特許 7114813 ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに結合する抗体と使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-07-29

(45)【発行日】2022-08-08

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに結合する抗体と使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220801BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220801BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20220801BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20220801BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220801BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220801BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220801BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/13 ZNA

C07K16/22

C07K16/24

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021535578

(86)(22)【出願日】2019-12-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-19

(86)【国際出願番号】 EP2019086529

(87)【国際公開番号】W WO2020127873

(87)【国際公開日】2020-06-25

【審査請求日】2021-08-06

(31)【優先権主張番号】18215023.5

(32)【優先日】2018-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ベンツ，イェルク

(72)【発明者】

【氏名】デングル，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ガスナー，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ハルトマン，グイド

(72)【発明者】

【氏名】ヒュールスマン，ペーター・ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】インホフ－ユング，ザビーネ

(72)【発明者】

【氏名】ケッテンベルガー，フーベルト

(72)【発明者】

【氏名】ローレンツ，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】モルケン，イェルク

(72)【発明者】

【氏名】ムンディグル，オラフ

(72)【発明者】

【氏名】ベックマン，ローラント

(72)【発明者】

【氏名】イェンセン，クリスチャン・ホボルト

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５１６５４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５３４６４６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）と可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、ＶＥＧＦパラトープが前記抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含み、ＩＬ－１ベータパラトープが前記抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ酸残基を含み、配列番号１１のＶＨ配列と配列番号１２のＶＬ配列とを含む、抗体。

【請求項2】

配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体。

【請求項3】

配列番号２０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の抗体。

【請求項4】

請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴により測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴により測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。

【請求項5】

請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体であって、前記抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法で測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。

【請求項7】

二重特異性抗体断片である、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。

【請求項9】

請求項８に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項10】

請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項11】

抗体が産生されるように請求項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＬ－１ベータ及びＶＥＧＦに結合する二重特異性抗体は、既に報告されており、眼血管疾患の治療用に提案されている（国際公開第２０１６／０７５０３４号、抗体「００３２」）。二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体００３２は、１つの結合アームにおけるＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する完全長ＩｇＧ様抗体であり（国際公開第２００９／０８０２５２号、Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191）、ここで、野生型抗体のドメイン配置の結合アームはＩＬ－１ベータに特異的に結合し、ＶＨ／ＶＬドメインクロスオーバーを含む結合アームはＶＥＧＦに特異的に結合する。ＶＥＧＦ結合アームは、抗ＶＥＧＦ抗体ラニビズマブのＶＨ及びＶＬドメインを含む。

【0003】

一対の可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に２つのパラトープを含む多重特異性抗体は、国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号及びＢｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３（２００９）１６１０－１６１４、並びに国際公開第２０１２／１６３５２０号に記載されている。

【0004】

国際公開第２０１２／１６３５２０号は、一対のＶＨドメインとＶＬドメインに２つの非重複パラトープを含む二重特異性抗体（「ＤｕｔａＦａｂ」）を開示している。国際公開第２０１２／１６３５２０号の二重特異性抗体の各パラトープは、重鎖及び軽鎖ＣＤＲからのアミノ酸を含み、重鎖ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ３と軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２は、第１のパラトープに寄与し、軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３と重鎖ＣＤＲ－Ｈ２は、第２のパラトープに寄与する。個々のパラトープを含む単一特異性抗体は、異なるＦａｂライブラリーから独立して単離され、第１又は第２のパラトープのいずれかが多様化される。上記単一特異性抗体のアミノ酸配列は、特定され、融合され、二重パラトープＶＨ及びＶＬ対になる。ＶＥＧＦ及びＩＬ－６に特異的に結合する１つの例示的Ｆａｂ断片は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている。

【0005】

ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに結合する改善された治療用抗体へのニーズがある。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体及びその使用方法に関する。

【0007】

一態様では、本発明は、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）と可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、ＶＥＧＦパラトープは抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含み、ＩＬ－１ベータパラトープは抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ酸残基を含む。

【0008】

一態様では、本発明は、ＶＬドメインとＶＨドメインの１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインのこの対は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに同時に結合する。

【0009】

一態様では、本発明は、ＶＬドメインとＶＨドメインの１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、ＶＥＧＦパラトープに含まれるアミノ酸のいずれもＩＬ－１ベータパラトープに含まれない。

【0010】

一態様では、本発明は、ＶＬドメインとＶＨドメインの１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体は、配列番号１１の可変重鎖ドメインと配列番号１２の可変軽鎖ドメインとを有する抗体が結合するのと同じ、ヒトＶＥＧＦ上のエピトープ及びヒトＩＬ－１ベータ上のエピトープに結合する。

【0011】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体の抗体Ｆａｂ断片は、（ｉ）表面プラズモン共鳴によって測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴によって測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する。

【0012】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体の抗体Ｆａｂ断片は、７０℃超の凝集開始温度を呈する。

【0013】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体の抗体Ｆａｂ断片は、動的光散乱法によって測定して８０℃超の融解温度を呈する。

【0014】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＶＥＧＦへの結合は、表面プラズモン共鳴によって測定して５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害し；該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合は、表面プラズモン共鳴によって測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する。

【0015】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。

【0016】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる。

【0017】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる抗体を提供する。一実施態様では、該抗体は、ＶＨドメインにＤ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６及びＲ８３のアミノ酸残基、並びにＶＬドメインにＩ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６のアミノ酸残基を含むＶＥＧＦパラトープと、ＶＨドメインにＥ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１のアミノ酸残基、並びにＶＬドメインにＬ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｙ９１のアミノ酸残基を含むＩＬ－１ベータパラトープとを含む。

【0018】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｓ６７、Ｈ６８、Ｅ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる抗体を提供する。一実施態様では、該抗体は、ＶＨドメインにＤ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６及びＲ８３のアミノ酸残基、並びにＶＬドメインにＩ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｓ６７、Ｈ６８、Ｅ６９、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６のアミノ酸残基を含むＶＥＧＦパラトープと、ＶＨドメインにＥ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１のアミノ酸残基、並びにＶＬドメインにＬ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｙ９１のアミノ酸残基を含むＩＬ－１ベータパラトープとを含む。

【0019】

一態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。

【0020】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、抗体を提供する。

【0021】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体において、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ４９、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＶＬドメインとを含み；ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体を提供する。

【0022】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含む抗体であって、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。

【0023】

一態様では、本発明は、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。一実施態様では、該抗体は、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸置換が配列番号１１の３～２５、３６～４９、９７～８２ｃ、８４～９３又は１０３～１１３位に位置するＶＨドメインと、（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインであって、アミノ酸置換が配列番号１２の１、４、６、８～２３、３５～４８、５８～６６、７０～８８又は９８～１０７位に位置する可変軽鎖ドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる。

【0024】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって（ａ）ＶＨドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）可変軽鎖ドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。

【0025】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含む抗体であって、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；（ａ）ＶＨドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）可変軽鎖ドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。

【0026】

一態様では、本発明は、配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。

【0027】

一態様では、本発明は、配列番号２０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。

【0028】

一態様では、本発明は、配列番号１８の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。

【0029】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み；ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；該抗体の抗体Ｆａｂ断片は、（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する。

【0030】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片は、（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定して１０ｐＭ未満のＫＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定して３０ｐＭ未満のＫＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体を提供する。

【0031】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片は７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体を提供する。

【0032】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片は、動的光散乱法によって測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体を提供する。

【0033】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合が、表面プラズモン共鳴で測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、抗体を提供する。

【0034】

本発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体断片に関する。本発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する二重特異性抗体断片に関する。本発明の一実施態様では、抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２又はそれらに由来する単鎖抗体から選択される。本発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合するＦａｂ断片に関する。本発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合するＦｖ断片に関する。

【0035】

本発明の一実施態様は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合す完全長ＩｇＧ抗体に関する。

【0036】

一態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0037】

一態様では、本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0038】

一態様では、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0039】

一態様では、本発明は、抗体が産生されるように本発明の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を製造する方法を提供する。

【0040】

一態様では、本発明は、本発明の方法によって産生された抗体を提供する。

【0041】

一態様では、本発明は、本発明の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤を提供する。

【0042】

本発明は、一態様においては医薬としての使用のための、一態様においては血管疾患の治療における使用のための本発明の抗体を提供する。

【0043】

本発明は、一態様においては医薬の製造における、一態様においては血管疾患の治療のための医薬の製造における本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物の使用を提供する。

【0044】

一態様において、本発明は、有効量の本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物を血管疾患を有する個体に投与することを含む、個体を治療する方法を提供する。

【0045】

一態様では、本発明は、血管新生を阻害するために、本発明の抗体又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体における血管新生を阻害する方法を提供する。
本発明によれば、二重特異性Ｆａｂ断片として提供された場合であっても、同時にその標的抗原に結合することができる治療用抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体が提供される。更に、本発明の抗体は、高い親和性、親水性、及び高い安定性のような、その治療適用を可能にする複数の貴重な特性を提供する。本発明の抗体は、眼への適用に適した粘度を有する高濃度の液体製剤中に提供することができる。本発明の抗体は、眼血管疾患の治療に適している。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】本発明の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体のＦａｂ断片の模式図。ＣＤＲアミノ酸の配置を含む同族ＶＨ／ＶＬ対の上から見た図を示す（上段の画像）。ＶＨドメインは灰色で、ＶＬドメインは白で示す。更に、ＣＤＲ領域の空間配置を示す。本発明の抗体のパラトープ領域がハイライトされており、ＶＥＧＦパラトープはＨ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ１及びＬ－ＣＤＲ２の領域に配置され、ＩＬ－１ベータパラトープはＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ３及びＬ－ＣＤＲ２の領域に配置されている（下の画像）。

【図2】本発明の例示的な抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体のＶＨドメインのアミノ酸性配列。アミノ酸位置のカバット番号付け、並びにＣＤＲ及びＦＲ領域を示す。ＶＥＧＦパラトープ、並びに実施例８で特定されたＩＬ－１ベータパラトープに寄与するアミノ酸位置がハイライトされている。

【図3】本発明の例示的な抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体のＶＬドメインのアミノ酸性配列。アミノ酸位置のカバット番号付け、並びにＣＤＲ及びＦＲ領域を示す。ＶＥＧＦパラトープ、並びに実施例８で特定されたＩＬ－１ベータパラトープに寄与するアミノ酸位置がハイライトされている。

【図4】実施例５に従いＳＰＲにより評価した、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体１ＨＶＬ１２．８５のＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータへの同時抗原結合。

【図5】実施例５に従いＳＰＲにより評価した、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体ＲＯ７２００３９４のＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータへの同時抗原結合。

【図6】実施例５に従いＳＰＲにより評価した、先行技術の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体００３２のＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータへの同時抗原結合。

【図7A】実施例６で評価した、抗体ＲＯ７２００３９４（Ｆａｂ断片）存在下でのＶＥＧＦのｈＶＥＧＦＲ２への結合の阻害。受容体結合阻害は、二重特異性抗体の一方の標的抗原であるＩＬ－１ベータの存在下及び非存在下で評価された。

【図7B】実施例６で評価された、先行技術の抗体００３２（完全長ＩｇＧ）の存在下におけるＶＥＧＦのｈＶＥＧＦＲ２への結合の阻害。受容体結合阻害は、二重特異性抗体の一方の標的抗原であるＩＬ－１ベータの存在下及び非存在下で評価された。

【図8A】実施例６で評価された、抗体ＲＯ７２００３９４（Ｆａｂ断片）の存在下でのＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合の阻害。受容体結合阻害は、二重特異性抗体の一方の標的抗原であるＶＥＧＦの存在下及び非存在下で評価された。

【図8B】実施例６で評価された、先行技術の抗体００３２（完全長ＩｇＧ）の存在下におけるＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合の阻害。受容体結合阻害は、二重特異性抗体の一方の標的抗原であるＶＥＧＦの存在下及び非存在下で評価された。

【図9】実施例６で評価された、示された抗体の存在下でのＶＥＧＦ１２１のＶＥＧＦ－Ｒ１への結合を評価する競合ＥＬＩＳＡ。

【図10】実施例６で評価された、示された抗体の存在下でのＶＥＧＦ１６５のＶＥＧＦ－Ｒ１への結合を評価する競合ＥＬＩＳＡ。

【図11】実施例７で評価された、本発明の抗体の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の結果。

【図12】先行技術の抗体００３２（実施例７）の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の結果。

【図13】実施例８で評価された、抗体１ＨＶＬ１２．８５の粘度。

【図14】実施例８で評価された、抗体ＲＯ７２００３９４の粘度。

【発明を実施するための形態】

【0047】

１．定義
本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、ここで特に規定しない限り、当業者に共通に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上別段の必要がない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。本開示の方法及び技術は通常、当技術分野で周知の従来の方法に従って行われる。概して、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質・核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は、当技術分野でよく知られており一般的に使用されている。

【0048】

本明細書中で特に定義されていない限り、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語を包含するものとする。

【0049】

特定の値（例：温度、濃度、時間、その他）に関連して本明細書中で使用される「約」という用語は、「約」という用語が指す特定の値の±１％の変動幅を指す。

【0050】

本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例：二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

【0051】

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法により決定されるように、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばＦｌａｔｍａｎら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照のこと。

【0052】

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般に少量で存在し得るバリアント抗体（例えば自然発生の変異を含むもの、又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生するもの）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する集団から得られる抗体を指す。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。

【0053】

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

【0054】

抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭがあり、これらのいくつかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２に分けられる。特定の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。特定の実施態様において、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの変異を有する、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。特定の実施態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するＳ２２８Ｐ変異をヒンジ領域に有する、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ?、?、?、?、?と呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちのいずれかに割り当てることができる。

