▶ ヘルプ・ステム・セル・イノベイションズ・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-29
(45)【発行日】2022-08-08
(54)【発明の名称】分化用培地及びオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0797 20100101AFI20220801BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20220801BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0797
C12N5/0793
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021517093
(86)(22)【出願日】2019-05-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-24
(86)【国際出願番号】 CN2019089625
(87)【国際公開番号】W WO2019228518
(87)【国際公開日】2019-12-05
【審査請求日】2020-11-27
(31)【優先権主張番号】201810553985.9
(32)【優先日】2018-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520467198
【氏名又は名称】ヘルプ・ステム・セル・イノベイションズ・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＬＰ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ツイ・ヤット・ピン
(72)【発明者】
【氏名】ワン・ジアシエン
(72)【発明者】
【氏名】チャン・イン・シン
(72)【発明者】
【氏名】シュム・クォック・ヤン・デイジー
(72)【発明者】
【氏名】ウー・ラップ・ケイ・ケネス
(72)【発明者】
【氏名】ラム・ガイ
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－２６３８２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－０４７１４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１２１９４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１４－０７６０４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０１７４３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０４４５０６１８（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２１１２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２７１５８４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１８７６８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－０１１４１３０（ＫＲ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１４６８３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２１６３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１９０７２９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０３０４６４７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０４０７３４６８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１２４５３３６（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１１－２１９４３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－２０２１８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０７５６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０６５８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２４３４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０３２１９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地であって、前記培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地、０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含むことを特徴とする培地。
【請求項2】
前記培地が、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で混合した基礎培地、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、１％のＮ２、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項3】
前記培地が、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地、０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、１～１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項4】
前記培地が、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で混合した基礎培地、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、１％のＮ２、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、１００ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む、ことを特徴とする請求項３に記載の培地。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の培地によりオリゴデンドロサイト前駆細胞を製造する方法において、前記培地を調製するステップ、
濃度が２．５～２５μｇ／ｍｌのＰＬＯ及び２．５～２５μｇ／ｍｌのラミニンで細胞培養容器にコーティングした後、前記培地を加え、１×１０４～５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で神経幹細胞を前記細胞培養容器に播種するステップ、および
オリゴデンドロサイト前駆細胞が前記培地に現れるまで培地を定期的に交換するステップ、
を含むことを特徴とするオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項6】
前記細胞培養容器が６ウェルプレートである、ことを特徴とする請求項５に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項7】
神経幹細胞を前記細胞培養容器に４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種する、ことを特徴とする請求項５に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項8】
前記神経幹細胞が、
神経幹細胞用培地として、０．５％～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％～５％のＢ２７、１０～６０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０～６０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５～４０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地を調製するステップ、
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、７５００～２００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で細胞非接着性培養容器に播種するステップ、および
前記神経幹細胞用培地を定期的に交換し、前記神経幹細胞はニューロスフェアとして前記神経幹細胞用培地に存在するステップ、
によって製造される、ことを特徴とする請求項５に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項9】
前記神経幹細胞が、
神経幹細胞用培地として、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地を調製するステップ、および
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で細胞非接着性培養容器に播種して培養するステップ、
