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特許7115755肝損傷の処置における使用のためのマクロファージに基づく治療法

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-01

(45)【発行日】2022-08-09

(54)【発明の名称】肝損傷の処置における使用のためのマクロファージに基づく治療法

(51)【国際特許分類】

A61K 35/15 20150101AFI20220802BHJP

A61P 1/16 20060101ALI20220802BHJP

C12N 5/0786 20100101ALI20220802BHJP

【ＦＩ】

A61K35/15 Z

A61P1/16

C12N5/0786 ZNA

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2019515418

(86)(22)【出願日】2017-09-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-11-14

(86)【国際出願番号】 GB2017052769

(87)【国際公開番号】W WO2018051136

(87)【国際公開日】2018-03-22

【審査請求日】2020-09-17

(31)【優先権主張番号】1615923.8

(32)【優先日】2016-09-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1707183.8

(32)【優先日】2017-05-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】513249781

【氏名又は名称】ザユニバーシティーコートオブザユニバーシティーオブエジンバラ

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＣＯＵＲＴＯＦＴＨＥＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＥＤＩＮＢＵＲＧＨ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フォーブス、ステュアート

(72)【発明者】

【氏名】ルイス、フィリップスターキー

(72)【発明者】

【氏名】フォレスター、レズリー

【審査官】西賢二

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０３９７７０２９（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１１４７２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J.Immunol.Methods,2012,Vol.385,p.1-14

【文献】Nat. Rev. Immunol., 2003, Vol. 3, p. 23-35

【文献】J.Leukoc.Biol.,2008,Vol.84,p.1410-1421

【文献】Immunity,2010,Vol.32,p.593-604

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｐ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

急性肝損傷の処置での使用のための医薬組成物であって、選択的活性化マクロファージを含む医薬組成物。

【請求項2】

前記急性肝損傷が、アセトアミノフェン、クラリスロマイシン、スタチン、ニコチン酸、アミオダロン、メトトレキサート、イソニアジド、ニトロフラントイン、オーグメンチン、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ナブメトン、ジクロフェナク、タクリンまたはジスルフィラムからなる群から選択される１つ以上の薬物の使用からの結果である、請求項１に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項3】

前記薬物がアセトアミノフェンである、請求項２に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項4】

前記選択的活性化マクロファージが、前記１つ以上の薬物の使用から１０時間後に投与される、請求項２または請求項３に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項5】

前記選択的活性化マクロファージが、ＩＬ－４と、ＩＬ－１３および／またはＣＳＦ－１の少なくとも一つとを用いてマクロファージを極性化させることによって得られる、請求項１～４の何れかに記載の使用のための医薬組成物。

【請求項6】

前記マクロファージが骨髄由来マクロファージである、請求項１～５の何れかに記載の使用のための医薬組成物。

【請求項7】

前記選択的活性化マクロファージが、急性肝損傷を有する対象にとって自己由来である、請求項１～６の何れかに記載の使用のための医薬組成物。

【請求項8】

前記選択的活性化マクロファージが多能性幹細胞由来である、請求項１～７の何れかに記載の使用のための医薬組成物。

【請求項9】

前記選択的活性化マクロファージが、静脈内投与または点滴用に処方される、請求項１～８の何れか１項に記載の使用のための医薬組成物。

【請求項10】

前記選択的活性化マクロファージが、細胞１ｘ１０^７～１ｘ１０^９個の用量で提供される、請求項１～９の何れか１項に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝損傷の処置での使用のための選択的活性化マクロファージに関する。

【背景技術】

【0002】

アセトアミノフェン（パラセタモール、ＡＰＡＰ）過剰摂取は、診療所における急性肝損傷（ＡＬＩ）の一般的原因であり、米国では急性肝不全（ＡＬＦ）の主な原因である（１～５）。ＡＰＡＰは、前臨床試験に対する典型的な肝臓毒ともなっており、ＡＰＡＰ肝毒性を支える分子機序は現在よく理解されており、これは少なくとも４０年の研究に相当する。しかし、診療所において、ＡＰＡＰ誘発性ＡＬＩの治療管理は、主に薬物服用後早期（一般的には１０時間以内）に有効な解毒剤として働くｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）療法に限定される。しかし、ＮＡＣ療法の有効性は、ＡＰＡＰ服用後遅れて（すなわち１０時間超）来院する患者では実質的に低下する（６）。遅れて来院する患者に対する処置は、支持療法に大きく集中しており、その後にＡＬＦを発症する患者では肝臓移植が必要とされ得る。適切な臓器ドナーの不足および生涯にわたり免疫抑制剤が必要となるがゆえに、肝臓移植が理想的な治療介入ではないことは明らかである。したがって、ＡＰＡＰ中毒で遅れて来院する患者に適用可能な新規療法の探索が急がれる。

【0003】

ＡＰＡＰ中毒は、肝臓の小葉中心部の肝細胞の壊死が急速に始まることを特徴とする。即時的な臨床介入がないと、実質的な肝損傷が、一般的には免疫活性化、脳症、低体温および多臓器不全および死亡の高リスクを特徴とする全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）として知られる敗血症様反応を付随する肝不全へと進行し得る（７）。最近の研究から、肝臓自然免疫を維持するために働く組織常在マクロファージ（クッパー細胞、ＫＣ）が、ＡＰＡＰ負荷後早期に枯渇するようになり、これが損傷中の肝臓における免疫学的欠損につながることが示された（８）。マクロファージは、アポトーシスのＴＮＦ関連弱誘導因子（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄｗｅａｋｉｎｄｕｃｅｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ）（ＴＷＥＡＫ）の分泌を通じて増殖するように細管細胞（ｄｕｃｔｕｌａｒｃｅｌｌ）を刺激すると考えられる（Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｈｅｐａｔｉｃｄｕｃｔｕｌａｒｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｉｎｊｕｒｙｖｉａｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴＷＥＡＫｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０，６５４２－６５４７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０２１６８１１０（２０１３）；Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔａｌ．ＴＷＥＡＫｉｎｄｕｃｅｓｌｉｖｅｒｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＪＣｌｉｎ５４８Ｉｎｖｅｓｔ１１５，２３３０－２３４０，ｄｏｉ：１０．１１７２／ｊｃｉ２３４８６（２００５））。これらの細管細胞（ｄｕｃｔｕｌａｒｃｅｌｌ）が線維症と関連し得る一方で（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｌｏｕｓｔｏｎ，Ａ．Ｄ．＆Ｆｏｒｂｅｓ，Ｓ．Ｊ．Ｌｉｎｋｓｂｅｔｗｅｅｎｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｄｕｃｔｕｌａｒｒｅａｃｔｉｏｎ，ａｎｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１４６，３４９－３５６，ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１３．１１．０３４（２０１４））、これらは、再生肝臓前駆細胞（ＨＰＣ）も含有し得る（Ｌｕ，Ｗ．Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｏｆｂｉｌｉａｒｙｏｒｉｇｉｎｗｉｔｈｌｉｖｅｒｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙ．ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ１７，９７１－９８３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ３２０３（２０１５））。ＫＣは、さらに全身毒性のリスクを与える肝損傷中に制御不全になる腸由来病原体からの免疫学的障壁も提供する（９、１０）。ＣＣＲ２依存性に肝臓に動員される循環単球の枯渇および機能不全につながるさらなる全身性の免疫学的な影響がある（１１～１３）。組織損傷および再生中のマクロファージ生物学の複雑で可塑性の性質を反映すると思われる肝損傷中のマクロファージの役割に関して、矛盾する文献が存在する。

【0004】

健常肝臓中の幹細胞は、非常に大きな再生能を有するが、ウイルス感染、アルコール乱用、毒素への曝露および代謝性障害により誘導される慢性損傷は、線維性スカー（ｆｉｂｒｏｔｉｃｓｃａｒｉｎｇ）、肝硬変およびその再生過程の最終的な不全につながる（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｈｅｐａｔｉｃｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３４，１６５５－１６６９，ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２００８．０３．００３（２００８））。

【0005】

利用可能な唯一の処置は臓器移植であるが、これは需要が増加しており、ドナー数が限定的であり、代替療法が急ぎ必要とされている（Ｓｏｌｔｙｓ，Ｋ．Ａ．ｅｔａｌ．Ｂａｒｒｉｅｒｓｔｏｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｂｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ＪＨｅｐａｔｏｌ５３，７６９－７７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｈｅｐ．２０１０．０５．０１０（２０１０））。

【0006】

肝損傷の処置において使用され得る新規療法は探索が急がれる。肝損傷に対する新規療法を提供することが本発明の目的である。有利に、このような療法は、肝臓壊死の消散を加速し、全身性炎症反応を抑制し、肝臓再生を促進することが可能である。

【発明の概要】

【0007】

本発明によれば、慢性または急性肝損傷などの肝損傷の予防または処置での使用のための選択的活性化マクロファージ（ＡＡＭ）が提供される。

【0008】

適切には、肝損傷は、急性肝損傷、例えば薬物使用または薬物過剰摂取に付随する肝損傷などであり得る。適切には、肝損傷は、アセトアミノフェン、クラリスロマイシン、スタチン、ニコチン酸、アミオダロン、メトトレキサート、イソニアジド、ニトロフラントイン、オーグメンチン、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ナブメトン、ジクロフェナク、タクリンまたはジスルフィラムからなる群から選択される１つ以上の薬物の使用からの結果であり得る。適切には、薬物はアセトアミノフェンであり得る。適切には、肝損傷は、キノコ中毒などの中毒からの結果であり得る。

【0009】

適切には、ＡＡＭは、肝臓が壊死の徴候を示しているときに投与され得る。適切には、ＡＡＭは、中毒または薬物過剰摂取から１０時間以上後に投与され得る。

【0010】

選択的活性化（Ｍ２様）マクロファージは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＣＳＦ－１またはそれらの組み合わせを用いてマクロファージを極性化することにより調製され得る。適切には、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３で極性化され得る。有利には、選択的活性化マクロファージは、ＡＡＭが肝損傷を有する対象にとって自己由来となるように、処置しようとする対象からのマクロファージ試料から調製され得る。

【0011】

適切には、選択的活性化マクロファージは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性細胞由来であり得る。

【0012】

適切には、選択的活性化マクロファージは静脈内投与用に処方される。

【0013】

適切には、選択的活性化マクロファージは、細胞１０^７～１０^９個の用量で提供され得る。

【0014】

別の態様において、本発明は、対象において肝損傷を予防するかまたは処置する方法であって、前記対象への治療的有効量の選択的活性化マクロファージを含む、方法を提供する。

【0015】

【0016】

【0017】

選択的活性化（Ｍ２様）マクロファージは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＣＳＦ－１またはそれらの組み合わせでマクロファージを極性化することにより調製され得る。適切には、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、ＩＬ－４およびＩＬ－１３で極性化され得る。有利には、選択的活性化マクロファージは、ＡＡＭが肝損傷を有する対象にとって自己由来となるように、処置しようとする対象からのマクロファージ試料から調製され得る。

【0018】

適切には、選択的活性化マクロファージは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性細胞由来であり得る。

【0019】

適切には、投与は静脈内であり得、および／または細胞１０^７～１０^９個の用量で提供され得る。

【図面の簡単な説明】

【0020】

本発明の実施形態は、添付の図面を参照して本明細書中で後にさらに記載する。

【0021】

【図1】図１は、静脈内投与されるＢＭＤＭが肝臓および脾臓において急速に生着することを示す。（Ａ）赤外線蛍光光学イメージングは、健常マウスおよびＡＰＡＰ中毒マウスにおいて４時間以内で上腹部でＶｉｖｏｔｒａｃｋ標識ＢＭＤＭ（５ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）が蓄積していることを示し、（Ｂ）１５分ごとに測定した腹部ＲＯＩからの蛍光シグナルの定量は、４時間までの蓄積を示す。白丸は、未染色ＢＭＤＭを投与されたマウスを示し、色付きの丸はＶｉｖｏｔｒａｃｋ染色ＢＭＤＭを投与されたマウス（黒丸、健常；赤丸、ＡＰＡＰ中毒）を示す。（Ｃ）ＢＭＤＭは、標識後の細胞ＡＴＰレベルにより示されるようにＶｉｖｏｔｒａｃｋに耐容性である。（Ｄ）蛍光顕微鏡は、標識後ＧＦＰ陽性のＢＭＤＭの強く均一な染色を示すが、未標識ＢＭＤＭでこれは示されず、（Ｅ）臓器のエクスビボイメージングは、健常マウスおよびＡＰＡＰ中毒マウスにおける、移植（ｉ．ｖ．）後４時間での肝臓、肺および脾臓におけるＢＭＤＭ局在化を示す。（Ｆ）臓器蛍光定量による臓器は、未染色細胞が投与された健常マウス（灰色のバー）および染色細胞が投与されたマウス（黒色のバー、健常；赤色のバー、ＡＰＡＰ中毒）の両方における、肝臓、肺および脾臓でのＢＭＤＭ局在を示す。蛍光シグナルは、健常な同等マウス肝臓と比較してＡＰＡＰ中毒マウスの肝臓において７０％弱く見え、このことから損傷肝臓において肝臓生着が少ないことが示唆される。（Ｇ）ＣＦＳＥ染色マクロファージにおけるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に対する免疫組織化学３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色は、肝臓および脾臓実質（黒矢印）における典型的なマクロファージ形態を有する細胞での陽性染色を示す。ＢＭＤＭは、肝臓の壊死領域（中心静脈（ＣＶ）周囲の強いバックグラウンド染色により特定；左画像中列）内およびその周囲で見られる。腎臓、肺または脳組織でＢＭＤＭは検出されなかった。パネル中の棒グラフは、標準偏差前後の平均値を示す。

【0022】

【図2】図２は、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷後、選択的活性化マクロファージ（ＡＡＭ）が肝臓壊死を軽減することを示す。空腹マウスをＡＰＡＰ（３５０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ）で処置し、ＡＰＡＰ投与から１６時間後に、未操作（ナイーブ）または予め極性化されたＢＭＤＭ（古典的活性化マクロファージ（ＣＡＭ）、ＡＡＭまたは脱活性化マクロファージ（ＤＡＭ））で処置した。（Ａ）肝損傷バイオマーカー（ＡＬＴ／ＡＳＴ／ＡＬＰ）および機能マーカー（総ビリルビン／血清アルブミン）の血清化学分析は処置群間で差は示さない。白丸は、示されるように群ごとの個々の動物からの値を表し、（Ｂ）ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）染色は、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷の特徴である、中心静脈周囲の典型的なエオシン好性壊死領域を示す。パネルはマウス肝臓からの代表的な画像を示す（２ｘ拡大率）。壊死の定量化は、示されているように群中の平均（水平線）前後の個々の動物あたりの白丸として右下に示す。アスタリスク記号は統計学的有意性を示す（Ｐ＜０．０５、クラスカル－ワリス検定）。

【0023】

【図3】図３は、極性化ＢＭＤＭ処置がＡＰＡＰ誘発肝損傷後に肝細胞増殖を誘発することを示す。（Ａ）増殖細胞を標識するために屠殺する１時間前に、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷後に極性化ＢＭＤＭで処置したマウスをＢｒｄＵ（１ｍｇ、ｉ．ｐ．）で標識した。パネルは、示されるように各群からの代表的な免疫蛍光（ＩＦ）染色を示す。核をＤＡＰＩで染色し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ｎｍ二次抗体の前に抗ＢｒｄＵ一次抗体（またはアイソタイプ対照抗体）を使用してＢｒｄＵ陽性を染色した。切片をＯｐｅｒｅｔｔａＨｉｇｈＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でイメージングし、定量した。全ての核のパーセンテージとして表した、ＢｒｄＵ陽性核（赤色に染色された核、５４６ｎｍチャネルにおける最小蛍光強度５００ＲＦＵ）の数を数えることによって、切片を定量した。ＢｒｄＵ定量は、平均（黒色線）前後の個々の動物ごとに白丸として群で示す（右下）。スケールバーはパネルごとに左下に示す。アスタリスク記号は群間の統計学的有意性を示す（Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）同時免疫染色から、実質および非実質起源の増殖細胞がＡＡＭマウスにおいて肝臓を再生することが示される。

【0024】

【図4】図４は、極性化ＢＭＤＭ投与により、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷を有するマウスにおいて一連の循環炎症性サイトカインが減弱することを示す。電気化学発光技術（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＢＭＤＭ（ナイーブＢＭＤＭ、ＣＡＭおよびＡＡＭ）を投与されたマウスからの血清を、１０プレックス（１０－ｐｌｅｘ）パネルの炎症促進性サイトカインについてアッセイした。パネルは、分析した各サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１（ＫＣ／ＧＲＯ）、ＴＮＦα）に対する群でのデータを示す。各白丸は、群ごとの個々の動物からのデータ点を表す。アスタリスク記号は統計学的有意性のレベルを表す（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。