【0055】

本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。

【0056】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；並びにＢ細胞の活性化が含まれる。

【0057】

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、各々が４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する（例えば、Kindt, T.J. ら., Kuby Immunology, 第5版., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91頁参照）。本発明の抗体において、ＶＨドメインとＶＬドメインの単一対、すなわち同族ＶＨ／ＶＬ対は、その２つの標的、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに特異的に結合する。

【0058】

「ＤｕｔａＦａｂ」は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されているような二重特異性抗体である。ＤｕｔａＦａｂでは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの単一対が２つの異なるエピトープに特異的に結合し、１つのパラトープはＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含み、もう１つのパラトープはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ残基を含む。ＤｕｔａＦａｂは、同族ＶＨ／ＶＬ対内に２つの非重複パラトープを含み、同時に２つの異なるエピトープに結合することができる。ＤｕｔａＦａｂと、単一特異性Ｆａｂ断片を含むライブラリーのスクリーニングによるそれらの生成方法は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている。

【0059】

「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0060】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），１－３巻にあるようなサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらのサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらのサブグループＩＩＩである。

【0061】

「抗体断片」とは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を意味する。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例：ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体などが含まれるが、これらに限定されない。

【0062】

本明細書で互換的に使用される「パラトープ」又は「抗原結合部位」とは、抗原を認識して結合する抗体の一部を指す。パラトープは、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインからの複数の個別のアミノ酸残基によって形成され、それらはＦｖ領域の三次構造において空間的に近接して配置される。本発明の抗体は、１つの同族ＶＨ／ＶＬ対に２つの「非重複」パラトープを含む。「非重複」とは、２つのパラトープの一方に含まれるアミノ酸のいずれも、もう一方のパラトープに含まれないことを意味する。

【0063】

本明細書で使用される「ＶＥＧＦパラトープ」は、ＶＥＧＦに結合するパラトープ又は抗原結合部位である。本発明の抗体のＶＥＧＦパラトープは、該抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含む。

【0064】

本明細書で使用される場合、「ＩＬ－１ベータパラトープ」は、ＩＬ－１ベータに結合するパラトープ又は抗原結合部位である。本発明の抗体のＩＬ－１ベータパラトープは、該抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ酸残基を含む。

【0065】

用語「ＶＥＧＦ」は、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、霊長類（例：ヒト）及びげっ歯類（例：マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＶＥＧＦを指す。この用語は、「完全長」の未処理のＶＥＧＦだけでなく、細胞内でのプロセシングの結果生じる任意の形態のＶＥＧＦを包含する。この用語は、天然に存在するＶＥＧＦのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＶＥＧＦのアミノ酸配列は、配列番号２６に示される。

【0066】

用語「抗ＶＥＧＦ抗体」及び「ＶＥＧＦに結合する抗体」とは、それがＶＥＧＦを標的とする際の診断及び／又は治療薬として有用であるような十分な親和性でＶＥＧＦと結合することができる抗体を意味する。一実施態様において、抗ＶＥＧＦ抗体の、無関係な非ＶＥＧＦタンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、抗体のＶＥＧＦへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様において、ＶＥＧＦに結合する抗体は、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ又は≦０．０１ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。抗体が１μＭ以下のＫ_Ｄを有する場合、抗体はＶＥＧＦに「特異的に結合する」という。

【0067】

用語「ＩＬ－１ベータ」は、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、霊長類（例：ヒト）及びげっ歯類（例：マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＩＬ－１ベータを指す。この用語は、「完全長」の未処理のＩＬ－１ベータだけでなく、細胞内でのプロセシングの結果生じる任意の形態のＩＬ－１ベータを包含する。この用語は、天然に存在するＩＬ－１ベータのバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子多型も包含する。例示的なヒトＩＬ－１ベータのアミノ酸配列は、配列番号２７に示される。

【0068】

用語「抗ＩＬ－１ベータ抗体」及び「抗ＩＬ－１ベータに結合する抗体」とは、それが抗ＩＬ－１ベータを標的とする際の診断及び／又は治療薬として有用であるような十分な親和性で抗ＩＬ－１ベータと結合することができる抗体を意味する。一実施態様において、抗ＩＬ－１ベータ抗体の、無関係な非ＩＬ－１ベータタンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、抗体の抗ＩＬ－１ベータへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様において、ＩＬ－１ベータに結合する抗体は、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ又は≦０．０３ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。抗体が１μＭ以下のＫ_Ｄを有する場合、抗体は抗ＩＬ－１ベータに「特異的に結合する」という。

【0069】

本発明の抗体が「ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに同時に結合する」とは、（ａ）ヒトＩＬ－１ベータに結合している本発明の抗体Ｆａｂ断片が、（同様に）ヒトＶＥＧＦにも特異的に結合し、且つ、（ｂ）ヒトＶＥＧＦに結合している本発明の抗体Ｆａｂ断片が、（同様に）ヒトＩＬ－１ベータにも特異的に結合することを意味する。同時結合は、当技術分野で既知の方法、例えば本明細書に記載されているような表面プラズモン共鳴によって評価することができる。

【0070】

本明細書で使用される用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、配列が超可変であり、抗原接触残基を含む抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、抗体は６つのＣＤＲ：ＶＨドメインに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）及びＶＬドメインに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）を含む。特に指定のない限り、ＣＤＲ残基及び可変ドメインの他の残基（例：ＦＲ残基）は、本明細書ではカバット番号付けシステム（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）に従って番号付けされている。

【0071】

本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメインアミノ酸残基を指す。可変ドメインのフレームワークは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＣＤＲ及びＦＲアミノ酸配列は、一般に、（ａ）ＶＨドメイン内にＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３－ＦＲ４；及び（ｂ）ＶＬドメイン内にＦＲ１－ＣＤＲ－Ｌ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｌ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｌ３－ＦＲ４で現れる。

【0072】

本明細書で使用されるカバット番号付けシステムによれば、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、可変ドメインの以下の領域に位置する。

【0073】

【表A】

【0074】

本明細書で言及されているカバット番号付けシステムによるアミノ酸位置は、本発明の抗体のアミノ酸配列とのアライメントで図２に示されている。アミノ酸配列内の特定の位置のアミノ酸への言及は、本明細書では、当技術分野で周知のように、アミノ酸とアミノ酸位置を記載することによってなされ、例えば「Ｅ２」は、抗体ドメインそれぞれのアミノ酸配列のカバット位置２に位置するグルタミン酸残基を指す。

【0075】

「親和性」とは、分子（例：抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例：抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度をいう。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例：抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的且つ例示的な実施態様が、本明細書に記載される。

【0076】

用語「エピトープ」とは、抗体が結合する抗原上のタンパク性又は非タンパク性の部位をいう。エピトープは、連続したアミノ酸ストレッチから形成される場合（線形エピトープ）も、又は、例えば抗原の折り畳みによって（すなわちタンパク性抗原の三次折り畳みによって）空間的に近接している不連続なアミノ酸を含む場合（構造的エピトープ）もある。線形エピトープは通常、タンパク性抗原を変性剤にさらした後も抗体によって結合されているが、一方、構造的エピトープは通常、変性剤で処理すると破壊される。エピトープは、特有の空間的立体構造で少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８～１０のアミノ酸を含む。

【0077】

特定のエピトープに結合する抗体（すなわち同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、例えば、非限定的に、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463参照）、ペプチド切断解析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Prot. Sci. 9 (2000) 487-496参照）、及びクロスブロッキング（「Antibodies」, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY参照）等、当技術分野で日常的な方法を使用して行うことができる。

【0078】

修飾支援プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）としても知られる、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＡＳＡＰ）は、多数の抗体の中の各抗体の、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する結合プロファイルに基づいて、ＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータに特異的に結合する多数のモノクローナル抗体をグループ（ｂｉｎ）に分けることを可能にする（例えば米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号参照）。各グループの複数の抗体は、同じエピトープに結合するが、このエピトープは、別のビンで表されるエピトープと明確に異なっているか又は部分的に重複する固有のエピトープであってよい。

【0079】

また、競合結合を用いて、抗体がＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータの同一エピトープに結合するか、又は本発明の参照抗体と結合するのに競合するかを容易に決定することができる。例えば、参照抗体と「同じＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータ上のエピトープに結合する抗体」は、それぞれの競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に参照抗体は、それぞれの競合アッセイにおいて上記抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする。また、例えば、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータに結合させることができる。過剰の参照抗体を除去した後、問題の抗体がＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータに結合する能力を評価する。問題の抗体が参照抗体の飽和結合後にＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータに結合することができるならば、問題の抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、問題の抗体が参照抗体の飽和結合後にＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータに結合できなければ、問題の抗体は参照抗体が結合したエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。問題の抗体が同じエピトープに結合するのか、それとも立体上の理由により結合が妨げられているだけなのかを確認するのに、日常的な実験を用いることができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当技術分野で利用可能なその他任意の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイ）。このアッセイは、２つのセットアップ、すなわち両方の抗体が飽和抗体である状態で、実行する必要がある。両方のセットアップで、第１の（飽和）抗体のみがＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータに結合できれば、問題の抗体及び参照抗体がＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータへの結合に関して競合すると結論付けることができる。

【0080】

いくつかの実施態様では、２つの抗体は、１、５、１０、２０又は１００倍過剰の一方の抗体がもう一方の抗体の結合を、競合結合アッセイで測定して少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％又は９９％以上阻害する場合、同じエピトープか又は重複するエピトープに結合するとみなされる（例えばJunghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502参照）。

【0081】

いくつかの実施態様では、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除する、抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合も減少させるか又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するアミノ酸変異のサブセットが他方の抗体の結合を減少させるか又は排除しさえすれば、「重複するエピトープ」を有するとみなされる。

【0082】

参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセントと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージのような一般に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて、当分野の技術範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。或いは、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して、パーセント同一性値を生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータープログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されており、且つ、国際公開第２０００／００５３１９号にも記載されている。

【0083】

但し、別途指示がない限り、本明細書において、％アミノ酸配列同一性値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを備えたＦＡＳＴＡパッケージ バージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），［Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」 Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；並びにＰｅａｒｓｏｎら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって作成され、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ又はｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから一般に入手可能である。或いは、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能なパブリックサーバーを使い、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して（ローカルではなく）グローバルアライメントを実行することで、これらの配列を比較することも可能である。パーセントアミノ酸同一性は、出力アライメントヘッダーに与えられる。

【0084】

用語「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的にはプリン又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基から構成される。しばしば、核酸分子は、塩基の配列によって記述され、それによって、前記塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には５’から３’まで表される。本明細書において、核酸分子という用語は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。核酸分子は、直鎖状又は環状であってよい。更に、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに一本鎖及び二本鎖形態を含む。更に、本明細書に記載される核酸分子は、天然又は非天然ヌクレオチドを含むことができる。非天然ヌクレオチドの例には、誘導体化糖又はリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基、又は化学修飾残基が含まれる。核酸分子はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで、例えば宿主又は患者において本発明の抗体の直接発現のためのベクターとして適しているＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包含する。そのようなＤＮＡ（例：ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例：ｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていてもいなくてもよい。例えば、ｍＲＮＡを化学的に改変してＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強し、ｍＲＮＡを対象に注入してｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成することができる（例えば、Stadler et al, Nature Medicine 2017、２０１７年６月１２日付オンライン版、doi:10.1038/nm.4356又はＥＰ第２１０１８２３号 Ｂ１を参照）。

【0085】

「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。

【0086】

抗体を「コードする単離された核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖をコードする１又は複数の核酸分子（又はその断片）を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中の当該核酸分子（複数可）及び宿主細胞の１又は複数の位置に存在する当該核酸分子が含まれる。

【0087】

本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターだけではなく、自己複製核酸構造としてのベクターも含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」という。

【0088】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これには、継代数に関係なく、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一ではない場合があるが、変異を含み得る。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。

【0089】

用語「薬学的組成物」又は「薬学的製剤」とは、中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になるような形態の調製物であり、且つ、薬学的組成物が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。

【0090】

「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物又は製剤中の活性成分以外の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。

【0091】

薬剤、例えば薬学的組成物の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。

【0092】

「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。

【0093】

本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など文法上の変形）は、治療されている個体の疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程において実行できる。治療の望ましい作用には、限定されないが、疾患の発生又は再発の防止、症候の緩和、疾患のいずれかの直接的又は間接的病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患進行速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を疾患の進行を遅くするために使用される。