によって製造される、ことを特徴とする請求項８に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項10】
前記ニューロスフェアを、１００ｇ～３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離して前記神経幹細胞用培地から分離する、ことを特徴とする請求項８に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項11】
前記骨髄間葉系幹細胞は、骨髄から以下の手順で調製されてなり、前記手順は、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地で前記骨髄を培養し、４８時間後に培地及び非接着細胞を取り除いて培養を続け；
培地に骨髄間葉系幹細胞のクローンが現れると、培地にＣＤ４５陽性細胞の含有量が１％未満になるまで４００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度でＳｔｅｍ Ｐｒｏ培地に播種して継代培養を行う、ことを特徴とする請求項８～１０のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【請求項12】
神経幹細胞を調製するための骨髄間葉系幹細胞ＳＴＲＯ－１、ＣＤ９０及びＣＤ７３陽性発現量が９０％より大きく、Ｎｅｓｔｉｎ陽性発現量が５％より大きく、且つＣＤ４５陽性発現量が１％未満である、ことを特徴とする請求項１１に記載のオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞分化の技術分野に関し、特に、培地及びオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
髄鞘は、神経系の重要な構造であり、脱髄疾患は、認知、記憶、運動などの機能障害を引き起こし、患者の生活の質に深刻な影響を与える恐れがある。
髄鞘は、脊椎動物の中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ、 ＣＮＳ）でオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ、 ＯＬｓ）がニューロンの軸索に巻き付いてなるものであり、神経発達の初期段階では、神経前駆細胞が最初にニューロンを生じた後、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、 ＯＰｓ）の生成を開始し、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、神経系の他の部分に遊走し、増殖し、最終的に成熟したオリゴデンドロサイト（ＯＬｓ）に分化して髄鞘を形成する。
髄鞘は、脊椎動物の中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ、 ＣＮＳ）でオリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ、 ＯＬｓ）がニューロンの軸索に巻き付いてなるものであり、神経発達の初期段階では、神経前駆細胞が最初にニューロンを生じた後、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、 ＯＰｓ）の生成を開始し、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、神経系の他の部分に遊走し、増殖し、最終的に成熟したオリゴデンドロサイト（ＯＬｓ）に分化して髄鞘を形成する。
【0003】
現在、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験の両方では、オリゴデンドロサイト前駆細胞が増殖、遊走及び分化後の髄鞘形成能を有することを証明しているため、オリゴデンドロサイト前駆細胞の移植は、髄鞘障害性疾患を治療するための有効な手段であり、最近の研究は、オリゴデンドロサイト前駆細胞移植の研究のホットスポットは髄鞘障害に関連する脊髄損傷の修復にあることを示す。
多能性幹細胞研究の推進に伴い、オリゴデンドロサイト前駆細胞の供給源の問題も解決されている。現在、多能性幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化は、主にオリゴデンドロサイトのｉｎ ｖｉｖｏでの自然発生過程を参照してシミュレートし、まず、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化誘導し、さらに、オリゴデンドロサイト前駆細胞に分化する。しかしながら、現在、多能性幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化の手順は、複雑で手間がかかり、培養プロセス全体には約４か月程度かかり、長いものには６か月かかり、細胞療法又は疾患モデルの構築におけるＯＰｓの適用を大幅に制限している。今まで、神経上皮細胞からＯＰｓへの培養方法では、培地にウシ胎児血清、非ヒトアルブミン又は非ヒト由来成長因子などの異物を多く添加し、臨床応用におけるＯＰｓのリスクが増加している。現在、多くの学者は、分化時間を短縮し、分化の効率を向上させることができる培地及び培養方法にの研究に専念している。
多能性幹細胞研究の推進に伴い、オリゴデンドロサイト前駆細胞の供給源の問題も解決されている。現在、多能性幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化は、主にオリゴデンドロサイトのｉｎ ｖｉｖｏでの自然発生過程を参照してシミュレートし、まず、多能性幹細胞を神経上皮細胞に分化誘導し、さらに、オリゴデンドロサイト前駆細胞に分化する。しかしながら、現在、多能性幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化の手順は、複雑で手間がかかり、培養プロセス全体には約４か月程度かかり、長いものには６か月かかり、細胞療法又は疾患モデルの構築におけるＯＰｓの適用を大幅に制限している。今まで、神経上皮細胞からＯＰｓへの培養方法では、培地にウシ胎児血清、非ヒトアルブミン又は非ヒト由来成長因子などの異物を多く添加し、臨床応用におけるＯＰｓのリスクが増加している。現在、多くの学者は、分化時間を短縮し、分化の効率を向上させることができる培地及び培養方法にの研究に専念している。
【発明の概要】
【0004】
外因子なしの条件下でオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する効率を向上させるために、一方、本発明の実施形態の一態様は、神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地を提供し、前記培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
本発明で提供される神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化する時間を短縮し、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化効率を向上させ、ここで、前記培地に２－メルカプトエタノールを添加することにより、細胞の抗酸化能力を向上し、細胞生存率を高めるだけでなく、前記２－メルカプトエタノールと培地でのＰＤＧＦ－ＡＡ及びβ－ＨＲＧ１との組み合わせ作用にり、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を大幅に高めることができる。
本発明で提供される神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地は、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化する時間を短縮し、神経幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化効率を向上させ、ここで、前記培地に２－メルカプトエタノールを添加することにより、細胞の抗酸化能力を向上し、細胞生存率を高めるだけでなく、前記２－メルカプトエタノールと培地でのＰＤＧＦ－ＡＡ及びβ－ＨＲＧ１との組み合わせ作用にり、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を大幅に高めることができる。
【0005】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率及び最終製品の純度をさらに向上させるために、好ましくは、前記神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地において、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、１％Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール、１％のＰ／Ｓを含む。
さらに好ましくは、前記培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、２～２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
さらに好ましくは、前記培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、２～２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0006】