【0025】

【図5】図５は、ＡＡＭ投与によって、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷後のマウスにおいてＣｓｆ１発現が上方制御され、炎症性Ｃｘｃｌ１およびＩｌ６発現が低下することを示す。ＡＬＩ中のマクロファージシグナル伝達に関与していることが知られているサイトカインおよびケモカインの一群を、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷に対するＢＭＤＭ処置後に肝臓全体でアッセイした。パネルは、ＡＰＡＰ投与後にＰＢＳを投与されたマウスと比較した群中の各遺伝子の平均相対発現を示す（ＢＭＤＭなし）。黒色バーは標準偏差前後の平均の倍単位の差を示す（ｎ＝６）。生存促進遺伝子Ｃｓｆ１の発現は、ＡＡＭ処置マウスにおいて有意に高かった。循環マーカーと一致して、Ｃｘｃｌ１およびＩｌ６の発現は、ＡＡＭ処置マウスにおいて有意に低かった。Ｇａｐｄｈをハウスキーピング遺伝子とした。アスタリスク記号は統計学的な差を示す（Ｐ＜０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ）。

【0026】

【図6】図６は、ＡＡＭがナイーブおよびＣＡＭを超える食作用能促進を呈することを示す。（Ａ）極性化ＢＭＤＭをアポトーシス蛍光胸腺細胞とともに温置した。ＢＭＤＭをアポトーシス胸腺細胞（以前のように、３～５週齢のＣ５７ＢＬ６マウスから採取し、１μＭヒドロコルチゾンで処理した初代胸腺細胞（Ｄ．Ａ．Ｆｅｒｅｎｂａｃｈら、２０１０）とともに温置した。製造者の説明書（Ｌ．Ｂｏｓｕｒｇｉら、２０１５）に従ってＣＭＴＭＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアポトーシス胸腺細胞を標識し、次いで、異なる表現型（緑色、ＡＡＭ；赤色、ＣＡＭ；黒色、ナイーブ）に対して極性化したＢＭＤＭとともに、３０、６０または１２０分間温置した。パネルは、ＣＭＴＭＲ陽性ＢＭＤＭのパーセンテージ（左）、それらの平均蛍光強度（ＭＦＩ；左から２番目）、正規化ＭＦＩ（右から２番目）およびＭＦＩヒストグラム（右）を示す。淡青色のヒストグラムは未染色細胞を表す。（Ｂ）ＡＡＭにおいて食作用後にＢＭＤＭ上のＬｙ６Ｃ発現が減少する。左パネルは、異なる表現型に対して極性化されたＬｙ６Ｃ陽性ＢＭＤＭのパーセンテージを示し、右パネルは代表的なヒストグラムを示す。（Ｃ）ＡＡＭは、ナイーブまたはＣＡＭよりも多くのザイモサン被覆ｐＨｒｏｄｏ粒子を貪食する。ＢＭＤＭをザイモサン被覆ｐＨｒｏｄｏバイオ粒子とともに最長で１２５分間温置し、ハイコンテンツイメージングを介してリアルタイムで分析した。グラフは、経時的に、群（緑色、ＡＡＭ；赤色、ＣＡＭ、黒色、ナイーブ）中の標準偏差前後の蛍光閾値（食作用に対して陽性）を上回る細胞の平均割合を示す。（Ｄ）様々な時間に撮影された代表的な画像から、ＡＡＭが、ナイーブマクロファージまたはＣＡＭよりも早く、大きい容量まで緑色蛍光を呈することが示される。青色核染色（ＮｕｃＢｌｕｅ）およびＤｅｅｐＲｅｄＣｅｌｌＭａｓｋで細胞を可視化する。

【0027】

【図7】図７は、移植されたＡＡＭがインビボで高度に食作用性であり、それらの抗炎症性表現型を保持することを示す。（Ａ）試験設計時系列は、ＡＰＡＰ後１６時間でのＢＭＤＭ移植前の空腹マウスへの単回ＡＰＡＰ投与を示す。内在および外来細胞の食作用能は、ＡＰＡＰ後３６時間での処分前に、ＰＫＨ２６色素（ｉ．ｖ．；貪食細胞によって専ら摂取される色素）の負荷によって評価した。（Ｂ）ＰＢＳ（最上列）またはＡＡＭ（最下列）を投与されたマウスからの、ペトリ皿中の代表的な左外側葉の写真。ＡＰＡＰ（青色の矢頭）後に出血性壊死の局所領域がＰＢＳ処置マウスで観察され、これはマクロファージ処置マウスの肝臓では観察されない。（Ｃ）ＢＭＤＭ療法が行われたマウスでは血清トランスアミナーゼが実質的に減少する（ＡＬＴ、左パネル；ＡＳＴ、右パネル）（Ｄ）上のパネルは、マクロファージ処置マウスが肝臓においてＬｙ６Ｃ＋浸潤マクロファージの若干の減少を呈することを示し、パネルは、浸潤細胞のパーセンテージ（左）および絶対数（右）を示す。下のパネルは、Ｌｙ６Ｃ＋マクロファージがマクロファージ処置マウスの肝臓においてより高い食作用活性を有することを示唆する傾向を示す（左パネル、パーセンテージ；右パネル絶対数）。（Ｅ）移植ＢＭＤＭは、移植後２０時間で、血液および肝臓の両方で多数検出される。（Ｆ）肝臓で検出されたＢＭＤＭの大部分はＬｙ６Ｃ陰性であり、これにより、殆どの細胞がそれらの抗炎症表現型を保持することが示唆され、（Ｇ）移植マクロファージは肝臓において実質的な食作用活性を示し、食作用はＣＦＳＥ＋およびＰＫＨ２６＋マクロファージにおいてゲートオン（ｇａｔｅｄｏｎ）された。９５％を超えるＬｙ６Ｃ－ＢＭＤＭが食作用に対して陽性であり、インビボで高い食作用活性を確認する。

【0028】

【図8】図８は、健常マウスにおける未操作ＢＭＤＭ投与後の血清化学を示す。ＢＭＤＭ投与の２０時間後に採取したマウス血清中で肝損傷および機能のマーカーをアッセイした（細胞１ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）。パネルは、群中の平均（黒線）前後の個々のマウス（白丸）の値を示す。何れのバイオマーカーも、ＰＢＳビヒクル対照と比較してＢＭＤＭ群で統計学的に有意ではなかった（スチューデントのｔ検定）。

【0029】

【図9】図９は、ＡＰＡＰ処置後早期（４時間）に投与されたナイーブＢＭＤＭが、肝損傷を軽減しないことを示す。ＡＰＡＰ投与（ＢＭＤＭ投与の２０時間後、１ｘ１０^６個ｉ．ｖ．）の２４時間後に採取したマウス血清中で肝損傷および機能のマーカーをアッセイした。測定したマーカーは統計学的に有意ではなかったものの、血清トランスアミナーゼは、ＢＭＤＭ処置マウスでより高い傾向を示し、死亡はＢＭＤＭ処置群でのみ観察された（スチューデントｔ検定）。

【0030】

【図10】図１０は、サイトカイン介在性ＢＭＤＭ極性化が通常および超低付着性プラスチック上で起こることを示す。通常のプラスチック（黒色バー）または超低付着性プラスチック（灰色バー）の何れかにおいて、４８時間にわたり、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍＬ）－ＣＡＭ用）、ＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ－１３（２０ｎｇ／ｍＬ）－ＡＡＭ用、ＩＬ－１０（１０ｎｇ／ｍＬ）－ＤＡＭ用の何れかとともに、または増殖因子なし（ナイーブマクロファージ）でＢＭＤＭを培養した。（Ａ）古典的活性化遺伝子（Ｎｏｓ２、Ｔｎｆ、Ｃｃｌ２）についての相対的遺伝子発現分析から、通常および低付着性プラスチックの両方においてＬＰＳ／ＩＦＮで処理したＢＭＤＭにおける発現の実質的かつ一貫した増加が示される。（Ｂ、Ｃ）原型的な選択的活性化遺伝子（Ｂ、選択的活性化遺伝子：Ｃｈｉｌ３、Ｒｅｔｎｌａ、Ｍｒｃ１、Ａｒｇ１；Ｃ、ＤＡＭ：Ｉｌ１０）の遺伝子発現分析から、それぞれＩＬ－４／ＩＬ－１３（Ｂ）およびＩＬ－１０（Ｃ）とともに培養したＢＭＤＭにおける発現の一貫した増加が示される。選択的活性化遺伝子は両方のプラスチックタイプでＩＬ－４／ＩＬ－１３によって上方制御され、一方でＩＬ－１０処理後の低付着性プラスチックにおいてＩｌ１０遺伝子発現がより高かった。

【0031】

【図11】図１１は、極性化ＢＭＤＭ投与が、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷を有するマウスの肝臓全体において炎症性サイトカインの一群にわたりより弱い傾向を示すことを示す。電気化学発光技術（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＢＭＤＭ（ナイーブ、ＣＡＭ、ＡＡＭ）で処置したマウスからの血清を、１０プレックス（１０－ｐｌｅｘ）パネルの炎症促進性サイトカインについてアッセイした。パネルは、分析した各サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１（ＫＣ／ＧＲＯ）、ＴＮＦα）に対する群でのデータを示す。各白丸は、群ごとの個々の動物からのデータ点を表す。アスタリスク記号は統計学的有意性のレベルを表す（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；一元配置ＡＮＯＶＡ）。

【0032】

【図12】図１２は、ヒト単球由来マクロファージがインビトロ極性化後に食作用動態の変化を示すことを示す。ＬＰＳ／ＩＦＮ（古典的活性化については、ｈＣＡＭに向けて）、ＩＬ４／ＩＬ－１３（選択的活性化については、ｈＡＡＭに向けて）、または刺激なし（ナイーブＭＤＭ）で培養する前に分化を推進するために７日間にわたりヒト組み換えＣＳＦ１とともにインビトロでヒト単球を温置した。マクロファージを９６ウェルＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒプレートに細胞１ｘ１０^５個／ウェルで播種し、ザイモサングリーンｐＨｒｏｄｏバイオ粒子とともに１２５分間温置した。（Ａ）群あたり４ウェルからのｐＨｒｏｄｏ陽性細胞のリアルタイム平均割合。スポットは、標準偏差前後の平均値を示す。（Ｂ）温置中の様々な時点における培養中のｈＭＤＭからの代表的画像。青色染色はＮｕｃＢｌｕｅ核を表す。赤色染色はＤｅｅｐＲｅｄ細胞マスクの細胞質染色である。緑色シグナルは、酸性リソソーム中の摂取されたｐＨｒｏｄｏバイオ粒子を表す。食作用の傾向はマウスＢＭＤＭと類似していたが、粒子摂取の開始が遅れた。

【0033】

【図13】図１３は、フローサイトメトリーゲーティングストラテジーを示す。肝臓消化物の亜集団の分類からの代表的なフロープロット。上部パネルは、ダブレットおよび肝臓／死染色について陰性であるものを除き、分析に使用される全ての細胞を示す。亜集団は全肝マクロファージまたはＣＤ４５＋細胞の割合として表した。肝常在マクロファージは、生存可能なＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ３－ＮＫ１．１－ＣＤ１９－ＣＤ１１ｂ^ｌｏｗＦ４／８０^ｈｉｇｈとして定義した。肝浸潤マクロファージは、消化された肝臓の非実質分画からの生存可能なＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ３－ＮＫ１．１－ＣＤ１９－ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈＦ４／８０^ｌｏｗ細胞として定義され、マクロファージサブセットを同定するために使用した。肝臓あたりの細胞の絶対数の定量は、各サブセットをＮＰＣの割合として表し、肝臓の消化部分中のＮＰＣの総数を計数し、重量差により肝臓全体中のＮＰＣの総数を計算し、それにより各サブ集団の総数を計算することにより行った。移植ＡＡＭはＣＦＳＥ＋として同定された。総生存可能ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｇ－ＣＤ３－ＣＤ１９－ＮＫ１．１－細胞のゲートでパーセンテージＣＦＳＥ＋細胞を計算した。陰性は、ＡＡＭの代わりにビヒクルを投与されたＡＰＡＰ中毒マウスからの肝臓において設定した。ＡＡＭを、それらのＬｙ６Ｃ発現についてさらに分類し、ＦＭＯ対照を使用してゲーティングを設定した。貪食細胞のパーセンテージ（陽性および陰性）は、ＣＦＳＥ＋細胞のゲートにおいて計算した。陰性は、ＡＡＭを移植したがＰＫＨ２６ＰＣＬの代わりにビヒクルを注射したＡＰＡＰ中毒マウスからの肝臓を用いて設定した。ＰＫＨ２６ＰＣＬＭＦｌは同じゲートにおいて計算した。

【0034】

【図14】図１４は、フローサイトメトリーゲーティングストラテジーを示す。食作用分析の亜集団の分類からの代表的なフロープロット。パネルは、ダブレットを除いて、試験において分析された全細胞を示す。ＢＭＤＭはＣＤ１１ｂ＋として同定された。貪食細胞のパーセンテージは、ＣＤ１１ｂ＋細胞のゲートにおいて計算した。食作用に対して陽性のＢＭＤＭは、ＣＭＴＭＲ＋（すなわち蛍光アポトーシス胸腺細胞）として定義された。非特異的結合のパーセンテージ（４℃での食作用、右上のパネル）を食作用性ＢＭＤＭのパーセンテージ（３７℃）から差し引いた。貪食細胞をそれらのＬｙ６Ｃ発現に基づいてさらに分類した（右下パネル）。ゲートはＦＭＯ対照を使用して設定した。

【0035】

【図15】図１５は、ＡＰＡＰ中毒マウスにおけるＡＡＭ送達後の全血パラメーターを示す。本発明者らは、ＤＰＢＳ（ビヒクル対照）対ＡＡＭ（５ｘ１０^６個、静脈内）を投与された中毒動物における全血の何れのパラメーター間でも統計学的差異を認めなかった。（Ａ）パネルは、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）および血小板（ＰＬＴ）について示されるように、群ごとに分類された白丸（個々の動物）を示す。（Ｂ）１群あたりのリンパ球数（左）およびパーセンテージ（右）。（Ｃ）１群あたりの単球数（左）およびパーセンテージ（右）。（Ｄ）１群あたりの顆粒球数（左）およびパーセンテージ（右）。

【0036】

【図16】図１６は、ＥＳＤＭおよびＢＭＤＭの比較を示す。画像解析を用いたＢＭＤＭ（Ａ）およびＥＳＤＭ（Ｂ）の染色サイトスピンは、ＥＳＤＭがより大きいことを示す（Ｃ）（スケールバー３０μＭ）。ＥＳＤＭにおける純粋な集団を示すＢＭＤＭ（Ｄ）およびＥＳＤＭ（Ｅ）のフローサイトメトリー分析。Ｐｈｒｏｄｏビーズ添加から０（Ｉ）、５０（ＩＩ）、１００（ＩＩＩ）および１５０（ＩＶ）分後のＢＭＤＭ（Ｇ）およびＥＳＤＭ（Ｈ）のライブ食作用アッセイからの画像およびＨａｒｍｏｎｙ画像解析ソフトウェアを用いた食作用速度の定量（Ｉ）（スケールバー５０μＭ）。［^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝３、（Ｃ）対応のないｔ検定、（Ｆ）クラスカル－ワリス検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ、（Ｉ）シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ］

【0037】

【図17】図１７は、ＥＳＤＭおよびＢＭＤＭのＭ１およびＭ２刺激を示す。ナイーブ、Ｍ１およびＭ２刺激ＢＭＤＭおよびＥＳＤＭのＧｒｉｅｓｓ一酸化窒素アッセイ（Ａ）、およびｑＲＴ－ＰＣＲ分析による主要マーカーの発現、Ｍ１のマーカーとしてのｉＮｏｓ（Ｂ）およびＣｄ８６（Ｃ）、Ｍ２表現型のマーカーとしてのＡｒｇ１（Ｄ）およびＦｉｚｚ１（Ｅ）、および組織再構築のマーカーとしてのＴｗｅａｋ（Ｆ）、Ｍｍｐ９（Ｇ）、Ｍｍｐ１２（Ｈ）およびＭｍｐ１３（Ｉ）。Ｍ１およびＭ２刺激ＢＭＤＭ（Ｊ）およびＥＳＤＭ（Ｋ）の食作用の定量化。［^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；群あたりｎ＝３、テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ］。

【0038】

【図18】図１８は、より高用量のＥＳＤＭが抗線維化効果を有することを示す。損傷および１０００万または２０００万個のマクロファージのマクロファージ注射の模式図（Ａ）。１０００万（１０ｍ）または２０００万（２０ｍ）個の何れかのＥＳＤＭを注射したＣＣｌ４処理肝臓からの肝臓切片のＰＳＲ染色（Ｂ～Ｇ）およびａＳＭＡ染色（Ｈ～Ｍ）。スケールバー２００μＭ。［^＊ｐ＜０．０５、１群あたりｎ＝５、対応のないｔ検定］。

【0039】

【図19】図１９は、ＥＳＤＭが損傷肝臓において前駆反応を開始し得ることを示す。対照損傷肝臓（Ａ～Ｆ）と比較して、ＥＳＤＭを注射したマウスにおいて、有意に多数のＰａｎＣＫ陽性細胞が観察された。スケールバー１００μＭ。［^＊ｐ＜０．０５、１群あたりｎ＝５、対応のないｔ検定］。

