともに発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａとの差が０．５以上である環境ｐＨに対
応したバッファを用いて、両性解離型イオン交換分離媒体に静電吸引によって発色プロー
ブを吸着させ、溶出する場合、発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イ
オン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち高い方よりも少なくとも１．３高く又は低い方よ
りも少なくとも１．３低い環境ｐＨを選択して、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の
正味荷電と発色プローブの正味荷電を同じにして静電反発によって発色プローブを溶出し
、溶出液での発色プローブの吸収を測定して、発色プローブに対する分離容量を換算し、
ｐＨによる両性解離型イオン交換分離媒体の発色プローブに対する分離容量への影響を測
定した結果、解離後の正味荷電が負である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最
小ｐＨ、解離後の正味荷電が正である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最大ｐ
Ｈが、両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの近似値である。
開示し、
ａ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、解離
定数又は等電点がｐＫａであり、分子量が６００Ｄａｌｔｏｎ未満で、可視光吸収ピーク
での吸収係数が１４ｍＭ－１．ｃｍ－１より大きく、ｐＨ３．０－１１．０での溶解度が
５．０μｍｏｌ／Ｌ以上で且つｐＨ３．０－１１．０で解離した後の正味荷電が正又は負
である有色有機物を発色プローブとし、
ｂ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするときに、
ｂ１．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが４．０－６．０である場合、解離
定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも
２．０大きいカチオンプローブ、又は解離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換
分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくとも２．０小さいアニオンプローブを用いる形態と
、
ｂ２．両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍが６．０－１０．０である場合、解
離定数又は等電点ｐＫａが両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍよりも少なくと
も２．０小さいアニオンプローブを用いる形態とを有し、
ｃ．前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量をキャリブレーションするとき、吸着
する場合、解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの
間にあり且つ両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍとの差が１．３以上であると
ともに発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａとの差が０．５以上である環境ｐＨに対
応したバッファを用いて、両性解離型イオン交換分離媒体に静電吸引によって発色プロー
ブを吸着させ、溶出する場合、発色プローブの解離定数又は等電点ｐＫａと両性解離型イ
オン交換分離媒体の等電点ｐＩｍのうち高い方よりも少なくとも１．３高く又は低い方よ
りも少なくとも１．３低い環境ｐＨを選択して、両性解離型イオン交換分離媒体の表面の
正味荷電と発色プローブの正味荷電を同じにして静電反発によって発色プローブを溶出し
、溶出液での発色プローブの吸収を測定して、発色プローブに対する分離容量を換算し、
ｐＨによる両性解離型イオン交換分離媒体の発色プローブに対する分離容量への影響を測
定した結果、解離後の正味荷電が負である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最
小ｐＨ、解離後の正味荷電が正である発色プローブに対する分離容量がゼロになる最大ｐ
Ｈが、両性解離型イオン交換分離媒体の等電点ｐＩｍの近似値である。
【0040】
即ち、両性解離型イオン交換分離媒体の発色プローブに対する分離容量のｐＨに伴う変化
、解離して負イオンを生成する発色プローブに対する分離容量がゼロになる最小ｐＨ、解
離して正イオンを生成する発色プローブに対する分離容量がゼロになる最大ｐＨ、即ちそ
のｐＩｍを測定する。
、解離して負イオンを生成する発色プローブに対する分離容量がゼロになる最小ｐＨ、解
離して正イオンを生成する発色プローブに対する分離容量がゼロになる最大ｐＨ、即ちそ
のｐＩｍを測定する。
【0041】
発色プローブの吸着後に残った発色プローブの量を測定することによって、発色プローブ
の吸着量を推定できる。次に、溶出液における発色プローブの量を測定すると、溶出液ｐ
Ｈによる溶出能力への影響を比較し、それによって、本発明の前記静電反発による荷電物
質の溶出効果を確認できる。
の吸着量を推定できる。次に、溶出液における発色プローブの量を測定すると、溶出液ｐ
Ｈによる溶出能力への影響を比較し、それによって、本発明の前記静電反発による荷電物
質の溶出効果を確認できる。
【0042】
四級アミン型カチオン発色プローブが少ないが、スルホン酸型アニオン発色プローブが多
数ある。アニオン色素としてのアシッドレッド１３は、本発明の前記両性解離型イオン交
換分離媒体の分離容量のキャリブレーション／キャラクタリゼーション及びｐＩｍの測定
のための発色プローブの代表例である。
数ある。アニオン色素としてのアシッドレッド１３は、本発明の前記両性解離型イオン交
換分離媒体の分離容量のキャリブレーション／キャラクタリゼーション及びｐＩｍの測定
のための発色プローブの代表例である。
【0043】
以下、使用実施例を説明し、実施例に使用される試薬及び材料は以下のとおりである。
【0044】
シラノールミクロン磁気ビーズ：ＴＨｅｒｍｏ－ＦｉｓＨｅｒ（サーモエレクトロン）社
、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙｏｎｅＳｉｌａｎｅシラノール磁気ビーズ（カタログ番号３
７００２Ｄ）；
磁気分離ラック：江蘇無錫百運ナノ科技有限公司製、８ウェル磁気分離ラック；
従来のＰＣＲ装置：ＢｉｏｒａｄＴ１００サーマルサイクラー；
蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲ装置：Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ；
カルボキシ磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ：中国発明特許（ＺＬ２０１６１０９
６３７６４．Ｘ）のように表面に四級アミン及びスルホン酸イオン対を含む修飾層を製造
しているため、カルボキシ磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨはｐＨ２．０－１２．
０では中性になる。
ピキア・グイリエルモンディウリカーゼＲＭＧＵ発現プラスミド：配列Ｇｅｎｂａｎｋ参
照、登録番号ＫＹ７０６２４４、等電点８．９；全合成したコード配列と発現ベクターｐ
ＤＥ１を連結してタグフリー発現プラスミドを得て、該プラスミド及びそのタンパク質を
ＲＭＧＵと呼ぶ。
アシッドレッド１３ストック溶液：蒸留水で２００ｍＭとなるように溶解して、０．２２
μｍ精密ろ過膜でろ過して４℃で保管し、使用時に希釈する。
核酸吸着バッファ：０．２０ｍ酢酸－酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ３．６－５．８；２
０ｍＭｍＥＳ、ｐＨ６．０～６．８；２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０～８．０；説明し
ない場合、ｐＨ３．６の核酸吸着バッファを用いる。
核酸溶出バッファ：２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０～９．０；説明しない場合、
ｐＨ８．９の核酸溶出バッファを用いる。
磁気ビーズ洗浄バッファ：ｐＨ３．６、０．２０ｍ酢酸－酢酸ナトリウムバッファ；
核酸の定量化：説明しない場合、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより２６０ｎｍでの吸収を測定して
定量化させる。
核酸電気泳動：臭化エチジウムとアガロースゲルを予備混合して電気泳動を行い、核酸タ
ンパク質イメージャで記録した。検出限界は約８０ｎｇである。
ウリカーゼ活性測定液：０．２０ｍホウ砂ｐＨ９．２、０．１０ｍＭ尿酸；１分間あたり
１．０ミクロモルの底質を消費する場合を１単位とする。
細胞溶解液１：ＲＭＧＵを組み換え発現させた大腸菌細胞を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．６で溶解する。
タンパク質溶出液１：ｐＨ１０．０グリシン－水酸化ナトリウムバッファ；
タンパク質電気泳動：従来のＳＤＳ－ＰＡＧＥ；説明しない場合、タンパク質を総量で５
ｇ注入する。
タンパク質濃度の測定：Ｂｒａｄｆｏｒｄの色素結合法、又はＮａｎｏｄｒｏｐにより２
８０ｎｍでの吸収を測定する。
使用される化学試薬はＴａｎｓｏｏプラットフォーム及びアラジン試薬ウェブサイトから