前記培地にＩＧＦ－１及びＷｎｔ３Ａを添加することにより、細胞生存率をさらに向上させ、オリゴデンドロサイト前駆細胞の生産量を増加させ、神経幹細胞からグリア細胞への分化を促進し、分化効率をさらに向上させることができ、ここで、培地中のＩＧＦ－１及びＷｎｔ３Ａの濃度は、それぞれ２～２５ｎｇ／ｍｌ及び１～１０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
さらにオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を向上させ、その生産量を増加させるために、前記神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地において、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、１％のＮ２、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、１００ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
さらにオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を向上させ、その生産量を増加させるために、前記神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるための培地において、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で混合した基礎培地を含み、さらに、最終濃度が１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、１％のＮ２、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、１００ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0007】
他方、本発明の実施形態の別の一態様は、オリゴデンドロサイト前駆細胞を製造する方法において、
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地を含み、さらに最終濃度が０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む培地を調製するステップと、
濃度が２．５～２５μｇ／ｍｌのＰＬＯ及び２．５～２５μｇ／ｍｌのラミニンで細胞培養容器にコーティングした後、上記ステップに記載の培地を加え、１×１０４～５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で神経幹細胞を前記細胞培養容器に播種するステップと、
細胞に十分な成長因子及び栄養素があることを保証する条件下でオリゴデンドロサイト前駆細胞が前記培地に現れるまで前記培地を定期的に交換し、前記培地を４８ｈおきに定期的に交換してもよいステップと、を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法を提供する。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを混合した基礎培地を含み、さらに最終濃度が０．５～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１～５％のＢ２７、０．５～２．５％のＮ２、２～２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２～２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５～２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１～２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む培地を調製するステップと、
濃度が２．５～２５μｇ／ｍｌのＰＬＯ及び２．５～２５μｇ／ｍｌのラミニンで細胞培養容器にコーティングした後、上記ステップに記載の培地を加え、１×１０４～５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で神経幹細胞を前記細胞培養容器に播種するステップと、
細胞に十分な成長因子及び栄養素があることを保証する条件下でオリゴデンドロサイト前駆細胞が前記培地に現れるまで前記培地を定期的に交換し、前記培地を４８ｈおきに定期的に交換してもよいステップと、を含む、オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法を提供する。
【0008】
オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化過程中では、細胞間相互作用が分化効率に影響を与え、１×１０４～５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度でオリゴデンドロサイト前駆細胞の数を確保した上で分化効率を向上させており、播種密度が５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２より高く又は１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２より低い場合には、同じ数のオリゴデンドロサイト前駆細胞の調製には、より長い分化時間がかかる。
ここで、分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞を臨床適用基準に近づけるか、又は満たすために、細胞培養容器にコーティングされるラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）は、ヒト由来ラミニンであることが好ましい。
ここで、分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞を臨床適用基準に近づけるか、又は満たすために、細胞培養容器にコーティングされるラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）は、ヒト由来ラミニンであることが好ましい。
【0009】
さらに好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、神経幹細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で前記細胞培養容器に播種し、その条件下で、播種日から５日間程度かけてオリゴデンドロサイト前駆細胞が観察され、第８日目まで培養し、当業者に周知の方法により純度が９０％より高いオリゴデンドロサイト前駆細胞を得ることができ、さらに臨床研究に適用するか、又は細胞製剤の活性成分として髄鞘障害に関連する疾患に適用することができる。
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記細胞培養容器は６ウェルプレートである。細胞密度を確保することを前提として、他の細胞培養プレート又は培養皿、例えば、１２ウェルプレート、２４ウェルプレートが除外されなく、又は実際に分化する必要があるオリゴデンドロサイトの量に従って細胞培養皿を選択して分化する。
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記細胞培養容器は６ウェルプレートである。細胞密度を確保することを前提として、他の細胞培養プレート又は培養皿、例えば、１２ウェルプレート、２４ウェルプレートが除外されなく、又は実際に分化する必要があるオリゴデンドロサイトの量に従って細胞培養皿を選択して分化する。
【0010】
本発明に係る実施例で提供されるオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法で用いれる神経幹細胞は、当業者に周知の様々な方法により調製された神経幹細胞であってもよく、好ましくは、前記神経幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞に由来し、骨髄間葉系幹細胞から本発明で提供される方法で調製されるオリゴデンドロサイト前駆細胞は、明らかな拒絶反応なしに種を越えて髄鞘障害治療又は他の研究に適用することができる。
本発明に係る実施例の別の目的は、骨髄間葉系幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製するプロセスを安定的に制御しながらオリゴデンドロサイト前駆細胞品質を向上させる方法を提供する。
本発明に係る実施例の別の目的は、骨髄間葉系幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製するプロセスを安定的に制御しながらオリゴデンドロサイト前駆細胞品質を向上させる方法を提供する。
【0011】
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記神経幹細胞の製造方法は、
神経幹細胞用培地として最終濃度が０．５％～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％～５％のＢ２７、１０～６０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０～６０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５～４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地を調製するステップと、