【0094】

本明細書で使用される用語「眼疾患」は、病理学的血管新生及び／又は萎縮に関連する任意の眼疾患を含む。眼疾患は、網膜又は角膜などの眼組織の構造物への新しい血管の変化した又は無秩序な増殖及び／又は侵入によって特徴づけることができる。眼疾患は、網膜組織（光受容体及びその下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び脈絡毛細管）の萎縮によって特徴づけることができる。非限定的な眼疾患には、例えば、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、及び地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例：中心窩を含まない限局性ＤＭＥ及び中心窩を含むびまん性ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（例：増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（例：網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（例：近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連する疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患、中心性漿液性網膜症（ＣＳＲ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コート病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連する網膜異常、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生性疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、ＣＭＶ網膜炎を含むがこれに限定されない網膜炎、眼内黒色腫、網膜芽腫、結膜炎（例：伝染性結膜炎及び非伝染性（例えばアレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障（レーバーの先天性黒内障又はＬＣＡとしても知られる）、ぶどう膜炎（伝染性及び非伝染性ぶどう膜炎を含む）、脈絡膜炎（例：多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、シェーグレン病、並びに疾患又は障害が眼の血管新生、血管漏出及び／若しくは網膜浮腫又は網膜委縮に関連するその他の眼疾患が含まれる。更なる例示的な眼疾患には、網膜分離症（網膜神経感覚層の異常な分裂）、皮膚潮紅（隅角の血管新生）に関連する疾患、及び増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む、血管結合組織又は線維組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患が含まれる。角膜血管新生に関連する例示的な疾患には、限定されないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズの過剰装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｌｉｍｂｉｃ ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡、フリクテン症、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂肪変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原虫症、カポジ肉腫、モーレン角膜潰瘍、テリエン周辺角膜変性症、辺縁角膜融解、関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナー肉芽腫症、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、類天疱瘡、放射状角膜切開術、及び角膜移植片拒絶反応が含まれる。脈絡膜新生血管と、血管漏出の増加、動脈瘤及び毛細血管脱落などの網膜血管系の欠陥とに関連する例示的な疾患には、限定されないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、皮疹、梅毒、弾力線維性仮性黄色腫、ページェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ぶどう膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性紅斑性狼瘡、未熟児網膜症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を引き起こす感染症（例：多病巣性脈絡膜炎）、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病（卵黄様黄斑変性）、近視、視窩、毛様体扁平部炎、網膜剥離（例：慢性網膜剥離）、過粘稠血症候群、トキソプラズマ症、外傷、及びレーザー後の合併症が含まれる。網膜組織（光受容体及びその下のＲＰＥ）の萎縮に関連する例示的な疾患には、萎縮性又は非滲出性ＡＭＤ（例：地図状萎縮又は進行性乾性ＡＭＤ）、黄斑萎縮症（例：新血管形成及び／又は地図状萎縮に関連する萎縮症）、糖尿病性網膜症、シュタルガルト病、Ｓｏｒｓｂｙ眼底ジストロフィー（Ｓｏｒｓｂｙ Ｆｕｎｄｕｓ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、網膜分離症、及び網膜色素変性症が含まれるが、これらに限定されない。

【0095】

「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。

【0096】

２．本発明の実施態様の詳細な説明
一態様では、本発明は、部分的には、治療用途の二重特異性抗体の提供に基づく。特定の態様において、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば血管疾患、例えば眼血管疾患の診断又は治療に有用である。

【0097】

ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する例示的な抗体
一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。一態様では、提供されるのは、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する単離された抗体である。一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体を提供する。

【0098】

特定の態様において、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供され、抗体は、ＶＬドメインとＶＨドメインの１つの同族対内にＩＶＥＧＦパラトープ（すなわち、ＶＥＧＦに結合する抗原結合部位）及びＬ－１ベータパラトープ（すなわち、ＩＬ－１ベータに結合する抗原結合部位）を含み、
・ ＶＥＧＦパラトープは、上記抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含み、ＩＬ－１ベータパラトープは、上記抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ酸残基を含み；且つ／又は
・ 可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインの対は、同時にヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し；且つ／又は
・ ＶＥＧＦパラトープに含まれるアミノ酸のうち、ＩＬ－１ベータパラトープに含まれるものはなく；且つ／又は
・ ＩＬ－１ベータパラトープに含まれるアミノ酸のうち、ＶＥＧＦパラトープに含まれるものはなく；且つ／又は
・ 上記抗体は、配列番号１１の可変重鎖ドメイン及び配列番号１２の可変軽鎖ドメインを有する抗体と同じ、ヒトＶＥＧＦ上のエピトープ及びヒトＩＬ－１ベータ上のエピトープに結合し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片は、（ｉ）表面プラズモン共鳴により測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴により測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片は、７０℃以上の凝集開始温度を呈し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片は、動的光散乱法によって測定して８０℃超の融解温度を呈し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＶＥＧＦへの結合は、表面プラズモン共鳴により測定して５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害し、上記抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合は、表面プラズモン共鳴により測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、
抗体。

【0099】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体を提供する。

【0100】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる抗体を提供する。

【0101】

別の態様では、本発明は、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる抗体を提供する。一実施態様では、該抗体は、ＶＨドメインにアミノ酸残基Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６及びＲ８３を、ＶＬドメインにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＥＧＦパラトープと、ＶＨドメインにアミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を、ＶＬドメインにアミノ酸残基Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｙ９１を含むＩＬ－１ベータパラトープとを含む。

【0102】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む抗体を提供する。

【0103】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体を提供する。

【0104】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、抗体を提供する。

【0105】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体において、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ４９、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体を提供する。

【0106】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含む抗体を提供し、ここで、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0107】

別の態様において、本発明は、（ａ）１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体を提供する。

【0108】

別の態様では、本発明は、（ａ）１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸置換が配列番号１１の３～２５、３６～４９、９７～８２ｃ、８４～９３又は１０３～１１３位に位置するＶＨドメインと、（ｂ）１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインであって、アミノ酸置換が配列番号１２の１、４、６、８～２３、３５～４８、５８～６６、７０～８８又は９８～１０７位に位置する可変軽鎖ドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体を提供する。

【0109】

別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは、１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）可変軽鎖ドメインは、１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。

【0110】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含む抗体であって、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；（ａ）ＶＨドメインは１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）可変軽鎖ドメインは１～１５、１～１０又は１～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。

【0111】

ある態様において、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。特定の態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対する置換（例：保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含んでいる、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１１において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様において、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。特定の態様において、ＶＨは、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0112】

ある態様において、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。特定の態様において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対する置換（例：保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含んでいる、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する能力を保持する。特定の態様では、配列番号１２において、合計１から１０のアミノ酸が、置換、挿入及び／又は欠失されている。特定の態様において、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲ外の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。特定の態様において、ＶＬは、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0113】

別の態様において、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、上で提供される態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上で提供される態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一態様では、該抗体は、配列番号１１及び配列番号１２のそれぞれＶＨ及びＶＬ配列を、これらの配列の翻訳後修飾も含め、含む。

【0114】

別の態様において、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、配列番号２０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0115】

別の態様において、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供され、ここで、抗体は、配列番号１８の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む。

【0116】

本発明の更なる態様において、上記態様のいずれかによるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ又はＦ（ａｂ’）_２断片である。別の態様では、抗体は、完全長抗体である。

【0117】

更なる態様において、上記態様のいずれかによるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、以下のセクション１～７に記載されるような特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。

【0118】

１．抗体親和性
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ又は≦０．０１ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でＶＥＧＦに結合する。特定の実施態様において、ＩＬ－１ベータに結合する抗体は、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ又は≦０．０３ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。

【0119】

ある態様では、Ｋ_Ｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。

【0120】

例えば、ＶＥＧＦに結合する抗体のＫ_Ｄは、約１０応答単位（ＲＵ）のＣ１チップに固定化されたＶＥＧＦ１２１を用いて２５℃で実施される、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用するアッセイで測定される。動力学測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（１．２～１００ｎＭ）をＨＢＳ‐Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）に２５℃、約３０μｌ／ｍｉｎの流量で注入する。会合率（ｋ_ｏｎ）と解離率（ｋｏ_ｆｆ）は、会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時に当てはめることにより、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェア バージョン３．２）を用いて計算される。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照。

【0121】

例えば、ＩＬ－１ベータに結合する抗体のＫ_Ｄは、約２０応答単位（ＲＵ）のＣ１チップに固定化された二重特異性抗体を用いて２５℃で実施される、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用するアッセイで測定される。動力学測定のために、ヒトＩＬ－１ベータの２倍段階希釈液（０．７４～６０ｎＭ）をＨＢＳ‐Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）に２５℃、約３０μｌ／分の流量で注入する。会合率（ｋ_ｏｎ）と解離率（ｋｏ_ｆｆ）は、会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時に当てはめることにより、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェア バージョン３．２）を用いて計算される。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照。

【0122】

２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。

【0123】

一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ又はＦ（ａｂ’）_２断片、特にＦａｂ断片である。インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）と、更には軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、用語「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片を含む抗体断片を指す。「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域からの１又は複数のシステインを含む、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での残基の付加によりＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）_２断片を生成する。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つ増加したｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0124】

抗体断片は、本明細書に記載のように、限定されないが、インタクトな抗体のタンパク質消化、並びに組換え宿主細胞（例えば大腸菌、ＣＨＯ）による組換え生産を含む様々な技術によって作製され得る。

【0125】

３．熱安定性
本明細書で提供される抗体は、優れた熱安定性を呈する。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のＦａｂ断片は、７０℃超の凝集開始温度を呈する。特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体のＦａｂ断片は、動的光散乱法によって測定して８０℃超の融解温度を呈する。

【0126】

４．ライブラリー由来の抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ライブラリーに由来する。本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法は、例えばＬｅｒｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）で概説されている。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成し、所望の結合特性を有する抗体のこのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。このような方法は、例えばＦｒｅｎｚｅｌら，ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎら，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）及びＺｈａｏら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）、及びＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）で概説されている。

【0127】

特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリー中でランダムに再結合され、このライブラリーはその後、ＷｉｎｔｅｒらのＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載のように、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓらがＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載のように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、全く免疫化せずに、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することもできる。更に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒがＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載のように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを人工的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許公報には、例えば、米国特許第５７５０３７３号、同第７９８５８４０号、同第７７８５９０３号及び同第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号が含まれる。

【0128】

所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野で既知の方法の更なる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、ＳｃｈｏｌｌｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）、並びにＺｈａｏらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）で概説されている。リボソームディスプレイの方法は、例えば、ＨｅらのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）に、ＨａｎｅｓらのＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。

【0129】

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書中ではヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。

【0130】

５．多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。

【0131】

本明細書で提供される抗体を含む３つ以上の結合特異性を有する多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメインを（例えば国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメインを（例えば国際公開第２００９／０８０２５３号参照）、又は完全なＦａｂアームを（例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号、並びにSchaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191及びKlein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20参照）を交換することによって提供され得る。多重特異性抗体の様々な更なる分子フォーマットが当技術分野で既知であり、本明細書に含まれる（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106参照）。

【0132】

６．抗体バリアント
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換が含まれる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行って、最終コンストラクトに到達することができるが、但し、これは最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有する場合に限る。

【0133】

特定の態様では、１又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発性の対象部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、以下の表の「好ましい置換基」の見出しの下に示されている。より実質的な変更を、表Ｂの「例示的置換」の見出しの下に示し、アミノ酸側鎖のクラスに従って下記に更に説明する。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、その生成物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。

【0134】

【表B】

【0135】

アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0136】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。

【0137】

あるタイプの置換バリアントは、親抗体（例：ヒト化又はヒト抗体）の１又は複数の超可変領域残基を置換することを要する。一般に、更なる研究のために選択された結果として生じるバリアントは、親抗体と比較して、特定の生物学的特性（例えば親和性の向上、免疫原性の低下）の改変（例えば向上）を有する、且つ／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、１又は複数のＨＶＲ残基が変異し、バリアント抗体がファージ上に表示されて、特定の生物学的活性（例：結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0138】

ＣＤＲにおいて、例えば、抗体親和性を改善するために、変更（例：置換）を行ってもよい。このような変更は、ＣＤＲ内の「ホットスポット」、すなわち体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされた残基（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）内及び／又は抗原に接する残基内で行うことができ、結果として生じるバリアントＶＨ又はＶＬの結合親和性が試験される。二次ライブラリーから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様において、多様性が、様々な方法（例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。その後、二次ライブラリーが作成される。その後、該ライブラリーは、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを特定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、複数のＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６個の残基）がランダム化されるＣＤＲ特異的アプローチ（ＣＤＲ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）を伴う。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えばアラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを用いて、具体的に特定することができる。特に、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が多くの場合標的とされる。

【0139】

特定の態様では、置換、挿入又は欠失は、これらの変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１又は複数のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。このような変更は、例えば、ＣＤＲ内の残基に接する抗原の外側にあってもよい。上で提供されている特定のバリアントＶＨ及びＶＬ配列において、各ＣＤＲは変更されないか、又はわずか１つ、２つ若しくは３つのアミノ酸置換を含む。

【0140】

変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を特定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的となる残基又は残基群（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ等の荷電残基）を特定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）で置き換えて、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。代替的に又は追加的には、抗体と抗原の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造が使用され得る。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうか判定することができる。

【0141】

アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入バリアントには、抗体の血清半減期を増加させる、抗体のＮ若しくはＣ末端と酵素（例えばＡＤＥＰＴ（抗体指向酵素プロドラッグ療法）のためのもの）又はポリペプチドとの融合体が含まれる。

【0142】

ａ）グリコシル化バリアント
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増大又は低下させるように変更される。グリコシル化部位の抗体への付加又は欠失は、１又は複数のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を改変更することにより、簡便に達成され得る。

【0143】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに付着するオリゴ糖を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばＷｒｉｇｈｔらＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸の他、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれ得る。いくつかの態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するためになされ得る。

【0144】

一態様において、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接又は間接的に）付着したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は、特に、二分岐オリゴ糖構造の幹における最初のＧｌｃＮＡｃに付着しているフコース残基を欠くＮ結合型オリゴ糖である。ある態様においては、天然抗体又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加している抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は約１００％でさえあり得る（すなわち、フコシル化オリゴ糖は存在しない）。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で測定される、Ａｓｎ２９７に付着した全ての糖構造（例えば複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造体）の合計に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体の軽微な配列変動に起因して、２９７位から上流又は下流に約±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。

【0145】

フコシル化が低下した抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質のフコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えばYamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくは輸送タンパク質の活性が低下若しくは停止されている細胞（例えば米国特許第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号参照）が含まれる。