購入し、純度が９５％以上である。
、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙｏｎｅＳｉｌａｎｅシラノール磁気ビーズ（カタログ番号３
７００２Ｄ）；
磁気分離ラック：江蘇無錫百運ナノ科技有限公司製、８ウェル磁気分離ラック；
従来のＰＣＲ装置：ＢｉｏｒａｄＴ１００サーマルサイクラー；
蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲ装置：Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ；
カルボキシ磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ：中国発明特許（ＺＬ２０１６１０９
６３７６４．Ｘ）のように表面に四級アミン及びスルホン酸イオン対を含む修飾層を製造
しているため、カルボキシ磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨはｐＨ２．０－１２．
０では中性になる。
ピキア・グイリエルモンディウリカーゼＲＭＧＵ発現プラスミド：配列Ｇｅｎｂａｎｋ参
照、登録番号ＫＹ７０６２４４、等電点８．９；全合成したコード配列と発現ベクターｐ
ＤＥ１を連結してタグフリー発現プラスミドを得て、該プラスミド及びそのタンパク質を
ＲＭＧＵと呼ぶ。
アシッドレッド１３ストック溶液：蒸留水で２００ｍＭとなるように溶解して、０．２２
μｍ精密ろ過膜でろ過して４℃で保管し、使用時に希釈する。
核酸吸着バッファ：０．２０ｍ酢酸－酢酸ナトリウムバッファ、ｐＨ３．６－５．８；２
０ｍＭｍＥＳ、ｐＨ６．０～６．８；２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０～８．０；説明し
ない場合、ｐＨ３．６の核酸吸着バッファを用いる。
核酸溶出バッファ：２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０～９．０；説明しない場合、
ｐＨ８．９の核酸溶出バッファを用いる。
磁気ビーズ洗浄バッファ：ｐＨ３．６、０．２０ｍ酢酸－酢酸ナトリウムバッファ；
核酸の定量化：説明しない場合、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより２６０ｎｍでの吸収を測定して
定量化させる。
核酸電気泳動：臭化エチジウムとアガロースゲルを予備混合して電気泳動を行い、核酸タ
ンパク質イメージャで記録した。検出限界は約８０ｎｇである。
ウリカーゼ活性測定液：０．２０ｍホウ砂ｐＨ９．２、０．１０ｍＭ尿酸；１分間あたり
１．０ミクロモルの底質を消費する場合を１単位とする。
細胞溶解液１：ＲＭＧＵを組み換え発現させた大腸菌細胞を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．６で溶解する。
タンパク質溶出液１：ｐＨ１０．０グリシン－水酸化ナトリウムバッファ；
タンパク質電気泳動：従来のＳＤＳ－ＰＡＧＥ；説明しない場合、タンパク質を総量で５
ｇ注入する。
タンパク質濃度の測定：Ｂｒａｄｆｏｒｄの色素結合法、又はＮａｎｏｄｒｏｐにより２
８０ｎｍでの吸収を測定する。
使用される化学試薬はＴａｎｓｏｏプラットフォーム及びアラジン試薬ウェブサイトから
購入し、純度が９５％以上である。
【0045】
以下、具体的な実施例を説明する。
【0046】
実施例１：代表的な構造形態を有する両性解離型イオン交換分離媒体の調製
ステップ１、下記溶液を準備する（同時に除菌を行うように０．２２ｕｍろ過膜を用いて
ろ過）：
（１）リジン溶液：１００ｍＭリジンを５０ｍＭ塩酸でｐＨ６．０にして、水で３０ｍＭ
に希釈し、ろ過して使用に備える。
（２）ヒスチジン溶液：５０ｍＭヒスチジン溶液を、１０ｍＭ塩酸でｐＨ６．０に調整し
て、３０ｍＭに希釈する。
（３）グリシン溶液：１００ｍＭグリシン溶液を希重炭酸ナトリウムでｐＨ６．０に調整
して、水で３０ｍＭに希釈し、ろ過して使用に備える。
（４）Ｎ,Ｎ－ジメチルエチレンジアミン溶液：１０ｍＭＮ,Ｎ－ジメチルエチレンジアミ
ンを０．１０ｍ塩酸でｐＨ６．０に調整し、１０ｍＭに希釈する。
（５）システイン溶液：５０ｍＭシステイン水溶液を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウムでｐＨ
６．０に調整して、１０ｍＭに希釈し、ろ過して使用に備える（調製後３０ｍｉｎ内に使
用）。
（６）メルカプトエチルアミン溶液：２０ｍＭメルカプトエチルアミン水溶液を、１０ｍ
Ｍ塩酸でｐＨ６．０に調整して、１０ｍＭに希釈する（調製後３０ｍｉｎ内に使用）。
（７）メルカプト酢酸溶液：２０ｍＭメルカプト酢酸水溶液を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウ
ムでｐＨ６．０に調整して、１０ｍＭに希釈する（調製後３０ｍｉｎ内に使用）。
（８）２－メルカプトイミダゾール溶液：２０ｍＭ２－メルカプトイミダゾール溶液を、
１０ｍＭ重炭酸ナトリウムでｐＨ６．０に調整して、１０ｍＭに希釈する（調製後３０ｍ
ｉｎ内に使用）。
ステップ２、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨのカルボキシ基を活性化させて活性エステルに
する。
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨを乾燥させたＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドＤＭＦで繰り返
して洗浄し、次に、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨを乾燥ＤＭＦで１０ｇ／Ｌになるまで懸
濁させ、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨの質量を基準にして、３倍のジシクロヘキシルカル
ボジイミドＤＣＣ、１．５倍のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ－ＯＨ）を加えて
、撹拌して均一に混合し、２８～３５℃で連続的に混合して～１２Ｈ反応させ、１回にＦ
ＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ １ｇあたりＤＭＦ １００ｍｌを添加して活性化後の磁気ビ
ーズを３回洗浄し、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ磁気ビーズのＮＨＳ活性エステルを得て
、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳとする（図２）。
ステップ３、アミドを形成するように活性エステルと連結して共有結合修飾を行い、両性
解離型イオン交換分離媒体を得る（図３）。
（１）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをリジン溶液７０ｍｌとグリシン溶液３０ｍ
ｌの混合物に懸濁させて修飾し、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して１３Ｈ反応さ
せ、１ｇあたりの磁気ビーズを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン
交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡとする。
（２）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをリジン溶液１００ｍｌに懸濁させて、共有
結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ
１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズ
を得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢとする。
（３）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをリジン溶液７０ｍｌとＮ,Ｎ－ジメチルエ
チレンジアミン溶液３０ｍｌの混合物に懸濁させて共有結合修飾を行い、室温下で上記修
飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回
洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－
ＺＥＷＣとする。
（４）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをヒスチジン溶液１００ｍｌに懸濁させて、
共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気
ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気
ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＤとする。
（５）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをＮ,Ｎ－ジメチルエチレンジアミン溶液１
００ｍｌに懸濁させて、共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して
１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イ
オン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＥとする。
ステップ４、メルカプト反応性基と連結して共有結合修飾を行い、両性解離型イオン交換
分離媒体を得る（図４）。
（１）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌに懸濁さ