【0040】

【図20】図２０は、ＥＳＤＭがリポソームクロドロネート処置マウスの肝臓を再配置させ得ることを示す。単球由来対組織常在マクロファージにおいて差次的に発現されるマーカー、Ｍｙｂ（Ａ）、Ｃｃｒ２（Ｂ）およびＰｕ．１（Ｃ）の発現。リポソームクロドロネート誘発クッパー細胞枯渇およびＥＳＤＭまたはＢＭＤＭの注射の略図（Ｄ）。異なる処置群からの肝臓切片のＣＦＳＥ免疫染色（Ｅ～Ｈ；スケールバー１００μＭ）およびＣＦＳＥ免疫組織化学（Ｉ～Ｌ、スケールバー５０μＭ）。ＣＦＳＥ＋免疫染色（Ｍ）およびＣＦＳＥ＋免疫組織化学（Ｎ）の定量。矢印は検出されたＣＦＳＥ＋細胞を指す。（Ｏ）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および（Ｐ）アルブミンレベルの血清分析。（Ｑ）Ｆ４／８０免疫組織化学によるリポソームクロドロネート処置後の肝臓評価におけるマクロファージ集団。クロドロネート処理後のＰＢＳ対照（Ａ）、２４時間（Ｂ）、４８時間（Ｃ）および７２時間（Ｄ）のＦ４／８０染色肝臓切片の代表的な画像。Ｆ４／８０＋染色の定量分析（Ｅ）。（Ｒ）ＦＩＴＣ免疫組織化学による異なる臓器におけるＥＳＤＭおよびＢＭＤＭ生着の評価。それぞれＰＢＳ（Ａ～Ｄ）、リポソームクロドロネート（Ｅ～Ｈ）、リポソームクロドロネートおよびＢＭＤＭ（Ｉ～Ｌ）およびリポソームクロドロネートおよびＥＳＤＭ（Ｍ～Ｐ）で処置したマウスの肝臓、肺、腎臓および心臓切片における外来性マクロファージの代表的画像（スケールバー１００μＭ）。［^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；群あたりｎ＝５、一元配置ＡＮＯＶＡ］

【0041】

【図21】図２１は、血清トランスアミナーゼが、ビヒクル対照と比較して、注射から２０時間後にＥＳＤＭ処置マウスにおいて異ならないことを示す。

【0042】

【図22】図２２は、ＥＳＤＭが、組み換えマウスＩＬ－４／ＩＬ－１３を用いたインビトロでの２４時間極性化後のＭ２関連遺伝子の顕著な増加を示すことを示す。

【0043】

【図23】図２３は、選択的活性化ＥＳＤＭがインビトロで食作用能が高いことを示す。インビトロでアポトーシス性胸腺細胞とともに温置されたＥＳＤＭは、栄養を与えられていない同等細胞に対して、食作用について７９％陽性を示す。

【0044】

【図24】図２４は、ＥＳＤＭ処置マウスが、ＥＳＤＭ注射（５ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）から２０時間後に小葉中心部壊死領域の縮小を示すことを示す。パネルは、ヘモトキシリン（Ｈａｅｍｏｔｘｙｌｉｎ）およびエオシン（Ｈ＋Ｅ）染色および画像定量化中に使用されるそれらの対応する画像セグメンテーション（分類子）を示す。

【0045】

【図25】図２５は、移植ＥＳＤＭ（黒矢印）が肝臓および脾臓に局在することを示す。パネルＡ－肝臓（上段、ｘ２０倍拡大率；下段、ｘ４０倍拡大率）切片。パネルＢ－脾臓切片。

【0046】

【図26】図２６は、ヒト多能性幹細胞からのマクロファージの産生を示し、ｈＰＳＣ由来のマクロファージは、ＣＤ１１ｂおよび２５Ｆ９の両方（Ｂ）を発現するが、ＣＤ９３（Ａ）は発現せず、重要なＭ１（Ｃ、Ｄ）およびＭ２関連遺伝子（Ｅ、Ｆ）は刺激時に上方制御される。ライブ食作用アッセイを使用したところ、ｉＰＳＣ－ＤＭはＭＤＭと同じ傾向を辿り、「ナイーブ」およびＭ２活性化マクロファージは、Ｍ１活性化マクロファージよりも食作用性が強かった（Ｇ、Ｈ）。［^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ＝３、（Ｃ～Ｆ）一元配置ＡＮＯＶＡ、（Ｇ～Ｈ）テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ］。

【0047】

【図27】図２７は、ｉＰＳＣ由来マクロファージがＣＤ４５（Ａ）、２５Ｆ９（Ｂ）、ＣＤ１６９（Ｃ）、ＣＤ１６３（Ｃ）、ＣＤ１４（Ｄ）およびＣＤ４３（Ｅ）を発現することを示す。ごく一部のｉＰＳＣには、低レベルのＶＣＡＭ１（Ｆ）およびＣＤ１５（Ｇ）がある。ｉＰＳＣはＣＤ９３（Ｂ）を発現しない。

【0048】

【図28】図２８は、ｉＰＳＣ由来マクロファージがＣＤ２０６（Ａ）、ＣＤ１１５（Ｂ）、ＣＤ８６（Ｃ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｅ）、ＣＣＲ２（Ｆ）、ＣＣＲ５（Ｇ）およびＣＣＲ８（Ｈ）を発現するがＨＬＡ－ＤＲ（Ｄ）を発現しないことを示す。

【0049】

【図29】図２９は、移植の２０時間後の転写変化度を決定するための、ＡＰＡＰ中毒マウスまたは健常マウス（ｎ＝３）への移植後のＦＡＣＳ分類ＡＡＭからの低密度マイクロアレイデータを示すボルケーノプロット（それぞれ、ｙ軸およびｘ軸上の倍単位の変化に対する統計学的有意性）を示す。ＡＰＡＰ処置マウスとＰＢＳ処置マウスとの間で異なる統計学的に有意な遺伝子は、水平線より上にある。スチューデントのｔ検定。ＡＡＭは一般に、それらの抗炎症表現型を保持し、分析された９５％の遺伝子は、ＡＰＡＰ処置マウスとＰＢＳ処置マウスとの間で差はなかった。

【詳細な説明】

【0050】

本発明者らは、驚くべきことに、選択的活性化マクロファージ（ＡＡＭ）が肝臓に対する損傷の処置において特に有用であることを見出した。驚くべきことに、ＡＡＭの投与の結果、以下の有利な効果のうち１つ以上が得られ得る：壊死の軽減、肝細胞増殖の増加、炎症促進性サイトカインレベルの低下、損傷部位での食作用の増加および内在性の炎症性浸潤マクロファージの割合の低下。したがって、ＡＡＭ療法は、有利に、肝炎壊死の解消を加速し得、全身性炎症反応を抑制し得、肝線維症を軽減し得、肝瘢痕化を軽減し得、および／または肝再生を促進し得る。

【0051】

インビトロでＥＳＣ由来の造血細胞は、発生中の卵黄嚢における造血の原始波（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｗａｖｅ）に関連する血液細胞とより密接に関連していると考えられる（Ｚａｍｂｉｄｉｓ，Ｅ．Ｔ．，Ｐｅａｕｌｔ，Ｂ．，Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｓ．，Ｂｕｎｚ，Ｆ．＆Ｃｉｖｉｎ，Ｃ．Ｉ．ｉｎＢｌｏｏｄＶｏｌ．１０６８６０－８７０（２００５））。組織常在マクロファージは、造血幹細胞（ＨＳＣ）が胚において出現するかなり前の造血の原始波（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｗａｖｅ）に由来し、Ｍｙｂの非存在下で発生することが知られている（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＡｌｉｎｅａｇｅｏｆｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆＭｙｂａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３６，８６－９０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１９１７９（２０１２））。適切には、本明細書に記載のマクロファージは組織常在様マクロファージであり得る。あるいは、本明細書に記載のマクロファージは単球由来様マクロファージであり得る。組織常在様マクロファージは、ＭｙｂおよびＣｃｒ２の発現レベルがより低いことおよびＰｕ．１の発現がより高いことを特徴とし得る。

【0052】

選択的活性化（Ｍ２様）マクロファージは当技術分野で公知であり、Ｔヘルパー２（ｔｈ２）サイトカインインターロイキン－４（ＩＬ－４）およびＩＬ－１３を用いて骨髄由来マクロファージを極性化することによって調製され得る。例えば、ＡＡＭはＧｏｒｄｏｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３２，Ｍａｙ２８，２０１，５９３～６０４頁で詳述される。有利には、ＡＡＭは、本発明の実施例に記載のようにマクロファージから産生され得る。

【0053】

ＡＡＭは、Ｃｈｉｌ３（Ｙｍ１）、Ｒｅｔｎｌａ（Ｆｉｚｚ）、Ｍｒｃ１（マンノース受容体１）およびＡｒｇ１（アルギナーゼ）のそれらの高発現を特徴とし得る。

【0054】

本明細書で使用される場合、「肝損傷」は肝毒性を指す。単なる例として、肝損傷は、自己免疫性肝炎、原発性移植片無機能、過小グラフト症候群、悪性腫瘍および／または薬物誘発性肝損傷の結果として対象において起こる。適切には、薬物誘発性肝損傷は、クラリスロマイシン、スタチン、ニコチン酸、アミオダロン、メトトレキサート、イソニアジド、ニトロフラントイン、オーグメンチン、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、ナブメトン、ジクロフェナク、タクリンまたはジスルフィラムからなる一覧から選択される１つ以上の薬物の使用の結果であり得る。より適切には、薬物誘発性肝損傷は、アセトアミノフェン過剰摂取の結果として生じる。

【0055】

肝臓への長期的な障害は慢性肝損傷につながり得る。単なる例として、慢性肝損傷は、ウイルス性肝炎、アルコール、肥満および代謝障害から引き起こされ得る。慢性肝損傷は、線維症、肝瘢痕化および肝硬変を引き起こし得、これらは正常な肝臓組織の瘢痕組織による置き換えを特徴とする。本発明は、驚くべきことに、投与されたＥＳＤＭが、インビボで肝線維症の量を有意に減少させ、線維形成性筋線維芽細胞および活性化肝前駆細胞（特にＰａｎＣＫ＋細管細胞（ｄｕｃｔｕｌａｒｃｅｌｌ））の数を下方制御したことを発見した。さらに、驚くべきことに、ＥＳＤＭが枯渇クッパー細胞区画を再配置させ得ることが見出された。理論に拘束されることを望まないが、ＥＳＤＭは瘢痕組織の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分を破壊するマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を分泌し得ると考えられる。適切には、Ｍ２様マクロファージに極性化されたＥＳＤＭも慢性肝損傷の処置において有用であり得る。

【0056】

本発明はまた、驚くべきことに、培養中にＡＡＭ表現型に刺激されたマクロファージがインビボでこの抗炎症性表現型を保持することも見出した。これにより、移植されたマクロファージが表現型において炎症促進性になり得、それによって損傷の処置に有害となり得るという潜在的な安全性の懸念が克服される。

【0057】

適切には、ＡＡＭは肝損傷後の再生期に投与され得る。例えば、薬物誘発性肝損傷から１６時間後である。本発明は、この期間におけるＡＡＭの投与によって壊死が軽減されることを示した。例えば、アセトアミノフェン過剰摂取後の再生期におけるＡＡＭの投与が、中心小葉壊死を６０％減少させ、肝細胞増殖を８倍増加させ、ならびに循環炎症促進性サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１およびＴＮＦ－αなど）のレベルを低下させることが示された。したがって、ＡＡＭは再生反応を加速させ得る。

【0058】

理論に縛られることを望むものではないが、ＡＡＭはそれらの高度に食作用性の表現型ゆえに肝臓から壊死物質を除去すると考えられる。

【0059】

有利には、選択的活性化マクロファージは、ＡＡＭが肝損傷を有する対象にとって自己由来となるように、処置しようとする対象からのマクロファージ試料から調製され得る。例えば、マクロファージ試料を対象から採取し、増殖させ、ＡＡＭとして特徴付けし、再注入し得る。

【0060】

適切には、選択的活性化マクロファージは、ヒト人工多能性幹細胞由来であり得る。これは、アセトアミノフェン中毒など、急性肝不全に急速に進行する肝損傷にとって有利であり得る。

【0061】

ＥＳ細胞およびｉＰＳＣなどの多能性幹細胞からマクロファージを産生させる様々な方法が当技術分野で公知である、Ｙｅｕｎｇｅｔａｌ．２０１２（ “Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ－ｒｅａｄｙｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｅｎａｂｌｅｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｆｕｎｃｔｉｏｎ”．Ｓｃ．Ｒｅｐ．２０１５Ｍａｒ１０；５：８９０９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０８９０８）、Ｚｈｕａｎｇｅｔａｌ．２０１２（“Ｐｕｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｍｕｒｉｎｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｆｒｏｍｃｕｌｔｕｒｅｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｓｔｕｄｉｅｓｏｆｃｈｅｍｏｔａｘｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｃｌｅａｒａｎｃｅ．” ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．２０１２Ｎｏｖ３０；３８５（１－２）：１－１４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１２．０６．００８．Ｅｐｕｂ２０１２Ｊｕｎ１８．）、Ｓｎｅｊｕｅｔａｌ．（“ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｉＰＳｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｔｏｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ” Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１４；３：ｅ２７９２７）、Ｈａｌｅｅｔａｌ．（“ＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌＤｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｓａＣｅｌｌｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｔｏＳｔｕｄｙＳａｌｍｏｎｅｌｌａａｎｄＯｔｈｅｒＰａｔｈｏｇｅｎｓ” ＰＬＯＳ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２４３０７）、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．（“ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃＰｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＭｏｄｅｌｉｎｇＭｅｎｄｅｌｉａｎＤｉｓｅａｓｅ” ＣｉｒｃＲｅｓ．２０１５Ｊｕｎ１９；１１７（１）：１７－２８）、Ｍｕｃｃｉｅｔａｌ．（“ＭｕｒｉｎｅｉＰＳＣ－ＤｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｓａＴｏｏｌｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＭｏｄｅｌｉｎｇｏｆＨｅｒｅｄｉｔａｒｙＰｕｌｍｏｎａｒｙＡｌｖｅｏｌａｒＰｒｏｔｅｉｎｏｓｉｓｄｕｅｔｏＣｓｆ２ｒｂＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ” ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ．２０１６Ａｕｇ９；７（２）：２９２－３０５．）、およびｖａｎＷｉｇｅｎｂｕｒｔｅｔａｌ．，（“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＬｏｎｇＴｅｒｍＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｙｔｅ－ＤｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓｆｒｏｍＨｕｍａｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓｕｎｄｅｒＰａｒｔｌｙ－ＤｅｆｉｎｅｄａｎｄＦｕｌｌｙ－ＤｅｆｉｎｅｄＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ” ＰＬＯＳＯＮＥ８（８）：ｅ７１０９８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７１０９８）を参照のこと。このようなマクロファージは、Ｔヘルパー２（ｔｈ２）サイトカインインターロイキン－４（ＩＬ－４）およびＩＬ－１３を用いてＡＡＭに極性化され得る。ＩＬ－４／ＩＬ－１３を用いた極性化の結果、Ｃｈｉｌ３（例えば、ナイーブＢＭＤＭに対して最大およそ１００倍の増加）、Ｒｅｔｎｌａ（例えば、最大１０００～１０００００倍の増加）、Ｍｒｃ１（例えば最大およそ１０倍の増加）、Ａｒｇ１（例えば最大およそ１００～１０００倍の増加）に対する遺伝子発現において動的な変化が起こり得る。

【0062】

適切には、ＡＡＭはＥＳ細胞由来であり得る。したがって、ＥＳ細胞由来マクロファージ（ＥＳＤＭ）は、ＥＳ細胞をコロニー刺激因子－１（ＣＳＦ－１）（Ｍ－ＣＳＦとしても知られる）およびＩＬ－３の存在下で培養して胚様体（ＥＢ）を形成させることによって作製され得る。ＥＢは組織培養プラスチックに接着する一方で、マクロファージ前駆細胞は非接着性であり、したがって培地中に放出される。次いで、マクロファージ前駆細胞を様々な時点で、例えば１０または２０日後に採取し、未処理ペトリ皿上に播種し、ＣＳＦ－１のみの存在下で培養し得る。この工程は、単層を形成させるプラスチックに接着し、ＥＳＤＭに成熟する単球様細胞を生じさせ得る。ＥＳ細胞のＥＳＤＭへの成熟は、成熟マクロファージ特異的マーカーＦ４／８０（マウスマクロファージ特異的）または２５Ｆ９（ヒトマクロファージ特異的）およびＣＤ１１ｂの存在を検出することによって監視し得る。さらに、ヒトマクロファージは、単球マーカーＣＤ９３が存在しないことを特徴とし得る。有利には、記載の方法は、ＥＳＤＭの実質的に均質な集団を生じさせる。