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、７５００～２００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で細胞非接着性培養容器に播種するステップと、
細胞の成長に応じて前記細胞非接着性培養容器内の神経幹細胞用培地を定期的に交換し、前記神経幹細胞は、ニューロスフェアとして前記神経幹細胞用培地に存在するステップと、を含む。
神経幹細胞用培地として最終濃度が０．５％～２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％～５％のＢ２７、１０～６０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０～６０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５～４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地を調製するステップと、
前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、７５００～２００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で細胞非接着性培養容器に播種するステップと、
細胞の成長に応じて前記細胞非接着性培養容器内の神経幹細胞用培地を定期的に交換し、前記神経幹細胞は、ニューロスフェアとして前記神経幹細胞用培地に存在するステップと、を含む。
【0012】
さらに好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、神経幹細胞用培地として最終濃度が１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ２７、４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む培地を調製し、前記神経幹細胞用培地により骨髄間葉系幹細胞の非接着性培養を行い、１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で細胞非接着性培養容器に播種し、ここで、高濃度のｂＦＧＦ及びＥＧＦをＩＧＦ－１と配合すると、ニューロスフェアの生産量を効果的に向上させることができる。
前記ニューロスフェアは、培養容器内で非接着培養により培養する必要があり、非接着培養は、ニューロスフェアの自律的分化を抑制でき、分化御製に役立ち、非接着性培養を使用して前記ニューロスフェアを収集する場合には細胞を消化する必要がなく、培養液を直接遠心分離することができ、消化ステップでの細胞への損傷を減らすため、非接着培養で骨髄間葉系幹細胞を培養することにより骨髄間葉系細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率を向上させることができる。
前記ニューロスフェアは、培養容器内で非接着培養により培養する必要があり、非接着培養は、ニューロスフェアの自律的分化を抑制でき、分化御製に役立ち、非接着性培養を使用して前記ニューロスフェアを収集する場合には細胞を消化する必要がなく、培養液を直接遠心分離することができ、消化ステップでの細胞への損傷を減らすため、非接着培養で骨髄間葉系幹細胞を培養することにより骨髄間葉系細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率を向上させることができる。
【0013】
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記神経幹細胞はニューロスフェアとして前記神経幹細胞用培地に存在し、前記ニューロスフェアは、１００ｇ～３００ｇで約５ｍｉｎ遠心分離する条件下で前記神経幹細胞用培地から分離する。
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記骨髄間葉系幹細胞は、骨髄から以下の手順で調製される。前記手順は、
前記骨髄をＳｔｅｍ Ｐｒｏ培地で培養し、４８時間後に培地及び非接着細胞を取り除き、新しい培地を追加して培養を続けること；
培地に骨髄間葉系幹細胞のクローンが現れると、培地にＣＤ４５陽性細胞の含有量が１％未満になるまで４００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度でＳｔｅｍ Ｐｒｏ培地に播種して継代培養を行うことを含む。
骨髄には、骨髄間葉系幹細胞以外の多くの異種細胞が含まれ、骨髄を４８ｈ接着培養した後、培地を除去すると、非接着性の異種細胞を大幅に低減させ、骨髄間葉系幹細胞の純度を向上させることができる。
好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、前記骨髄間葉系幹細胞は、骨髄から以下の手順で調製される。前記手順は、
前記骨髄をＳｔｅｍ Ｐｒｏ培地で培養し、４８時間後に培地及び非接着細胞を取り除き、新しい培地を追加して培養を続けること；
培地に骨髄間葉系幹細胞のクローンが現れると、培地にＣＤ４５陽性細胞の含有量が１％未満になるまで４００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度でＳｔｅｍ Ｐｒｏ培地に播種して継代培養を行うことを含む。
骨髄には、骨髄間葉系幹細胞以外の多くの異種細胞が含まれ、骨髄を４８ｈ接着培養した後、培地を除去すると、非接着性の異種細胞を大幅に低減させ、骨髄間葉系幹細胞の純度を向上させることができる。
【0014】
発明者は、実験を通じて、骨髄内の造血幹細胞が骨髄間葉系幹細胞から神経幹細胞を調製する効率に影響を与えることを見出し、骨髄を４８ｈ培養した後、接着性細胞を継代培養すると、骨髄内の造血幹細胞を大幅に減少させることができ、通常に、３～４回継代培養することで、発現するＣＤ４５陽性細胞の含有量を１％未満にすることができる。
さらに、４００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で継代すると、骨髄間葉系幹細胞の幹細胞性が維持され、骨髄間葉系幹細胞のランダムな分化が抑制されるため、骨髄からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率を向上させる。
さらに好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、神経幹細胞を調製するための骨髄間葉系幹細胞ＳＴＲＯ－１、ＣＤ９０及びＣＤ７３陽性発現量が９０％より大きく、Ｎｅｓｔｉｎ陽性発現量が５％より大きく、且つＣＤ４５陽性発現量が１％未満である。培地中の細胞マーカーの陽性発現量は、骨髄間葉系幹細胞の継代培養の回数により制御され、培地中のＣＤ４５陽性発現量が１％未満である場合には、造血幹細胞が骨髄間葉系幹細胞による神経幹細胞の調製に与える影響は無視できる。
さらに、４００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で継代すると、骨髄間葉系幹細胞の幹細胞性が維持され、骨髄間葉系幹細胞のランダムな分化が抑制されるため、骨髄からオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率を向上させる。
さらに好ましくは、前記オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法において、神経幹細胞を調製するための骨髄間葉系幹細胞ＳＴＲＯ－１、ＣＤ９０及びＣＤ７３陽性発現量が９０％より大きく、Ｎｅｓｔｉｎ陽性発現量が５％より大きく、且つＣＤ４５陽性発現量が１％未満である。培地中の細胞マーカーの陽性発現量は、骨髄間葉系幹細胞の継代培養の回数により制御され、培地中のＣＤ４５陽性発現量が１％未満である場合には、造血幹細胞が骨髄間葉系幹細胞による神経幹細胞の調製に与える影響は無視できる。
【0015】
本発明は、オリゴデンドロサイト前駆細胞を効率よく分化させることができる培地、及び該培地によりオリゴデンドロサイト前駆細胞を製造する方法を提供し、前記方法は、骨髄によりオリゴデンドロサイト前駆細胞を製造する方法を含む。本発明で提供される培地及びオリゴデンドロサイト前駆細胞の調製プロセスでは、外因子を使用せず、外因子の汚染を回避し、臨床研究の可能性を与える。また、本発明で提供される製造方法は、さらに調製されるオリゴデンドロサイト前駆細胞の高収率、高い分化効率、制御可能な分化プロセスという有益な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明を図面及び具体的実施例によりさらに説明するが、実施例に係る実験方法は、特に断りがない限り、いずれも常法であり、実験で用いられる機器及び試薬はすべて市販として入手できる。
本発明に係る実施例で用いられる培地は、主成分の来源情報は、以下の通りである。
ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．： Ａ１０３３２０１
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．： １２６３４０２８
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．： ２１１０３０４９
本発明に係る実施例で用いられる培地は、主成分の来源情報は、以下の通りである。
ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．Ｎｏ．： Ａ１０３３２０１
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．： １２６３４０２８
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．： ２１１０３０４９