【0146】

更なる実施態様では、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアント、例えば、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている抗体バリアントが提供される。このような抗体バリアントは、上述のように、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントの例は、例えばＵｍａｎａら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。

【0147】

Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１のガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号に記載されている。

【0148】

ｂ）Ｆｃ領域バリアント
特定の態様において、１又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１又は複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸修飾（例：置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例：ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４ Ｆｃ領域）を含み得る。

【0149】

特定の態様では、本発明は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有し、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要であるにもかかわらず、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不要であったり有害であったりする場合の用途のための望ましい候補となる、抗体バリアントを企図している。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低下／枯渇を確認するために実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって恐らくはＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能を保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えばHellstrom, I et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al.,J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えばフローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、ＣｌｙｎｅｓｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルで、評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体がＣ１ｑに結合できないこと、それ故ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために行うこともできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)、Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)、及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。また、ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定も、当分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；国際公開第２０１３／１２０９２９号参照）。

【0150】

エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有する抗体が含まれる（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含め、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。

【0151】

ＦｃＲへの結合が向上又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
特定の態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１又は複数のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。

【0152】

特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を縮小する１又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２３４位及び２３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。一態様において、置換はＬ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の態様では、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内にＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを更に含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照のこと。）別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）である。

【0153】

いくつかの態様では、Ｆｃ領域において、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅらのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載のような、変更された（すなわち向上したか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変更がなされる。

【0154】

増加した半減期を持ち、胎児への母性ＩｇＧの輸送を担う（Guyerら、J. Immunol. 117:587 (1976)及びKimら、J. Immunol. 24:249 (1994)）新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。このような抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１又は複数における置換を有するものが含まれる（例えば米国特許第７３７１８２６号；Dall’Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524参照）。

【0155】

マウスＦｃ－マウスＦｃＲｎ相互作用に重要なＦｃ領域残基は、部位特異的変異誘発によって特定されている（例えばDall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180参照）。この相互作用には、残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４及びＨ４３５（ＥＵ番号付け）が関与している（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０及びＨ４３５は、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に重要であることが判明した(Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999 ; 2819)。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、この相互作用には残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５及びＹ４３６が重要であることが示されている（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．らのＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１では、残基２４８～２５９及び３０１～３１７及び３７６～３８２及び４２４～４３７の様々な変異体が報告及び調査されている。

【0156】

特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低減させる１又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５３位及び／又は３１０位及び／又は４３５位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、２５３位、３１０位、及び４３５位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａである。例えばＧｒｅｖｙｓ，Ａ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７－５５０８を参照されたい。

【0157】

特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低減させる１又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の３１０位及び／又は４３３位及び／又は４３６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。特定の態様では、抗体バリアントは、３１０位、４３３位、及び４３６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａである。（例えば国際公開第２０１４／１７７４６０号参照）

【0158】

特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増大させる１又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５２位及び／又は２５４位及び／又は２５６位（残基のＥＵ番号付け）における置換を有するＦｃ領域を含む。特定の態様において、抗体バリアントは、２５２位、２５４位、及び２５６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域内のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅである。Ｆｃ領域のバリアントのその他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）、米国特許第５６４８２６０号、米国特許第５６２４８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0159】

本明細書で報告される抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端とすることができる。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端のアミノ酸残基のうちの１つ又は２つが除去されている、短縮されたＣ末端とすることができる。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。本明細書で報告される全ての態様のうちの一態様において、本明細書に明記されているＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、アミノ酸位置のＥＵインデックス番号付け）を含む。本明細書で報告される全ての態様のうちの一態様において、本明細書に明記されているＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、アミノ酸位置のＥＵインデックス番号付け）を含む。

【0160】

ｃ）システイン操作抗体バリアント
特定の態様において、抗体の１又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えばチオＭＡｂ^ＴＭを作製することが望ましい場合がある。特定の態様において、置換残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中で詳述されるように、イムノコンジュゲートを生成するために、例えば薬物部分又はリンカー－薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用され得る。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号、同第８３０９３０号、同第７８５５２７５号、同第９０００１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載されているように生成することができる。

【0161】

７．イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素活性毒素又はこれらの断片）又は放射性同位体などの１種以上の治療剤にコンジュゲート（化学結合）している、本明細書に開示のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0162】

一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が上述の１種以上の治療剤にコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。該抗体は、典型的には、リンカーを用いて１種以上の治療剤に結合される。治療剤及び治療薬、並びにリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に明記されている。

【0163】

組換え方法及び組成物
例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて抗体を製造することができる。このような方法のために、抗体をコードする１又は複数の単離された核酸が提供される。

【0164】

一態様では、本発明の抗体をコードする単離された核酸が提供される。

【0165】

一態様では、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を作製する方法であって、該抗体の発現に適した条件下で、上述のような、該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することとを含む方法が提供される。

【0166】

ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の組換え生産のために、例えば上述のような、該抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定することができ、又は組換え法で生産したり、化学合成で得ることができる。

【0167】

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で生産され得る。細菌内での抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号、同第５７８９１９９号、及び同第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton, K.A., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), p. 245-254も参照）。発現後、抗体を、可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離し、更に精製することができる。

【0168】

脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L.ら, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載の２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載のＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えばMather, J.Pら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のもの）；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），２５５－２６８頁を参照。

【0169】

一態様では、宿主細胞は、真核生物であり、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。

【0170】

薬学的組成物
更なる態様において、本明細書で提供される抗体のいずれかを含む薬学的組成物が、例えば下記の治療方法のいずれかにおける使用のために提供される。一態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、例えば後述の少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。

【0171】

本明細書に記載のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の薬学的組成物は、所望の純度を有する当該抗体を１種以上の任意の薬学的に許容される担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することによって、凍結乾燥組成物又は水溶液の形態で調製される。通常、薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定されるものではないが、ヒスチジン、リン酸、クエン酸、酢酸及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及びその他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）などの介在性薬物分散剤、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ社）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。

【0172】

例示的な凍結乾燥抗体組成物は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体組成物には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の組成物はヒスチジン－酢酸バッファーを含む。

【0173】

本明細書に記載の薬学的組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な、１種より多い活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものも含有し得る。そのような活性成分は、好適には、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在する。

【0174】

活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに、封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0175】

徐放性の薬学的組成物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0176】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に用いる薬学的組成物は、一般に滅菌である。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成することができる。

【0177】

治療方法及び投与経路
本明細書に提供される、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する任意の抗体を、治療方法において使用することができる。

【0178】

ある態様において、医薬としての使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供される。更なる態様において、血管疾患の治療における使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供される。特定の態様において、治療の方法における使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供される。特定の態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の有効量を血管疾患を有する個体に投与することを含む、該個体を治療する方法における使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。このような一態様において、該方法は、例えば後述の少なくとも１種の追加の治療剤（例：１、２、３、４、５又は６種の追加の治療剤）の有効量を該個体に投与することを更に含む。更なる態様において、本発明は、血管新生の阻害における使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、血管新生を阻害するために、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の有効量を個体に投与することを含む、個体の血管新生を阻害する方法における使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を提供する。上記の態様のいずれによる「個体」も、好ましくはヒトである。

【0179】

更なる態様において、眼疾患の治療における使用のための、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体が提供される。一実施態様では、眼疾患は、ＡＭＤ（一実施態様では湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、及び地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（一実施態様では中心窩を含まない限局性ＤＭＥ及び中心窩を含むびまん性ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（一実施態様では増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲ）、その他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）（一実施態様では網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）及び網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ））、ＣＮＶ（一実施態様では近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連する疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患、中心性漿液性網膜症（ＣＳＲ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＦＥＶＲ、コート病、ノリエ病、骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連する網膜異常、結膜下出血、皮膚潮紅、眼の血管新生性疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧網膜症、網膜血管腫の増殖、黄斑毛細血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、嚢胞様黄斑浮腫（ＣＭＥ）、脈管炎、視神経乳頭浮腫、ＣＭＶ網膜炎を含むがこれに限定されない網膜炎、眼内黒色腫、網膜芽腫、結膜炎（一実施態様では伝染性結膜炎及び非伝染性（一実施態様ではアレルギー性）結膜炎）、レーバー先天黒内障（レーバーの先天性黒内障又はＬＣＡとしても知られる）、ぶどう膜炎（伝染性及び非伝染性ぶどう膜炎を含む）、脈絡膜炎（一実施態様では多病巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラスマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性の目の損傷、シェーグレン病、並びに疾患又は障害が眼の血管新生、血管漏出及び／若しくは網膜浮腫又は網膜委縮に関連するその他の眼疾患から選択される。一実施態様において、眼疾患は、ＡＭＤ（一実施態様では湿性ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、中間ＡＭＤ、進行性ＡＭＤ、及び地図状委縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（一実施態様では中心窩を含まない限局性ＤＭＥ及び中心窩を含むびまん性ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病網膜症（ＤＲ）（一実施態様では増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高地ＤＲ）から選択される。

【0180】

更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の使用を提供する。一態様において、医薬は、血管疾患の治療のためのものである。更なる態様において、医薬は、その有効量を血管疾患を有する個体に投与することを含む、血管疾患を治療する方法における使用のためのものである。このような一態様では、本発明の方法は、例えば後述の少なくとも１種の追加の治療剤の有効量を上記個体に投与することを更に含む。

【0181】

ある態様において、医薬は、眼疾患の治療のためのものである。更なる態様において、医薬は、その有効量を眼疾患を有する個体に投与することを含む眼疾患を治療する方法における使用のためのものである。このような一態様では、本発明の方法は、例えば後述の少なくとも１種の追加の治療剤の有効量を上記個体に投与することを更に含む。

【0182】

更なる態様において、本発明は、血管疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、この方法は、上記血管疾患を有する個体に、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の有効量を投与することを含む。このような一態様では、本方法は、後述するような少なくとも１種の追加の治療剤の有効量を上記個体に投与することを更に含む。

【0183】

更なる態様において、本発明は、眼疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、この方法は、上記眼疾患を有する個体に、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の有効量を投与することを含む。このような一態様では、本方法は、後述するような少なくとも１種の追加の治療剤の有効量を上記個体に投与することを更に含む。

【0184】

上記の態様のいずれによる「個体」も、ヒトであってよい。

【0185】

更なる態様において、本発明は、例えば上記の治療法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合するいずれかの抗体を含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的組成物は、本明細書に提供される、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体のいずれかと、例えば後述の少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。

【0186】

本発明の抗体は、単独で投与するか、又は併用療法で用いることができる。例えば、併用療法は、本発明の抗体を投与することと、少なくとも１種の追加の治療薬（例えば、１、２、３、４、５又は６種の追加の治療剤）を投与することとを含む。

【0187】

例えば、特定の実施態様では、上記方法のいずれもが、１種以上の追加の化合物を更に含む。特定の実施態様では、本明細書に提供される、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、追加の化合物と同時に投与される。特定の実施態様では、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、追加の化合物（複数可）の前又は後に投与される。特定の実施態様では、追加の化合物は、ＩＬ－６；ＩＬ－６Ｒ；ＩＬ－１３；ＩＬ－１３Ｒ；ＰＤＧＦ；アンジオポエチン；Ａｎｇ２；Ｔｉｅ２；Ｓ１Ｐ；インテグリンαｖβ３、αｖβ５、及びα５β１；ベータセルリン；アペリン／ＡＰＪ；エリスロポエチン；補体因子Ｄ；ＴＮＦα；ＨｔｒＡ１；ＶＥＧＦ受容体；ＳＴ－２受容体；及びＡＭＤのリスクに遺伝的に関連するタンパク質、例えば補体経路成分Ｃ２、Ｂ因子、Ｈ因子、ＣＦＨＲ３、Ｃ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、及びＣ３ａ；ＨｔｒＡ１；ＡＲＭＳ２；ＴＩＭＰ３；ＨＬＡ；インターロイキン－８（ＩＬ－８）；ＣＸ３ＣＲ１；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＣＥＴＰ；ＬＩＰＣ、ＣＯＬ１０Ａ１；並びにＴＮＦＲＳＦ１０Ａからなる群より選択される、第２の生体分子に結合する。特定の実施態様では、追加の化合物は、抗体又はその抗原結合断片である。

【0188】

上記実施態様のいずれかによる（又はそれらのいずれかに適用される）特定の実施態様では、眼の障害は、増殖性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性及びその他虚血関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、目のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯを含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、並びに未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群より選択される眼内血管新生性疾患である。

【0189】

場合によって、本明細書に提供されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害、例えば本明細書に記載の眼の障害（例：ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、少なくとも１種の追加治療剤と組み合わせて投与され得る。眼の障害の治療のための併用療法用の例示的な追加の治療剤には、限定されないが、例えば抗ＶＥＧＦ抗体（例：抗ＶＥＧＦ Ｆａｂルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ））、可溶性受容体融合タンパク質（例：組換え可溶性受容体融合タンパク質アイリーア（登録商標）（ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ Ｅｙｅとしても知られるアフリベルセプト；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ／Ａｖｅｎｔｉｓ））、アプタマー（例：抗ＶＥＧＦペグ化アプタマー マクジェン（登録商標）（ペガプタニブ－ナトリウム；ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））、及びＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例：４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサニブ（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）、及びスーテント（登録商標）（スニチニブ））を含むＶＥＧＦアンタゴニスト；トリプトファニル－ｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）；スクアラミン；ＲＥＴＡＡＮＥ（登録商標）（デポ懸濁液用の酢酸アネコルタブ；Ａｌｃｏｎ社）；コンブレタスチンＡ４プロドラッグ（ＣＡ４Ｐ）；ＭＩＦＥＰＲＥＸ（登録商標）（ミフェプリストン－ｒｕ４８６）；サブテノントリアムシノロンアセトニド；硝子体内結晶質トリアムシノロンアセトニド；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例：Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ（ＡＧ３３４０；ファイザー））；フルオシノロンアセトニド（フルオシノロン眼内レンズを含む；Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ／Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；リノミド；インテグリンβ３機能の阻害剤；アンギオスタチン等の抗血管新生剤、並びにこれらの組み合わせが含まれる。ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する本発明の抗体と組み合わせて投与することのできる上記及びその他の治療剤は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００１７２４４号に記載されている。