【0063】

あるいは、ＡＡＭはｉＰＳＣ由来であり得る。適切には、ｉＰＳＣのマクロファージへの分化のための方法は、サイトカインミックス１（骨形成タンパク質（ＢＭＰ４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む）を培地に追加することを含み得る。細胞を切断し、除去し、分割し、サイトカインミックス１を追加した新鮮培地中で再培養し得る。第２日にサイトカインを追加しながら３日間懸濁状態で細胞を培養し、ＥＢを形成させ得る。次いで、サイトカインミックス２（Ｍ－ＣＳＦ、ＩＬ３、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびβ－メルカプトエタノールを含む）を追加した培地にＥＢを移し得る。プロトコールの残りの期間、使用済み培地を３～４日ごとに新鮮培地と交換して、この培地中でＥＢを維持し得る。約２週間後、ＥＢが培養上清中にマクロファージ前駆体を産生し、これを回収し、サイトカインミックス３（Ｍ－ＣＳＦ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ペニシリン／ストレプトマイシン）を追加した培地に移し、ｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ－ＤＭ）に成熟させた。マクロファージ前駆細胞は、およそ２か月間、週に２回、回収し続け得る。

【0064】

好ましくは、ｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ－ＤＭ）はヒトｉＰＳＣ由来である。あるいは、ｉＰＳＣ－ＤＭはマウス由来であり得る。

【0065】

得られたＥＳＤＭまたはｉＰＳＣ－ＤＭは、続いて、ＬＰＳおよびＩＦＮγで処理することによりＭ１様表現型の何れかを採用するためにインビトロで極性化され得る。あるいは、ＩＬ－４を用いてＡＡＭを得るためにＥＳＤＭまたはｉＰＳＣ－ＤＭを極性化し得る。あるいは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３およびＣＳＦ－１を用いてＡＡＭを得るためにＥＳＤＭを極性化し得る。Ｍ１様極性化マクロファージは古典的活性化マクロファージ（ＣＡＭ）としても知られる。ＥＳＤＭ由来のＡＡＭは、それらの、Ｃｈｉｌ３（Ｙｍ１）、Ｒｅｔｎｌａ（Ｆｉｚｚ）、Ｍｒｃ１（マンノース受容体１）およびＡｒｇ１（アルギナーゼ）の高発現を特徴とし得る。対照的に、Ｍ１様極性化マクロファージ（ＥＳＤＭ、ＢＭＤＭまたはｉＰＳＣ－ＤＭなど）は、ＮＯ産生の有意な増加ならびにｉＮｏｓおよびＣｄ８６の遺伝子発現増加を特徴とし得る。

【0066】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、肝損傷の処置から恩恵を受け得るあらゆる個体を指す。対象はヒト対象であり得る。

【0067】

本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、進行を妨げる、または対象における肝損傷を伴う臨床症状を部分的または完全に軽減する介入を指す。適切には、この処置の結果、肝臓再生が増加し得るかまたは加速され得る。

【0068】

当然のことながら、治療的有効量のＡＡＭは、処置しようとする対象の体重を含む様々な要因に依存する。例として、治療的有効量は、１ｘ１０^７～１ｘ１０^９個のＡＡＭの用量の形態であり得るか、または治療的有効量は、２ｘ１０^７～２ｘ１０^９個のＡＡＭの用量の形態であり得る。具体的には、治療的有効量は、２ｘ１０^７個の用量の形態であり得る。

【0069】

適切には、ＡＡＭまたはＡＡＭを含む医薬組成物は、単回投与で提供され得る。そうではあるが、複数回投与もまた利用され得ることが理解されよう。

【0070】

適切には、ＡＡＭは医薬組成物中に含まれ得る。例えば、医薬組成物は治療的有効量のＡＡＭおよび薬学的に許容される担体を含み得る。

【0071】

本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、対象への投与に適した、何らかの適切な希釈剤、賦形剤またはそれらの組み合わせを指す。薬学的に許容される担体は、対象へのＡＡＭの送達を促進する有機または無機物質であり得る。

【0072】

適切な実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤および適合性の担体をさらに含み得る。本組成物はまた、抗酸化剤および／または保存剤も含み得る。適切な抗酸化剤は、言及されるチオール誘導体（例えばチオグリセロール、システイン、アセチルシステイン、シスチン、ジチオエリスリトール、ジチオスレイトール、グルタチオン）、トコフェロール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、亜硫酸塩（例えば硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムアセトン、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒドスルホキシレート、チオ硫酸ナトリウム）およびノルジヒドログアイアレイン酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃａｃｉｄ）からなる群から選択され得る。適切な保存剤は、例えばフェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび塩化セチルピリジニウムであり得る。

【0073】

本発明の医薬組成物は、何らかの適切な経路を介して対象に投与するためのものであり得る。適切な投与経路は、静脈内注射または点滴からなる群から選択され得る。医薬組成物を投与するための他の方法は当業者にとって公知であろう。

【0074】

本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という語およびそれらの変形語は、「含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｔｎｏｔｌｉｍｉｔｅｄｔｏ）」ことを意味し、それらは他の部分、添加剤、成分、整数または段階を排除すること（および排除しないこと）を意図しない。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書は、文脈上別段の要求がない限り、複数形ならびに単数形を企図すると理解すべきである。

【0075】

本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載される特性、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、適合しない場合を除き、本明細書中に記載の何らかの他の態様、実施形態または例に適用可能であると理解されたい。本明細書中で開示される全ての特性（何れの添付の特許請求の範囲、要約および図面も含む）、および／またはそのように開示される何らかの方法または工程の全ての段階は、このような特性および／または段階の少なくとも一部が互いに排他的である組み合わせを除き、あらゆる組み合わせで組み合わせられ得る。本発明は、何れの前述の実施形態の詳細にも限定されない。本発明は、本明細書中で開示される特性のあらゆる新規のものまたはあらゆる新規の組み合わせ（何れの添付の特許請求の範囲、要約および図面も含む）、またはそのように開示されるあらゆる方法または工程の段階のあらゆる新規の１つまたはあらゆる新規の組み合わせに及ぶ。

【0076】

読者は、本願に関連して本明細書と同時またはそれ以前に提出された全ての論文および文書に注目し、これらは、本明細書とともに公衆の縦覧に対して開かれ、このような論文および文書の全ての内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
［実施例］
実施例１：骨髄由来マクロファージ
方法

【0077】

マウスＢＭＤＭ：ペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ）中でＣ５７／ＢＬ６雄マウス（８～１０週齢）の大腿骨および脛骨を回収した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）を追加したＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて骨髄（ＢＭ）を流し出した。マウスＢＭを遠心分離し（４００ｇ、５分）、次いで再懸濁し、２０ｎｇ／ｍＬマウス組み換えＣＳＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する追加済みＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（２０ｍＬ）中で１００μｍフィルターに通して濾過した。次いで、ＢＭ懸濁液を滅菌超低接着性フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．）に移し、３７℃、５％ＣＯ_２、２０ｍＬ体積で温置した。２日ごとに、４００ｎｇＣＳＦ１を含有する新鮮培地と培地の１０～２０％を交換した。ＢＭＤＭ極性化のために、移植の２４時間前に、超低接着性フラスコ中でリポ多糖（ＬＰＳ、５０ｎｇ／ｍＬ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）および組み換えマウスインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ、２０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を用いて細胞を極性化させ、古典的活性化マクロファージ（ＣＡＭ）を生成させた。ＡＡＭについては、組み換えマウスインターロイキン－４およびインターロイキン－１３（ＩＬ－４／ＩＬ－１３、２０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でＢＭＤＭを極性化させた。不活性化マクロファージ（ＤＡＭ）については、組み換えマウスインターロイキン－１０（ＩＬ－１０、１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でＢＭＤＭを２４時間刺激した。

【0078】

ヒト単球由来マクロファージ：ヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）は、本質的に以前に記載されたように（１９）、凍結保存ＣＤ１４単球から分化させた。簡潔に述べると、超低接着性フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、細胞２ｘ１０^６個／ｍＬで、低温保存ストックを急速に凍結融解し、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）、２ｍＭグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（５００Ｕ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ）および１００ｎｇ／ｍＬヒト組み換えＣＳＦ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を追加したＩｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ（ＩＭＥＭ）中で希釈した。２日ごとに１μｇＣＳＦ１を含有する１０％培地交換により、７日間にわたり細胞をマクロファージへと分化させた。７日後、ｈＭＤＭを回収し、計数し、ＣＡＭおよびＡＡＭに対するヒト組み換えサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、上記で詳述）とともに、または未刺激のままにして（ナイーブｈＭＤＭ）、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒプレート上に播種した。ｈＭＤＭを食作用アッセイのために使用した（下記参照）。

【0079】

ＡＰＡＰ誘発性肝損傷およびＢＭＤＭ投与：全ての動物実験はＢｒｉｔｉｓｈＨｏｍｅＯｆｆｉｃｅの手続きおよび倫理的指針のもとで行い、実験計画は独立に獣医が審査した。野生型Ｃ５７ＢＬ６雄マウス（１０週齢）は、Ｈａｒｌａｎ（ＵＫ）によって供給され、清潔な動物施設で最低２週間順応させた。マウスをオープントップケージに５／６匹の群で収容し、食餌および水を自由に摂取させながら１２時間の暗／明サイクルに同調させた。ＡＰＡＰ投与前に、マウスを少なくとも１２時間絶食させた。マウスに対して、温生理食塩水中で溶解させたＡＰＡＰ（３５０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水のみの何れかの単回注射（ｉ．ｐ．）を行った。ＣＦＳＥ染色ＢＭＤＭをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で再懸濁し、ＡＰＡＰ投与の４時間後または１６時間後の何れかに、イソフルラン／酸素ガス麻酔下で尾静脈を介してマウスに投与した（細胞１ｘ１０^６個、１００μＬ）。処分の１時間前に、マウスにＰＢＳ中の１ｍｇ（ｉ．ｐ．）の５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を適用して、増殖細胞を標識した。ＣＯ_２増加雰囲気中での窒息により人道的にマウスを処分した。心臓穿刺を介して全血を回収し、４℃で一晩凝血させて血清を回収した。肝臓組織を採取し、左側葉を２片に分け、凍結イソペンタン浴に入れるか、またはメタカン中で２４時間固定した。残存肝臓および他の臓器を、パラフィン包埋前に２４時間、ホルマリン（４％パラホルムアルデヒド）中で固定した。

【0080】

インビボ細胞追跡：末梢投与された移植細胞の肝臓局在を確認するために、本発明者らは蛍光イメージングを利用した。移植前に、ＢＭＤＭをインビトロでＶｉｖｏＴｒａｃｋ６８０（近赤外蛍光造影剤、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で染色した。ＢＭＤＭ（５ｘ１０^６個）を４ｍＬのＤＰＢＳ中の再構成ＶｉｖｏＴｒａｃｋ（２ｍＬ）とともに温置し、暗環境において室温で１５分間温置し、続いて過剰な色素を除去するために２回洗浄した。イメージングは、健常マウス（ＤＰＢＳ処置、ｉ．ｐ．）またはＡＰＡＰ処置マウスにおいて１６時間で行った。マウスを麻酔し、酸素／イソフルオランガスで維持し、毛を刈り取り、その後、ＰｈｏｔｏｎＩＭＡＧＥＲ（商標）（ＢｉｏｓｐａｃｅＬａｂ）イメージングスイートを用いて、時系列蛍光画像を６８７ｎｍ励起および７２２ｎｍ発光（４８７ｎｍでバックグラウンド補正）で１５分間隔で背臥位で撮影した。５時間後、マウスを人道的に処分し、臓器をエクスビボで画像化してＡＡＭ局在化を確認した。いくつかの実験において、インビトロでＶｉｖｏｔｒａｃｋ６８０での染色を確認するために、構成的発現ＧＦＰマウスから分化させたＢＭＤＭ（２０）を使用した。

【0081】

ＣＦＳＥ染色：本質的に製造業者の説明書に従って、ＢＭＤＭをＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。簡潔に述べると、ＢＭＤＭをＤＰＢＳ中で細胞１ｘ１０^７個／ｍＬで再懸濁し、３７℃、暗条件で２０分間、最終濃度５０μＭのＣＦＳＥとともに温置した。細胞を遠心分離し（４００ｇ、５分）、１０ｘＤＰＢＳ体積で洗浄し、暗条件で３７℃にて２０分間再度温置した。最後に、染色細胞を遠心分離し、細胞１ｘ１０^７個／ｍＬでＤＰＢＳ中で再懸濁し、移植まで氷上で保存した。

【0082】

血清調製：血液を４℃で一晩凝血させた。血清を連続遠心分離により得た。簡潔に述べると、１５００ｇ（５分、４℃）での遠心分離によって血清を血液細胞から分離し、新しいマイクロチューブにピペットで移した。血清を再度遠心分離し（１４０００ｇ、５分、４℃）、あらゆる残存血液細胞および細胞片をペレット化した。血清を新しいマイクロチューブに移し、使用するまで－２０℃で凍結した。

【0083】

血清化学評価：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、総ビリルビンおよび血清アルブミンの測定によって血清化学検査を行った。市販のキット（ＡｌｐｈａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ）を利用して、（２１）により記載の方法を用いてＡＬＴを測定した。ＡＳＴおよびＡＬＰは市販のキット（ＲａｎｄｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により決定した。総ビリルビンは、市販のキット（ＡｌｐｈａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ）を使用して、ＰｅａｒｌｍａｎおよびＬｅｅ（２２）によって記載の酸ジアゾ法（ａｃｉｄｄｉａｚｏｍｅｔｈｏｄ）によって決定した。マウス血清アルブミン測定値は市販の血清アルブミンキット（ＡｌｐｈａＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＬｔｄ）を用いて決定した。キットは全て、ＣｏｂａｓＦａｒａ遠心分離分析装置（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＬｔｄ）での使用に適応していた。全アッセイについて、実験内精度はＣＶ＜４％であった。いくつかの実験において、ＡＬＰ活性を除き、アッセイは血漿試料に対して行った。

【0084】

ヘマトキシリンおよびエオシン染色および壊死の定量：肝臓組織の４ミクロン切片を回転式ミクロトームで切り、ＳｕｒｇｉｐａｔｈＳｕｐｅｒｉｏｒＡｄｈｅｓｉｖｅＳｌｉｄｅｓ（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で回収し、４５℃で一晩乾燥させた。ＳｈａｎｄｏｎＶａｒｉｓｔａｉｎＧｅｍｉｎｉＥＳＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｌｉｄｅＳｔａｉｎｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でヘマトキシリンおよびエオシンで切片を染色し、ＳｈａｎｄｏｎＣｌｅａｒＶｕｅＣｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて標本にした。壊死の定量のために、電動ステージおよびＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１顕微鏡を使用してＤｏｔｓｌｉｄｅＶＳ－ＡＳＷソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で単独画像を作成するためにスライドをスキャンし、ＯｌｙｍｐｕｓＰｌａｎＡｐｏ２ＸレンズおよびＯｌｙｍｐｕｓＸＣ１０カメラを使用して画像を取得した。ＦＩＪＩ（２４、２５）においてＴｒａｉｎａｂｌｅＷＥＫＡＳｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎプラグイン（２３）を使用して画像を解析した。壊死組織および生存組織を識別する別個の分類子を決定し、各画像において全組織に適用した。

【0085】

ＢｒｄＵ免疫蛍光染色：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックの４ミクロン切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（商標）Ｐｌｕｓスライド上で回収した。切片を脱ワックス処理し、クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液中で熱誘導性抗原回収の前に再水和した。タンパク質溶液（ＳｐｒｉｎｇＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）中で切片を３０分間ブロッキング処理した後、ラット抗ＢｒｄＵ一次抗体（Ａｂｃａｍ）とともに３０分間、またはアイソタイプ対照ラットＩｇＧ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに温置した。切片をＰＢＳで十分に洗浄した後、ヤギ抗ラットＩｇＧ二次抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合物を暗環境で６０分間適用した。切片をＰＢＳで再度洗浄した後、ＤＡＰＩ含有フルオロマウントＧおよびカバースリップにおいて標本にした。Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で切片を画像化し、ＤＡＰＩ陽性領域（核）において５４６ｎｍのシグナルを含有する陽性細胞のパーセンテージに基づいて定量した。共局在実験のために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８複合物を用いて（暗環境で６０分間温置）、Ｈｎｆ４ａ（ヤギ抗マウス、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）およびＣＤ３１（ウサギ抗マウス、Ａｂｃａｍ）で二重染色を行った。

