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特許7112414網膜神経節細胞中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターＳＹＮＰ８８
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-26
(45)【発行日】2022-08-03
(54)【発明の名称】網膜神経節細胞中の遺伝子の特異的発現のためのプロモーターＳＹＮＰ８８
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20220727BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220727BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220727BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220727BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220727BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220727BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2019542436
(86)(22)【出願日】2018-02-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-03-05
(86)【国際出願番号】 IB2018050696
(87)【国際公開番号】W WO2018146588
(87)【国際公開日】2018-08-16
【審査請求日】2021-02-04
(31)【優先権主張番号】17155193.0
(32)【優先日】2017-02-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】518089687
【氏名又は名称】フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100186897
【弁理士】
【氏名又は名称】平川 さやか
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ロスカ，ボトンド
(72)【発明者】
【氏名】ユエットナー，ジョゼフィーヌ
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１７４６２４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Dukes,A. et al.，Mus musculus BAC cloneRP24-93F20 from chromosome 9, complete sequence.，Database GenBank，2005年，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/77020623/，Accession No.AC165080.4
【文献】Wilson,R.K.，Mus musculus chromosome 9 cloneRP23-149G19, *** SEQUENCING IN PROGRESS ***, 8 unordered pieces.，Database GenBank，2005年，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AC165354.1/，Accession No.AC165354.1
【文献】Birren,B. et al.，Mus musculus clone RP24-392D19,WORKING DRAFT SEQUENCE, 12 unordered pieces.，Database GenBank，2003年，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AC121559.2/，Accession No.AC121559.2
【文献】SHEVTSOVA Z，PROMOTERS AND SEROTYPES: TARGETING OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR GENE TRANSFER IN THE RAT CENTRAL NERVOUS SYSTEM IN VITRO AND IN VIVO，EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY，英国，2005年，VOL:90, NR:1，PAGE(S):53 - 59，https://physoc.onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1113/expphysiol.2004.028159
【文献】HILDA PETRS-SILVA，NOVEL PROPERTIES OF TYROSINE-MUTANT AAV2 VECTORS IN THE MOUSE RETINA，MOLECULAR THERAPY，2010年11月02日，VOL:19, NR:2，PAGE(S):293 - 301，https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S1525-0016%2816%2932387-5
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離核酸分子を含む発現カセットであって、
前記単離核酸分子は、配列番号１の核酸配列を含み、遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に連結されており、および、網膜神経節細胞中の遺伝子の発現を駆動するのに有効である、前記発現カセット。
【請求項2】
前記網膜神経節細胞が、ヒト網膜神経節細胞である、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項3】
前記網膜神経節細胞が、マウス網膜神経節細胞である、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項4】
前記単離核酸分子は、最小プロモーターをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項5】
前記最小プロモーターが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項４に記載の発現カセット。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項7】
ウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項8】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項9】
網膜神経節細胞における遺伝子発現のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項６～８のいずれか一項に記載のベクターのインビトロ又はエクスビボの使用。
【請求項10】
単離細胞、細胞系または細胞集団に請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセットで形質移入することを含む、網膜神経節細胞中で遺伝子を発現させるインビトロまたはエクスビボの方法であって、前記単離細胞が網膜神経節細胞である、または前記細胞系もしくは前記細胞集団が網膜 神経節細胞を含む場合、前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系または前記細胞集団によ り発現させる、方法。
【請求項11】
前記単離細胞がヒト細胞である、または、前記細胞系もしくは前記細胞集団がヒト細胞 を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記単離細胞がマウス細胞である、または、前記細胞系もしくは前記細胞集団がマウス 細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセットまたは請求項６～８のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
【請求項14】
前記発現カセットまたはベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、請求項１３に記載の細胞。
【請求項15】
前記遺伝子の産物が、光感受性分子、ＭＴ－ＮＤ４、ＭＴ－ＮＤ１、ＭＴ－ＮＤ６、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＣＯ３、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ２、５ＭＴ－ＣＯＩ、ＭＴ－ＡＴ Ｐ６、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ 、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオスタチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４および桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項６～８のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３もしくは１４に記載の細胞。
【請求項16】
前記光感受性分子が、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、請求項１５に記載の発現カセット、ベクターまたは細胞。
【請求項17】
前記遺伝子の産物が、光感受性分子、ＭＴ－ＮＤ４、ＭＴ－ＮＤ１、ＭＴ－ＮＤ６、Ｍ Ｔ－ＣＹＢ、ＭＴ－ＣＯ３、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ２、５ＭＴ－ＣＯＩ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ 、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオス タチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４および桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
【請求項18】
前記光感受性分子が、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、請求項１７に記載の使用または方法。
【請求項19】
請求項１～５のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、網膜神経節細胞中で遺伝子を発現させるためのキット。
【請求項20】