せて、モノクロロアセチルエチレンジアミン０．５ｇを加え、室温で振とう反応を４Ｈ行
って、クロロアセチルをメルカプト反応性基とした修飾対象の分離媒体を得て、単にＦＢ
Ｄ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌとする。
（２）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをシステイン溶液７０ｍｌとメルカプト
酢酸溶液３０ｍｌの混合物に懸濁させて修飾し、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌し
て～１３ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解
離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ１とする。
（３）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをシステイン溶液１００ｍｌに懸濁させ
て、共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、
磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン
磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ２とする。
（４）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをシステイン溶液７０ｍｌとメルカプト
エチルアミン溶液３０ｍｌの混合物に懸濁させて共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾
系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗
浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－Ｚ
ＥＷ３とする。
（５）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをメルカプト酢酸溶液５０ｍｌと２－メ
ルカプトイミダゾール溶液５０ｍｌの混合物に懸濁させて共有結合修飾を行い、室温下で
上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌ
で３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－Ｍ
ＳＰ－ＺＥＷ４とする。
（６）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをメルカプトエチルアミン溶液１００ｍ
ｌに懸濁させて、共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３
Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン
交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ５とする。
（７）勿論、本調製実施例において調製された製品は、両性解離型イオン交換分離媒体の
調製方法を説明するために過ぎず、材料を、上記他の前記解離して負電荷を発生させる脂
肪族カルボキシ基、解離して正電荷を発生させる脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイ
ミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせに変更しても、本発明の目的を達成で
きる。
ステップ１、下記溶液を準備する（同時に除菌を行うように０．２２ｕｍろ過膜を用いて
ろ過）：
（１）リジン溶液：１００ｍＭリジンを５０ｍＭ塩酸でｐＨ６．０にして、水で３０ｍＭ
に希釈し、ろ過して使用に備える。
（２）ヒスチジン溶液：５０ｍＭヒスチジン溶液を、１０ｍＭ塩酸でｐＨ６．０に調整し
て、３０ｍＭに希釈する。
（３）グリシン溶液：１００ｍＭグリシン溶液を希重炭酸ナトリウムでｐＨ６．０に調整
して、水で３０ｍＭに希釈し、ろ過して使用に備える。
（４）Ｎ,Ｎ－ジメチルエチレンジアミン溶液：１０ｍＭＮ,Ｎ－ジメチルエチレンジアミ
ンを０．１０ｍ塩酸でｐＨ６．０に調整し、１０ｍＭに希釈する。
（５）システイン溶液：５０ｍＭシステイン水溶液を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウムでｐＨ
６．０に調整して、１０ｍＭに希釈し、ろ過して使用に備える（調製後３０ｍｉｎ内に使
用）。
（６）メルカプトエチルアミン溶液：２０ｍＭメルカプトエチルアミン水溶液を、１０ｍ
Ｍ塩酸でｐＨ６．０に調整して、１０ｍＭに希釈する（調製後３０ｍｉｎ内に使用）。
（７）メルカプト酢酸溶液：２０ｍＭメルカプト酢酸水溶液を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウ
ムでｐＨ６．０に調整して、１０ｍＭに希釈する（調製後３０ｍｉｎ内に使用）。
（８）２－メルカプトイミダゾール溶液：２０ｍＭ２－メルカプトイミダゾール溶液を、
１０ｍＭ重炭酸ナトリウムでｐＨ６．０に調整して、１０ｍＭに希釈する（調製後３０ｍ
ｉｎ内に使用）。
ステップ２、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨのカルボキシ基を活性化させて活性エステルに
する。
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨを乾燥させたＮ,Ｎ－ジメチルホルムアミドＤＭＦで繰り返
して洗浄し、次に、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨを乾燥ＤＭＦで１０ｇ／Ｌになるまで懸
濁させ、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨの質量を基準にして、３倍のジシクロヘキシルカル
ボジイミドＤＣＣ、１．５倍のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ－ＯＨ）を加えて
、撹拌して均一に混合し、２８～３５℃で連続的に混合して～１２Ｈ反応させ、１回にＦ
ＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ １ｇあたりＤＭＦ １００ｍｌを添加して活性化後の磁気ビ
ーズを３回洗浄し、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＯＨ磁気ビーズのＮＨＳ活性エステルを得て
、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳとする（図２）。
ステップ３、アミドを形成するように活性エステルと連結して共有結合修飾を行い、両性
解離型イオン交換分離媒体を得る（図３）。
（１）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをリジン溶液７０ｍｌとグリシン溶液３０ｍ
ｌの混合物に懸濁させて修飾し、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して１３Ｈ反応さ
せ、１ｇあたりの磁気ビーズを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン
交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡとする。
（２）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをリジン溶液１００ｍｌに懸濁させて、共有
結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ
１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズ
を得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢとする。
（３）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをリジン溶液７０ｍｌとＮ,Ｎ－ジメチルエ
チレンジアミン溶液３０ｍｌの混合物に懸濁させて共有結合修飾を行い、室温下で上記修
飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回
洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－
ＺＥＷＣとする。
（４）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをヒスチジン溶液１００ｍｌに懸濁させて、
共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気
ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気
ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＤとする。
（５）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをＮ,Ｎ－ジメチルエチレンジアミン溶液１
００ｍｌに懸濁させて、共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して
１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イ
オン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＥとする。