【0086】

炎症促進性サイトカインの血清および肝臓の定量化：炎症促進性サイトカインの一群（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＴＮＦ－α）は、本質的に製造業者の説明書に従って、発光ベースのＶ－ｐｌｅｘ炎症促進パネル１（マウス）キット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、マウス血清または肝臓ホモジネート中で多重化した。肝臓ホモジネートについては、ＴｉｓｓｕｅＴｅａｒｏｒホモジナイザー（ＢｉｏｓｐｅｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して、７５ｍｇ肝臓組織を冷溶解緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（ｖ／ｖ）、２ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ））中で溶解させた。粗製ホモジネートを遠心分離（２０，０００ｇ、１０分間、４℃）して細胞片を除去した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ法を用いて上清についてタンパク質濃度を決定した。サイトカイン定量のために、２５μＬの血清または１００μｇの肝臓ホモジネートを各ウェルに添加し、５０μＬの体積で希釈剤４１と混合し、振盪プレートミキサー（６００ｒｐｍ）上で２時間温置した。ウェルを十分に洗浄した後（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ｖ／ｖ）、二次抗体のカクテルを適用した。プレートをＱｕｉｃｋＰｌｅｘＳＱ１２０アナライザー（ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でアッセイし、各分析物の標準曲線に対する線形回帰に基づいて分析物を定量した。推奨されるように２つ組で標準物質をアッセイした。アッセイ内精度が高く、生物学的複製物が多数であるため、試料を１つ組でアッセイした。

【0087】

インビトロでの超低接着性プラスチック上で適切なＢＭＤＭサイトカイン誘導性極性化を確認するための遺伝子発現分析：ＢＭＤＭを２４ウェルプラスチックプレートまたは２４ウェル超低接着性プレートにおいて細胞２．５ｘ１０^５個／ウェルで播種した。細胞を完全培地（２０ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ１を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地）中で一晩接着させた。培地を除去し、極性化を推進するために、４８時間にわたり適切なサイトカインを含む、および含まないＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で置き換えた（ｎ＝３；上記方法を参照）。製造者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からＲＮＡを回収した。ＮａｎｏｄｒｏｐＮＤ－１０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分光光度によりＲＮＡを定量し、ゲノムＤＮＡ除去段階を含むＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写を行った。ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上、３８４ウェル方式でＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて遺伝子発現を定量した。遺伝子発現は、以下の遺伝子に対して設計された市販のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて測定した：ｉＮｏｓ、Ｔｎｆ、Ｍｃｐ（ＣＡＭ用）、Ｙｍ１、Ｆｉｚｚ、Ｍｒ、Ａｒｇ１（ＡＡＭ用）およびＩｌ１０（ＤＡＭ用；Ｉｌ－１０－ＢＭＤＭ）。ハウスキーピング遺伝子として１８ＳｒＲＮＡを用いて、ナイーブＢＭＤＭに対して、２－ΔΔＣＴ法を使用して、相対的発現を決定した。

【0088】

ＡＰＡＰ処置マウス由来の肝臓組織における炎症促進性遺伝子発現分析のための遺伝子発現分析：およそ１０ｍｇの凍結肝臓組織を秤量し、組織ティアラ－（ｔｉｓｓｕｅｔｅａｒｏｒ）を用いて９００μＬＱｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。クロロホルム（２００μＬ）を添加し、手作業で混合し、温置した（５分間、室温）。遠心分離（１２０００ｇ、１５分、４℃）後に水相においてＲＮＡを除去し、イソプロピルアルコールで沈殿させた。エタノール洗浄後、ＲＮＡｓｅ不含水を用いて風乾ペレットからＲＮＡを再懸濁した。ＲＮＡを定量し、ＤＮａｓｅ処理し、記載のように逆転写した。遺伝子発現分析のために、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ７、Ｃｃｌ１２、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ－６、ＴｎｆおよびＴｇｆβに対するＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。Ｇａｐｄｈをハウスキーピング遺伝子とした。

【0089】

食作用アッセイ：食作用を調べるために、非極性化ＢＭＤＭ（ナイーブ）、ＣＡＭまたはＡＡＭを使用した。ＢＭＤＭをアポトーシス胸腺細胞（以前のように（２６）３～５週齢のＣ５７ＢＬ６マウスから採取し、１μＭヒドロコルチゾンで処理した初代胸腺細胞とともに温置した。製造者の説明書に従い、ＣＭＴＭＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアポトーシス胸腺細胞を標識した（２７）。３７℃または４℃で１：５の比率で３０分間、１時間または２時間、ＢＭＤＭに標識アポトーシス細胞を負荷した。細胞を洗浄し、抗ＣＤ１１ｂＢＶ６５０（クローンＭ１／７０；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗Ｌｙ６ＣＶ４５０（クローンＨＫ１．４；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した後、フローサイトメトリーにより食作用を確認した。食作用は、３７℃でのＣＤ１１ｂ＋ＣＭＴＭＲ＋細胞のパーセンテージマイナス４℃でのＣＤ１１ｂ＋ＣＭＴＭＲ＋細胞のパーセンテージとして計算した。Ｌｙ６Ｃ＋細胞のパーセンテージは、３７℃でＣＤ１１ｂ＋ＣＭＴＭＲ＋細胞のゲートにおいて計算した。ＣＭＴＭＲに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、同じ条件で同じゲートにおいて計算した。データはＬＳＲＩＩＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。

【0090】

リアルタイム実験のための食作用アッセイ：マウスＢＭＤＭまたはｈＭＤＭを９６ウェルＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒマイクロプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において一晩播種し（１ｘ１０^５個／ウェル）、その後、適切なサイトカインで刺激して（上記方法を参照）、極性化を推進した。イメージングの前に、製造者の説明書に従い、ＢＭＤＭをＮｕｃＢｌｕｅ生細胞染色剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＣｅｌｌＭａｓｋＤｅｅｐＲｅｄ原形質膜染色剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。プレートをＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移し、３７℃および５％ＣＯ_２で平衡化させた。製造者の説明書に従い、ウェルにｐＨｒｏｄｏｇｒｅｅｎｚｙｍｏｓａｎｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加することによって食作用を開始させた。最長１５０分間バイオ粒子を添加する前および添加した後５分間隔で、蛍光画像をＤＡＰＩチャネル、４８８ｎｍおよび６４７ｎｍで撮影した。画像をＣｏｌｕｍｂｕｓ画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で定量した。５００を超える蛍光強度（４８８ｎｍ）に基づいて食作用に対して陽性のマクロファージを分類し、全生細胞（ＮｕｃＢｌｕｅ陽性細胞）の割合として表した。群あたり４個の別個のウェルから平均割合値を取った。

【0091】

肝臓消化、白血球単離およびフローサイトメトリー：インビボで移植ＡＡＭの局在および表現型を調べるために、ＣＦＳＥ染色ＡＡＭまたはビヒクルをＡＰＡＰ投与から１６時間後にマウスに移植した。３時間後、マウスに対してＰＫＨ２６ＰＣＬ（１００μＬ、０．１ｍＭ）のｉ．ｖ．注射を行い、貪食細胞を標識した。３６時間で、ＥＤＴＡチューブにおいて屠殺マウスから血液を採取し、血液学的分析のためにＣｅｌｌｔａｃαアナライザー（日本光電）ですぐに処理した。遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を介して残りの血液から血漿を採取し、凍結した。僅かに変更を加えて、以前に記載の方法（１５、２８）に従って肝臓を消化した。簡潔に述べると、肝臓にＰＢＳを灌流させ、ＡＰＡＰ投与の３６時間後に左側葉を氷冷ＲＰＭＩ培地中で回収した。５ｍＬ肝臓消化酵素カクテル（コラゲナーゼＶ、Ｓｉｇｍａ、０．８ｍｇ／ｍＬ；コラゲナーゼＤ、Ｒｏｃｈｅ、０．６３ｍｇ／ｍＬ；ディスパーゼ、Ｇｉｂｃｏ、１ｍｇ／ｍＬ；ＤＮａｓｅ１、Ｒｏｃｈｅ、１００μｇ／ｍＬ）中で葉をメスにより機械的に破壊した。ホモジネートを振盪インキュベーター中にて３７℃、２４０ｒｐｍで２５分間消化した。肝臓消化物を７０μｍフィルターに通し、ＲＰＭＩで３０ｍＬにした。消化物を遠心分離し（３００ｇ、５分間、４℃）、赤血球溶解処理（Ｓｉｇｍａ）の前に洗浄した。細胞数を数え、適切な対照（すなわち、未染色、蛍光マイナス１）とともに細胞表面マーカーを標的とするための抗体の一群を用いて染色した。細胞を１０％マウス血清とともに４℃で２０分間温置することによって非特異的抗体結合を阻止し、続いて一次抗体の組み合わせ（それぞれ１：２００希釈で使用）とともに４℃で２０分間温置した。以下の複合抗体を使用した：ＣＤ１１ｂＢＶ６５０（クローンＭ１／７０；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｌｙ－６ＣＶ４５０（クローンＨＫ１．４；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５．２ＡＦ７００（クローン１０４；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｆ４／８０ＡＰＣ（希釈率１：１００；クローンＢＭ８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌｙ－６ＧＰＥ－Ｃｙ７（クローン１Ａ８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３ＰＥ－Ｃｙ７（クローン１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＮＫ１．１ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＰＫ１３６；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９ＰＥ－Ｃｙ７（クローン６Ｄ５；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞生存率は、製造者のプロトコールに従って、ＦｉｘａｂｌｅＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅｅＦｌｕｏｒ７８０（１：１０００、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて評価した。抗体染色後、ＬＳＲＩＩＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターで分析する前に、試料をすぐに分析するか、またはＢＤＣｅｌｌＦｉｘ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定した。ＦｌｏｗＪｏ１０ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを分析した。

【0092】

統計：データは全て、別段の断りがない限り、平均±標準偏差として表す。統計学的検定については、スチューデントのｔ検定を２群のパラメトリックデータに対して行い、マン－ホイットニーＵ検定を２群のノンパラメトリックデータセットに対して行った。複数群を含むデータセットについては、パラメトリックデータセットに対して一元配置ＡＮＯＶＡを行った。データセットが正規分布するか否かを判断するためにシャピロ－ウィルク検定を使用した。全ての統計はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）で行った。

【0093】

結果

【0094】

ＢＭＤＭは静脈内投与後迅速に脾臓および肝臓に向かう：インビボおよびエクスビボイメージング技術を使用して、健常マウスおよびＡＰＡＰ中毒マウスにおけるＢＭＤＭの初期体内分布を監視した。肝臓への局在を監視するために、ＢＭＤＭをＶｉｖｏｔｒａｃｋ６８０（蛍光赤外造影剤）で標識して、およびＶｉｖｏｔｒａｃｋ６８０なしで、ＡＰＡＰ投与１６時間後のマウスまたは健常対照に移植した（５ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）。健常マウスおよびＡＰＡＰ処置マウスの上腹部における蛍光シグナルのほぼ直線状の蓄積が最初の４時間にわたって観察され、このことから、１つ以上の腹部臓器において徐々に局在することが示唆される（図１Ａ、Ｂ）。ＢＭＤＭはＶｉｖｏｔｒａｃｋ標識に十分に耐容性であり、標識後のＡＴＰレベルの有意な低下は見られなかった（図１Ｃ）。さらに、蛍光顕微鏡から、ＧＦＰ陽性ＢＭＤＭは、４８８ｎｍでのみ可視的である非標識細胞と比較して、細胞をビボトラック標識した後に強く均一な赤外蛍光シグナルを呈することが示された（図１Ｄ）。エクスビボ分析から、ＢＭＤＭ投与の４時間後に、健常マウスおよびＡＰＡＰ処置マウスにおいてＢＭＤＭの肝臓および脾臓局在が確認された（図１Ｅ）。静脈血通過に対する障壁として作用すると思われる肺においても実質的なシグナルが観察された。定量により、肝臓局在が健常マウスにおいてより高く、一方で脾臓局在は同等であったことが示された（図１Ｆ）。最後に、顕微鏡アプローチを使用して、ＢＭＤＭをインビトロでＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、ＡＰＡＰの１６時間後に移植し、３６時間で処分した。ＣＦＳＥ染色細胞は、ＦＩＴＣに対してＤＡＢに基づく免疫組織化学染色を用いて検出された。ＤＡＢ陽性細胞は、典型的なマクロファージ形態を有するＦＦＰＥ切片において脾臓および肝臓で検出されたが（図１Ｇ）、肺、心臓または脳では検出されなかった（データは示さない）。肝臓および脾臓のＢＭＤＭ局在は、健常動物およびＡＰＡＰ中毒動物において観察され、一部のＢＭＤＭは壊死病変に局在し、これは中心静脈周囲の散在性のバックグラウンドＤＡＢ染色によって可視化された（図１Ｇ）。

【0095】

ＡＡＭ処置は、ＡＰＡＰ処置マウスにおいて壊死領域を縮小させる：ＡＬＩを処置するためのＢＭＤＭの治療可能性を試験するために、本発明者らは、ＡＰＡＰ投与後およそ１２時間でピークに達するピーク肝損傷壊死につながるＡＰＡＰ誘発性肝損傷のマウスモデルを使用した。健常動物におけるＢＭＤＭ移植単独では、臨床化学検査中に日常的に測定される循環肝臓バイオマーカー（図８）へのいかなる顕著な撹乱も起こらなかった。本発明者らは、未処理（ナイーブ）ＢＭＤＭ（１ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）がＡＰＡＰ投与後すぐに（４時間）与えられた損傷を軽減し得るか否かを試験した。ＡＰＡＰの２４時間後に血清トランスアミナーゼの減少がないことにより証明されるように、ナイーブＢＭＤＭ療法はＡＰＡＰの４時間後では治療的利益がなかった（ＡＰＡＰ／ＰＢＳ対ＡＰＡＰ／ＢＭＤＭ；ＡＬＴ：６３６５±２９５５対１０６０３±７９７４Ｕ／Ｌ、ＡＳＴ：６３３３±３１３８対７０６８±５５８４Ｕ／Ｌ）（図９）。また、ＢＭＤＭ処置群の２匹のマウスは、過剰な表現型を示した後、人道的な理由で早期に処分した。したがって、本発明者らは、再生期中にＡＰＡＰ投与（１ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）の１６時間後にＢＭＤＭを移植した。ＢＭＤＭは、組み換え因子を用いてインビトロで異なる表現型に極性化させた。ＡＰＡＰから３６時間後の血清ＡＬＴは、全ＢＭＤＭ処置群においてやや低かった（図２Ａ、ＰＢＳ：３８００±１９３４Ｕ／Ｌ対ナイーブ：２７３７±２０２０、ＣＡＭ：２４１３±１２２２、ＡＡＭ：２２４８±１１９６、ＤＡＭ：２９９３±２１８２）が、統計学的有意性には達しなかった。血清トランスアミナーゼは比較的長い循環半減期を有し、その後の損傷によってなお上昇し得るので、本発明者らは３６時間で採取した肝臓組織に対してヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。画像解析ソフトウェアを用いてＡＰＡＰにより引き起こされる小葉中心壊死を定量し、壊死領域を全肝臓組織のパーセンテージとして表した。ＡＡＭで処置したマウスは、壊死領域の６０％の縮小を示した（図２Ｂ、Ｐ＜０．０３）。

【0096】

ＡＡＭ処置は、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷後に実質および非実質増殖を誘発する：本発明者らは、マクロファージ療法の２０時間後（ＡＰＡＰの３６時間後）の肝臓におけるＢｒｄＵ取り込みを測定した。増殖細胞を標識するために、処分の１時間前にマウスに１ｍｇのＢｒｄＵを適用した（ｉ．ｐ．）。免疫蛍光（ＩＦ）切片をハイコンテンツイメージングシステムでイメージングし、バックグラウンド染色を無視するためにＤＡＰＩ染色核との共局在化によりＢｒｄＵ陽性を確認した。ＩＦ分析から、ＡＡＭ療法後に肝臓において増殖細胞の８．４倍の増加（Ｐ＜０．０５）が示された（図３Ａ）。増殖細胞はまた、ＣＡＭで処置したマウスでも８．５倍多かった（Ｐ＝０．０３）が、ＤＡＭ処置では増加せず、より多かったものの統計学的有意性には達しなかった。ＡＡＭ処置マウスにおける増殖細胞の正体を理解するために、本発明者らは、Ｈｎｆ４ａ（肝細胞マーカー）およびＣＤ３１（内皮マーカー）を用いて二重染色を行った。本発明者らは、ＣＤ３１と密接に結び付いた中心静脈周囲の非実質細胞の寄与とともに、殆どのＢｒｄＵ陽性細胞がＨｎｆ４ａと共局在していたことを観察した（図３Ｂ）。