前記単離核酸分子またはその薬学的に許容可能な配合物を投与するための、針、シリン ジ、および／また説明書をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、網膜神経節細胞中で遺伝子の発現を特異的にもたらす核酸配列に関する。
【背景技術】
【0002】
発現目的のため、組換え遺伝子は、通常、標的細胞、細胞集団または組織中に、異種遺伝子の転写を可能とする活性発現カセットの環境下のｃＤＮＡ構築物として形質移入される。ＤＮＡ構築物は、シス制御エレメント、例として、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターおよびプロモーター（本明細書においてまとめて「プロモーター」と称される）における多くのトランス作用性転写因子（ＴＦ）の活性を含むプロセスにおける細胞転写機構により認識される。
【0003】
遺伝子プロモーターは、それらの調節のレベルの全てに関与し、ＤＮＡ配列、転写因子結合およびエピジェネティックな特色の影響を組み込むことにより遺伝子転写における決定因子として機能する。これらは、例えば、プラスミドベクターによりコードされる導入遺伝子発現の強度および前記導入遺伝子が発現される１つまたは複数の細胞タイプを決定する。
【0004】
哺乳動物細胞中の異種遺伝子発現をドライブするために使用される最も一般的なプロモーターは、ヒトおよびマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターである。これらは強力な発現を付与し、いくつかの細胞タイプにおいてロバストであることが証明されている。他のウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０最初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターも発現カセット中で高頻度で使用される。
【0005】
ウイルスプロモーターの代わりに、細胞プロモーターを使用することもできる。公知のプロモーターの中には、大量に転写される細胞転写産物、例えば、ベータ－アクチン、伸長因子１－アルファ（ＥＦ－ｌアルファ）、またはユビキチンをコードするハウスキーピング遺伝子からのものがある。ウイルスプロモーターと比較して、真核生物遺伝子発現は複雑であり、多くの異なる因子の正確な協調を要求する。
【0006】
導入遺伝子発現のための内因性調節エレメントの使用に関する態様の１つは、安定なｍＲＮＡの生成であり、発現が、それに応じてトランス作用性転写因子が提供される宿主細胞の天然環境中で生じ得ることである。真核生物遺伝子の発現は、シスおよびトランス作用性調節エレメントの複雑な機構により制御されるため、ほとんどの細胞プロモーターは、詳細な機能の特徴付けが欠けている。真核生物プロモーターの一部は、通常、その転写される配列のすぐ上流に位置し、転写開始点として機能する。コアプロモーターは、転写機構により認識されるのに十分である転写開始部位（ＴＳＳ）を直接囲む。近位プロモーターは、コアプロモーターの上流の領域を含み、ＴＳＳおよび転写調節に要求される他の配列特色を含有する。転写因子は、プロモーターおよびエンハンサー配列中の調節モチーフに結合し、それにより、ヌクレオソーム構造および最終的に転写の開始を可能とするその位置を変更するクロマチンおよびヒストン修飾酵素を活性化させることにより配列特異的に作用する。機能プロモーターの同定は、主に、関連する上流または下流のエンハンサーエレメントの存在に依存的である。
【0007】
導入遺伝子発現のための内因性調節エレメントの使用に関する別の重大な態様は、一部のプロモーターが細胞特異的様式で作用し得、規定のタイプの細胞中で、またはプロモーターに依存して特定のサブセットの細胞中で導入遺伝子の発現をもたらすことである。
【0008】
したがって、本発明の１つの課題は、哺乳動物細胞中で高い発現レベルで、細胞タイプ特異的様式で組換え遺伝子を発現させるのに好適な新たな配列を得ることである。
【0009】
このような配列は、神経変性障害、視力回復、創薬、腫瘍療法および障害の診断の研究のための系を開発するための網膜細胞特異的プロモーターについての当分野における必要性に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
網膜は、２つの部分、網膜色素上皮（ＲＰＥ）および神経感覚網膜に分けることができる。ＲＰＥは、神経感覚網膜機能を維持することに能動的に関与している。神経感覚網膜は、光受容器および網膜神経節細胞（ＲＧＣ、または網膜神経節）を含む神経回路網として組織化されている。光受容器は、光の情報をＲＧＣに向けた電気的情報に変換させ、ＲＧＣは、視覚情報を網膜から視覚皮質へ伝達するための責任を担っている。これらの異なる細胞型間では、光強度の様々な条件およびコントラスト情報の増加への網膜応答の適応を可能にする負のフィードバックを誘導する、例えば水平細胞などの制御的機能を有する細胞もまた見出すことができる。
【0011】
ＲＧＣは、主としてグルタミン酸作動性ニューロンであり、網膜の内表面（神経節細胞層）内に位置する。それらの軸索は、視神経を形成する。約１５～２０数種のＲＧＣが存在する。ＲＧＣは、視覚過程において重要な役割を果たし、ＲＧＣの機能障害もしくは変性は、失明をもたらし得る。
【0012】
視神経症と呼ばれる極めて様々な病理は、ＲＧＣの一次欠損によって引き起こされる。それらの一部は、例えば、ミトコンドリア遺伝子の突然変異によって誘発されるレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）などの遺伝病である。しかし、例えば、緑内障などの後天性視神経症の方がはるかに多く蔓延しており、緑内障は、先進国における失明の２番目に重要な原因であり、世界中で７千万人が罹患している。
【0013】
これらの疾患の原因である遺伝子または神経保護因子をコードする遺伝子の健常バージョンの神経節細胞内での標的発現は、これらの視神経症の治療を可能にし得る。したがって、遺伝子療法を提供するためには、これらの細胞中において強力で特異的な遺伝子発現を得られることが不可欠である。
【0014】
さらに、ＲＧＣは、退行変性過程に直接的に関与することなく、治療標的を構成し得る。例えば、ＲＧＣは、先天性（すなわち、網膜色素変性症）もしくは後天性疾患に起因して光受容器が消失している疾患において、光受容器の変性後の長期間にわたって存続するので、したがってオプトジェネティックツールを使用して網膜を生き返らせる治療のための標的を構成する。これに関連して、ＲＧＣは、強力で制限された方法での光感受性タンパク質の発現が視覚回復に成功するために不可欠である変性細胞からは独立した細胞標的である。
【0015】
本発明者らは、エピジェネティクス、バイオインフォマティクスおよび神経科学を組み合わせて眼球中に存在する場合、網膜神経節細胞中でのみ遺伝子発現を駆動するプロモーターを見出した。
【0016】
本発明の配列の核酸配列は：
である。
【化1】
である。
【0017】
したがって、本発明は、配列番号１の核酸配列または配列番号１の前記核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも１８００ｂｐの核酸配列を含み、またはそれからなる単離核酸分子であって、遺伝子をコードする前記核酸配列に作動可能に結合している前記遺伝子の網膜神経節中の発現を特異的にもたらす単離核酸分子を提供する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９６％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９７％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と１００％の同一性を有する。
【0018】
本発明の単離核酸分子は、最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーターまたは例、例えば
において使用されるものをさらに含み得る。
【化2】
において使用されるものをさらに含み得る。
【0019】
上記の本発明の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子も提供される。
【0020】
本発明はまた、上記の本発明の単離核酸を含む発現カセットであって、前記プロモーターが、少なくとも、網膜神経節中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセットを提供する。
【0021】
本発明はさらに、本発明の発現カセットを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、前記ベクターは、ウイルスベクターである。
【0022】
本発明はまた、網膜神経節中の遺伝子の発現のための、本発明の核酸の、本発明の発現カセットの、または本発明のベクターの使用を包含する。
【0023】
本発明はさらに、単離細胞、細胞系または細胞集団（例えば、組織）に本発明の発現カセットを形質移入するステップを含む、網膜神経節中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞が網膜神経節であり、または前記細胞が網膜神経節を含む場合、発現させるべき遺伝子を単離細胞、細胞系または細胞集団により発現させる方法を提供する。一部の実施形態において、単離細胞、細胞系または細胞集団もしくは組織はヒトである。
【0024】
本発明はまた、本発明の発現カセットを含む単離細胞を提供する。一部の実施形態において、発現カセットまたはベクターは、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている。
【0025】
本発明のプロモーターに作動可能に結合させることができる典型的な遺伝子は、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンをコードする遺伝子である。治療用遺伝子、すなわち病的状態の治療のために有用な治療用タンパク質をコードする遺伝子もまた使用できる。治療用遺伝子の例としては、限定されるものではないが、例えば、ＭＴ－ＮＤ４（遺伝子ＩＤ：４５３８）、ＭＴ－ＮＤ１（遺伝子ＩＤ：４５３５）、ＭＴ－ＮＤ６（遺伝子ＩＤ：４５４１）、ＭＴ－ＣＹＢ（遺伝子ＩＤ：４５１９）、ＭＴ－ＣＯ３（遺伝子ＩＤ：４５１４）、ＭＴ－ＮＤ５（遺伝子ＩＤ：４５４０）、ＭＴ－ＮＤ２（遺伝子ＩＤ：４５３６）、５ＭＴ－ＣＯＩ（遺伝子ＩＤ：４５１２）、ＭＴ－ＡＴＰ６（遺伝子ＩＤ：４５０８）、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ（遺伝子ＩＤ：４５３９）、ＯＰＡ１（遺伝子ＩＤ：４９７６）、ＯＰＡ３（遺伝子ＩＤ：８０２０７）、ＯＰＡ７（遺伝子ＩＤ：８４２３３）およびＡＣＯ２（遺伝子ＩＤ：５０）などの網膜疾患を引き起こすことが公知である消失遺伝子もしくは突然変異遺伝子に置換するための核酸が挙げられる。これらの治療用遺伝子は、さらに例えばＧＤＮＦ（遺伝子ＩＤ：２６６８）、ＣＮＴＦ（遺伝子ＩＤ：１２７０）、ＦＧＦ２（遺伝子ＩＤ：２２４７）、ＢＤＮＦ（遺伝子ＩＤ：６２７）およびＥＰＯ（遺伝子ＩＤ：２０５６）などの神経栄養因子、例えばＢＣＬ２（遺伝子ＩＤ：５９６）およびＢＣＬ２Ｌ１（遺伝子ＩＤ：５９８）などの抗アポトーシス遺伝子、例えばエンドスタチン、アンギオスタチンおよびｓＦｌｔなどの抗血管形成因子、例えばＩＬ１０（遺伝子ＩＤ：３５８６）、ＩＬ１Ｒ１（遺伝子ＩＤ：３５５４）、ＴＧＦＢＩ（遺伝子ＩＤ：７０４５）およびＩＬ４（遺伝子ＩＤ：３５６５）などの抗炎症因子または桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）（遺伝子ＩＤ：１１５８６１）もまたコードし得る。