ステップ４、メルカプト反応性基と連結して共有結合修飾を行い、両性解離型イオン交換
分離媒体を得る（図４）。
（１）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＮＨＳ １ｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌに懸濁さ
せて、モノクロロアセチルエチレンジアミン０．５ｇを加え、室温で振とう反応を４Ｈ行
って、クロロアセチルをメルカプト反応性基とした修飾対象の分離媒体を得て、単にＦＢ
Ｄ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌとする。
（２）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをシステイン溶液７０ｍｌとメルカプト
酢酸溶液３０ｍｌの混合物に懸濁させて修飾し、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌し
て～１３ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解
離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ１とする。
（３）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをシステイン溶液１００ｍｌに懸濁させ
て、共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、
磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン
磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ２とする。
（４）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをシステイン溶液７０ｍｌとメルカプト
エチルアミン溶液３０ｍｌの混合物に懸濁させて共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾
系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗
浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－Ｚ
ＥＷ３とする。
（５）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをメルカプト酢酸溶液５０ｍｌと２－メ
ルカプトイミダゾール溶液５０ｍｌの混合物に懸濁させて共有結合修飾を行い、室温下で
上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌ
で３回洗浄し、対応した両性解離イオン交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－Ｍ
ＳＰ－ＺＥＷ４とする。
（６）ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＦＣＯＣＨ２Ｃｌ １ｇをメルカプトエチルアミン溶液１００ｍ
ｌに懸濁させて、共有結合修飾を行い、室温下で上記修飾系を中等速度で撹拌して～１３
Ｈ反応させ、磁気ビーズ１ｇを蒸留水１００ｍｌで３回洗浄し、対応した両性解離イオン
交換ミクロン磁気ビーズを得て、単にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷ５とする。
（７）勿論、本調製実施例において調製された製品は、両性解離型イオン交換分離媒体の
調製方法を説明するために過ぎず、材料を、上記他の前記解離して負電荷を発生させる脂
肪族カルボキシ基、解離して正電荷を発生させる脂肪族一級、二級、三級アミン基及びイ
ミダゾリル基のうちの１種又は複数種の組み合わせに変更しても、本発明の目的を達成で
きる。
【0047】
実施例２：両性解離型イオン交換媒体によるアシッドレッド１３に対する吸着分離容量の
測定操作手順
ステップ１、ｐＨによるアシッドレッド１３の消光係数への影響を測定し、結果を図５に
示す。アシッドレッド１３の消光係数は、ｐＨ４．０－８．９では変化がなく、すべて１
８．０（ｍＭ）－１．ｃｍ－１である。以下、アシッドレッド１３にはすべてこの消光係
数を用いる。
ステップ２、両性解離型イオン交換分離媒体をｐＨ３．６のバッファで３回洗浄して、こ
のバッファに再懸濁させる。
ステップ３、アシッドレッド１３を吸着バッファで５．０ｍＭ以上に希釈する。
ステップ４、所定量のイオン交換分離媒体から水相を除去した後、吸着バッファ０．８０
ｍｌに再懸濁させ、５０μｌ以下のアシッドレッド１３の希釈溶液を加えて所望の最終濃
度にし、４次元ミキサーを用いて室温で５～１０ｍｉｎかけて連続的に軽く混合して均一
にする。
ステップ５、結合されたアシッドレッド１３を磁気分離して、洗浄バッファ０．８０ｍｌ
で磁気ビーズを２回洗浄し、磁気ビーズを溶出バッファ０．８０ｍｌに懸濁させて、４次
元ミキサーで５～１０ｍｉｎ振とうし、磁気ビーズを磁気除去して、上澄み液０．７０ｍ
ｌを用いて、５０６ｎｍでの吸収を測定する。
ステップ６、両性解離型イオン交換分離媒体によるアシッドレッド１３の分離容量のｐＨ
に伴う変化から、分離容量がゼロになる最大ｐＨを近似推定して、測定対象の両性解離型
イオン交換分離媒体のｐＩｍとする。
ステップ７、ｐＨ３．６の吸着バッファにおけるアシッドレッド１３に対する分離容量で
両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量を示し、各種表面が両性解離イオン交換基であ
る磁気ビーズの計算に用いる。
実施例３．吸着及び溶出条件による両性解離分離媒体の分離容量への影響（操作は実施例
２と同様）。
ステップ１、ｐＨ３．６で吸着させて、アシッドレッド１３を６０Ｍとし、溶出液のｐＨ
効果を測定して、表１に示す。
ｐＨ８．０－８．９では、溶出液は、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＣ及びＦＢＤ－ＭＳＰ－Ｚ
ＥＷ３のアシッドレッド１３に対する分離容量だけに強い影響を与えるが、ｐＨ＞８．９
では、影響の増加が低下した。以下、説明しない場合、吸着されたアシッドレッド１３又
は核酸のいずれも、ｐＨ８．９の溶出液を用いる。吸着前のアシッドレッド１３の量を全
量として、使用される洗浄条件で、洗浄液に存在するアシッドレッド１３の比率及び洗浄
による損失率が２％未満である。以上の澄み液におけるアシッドレッド１３の減少量が全
吸着量であり、ｐＨ８．９では、試験対象の両性解離イオン交換磁気ビーズの代表例によ
り吸着されたアシッドレッド１３の溶出率は、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＥ及びＦＢＤ－Ｍ
ＳＰ－ＺＥＷ５以外、すべて９５％より大きい。ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＥ及びＦＢＤ－
ＭＳＰ－ＺＥＷ５は、ｐＨ８．９での溶出率も２％未満である。これら結果から、ｐＨを
調整することにより表面の正味荷電を逆転させて荷電物質の溶出を促進できることが確認
された。
表１ 溶出液ｐＨによる２種の両性解離吸着分離磁気ビーズにより吸着されるアシッドレ
ッド１３の溶出収率への影響
＊：ｐＨ８．９での溶出効率が低すぎる。アシッドレッド１３吸着後の上澄み液の減少量
から分離容量を推定し、それに基づいてｐＩｍを推定する。
ステップ２、ｐＨ３．６では吸着、ｐＨ８．９では溶出を行い、吸着バッファにおけるア
シッドレッド１３の最終濃度を６０μＭとし、吸着分離量の用量効果関係を測定する。結
果から明らかなように、溶出液におけるアシッドレッド１３分離量は１６０μｇ以下のＦ
ＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢの量に対して線形応答を示した（図６）。しかも、ＦＢＤ－ＭＳ
Ｐ－ＺＥＷＡが０．１０ｍｇである場合、吸着反応系には異なる濃度のアシッドレッド１
３を用いたところ、得られた溶出液におけるアシッドレッド１３の量は吸着反応系の限ら
れた範囲内でのアシッドレッド１３の量に対して略線形応答を示した（図７）。これら結
果から、アシッドレッド１３を発色プローブとすることは、このような両性解離分離媒体
の分離容量のキャリブレーションに適用できることが確認され、且つ本発明で設計された
両性解離イオン交換剤は染色や製織廃液における水溶性染料の効率的な回収利用に適して
おり、再利用を容易に行うとともに、環境汚染を削減させることが認められた。
ステップ３、吸着反応ｐＨは両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量にも明らかな影響
を与え（表１）、代表的なデータを図８に示した。ｐＨ＞４．０では、磁気ビーズのアシ
ッドレッド３への分離容量はすべて低下し、このことから、その正電荷が持続的に減少す
ることを示した。最大分離容量になるのに、吸着反応系のｐＨをｐＨ３．６～４．０にす
る必要がある。アシッドレッド１３への分離容量がゼロに近い最小ｐＨはそのｐＩｍであ
り、以上から明らかなように、３種類の磁気ビーズの例のｐＩｍは明らかに異なる（図８
）。ｐＨ８．０では、図８における３種類の磁気ビーズのアシッドレッド１３に対する吸
着容量はいずれもゼロに近く、それは、この際の３種類の磁気ビーズの表面の正味荷電が
いずれも負であることを示した。これに基づいて調製された両性解離型イオン交換分離媒
体のｐＩｍを推定する。これらｐＩｍの差からも、溶出液のｐＨ効果が認められ、さらに
本発明の設計構想及び得られたイオン交換剤の使用が認められた（表１）。
ステップ４、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡ ０．１０ｍｇとアシッドレッド１３ ６０μＭ