【0190】

眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ又はＧＡ）の治療のために、本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体と組み合わせて使用することのできる追加の治療剤の更なる例には、限定されないが、ビスダイン（登録商標）（ベルテポルフィン；典型的には非熱レーザーを用いる光力学療法と組み合わせて使用される光活性化薬）、ＰＫＣ４１２、Ｅｎｄｏｖｉｏｎ（ＮＳ ３７２８；ＮｅｕｒｏＳｅａｒｃｈ社）、神経栄養因子（例：グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及び毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ））、ジルチアゼム、ドルゾラミド、ＰＨＯＴＯＴＲＯＰ（登録商標）、９－シス－網膜、目薬（例：ヨウ化ホスホリン、エコチオフェート又は炭酸脱水酵素阻害剤）、ネオバスタット（ＡＥ－９４１；ＡＥｔｅｒｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、Ｓｉｒｎａ－０２７（ＡＧＦ－７４５；Ｓｉｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）、ニューロトロフィン（例示のみを目的として、ＮＴ－４／５、ジェネンテック）を含む）、Ｃａｎｄ５（Ａｃｕｉｔｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＩＮＳ－３７２１７（Ｉｎｓｐｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インテグリンアンタゴニスト（Ｊｅｒｉｎｉ社及びＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのものを含む）、ＥＧ－３３０６（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社）、ＢＤＭ－Ｅ（ＢｉｏＤｉｅｍ社）、サリドマイド（例えばＥｎｔｒｅＭｅｄ社が使用）、カルジオトロフィン－１（ジェネンテック）、２－メトキシエストラジオール（アラガン／Ｏｃｕｌｅｘ）、ＤＬ－８２３４（東レ）、ＮＴＣ－２００（Ｎｅｕｒｏｔｅｃｈ）、テトラチオモリブデート（ミシガン大学）、ＬＹＮ－００２（Ｌｙｎｋｅｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、微細藻類化合物（Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ／Ａｌｂａｎｙ、Ｍｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｄ－９１２０ （セルテックグループ）、ＡＴＸ－Ｓ１０ （浜松ホトニクス）、ＴＧＦ－ベータ２ （Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｌｔｒｉｘ）、チロシンキナーゼ阻害剤（例：アラガン、ＳＵＧＥＮ又はファイザーのもの）、ＮＸ－２７８－Ｌ（ＮｅＸｓｔａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ギリアド・サイエンシズ）、Ｏｐｔ－２４（フランスＯＰＴＩＳ社）、網膜細胞ガングリオン神経保護物質（Ｃｏｇｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎ－ニトロピラゾール誘導体（テキサスＡ＆Ｍ大学システム）、ＫＰ－１０２（Ｋｒｅｎｉｔｓｋｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、シクロスポリンＡ、光力学療法に使用される治療剤（例：ビスダイン（登録商標）；受容体標的化ＰＤＴ、ブリストル・マイヤーズスクイブ社；ＰＤＴによる注射のためのポルフィマーナトリウム；ベルテポルフィン、ＱＬＴ社；ＰＤＴによるロスタポルフィン、Ｍｉｒａｖｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ＰＤＴによるタラポルフィンナトリウム、日本ペトロリアム；及びモテキサフィンルテチウム、Ｐｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓ社）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例として、Ｎｏｖａｇａｌｉ Ｐｈａｒｍａ社により試験済みの製品及びＩＳＩＳ－１３６５０、アイオニス・ファーマシューティカルズを含む）、及びこれらの組み合わせが含まれる。

【0191】

本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、療法又は外科手技と組み合わせて投与することができ、そのような療法又は外科手技には、例えば、レーザー光凝固（例：汎網膜光凝固（ＰＲＰ））、ドルーゼンレーザー治療（drusen lasering）、黄斑円孔の手術、黄斑移動術、移植式超小型テレスコープ、ＰＨＩ－モーション血管造影法（マイクロレーザー療法及びフィーダー血管治療としても知られる）、陽子線治療、微小刺激療法、網膜剥離及び硝子体手術、胸膜バックル、黄斑下手術、経瞳孔温熱療法、光化学系Ｉ療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外循環式レオフェレーシス（extracorporeal rheopheresis）（膜差濾過（membrane differential filtration）及びレオセラピーとしても知られる）、マイクロチップ移植、幹細胞療法、遺伝子置換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答エレメントに対する遺伝子療法、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｌｅｎｔｉｐａｋ、Ｇｅｎｅｔｉｘ；及びＰＤＥＦ遺伝子療法、ＧｅｎＶｅｃを含む）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞（Ｄｉａｃｒｉｎ社）；網膜細胞移植（例えば米国アステラス製薬社）、ＲｅＮｅｕｒｏｎ（ＣＨＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含む）、鍼療法、及びこれらの組み合わせが含まれる。

【0192】

場合によって、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、抗血管新生剤と組み合わせて投与され得る。ＣａｒｍｅｌｉｅｔらＮａｔｕｒｅ ４０７：２４９－２５７，２０００によってリスト化されているものを含むがこれらに限定されない任意の適切な抗血管新生剤を、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する本発明の抗体と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施態様では、抗血管新生剤はＶＥＧＦアンタゴニストであり、これには、限定されないが、抗ＶＥＧＦ抗体（例：抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（旧ＥＳＢＡ－１００８、抗ＶＥＧＦ単鎖抗体断片；ノバルティス）又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例：ファリシマブなどの抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体；ロッシュ）、可溶性組換え受容体融合タンパク質（例：アイリーア（登録商標）（アフリベルセプト））、ＶＥＧＦバリアント、可溶性ＶＥＧＦＲ断片、ＶＥＧＦを遮断することのできるアプタマー（例：ペガプタニブ）又はＶＥＧＦＲを遮断することのできるアプタマー、中和性抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの低分子阻害剤、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例：アビシパルぺゴル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ社／アラガン社）、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲの発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡ、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（例：４－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－６－メトキシ－７－（１－メチルピペリジン－４－イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４）、４－（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イルオキシ）－６－メトキシ－７－（３－ピロリジン－１－イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７）、セマクサニブ（ＳＵ５４１６；ＳＵＧＥＮ）及びスーテント（登録商標）（スニチニブ））、並びにこれらの組み合わせが含まれる。

【0193】

眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体と組み合わせて投与することのできる他の適切な抗血管新生剤には、コルチコステロイド、抗血管新生ステロイド、酢酸アネコルタブ、アンギオスタチン、エンドスタチン、チロシンキナーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、間質由来因子（ＳＤＦ－１）アンタゴニスト（例：抗ＳＤＦ－１抗体）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ガンマセクレターゼ、Ｄｅｌｔａ様リガンド４、インテグリンアンタゴニスト、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）－１αアンタゴニスト、プロテインキナーゼＣＫ２アンタゴニスト、血管新生の部位への幹細胞（例：内皮前駆細胞）のホーミングを阻害する薬剤（例：抗血管内皮カドヘリン（ＣＤ－１４４）抗体及び／又は抗ＳＤＦ－１抗体）、並びにこれらの組み合わせが含まれる。

【0194】

更なる例では、場合によって、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体及び／又はその高分子製剤（polymeric formulation）は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、血管新生に対する活性を有する薬剤と組み合わせて投与することができ、そのような薬剤は、例えば、抗炎症薬、哺乳類のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤（例：ラパマイシン、アフィニトール（登録商標）（エベロリムス）及びトーリセル（登録商標）（テムシロリムス））、シクロスポリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト（例：抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合断片（例：インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及びゴリムマブ）又は可溶性受容体融合タンパク質（例：エタネルセプト））、抗補体剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、或いはこれらの組み合わせである。

【0195】

また更なる例では、場合によって、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、神経保護性で、乾性ＡＭＤから湿性ＡＭＤへの進行を低減させ得る薬剤、例えば「神経ステロイド」と呼ばれる種類の薬物と組み合わせて投与することができ、そのような薬物には、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（商標名：ＰＲＡＳＴＥＲＡ^ＴＭ及びＦＩＤＥＬＩＮ（登録商標））、デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩、及びプレグネノロン硫酸塩などが含まれる。

【0196】

眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体と組み合わせて投与することのできる適切なＡＭＤ治療剤には、限定されないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例：ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（旧ＥＳＢＡ－１００８、抗ＶＥＧＦ単鎖抗体断片；ノバルティス）又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例：抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体、例えばファリシマブ；ロッシュ））、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例：アイリーア（登録商標）（アフリベルセプト））、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例：アビシパルぺゴル）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓｓ社／アラガン）又は抗ＶＥＧＦアプタマー（例：マクジェン（登録商標）（ペガプタニブ‐ナトリウム））；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、例えば抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体（例：ＲＥＧＮ２１７６－３）、抗ＰＤＧＦ－ＢＢペグ化アプタマー（例：フォビスタ（登録商標）；オフソテック／ノバルティス）、可溶性ＰＤＧＦＲ受容体融合タンパク質又は二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例：低分子阻害剤（例：ＤＥ－１２０（参天）又はＸ－８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））又は二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体））；ビスダイン（登録商標）（ベルテポルフィン）と光力学療法の組み合わせ；抗酸化剤；補体系アンタゴニスト、例えば補体因子Ｃ５アンタゴニスト（例；低分子阻害剤（例：ＡＲＣ－１９０５；Ｏｐｔｈｏｔｅｃｈ）又は抗Ｃ５抗体（例：ＬＦＧ－３１６；ノバルティス）、プロパジンアンタゴニスト（例：抗プロパジン抗体、例えばＣＬＧ－５６１；アルコン）又は補体因子Ｄアンタゴニスト（例：抗補体因子Ｄ抗体、例えばランパリズマブ；ロッシュ））；Ｃ３ブロッキングペプチド（例：ＡＰＬ－２、Ａｐｐｅｌｌｉｓ）；視覚サイクル調節剤（例：エミクススタット塩酸塩）；スクアラミン（例：ＯＨＲ－１０２；Ｏｈｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ビタミン及びミネラルのサプリメント（例：加齢性眼疾患研究１（ＡＲＥＤＳ１）に記載のもの；亜鉛及び／又は抗酸化剤）、並びに同研究２（ＡＲＥＤＳ２）に記載のもの；亜鉛、抗酸化剤、ルテイン、ゼアキサンチン、及び／又はオメガ－３脂肪酸））；細胞療法、例えばＮＴ－５０１（Ｒｅｎｅｘｕｓ）；ＰＨ－０５２０６３８８（ファイザー）、ｈｕＣＮＳ－ＳＣ細胞移植（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）、ＣＮＴＯ－２４７６（ヤンセン）、ＯｐＲｅｇｅｎ（Ｃｅｌｌ Ｃｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞移植（Ｏｃａｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；組織因子アンタゴニスト（例：ｈＩ－ｃｏｎ１；Ｉｃｏｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；アルファ－アドレナリン受容体アゴニスト（例：酒石酸ブリモニジン；アラガン）；ペプチドワクチン（例：Ｓ－６４６２４０；シオノギ）；アミロイドベータアンタゴニスト（例：抗ベータアミロイドモノクローナル抗体、例えばＧＳＫ－９３３７７６）；Ｓ１Ｐアンタゴニスト（例：抗Ｓ１Ｐ抗体、例えばｉＳＯＮＥＰ^ＴＭ；Ｌｐａｔｈ社）；ＲＯＢＯ４アンタゴニスト（例：抗ＲＯＢＯ４抗体、例えばＤＳ－７０８０ａ；第一三共）；レンチウイルスベクター発現エンドスタチン及びアンギオスタチン（例：ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ）；並びにこれらの任意の組み合わせが含まれる。場合によって、ＡＭＤ治療剤（前述のＡＭＤ治療剤のいずれかを含む）を共製剤化することができる。例えば、抗ＰＤＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ２１７６－３は、アフリベルセプト（アイリーア（登録商標））と共製剤化することができる。場合によって、このような共製剤は、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体と組み合わせて投与することができる。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。

【0197】

ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）と組み合わせて投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0198】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、ルセンティス（登録商標）（アフリベルセプト）と組み合わせて投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0199】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、マクジェン（登録商標）（ペガプタニブ‐ナトリウム）と組み合わせて投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0200】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、ビスダイン（登録商標）（ベルテポルフィン）及び光力学療法を組み合わせて投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0201】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、ＰＤＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与され得る。本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体と組み合わせて使用され得る例示的なＰＤＧＦアンタゴニストには、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、低分子阻害剤（例：スクアラミン）、抗ＰＤＧＦ－Ｂペグ化アプタマー（例えばフォビスタ（登録商標）（Ｅ１００３０；オフソテック／ノバルティス））又は二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例：低分子阻害剤（例：ＤＥ－１２０（参天）又はＸ－８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））又は二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体が含まれる。例えば、フォビスタ（登録商標）は、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体に対する補助療法として投与され得る。ＯＨＲ－１０２は、ルセンティス（登録商標）又はアイリーア（登録商標）などのＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与され得る。いくつかの実施態様において、ヒトＶＥＧＦ及び本発明のヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ＯＨＲ－１０２、ルセンティス（登録商標）、及び／又はアイリーア（登録商標）と組み合わせて投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0202】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、ＲＴＨ－２５８と組み合わせて投与され得る。ＲＴＨ－２５８は、例えば、硝子体内注射又は眼点滴によって投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0203】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、アビシパルぺゴルと組み合わせて投与され得る。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0204】