【0018】
本発明に係る実施例では、臨床的標準の成長因子、例えば、ＣＴＳ Ｎ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．： １３７０７０１）、ＣＴＳ Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ． Ｎｏ．： １４８６７０１）ＧＭＰ ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、 Ｃａｔ． Ｎｏ．：ＧＭＰ１００－１８Ｂ）及びＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、 Ｃａｔ． Ｎｏ．：ＧＭＰ１００－１３Ａ）を使用した。オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製するために本発明に係る実施例において非臨床的標準の化学試薬を使用することが排除されない。
【0019】
実施例１：骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）の予備処理
１、原料由来：
骨髄は、３０日齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット又は年齢が１８～４０歳の成人に由来するが、これらに限定されない。
２、ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地９ｍｌでＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット又は成人骨髄１ｍｌを希釈し、細胞接着培養に適するように変性処理された１０ｃｍの細胞培養皿に希釈後の骨髄を加えて培養し、骨髄の接着培養を行う日をオリゴデンドロサイト前駆細胞分化過程の初日（Ｄ０）を定義した。
１、原料由来：
骨髄は、３０日齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット又は年齢が１８～４０歳の成人に由来するが、これらに限定されない。
２、ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地９ｍｌでＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット又は成人骨髄１ｍｌを希釈し、細胞接着培養に適するように変性処理された１０ｃｍの細胞培養皿に希釈後の骨髄を加えて培養し、骨髄の接着培養を行う日をオリゴデンドロサイト前駆細胞分化過程の初日（Ｄ０）を定義した。
【0020】
３、４８時間後に培地を細胞培養皿から取り出し、ＤＰＢＳで非接着性細胞を洗浄した後、ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地１０ｍｌを加え、その後、ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地を７２時間おきに１回交換して培養を継続した。
４、Ｄ６～Ｄ７まで培養する際に、培養皿で骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）クローンを観察でき、Ｄ８～Ｄ１０まで培養する際に、培地を吸引し、培養皿中の非接着性細胞をＤＰＢＳ ３ｍｌで洗浄し、上記ＤＰＢＳを取り除き、培養皿にＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ １ｍｌを加え、３７℃で５ｍｉｎインキュベートし、消化された細胞溶液を収集し、室温の条件下、２００ｇで５ｍｉｎ遠心してペレットを得、ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地で上記遠心ペレットを再懸濁した。
５、上記細胞を４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で６ｃｍ又は１０ｃｍの細胞培養皿に播種した。
６、培養皿中のＢＭＳＣは８０％～９０％のコンフルエントに達する時に、継代培養を行い、ここで、ＢＭＳＣが１０世代を超えて継代培養することはできない。
４、Ｄ６～Ｄ７まで培養する際に、培養皿で骨髄間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）クローンを観察でき、Ｄ８～Ｄ１０まで培養する際に、培地を吸引し、培養皿中の非接着性細胞をＤＰＢＳ ３ｍｌで洗浄し、上記ＤＰＢＳを取り除き、培養皿にＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ １ｍｌを加え、３７℃で５ｍｉｎインキュベートし、消化された細胞溶液を収集し、室温の条件下、２００ｇで５ｍｉｎ遠心してペレットを得、ＣＴＳ Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ培地で上記遠心ペレットを再懸濁した。
５、上記細胞を４×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で６ｃｍ又は１０ｃｍの細胞培養皿に播種した。
６、培養皿中のＢＭＳＣは８０％～９０％のコンフルエントに達する時に、継代培養を行い、ここで、ＢＭＳＣが１０世代を超えて継代培養することはできない。
【0021】
７、ＢＭＳＣの同定
フローサイトメーターによるそのマーカーの検出：
ＢＭＳＣがＰ３に継代されると、細胞を収集し、通常に消化し、ＤＰＢＳで細胞を再懸濁した後に、４％のＰＦＡを加えて１０ｍｉｎ固定した後、遠心分離し、細胞ペレットをＤＰＢＳで２～３回洗浄してＰＦＡを除去し、それぞれＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４５、Ｎｅｓｔｉｎ及びＳＴＲＯ－１を含む一次抗体のブロッキング溶液で細胞を２ｈインキュベートし、遠心分離した後、さらに蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）で標識された二次抗体を含むブロッキング溶液で細胞を３０ｍｉｎインキュベートし、遠心分離して細胞をＤＰＢＳで再懸濁した後、フローサイトメーターで細胞表面抗原を検出した。陰性対照は、一次抗体の由来、Ｉｇタイプ及びラベルに一致する非特異的抗体をアイソタイプコントロールとして使用された。図１に示されるフローサイトメトリー解析結果は、本発明に係る実施例で調製されたＢＭＳＣはＣＤ７３、ＣＤ９０及びＳＴＲＯ－１を安定して発現し、且つＢＭＳＣには造血幹細胞がほとんどないことを示している。
フローサイトメーターによるそのマーカーの検出：
ＢＭＳＣがＰ３に継代されると、細胞を収集し、通常に消化し、ＤＰＢＳで細胞を再懸濁した後に、４％のＰＦＡを加えて１０ｍｉｎ固定した後、遠心分離し、細胞ペレットをＤＰＢＳで２～３回洗浄してＰＦＡを除去し、それぞれＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４５、Ｎｅｓｔｉｎ及びＳＴＲＯ－１を含む一次抗体のブロッキング溶液で細胞を２ｈインキュベートし、遠心分離した後、さらに蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）で標識された二次抗体を含むブロッキング溶液で細胞を３０ｍｉｎインキュベートし、遠心分離して細胞をＤＰＢＳで再懸濁した後、フローサイトメーターで細胞表面抗原を検出した。陰性対照は、一次抗体の由来、Ｉｇタイプ及びラベルに一致する非特異的抗体をアイソタイプコントロールとして使用された。図１に示されるフローサイトメトリー解析結果は、本発明に係る実施例で調製されたＢＭＳＣはＣＤ７３、ＣＤ９０及びＳＴＲＯ－１を安定して発現し、且つＢＭＳＣには造血幹細胞がほとんどないことを示している。
【0022】
ここで、ブロッキング溶液は、２％のＢＳＡ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＤＰＢＳである。
フローサイトメトリー法により以下の３群のマーカーを検出した。即ち
Ａ：ＢＭＳＣマーカー：ＳＴＲＯ－１、ＣＤ９０及びＣＤ７３；
Ｂ：神経幹細胞マーカー：Ｎｅｓｔｉｎ；
Ｃ：造血幹細胞マーカー：ＣＤ４５。
培養皿内の細胞のＡ群マーカーに陽性が９０％より大きく、Ｂ群マーカーに陽性率が５％より大きく、且つＣ群マーカーに陽性率が１％未満である場合には、培養皿中での細胞は、次の操作に用いれた。
フローサイトメトリー法により以下の３群のマーカーを検出した。即ち
Ａ：ＢＭＳＣマーカー：ＳＴＲＯ－１、ＣＤ９０及びＣＤ７３；
Ｂ：神経幹細胞マーカー：Ｎｅｓｔｉｎ；
Ｃ：造血幹細胞マーカー：ＣＤ４５。
培養皿内の細胞のＡ群マーカーに陽性が９０％より大きく、Ｂ群マーカーに陽性率が５％より大きく、且つＣ群マーカーに陽性率が１％未満である場合には、培養皿中での細胞は、次の操作に用いれた。
【0023】
実施例２：ＢＭＳＣの神経幹細胞への分化
１、神経幹細胞用培地の調製
最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
２、ＢＭＳＣが第３世代から第１０世代の間に継代した時に（好ましくはＤ１５）、ＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ ＳｅｌｅｃｔでＢＭＳＣを消化し、遠心分離した後、神経幹細胞用培地でＢＭＳＣを再懸濁し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でＵｌｔｒａ Ｌｏｗ（登録商標）非接着性培養用６ウェルプレートに播種した。
３、神経幹細胞用培地を４８時間おきに交換し、培養時間の延長に伴い、神経幹細胞はニューロスフェアを形成し、神経幹細胞用培地に懸濁し、非接着性培養の５～７日目に、培地を２００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してニューロスフェアとして存在する神経幹細胞を得た。