、吸着系０．８０ｍｌｐＨ３．６、溶出液ｐＨ８．９ 合計０．８０ｍｌを用いて、ＦＢ
Ｄ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡを独立して希釈し、アシッドレッド１３に対する分離容量を繰り返
して測定した結果、（５５±２） μｍｏｌｅ／ｇ磁気ビーズ（ｎ＝５）であった。この
方法は、非常に高い精度を有し、本発明の前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量
のキャリブレーションに適していることが明らかになる。以下の実施例では、いずれも磁
気ビーズについて、ｐＨ３．６でのアシッドレッド１３に対する分離量を計算する。
測定操作手順
ステップ１、ｐＨによるアシッドレッド１３の消光係数への影響を測定し、結果を図５に
示す。アシッドレッド１３の消光係数は、ｐＨ４．０－８．９では変化がなく、すべて１
８．０（ｍＭ）－１．ｃｍ－１である。以下、アシッドレッド１３にはすべてこの消光係
数を用いる。
ステップ２、両性解離型イオン交換分離媒体をｐＨ３．６のバッファで３回洗浄して、こ
のバッファに再懸濁させる。
ステップ３、アシッドレッド１３を吸着バッファで５．０ｍＭ以上に希釈する。
ステップ４、所定量のイオン交換分離媒体から水相を除去した後、吸着バッファ０．８０
ｍｌに再懸濁させ、５０μｌ以下のアシッドレッド１３の希釈溶液を加えて所望の最終濃
度にし、４次元ミキサーを用いて室温で５～１０ｍｉｎかけて連続的に軽く混合して均一
にする。
ステップ５、結合されたアシッドレッド１３を磁気分離して、洗浄バッファ０．８０ｍｌ
で磁気ビーズを２回洗浄し、磁気ビーズを溶出バッファ０．８０ｍｌに懸濁させて、４次
元ミキサーで５～１０ｍｉｎ振とうし、磁気ビーズを磁気除去して、上澄み液０．７０ｍ
ｌを用いて、５０６ｎｍでの吸収を測定する。
ステップ６、両性解離型イオン交換分離媒体によるアシッドレッド１３の分離容量のｐＨ
に伴う変化から、分離容量がゼロになる最大ｐＨを近似推定して、測定対象の両性解離型
イオン交換分離媒体のｐＩｍとする。
ステップ７、ｐＨ３．６の吸着バッファにおけるアシッドレッド１３に対する分離容量で
両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量を示し、各種表面が両性解離イオン交換基であ
る磁気ビーズの計算に用いる。
実施例３．吸着及び溶出条件による両性解離分離媒体の分離容量への影響（操作は実施例
２と同様）。
ステップ１、ｐＨ３．６で吸着させて、アシッドレッド１３を６０Ｍとし、溶出液のｐＨ
効果を測定して、表１に示す。
ｐＨ８．０－８．９では、溶出液は、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＣ及びＦＢＤ－ＭＳＰ－Ｚ
ＥＷ３のアシッドレッド１３に対する分離容量だけに強い影響を与えるが、ｐＨ＞８．９
では、影響の増加が低下した。以下、説明しない場合、吸着されたアシッドレッド１３又
は核酸のいずれも、ｐＨ８．９の溶出液を用いる。吸着前のアシッドレッド１３の量を全
量として、使用される洗浄条件で、洗浄液に存在するアシッドレッド１３の比率及び洗浄
による損失率が２％未満である。以上の澄み液におけるアシッドレッド１３の減少量が全
吸着量であり、ｐＨ８．９では、試験対象の両性解離イオン交換磁気ビーズの代表例によ
り吸着されたアシッドレッド１３の溶出率は、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＥ及びＦＢＤ－Ｍ
ＳＰ－ＺＥＷ５以外、すべて９５％より大きい。ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＥ及びＦＢＤ－
ＭＳＰ－ＺＥＷ５は、ｐＨ８．９での溶出率も２％未満である。これら結果から、ｐＨを
調整することにより表面の正味荷電を逆転させて荷電物質の溶出を促進できることが確認
された。
表１ 溶出液ｐＨによる２種の両性解離吸着分離磁気ビーズにより吸着されるアシッドレ
ッド１３の溶出収率への影響
＊：ｐＨ８．９での溶出効率が低すぎる。アシッドレッド１３吸着後の上澄み液の減少量
から分離容量を推定し、それに基づいてｐＩｍを推定する。
ステップ２、ｐＨ３．６では吸着、ｐＨ８．９では溶出を行い、吸着バッファにおけるア
シッドレッド１３の最終濃度を６０μＭとし、吸着分離量の用量効果関係を測定する。結
果から明らかなように、溶出液におけるアシッドレッド１３分離量は１６０μｇ以下のＦ
ＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢの量に対して線形応答を示した（図６）。しかも、ＦＢＤ－ＭＳ
Ｐ－ＺＥＷＡが０．１０ｍｇである場合、吸着反応系には異なる濃度のアシッドレッド１
３を用いたところ、得られた溶出液におけるアシッドレッド１３の量は吸着反応系の限ら
れた範囲内でのアシッドレッド１３の量に対して略線形応答を示した（図７）。これら結
果から、アシッドレッド１３を発色プローブとすることは、このような両性解離分離媒体
の分離容量のキャリブレーションに適用できることが確認され、且つ本発明で設計された
両性解離イオン交換剤は染色や製織廃液における水溶性染料の効率的な回収利用に適して
おり、再利用を容易に行うとともに、環境汚染を削減させることが認められた。
ステップ３、吸着反応ｐＨは両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量にも明らかな影響
を与え（表１）、代表的なデータを図８に示した。ｐＨ＞４．０では、磁気ビーズのアシ
ッドレッド３への分離容量はすべて低下し、このことから、その正電荷が持続的に減少す
ることを示した。最大分離容量になるのに、吸着反応系のｐＨをｐＨ３．６～４．０にす
る必要がある。アシッドレッド１３への分離容量がゼロに近い最小ｐＨはそのｐＩｍであ
り、以上から明らかなように、３種類の磁気ビーズの例のｐＩｍは明らかに異なる（図８
）。ｐＨ８．０では、図８における３種類の磁気ビーズのアシッドレッド１３に対する吸
着容量はいずれもゼロに近く、それは、この際の３種類の磁気ビーズの表面の正味荷電が
いずれも負であることを示した。これに基づいて調製された両性解離型イオン交換分離媒
体のｐＩｍを推定する。これらｐＩｍの差からも、溶出液のｐＨ効果が認められ、さらに
本発明の設計構想及び得られたイオン交換剤の使用が認められた（表１）。
ステップ４、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡ ０．１０ｍｇとアシッドレッド１３ ６０μＭ
、吸着系０．８０ｍｌｐＨ３．６、溶出液ｐＨ８．９ 合計０．８０ｍｌを用いて、ＦＢ
Ｄ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡを独立して希釈し、アシッドレッド１３に対する分離容量を繰り返
して測定した結果、（５５±２） μｍｏｌｅ／ｇ磁気ビーズ（ｎ＝５）であった。この
方法は、非常に高い精度を有し、本発明の前記両性解離型イオン交換分離媒体の分離容量
のキャリブレーションに適していることが明らかになる。以下の実施例では、いずれも磁
気ビーズについて、ｐＨ３．６でのアシッドレッド１３に対する分離量を計算する。
【0048】
実施例４（使用）．ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ及びＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡによるプラ
スミドＤＮＡの抽出
ステップ１：ＲＭＧＵプラスミドをテンプレートとし、大腸菌細胞を拡大培養した後、天
根生化社製のスピンコラムプラスミド抽出キットを用いて、アルカリによる大腸菌細胞の
溶解及びスピンカラムを組み合わせて、プラスミドを抽出して核酸サンプルとする。
ステップ２：以下、別に説明しない場合、全ての磁気ビーズ結合プラスミドのｐＨは３．
６、溶出ｐＨは８．９である。
ステップ３：サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビーズ０．４０ｍｇ、ＦＢ
Ｄ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡ ５．５ｎｍｏｌ（０．１０ｍｇ）；吸着体系合計０．２０ｍｌ、
溶出液４０μｌ。ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＡ２６０核酸を測定して定量化させ、核酸の
分離量の吸着反応系における過量の核酸量に対する応答曲線は図９に示される。この曲線
から分かるように、核酸が過量である場合、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡの核酸分離容量は
サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビーズよりも４倍高くなった。吸着反応
系の核酸全量から吸着反応後の上澄みに残った核酸量を減算して、磁気ビーズの核酸最大
吸着量として溶出能力を計算し、ｐＨ８．９では、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡに吸着され
た核酸の溶出能力が８５％より大きく、それに対して、サーモエレクトロン株式会社製の
シラノール磁気ビーズに吸着された核酸の溶出能力が３０％であり、この結果から、本発
明の設計構想が認められた。
ステップ４：プラスミド５．０μｇを含む吸着体系合計０．２０ｍｌ、溶出液４０μｌ。
得られた核酸量の磁気ビーズ用量に対する応答曲線は図１０に示される。この曲線から分
かるように、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢにより分離された核酸の力価はサーモエレクトロ
ン株式会社製のシラノール磁気ビーズの９倍よりも高くなる可能性がある。ＦＢＤ－ＭＳ
Ｐ－ＺＥＷＢの核酸分離容量はＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡより遥かに高く、両方のアシッ