眼の障害（例：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ又はＧＡ）の治療のために、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体と組み合わせて任意の適切なＤＭＥ及び／又はＤＲ治療剤を投与することができ、これには、限定されはないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例：ルセンティス（登録商標）又はアイリーア（登録商標））、コルチコステロイド（例：コルチコステロイドインプラント（例：オズルデックス（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）又はＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（フルオシノロンアセトニド硝子体内インプラント））又は硝子体内注射（例：トリアムシノロンアセトニド）による投与のため製剤化されたコルチコステロイド、或いはこれらの組み合わせが含まれる。場合によっては、眼の障害は、ＤＭＥ及び／又はＤＲである。

【0205】

本発明のヒトＶＥＧＦ及び本発明のヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ＤＭＥ及び／又はＤＲ（例：ＮＰＤＲ又はＰＤＲ）の治療のために、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）と組み合わせて投与され得る。

【0206】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ＤＭＥ及び／又はＤＲ（例：ＮＰＤＲ又はＰＤＲ）の治療のために、アイリーア（登録商標）（アフリベルセプト）と組み合わせて投与され得る。

【0207】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ＤＭＥ及び／又はＤＲの治療のために、オズルデックス（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）と組み合わせて投与され得る。

【0208】

本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体は、ＤＭＥ及び／又はＤＲの治療のために、ＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）と組み合わせて投与され得る。

【0209】

場合によっては、ＴＡＯ／ＰＲＮ治療レジメン又はＴＡＥ治療レジメンを用いて、ＡＭＤ治療薬剤（例：ラニビズマブ又はアフリベルセプト）を、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体、並びに／又はその高分子製剤と組み合わせて投与してもよい。場合によって、眼の障害は、ＡＭＤ（例：湿性ＡＭＤ）である。場合によって、眼の障害は、ＧＡである。

【0210】

上記のこうした併用療法は、併用投与（２種以上の治療剤が同一又は別々の製剤に含まれている）と、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の投与が追加の治療剤（複数可）の投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こる個別投与とを包含する。一実施態様では、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体の投与と追加の治療剤の投与は、約１、２、３、４若しくは５カ月以内に、又は約１、２若しくは３週間以内に、又は約１、２、３、４、５若しくは６日以内の間隔で起こる。

【0211】

本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与することができ、また、局所治療が望まれる場合は、病巣内投与であってもよい。非経口点滴は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存して、任意の適切な経路で、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが企図される。

【0212】

本発明の抗体は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与される。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。本発明の抗体は、必ずしも必須ではないが任意選択的に、問題の障害を予防若しくは治療するのに目下使用されている１種以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、薬学的組成物中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、その他上述の要素に依存する。このような他の薬剤は一般に、本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％～９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。

【0213】

疾患の予防又は治療に関し、本発明の抗体の（単独での使用又は１種以上の他の追加的治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防又は治療のどちらの目的で投与されるか、従前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。本発明の抗体は、単回又は一連の治療にわたって患者へ適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか、持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上記要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで継続されるであろう。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば、約２から約２０又は例えば約６投与量の抗体を患者が受けるように）投与してもよい。初回の高負荷用量の後、それより低い用量を１以上投与してもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。

【0214】

製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、病状の治療、予防、及び／又は診断に有効な組成物を単独で又は別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物をその中に収容する第１の容器と、（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤含む組成物を中に収容する第２の容器を含んでもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書を更に備えてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を含む第２（又は第３）の容器を更に備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の物質を更に備えてもよい。

【0215】

３．本発明の特定の実施態様
本発明の特定の実施態様を以下に列挙する。
１．可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）と可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、ＶＥＧＦパラトープは抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含み、ＩＬ－１ベータパラトープは抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ酸残基を含む、抗体。
２．可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）と可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインのこの対が、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに同時に結合する、抗体。
３．可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）と可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、ＶＥＧＦパラトープに含まれるアミノ酸のいずれもＩＬ－１ベータパラトープに含まれない、抗体。
４．可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）と可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、該抗体が、配列番号１１の可変重鎖ドメインと配列番号１２の可変軽鎖ドメインとを有する抗体が結合するのと同じ、ヒトＶＥＧＦ上のエピトープ及びヒトＩＬ－１ベータ上のエピトープに結合する、抗体。
５．可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内のＶＥＧＦパラトープ及びＩＬ－１ベータパラトープを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体であって、
・ ＶＥＧＦパラトープは、上記抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３からのアミノ酸残基を含み、ＩＬ－１ベータパラトープは、上記抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２からのアミノ酸残基を含み；且つ／又は
・ 可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインの対は、同時にヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合し；且つ／又は
・ ＶＥＧＦパラトープに含まれるアミノ酸のうち、ＩＬ－１ベータパラトープに含まれるものはなく；且つ／又は
・ 上記抗体は、配列番号１１の可変重鎖ドメイン及び配列番号１２の可変軽鎖ドメインを有する抗体と同じ、ヒトＶＥＧＦ上のエピトープ及びヒトＩＬ－１ベータ上のエピトープに結合し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片は、（ｉ）表面プラズモン共鳴により測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴により測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片は、７０℃以上の凝集開始温度を呈し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片は、動的光散乱法によって測定して８０℃超の融解温度を呈し；且つ／又は
・ 上記抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＶＥＧＦへの結合は、表面プラズモン共鳴により測定して５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害し、上記抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合は、表面プラズモン共鳴により測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、
抗体。
６．（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、実施態様１から５のいずれか１つの抗体。
７．（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体。
８．（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、実施態様１から７のいずれか１つの抗体。
９．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体。
１０．アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、実施態様１から９のいずれか１つの抗体。
１１．
－ ＶＨドメインにアミノ酸残基Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６及びＲ８３を、ＶＬドメインにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６
を含むＶＥＧＦパラトープと、
－ ＶＨドメインにアミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を、ＶＬドメインにアミノ酸残基Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｙ９１を含むＩＬ－１ベータパラトープ
とを含む、実施態様１０の抗体。
１２．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、一対のＶＬドメインとＶＨドメインに（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体。
１３．
－ ＶＨドメインにアミノ酸残基Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６及びＲ８３を、ＶＬドメインにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＥＧＦパラトープと、
－ ＶＨドメインにアミノ酸残基：Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を、ＶＬドメインにアミノ酸残基：Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｙ９１を含むＩＬ－１ベータパラトープ
とを含む、実施態様１２の抗体。
１４．（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施態様１から１３のいずれか１つの抗体。
１５．（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、実施態様１から１４のいずれか１つの抗体。
１６．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインと（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインとを含む、抗体。
１７．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体において、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＶＨドメインと、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ４９、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＶＬドメインとを含み；ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、抗体。
１８．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含む抗体であって、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体。
１９．（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、実施態様１から１８のいずれか１つの抗体。
２０．（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、アミノ酸置換が配列番号１１の３～２５、３６～４９、９７～８２ｃ、８４～９３又は１０３～１１３位に位置するＶＨドメインと、（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインであって、アミノ酸置換が配列番号１２の１、４、６、８～２３、３５～４８、５８～６６、７０～８８又は９８～１０７位に位置する可変軽鎖ドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムによる、実施態様１から１９のいずれか１つの抗体。
２１．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータ特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって（ａ）ＶＨドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）可変軽鎖ドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む、抗体。
２２．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含む抗体であって、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；（ａ）ＶＨドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１１のアミノ酸配列を含み、（ｂ）可変軽鎖ドメインは１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１２のアミノ酸配列を含む、抗体。
２３．配列番号１１のＶＨ配列と配列番号１２のＶＬ配列とを含む、実施態様１から２２のいずれか１つの抗体。
２４．配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号１２のＶＬ配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体。
２５．配列番号２０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、実施態様１から２４のいずれか１つの抗体。
２６．配列番号２０の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体。
２７．配列番号１８の重鎖アミノ酸配列と配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列とを含む、実施態様１から２６のいずれか１つの抗体。
２８．配列番号１８の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１９の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体。
２９．実施態様１から２８のいずれか１つの抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴により測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴により測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。
３０．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴によって測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴によって測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。
３１．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。
３２．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み；ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより；該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。
３３．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、一対のＶＬドメインとＶＨドメインに（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。
３４．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合し、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、（ｉ）表面プラズモン共鳴で測定して１０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ１２１に結合し、（ｉｉ）表面プラズモン共鳴で測定して３０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＩＬ－１ベータに結合する、抗体。
３５．実施態様１から３４のいずれか１つの抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。
３６．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。
３７．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。
３８．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。
３９．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、一対のＶＬドメインとＶＨドメインに（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。
４０．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片が７０℃超の凝集開始温度を呈する、抗体。
４１．実施態様１から４０のいずれか１つの抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法で測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。
４２．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法で測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。
４３．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法で測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。
４４．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法で測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。
４５．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、一対のＶＬドメインとＶＨドメインに（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法で測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。
４６．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、動的光散乱法によって測定して８０℃超の融解温度を呈する、抗体。
４７．実施態様１から４６のいずれか１つの抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＶＥＧＦへの結合は、表面プラズモン共鳴により測定して５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害し、該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合は、表面プラズモン共鳴により測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、抗体。
４８．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＶＥＧＦへの結合は、表面プラズモン共鳴によって測定して５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合を阻害し；該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合は、表面プラズモン共鳴によって測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、抗体。
４９．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ１－ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、表面プラズモン共鳴で測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、抗体。
５０．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８及びＫ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６、Ｒ８３及びＫ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメインと、（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、並びに（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｙ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８及びＱ６９を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、表面プラズモン共鳴で測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、抗体。
５１．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、一対のＶＬドメインとＶＨドメインに（ｉ）アミノ酸残基Ｅ２、Ｇ２６、Ｖ２８、Ｋ３０、Ｗ３１、Ｎ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｋ５２ａ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｒ６６、Ｒ８３、Ｋ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８及びＤ１０１を含むＶＨドメインと、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｓ２７ｃ、Ｓ２７ｄ、Ｌ３２、Ｙ４９、Ｄ５０、Ｙ５３、Ｋ５４、Ｌ５６、Ｇ５７、Ｅ６７、Ｄ６８、Ｑ６９、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４及びＹ９６を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨ及びＶＬドメインの番号付けはカバット番号付けシステムにより、該抗体の抗体Ｆａｂ断片が、表面プラズモン共鳴で測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１ベータＲ１への結合を阻害する、抗体。
５２．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む抗体であって、（ａ）ＶＨドメインは配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）ＶＬドメインは配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；該抗体の抗体Ｆａｂ断片のヒトＩＬ－１ベータへの結合が、表面プラズモン共鳴で測定して３０ｎＭ未満のＩＣ５０でＩＬ－１ベータのＩＬ－１べータＲ１への結合を阻害する、抗体。
５３．モノクローナル抗体である、実施態様１から５２のいずれか１つの抗体。
５４．ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体断片である、実施態様１から５３のいずれか１つの抗体。
５５．二重特異性である、実施態様１から５４のいずれか１つの抗体。
５６．Ｆａｂ断片である、実施態様１から５５のいずれか１つの抗体。
５７．二重特異性抗体断片である、実施態様１から５６のいずれか１つの抗体。
５８．多重特異性である、実施態様１から５７のいずれか１つの抗体。
５９．実施態様１から５８のいずれか１つの抗体をコードする、単離された核酸。
６０．実施態様５９の核酸を含む宿主細胞。
６１．実施態様６１の核酸を含む発現ベクター。
６２．抗体が産生されるように実施態様６０の宿主細胞を培養することを含む、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＩＬ－１ベータに結合する抗体を製造する方法。
６３．宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、実施態様６２の方法。
６４．実施態様６２又は６３の方法によって製造される抗体。
６５．実施態様１から５８のいずれか１つの抗体と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
６６．医薬としての使用のための、実施態様１から５８のいずれか１つの抗体。
６７．血管疾患の治療における使用のための、実施態様１から５８のいずれか１つの抗体。
６８．眼の血管疾患の治療における使用のための、実施態様１から５８のいずれか１つの抗体。
６９．医薬の製造における、実施態様１から５８のいずれか１つの抗体又は実施態様６５の薬学的組成物の使用。
７０．血管新生を阻害するための医薬の製造における、実施態様１から５８のいずれか１つの抗体又は実施態様６５の薬学的組成物の使用。
７１．血管疾患を有する個体を治療する方法であって、該個体に実施態様１から５８のいずれか１つの抗体又は実施態様６５の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法。
７２．眼の血管疾患を有する個体を治療する方法であって、該個体に実施態様１から５８のいずれか１つの抗体又は実施態様６５の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、方法。
７３．血管新生を阻害するために、個体に実施態様１から５８のいずれか１つの抗体又は実施態様６５の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、個体における血管新生を阻害する方法。

【0216】

【表C-1】

【0217】

【表C-2】

【0218】

【表C-3】

【0219】

【表C-4】

【実施例】

【0220】

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提示されるが、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。

【0221】

実施例１：
二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の生成
前述の方法（例えば国際公開第２０１２／１６３５２０号に記載の方法）により、非重複パラトープを含み、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに結合する単一特異性抗体を独立にスクリーニングすることと、その後アミノ酸配列を融合させて、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに結合する二重パラトープＶＨ／ＶＬ対にすることによって、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片を生成した。