【0026】
さらに、本発明はまた、本発明の単離核酸分子を含む、網膜神経節中で遺伝子を発現させるためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】マウスの網膜における配列番号１を有するプロモーターからのＥＧＦＰ発現のレーザー走査型共焦点顕微鏡写真。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの眼におけるＡＡＶ２／８－ｓｙｎＰ８８－ＣｈＲ２－ＥＧＦＰの網膜下注射から３週間後。ＲＢＰＭＳ染色によって標識された網膜神経節細胞中の誘導発現を観察することができる。緑色＝配列番号１により駆動されたＥＧＦＰ。赤紫色＝ＲＢＰＭＳ（多重スプライシングを有するＲＮＡ結合タンパク質）。白色＝Ｈｏｅｃｈｓｔ。
【図2】ＮＨＰの網膜における配列番号１を有するプロモーターからのＥＧＦＰ発現のレーザー走査型共焦点顕微鏡写真。成体非ヒト霊長類の眼におけるＡＡＶＢＰ２／８－ｓｙｎＰ８８－ＣｈＲ２－ＥＧＦＰの網膜下注射から３カ月後。ＲＢＰＭＳ染色によって標識された網膜神経節細胞中の誘導発現を観察することができる。緑色＝配列番号１により駆動されたＥＧＦＰ。赤紫色＝ＲＢＰＭＳ（多重スプライシングを有するＲＮＡ結合タンパク質）。白色＝Ｈｏｅｃｈｓｔ。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明者らは、エピジェネティクス、バイオインフォマティクスおよび神経科学を組み合わせて眼球中に存在する場合、網膜神経節細胞中でのみ遺伝子発現をドライブするプロモーターを見出した。
【0029】
本発明の配列の核酸配列は、
である。
【化3】
である。
【0030】
したがって、本発明は、配列番号１の核酸配列または配列番号１の前記核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する少なくとも１８００ｂｐの核酸配列を含み、またはそれからなる単離核酸分子であって、遺伝子をコードする前記核酸配列に作動可能に結合している前記遺伝子の網膜神経節中の発現を特異的にもたらす単離核酸分子を提供する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９６％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９７％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９９％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも１８００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と１００％の同一性を有する。
【0031】
本発明の単離核酸分子は、最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーターまたは例、例えば
において使用されるものをさらに含み得る。
【化4】
において使用されるものをさらに含み得る。
【0032】
上記の本発明の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子も提供される。
【0033】
本発明はまた、上記の本発明の単離核酸を含む発現カセットであって、前記プロモーターが、少なくとも、網膜神経節中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセットを提供する。
【0034】
本発明はさらに、本発明の発現カセットを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、前記ベクターは、ウイルスベクターである。
【0035】
本発明はまた、網膜神経節中の遺伝子の発現のための、本発明の核酸の、本発明の発現カセットの、または本発明のベクターの使用を包含する。
【0036】
本発明はさらに、単離細胞、細胞系または細胞集団（例えば、組織）に本発明の発現カセットを形質移入するステップを含む、網膜神経節中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞が網膜神経節であり、または前記細胞が網膜神経節を含む場合、発現させるべき遺伝子を単離細胞、細胞系または細胞集団により発現させる方法を提供する。一部の実施形態において、単離細胞、細胞系または細胞集団もしくは組織はヒトである。
【0037】
本発明はまた、本発明の発現カセットを含む単離細胞を提供する。一部の実施形態において、発現カセットまたはベクターは、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。
【0038】
本発明のプロモーターに作動可能に結合させることができる典型的な遺伝子は、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンをコードする遺伝子である。治療用遺伝子、すなわち病的状態の治療のために有用な治療用タンパク質をコードする遺伝子もまた使用できる。治療用遺伝子の例としては、限定されるものではないが、例えば、ＭＴ－ＮＤ４（遺伝子ＩＤ：４５３８）、ＭＴ－ＮＤ１（遺伝子ＩＤ：４５３５）、ＭＴ－ＮＤ６（遺伝子ＩＤ：４５４１）、ＭＴ－ＣＹＢ（遺伝子ＩＤ：４５１９）、ＭＴ－ＣＯ３（遺伝子ＩＤ：４５１４）、ＭＴ－ＮＤ５（遺伝子ＩＤ：４５４０）、ＭＴ－ＮＤ２（遺伝子ＩＤ：４５３６）、５ＭＴ－ＣＯＩ（遺伝子ＩＤ：４５１２）、ＭＴ－ＡＴＰ６（遺伝子ＩＤ：４５０８）、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ（遺伝子ＩＤ：４５３９）、ＯＰＡ１（遺伝子ＩＤ：４９７６）、ＯＰＡ３（遺伝子ＩＤ：８０２０７）、ＯＰＡ７（遺伝子ＩＤ：８４２３３）およびＡＣＯ２（遺伝子ＩＤ：５０）などの網膜疾患を引き起こすことが公知である消失遺伝子もしくは突然変異遺伝子に置換するための核酸が挙げられる。これらの治療用遺伝子は、さらに例えばＧＤＮＦ（遺伝子ＩＤ：２６６８）、ＣＮＴＦ（遺伝子ＩＤ：１２７０）、ＦＧＦ２（遺伝子ＩＤ：２２４７）、ＢＤＮＦ（遺伝子ＩＤ：６２７）およびＥＰＯ（遺伝子ＩＤ：２０５６）などの神経栄養因子、例えばＢＣＬ２（遺伝子ＩＤ：５９６）およびＢＣＬ２Ｌ１（遺伝子ＩＤ：５９８）などの抗アポトーシス遺伝子、例えばエンドスタチン、アンギオスタチンおよびｓＦｌｔなどの抗血管形成因子、例えばＩＬ１０（遺伝子ＩＤ：３５８６）、ＩＬ１Ｒ１（遺伝子ＩＤ：３５５４）、ＴＧＦＢＩ（遺伝子ＩＤ：７０４５）およびＩＬ４（遺伝子ＩＤ：３５６５）などの抗炎症因子または桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）（遺伝子ＩＤ：１１５８６１）もまたコードし得る。
【0039】
さらに、本発明はまた、本発明の単離核酸分子を含む、網膜神経節中で遺伝子を発現させるためのキットを提供する。
【0040】
本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」は、任意のシス調節エレメント、例として、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターおよびプロモーターを指す。プロモーターは、転写が必要とされる遺伝子の上流に（５’領域に向かって）一般には位置するＤＮＡの領域である。プロモーターは、それが制御する遺伝子の適切な活性化または抑制を可能とする。本発明の関連において、プロモーターは、それらに作動可能に結合している遺伝子の網膜神経節中の特異的発現をもたらす。「あるタイプの細胞中でのみの発現」とも称される「特異的発現」は、目的の遺伝子を発現する細胞の少なくとも７５％超が、規定されたタイプ、すなわち、本事例においては網膜神経節であることを意味する。
【0041】
発現カセットは典型的には、宿主細胞中への発現カセットの侵入および宿主細胞中の発現カセットの維持を促進するベクター中に導入される。このようなベクターは一般に使用されており、当業者に周知である。多数のそのようなベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されており、多数のガイド、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｇｕｔｈｒｉｅ、Ｓｔｒａｔｈｅｍ、またはＢｅｒｇｅｒなどに記載されている（全て前掲）。このようなベクターとしては、典型的には、多重クローニング部位、および追加のエレメント、例えば、複製起点、選択マーカー遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＧＦＰ）、セントロメア配列などと共にプロモーター、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。
【0042】
ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ、ＰＲＶまたはレンチウイルスは、本発明のプロモーターを使用して遺伝子を網膜神経節に標的化し、送達するのに好適である。
【0043】
網膜細胞のアウトプットは、電気的方法、例えば、多電極アレイもしくはパッチクランプを使用して、または視覚的方法、例えば、蛍光の検出を使用して計測することができる。
【0044】
本発明の核酸配列を使用する方法であって、本発明のプロモーター下で１つ以上の導入遺伝子を発現する網膜神経節と試験化合物を接触させるステップ、および前記試験化合物の存在下で得られた網膜神経節の少なくとも１つのアウトプットを、前記試験化合物の不存在下で得られた同一のアウトプットと比較するステップを含む方法は、網膜神経節が関与する神経障害、または網膜の障害の治療のための治療剤を同定するために使用することができる。
【0045】
さらに、本発明のプロモーターを使用する方法であって、本発明のプロモーターの制御下で１つ以上の導入遺伝子を発現する網膜神経節を薬剤と接触させるステップ、および前記薬剤との接触後に得られた少なくとも１つのアウトプットを、前記薬剤との前記接触前に得られた同一のアウトプットと比較するステップを含む方法も、視力回復のインビトロ試験に使用することができる。
【0046】
チャネルロドプシンは、光開閉型イオンチャネルとして機能するオプシンタンパク質のサブファミリーである。これらは、単細胞緑藻中で感覚光受容器として機能し、走光性、すなわち、光に応答する運動を制御する。他の生物体の細胞中で発現されると、それらは、細胞内酸性度、カルシウム流入、電気興奮性、および他の細胞プロセスを制御するための光の使用を可能とする。以下の少なくとも３つの「天然」チャネルロドプシン：チャネルロドプシン－１（ＣｈＲ１）、チャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）、およびボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）が現在公知である。さらに、これらのタンパク質の一部の改変／改善バージョンも存在する。全ての公知のチャネルロドプシンは非特異的陽イオンチャネルであり、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣａ２＋イオンを伝導する。