ドレッド１３に対する分離容量の差異と一致する。このような差異も本発明の設計構想及
び設計されたイオン交換剤の実用性を認めた。
ステップ５：プラスミド０．４０μｇを含む吸着体系合計０．２０ｍｌ。ＦＢＤ－ＭＳＰ
－ＺＥＷＢ（～０．１５ｍｇ）５０ｎｍｏｌ、サーモエレクトロン株式会社製のシラノー
ル磁気ビーズ１．０ｍｇ及びＢｉｏｍｉｇａキットにおけるシラノール磁気ビーズ１．０
ｍｇを用いて分離し、溶出液を４０μｌとする。得られた核酸抽出液２．５μｌをＰＣＲ
反応系５０μｌに入れて、各種サイクル／増幅回数後のアガロース電気泳動検出のＰＣＲ
産物を図１１に示す。その符号は以下のとおりである。Ｍ：核酸分子量の参照；１、４、
７、１０、１３、１６：ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ０．１５ｍｇでプラスミドを抽出す
る。２、５、８、１１、１４、１７：サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビ
ーズ１．０ｍｇでプラスミドを抽出する。３、６、９、１２、１５、１８：Ｂｉｏｍｉｇ
ａに使用されるシラノール磁気ビーズ（キットにおけるシラノール磁気ビーズの供給源は
未知）１．０ｍｇでプラスミドを抽出する；１、２、３：合計１０個のＰＣＲサイクル；
４、５、６：合計１３個のＰＣＲサイクル；７、８、９：合計１６個のＰＣＲサイクル；
１０、１１、１２：合計１９個のＰＣＲサイクル；１３、１４、１５：合計２２個のＰＣ
Ｒサイクル；１６、１７、１８：合計２５個のＰＣＲサイクル。
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ５０ｎｍｏｌの、テンプレートとしての核酸の抽出能力は、
サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビーズ１．０ｍｇ、Ｂｉｏｍｉｇａに使
用されるシラノール磁気ビーズ（キットにおけるシラノール磁気ビーズの供給源は未知）
１．０ｍｇのテンプレートとしての核酸の抽出能力より遥かに高い。ＦＢＤ－ＭＳＰ－Ｚ
ＥＷＢは、ＰＣＲ用の核酸抽出により適用でき、前記イオン交換剤の使用が認められた。
スミドＤＮＡの抽出
ステップ１：ＲＭＧＵプラスミドをテンプレートとし、大腸菌細胞を拡大培養した後、天
根生化社製のスピンコラムプラスミド抽出キットを用いて、アルカリによる大腸菌細胞の
溶解及びスピンカラムを組み合わせて、プラスミドを抽出して核酸サンプルとする。
ステップ２：以下、別に説明しない場合、全ての磁気ビーズ結合プラスミドのｐＨは３．
６、溶出ｐＨは８．９である。
ステップ３：サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビーズ０．４０ｍｇ、ＦＢ
Ｄ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡ ５．５ｎｍｏｌ（０．１０ｍｇ）；吸着体系合計０．２０ｍｌ、
溶出液４０μｌ。ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＡ２６０核酸を測定して定量化させ、核酸の
分離量の吸着反応系における過量の核酸量に対する応答曲線は図９に示される。この曲線
から分かるように、核酸が過量である場合、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡの核酸分離容量は
サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビーズよりも４倍高くなった。吸着反応
系の核酸全量から吸着反応後の上澄みに残った核酸量を減算して、磁気ビーズの核酸最大
吸着量として溶出能力を計算し、ｐＨ８．９では、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡに吸着され
た核酸の溶出能力が８５％より大きく、それに対して、サーモエレクトロン株式会社製の
シラノール磁気ビーズに吸着された核酸の溶出能力が３０％であり、この結果から、本発
明の設計構想が認められた。
ステップ４：プラスミド５．０μｇを含む吸着体系合計０．２０ｍｌ、溶出液４０μｌ。
得られた核酸量の磁気ビーズ用量に対する応答曲線は図１０に示される。この曲線から分
かるように、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢにより分離された核酸の力価はサーモエレクトロ
ン株式会社製のシラノール磁気ビーズの９倍よりも高くなる可能性がある。ＦＢＤ－ＭＳ
Ｐ－ＺＥＷＢの核酸分離容量はＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＡより遥かに高く、両方のアシッ
ドレッド１３に対する分離容量の差異と一致する。このような差異も本発明の設計構想及
び設計されたイオン交換剤の実用性を認めた。
ステップ５：プラスミド０．４０μｇを含む吸着体系合計０．２０ｍｌ。ＦＢＤ－ＭＳＰ
－ＺＥＷＢ（～０．１５ｍｇ）５０ｎｍｏｌ、サーモエレクトロン株式会社製のシラノー
ル磁気ビーズ１．０ｍｇ及びＢｉｏｍｉｇａキットにおけるシラノール磁気ビーズ１．０
ｍｇを用いて分離し、溶出液を４０μｌとする。得られた核酸抽出液２．５μｌをＰＣＲ
反応系５０μｌに入れて、各種サイクル／増幅回数後のアガロース電気泳動検出のＰＣＲ
産物を図１１に示す。その符号は以下のとおりである。Ｍ：核酸分子量の参照；１、４、
７、１０、１３、１６：ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ０．１５ｍｇでプラスミドを抽出す
る。２、５、８、１１、１４、１７：サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビ
ーズ１．０ｍｇでプラスミドを抽出する。３、６、９、１２、１５、１８：Ｂｉｏｍｉｇ
ａに使用されるシラノール磁気ビーズ（キットにおけるシラノール磁気ビーズの供給源は
未知）１．０ｍｇでプラスミドを抽出する；１、２、３：合計１０個のＰＣＲサイクル；
４、５、６：合計１３個のＰＣＲサイクル；７、８、９：合計１６個のＰＣＲサイクル；
１０、１１、１２：合計１９個のＰＣＲサイクル；１３、１４、１５：合計２２個のＰＣ
Ｒサイクル；１６、１７、１８：合計２５個のＰＣＲサイクル。
ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ５０ｎｍｏｌの、テンプレートとしての核酸の抽出能力は、
サーモエレクトロン株式会社製のシラノール磁気ビーズ１．０ｍｇ、Ｂｉｏｍｉｇａに使
用されるシラノール磁気ビーズ（キットにおけるシラノール磁気ビーズの供給源は未知）
１．０ｍｇのテンプレートとしての核酸の抽出能力より遥かに高い。ＦＢＤ－ＭＳＰ－Ｚ
ＥＷＢは、ＰＣＲ用の核酸抽出により適用でき、前記イオン交換剤の使用が認められた。
【0049】
実施例５（使用）．ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢイオン交換による微量の組換え発現ＲＭＧ
Ｕタンパク質の精製
ＭＧＵは、カルボキシメチル又はリン酸化セルロース、Ｔｏｙｏｐｅａｒシリーズのスル
ホン酸親水性マクロポーラス樹脂類のカチオン交換媒体のいずれにおいても強い吸着性を
有し、ゲル体積に対して１０倍の溶出液を用いても吸着されたＭＧＵ（Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｊ（２０１６） ３５：３１８-３２９及び本明細書の引用文献）を溶出できない。両性
解離イオン交換剤の分離容量を向上させて、ＲＭＧＵ安定性を確保するために、ＲＭＧＵ
のｐＩｓとは２．０個のｐＨ単位の差がある６．６に近いｐＩｍを有するＦＢＤ－ＭＳＰ
－ＺＥＷＢを用い、両方の間にあり且つ中性ｐＨに近いバッファで細胞を溶解し、０．２
２μｍ精密ろ過膜にかけると、直接吸着分離に利用できる。
ステップ１：ＲＭＧＵを誘導発現させて、細胞溶解液１において超音波溶解し、１２００
０ｒｐｍで上澄み液を遠心分離してろ過し、組換え発現ＲＭＧＵの粗酵素サンプルとする
。タンパク質濃度３．２５ｇ／Ｌ、活性３．２７ｋＵ／Ｌ、比活性１．０１ｋＵ／ｇ。
ステップ２：磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ３．０μｍｏｌを細胞溶解液で３回
洗浄し、異なる量の粗酵素サンプルを加えて、室温で１０ｍｉｎ混合し、磁気分離して細
胞溶解液１で磁気ビーズを洗浄して、タンパク質溶出液１を加えて室温で３０ｍｉｎ混合
し、溶出液を得て、溶出液を収集した後、前記量の溶出液を加えて３０ｍｉｎ再溶出し、
複数回繰り返して溶出を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて２８０ｎｍでの吸収を測定する
（タンパク質濃度）。結果を表２に示す。結果から分かるように、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥ
ＷＢは、ＲＭＧＵを効率的に精製することができ、得られた酵素の比活性がＤＥＡＥ－セ
ルロースで不純物を３回吸着することにより精製する場合の比活性（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ
（２０１６）３５：３１８-３２９）より高く、吸着されたＲＭＧＵは、活性換算で最
高溶出能力が８０％に近く、それに対して、従来の古典的なカチオン交換媒体により吸着
されたＭＧＵは溶出できなかった。且つ、溶出液を用いてバッチ式で溶出した結果、二回
目の溶出には最高活性濃度のＲＭＧＵは得られた。二回目の溶出液（各８０μｌ）を凍結
乾燥させ、直接ＳＤＳ－ＰＡＧＥ注入バッファ２５μｌで加熱して溶解し、同量のタンパ
ク質を注入してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った結果、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢでイオン
交換を１回行って精製したＲＭＧＵの純度は非常に高く、ＤＥＡＥ－セルロースによる３
回の精製の場合より遥かに優れている（図１２；文献の記載との比較Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ
（２０１６）３５：３１８-３２９）。
表２ ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ３．０μｍｏｌによるＲＭＧＵの高速分離（ＮＤ：タ
ンパク質濃度が低すぎるため、測定不能）
Ｕタンパク質の精製
ＭＧＵは、カルボキシメチル又はリン酸化セルロース、Ｔｏｙｏｐｅａｒシリーズのスル
ホン酸親水性マクロポーラス樹脂類のカチオン交換媒体のいずれにおいても強い吸着性を
有し、ゲル体積に対して１０倍の溶出液を用いても吸着されたＭＧＵ（Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｊ（２０１６） ３５：３１８-３２９及び本明細書の引用文献）を溶出できない。両性
解離イオン交換剤の分離容量を向上させて、ＲＭＧＵ安定性を確保するために、ＲＭＧＵ
のｐＩｓとは２．０個のｐＨ単位の差がある６．６に近いｐＩｍを有するＦＢＤ－ＭＳＰ
－ＺＥＷＢを用い、両方の間にあり且つ中性ｐＨに近いバッファで細胞を溶解し、０．２
２μｍ精密ろ過膜にかけると、直接吸着分離に利用できる。
ステップ１：ＲＭＧＵを誘導発現させて、細胞溶解液１において超音波溶解し、１２００
０ｒｐｍで上澄み液を遠心分離してろ過し、組換え発現ＲＭＧＵの粗酵素サンプルとする
。タンパク質濃度３．２５ｇ／Ｌ、活性３．２７ｋＵ／Ｌ、比活性１．０１ｋＵ／ｇ。
ステップ２：磁気ビーズＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ３．０μｍｏｌを細胞溶解液で３回
洗浄し、異なる量の粗酵素サンプルを加えて、室温で１０ｍｉｎ混合し、磁気分離して細
胞溶解液１で磁気ビーズを洗浄して、タンパク質溶出液１を加えて室温で３０ｍｉｎ混合
し、溶出液を得て、溶出液を収集した後、前記量の溶出液を加えて３０ｍｉｎ再溶出し、
複数回繰り返して溶出を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて２８０ｎｍでの吸収を測定する
（タンパク質濃度）。結果を表２に示す。結果から分かるように、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥ
ＷＢは、ＲＭＧＵを効率的に精製することができ、得られた酵素の比活性がＤＥＡＥ－セ
ルロースで不純物を３回吸着することにより精製する場合の比活性（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ
（２０１６）３５：３１８-３２９）より高く、吸着されたＲＭＧＵは、活性換算で最
高溶出能力が８０％に近く、それに対して、従来の古典的なカチオン交換媒体により吸着
されたＭＧＵは溶出できなかった。且つ、溶出液を用いてバッチ式で溶出した結果、二回
目の溶出には最高活性濃度のＲＭＧＵは得られた。二回目の溶出液（各８０μｌ）を凍結
乾燥させ、直接ＳＤＳ－ＰＡＧＥ注入バッファ２５μｌで加熱して溶解し、同量のタンパ
ク質を注入してＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った結果、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢでイオン
交換を１回行って精製したＲＭＧＵの純度は非常に高く、ＤＥＡＥ－セルロースによる３
回の精製の場合より遥かに優れている（図１２；文献の記載との比較Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊ
（２０１６）３５：３１８-３２９）。
表２ ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ３．０μｍｏｌによるＲＭＧＵの高速分離（ＮＤ：タ
ンパク質濃度が低すぎるため、測定不能）
【0050】
実施例６．ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢによる定量的ＰＣＲ用のＲＭＧＵプラスミドの抽出
ステップ１：大腸菌細胞にＲＭＧＵを形質転換した後に拡大培養し、細胞を収集して、ア
ルカリで溶解した後、スピンカラム法によりプラスミドを抽出して、初期精製プラスミド
とし、初期精製プラスミドを０．２０ｍ酢酸でｐＨ３．６に調整し、次に後続精製に用い
る。
ステップ２：ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢを用いて上記プラスミドをさらに精製し、得た溶
出液を０．２０ｍ酢酸でｐＨ３．６に調整し、次にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢで再度精製
し、プラスミド標準品を得て、ステップ６に記載の適切な濃度になるまで希釈する。
ステップ３：それぞれＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ５０ｎｍｏｌ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓｍ
ｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ １．０ｍｇ、Ｂｉｏｍｉｇａキット磁気ビーズ１．０ｍｇを用
いて、直接溶出液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．９）４０μｌで溶出して、磁
気ビーズ由来の不純物を得る。
ステップ４：磁気ビーズ由来の不純物に同量のプラスミド標準品を加えて、磁気ビーズの
空白とし、蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に用い、異なる磁気ビーズにより
抽出された核酸における、ｑＰＣＲに対して阻害作用を有する不純物の含有量を比較する
。
ステップ５：スピンカラムにより精製されたプラスミド２０μｌを合計０．４０μｇにな
るまで希釈し、０．２０ｍ酢酸ナトリウム４５μｌ、０．２０ｍ酢酸２３５μｌを加えて
ｐＨ～３．６に調整し、それぞれＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ５０ｎｍｏｌ（０．１５ｍ
ｇ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ １．０ｍｇ、Ｂｉｏｍｉｇａキッ
トに使用される磁気ビーズ１．０ｍｇを用いて抽出し、４０μｌ溶出し（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．９）、磁気ビーズ抽出核酸の試験液とする。
ステップ６：ｑＰＣＲ用のサンプルは以下のとおりである。
１ プラスミド標準品：ＲＭＧＵプラスミドをスピンカラム法により１回精製した後、Ｆ
ＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢで２回精製し、Ａ２６０を測定した結果、プラスミド濃度は２６
．９ｍｇ／Ｌである。溶出液で１１２５倍希釈して、プラスミドの標準品使用液とし、プ
ラスミドの標準品使用液を溶出液でさらに４、１６、６４、２５６、１０２４倍希釈し、
ｑＰＣＲに用いる。
２ ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ空白：５０ｎｍｏｌ単独磁気ビーズ溶出液２０μｌ＋標準
品使用液の６４倍希釈液２０μｌ；
３ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ空白：１．０ｍｇ単独磁気ビーズ溶
出液２０μｌ＋標準品使用液の６４倍希釈液２０μｌ；
４ Ｂｉｏｍｉｇａ磁気ビーズ空白：１．０ｍｇ単独磁気ビーズ溶出液２０μｌ＋標準品
使用液の６４倍希釈液２０μｌ；
５ ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ試験：磁気ビーズ５０ｎｍｏｌでプラスミド０．４０ｇを
抽出し、溶出液をさらに３６０倍希釈する。
６ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ試験：磁気ビーズ１．０ｍｇでプラ
スミド０．４０ｇを抽出し、溶出液をさらに３６０倍希釈する。
７ Ｂｉｏｍｉｇａ磁気ビーズ試験：磁気ビーズ１．０ｍｇでプラスミド０．４０ｇを抽
出し、溶出液をさらに３６０倍希釈する。
ステップ７：蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲ
Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ９６を用いて標準手順を行う。蛍光色素をＳｙｂｒｇｒｅｅｎとし
、ＰＣＲ反応系に、酵素、トリヌクレオチド、プライマー（産物を１５０ｂｐに制御する
）、Ｓｙｂｒｌｇｒｅｅｎ及びテンプレート２．５μｌを含み、合計２５μｌとし、磁気
ビーズ空白の追跡過程を図１３、磁気ビーズ試験の追跡過程を図１４、応答曲線を図１５
に示す。プラスミドの標準品使用液におけるプラスミド濃度を２４ｐｇ／Ｌとすると、応
答曲線における各反応系のプラスミドの全量の勾配は順次、６０、１５、３．７５、０．
９４、０．２４、０．０６ｐｇであり、自然対数を横座標として負の応答曲線を得て、そ
の詳細は図１５に示される。
ステップ８：表３から明らかなように、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢでは、不純物によるＰ
ＣＲへの阻害作用が最も少なく、２種のシラノール磁気ビーズにより抽出された核酸にお
ける不純物によるＰＣＲへの阻害がより強く、特にＢｉｏｍｉｇａに使用される磁気ビー
ズにおける阻害性不純物がより多くなった。痕跡量のプラスミドに対しては、磁気ビーズ