【0097】

循環炎症促進性サイトカインの一群は、ＡＰＡＰ誘発性肝損傷後の極性化マクロファージ処置マウスにおいてより低い：本発明者らは、マクロファージが損傷後の炎症反応を軽減して治癒を促進すると仮定した。これを調べるために、本発明者らは、電気化学発光技術を使用して、３６時間で採取したマウス血清中の炎症性サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＫＣ／ＧＲＯ、ＴＮＦ－α）の１０プレックス（１０－ｐｌｅｘ）パネルを測定した。一貫して、ＡＡＭは炎症促進性サイトカインの一群の実質的な減少を示し、ＩＦＮ－γ（８２％、Ｐ＜０．０１）、ＩＬ－１２ｐ７０（７３％、Ｐ＝０．０２）、ＩＬ－６（７５％、Ｐ＜０．０１）、ＣＸＣＬ１（３６％、Ｐ＜０．０１）およびＴＮＦα（２７％、Ｐ＜０．０１）の減少を示した（図４）。両方のＣＡＭで処置したマウスにおいても循環炎症促進性サイトカインの減少が観察された－ＩＦＮ－γ（８８％、Ｐ＝０．０３）、ＩＬ－６（８０％、Ｐ＝０．０１）、ＣＸＣＬ１（４５％、Ｐ＜０．０１）およびＴＮＦα（３９％、Ｐ＜０．０１）－およびＤＡＭ－ＩＦＮ－γ（８６％、Ｐ＜０．０１）、ＩＬ－６（６４％、Ｐ＝０．０１）、ＣＸＣＬ１（３５％、Ｐ＜０．０１）、ＴＮＦα（２３％、Ｐ＝０．０２）。さらに、ナイーブＢＭＤＭで処置したマウスは、極性化同等物よりも程度は低いが、一部の炎症促進性マーカーの減少を示した－ＩＦＮ－γ（７３％、Ｐ＜０．０１）、ＣＸＣＬ１（３６％、Ｐ＜０．０１）、ＴＮＦ（２３％、Ｐ＜０．０１）。これらのデータから、ＡＰＡＰ中毒の再生期中に投与されたマクロファージが、特にＡＡＭで処置されたマウスにおいて抗炎症反応を発揮することが示される。

【0098】

さらに、本発明者らは、ｑＰＣＲを介した、炎症および／または修復に関連する肝臓組織全体における遺伝子の一群（Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ７、Ｃｃｌ１２、Ｃｘｃｌ１、Ｃｘｃｌ２、Ｉｌ－６、ＴｎｆおよびＴｇｆβ）の発現を測定した。これから、ビヒクル対照に対して、ＡＡＭ処置マウスにおける生存促進性Ｃｓｆ１遺伝子発現の平均２．３倍の増加（Ｐ＜０．０１）が示された（図６）。これと一致して、本発明者らが観察した唯一の有意な変化は、炎症促進性遺伝子Ｃｘｃｌ１（２．４倍、Ｐ＜０．０５）およびＩｌ－６（５．８倍、Ｐ＜０．０５）の減少を示した同じ動物群においてであった。このデータは、ＡＡＭのみが壊死領域の有意な縮小をもたらす、群間で観察された組織学的差異を説明する（図３Ｂ）。さらに、炎症促進性サイトカインＣｘｃｌ１およびＩＬ－６の遺伝子発現データは、タンパク質レベルでの循環プロファイルを反映する（図５）。

【0099】

ＡＡＭはインビトロで食作用速度および能力の増大を示す：本発明者らは、インビトロで異なる表現型に極性化されたＢＭＤＭの食作用を測定した。極性化ＢＭＤＭを蛍光標識アポトーシス胸腺細胞と温置した後、本発明者らは、３０分間の食作用後により多くのＡＡＭが貪食したという有意でない傾向を観察した（ナイーブに対して１１％の増加、Ｍ１に対して７．３％の増加）が、この差は６０分および１２０分後には定常に達した（図６Ａ）。さらに、他の群に対して３０分でＡＡＭにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）の有意な上昇（ナイーブに対して２１％の上昇、ＣＡＭに対して７５％の上昇、ヒストグラムにおいてデータをプロット）および６０分でＣＡＭマクロファージに対して６４％の上昇があった。細胞数に対して正規化した後のＡＡＭにおけるより高いＭＦＩ（ＣＡＭに対して６７％の上昇）が観察される。古典的炎症性骨髄表面マーカーである炎症マーカーＬｙ６Ｃを発現するＢＭＤＭのパーセンテージを測定した。ＡＡＭは、３０分（ナイーブに対して２２％低下、ＣＡＭに対して３４％低下）、６０分（ナイーブに対して４４％低下、ＣＡＭに対して５２％低下）および１２０分（ナイーブに対して６１％低下、ＣＡＭに対して７２％低下；図６Ｂ）でＬｙ６Ｃ陽性細胞のパーセンテージが有意に低い。

【0100】

極性化ＢＭＤＭを用いてザイモサン（酵母中に存在するグルカン）で被覆されたｐＨ感受性蛍光マイクロビーズの食作用を監視するためのリアルタイム食作用アッセイを行った。フローサイトメトリー分析と一致して、経時的にＡＡＭ中のｐＨｒｏｄｏ陽性細胞のパーセンテージの増加が観察され、それは９０分に近づくにつれて定常に達していった（図６Ｃ）。ナイーブおよびＣＡＭと比較した、ＡＡＭにおける貪食率および能力の上昇を示す代表的な画像が提供される（図６Ｄ）。

【0101】

ＡＡＭは、食作用性が高く、インビボで抗炎症性表現型を保持する：移植後のＡＡＭを特徴付けるためにインビボ食作用実験を行った。ＡＰＡＰ投与の１６時間後に、ＣＦＳＥ標識ＡＡＭをマウスに移植した（５ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）。３時間後、内在性および外来性マクロファージを標識するために、ＰＫＨ２６（貪食細胞の特異的標識のための赤色蛍光色素）のｉ．ｖ．投与をマウスに対して行った（試験計画については図７Ａを参照のこと）。ビヒクルのみを投与されたマウスにおいて肉眼的な組織学的異常が観察され、これは、ＡＡＭ処置マウスでは殆ど存在しなかった点状の出血性壊死領域を特徴とした（図７Ｂ）。血清化学分析から、ＡＡＭ処置マウスにおいて血清トランスアミナーゼの有意な減少（５９％低いＡＬＴ、７５％低いＡＳＴ）が示された（図７Ｃ）。

【0102】

ＢＭＤＭ処置マウスの肝臓における浸潤性炎症性マクロファージのパーセンテージの、中程度であるが統計学的に有意な減少が観察され（図７Ｄ）、これは、これらの炎症性細胞における貪食細胞の増加傾向に対応した（Ｐ＝０．０８）。ｉ．ｖ．移植の２０時間後に肝臓と血液の両方における移植ＡＡＭが検出され、これは肝臓消化中に採取された肝臓白血球のおよそ１％を占めた（図７Ｅ）。移植ＡＡＭのうち、検出されたものの８３％がＬｙ６Ｃｌｏであり、このことから、これらの細胞がインビボでそれらの抗炎症性表現型を保持していることが確認された（図７Ｆ）。それらのＬｙ６Ｃ発現に基づいてＰＫＨ２６を貪食した移植細胞のパーセンテージを測定した。Ｌｙ６Ｃｈｉ細胞の７０％およびＬｙ６Ｃｌｏ細胞の９８％超がＰＫＨ２６陽性であり、このことから、移植ＡＡＭがインシトゥで高度に食作用性であることが示唆される。
考察

【0103】

ＡＰＡＰ中毒は、来院の一般的な理由であり、米国および英国で年間何千もの緊急入院の主要因である。処置の中心は、広範囲の傷害が起こる前に肝臓において抗酸化能を高めるために、スルフヒドリル供与体であるＮＡＣを早期に投与することを含む。しかし、この解毒療法の有効性は、肝臓壊死が既に確立され得る、遅れて来院する患者では著しく低下する。ＡＰＡＰ中毒は、米国におけるＡＬＦの主な原因に相当し、肝臓移植が唯一の有効な治療法である。したがって、ＡＬＦのリスクを低下させるために、真正の肝損傷を有する患者を処置するための新規治療ストラテジーを特定し、開発することが臨床的に必要とされる。さらに、ＡＬＩからの回復を促進し、付随する費用および臨床的支出を減少させるための処置もまた非常に有益である。

【0104】

本発明者らは、肝損傷に対する可能性のある細胞療法（ＡＬＩなど）を試験した。マクロファージは、インビボでアポトーシスおよび壊死細胞の両方のクリアランスに関与する。しかし、ＫＣ（肝臓常在マクロファージ）はＡＰＡＰ－ＡＬＩ中に枯渇するようになり、自然免疫の障害が起こる（８）。マクロファージは、糖尿病（３０）、腎線維症（３１）、肺障害（３２）および悪性腫瘍（３３）を含む他の疾患適応症に対する可能性のある細胞療法として既に研究されてきたが、肝損傷（ＡＬＩなど）に関してはまだ評価されていない。潜在的な凝固障害のため、ＡＰＡＰモデルでは侵襲的外科手術は実用的ではないが、疾患の劇症性ゆえに損傷部位に治療を迅速に施すことが不可欠である。したがって、本発明者らは、健常マウスおよびＡＰＡＰ中毒マウスにおいて４時間以内にＢＭＤＭを肝臓および脾臓に静脈内送達した（尾静脈経由）。本発明者らは、健常対照と比較して、ＡＰＡＰ処置マウスにおけるＢＭＤＭ生着の減少を観察した。これは、ＡＰＡＰ－ＡＬＩの特徴である、微小環境への浸潤または肝微小循環の撹乱が原因であり得る（３４）。肺は、ｉ．ｖ．注射後の細胞にとって別の障害物であるが、マクロファージは、サイズが比較的小さいため、末梢投与に適している。実際に、本発明者らは、投与の２０時間後に肺においてマクロファージを全く観察せず、このことから、ボーラス注射後の肺での局在が一時的であることが示唆された。それにもかかわらず、肺塞栓症は依然として安全上の懸念事項である。したがって、他の非侵襲的投与経路を使用し得る。健常マウスにおける１ｘ１０^６個のＢＭＤＭのｉ．ｖ．投与は安全であると思われ、この投与の結果、血液化学のいかなる指標も変化せず、細胞５ｘ１０^６個の送達時にＡＰＡＰ処置マウスにおいて何れの血液学的パラメーターも変化しなかった（データは示さない）。

【0105】

ＡＰＡＰ－ＡＬＩ中の肝細胞死は、炎症性メディエーターの放出および危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、例えばＨＭＧＢ１などを通じた自然免疫系の活性化の刺激事象である（３５）。自然免疫系の全身的活性化が制御されないと、臨床転帰の重要な決定要因であるＳＩＲＳとして臨床的に認識されている、多臓器不全および死亡につながり得る（７）。本発明者らのマウスモデルにおけるＡＡＭの投与は、ヒトＡＬＦ中に上昇することが知られている循環炎症促進性サイトカイン減少につながった（３６、３７）。さらに、ＡＰＡＰ－ＡＬＩでは壊死性物質の除去が遅れ得るが、それは、内在性ＫＣが最初の損傷中にも失われ、その結果、肝臓の自然免疫能が低下するからである（８）。貪食細胞の養子移植を介したこの自然免疫能の補充は、全身性炎症を軽減し、ＡＬＦへの進行を予防するために、死にかけている細胞から、または腸由来病原体から放出される炎症シグナルを制限し得る。肝損傷に対するマクロファージ療法の安全性に関する潜在的な懸念の１つは、移植されたマクロファージ自体が炎症促進性になり、炎症および損傷を増悪させる可能性があることであるが、本発明者らは、選択的活性化表現型へと培養中に一旦刺激されると、移植されたＡＡＭが少なくとも２０時間にわたりインビボでそれらの抗炎症性の表現型を保持したことを見出した（図７Ｆ）。

【0106】

ＡＰＡＰ－ＡＬＩ後の肝再生は損傷の消散における重要な特性である。本発明者らは、ＡＰＡＰから３６時間後、増殖細胞数が８倍増加したことを見出し、このことから、ＡＡＭ療法が再生反応を加速させることが示唆される。これにより、ＡＡＭが肝損傷の様々な原因を処置するのに有用であり得ることが明らかとなる。

【0107】

二重染色から、増殖細胞が肝細胞（Ｈｎｆ４ａ陽性）および内皮（ＣＤ３１陽性）起源のものであったことが明らかになった。小葉中心性肝細胞は、これらのＣＹＰ２Ｅ１陽性細胞が、最終的に細胞死を引き起こす、ＡＰＡＰの毒性代謝産物であるＮ－アセチル－ｐ－ベンゾ－キノンイミン（ＮＡＰＱＩ）を生成するので、主な損傷部位である。しかし、肝類洞内皮細胞がＡＰＡＰ－ＡＬＩ中に撹乱されるようになることも知られている（３８、３９）。実質および血管系の両方の再生は、おそらく肝臓のＡＡＭ介在性修復中の重要な機序である。

【0108】

理論に縛られることを望むものではないが、本発明者らは、ＡＡＭがそれらの高度に食作用性の表現型ゆえに壊死物質を除去するという仮説を立てる。食作用能の低下を示すＣＡＭもまた、ＡＡＭよりも程度は低いが、炎症を部分的に軽減し、増殖を刺激した。移植されたＢＭＤＭが治療セクレトームを提供し、炎症を軽減するかまたはインシトゥで肝臓再生を促進するための栄養因子を送達することが可能である。

【0109】

肝臓中の移植されたＢＭＤＭの寿命は一過性であると思われる。以前の研究から、移植されたＢＭＤＭが、直接肝門脈注射を介して線維性肝臓において移植後少なくとも７日間にわたり検出可能であることが示されている（１８）。本発明者らのグループはまた、健常マウスで３週間を超えずにＭＲＩを介してＢＭＤＭを検出するためにＳＰＩＯＮも使用した。（データは示さない）。これらの細胞の一過性の性質は、肝臓がその正常な生理的状態に戻ることを可能にする数週間にわたって移植細胞を自然に除去できるようにするのに有益であり得る。治療域は移植後の最初の４８時間以内に存在すると思われるので、この療法の一過性の性質も懸念事項ではない。それでもなお、必要に応じて複数回のＢＭＤＭ投与を比較するため、または塞栓症のリスクを低下させるためにＢＭＤＭの持続注入を提供するために、この細胞に基づく治療の薬物動態を最適化し得る。

【0110】

ＡＰＡＰ中毒は、圧倒的に迅速にＡＬＦにつながり得る医学的緊急事態である。これは、細胞採取、増殖、特徴評価および再注入のための時間を見込む処置前後の数週間および数か月にわたりに患者を監視し得る肝線維症などの他の肝疾患とは対照的である。ＡＬＩを伴う緊急臨床状況の場合には、ＡＡＭを集中治療室で直ちに投与し得るように既存のマクロファージバンクを設定し得る。幹細胞分野における大きな進歩から、最近、主要同等物（ｐｒｉｍａｒｙｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）の生物学および機能を再現するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のマクロファージが記載された（４０～４２）。これらの細胞由来のＡＡＭは生細胞療法に相当し得ると想定される。

【0111】

まとめると、本発明者らは、定められた因子によりＢＭＤＭを高度に食作用性の表現型に極性化することによって、これらの細胞が、細胞増殖を刺激し、全身性炎症を軽減し、肝損傷における壊死性病変を改善する（例えばＡＰＡＰ－ＡＬＩの再生期間中）ための細胞療法となり得ることを示した。ＡＡＭは、応用の可能性がある、肝組織修復を促進するための有望な細胞療法に相当し得る。

【0112】

実施例２：マウス胚性幹細胞由来マクロファージ（ＥＳＤＭ）

【0113】

キーポイント：
・ＥＳＤＭは、肝損傷マウスモデルにおける線維症を軽減し、ＢＭＤＭ療法に伴いみられる特性である細胆管反応を刺激した。
・ＥＳＤＭは組織常在マクロファージと幾分類似しており、これはおそらくそれらの発生起源を反映する。
・ＥＳＤＭは、リポソームクロドロネートを用いてマクロファージを枯渇させたマウスのクッパー細胞区画を再配置させた。
・食作用を定量するために新しいライブ細胞イメージング技術が開発され、これを用いて、本発明者らは、胚性幹細胞由来および骨髄由来マクロファージの食作用指標の違いを実証する。

【0114】

本発明者らは、マクロファージの純粋な集団がインビトロで大規模にマウスＥＳＣから産生され得ること、およびこれらの細胞が、肝線維症のマウスモデルにおいてインビボで修復能を有することを実証する。ＥＳＣ由来マクロファージは、食作用活性において、および重要な機能的マーカーの発現においてそれらの骨髄由来の対応物と区別され得、これは、ＰＳＣ由来マクロファージがクッパー細胞およびランゲルハンス細胞を含む組織常在マクロファージに発生学的な面で関連することを示唆する最近の研究を裏付ける（Ｂｕｃｈｒｉｅｓｅｒ，Ｊ．，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．＆Ｍｏｏｒｅ，Ｍ．Ｄ．ＨｕｍａｎＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌ－ＤｅｒｉｖｅｄＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓＳｈａｒｅＯｎｔｏｇｅｎｙｗｉｔｈＭＹＢ－ＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＴｉｓｓｕｅ－ＲｅｓｉｄｅｎｔＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ８，３３４－３４５）。本発明者らは、ＥＳＣ由来マクロファージが、マクロファージ枯渇肝臓のクッパー細胞区画を効率的に再配置可能であり、したがって組織修復における組織常在マクロファージの役割を研究するための有効なストラテジーを提供することを示す。