【0047】
ハロロドプシンは、塩化物イオンに特異的な光駆動性イオンポンプであり、好塩菌として公知の系統発生的に古代の「細菌」（古細菌）に見出される。これは、レチニリデンタンパク質ファミリーの７回膜貫通型タンパク質であり、光駆動性プロトンポンプバクテリオロドプシンと相同であり、網膜中で光を感知する色素の脊椎動物ロドプシンと三次構造において類似する（しかし、一次配列構造においては類似しない）。ハロロドプシンは、光駆動性イオンチャネルのチャネルロドプシンとも配列類似性を共有する。ハロロドプシンは、必須の光異性化可能ビタミンＡ誘導体オールトランスレチナールを含有する。ハロロドプシンは、結晶構造が公知の数少ない膜タンパク質の１つである。ハロロドプシンアイソフォームは、好塩菌の複数の種、例として、Ｈ．サリナラム（Ｈ．ｓａｌｉｎａｒｕｍ）およびＮ．ファラオニス（Ｎ．ｐｈａｒａｏｎｉｓ）に見出すことができる。非常に進行中の研究はこれらの違いを探究中であり、それらを使用して光周期およびポンプ特性を別個に解析している。バクテリオロドプシンの後に、ハロロドプシンは研究される最良のＩ型（微生物）オプシンであり得る。ハロロドプシンレチナール複合体のピーク吸光度は約５７０ｎｍである。近年、ハロロドプシンは、オプトジェネティクスにおけるツールとなっている。青色光活性化イオンチャネルのチャネルロドプシン－２が、青色光の短いパルスで興奮性細胞（例えば、ニューロン、筋細胞、膵臓細胞、および免疫細胞）を活性化させる能力を開くように、ハロロドプシンは、黄色光の短いパルスで興奮性細胞を静める能力を開く。このように、ハロロドプシンおよびチャネルロドプシンは一緒になって、神経活動の多色光学的な活性化、鎮静、および脱同期を可能とし、強力な神経工学のツールボックスを作出する。
【0048】
一部の実施形態において、プロモーターは、生存網膜神経節中で検出可能である少なくとも１つのレポーター遺伝子を発現する、網膜に標的化されるベクターの一部である。
【0049】
本発明に好適なウイルスベクターは、当分野において周知である。例えば、ＡＡＶ、ＰＲＶまたはレンチウイルスは、遺伝子を網膜神経節に標的化し、送達するのに好適である。
【0050】
単離された網膜を用いて作業する場合、網膜細胞のための最適なウイルス送達は、網膜の光受容器側が露出させられ、したがってより良好に形質移入され得るように、神経節細胞側片を下向きに載せることによって達成できる。また別の技術は、例えば、送達ウイルスが内膜を透過できるように、網膜の内境界膜を例えば安全剃刀を用いてスライスする方法である。また別の方法は、寒天内に網膜を包埋し、前記網膜をスライスし、そして送達ウイルスをスライスの側面から適用する方法である。
【0051】
形質移入された細胞のアウトプットは、周知の方法を使用して、例えば、電気的方法、例えば、多電極アレイもしくはパッチクランプを使用して、または視覚的方法、例えば、蛍光の検出を使用して計測することができる。一部の場合、内境界膜の顕微手術により内境界膜が除去される。他の場合、記録は、内境界膜に実施されたスライスを通して達成される。
【0052】
網膜細胞の任意の供給源を、本発明に使用することができる。本発明の一部の実施形態において、網膜細胞は、ヒト網膜由来であり、またはその中に存在する。他の実施形態において、網膜は、動物からのもの、例えば、ウシまたはげっ歯類起源のものである。ヒト網膜は、前記網膜が通常は角膜の切開後に廃棄される角膜バンクから容易に入手することができる。成人のヒト網膜は大きな表面積（約１１００ｍｍ２）を有するので、このため多数の実験的小区域に容易に分離することができる。さらに、網膜は、脳の残りの部分と同一であるシナプスを有するので、シナプス連絡にとっての申し分のないモデルとして使用することもできる。
【0053】
本明細書において使用される場合、用語「動物」は、全ての動物を含むように本明細書において使用される。本発明の一部の実施形態において、非ヒト動物は脊椎動物である。動物の例は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ネコ、イヌなどである。用語「動物」はまた、胚期および胎生期を含め、全ての発生段階における個々の動物を含む。「遺伝子改変動物」は、細胞下レベルでの意図的な遺伝子操作、例えば、標的化組換え、マイクロインジェクションまたは組換えウイルスの感染によるものにより、直接的または間接的に変更され、または受け入れられた遺伝子情報を担持する１つ以上の細胞を含有する任意の動物である。用語「遺伝子改変動物」は、古典的な交雑も体外受精も包含するものではなく、むしろ、１つ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子により変更され、またはそれを受け入れている動物を包含することを意味する。この組換えＤＮＡ分子は、規定の遺伝子座に特異的に標的化され得、染色体内にランダムに組み込まれ得、またはそれは、染色体外複製ＤＮＡであり得る。用語「生殖細胞系列遺伝子改変動物」は、遺伝子変更または遺伝子情報が生殖系列細胞中に導入され、それにより、遺伝子情報をその子孫へ伝達する能力が付与された遺伝子改変動物を指す。このような子孫が、実際、その変更または遺伝子情報の一部または全部を保有する場合、それらは、同様に遺伝子改変動物である。
【0054】
変更または遺伝子情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来、もしくは特定の個々のレシピエントにとってのみ外来であり得、またはレシピエントにより既に保有される遺伝子情報であり得る。その最後の場合、変更され、または導入された遺伝子は、天然遺伝子とは異なって発現され得、または全く発現され得ない。
【0055】
標的遺伝子を変更するために使用される遺伝子は広範な技術により得ることができ、それとしては、限定されるものではないが、ゲノム資源からの単離、単離ｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接的合成、またはそれらの組合せが挙げられる。
【0056】
導入遺伝子導入のための標的細胞のタイプは、ＥＳ細胞である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養された着床前胚から得ることができ、胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５－２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５－９０６９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５－４４８；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４５８２－４５８４）。導入遺伝子は、標準的技術、例えば、エレクトロポレーションを使用するＤＮＡ形質移入により、またはレトロウイルス媒介性形質導入によりＥＳ細胞中に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、その後、凝集により桑実胚と組み合わせることができ、または非ヒト動物からの胚盤胞中に注射することができる。その後、導入ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８－１４７４）。遺伝子標的化された遺伝子改変マウスの生成における遺伝子標的化されたＥＳ細胞の使用は１９８７年に記載され（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｃｅｌｌ ５１：５０３－５１２）、他箇所で概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｃｅｌｌ ５６：１４５－１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５：７０－７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６：４８１－４９２；Ｗａｇｎｅｒ（１９９０），ＥＭＢＯ Ｊ．９：３０２５－３０３２；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４－５３９）。
【0057】
染色体アレル中に特異的変化を挿入するための標的化相同組換えを使用することにより、任意の遺伝子領域を不活性化させ、または所望される任意の突然変異に変更する技術が利用可能である。
【0058】
本明細書において使用される場合、「標的化遺伝子」は、ヒトの介入により非ヒト動物の生殖細胞系列中に導入されるＤＮＡ配列であり、それとしては、限定されるものではないが、本明細書に記載の方法が挙げられる。本発明の標的化遺伝子としては、同族の内因性アレルを特異的に変化させるように設計されるＤＮＡ配列が挙げられる。
【0059】
本発明において、「単離」は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から取り出された材料を指し、したがって、その天然状態から「人工的に」変更されている。例えば、単離ポリヌクレオチドは、ベクターもしくは物質の組成物の一部であり得、または細胞内に含有され得、依然として「単離」されている。それというのも、そのベクター、物質の組成物、または特定の細胞はそのポリヌクレオチドの元の環境ではないためである。用語「単離」は、ゲノムライブラリーもｃＤＮＡライブラリーも、全細胞トータルＲＮＡ調製物もｍＲＮＡ調製物も、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動により分離され、ブロット上に転写されたものを含む）も、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物も、当分野が本発明のポリヌクレオチド／配列の区別される特色を実証していない他の組成物も指さない。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持された組換えＤＮＡ分子または溶液中の（部分的に、または実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。しかしながら、ライブラリーの他のメンバーから単離されていないライブラリー（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるクローン中に（例えば、ライブラリーのそのクローンおよび他のメンバーを含有する均質な溶液の形態で）、あるいは細胞または細胞溶解物から取り出された染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド」）内に、あるいはランダムに剪断されたゲノムＤＮＡの調製物または１つ以上の制限酵素により切断されたゲノムＤＮＡの調製物内に含有される核酸は、この発明においては、「単離」されていない。本明細書にさらに考察されるとおり、本発明による単離核酸分子は、天然に、組換えにより、または合成により産生することができる。