用量（質量）及びｑＰＣＲ測定用のテンプレート量を考慮すると、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥ
ＷＢのｑＰＣＲ用核酸の抽出能力はＤｙｎａｂｅａｄｓｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅの１０
倍になり、Ｂｉｏｍｉｇａに使用される磁気ビーズでは、ｑＰＣＲを阻害する不純物は明
らかに多く、また、ｑＰＣＲによるテンプレート量は最低である。
表３ 蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲにより測定された、磁気ビーズのプラスミド抽出量
及び各種磁気ビーズ抽出物における妨害不純物
ステップ１：大腸菌細胞にＲＭＧＵを形質転換した後に拡大培養し、細胞を収集して、ア
ルカリで溶解した後、スピンカラム法によりプラスミドを抽出して、初期精製プラスミド
とし、初期精製プラスミドを０．２０ｍ酢酸でｐＨ３．６に調整し、次に後続精製に用い
る。
ステップ２：ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢを用いて上記プラスミドをさらに精製し、得た溶
出液を０．２０ｍ酢酸でｐＨ３．６に調整し、次にＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢで再度精製
し、プラスミド標準品を得て、ステップ６に記載の適切な濃度になるまで希釈する。
ステップ３：それぞれＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ５０ｎｍｏｌ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓｍ
ｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ １．０ｍｇ、Ｂｉｏｍｉｇａキット磁気ビーズ１．０ｍｇを用
いて、直接溶出液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．９）４０μｌで溶出して、磁
気ビーズ由来の不純物を得る。
ステップ４：磁気ビーズ由来の不純物に同量のプラスミド標準品を加えて、磁気ビーズの
空白とし、蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に用い、異なる磁気ビーズにより
抽出された核酸における、ｑＰＣＲに対して阻害作用を有する不純物の含有量を比較する
。
ステップ５：スピンカラムにより精製されたプラスミド２０μｌを合計０．４０μｇにな
るまで希釈し、０．２０ｍ酢酸ナトリウム４５μｌ、０．２０ｍ酢酸２３５μｌを加えて
ｐＨ～３．６に調整し、それぞれＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ ５０ｎｍｏｌ（０．１５ｍ
ｇ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ １．０ｍｇ、Ｂｉｏｍｉｇａキッ
トに使用される磁気ビーズ１．０ｍｇを用いて抽出し、４０μｌ溶出し（２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．９）、磁気ビーズ抽出核酸の試験液とする。
ステップ６：ｑＰＣＲ用のサンプルは以下のとおりである。
１ プラスミド標準品：ＲＭＧＵプラスミドをスピンカラム法により１回精製した後、Ｆ
ＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢで２回精製し、Ａ２６０を測定した結果、プラスミド濃度は２６
．９ｍｇ／Ｌである。溶出液で１１２５倍希釈して、プラスミドの標準品使用液とし、プ
ラスミドの標準品使用液を溶出液でさらに４、１６、６４、２５６、１０２４倍希釈し、
ｑＰＣＲに用いる。
２ ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ空白：５０ｎｍｏｌ単独磁気ビーズ溶出液２０μｌ＋標準
品使用液の６４倍希釈液２０μｌ；
３ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ空白：１．０ｍｇ単独磁気ビーズ溶
出液２０μｌ＋標準品使用液の６４倍希釈液２０μｌ；
４ Ｂｉｏｍｉｇａ磁気ビーズ空白：１．０ｍｇ単独磁気ビーズ溶出液２０μｌ＋標準品
使用液の６４倍希釈液２０μｌ；
５ ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢ試験：磁気ビーズ５０ｎｍｏｌでプラスミド０．４０ｇを
抽出し、溶出液をさらに３６０倍希釈する。
６ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅ試験：磁気ビーズ１．０ｍｇでプラ
スミド０．４０ｇを抽出し、溶出液をさらに３６０倍希釈する。
７ Ｂｉｏｍｉｇａ磁気ビーズ試験：磁気ビーズ１．０ｍｇでプラスミド０．４０ｇを抽
出し、溶出液をさらに３６０倍希釈する。
ステップ７：蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲ
Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ９６を用いて標準手順を行う。蛍光色素をＳｙｂｒｇｒｅｅｎとし
、ＰＣＲ反応系に、酵素、トリヌクレオチド、プライマー（産物を１５０ｂｐに制御する
）、Ｓｙｂｒｌｇｒｅｅｎ及びテンプレート２．５μｌを含み、合計２５μｌとし、磁気
ビーズ空白の追跡過程を図１３、磁気ビーズ試験の追跡過程を図１４、応答曲線を図１５
に示す。プラスミドの標準品使用液におけるプラスミド濃度を２４ｐｇ／Ｌとすると、応
答曲線における各反応系のプラスミドの全量の勾配は順次、６０、１５、３．７５、０．
９４、０．２４、０．０６ｐｇであり、自然対数を横座標として負の応答曲線を得て、そ
の詳細は図１５に示される。
ステップ８：表３から明らかなように、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥＷＢでは、不純物によるＰ
ＣＲへの阻害作用が最も少なく、２種のシラノール磁気ビーズにより抽出された核酸にお
ける不純物によるＰＣＲへの阻害がより強く、特にＢｉｏｍｉｇａに使用される磁気ビー
ズにおける阻害性不純物がより多くなった。痕跡量のプラスミドに対しては、磁気ビーズ
用量（質量）及びｑＰＣＲ測定用のテンプレート量を考慮すると、ＦＢＤ－ＭＳＰ－ＺＥ
ＷＢのｑＰＣＲ用核酸の抽出能力はＤｙｎａｂｅａｄｓｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅの１０
倍になり、Ｂｉｏｍｉｇａに使用される磁気ビーズでは、ｑＰＣＲを阻害する不純物は明
らかに多く、また、ｑＰＣＲによるテンプレート量は最低である。
表３ 蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲにより測定された、磁気ビーズのプラスミド抽出量
及び各種磁気ビーズ抽出物における妨害不純物
【0051】
上記使用実施例から、本発明の両性解離型イオン交換分離媒体の実用性が確認された。こ
のような媒体は、アシッドレッド１３類の染料に対する吸着能力も溶出能力も強く、前記
イオン交換分離媒体のキャラクタリゼーションにも、捺染廃液におけるシッドレッド系水
溶性染料の回収利用にも適用できる。このようなイオン交換分離媒体及びアシッドレッド
１３の溶出と測定を組み合わせることによって、調製された両性解離型イオン交換分離媒
体のｐＩｍ、溶出効率のｐＨ効果を容易にキャラクタリゼーションできる。適切なｐＩｍ
を有する両性解離型イオン交換分離媒体を用いると、タンパク質を効率よく迅速に精製し
たり、核酸を効率よく抽出したりすることができ、且つ得られた核酸がＰＣＲにより適し
ており、また、蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲから明らかなように、前記両性解離型イオ
ン交換分離媒体のＰＣＲ用核酸の抽出能力は、ミクロン磁気ビーズの質量換算で、Ｔｈｅ
ｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅシラノール磁気
ビーズの１０倍に近い。
のような媒体は、アシッドレッド１３類の染料に対する吸着能力も溶出能力も強く、前記
イオン交換分離媒体のキャラクタリゼーションにも、捺染廃液におけるシッドレッド系水
溶性染料の回収利用にも適用できる。このようなイオン交換分離媒体及びアシッドレッド
１３の溶出と測定を組み合わせることによって、調製された両性解離型イオン交換分離媒
体のｐＩｍ、溶出効率のｐＨ効果を容易にキャラクタリゼーションできる。適切なｐＩｍ
を有する両性解離型イオン交換分離媒体を用いると、タンパク質を効率よく迅速に精製し
たり、核酸を効率よく抽出したりすることができ、且つ得られた核酸がＰＣＲにより適し
ており、また、蛍光リアルタイム定量的ＰＣＲから明らかなように、前記両性解離型イオ
ン交換分離媒体のＰＣＲ用核酸の抽出能力は、ミクロン磁気ビーズの質量換算で、Ｔｈｅ
ｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙｏｎｅ Ｓｉｌａｎｅシラノール磁気
ビーズの１０倍に近い。
【0052】
最後に、なお、以上の実施例は本発明の技術案を説明するものに過ぎず、限定的なもので
はない。当業者であれば、本発明の技術案の主旨及び範囲から逸脱することなく本発明の
技術案について修正又は等同置換を行うことができ、それらはいずれも本発明の特許請求
の範囲に含まれることが理解できる。
はない。当業者であれば、本発明の技術案の主旨及び範囲から逸脱することなく本発明の
技術案について修正又は等同置換を行うことができ、それらはいずれも本発明の特許請求
の範囲に含まれることが理解できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