【0115】

結果

【0116】

胚性幹細胞由来および骨髄由来マクロファージの比較

【0117】

本発明者らは自身が公表した方法を使用して胚性幹細胞（ＥＳＣ）からマクロファージを作製し（Ｚｈｕａｎｇ，Ｌ．ｅｔａｌ．Ｐｕｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｍｕｒｉｎｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｆｒｏｍｃｕｌｔｕｒｅｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｓｔｕｄｉｅｓｏｆｃｈｅｍｏｔａｘｉｓａｎｄａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｃｌｅａｒａｎｃｅ．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３８５，１－１４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１２．０６．００８（２０１２））、それらの表現型および機能を、初代マクロファージの代表的な起源である古典的な骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）と直接比較した。簡潔に述べると、ＥＳＣをＣＳＦ－１およびＩＬ－３の存在下で増殖させて胚様体（ＥＢ）を形成させた。ＥＢは組織培養プラスチックに接着し、非接着性マクロファージ前駆細胞を培地に放出する。これらの細胞を採取し、ＣＳＦ－１のみの存在下で未処理のペトリ皿に播種する。それらはプラスチックに付着し、単層を形成するマクロファージを生じさせる。胚性幹細胞由来マクロファージ（ＥＳＤＭ）およびＢＭＤＭは同等の形態を有したが、ＥＳＤＭはＢＭＤＭよりも僅かにサイズが大きいと思われた（図１６Ａ～Ｃ）。フローサイトメトリー分析から、９０％を超えるＥＳＤＭがマクロファージマーカー、Ｆ４／８０およびＣＤ１１ｂについて二重陽性であったこと、および分化過程（第１０日～２０日）の間の異なる時点に由来する細胞が同等レベルの細胞表面マーカー発現を示したことが明らかになった（図１６Ｅ、Ｆ）。比較すると、ＢＭＤＭの集団では二重陽性Ｆ４／８０およびＣＤ１１ｂ細胞のパーセンテージが僅かに低く、このことから、このプロトコールで作製されたＢＭＤＭはＥＳＤＭよりも不均一であったことが示された（図１６Ｄ、Ｆ）。

【0118】

ＥＳＤＭおよびＢＭＤＭの食作用活性を比較するために、本発明者らは、完全に自動化され、したがってイメージングおよび分析からの操作者によるバイアスがない、ＯｐｅｒｅｔｔａＨｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、新たなライブイメージングアッセイを開発した。このアッセイにおいて、酸性の細胞内環境内でのみ蛍光を発するｐＨ感受性ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓを使用した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。このアッセイにより、本発明者らは、生体粒子の量ならびに取り込み速度をリアルタイムで定量化することが可能となった。ＤｅｅｐＲｅｄＰｌａｓｍａＭｅｍｂｒａｎｅ染色剤およびＮｕｃＢｌｕｅＬｉｖｅＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ試薬で細胞を染色し、ｐＨｒｏｄｏ（商標）生体粒子とともに温置し、ＯｐｅｒｅｔｔａＨｉｇｈ－ＣｏｎｔｅｎｔＳｙｓｔｅｍを用いて２．５時間にわたり５分ごとに画像化した（図１６Ｇ、Ｈ）。蛍光を発する細胞数の増加が両細胞タイプにおいて経時的に観察されたが、ＥＳＤＭの食作用速度はＢＭＤＭよりも有意に低かった（図１６Ｉ）。フローサイトメトリーを用いた本発明者らの以前の研究から、ＢＭＤＭとＥＳＤＭとの間で食作用活性に有意差がなかったことが示されたが、一方でこの高感度のリアルタイムストラテジーによって微妙な差が明らかになった。

【0119】

それらをそれぞれＬＰＳおよびＩＦＮγまたはＩＬ－４で処理することによって、Ｍ１またはＭ２様表現型となるようにＥＳＤＭおよびＢＭＤＭをインビトロで刺激した。ＢＭＤＭおよびＥＳＤＭの両方からのＬＰＳ／ＩＦＮγ刺激時の一酸化窒素（ＮＯ）産生の有意な増加があったが、ＥＳＤＭの活性化レベルはＢＭＤＭほど高くなかった（図１７Ａ）。これは、ＥＳＤＭにおけるＭ１関連遺伝子、ｉＮｏｓおよびＣｄ８６の発現レベルがより低いことによって確認された（図１７Ｂ、Ｃ）。対照的に、ＩＬ４に対するＥＳＤＭの反応は、Ｍ２関連遺伝子、Ａｒｇ１およびＦｉｚｚ１の発現増加によって評価されるように、ＢＭＤＭよりも有意に高かった（図１７Ｄ、Ｅ）。Ｔｗｅａｋ、Ｍｍｐ１２およびＭｍｐ１３などの組織再生のマーカーは、ＢＭＤＭと比較してＥＳＤＭにおいてより低く、一方Ｍｍｐ９はより高いレベルで発現された（図１７Ｆ～Ｉ）。

【0120】

本発明者らは、Ｍ１およびＭ２極性化ＥＳＤＭおよびＢＭＤＭの食作用活性を比較するために自身らの新たなイメージングストラテジーを使用した。ＬＰＳ－ＩＦＮγ刺激によって、両細胞タイプで食作用速度が低下し、ＩＬ４によって上昇したが、ＥＳＤＭはそれらの刺激を受けた培養において、ＢＭＤＭの同等の培養と比較して食作用速度がより低かった（図１７Ｊ、Ｋ）。

【0121】

まとめると、これらのデータから、ＥＳＤＭの表現型をＢＭＤＭと同等の方法で改変し得るが、極性化に対するそれらの反応の程度には僅かな違いがあることが実証される。

【0122】

肝線維症のマウスモデルにおける有効な細胞療法としてのＥＳＤＭ

【0123】

本発明者らは、次に、ＥＳＤＭが肝損傷のマウスモデルにおいて治療効果を有し得るか否かを試験した。マウスを四塩化炭素ＣＣｌ_４で週に２回、４週間にわたり処置し、その割合を無作為に選択して、第２週の始めに静脈内に１０または２０ｘ１０^６個の何れかのＥＳＤＭを投与した。ＥＳＤＭ注射の２１日後にマウスを屠殺し、肝臓を免疫組織化学用に処理した（図１８Ａ）。

【0124】

ＢＭＤＭ療法は線維症を改善することが以前に示されていたので、本発明者らは、肝コラーゲンに対するＰｉｃｒｏＳｉｒｉｕｓＲｅｄ（ＰＳＲ）染色を用いてＥＳＤＭが肝線維症にも効果があるか否かを評価した。より少ない数（１０ｘ１０^６個）のＥＳＤＭを使用した場合、線維症のレベルに有意な効果はなく（図１８Ｂ～Ｄ）、一方で、２倍という多数のＥＳＤＭを注射した場合、ＰＳＲ染色の有意な減少が観察された（図１８Ｅ～Ｇ）。筋線維芽細胞数の減少は線維症の消散中の重要な事象であり、本発明者らはまた、より高用量のＥＳＤＭで処置したマウスにおいてαＳＭＡ陽性筋線維芽細胞数が有意に少ないことにも注目した（図１８Ｋ～Ｍ）。健常で損傷がない肝臓も染色し、分析した。

【0125】

本発明者らは、対照損傷肝臓と比較して、ＥＳＤＭを注射されたＣＣｌ_４損傷肝臓において、ＰａｎＣＫ染色によってマークされる有意に多数の肝臓細管細胞を観察した（図１９Ａ～Ｆ）。以前にＢＭＤＭで観察された効果を再現するＥＳＤＭの両用量を投与された動物において、より多数のＰａｎＣＫ陽性細胞が明らかになった（Ｂｉｒｄ，Ｔ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｓｈｅｐａｔｉｃｄｕｃｔｕｌａｒｒｅａｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｉｎｊｕｒｙｖｉａｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄＴＷＥＡＫｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０，６５４２－６５４７，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１３０２１６８１１０（２０１３））。

【0126】

結論として、この研究から、ＥＳＤＭが大規模に作製され得、それらが筋線維芽細胞の密度およびその結果としてのコラーゲン沈着を減少させることによって肝損傷の影響を変化させる可能性があることが実証される。これらの実験で使用されるＥＳＤＭの細胞数は、以前の研究においてＢＭＤＭに対して使用されたものより１０倍多かった。

【0127】

ＥＳＤＭは組織常在マクロファージと同等の表現型を有するか？
インビトロでＥＳＣに由来する造血細胞は、発生中の卵黄嚢における造血の原始波（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｗａｖｅ）と関係がある血液細胞とより関連があると考えられる（Ｚａｍｂｉｄｉｓ，ＥＴ，Ｐｅａｕｌｔ，Ｂ，Ｐａｒｋ，ＴＳ，Ｂｕｎｚ，Ｆ＆Ｃｉｖｉｎ，ＣＩ２００５， ‘Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｈｅｍａｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ，ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ，ａｎｄｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅｓｔａｇｅｓｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇｈｕｍａｎｙｏｌｋｓａｃｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’ Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ１０６，ｎｏ．３，ｐｐ．８６０－８７０．ＤＯＩ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００４－１１－４５２２）。組織常在マクロファージは、造血幹細胞（ＨＳＣ）が胚において出現するかなり前の造血の原始波（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅｗａｖｅ）に由来し、重要なＨＳＣ転写因子であるＭｙｂの非存在下で発生することが知られている（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｃ．ｅｔａｌ．ＡｌｉｎｅａｇｅｏｆｍｙｅｌｏｉｄｃｅｌｌｓｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆＭｙｂａｎｄｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３３６，８６－９０，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１９１７９（２０１２））。本発明者らがマウスＥＳＤＭとＢＭＤＭとの間で観察した微妙な違いは、それらの培養条件よりもむしろそれらの起源に関連し得ると本発明者らは考えた。本発明者らは、ＭｙｂおよびＣｃｒ２がＢＭＤＭと比較してＥＳＤＭにおいてより低いレベルで発現されるのに対して、Ｐｕ．１がより高かったことを実証することによってこれを確認した（図２０Ａ～Ｃ）。したがって、ＥＳＤＭが循環単球由来細胞よりも組織常在マクロファージに近い場合、本発明者らは、内在性常在マクロファージをリポソームクロドロネートで除去した後の肝臓のクッパー細胞区画を再配置することにおいてそれらがより効率的であるという仮説を立てた。

【0128】

本発明者らは、最初に、リポソームクロドロネート処理によって実際に常在マクロファージ集団が除去されたことを確認し、外来マクロファージの添加に最適な時期を決定するために様々な時点で組織を分析した。リポソームクロドロネート処理の４８時間後に肝臓切片でＦ４／８０^＋マクロファージは観察されず、このことから、この時点までに完全な枯渇が起こったことが示される。内在性循環マクロファージが組織を再配置し始める、処置の７２時間後に、数個のＦ４／８０^＋マクロファージが明らかであった（図２０Ｐ）。

【0129】

ＥＳＤＭおよびＢＭＤＭをＣＦＳＥ細胞追跡色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、リポソームクロドロネート処理の４８時間後に細胞５ｘ１０^６個を静脈内注射した（図２０Ｄ）。肝臓、肺、腎臓および心臓組織を２４時間後に採取し、抗ＦＩＴＣ抗体（これはＣＦＳＥを含むフルオレセインの全ての誘導体を検出する）を用いた免疫染色を使用して、注射されたＣＦＳＥ染色細胞を検出した（図２０Ｅ～Ｈ、Ｒ）。ＢＭＤＭまたはＥＳＤＭの何れかを投与されたリポソームクロドロネート処理マウスに由来する肝臓切片において、ＣＦＳＥ^＋細胞が検出された。画像の定量から、ＢＭＤＭと比較してＥＳＤＭを注射されたマウスの肝臓において有意により多くのＣＳＦＥ^＋細胞があったことが実証された（図２０Ｍ）。この結果は、ＣＳＦＥ^＋細胞を同定するためのＤＡＢに基づく検出方法の定量化によって確認された（図２０Ｉ～Ｌ、Ｎ）。幾分かのＢＭＤＭおよびＥＳＤＭも肺組織において検出されたが、クロドロネート処置動物の腎臓および心臓において生着した細胞は殆どなかった。（図２０Ｒ）。

【0130】

これらのデータから、ＥＳＤＭがＢＭＤＭよりもクッパー細胞区画を再配置させる能力が高いことが示される。

【0131】

血清分析を実施して、マウスの肝機能において実施した処置の効果を評価した（図２０Ｏ、Ｐ）。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルは、ＰＢＳ対照マウスと比較して、リポソームクロドロネート処置マウスにおいて有意に上昇し、このことから肝損傷が示された。ＥＳＤＭを投与されたマウスにおいて、対照と比較してＡＬＰレベルが有意に低下し、このことから、ＥＳＤＭが幾分かの修復効果を有したことが示された。ＥＳＤＭレシピエントマウスの血清アルブミンレベルもまた健常対照と同等であった。

【0132】

次に、本発明者らは、培養した胚性幹細胞由来のマクロファージが初代マクロファージの治療効果を再現して、アセトアミノフェン誘発性肝損傷を改善し得るか否かを調べた。本発明者らは、１６時間での単回ｉ．ｖ．注射（細胞５ｘ１０^６個）を介して、アセトアミノフェン誘発性肝損傷モデルにおけるマウスＥＳＤＭの治療効果を試験した。本発明者らは、血清化学マーカーにおいて有意差を認めなかったが（図２１）、本発明者らは、Ｈ＋Ｅ染色によって評価されるように壊死領域の有意な縮小を認めた（図２４）。ＢＭＤＭと同様に、ＥＳＤＭは、ＩＬ－４／ＩＬ－１３を用いて一晩極性化させた後、選択的活性化のマーカー（Ｙｍ－１、Ｆｉｚｚ、ＭＲ、Ａｒｇ－１）に対する遺伝子発現において非常にダイナミックな切り替えを示し、このことから、これらのシグナル伝達経路がこれらの細胞においてインタクトであることが確認された（図２２）。さらに、極性化ＥＳＤＭは、肝損傷モデルにおけるこれらの細胞の提案された治療機序であるアポトーシス物質の貪食性摂取の能力があることが示された：本発明者らは、極性化ＥＳＤＭがインビトロで蛍光標識アポトーシス胸腺細胞を容易に貪食し得ることを実証する（図２３）。最後に、本発明者らは、細胞追跡を介して、ＢＭＤＭと同様にＥＳＤＭがｉ．ｖ．注射後すぐに肝臓および脾臓に集合することを示す（図２５）。結果から、ＥＳＤＭが急性肝損傷のモデルにおいて初代ＢＭＤＭと類似の治療能を有することが示される。

【0133】

考察

【0134】

本発明者らは、マクロファージ貪食能を評価するためのライブイメージングアッセイを開発した。これにより、本発明者らが、最終的に貪食された粒子数だけでなく、マクロファージが粒子を貪食した速度も監視することが可能となった。本発明者らは、未刺激ＥＳＤＭが、ＢＭＤＭほど速く、またはＢＭＤＭほど多くの生体粒子を貪食しなかったことを見出した。さらに、Ｍ２様表現型に向けて刺激を受けたＥＳＤＭおよびＢＭＤＭは、それらのＭ１刺激同等物よりも多くの生体粒子を貪食した。

【0135】

ＥＳＤＭは肝線維症のマウスモデルにおける線維症退縮を促進する

【0136】

２０ｘ１０^６個のＥＳＤＭを移植した場合、肝線維症の量は有意に減少し、αＳＭＡ＋筋線維芽細胞数はＥＳＤＭ送達後に対照の５０％に減少した。１０ｘ１０^６個のＥＳＤＭを移植した場合、線維症または筋線維芽細胞数に有意な変化は観察されず、このことから、この抗線維化効果が用量依存的であったことが示された。興味深いことに、ＢＭＤＭと同様に、高用量および低用量の両方のＥＳＤＭが、ＰａｎＣＫ＋前駆体の有意な増加によって実証されるように、細胆管反応を刺激した。これらのデータから、ＥＳＤＭ療法が、ＰａｎＣＫ＋細管細胞の増殖を誘導することによって損傷肝臓組織の再生を促進し得、高用量では線維症を改善し得ることが実証される。本発明者らの知る限りでは、これは肝損傷のモデルにおけるＥＳＤＭの治療効果を実証する最初の研究である。

【0137】

ＥＳＤＭは、ＢＭＤＭよりも、クッパー細胞枯渇肝臓の再配置において効率的である

【0138】

本発明者らは、ＥＳＤＭがＢＭＤＭよりも低レベルのＭｙｂおよびＣｃｒ２を発現し、高レベルのＰｕ．１を発現することを見出し、このことから、組織常在マクロファージプロファイルが示される。したがって、本発明者らは、この実験においてＥＳＤＭがＢＭＤＭよりも効率的であるか否かを試験するために、クッパー細胞枯渇肝臓におけるインビボでのＥＳＤＭおよびＢＭＤＭの再配置能力を評価した。ＢＭＤＭレシピエントと比較して、ＥＳＤＭレシピエントでは、有意に多数のＣＦＳＥ＋移植細胞が検出された。これらの結果から、クッパー細胞区画を部分的に再配置させることによってマウスにおけるリポソームクロドロネート処置の効果を逆転させることにおいて、ＥＳＤＭがＢＭＤＭよりも効率的であることが示された。これは、ＥＳＤＭの表現型がＢＭＤＭよりも組織常在マクロファージと近いという事実、またはそれらがマクロファージ枯渇組織に遊走する能力が増強されているという事実の何れかによるものであり得る。