【0060】
「ポリヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の改変塩基または安定性のためにもしくは他の理由のために改変されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有し得る。「改変」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および異常塩基、例えば、イノシンが挙げられる。種々の改変がＤＮＡおよびＲＮＡになされ得；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に改変された形態を包含する。
【0061】
表現「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、そのポリペプチドについてのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコード配列および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【0062】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の４２℃における一晩のインキュベーションとそれに続く約５０℃における０．１×ＳＳＣ中のフィルターの洗浄を指す。ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーの変化は、主に、ホルムアミド濃度（より低い割合のホルムアミドがストリンジェンシーの低下をもたらす）；塩条件、または温度の操作を通して達成される。例えば、中程度に高いストリンジェンシー条件としては、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中の３７℃における一晩のインキュベーションとそれに続く５０℃における１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が挙げられる。さらに、いっそうより低いストリンジェンシーを達成するため、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実施される洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）において行うことができる。上記の条件における変法は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替ブロッキング試薬の包含および／または置換を通して達成することができる。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の専売配合物が挙げられる。規定のブロッキング試薬の包含は、適合性についての問題に起因して上記のハイブリダイゼーション条件の改変を要求し得る。
【0063】
ポリペプチドに言及する場合の用語「断片」、「誘導体」および「アナログ」は、そのようなポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性のいずれかを保持するポリペプチドを意味する。アナログとしては、プロタンパク質部分の開裂により活性化させて活性成熟ポリペプチドを産生することができるプロタンパク質が挙げられる。
【0064】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それは、コード領域に先行する領域およびその後に続く領域「リーダーおよびトレーラー」ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【0065】
ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結しているアミノ酸または改変ペプチド結合により互いに連結しているアミノ酸、すなわち、ペプチドイソスターから構成され得、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、天然プロセス、例えば、翻訳後プロセシング、または当分野において周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾することができる。このような修飾は、基礎的な教本およびより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究論文に十分記載されている。修飾は、ポリペプチド中のいずれの箇所においても生じ得、その箇所としては、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端が挙げられる。同一のタイプの修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位において同一または変動する程度で存在し得ることが認識される。さらに、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝鎖であり得、それらは分枝を有し、または分枝を有さない環状であり得る。環状、分枝鎖、および分枝鎖環状ポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じ得、または合成方法により作製することができる。修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ビオチン化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性付着、ヘム部分の共有結合性付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性付着、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合性付着、架橋、環化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング（例えば、開裂）、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、例えば、アルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ－ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．Ｉ－１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６－６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８－６２（１９９２）参照）。
【0066】
「生物学的活性を有する」ポリペプチド断片は、用量依存性を伴い、または伴わない、特定の生物学的アッセイにおいて計測される元のポリペプチド、例えば、成熟形態の活性と類似するが必ずしも同一でなくてもよい活性を示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、それは、ポリペプチドのそれと同一である必要はなく、むしろ、元のポリペプチドと比較して所与の活性において用量依存性と実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、元のポリペプチドに対して高い活性または約２５倍以下少ない、一部の実施形態においては、約１０倍以下少ない活性、もしくは約３倍以下少ない活性を示す）。
【0067】
種ホモログは、本明細書に提供される配列から好適なプローブまたはプライマーを作製し、好適な核酸資源を所望のホモログについてスクリーニングすることにより単離および同定することができる。
【0068】
「バリアント」は、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その必須の特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。一般に、バリアントは、元のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと全体的に密接に類似し、多くの領域において、同一である。
【0069】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか否かは、慣用的には、公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的なマッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｌｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列および対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することにより比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性におけるものである。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ユニタリー、ｋ－タプル＝４、ミスマッチペナルティ－－１、結合ペナルティ－－３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝ｌ、ギャップペナルティ－－５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。対象配列が、内部欠失のためではなく５’または３’欠失に起因してクエリ配列よりも短い場合、その結果を手作業により補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、パーセント同一性を計算する場合、対象配列の５’および３’トランケーションを考慮しないためである。クエリ配列に対して５’または３’末端においてトランケートされた対象配列について、パーセント同一性は、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、マッチング／アラインメントされていない対象配列の５’および３’であるクエリ配列の塩基の数を計算することにより補正される。ヌクレオチドがマッチング／アラインメントされているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、この割合は、規定のパラメータを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性から減算され、最終のパーセント同一性スコアに達する。この補正スコアが、本発明のために使用されるものである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによりディスプレイされる対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみが、パーセント同一性スコアを手作業により調整する目的に計算される。例えば、９０塩基の対象配列は、１００塩基のクエリ配列とアラインメントされてパーセント同一性が決定される。欠失は対象配列の５’末端において生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端における最初の１０塩基のマッチング／アラインメントを示さない。この１０個の損なわれた塩基はその配列の１０％（マッチングされていない５’および３’末端における塩基の数／クエリ配列中の塩基の総数）に相当し、したがって、１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０塩基が完全にマッチした場合、最終のパーセント同一性は９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリ配列と比較される。この場合、欠失は内部欠失であるため、クエリとマッチング／アラインメントされていない対象配列の５’にも３’にも塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は、手作業により補正されない。再度述べると、クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない対象配列の５’および３’の塩基のみが手作業により補正される。