１、神経幹細胞用培地の調製
最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、４０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＩＧＦ－１及び１％のＰ／Ｓを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を調製した。
２、ＢＭＳＣが第３世代から第１０世代の間に継代した時に（好ましくはＤ１５）、ＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ ＳｅｌｅｃｔでＢＭＳＣを消化し、遠心分離した後、神経幹細胞用培地でＢＭＳＣを再懸濁し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でＵｌｔｒａ Ｌｏｗ（登録商標）非接着性培養用６ウェルプレートに播種した。
３、神経幹細胞用培地を４８時間おきに交換し、培養時間の延長に伴い、神経幹細胞はニューロスフェアを形成し、神経幹細胞用培地に懸濁し、非接着性培養の５～７日目に、培地を２００ｇで５ｍｉｎ遠心分離してニューロスフェアとして存在する神経幹細胞を得た。
【0024】
実施例３：神経幹細胞の同定
骨髄間葉系幹細胞を対照として、実施例２に係る非接着性培養の５日目のニューロスフェアを分散させた後に、免疫蛍光法にてニューロスフェアでのＮｅｓｔｉｎ及びＧＦＡＰ陽性細胞の含有量を検出してカウントし、図２から、実施例２においてニューロスフェア中のＮｅｓｔｉｎ及びＧＦＡＰ陽性細胞の含有量が８５％を超えることが分かった。
実験により、実施例２にかかるニューロスフェアのＮｅｓｔｉｎ及びＧＦＡＰ陽性細胞の含有量が７５％を超える時に、そのニューロスフェアを使用してさらに分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度及び分化効率は高くなることが分かった。
骨髄間葉系幹細胞を対照として、実施例２に係る非接着性培養の５日目のニューロスフェアを分散させた後に、免疫蛍光法にてニューロスフェアでのＮｅｓｔｉｎ及びＧＦＡＰ陽性細胞の含有量を検出してカウントし、図２から、実施例２においてニューロスフェア中のＮｅｓｔｉｎ及びＧＦＡＰ陽性細胞の含有量が８５％を超えることが分かった。
実験により、実施例２にかかるニューロスフェアのＮｅｓｔｉｎ及びＧＦＡＰ陽性細胞の含有量が７５％を超える時に、そのニューロスフェアを使用してさらに分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度及び分化効率は高くなることが分かった。
【0025】
実施例４：神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化
１、オリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地の調製
実施例２で調製された神経幹細胞を分化させるために、それぞれ以下の１０群のオリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を調製した。即ち
（１）第１群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
１、オリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地の調製
実施例２で調製された神経幹細胞を分化させるために、それぞれ以下の１０群のオリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を調製した。即ち
（１）第１群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0026】
（２）第２群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比９：２で均一に混合した基礎培地、及びそれぞれ最終濃度が０．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＢ２７、０．５％のＮ２、２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、１μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（３）第３群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１．５：７．５で均一に混合した基礎培地、及びそれぞれ最終濃度が２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、５％のＢ２７、２．５％のＮ２、２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（３）第３群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１．５：７．５で均一に混合した基礎培地、及びそれぞれ最終濃度が２．５％のＧｌｕｔａＭＡＸ、５％のＢ２７、２．５％のＮ２、２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ－ＡＡ、２５０ｎｇ／ｍｌのβ－ＨＲＧ１、２０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0027】
（４）第４群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、２ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、２５ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（５）第５群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、２ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ １００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（５）第５群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、２５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、２ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ １００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0028】
（６）第６群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１５ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ－１、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａ 、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（７）第７群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１及び１％のＰ／Ｓを含む。
（７）第７群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0029】
（８）第８群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ β－ＨＲＧ１、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（９）第９群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
（９）第９群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰ ＰＤＧＦ－ＡＡ、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
【0030】
（１０）第１０群の分化用培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２とＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを体積比１：１で均一に混合した基礎培地、及び最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１％のＣＴＳ Ｎ２、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰレベルのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＧＭＰレベルのＰＤＧＦ－ＡＡ、１０ｎｇ／ｍｌのＮＴ－３（神経栄養因子３）、１０μＭの２－メルカプトエタノール及び１％のＰ／Ｓを含む。
２、濃度がいずれも１０μｇ／ｍｌであるポリ－Ｌ－オルニチン（ＰＬＯ）及びヒト由来ラミニンで６ウェルプレートにコーティングし、その６ウェルプレートにオリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を加えた後、実施例２で調製された神経幹細胞を播種し、ここで、播種密度は４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。