【0222】

合成Ｆａｂ断片の２つの異なるファージディスプレイライブラリーが利用され、第１のファージディスプレイライブラリーでは、Ｆａｂ断片のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２領域内の残基が多様化され、第２のファージディスプレイライブラリーでは、Ｆａｂ断片のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ３及びＣＤＲ－Ｈ２領域内の残基が多様化された。各ライブラリーでは、その他の３つのＣＤＲ領域は、不変のダミー配列として多様化されずに保たれた。両方のライブラリーで、ファージディスプレイを容易にするために、Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインはリンカーを介して切断型遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合された。

【0223】

ファージライブラリーのパニングによって、第１のライブラリーではヒトＩＬ－１ベータに対するバインダーを濃縮し、第２のライブラリーではヒトＶＥＧＦ－Ａに対するバインダーを濃縮した。パニング後、ファージミドベクターの両方の濃縮されたプールについてプラスミドミニプレップを調製した。ミニプレップを制限酵素で消化して、切断型遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードする領域を切り出し、ライゲーションによって再環状化し、それぞれＩＬ－１ベータバインダー又はＶＥＧＦ－Ａバインダーについて濃縮された可溶性Ｆａｂ断片をコードする発現ベクターのプールを得た。これらのベクタープールをＴＧ１大腸菌細胞に形質転換し、個々のコロニーを採取して培養し、個々のＦａｂクローンをマイクロタイタープレートで可溶性発現させた。可溶性Ｆａｂ断片を含む上清を、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いてＩＬ－１ベータ又はＶＥＧＦ－Ａへの結合についてスクリーニングし、特異的なバインダーを生成するＴＧ１クローンをＤＮＡプラスミド調製及び配列決定に供して、それぞれＩＬ－１ベータ又はＶＥＧＦ－Ａのいずれかに特異的に結合するＶＨ及びＶＬ配列の対を得た。

【0224】

（１）ＩＬ－１ベータ特異的ＦａｂのＶＨ配列の無関係なＶＨ残基５２ｂ～６５をＶＥＧＦ－Ａ特異的Ｆａｂの選択されたＶＨ残基５２ｂ～６５で置き換えることにより、ＶＥＧＦ－Ａ特異的パラトープの一部である可能性のあるＣＤＲ－Ｈ２残基をＩＬ－１ベータバインダー重鎖に置換することと、（２）ＶＥＧＦ－Ａ特異的ＦａｂのＶＬ配列中の無関係なＶＬ残基４９～５７をＩＬ－１ベータ特異的Ｆａｂの選択されたＶＬ残基４９～５７で置き換えることにより、ＩＬ－１ベータ特異的パラトープの一部である可能性のあるＣＤＲ－Ｌ２残基をＶＥＧＦ－Ａバインダー軽鎖に置換することによって、二重特異性抗ＶＥＧＦ／ＩＬ－１ベータベータＶＨ及びＶＬ配列の対をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計した。

【0225】

実施例２：
二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ２．３の発現
得られた二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＶＨ及びＶＬ配列の設計された対を合成し、ＣＨ１及びＣカッパドメインをコードする遺伝子配列と共にインフレームで大腸菌発現ベクターにクローニングした。このベクターをＴＧ１大腸菌細胞に形質転換し、二重特異性抗体Ｆａｂ断片の可溶性発現のために個々のコロニーを培養した。アフィニティークロマトグラフィーによりＴＧ１培養上清から二重特異性抗体を精製し、ＩＬ‐１ベータとＶＥＧＦ‐Ａの両方への特異的結合を確認した。

【0226】

二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体「１ＨＶＬ２．３」を選択し、配列番号９の重鎖及び配列番号１０の軽鎖によって特徴づけた。

【0227】

更なる分析のために、本発明の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体を、標準的な組換え方法によってＨＥＫ２９３細胞に形質転換し、そしてそれから発現させた。

【0228】

実施例３：
二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ２．３の特徴づけ
二重特異性抗体１ＨＶＬ２．３の結合親和性、親水性及び熱安定性を以下のように評価した。

【0229】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で評価したＶＥＧＦ結合反応速度：
抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ＧＥヘルスケア ２８９９５０５６）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサーチップＣ１（ＧＥヘルスケア ２９１０４９９０）に固定化し、約５００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いた。ヒトＶＥＧＦ１２１－Ｈｉｓを表面に捕捉し、それぞれ約１０及び２０ＲＵのリガンド密度を得た。二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ‐１ベータＦａｂ断片の希釈系列（１．２‐１００ｎＭ、１：３希釈）をそれぞれ９０秒間連続的に注入し、解離を３０μｌ／ｍｉｎの流量で３６００秒間モニターした（シングルサイクル法（single cycle kinetics）。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を６０秒間注入することにより、表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、且つ、捕捉されたヒトＶＥＧＦ１２１を含まない対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ラングミュア結合モデルを使用してカーブフィッティングを行った。よりロバストなフィッティングを提供するために、両方のリガンド密度を用いるグローバルフィッティングにＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｍａｘオプションを選択した。

【0230】

ＩＬ－１ｂ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で評価した結合反応速度：
抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥヘルスケア ２８９５８３２５）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサーチップＣ１（ＧＥヘルスケア ２９１０４９９０）に固定化し、約５００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片が表面に捕捉され、約２０ＲＵの捕捉レベルが得られた。ヒトＩＬ－１ベータ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ２００－０１Ｂ）又はカニクイザルＩＬ－１ベータ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ９００１０－ＣＮＡＥ）のいずれかの０．７４～６０ｎＭ（１：３希釈）の希釈系列を９０秒間注入し、解離を３０μｌ／ｍｉｎの流量で少なくとも６００秒間モニターした。１０ｍＭグリシンｐＨ２．１をそれぞれ６０秒間２回連続して注入することにより、表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、且つ、捕捉された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片を含まない対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ラングミュア結合モデルを使用してカーブフィッティングを行った。

【0231】

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）：
見掛け上の疎水性を、２５ｍＭリン酸Ｎａ、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で平衡化したＨＩＣ－Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ（東ソー）カラムに２０μｇの二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片を注入することにより決定した。溶出は、０から１００％のバッファーＢ（２５ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）の直線勾配で６０分以内に実施した。保持時間を、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。

【0232】

熱安定性：
二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の試料を、２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジンクロリド、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、０．４μｍのフィルタープレートに通す遠心分離により３８４ウェルオプティカルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。試料を２５℃から８０℃まで０．０５℃／ｍｉｎの速度で加熱しながら、ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｗｙａｔｔ）で動的光散乱法により流体力学的半径を繰り返し測定する。或いは、試料を１０μＬのマイクロキュベットアレイに移し、２５℃から９０℃まで０．１℃／ｍｉｎの速度で加熱しながら、２６６ｎｍレーザーによる励起時の蛍光データと静的光散乱データをＯｐｔｉｍ１０００装置（Ａｖａｃｔａ社）で記録した。

【0233】

凝集開始温度は、流体力学的半径（ＤＬＳ）又は散乱光強度（Ｏｐｔｉｍ１０００）が増加し始めた時の温度と定義される。融解温度は、蛍光強度対波長グラフにおける変曲点と定義される。

【0234】

結果を表１及び２に示す。

【0235】

【表1】

【0236】

【表2】

【0237】

実施例４：
二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ２．３の改善
上述のように、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ２．３は、非常に安定であるが、ナノモル範囲のＩＬ－１ベータへの親和性及び顕著な疎水性を呈する。眼への治療薬の注射を必要とする眼の血管疾患の治療の場合、治療効果の持続性を高め、且つ患者の不便さを最小限にするために、標的抗原に対する親和性が高く、且つ非常に高い濃度の治療薬を提供することが望ましい。したがって、この意図した目的のために、抗体の親和性を高め、且つ疎水性を減少させて、高濃度における等張バッファーへの可溶性を確保することが望まれる。

【0238】

そのため、臨床応用のためには、抗体は、例えばＩＬ－１ベータの結合に関する改善（特にオフレートの改善による）及び疎水性の低減など、更なる改善が必要であった。ＶＨ及びＶＬドメインに異なるアミノ酸置換を導入することにより、数ラウンドの成熟化を行った。成熟化の間、抗体１ＨＶＬ２．３に由来する候補抗体は、収率、親和性、同時抗原結合、親水性、安定性、粘度及びその他のパラメーターに関する所望の特性に基づいてスクリーニングされ、選択された。

【0239】

改善された候補抗体１ＨＶＬ５．１５、１ＨＶＬ１２．８５及びＲＯ７２００３９４を複数の試験候補抗体分子から選択した。これらの改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片のアミノ酸配列は、表３で明らかにされる。

【0240】

【表3】

【0241】

図２及び３は、生成された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインのアライメントを例示している。ＶＨ及びＶＬドメイン内のアミノ酸位置の番号付けは、カバット番号付けシステムに従っている。簡略化のため、番号付けは図に含まれており、フレームワークとＣＤＲアミノ酸の位置を更に示している。

【0242】

実施例５：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の抗原結合反応速度
候補抗体のＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータへの結合反応速度を、示された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片（表３に示されたようなアミノ酸配列）を使用して、実施例３に記載されているように評価した。比較のために、国際公開第２０１６／０７５０３４号に開示されているような、完全長ＩｇＧ抗体である先行技術の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体００３２の抗原結合反応速度を示す。

【0243】

ＩＬ－１ベータの結合反応速度の結果を表４及び表５に示す。

【0244】

【表4】

【0245】

【表5】

【0246】

抗体１ＨＶＬ５．１５及び１ＨＶＬ１２．８５について、他の種及び関連タンパク質のＩＬ－１ベータに対する結合反応速度を、実施例３に記載したのと同じ実験設定を用いてＳＰＲで評価した。ラットＩＬ－１ベータ、ブタＩＬ－１ベータ、ヒトＩＬ－１アルファ及びヒトＩＬ－１ＲＡに対する結合は観察されなかった。マウス及びウサギのＩＬ１－ベータに対する弱い結合が観察された。

【0247】

ＶＥＧＦ結合反応速度の結果を表６に示す。

【0248】

【表6】

【0249】

候補抗体のＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに対する同時抗原結合を以下のように評価した。

【0250】

抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ＧＥヘルスケア ２８９９５０５６）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサーチップＣ１（ＧＥヘルスケア ２９１０４９９０）に固定化し、約５００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いた。ヒトＶＥＧＦ１２１－Ｈｉｓを表面に捕捉し、続いて候補抗体及びＩＬ－１ベータを連続して注入した。１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を６０秒間注入することにより、表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、且つ、捕捉されたヒトＶＥＧＦ１２１を含まない対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。

【0251】

全ての改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片、すなわち１ＨＶＬ５．１５、１ＨＶＬ１２．８５及びＲＯ７２００３９４について、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータへの候補抗体の同時結合が確認された。図４は、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ１ＨＶＬ１２．８５の同時結合を示している。図５は、抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＲＯ７２００３９４の同時結合を示している。

【0252】

完全長ＩｇＧ先行技術抗体００３２（国際公開第２０１６／０７５０３４号）の同時抗原結合も、同じ実験設定を用いて評価された。その結果を図６に示す。

【0253】

実施例６：
ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータのそれぞれの受容体への結合の阻害
受容体阻害アッセイ
候補抗体ＲＯ７２００３９４（Ｆａｂ断片）の存在下での、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータのそれぞれの受容体、ｈＶＥＧＦＲ２、ＩＬ－１ベータＲ１への結合の阻害を、以下に記載のように評価した。比較のために、国際公開第２０１６／０７５０３４号に開示されているような、先行技術の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体００３２（完全長ＩｇＧ）の反応速度も評価した。

【0254】

ｈＶＥＧＦＲ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ３５７－ＫＤ）及びＩＬ－１ｂＲ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社 １０１２６－Ｈ０２Ｈ）を異なるフローセル上で、標準的なアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア ２９１０４９８８）に固定化し、それぞれ約８０００、２００００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いた。

【0255】

ＶＥＧＦ－受容体結合阻害を評価するために、最終濃度２００ｎＭのＲＯ７２００３９４又は４００ｎＭの抗体００３２を５０ｎＭのＶＥＧＦ１２１とプレインキュベートした。ＩＬ－１ベータ－受容体結合阻害を評価するために、最終濃度２００ｎＭのＲＯ７２００３９４又は２００ｎＭの抗体００３２を５０ｎＭのＩＬ－１ベータとプレインキュベートした。試料を、対応する５０ｎＭのＶＥＧＦ１２１又はＩＬ－１ベータ溶液で希釈（１：２）した。

【0256】

この抗体／リガンド混合物を、流量５μｌ／ｍｉｎで６０秒間、ＶＥＧＦＲ２又はＩＬ－１Ｒ１表面に注入した。６０秒間の解離相の後、ＶＥＧＦＲ２表面は５ｍＭのＮａＯＨを６０秒間注入することにより再生されたが、ＩＬ‐１Ｒ１表面は１０ｍＭグリシンｐＨ３．０に続いて５ｍＭのＮａＯＨをそれぞれ６０秒間注入することにより再生された。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、且つ、ブランク対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。評価のために、注入終了から５秒後の結合応答を取得した。ＲＵで得られた応答は、抗体を含まないリガンドに対応する初期シグナルに対する結合応答（binding response）に変換された。ＩＣ５０値を、４パラメーターロジスティックモデル（ＸＬｆｉｔ、ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）を使用して計算した。
結果を表７及び表８、並びに図７Ａ（抗体ＲＯ７２００３９４存在下でのＶＥＧＦＲ２阻害）、図７Ｂ（抗体００３２存在下でのＶＥＧＦＲ２阻害）、図８Ａ（抗体ＲＯ７２００３９４存在下でのＩＬ－１Ｒ１阻害）及び図８Ｂ（抗体００３２存在下でのＩＬ－１Ｒ１阻害）に示す。