【0070】
本発明のクエリアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、対象ポリペプチド配列がクエリアミノ酸配列のそれぞれの１００アミノ酸につき５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除きクエリ配列と同一であることが意図される。換言すると、クエリアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るため、対象配列中のアミノ酸残基の５％までを挿入し、欠失し、または別のアミノ酸と置換することができる。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置において、またはそれらの末端位置の間のいずれの箇所でも、参照配列中の残基の間に個々に、または参照配列内の１つ以上の連続する群として散在して生じ得る。
【0071】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列に示されるアミノ酸配列または寄託ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか否かは、慣用的には、公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的なマッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列および対象配列は両方ともヌクレオチド配列または両方ともアミノ酸配列のいずれかである。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性におけるものである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ＰＡＭ０、ｋ－タプル＝２、ミスマッチペナルティ－－Ｉ、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝ｌ、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ－－５、ギャップサイズペナルティ－－０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。対象配列が、内部欠失のためではなくＮまたはＣ末端欠失に起因してクエリ配列よりも短い場合、その結果を手作業により補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバルパーセント同一性を計算する場合、対象配列のＮおよびＣ末端トランケーションを考慮しないためである。クエリ配列に対してＮおよびＣ末端においてトランケートされた対象配列について、パーセント同一性は、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、対応する対象残基とマッチング／アラインメントされていない、対象配列のＮおよびＣ末端であるクエリ配列の残基の数を計算することにより補正される。残基がマッチング／アラインメントされているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、この割合は、規定のパラメータを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性から減算され、最終のパーセント同一性スコアに達する。この最終パーセント同一性スコアが、本発明のために使用されるものである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、対象配列のＮおよびＣ末端にある残基のみが、パーセント同一性スコアを手作業により調整する目的に考慮される。それは、対象配列の最も遠いＮおよびＣ末端残基の外側のクエリ残基位置のみである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいてディスプレイされる対象配列のＮおよびＣ末端の外側の残基位置のみが手作業により補正される。他の手作業による補正は、本発明のために行われるべきでない。
【0072】
天然に存在するタンパク質バリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ １１，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかにおいて変動し得る。あるいは、天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技術により、または直接的合成により産生することができる。
【0073】
「標識」は、直接的に、またはシグナル産生系の１つ以上の追加のメンバーとの相互作用を通して、検出可能なシグナルを提供し得る薬剤を指す。直接的に検出可能であり、本発明において使用することができる標識としては、蛍光標識が挙げられる。具体的なフルオロフォアとしては、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素などが挙げられる。
【0074】
「蛍光標識」は、ある波長の光を、別の波長の光により活性化された場合に放射する能力を有する任意の標識を指す。
【0075】
「蛍光」は、蛍光シグナルの任意の検出可能な特徴を指し、それとしては、強度、スペクトル、波長、細胞内分布などが挙げられる。
【0076】
蛍光を「検出すること」は、定性的または定量的方法を使用して細胞の蛍光を評価することを指す。本発明の実施形態の一部において、蛍光は、定性的様式で検出される。換言すれば、組換え融合タンパク質が発現されるか否かを示す蛍光マーカーが存在するか否かである。他の例として、蛍光は、例えば、蛍光強度、スペクトル、または細胞内分布を計測する定量的手段を使用して測定することができ、異なる条件下で得られる値の統計的比較を可能とする。レベルは、定性的方法、例えば、複数の試料、例えば、蛍光顕微鏡または他の光学的検出器（例えば、画像分析システムなど）を使用して検出される試料のヒトによる目視分析および比較を使用して測定することもができる。蛍光における「変更」または「モジュレーション」は、別の条件と比較した特定の条件下での蛍光の強度、細胞内分布、スペクトル、波長、または他の側面における任意の検出可能な差を指す。例えば、「変更」または「モジュレーション」は定量的に検出され、その差は統計的に有意な差である。蛍光における任意の「変更」または「モジュレーション」は、標準的な機器、例えば、蛍光顕微鏡、ＣＣＤ、もしくは任意の他の蛍光検出器を使用して検出することができ、自動システム、例えば、統合システムを使用して検出することができ、またはヒト観測者による変更の主観的検出を反映し得る。
【0077】
「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）は、青色光に曝露された場合に緑色の蛍光を発する、クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）／エクオレア・エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ａｅｑｕｏｒｅａ）／エクオレア・フォルスカレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｆｏｒｓｋａｌｅａ）から最初に単離された、２３８アミノ酸（２６．９ｋＤａ）から構成されるタンパク質である。Ａ．ビクトリア（Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ）からのＧＦＰは、３９５ｎｍの波長におけるメジャー励起ピークおよび４７５ｎｍにおけるマイナーピークを有する。この発光ピークは５０９ｎｍであり、それは、可視スペクトルの低い方の緑色部分に存在する。ウミシイタケ（レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））からのＧＦＰは、４９８ｎｍにおける単一のメジャー励起ピークを有する。広範な使用法の潜在性および研究者らの発展的要望に起因して、ＧＦＰの多くの異なる突然変異体が遺伝子操作されている。最初の主要な改善は、Ｒｏｇｅｒ ＴｓｉｅｎによりＮａｔｕｒｅにおいて１９９５年に報告された単一点突然変異（Ｓ６５Ｔ）であった。この突然変異は、ＧＦＰのスペクトル特徴を大幅に改善し、増加した蛍光、光安定性およびピーク放射を５０９ｎｍに保持したままでのメジャー励起ピークの４８８ｎｍへのシフトをもたらした。この足場への３７℃フォールディング効率（Ｆ６４Ｌ）点突然変異体の追加は、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を生じさせた。ＥＧＦＰは、９．１３×１０－２１ｍ２／分子の光学的断面積としても公知であり、５５，０００Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）としても引用される、消衰係数（εと表示される）を有する。十分にフォールディングしていないペプチドと融合した場合でさえもＧＦＰが迅速にフォールディングし、成熟するのを可能とする一連の突然変異であるスーパーフォールダー（Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）ＧＦＰが２００６年に報告された。
【0078】
「黄色蛍光タンパク質」（ＹＦＰ）は、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光タンパク質の遺伝子突然変異体である。この励起ピークは５１４ｎｍであり、その発光ピークは５２７ｎｍである。
【0079】
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他に記述しない限り、複数の参照対象を含む。
【0080】