２、濃度がいずれも１０μｇ／ｍｌであるポリ－Ｌ－オルニチン（ＰＬＯ）及びヒト由来ラミニンで６ウェルプレートにコーティングし、その６ウェルプレートにオリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を加えた後、実施例２で調製された神経幹細胞を播種し、ここで、播種密度は４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。
【0031】
３、播種後、オリゴデンドロサイト前駆細胞分化用培地を４８時間おきに交換し、神経幹細胞を第１群のオリゴデンドロサイト前駆細胞を含有する分化用培地に播種後の８日目から、ＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔで消化してオリゴデンドロサイト前駆細胞を収集し、実施例１での骨髄１ｍｌから本発明で提供されるオリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法により２×１０７個のオリゴデンドロサイト前駆細胞を得るため、本発明で提供される分化用培地及び培養方法によるオリゴデンドロサイト前駆細胞の調製時間は従来技術よりも大幅に短縮され、オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製効率を向上させ、しかも、細胞のカウント結果により、本発明でオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する収率は高くなることが分かった。
【0032】
４、フローサイトメトリー法により細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２及びＳＯＸ１０の発現を検出し、ここで、Ｏｌｉｇ２は、オリゴデンドロサイト前駆細胞で特異的に発現されるマーカーである。図４には、第１群の分化用培地で１０日目に調製されたオリゴデンドロサイト前駆細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性細胞率を示し、ここで、Ｏｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０の陽性率は、それぞれ９５．１３％、９７．２２％、９０．０７％及び９４．４３％であり、神経幹細胞を第２群の分化用培地で培養開始後１９日目に、Ｏｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０の陽性細胞率は、それぞれ７２．５％、６９．３６％、７５．９１％及び７４．７５％であり、神経幹細胞を第３群の分化用培地で培養開始後１７日目に、Ｏｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０の陽性細胞率は、それぞれ８３．４１％、７９．６７％、７８．５％及び８１．７４％である。第３群の培地において物質の濃度が高くなるため、オリゴデンドロサイト前駆細胞をオリゴデンドロサイトへ変換し、Ｏｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０の陽性細胞率をある程度低減させた。
分化用培地にＩＧＦ－１及びＷｎｔ３Ａを添加することにより、神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化効率を向上させることができ、神経幹細胞を第４群の分化用培地で培養開始後６日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７９．１１％、８４．７５％、８４．３２％及び８７．６９％であり、神経幹細胞を第５群の分化用培地で培養開始後６日目に調製される細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ８１．５１％、８８．６２％、８３．７３％及び８０．３４であり、神経幹細胞を第６群の分化用培地で培養開始後５日目に調製される細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ９５．３５％、９８．８１％、９５．３３％及び９４．１７％である。
分化用培地にＩＧＦ－１及びＷｎｔ３Ａを添加することにより、神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化効率を向上させることができ、神経幹細胞を第４群の分化用培地で培養開始後６日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７９．１１％、８４．７５％、８４．３２％及び８７．６９％であり、神経幹細胞を第５群の分化用培地で培養開始後６日目に調製される細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ８１．５１％、８８．６２％、８３．７３％及び８０．３４であり、神経幹細胞を第６群の分化用培地で培養開始後５日目に調製される細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ９５．３５％、９８．８１％、９５．３３％及び９４．１７％である。
【0033】
神経幹細胞を第７群の分化用培地で培養開始後１０日目に調製される細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ６７．７３％、７１．９５％、６９．２５％及び６６．０９％であり、その純度は、第１群の分化用培地で１０日目に調製された細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度よりもはるかに低く、しかも、２－メルカプトエタノールが含まれていない分化用培地にてオリゴデンドロサイト前駆細胞を調製する効率は顕著に低下した。
神経幹細胞を第８群の分化用培地で培養開始後１０日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７６．６２％、７１．４５％、７９．８１％及び７７．６９％であり、神経幹細胞を第９群の分化用培地で培養開始後１０日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７１．３７％、６８．４５％、７２．６９％及び７１．１１％であり、これらの２群の実験より、２－メルカプトエタノールとβ－ＨＲＧ１の両方を含む培地は、２－メルカプトエタノールとＰＤＧＦ－ＡＡの両方を含む培地よりも神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を促進できることが分かった。
神経幹細胞を第８群の分化用培地で培養開始後１０日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７６．６２％、７１．４５％、７９．８１％及び７７．６９％であり、神経幹細胞を第９群の分化用培地で培養開始後１０日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２、及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７１．３７％、６８．４５％、７２．６９％及び７１．１１％であり、これらの２群の実験より、２－メルカプトエタノールとβ－ＨＲＧ１の両方を含む培地は、２－メルカプトエタノールとＰＤＧＦ－ＡＡの両方を含む培地よりも神経幹細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化を促進できることが分かった。
【0034】
神経幹細胞を第１０群の分化用培地で培養開始後１０日目に調製された細胞のＯｌｉｇ２、ＰＤＧＦＲα、ＮＧ２及びＳＯＸ１０陽性率は、それぞれ７２．４４％、７４．９６％、７５．３１％及び７１．３３％であり、それにより、神経栄養因子３と２－メルカプトエタノールとＰＤＧＦ－ＡＡとの組み合わせも同様に神経幹細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させることができるが、分化効率がβ－ＨＲＧ１、２－メルカプトエタノール及びＰＤＧＦ－ＡＡの組み合わせよりも低いことが分かった。
細胞の以上の４つのマーカーの陽性率がいずれも９０％よりも高くなる場合には、該細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度が高くなり、さらに細胞製剤の有効成分として使用されるか、又は臨床研究に適用されることができる。
細胞の以上の４つのマーカーの陽性率がいずれも９０％よりも高くなる場合には、該細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞の純度が高くなり、さらに細胞製剤の有効成分として使用されるか、又は臨床研究に適用されることができる。
【0035】
実施例５：オリゴデンドロサイト前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
１、Ｍｙｅｌｉｎ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＦＭ）の調製
最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１０μＭの２－メルカプトエタノール、１％のＰ／Ｓ及び最終濃度が１０μＭのＴ３を含むＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを調製した。
２、上記の方法でＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット又は成人骨髄により調製されるＢＭＳＣから分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞及びニューロンをＭＦＭで１５間共培養した際にミエリン塩基性タンパク質の発現量の顕著な増加が認められた。