【0257】

【表7】

【0258】

【表8】

【0259】

本発明の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片へのＩＬ－１ベータの結合はＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ２相互作用の阻害を妨げないことが実証される。また、本発明の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片へのＶＥＧＦの結合は、ＩＬ－１ベータ／ＩＬ－１ベータＲ１相互作用の阻害を妨げない。

【0260】

ＶＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡ
以下のバッファーを使用した：ＰＢＳ（１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４）；ＰＢＳＴ（０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ－２０を補充した１ｘＰＢＳＴ）；ＰＢＳＴ １％ＢＳＡ（１％ＢＳＡを補充したＰＢＳＴ（シグマアルドリッチ、Ａ３３６のウシ血清アルブミン溶液３０％）；ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ９．４のＮａＨＣＯ_３溶液、ＢｕｐＨ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐａｃｋｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２８３８２）から作製）；２％ＭＰＢＳＴ（２％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、Ｔ１４５．３）を補充したＰＢＳＴ）。

【0261】

９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ‐Ｉｍｍｏｐｌａｔｅｓ）を、２００ｍＭ ＮａＨＣ０_３（ｐＨ９．４）中に最終濃度１μｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦＲ‐１‐Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ ＃３２１‐ＦＬ‐０５０）５０μＬ／ウェルで、室温で１時間コーティングした。

【0262】

一方、異なる濃度の抗体Ｆａｂ断片をＶＥＧＦとプレインキュベートし、次のようにして抗体Ｆａｂ－ＶＥＧＦプレミックスを形成した：抗体Ｆａｂ断片の希釈系列を、抗体Ｆａｂ断片の溶液（ＰＢＳＴ－１％ＢＳＡ中４０９．６ｎＭ抗体）２８０μｌを丸底９６ウェルＰＳプレートの第１カラムのウェルに添加することによって、調製した。同じプレートのカラム２～１２の個々のウェルに１４０μｌのＰＢＳＴ－１％ＢＳＡを充填した。その後、抗体溶液１４０μｌを次のカラムに移し、完全に混合して、この希釈した抗体溶液１４０μｌを次のカラムに移すことにより、１：２希釈を行った。これをカラム１１まで繰り返す。１４０μｌを超えた量は廃棄して、全てのウェルが１４０μｌを含むようにした。カラム１２を対照（ブランク）とした。ＶＥＧＦとのプレインキュベーションのために、丸底９６ウェルＰＳプレートに、ＰＢＳＴ－１％ＢＳＡ中２ｎＭ ＶＥＧＦ１２１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ、ＨＺ－１２０６、ロット６１４－０１）又は２ｎＭ ＶＥＧＦ１６５（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ、ＨＺ－１１５３、ロット７１６－０１）溶液を１ウェル当たり５０μｌずつ事前充填した。それぞれの抗体Ｆａｂ断片の希釈系列５０μｌをＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５にそれぞれ添加し、完全に混合し、室温で１．５時間インキュベートした。

【0263】

ｒｈＶＥＧＦＲ－１－ＦｃをコートしたプレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、２００μｌの２％ＭＰＢＳＴで４５分間ブロックした。ＭＰＢＳＴ溶液をＰＢＳＴで２回洗い落とした後、抗体Ｆａｂ－ＶＥＧＦプレミックス５０μｌをプレートに加え、室温で１．５時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した。その後、ビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ、ＢＡＦ２９３；ＰＢＳＴで１：２０００希釈）及びＳＡ－ＨＲＰ（ＫＰＬ、１４－３０－００；ＰＢＳＴで１：２０００希釈）を含む溶液５０μｌを加え、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄後、５０μｌのＴＭＢ基質溶液（２成分ＨＲＰ基質（ＫＰＬ、３４０２１）；室温で使用）を加え、室温で３０分間インキュベートした。５０μｌの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を加え、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。

【0264】

結果を図９及び図１０に示すが、１ＨＶＬ２．３よりも１ＨＶＬ１２．８５及びＲＯ７２００３９４の方が、ＶＥＧＦ－Ｒ１結合阻害の改善を示している。

【0265】

実施例７：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の生物物理学的特性（安定性及び疎水性）
候補抗体の示された生物物理学的特性を、示された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片（表３に示されたようなアミノ酸配列）を使用して、実施例３に記載されているように評価した。

【0266】

表９は、分析した抗体の熱安定性及び疎水性を示している。比較のために、国際公開第２０１６／０７５０３４号に開示されているような、完全長ＩｇＧ抗体である先行技術の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体００３２の熱安定性が含まれている。ＨＩＣからのクロマトグラムを、二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片については図１１に、先行技術の抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＩｇＧ抗体００３２については図１２に示す。

【0267】

【表9】

【0268】

実施例８：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の生物物理学的特性（力学的粘度）
候補抗体の粘度を、示された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片（表３に図示されたようなアミノ酸配列）を使用して、以下のように評価した。
粘度を、前述のようにラテックスビーズＤＬＳ法（latex-bead DLS method）（He F et al.; Anal Biochem. 2010 Apr 1;399(1):141-3）で測定した。簡単に説明すると、遠心濃縮装置、例えばＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心フィルター、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０Ｋ、カタログ番号ＵＦＣ５０１０９６などの遠心濃縮装置を用いて、試料を＞２００ｍｇ／ｍＬに濃縮した（材料の入手可能性に基づく）。

【0269】

約１０ｍｇ／ｍｌから最大実現可能濃度までの希釈系列を用意し、ポリソーベート２０及びビーズ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、呼び径：３００ｎｍ、１％固形分、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号３３００Ａ）を、それぞれ最終濃度０．０２％（ＰＳ２０）、０．０３％（ｗ／ｗ、ビーズ）になるように添加した。

【0270】

これらの試料の少量のアリコートを最大速度で１分間遠心分離した後、タンパク質濃度をＵＶ２８０吸収により決定した。

【0271】

残りの試料を３８４ウェルオプティカルプレートに移し、蒸発防止のためパラフィンオイルの層で覆い、示された温度でＤＬＳデータを記録した。ラテックスビーズの見掛けの流体力学的半径のＤＬＳデータから、溶液の粘度をＨｅ Ｆらの前掲書に記載されているように計算した。測定した最高濃度での粘度を表１０に報告する。結果は、図１３（１ＨＶＬ１２．８５）及び図１４（ＲＯ７２００３９４）にも示されている。

【0272】

【表10】

結果は、本発明の抗体が、注射針通過性のための許容される粘度限界（最大３０ｃＰ）未満の粘度を含む高濃度で製剤化され得ることを示す。両方の試験で抗体が高い濃縮性を持つことが示されているが、その効果はＲＯ７２００３９４抗体でより顕著である。

【0273】

結果的に、本発明の抗体は、限られた注射量で高いモル用量を提供することができるため、眼適用に非常に適している。このことは、高力価と組み合わされた場合に高いい持続性をもたらし、その結果投与頻度を減少させ、これは、患者側の困難を減少させるために望ましい。

【0274】

実施例９：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片の化学的安定性
化学分解試験：
各抗体試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に配合し、３つのアリコートに分割した：１つのアリコートはそれぞれＰＢＳに再緩衝化し、２つのアリコートは元の配合で保存した。ＰＢＳアリコートと１つのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌアリコートを１ｍｇ／ｍｌで４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）で２週間（２ｗ）インキュベートし、ＰＢＳ試料は更に合計４週間（４ｗ）インキュベートした。３番目の対照アリコート試料は－８０℃で保存した。インキュベーション終了後、試料の相対活性濃度（Ｂｉａｃｏｒｅ；各バインダーのストレスをかけた両アリコートの活性濃度を、ストレスをかけていない４℃のアリコートに対して正規化）、凝集（ＳＥＣ）、及び断片化（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ）について分析し、未処理対照と比較した。

【0275】

ストレス後の結合活性を以下のように評価した。
抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥヘルスケア ２８９５８３２５）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア ２９１０４９８８）上に固定化し、４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニング及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いた。２μｇ／ｍｌの濃度を有する抗体抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータ抗体１ＨＶＬ１２．８５を５μｌ／ｍｉｎの流量で６０秒間注入した。ＨｕＶＥＧＦ１２１（インハウス調製）又はｈｕＩＬ‐１ベータ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２００‐０１Ｂ）をそれぞれ２μｇ／ｍｌの濃度で６０秒間注入し、解離を５μｌ／ｍｉｎの流量で６０秒間モニターした。１０ｍＭグリシンｐＨ２．１をそれぞれ６０秒間２回連続して注入することにより、表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、且つ、ブランク対照フローセルから得られた応答を差し引くことによって補正された。評価のために、注入終了から５秒後の結合応答を取得した。結合シグナルを正規化するために、ＶＥＧＦ又はＩＬ－１ベータ結合応答を抗Ｆａｂ応答で除した。相対活性濃度は、各温度ストレス試料の基準を対応する非ストレス試料にすることにより計算した。

【0276】

結果を表１１及び表１２に示す。

【0277】

【表11】

【0278】

【表12】

【0279】

実施例１０：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ５．１５の構造解析
抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ５．１５の構造解析を、以下の通りＸ線結晶解析により行った。

【0280】

三元複合体ＩＬ１ベータ‐ＶＥＧＦ１２１‐Ｆａｂ １ＨＶＬ５．１５の複合体形成と結晶化
複合体形成のために、１：１．１モル比で、１ＨＶＬ５．１５Ｆａｂ断片とヒトＩＬ１ベータ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を混合した。４℃で一晩１６時間インキュベートした後、ヒトＶＥＧＦ１２１（インハウス調製）を加えて、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した三元複合体を得た。初期結晶化試験は、２１℃のシッティングドロップ蒸気拡散設定で行った。最初の微結晶は、１．４Ｍマロン酸ナトリウムから４日以内に出現した。その後の播種実験では、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムｐＨ５．５、０．１Ｍ酢酸カルシウム、１２％ＰＥＧ８０００から結晶が得られた。これらの結晶は、更なる最適化工程なしに、スクリーニングプレートから直接採取した。

【0281】

データ収集と構造決定
データ収集のために、結晶を、抗凍結剤としてエチレングリコールを１５％添加した沈殿剤溶液中で１００Ｋでフラッシュ冷却した。回折データは、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（スイス、ビリゲン）のビームラインＸ１０ＳＡでＰＩＬＡＴＵＳ ６Ｍ検出器を用いて、波長１．００００Åで収集した。データは、ＸＤＳで処理し（Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)）、ＳＡＤＡＢＳ（ＢＲＵＫＥＲ）でスケーリングした。結晶は、空間群Ｃ２２２_１に属し、セル軸はａ＝１７７．９７Å、ｂ＝２８６．７０Å、ｃ＝１０５．３９Å、α＝?＝９０°で、２．９７Å分解能まで回折した。構造は、関連するインハウス構造であるＦａｂ断片、ＩＬ１β、及びＶＥＧＦのｐｄｂ ｅｎｔｒｙ １ＭＫＫの座標を探索モデルとして使用して、ＰＨＡＳＥＲでの分子置換により決定した（McCoy, A.J. et al. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)）。ＣＣＰ４スイート（Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)）及びＢｕｓｔｅｒ（Bricogne, G., et al. (2011). Ｂｕｓｔｅｒ バージョン２．９．５ 英国、ケンブリッジ：Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ社）のプログラムを使用して、構造の精密化を行った。差電子密度（difference electron density）を用いるタンパク質の手動再構築を、ＣＯＯＴで行った（Emsley, P., et al. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)）。データ収集及び精密化統計値を表１３に要約する。グラフィック表現は全て、ＰＹＭＯＬ（DeLano Scientific, Palo Alto, CA, 2002）を用いて作成した。ＣＣＰ４スイート（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｎｕｍｂｅｒ４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０－７６３（１９９４））のプログラムＣＯＮＴＡＣＴで構造を解析し、最大４Åの接触距離を用いてパラトープ残基とエピトープ残基を特定した。

【0282】

【表13】

【0283】

それぞれの抗原、ＶＥＧＦ及びＩＬ－１ベータに接触しているアミノ酸残基は、複合体中の二重特異性抗ＶＥＧＦ／抗ＩＬ－１ベータＦａｂ断片１ＨＶＬ５．１５の結晶構造から特定された。ＶＨドメイン及びＶＬドメイン内のパラトープアミノ酸残基の位置を図２と図３に示す。

【0284】

軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ３及び重鎖ＣＤＲ２からのアミノ酸は、ＶＥＧＦパラトープに寄与する。ＶＥＧＦパラトープは、軽鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ１及び重鎖ＣＤＲ３からのアミノ酸を含まない。ＩＬ－１ベータパラトープは、軽鎖ＣＤＲ２からのアミノ酸を含まない。

【0285】

抗原結合に寄与すると特定されたアミノ酸残基を表１４（可変重鎖ドメインアミノ酸残基の場合）及び表１５（可変軽鎖ドメインアミノ酸残基の場合）に明らかにする。アミノ酸位置は、カバット番号付けシステムに従って番号付けされている（図２及び図３では同じ番号付けを使用）。抗原結合に関与するアミノ酸位置は、ＶＨ又はＶＬドメインのカバット位置によって特定される（図２と３の番号付けも参照）。

【0286】

【表14】

【0287】

【表15】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

0007114813000001.app