「ウイルス」は、宿主細胞の外側では成長も繁殖もし得ない超顕微鏡的感染性物質である。それぞれのウイルス粒子、またはビリオンは、キャプシドと呼ばれる保護タンパク質コート内の遺伝子材料、ＤＮＡ、またはＲＮＡからなる。キャプシド形状は、単純ならせんおよび正二十面体（多面体またはほぼ球形）形態から、尾部またはエンベロープを有するより複雑な構造まで変動する。ウイルスは、細胞生物形態に感染し、感染される宿主のタイプに応じて動物、植物および細菌タイプに分類される。
【0081】
本明細書において使用される場合、用語「経シナプス性ウイルス」は、あるニューロンから別の介在ニューロンにシナプスを通って移動し得るウイルスを指す。このような経シナプス性ウイルスの例は、ラブドウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、およびアルファヘルペスウイルス、例えば、仮性狂犬病ウイルスまたは単純ヘルペスウイルスである。本明細書において使用される場合、用語「経シナプス性ウイルス」はまた、あるニューロンから別の介在ニューロンにシナプスを通って移動する能力をそれ自体で有するウイルスのサブユニットおよび生物学的ベクター、例えば、そのようなサブユニットを組み込み、あるニューロンから別の介在ニューロンにシナプスを通って移動する能力を実証する改変ウイルスを包含する。
【0082】
経シナプス性移動は、順行性または逆行性のいずれかであり得る。逆行性移動の間、ウイルスは、シナプス後ニューロンからシナプス前ニューロンに動く。したがって、順行性移動の間、ウイルスは、シナプス前ニューロンからシナプス後ニューロンに動く。
【0083】
ホモログは、共通の祖先を共有するタンパク質を指す。アナログは、共通の祖先を共有しないが、それらを１つのクラスに含めることにさせるいくつかの（構造的よりむしろ）機能的な類似性を有する（例えば、トリプシン様セリンプロテイナーゼおよびサブチリシンは明らかに関連せず、活性部位の外側のそれらの構造は完全に異なるが、それらは、事実上幾何的に同一の活性部位を有し、したがって、アナログへの収束進化の一例とみなされる）。
【0084】
ホモログの２つのサブクラスのオルソログおよびパラログが存在する。オルソログは、異なる種における同一遺伝子である（例えば、シトコム（ｃｙｔｏｃｈｏｍｅ）「ｃ」）。同一生物体における２つの遺伝子は、オルソログであり得ない。パラログは遺伝子重複の結果である（例えば、ヘモグロビンベータおよびデルタ）。２つの遺伝子／タンパク質が相同であり、同一生物体内に存在する場合、それらはパラログである。
【0085】
本明細書において使用される場合、用語「障害」は、不快感、疾患、疾病、臨床病態、または病的状態を指す。
【0086】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、化学的に不活性であり、それが投与される患者に対して毒性ではない担体媒体を指す。
【0087】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な誘導体」は、対象に対して比較的無毒である、例えば、本発明のスクリーニングの方法を使用して同定される薬剤の任意のホモログ、アナログ、または断片を指す。
【0088】
用語「治療剤」は、障害または障害の合併症の予防または治療を補助する任意の分子、化合物、または治療物を指す。
【0089】
適合性医薬担体中に配合されたそのような薬剤を含む組成物は、治療のために調製し、包装し、ラベル貼付することができる。
【0090】
複合体が水溶性である場合、それは、適切な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または他の生理学的に適合性の溶液中で配合することができる。
【0091】
あるいは、得られた複合体が水性溶媒中で不十分な溶解度を有する場合、それは、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、またはポリエチレングリコールと共に配合することができる。したがって、化合物および生理学的に許容可能なその溶媒和物は、（口腔または鼻腔のいずれかを介する）吸入もしくは吹送による投与または経口、バッカル、非経口、直腸投与のために配合することができ、または腫瘍の場合、固形腫瘍中に直接注射することができる。
【0092】
経口投与について、医薬製剤は、液体形態、例えば、液剤、シロップ剤もしくは懸濁液剤であり得、または使用前の水もしくは他の好適なビヒクルによる再構成のための薬物製品として提供することができる。このような液体製剤は、薬学的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水添食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシアガム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピルｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を用いて慣用の手段により調製することができる。医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて慣用の手段により調製される、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当分野において周知の方法によりコーティングすることができる。
【0093】
経口投与のための製剤は、活性化合物の徐放性を与えるように好適に配合することができる。
【0094】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、添加される保存剤と共に、単位剤形中で、例えば、アンプル中または複数用量容器中で提供することができる。
【0095】
組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションのような形態をとり得、配合用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、例えば、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前の好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水による構成のための粉末の形態であり得る。
【0096】
化合物は、例えば、局所的適用、例えば、クリーム剤またはローション剤として配合することもできる。
【0097】
上記の配合物に加えて、化合物はまた、デポー製剤として配合することができる。このような長時間作用性配合物は、埋込（例えば、眼内、皮下または筋肉内）により、または眼内注射により投与することができる。
【0098】
したがって、例えば、化合物は、好適なポリマーもしくは疎水性材料と共に（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）、またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として配合することができる。リポソームおよびエマルションは、親水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の周知の例である。
【0099】
組成物は、所望により、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得るパックまたは分注装置中で提供することができる。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。パックまたは分注装置には、投与についての説明書を添付することができる。
【0100】
本発明はまた、本発明の治療レジメンを実施するためのキットを提供する。このようなキットは、１つ以上の容器中で、治療または予防有効量の組成物を薬学的に許容可能な形態で含む。
【0101】
キットのバイアル中の組成物は、例えば、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液、または他の薬学的に許容可能な滅菌流体との組合せで、薬学的に許容可能な溶液の形態であり得る。あるいは、複合体は、凍結乾燥または乾燥させることができ；この場合、キットは、場合により、容器中で複合体を再構成して注射目的の溶液を形成するための好ましくは滅菌した薬学的に許容可能な溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液など）をさらに含む。
【0102】
別の実施形態において、キットは、複合体を注射するための、好ましくは無菌形態で包装された針もしくはシリンジ、および／または包装されたアルコールパッドをさらに含む。臨床医または患者による組成物の投与についての説明書が場合により含まれる。
【0103】
「網膜神経節細胞」（ＲＧＣ）は、眼の網膜の内表面（神経節細胞層）の近くに位置するニューロンの１つのタイプである。ＲＧＣは、光受容器から２つの中間型ニューロンである双極細胞および網膜アマクリン細胞を介して視覚情報を受け取る。網膜神経節細胞は、網膜から画像形成および非画像形成視覚情報を活動電位の形態で視床、視床下部および中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎもしくはｍｉｄｂｒａｉｎ）内のいくつかの領域に集合的に伝達する。網膜神経節細胞は、それらのサイズ、結合部および視覚刺激への反応に関しては大きく異なるが、それらは全てが脳内に伸びる長い軸索を有するという決定的な特性を共有している。これらの軸索は、視神経、視神経交叉および視索を形成する。少ないパーセンテージの網膜神経節細胞は視覚にほとんどもしくは全く寄与しないが、それら自体が光感受性である；それらの軸索は網膜視床下部路を形成し、概日リズムおよび瞳孔のサイズ調整である瞳孔対光反射に寄与する。
【0104】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は説明のためのものにすぎず、限定的なものではない。
【実施例】
【0105】
ベクター構築物
本試験で使用した合成プロモーターは、ハリネズミアシルトランスフェラーゼ様（Ｈｈａｔｌ）をコードするマウス遺伝子の翻訳開始コドン前の２０００ｂｐからなる。ＧＦＰコーディング配列はこのプロモーターおよび最適化コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）の直後に挿入され、それにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）およびＳＶ４０ポリアデニル化部位が続いた。７．７Ｅ＋０９ＧＣ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ血清型２／８を使用して、マウス網膜ニューロンを標的化した。２．９Ｅ＋１３ＧＣ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ血清型ＢＰ２を使用して、非ヒト霊長類網膜ニューロンを標的化した。