１、Ｍｙｅｌｉｎ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＦＭ）の調製
最終濃度が１％のＣＴＳ ＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＣＴＳ Ｂ２７、１０μＭの２－メルカプトエタノール、１％のＰ／Ｓ及び最終濃度が１０μＭのＴ３を含むＣＴＳ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍを調製した。
２、上記の方法でＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット又は成人骨髄により調製されるＢＭＳＣから分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞及びニューロンをＭＦＭで１５間共培養した際にミエリン塩基性タンパク質の発現量の顕著な増加が認められた。
【0036】
実施例６：オリゴデンドロサイト前駆細胞のｉｎ ｖｉｖｏ実験
１、細胞注射用バッファーの調製（Ｃｅｌｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ＣＩＢ）
最終濃度が２０ ｍＭ的Ｄ－グルコース、１％のＰ／ＳをＣａ２＋フリーのフェノール溶液又はＭｇ２＋フリーのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）溶液を調製した。
２、ＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔにて実施例４で調製されるオリゴデンドロサイト前駆細胞を消化し、ＣＩＢを追加して消化を停止し、２００ｇで５ｍｉｎ遠心した後にＣＩＢでペレットを再懸濁させ、オリゴデンドロサイト前駆細胞注射液とした。
３、動物実験
それぞれｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスの中枢神経にヒト由来骨髄から分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液及びＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット骨髄から分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液を注射し、ここで、注射液濃度は、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｕｌであり、且つ対照としてオリゴデンドロサイト前駆細胞が含まれていないＣＩＢを使用した。
ここで、ｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスは、中枢神経系の髄鞘が損傷し、寿命が約９０日間のみである実験マウスであり、現在、髄鞘障害の研究に広く使用されている。
１、細胞注射用バッファーの調製（Ｃｅｌｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ＣＩＢ）
最終濃度が２０ ｍＭ的Ｄ－グルコース、１％のＰ／ＳをＣａ２＋フリーのフェノール溶液又はＭｇ２＋フリーのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）溶液を調製した。
２、ＣＴＳ Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔにて実施例４で調製されるオリゴデンドロサイト前駆細胞を消化し、ＣＩＢを追加して消化を停止し、２００ｇで５ｍｉｎ遠心した後にＣＩＢでペレットを再懸濁させ、オリゴデンドロサイト前駆細胞注射液とした。
３、動物実験
それぞれｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスの中枢神経にヒト由来骨髄から分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液及びＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット骨髄から分化したオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液を注射し、ここで、注射液濃度は、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｕｌであり、且つ対照としてオリゴデンドロサイト前駆細胞が含まれていないＣＩＢを使用した。
ここで、ｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスは、中枢神経系の髄鞘が損傷し、寿命が約９０日間のみである実験マウスであり、現在、髄鞘障害の研究に広く使用されている。
【0037】
図５より、Ｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスにオリゴデンドロサイト前駆細胞注射液を注射してから１２週間後に、該モデルマウスの脳組織で大量のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）陽性発現が検出されることが明らかになり、それにより、オリゴデンドロサイト前駆細胞が損傷した髄鞘の回復に寄与することを示した。ここで、オリゴデンドロサイト前駆細胞は、マウス由来骨髄の分化により調製された。
また、図６より、オリゴデンドロサイト前駆細胞がｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスの平均寿命を１２５日間（最長１３８日間）まで延長し、且つヒト由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞とマウス由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞とは、同様にモデルマウス寿命を延長させることができ、ヒト由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞をｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスに注射した後、明らかな拒絶反応が認められない。
以上の実験結果より、本発明に係る分化条件で骨髄間葉系幹細胞から分化するオリゴデンドロサイト前駆細胞は髄鞘障害又は他のオリゴデンドロサイトに関連する神経系疾患を治療する潜在能力を有し、本発明で提供される方法は、骨髄間葉系幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化時間を顕著に短縮させ、しかも、本発明で用いれる培地がいずれも非動物由来成分処方であるため、さらにオリゴデンドロサイト前駆細胞の臨床応用を促進することが分かった。
また、図６より、オリゴデンドロサイト前駆細胞がｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスの平均寿命を１２５日間（最長１３８日間）まで延長し、且つヒト由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞とマウス由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞とは、同様にモデルマウス寿命を延長させることができ、ヒト由来骨髄から調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞をｓｈｉｖｅｒｅｒモデルマウスに注射した後、明らかな拒絶反応が認められない。
以上の実験結果より、本発明に係る分化条件で骨髄間葉系幹細胞から分化するオリゴデンドロサイト前駆細胞は髄鞘障害又は他のオリゴデンドロサイトに関連する神経系疾患を治療する潜在能力を有し、本発明で提供される方法は、骨髄間葉系幹細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞への分化時間を顕著に短縮させ、しかも、本発明で用いれる培地がいずれも非動物由来成分処方であるため、さらにオリゴデンドロサイト前駆細胞の臨床応用を促進することが分かった。
【0038】
本発明に係る実施例での細胞の同定及び検出方法において用いれる免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー法という実験方法及び使用される関連試薬は、いずれも当業者が対応する細胞の検出又は同定に用いれる常法である。
本発明の実施例に開示されている様々な実験パラメータは、発明者が複数回の実験により選別された、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を効果的に向上させる可能なものであるが、本発明の保護範囲を制限しない。本発明を基づいて培地の組成、含有量又は実験条件、例えば、培養時間、遠心力、遠心時間、培養温度などに加える明らかな変更、置換または修正は、すべて本発明の範囲内にある。
本発明の実施例に開示されている様々な実験パラメータは、発明者が複数回の実験により選別された、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化効率を効果的に向上させる可能なものであるが、本発明の保護範囲を制限しない。本発明を基づいて培地の組成、含有量又は実験条件、例えば、培養時間、遠心力、遠心時間、培養温度などに加える明らかな変更、置換または修正は、すべて本発明の範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