本試験で使用した合成プロモーターは、ハリネズミアシルトランスフェラーゼ様（Ｈｈａｔｌ）をコードするマウス遺伝子の翻訳開始コドン前の２０００ｂｐからなる。ＧＦＰコーディング配列はこのプロモーターおよび最適化コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）の直後に挿入され、それにウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）およびＳＶ４０ポリアデニル化部位が続いた。７．７Ｅ＋０９ＧＣ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ血清型２／８を使用して、マウス網膜ニューロンを標的化した。２．９Ｅ＋１３ＧＣ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ血清型ＢＰ２を使用して、非ヒト霊長類網膜ニューロンを標的化した。
【0106】
ウイルス形質移入および組織製剤
マウスにおけるＡＡＶ投与のため、麻酔した動物の眼に先の尖った３０ゲージ針によって水晶体の近くで強膜を穿刺した。ハミルトンシリンジによって網膜下に２μＬのＡＡＶ粒子懸濁液を注射した。３週間後、単離した網膜を３０分間にわたりＰＢＳ中の４％のＰＦＡ中で固定し、次いでＰＢＳ中で４℃において洗浄ステップを行った。全網膜は、室温で１時間にわたり１０％の標準ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、ＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により処理した。ＰＢＳ中の３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中のモノクローナルラット抗ＧＦＰ Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：５００）およびポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：２００）による処理を、室温において５日間実施した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：２００）、抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６３３およびＨｏｅｃｈｓｔによる処理を２時間行った。切片を洗浄し、スライドガラス上にＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止用試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）と共に載せ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）を使用してイメージングした。非ヒト霊長類におけるＡＡＶ投与のためには、Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｃｈｉｎａの眼科医および外部委託先と連携して、５０μＬのＡＡＶ粒子懸濁剤を網膜下に注射した。３カ月後、単離した眼杯を一晩、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡ中で固定し、次いでＰＢＳ中で４℃において洗浄ステップを行った。固定した眼杯を受領した後、感染した網膜領域をバラバラにし、マウス組織について上述した処理と同一の処理を行った。
本発明は、以下の態様を提供しうる。
[１]
配列番号１の核酸配列を含み、もしくはそれからなり、または配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１８００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、網膜神経節細胞中の遺伝子の特異的発現を、前記遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にもたらす単離核酸分子。
[２]
最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記[１]に記載の単離核酸分子。
[３]
上記[１]または[２]に記載の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子。
[４]
規定の細胞中の遺伝子発現を促進するエレメントとして上記[１]または[２]に記載の単離核酸を含む発現カセットであって、前記単離核酸が、少なくとも、網膜神経節細胞中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセット。
[５]
上記[４]に記載の発現カセットを含むベクター。
[６]
ウイルスベクターである、上記[５]に記載のベクター。
[７]
網膜神経節細胞中の遺伝子の前記発現のための、上記[１]もしくは[２]に記載の核酸の、上記[４]に記載の発現カセットの、または上記[５]に記載のベクターの使用。
[８]
単離細胞、細胞系または細胞集団に上記[４]に記載の発現カセットを形質移入するステップを含む、網膜神経節細胞中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞が網膜神経節であり、または前記細胞が網膜神経節を含む場合、発現させるべき前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系または前記細胞集団により特異的に発現させる方法。
[９]
上記[４]に記載の発現カセットまたは上記[５]に記載のベクターを含む単離細胞。
[１０]
前記発現カセットまたはベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、上記[９]に記載の細胞。
[１１]
前記遺伝子の産物が、光感受性分子、例えば、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、上記[１]もしくは[２]に記載の単離核酸分子、上記[４]に記載の発現カセット、上記[５]に記載のベクター、上記[７]に記載の使用、上記[８]に記載の方法または上記[９]に記載の細胞。
[１２]
上記[１]または[２]に記載の単離核酸分子を含む、網膜神経節細胞中で遺伝子を発現させるためのキット。
マウスにおけるＡＡＶ投与のため、麻酔した動物の眼に先の尖った３０ゲージ針によって水晶体の近くで強膜を穿刺した。ハミルトンシリンジによって網膜下に２μＬのＡＡＶ粒子懸濁液を注射した。３週間後、単離した網膜を３０分間にわたりＰＢＳ中の４％のＰＦＡ中で固定し、次いでＰＢＳ中で４℃において洗浄ステップを行った。全網膜は、室温で１時間にわたり１０％の標準ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、ＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により処理した。ＰＢＳ中の３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中のモノクローナルラット抗ＧＦＰ Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：５００）およびポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：２００）による処理を、室温において５日間実施した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：２００）、抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６３３およびＨｏｅｃｈｓｔによる処理を２時間行った。切片を洗浄し、スライドガラス上にＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止用試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）と共に載せ、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）を使用してイメージングした。非ヒト霊長類におけるＡＡＶ投与のためには、Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｃｈｉｎａの眼科医および外部委託先と連携して、５０μＬのＡＡＶ粒子懸濁剤を網膜下に注射した。３カ月後、単離した眼杯を一晩、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡ中で固定し、次いでＰＢＳ中で４℃において洗浄ステップを行った。固定した眼杯を受領した後、感染した網膜領域をバラバラにし、マウス組織について上述した処理と同一の処理を行った。
本発明は、以下の態様を提供しうる。
[１]
配列番号１の核酸配列を含み、もしくはそれからなり、または配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１８００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、網膜神経節細胞中の遺伝子の特異的発現を、前記遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にもたらす単離核酸分子。
[２]
最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記[１]に記載の単離核酸分子。
[３]
上記[１]または[２]に記載の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子。
[４]
規定の細胞中の遺伝子発現を促進するエレメントとして上記[１]または[２]に記載の単離核酸を含む発現カセットであって、前記単離核酸が、少なくとも、網膜神経節細胞中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセット。
[５]
上記[４]に記載の発現カセットを含むベクター。
[６]
ウイルスベクターである、上記[５]に記載のベクター。
[７]
網膜神経節細胞中の遺伝子の前記発現のための、上記[１]もしくは[２]に記載の核酸の、上記[４]に記載の発現カセットの、または上記[５]に記載のベクターの使用。
[８]
単離細胞、細胞系または細胞集団に上記[４]に記載の発現カセットを形質移入するステップを含む、網膜神経節細胞中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞が網膜神経節であり、または前記細胞が網膜神経節を含む場合、発現させるべき前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系または前記細胞集団により特異的に発現させる方法。
[９]
上記[４]に記載の発現カセットまたは上記[５]に記載のベクターを含む単離細胞。
[１０]
前記発現カセットまたはベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、上記[９]に記載の細胞。
[１１]
前記遺伝子の産物が、光感受性分子、例えば、ハロロドプシンまたはチャネルロドプシンである、上記[１]もしくは[２]に記載の単離核酸分子、上記[４]に記載の発現カセット、上記[５]に記載のベクター、上記[７]に記載の使用、上記[８]に記載の方法または上記[９]に記載の細胞。
[１２]
上記[１]または[２]に記載の単離核酸分子を含む、網膜神経節細胞中で遺伝子を発現させるためのキット。
【図1】
【図2】
【配列表】