【0139】

材料および方法

【0140】

マウスＥＳＣの維持および分化：以前に記載のような１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｌｏｎｚａ）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、４ｍＭＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）および１００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（ＬＩＦ）を追加したＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）中でマウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）株Ｅ１４ＩＶを維持した（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｈ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ａ．＆Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，Ｌ．Ｍ．Ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｉｄｂｏｄｉｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ６３３，１－１８，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－５９７４５－０１９－５＿１（２０１０））。１５％Ｌ９２９馴化培地および１ｎｇ／ｍＬ組み換えＩＬ－３（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を追加した同じ培地（ＬＩＦなし）（本明細書中で分化培地と呼ぶ）を前述のようにマクロファージ作製のために使用した（Ｚｈａｎｇら）。簡潔に説明すると、６ｘ１０^５個のＥＳＣを分化培地中で懸濁状態で培養し、胚様体（ＥＢ）を形成させた。第８日に、ゼラチン化組織培養皿上にＥＢを播種し、次いで未接着細胞を１日おきに（第１０～２０日）これらの培養物から回収し、次いでＩＬ－３なしの分化培地中で未処理細菌学用ペトリ皿上に播種した。これらの単球様細胞は、プラスチックペトリ皿に接着して単層を形成し、成熟して、胚性幹細胞由来マクロファージ（ＥＳＤＭ）になった。

【0141】

骨髄由来マクロファージ：骨髄をマウス大腿骨および脛骨から流し出し、１０％ＦＣＳ、１５％Ｌ９２９馴化培地および１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ入りのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）中で超低接着性の２５ｃｍ^２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において７日間（第４日に培地交換）培養し、次いで全ての接着細胞および非接着細胞を回収することによって骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を収集した。

【0142】

サイトスピンおよび迅速ロマノフスキー染色：２００μＬＰＢＳ中で１ｘ１０^５個のマクロファージを採取し、計数し、再懸濁することにより、マクロファージのサイトスピンを調製した。それらをＴｈｅｒｍｏＳｈａｎｄｏｎＣｙｔｏｓｐｉｎ４中で３００ｇで３分間細胞遠心分離し、風乾させた。迅速ロマノフスキー染色パック（ＴＣＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造者の説明書に従って細胞を固定および染色した。スライドを水中で短時間すすぎ、風乾し、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を用いて標本にした。

【0143】

マクロファージの極性化：接着性ＥＳＤＭおよびＢＭＤＭは、４８時間にわたり、それぞれ、ＬＰＳ（０．１μｇ／ｍＬ）（ＳｉｇｍａＬ４３９１－１ｍｇ）およびＩＦＮγ（１０Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ）で処理することによって、Ｍ１またはＭ２様表現型の形をとるようにインビトロで刺激した。製造者の説明書に従って、培養上清中のＮＯ^－レベルを測定するためにＧｒｉｅｓｓＲｅａｇｅｎｔＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。

【0144】

フローサイトメトリー：細胞を採取し、計数し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１００μＬＰＢＳ中で細胞１ｘ１０^６個を再懸濁した。プレコンジュゲート（ｐｒｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体をそれらの最適濃度で添加し、氷上で２０分間温置した。続いて細胞を２ｍＬＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）中で洗浄し、４００ｇで５分間遠心分離した。１％ＢＳＡ入りの２００μＬＰＢＳ中で細胞ペレットを再懸濁した。殆どの実験において、ＤＡＰＩまたは７－ＡＡＤなどの生／死細胞判別染色剤で細胞を染色した。以下の抗マウス抗体を使用した：抗Ｆ４／８０ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１１ｂＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。以下の抗ヒト抗体を使用した：抗ＣＤ９３ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗２５Ｆ９ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ１１ｂＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。

【0145】

定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）：ＡＢＩ７５００ＦａｓｔＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを行い、ＳＤＳソフトウェアバージョン１．４（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙＳｙｓｔｅｍＡｓｓａｙＤｅｓｉｇｎＣｅｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）で設計されたＵＰＬアッセイとともに、ＴａｑｍａｎＦａｓｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（２ｘ）（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した（表１）。ＧＡＰＤＨとともにΔΔＣｔ法を使用して、ｃＤＮＡレベルを正規化し、各実験の「対照」試料を遺伝子発現の相対的変化を計算するための標準物質として使用した。データは全て、標準物質の発現レベルに対する倍単位の変化として提示する。

【0146】

表１：プライマー配列

【表1】

【0147】

ライブイメージングによる食作用アッセイ：イメージングの３日前に、１ｘ１０^５個のマクロファージを組織培養グレードの９６ウェルプレート（ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に播種した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＮｕｃＢｌｕｅＬｉｖｅＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓＲｅａｇｅｎｔ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）（ＰＢＳ１ｍＬあたり２滴）を各ウェルに添加し、３７℃で２０分間温置した。細胞をＰＢＳで洗浄し、製造者の説明書に従い、１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）ＤｅｅｐＲｅｄＰｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅＳｔａｉｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）で処理し、さらに３０分間温置した。ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）試薬を吸引し、１００μＬのＰＢＳを各ウェルに添加した。１バイアルのｐＨｒｏｄｏ（商標）ＧｒｅｅｎＺｙｍｏｓａｎＡＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓＣｏｎｊｕｇａｔｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を２ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬＰＢＳ中で再懸濁し、十分にボルテックス処理し、短時間超音波処理し、次いでさらにＰＢＳ中で１：５希釈した。イメージングの直前に、１００μＬのｐＨｒｏｄｏ（商標）ＢｉｏＰａｒｔｉｃｌｅｓをそれぞれに添加した。イメージングは、ＯｐｅｒｅｔｔａＨｉｇｈ－ＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）において５分間隔で、４０ｘの拡大率で行い、ＨａｒｍｏｎｙＨｉｇｈ－ＣｏｎｔｅｎｔＩｍａｇｉｎｇおよびＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像を解析した。各実験を３回実施し、３回の技術的反復を含んだ。

【0148】

肝線維症モデル：８～１０週齢の１２９／ＳＶマウス（ＨａｒｌａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、４週間にわたる週に２回の２μＬ／ｇＣＣｌ_４（１：３のＣＣｌ_４：オリーブ油）の腹腔内注射によって肝損傷を誘発した。第２週の始めにマウスを無作為に選択してＥＳＤＭまたは対照食塩水（１群あたりｎ＝５）の静脈内注射を行い、２１日後にマウスを処分した。肝臓に対して食塩水で灌流を行い、摘出し、ホルマリン中で固定し、免疫組織化学用に処理した。

【0149】

リポソームクロドロネートが介在するクッパー細胞枯渇：リポソームクロドロネート（５ｍｇ／ｍＬ）は、ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．ｏｒｇから購入した。クロドロネート懸濁液を３７℃にし、注射前に十分に混合した。２００μＬのリポソームクロドロネートまたは対照ＰＢＳ（各群ｎ＝５）を尾静脈に注射した。

【0150】

免疫組織化学：組織をパラフィン中に包埋し、４μｍのスライスに切って、スライドガラス上に載せ、記載のようにαＳＭＡ、ＰａｎＣＫ、ＣＦＳＥおよびＦ４／８０の検出のために免疫組織化学を実施した（Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｍｕｒｉｎｅｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｒｅｃｒｕｉｔｓｈｏｓｔｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓｉｍｐｒｏｖｉｎｇｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５３，２００３－２０１５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２４３１５（２０１１）；Ｒｕｓｓｏ，Ｆ．Ｐ．ｅｔａｌ．Ｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３０，１８０７－１８２１，ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２００６．０１．０３６（２００６））（表２）。ＰＳＲ染色のために、切片を脱ワックス処理し、再水和した。切片をヘマトキシリン中で８分間、続いてＰｉｃｒｏＳｉｒｉｕｓＲｅｄ中で１時間処理した。続いてスライドを酸性水で洗浄し、脱水し、標本にした。

【0151】

表２：抗体のリスト

【表2】

【0152】

ＰＳＲおよびαＳＭＡ染色の定量化のために、４０ｘの画像（ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＥ６００顕微鏡）を並べ、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて陽性染色の定量を行った。ＰａｎＣＫ染色の定量のために、記載されているように試料あたり２０か所の非重複視野から陽性細胞を計数した（ＴｈｏｍａｓＪ．Ａ．ｅｔａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｍｕｒｉｎｅｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓｒｅｃｒｕｉｔｓｈｏｓｔｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓｉｍｐｒｏｖｉｎｇｆｉｂｒｏｓｉｓ，ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５３，２００３－２０１５，ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２４３１５（２０１１））。

【0153】

統計学的解析：ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０ｃを用いて統計学的解析を行った。データは全て、平均＋平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。０．０５未満のｐ値は統計学的に有意であると見なした（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。以下の統計学的解析を用いた：対応のないスチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡ。

【0154】

マウス胚性幹細胞由来マクロファージ：本質的に以前に記載のように（Ｚｈｕａｎｇら、２０１２）、純粋なｍＥＳＤＭＳ集団をマウスＥ１４マウス胚性幹細胞株（Ｈａｎｄｙｍａｎら、１９８９）から分化させた。簡潔に説明すると、組み換えＩＬ－３（１μｇ／ｍＬ）を含有するＧＭＥＭおよびｍ－ＣＳＦ（１５％ｖ／ｖ）を含有するＬ９２９馴化培地とともにＥＳＣを８日間培養して、非接着性マクロファージ前駆細胞を得た。その後６～１０日間、ｍ－ＣＳＦ（１５％ｖ／ｖ）を含有するＬ９２９馴化培地のみを含有するＧＭＥＭ中でマクロファージ前駆体を成熟させた。超低接着性フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）からｍＥＳＤＭを採取し、計数し、組み換えマウスＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１３（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＣＳＦ１（２０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＧＭＥＭ中で２４時間極性化させた。アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性肝損傷（５ｘ１０^６個、ｉ．ｖ．）を有するマウスに注射する前に、極性化ＥＳＤＭを採取し、計数し、ＣＦＳＥで染色した。

【0155】

ＡＰＡＰ誘発性肝損傷：ＡＰＡＰ投与前に、マウスを１４時間絶食させた。マウスには、温生理食塩水中のＡＰＡＰ（３５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）または生理食塩水のみの単回注射の何れかを投与した。ＣＦＳＥ染色ＥＳＤＭをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で再懸濁し、ＡＰＡＰ投与の１６時間後に、尾静脈を介してマウスに投与した（細胞５ｘ１０^６個、１００μＬ）。処分の１時間前に、マウスにＰＢＳ中の１ｍｇ（ｉ．ｐ．）の５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を適用して、増殖細胞を標識した。マウスを処分し、心臓穿刺により全血を採取した。凝血後、遠心分離（１４，０００ｇ、４℃）を介して血清を回収した。肝臓組織を採取し、ホルマリン中で固定するか（２０時間）またはドライアイス上で凍結し、分析前に－８０℃で保存した。

【0156】

壊死の定量：肝臓組織の４ミクロン切片を回転式ミクロトームで切り、ＳｕｒｇｉｐａｔｈＳｕｐｅｒｉｏｒＡｄｈｅｓｉｖｅＳｌｉｄｅｓ（ＬｅｉｃａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で回収し、４５℃にて一晩乾燥させた。ＳｈａｎｄｏｎＶａｒｉｓｔａｉｎＧｅｍｉｎｉＥＳＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｌｉｄｅＳｔａｉｎｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でヘマトキシリンおよびエオシンで切片を染色し、ＳｈａｎｄｏｎＣｌｅａｒＶｕｅＣｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて標本にした。壊死の定量のために、電動ステージおよびＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１顕微鏡を使用してＤｏｔｓｌｉｄｅＶＳ－ＡＳＷソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で単独画像を作成するためにスライドをスキャンし、ＯｌｙｍｐｕｓＰｌａｎＡｐｏ２ＸレンズおよびＯｌｙｍｐｕｓＸＣ１０カメラを使用して画像を取得した。ＦＩＪＩにおいてＴｒａｉｎａｂｌｅＷＥＫＡＳｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎプラグインを使用して画像を解析した。壊死組織および生存組織を識別する別個の分類子を決定し、各画像中の全組織に適用した。

【0157】

遺伝子発現分析：インビトロで超低接着性プラスチック上で適切なＥＳＤＭサイトカイン誘導性極性化を確認するために、ＥＳＤＭを２４ウェルプラスチックプレートまたは２４ウェル超低接着プレートにおいて細胞２．５ｘ１０５個／ウェルで播種した。細胞を完全培地（２０ｎｇ／ｍＬのＣＳＦ１を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地）中で一晩接着させた。培地を除去し、極性化を推進するために、２４時間にわたり適切なサイトカインを含む、および含まないＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で置き換えた（ｎ＝３；上記方法を参照）。製造者の説明書に従ってＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からＲＮＡを回収した。ＮａｎｏｄｒｏｐＮＤ－１０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分光光度によりＲＮＡを定量し、ゲノムＤＮＡ除去段階を含むＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写を行った。ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上、３８４ウェル方式でＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて遺伝子発現を定量した。以下の遺伝子Ｙｍ１、Ｆｉｚｚ、Ｍｒ、Ａｒｇ１用に設計された市販のＱｕａｎｔｉｔｅｃｔプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて遺伝子発現を測定した。ハウスキーピング遺伝子として１８ＳｒＲＮＡを用いて、ナイーブＥＳＤＭに対して、２－ΔΔＣＴ法を用いて相対的発現を決定した。

【0158】

食作用アッセイ：ＡＡＭをアポトーシス胸腺細胞（以前のように３～５週齢のＣ５７ＢＬ６マウスから採取し、１μＭヒドロコルチゾンで処理した初代胸腺細胞）とともに温置した（３０）。製造者の説明書に従い、ＣＭＴＭＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアポトーシス胸腺細胞を標識した（３１）。３７℃または４℃で１：５の比率で３０分間、１時間または２時間、ＢＭＤＭに標識アポトーシス細胞を負荷した。細胞を洗浄し、抗ＣＤ１１ｂＢＶ６５０（クローンＭ１／７０；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗Ｌｙ６ＣＶ４５０（クローンＨＫ１．４；Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した後、フローサイトメトリーにより食作用を確認した。Ｌｙ６Ｃ＋細胞のパーセンテージは、３７℃でＣＤ１１ｂ＋ＣＭＴＭＲ＋細胞のゲートにおいて計算した。ＣＭＴＭＲに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、同じ条件で同じゲートにおいて計算した。データはＬＳＲＩＩＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。

【0159】

ＥＳＤＭ局在化に対する免疫組織化学：肝臓および脾臓組織の４ミクロン切片を回転式ミクロトームで切り、ＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓ接着性スライド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で回収し、４５℃で一晩乾燥させた。スライドをキシレン中で脱ワックス処理し、アルコール（１００％～７０％）に通して再水和した。抗原回復は、クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中で１５分間煮沸することによって行った。内在性ペルオキシダーゼ活性は、室温で１５分間Ｂｌｏｘａｌｌ（Ｖｅｃｔｏｒ）とともに温置することによって遮断した。スライドをＰＢＳ中ですすいだ。内在性アビジンおよびビオチン結合部位を、それぞれ室温で１５分間、アビジンブロック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびビオチンブロック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに温置することによって遮断した。各段階の後、スライドをＰＢＳ中ですすいだ。非特異的結合は、室温で１時間、Ｐｒｏｔｅｉｎｂｌｏｃｋ（ＳｐｒｉｎｇＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で遮断した。抗体希釈剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２００分の１に希釈した一次抗ＦＩＴＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡＴ＃７１－１９００）とともにスライドを温置した。一次抗体のタンパク質濃度と一致するように、アイソタイプ対照抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、１－１０００）を抗体希釈剤中で希釈した。スライドを４℃で一晩温置した。スライドをＰＢＳ中ですすいだ。抗体希釈剤中で１：５００に希釈した二次ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、ＢＡ－１０００）とともにスライドを温置し、室温で１時間温置した。スライドをＰＢＳ中ですすいだ。スライドをＶｅｃｔｏｒＲＴＵＡＢＣ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ）とともに室温で３０分間温置してＤＡＢ検出を行った。スライドをＰＢＳ中ですすぎ、次に暗所で室温にて５分間ＤＡＢ試薬（Ｄａｋｏ）とともに温置した。スライドをＰＢＳ中ですすいだ。スライドをハリスヘマトキシリンで対比染色し、次いでスコットのタップウォーター（Ｓｃｏｔｔ’ｓｔａｐｗａｔｅｒ）に短時間入れた。スライドをアルコール（７０％～１００％）に通して脱水し、キシレン中で清浄化した。スライドをＰｅｒｔｅｘ封入剤中で封入し、ＱＩｍａｇｉｎｇＲｅｔｉｇａ２０００Ｒカメラを備えたＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＥ６００顕微鏡を用いて画像化した。

【0160】

実施例３：ヒトｉＰＳＣ由来マクロファージ

【0161】

ヒトｉＰＳＣ細胞のマクロファージへの分化

【0162】

本発明者らの研究をヒト研究に拡張するため、ｖａｎＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇらによって公開された研究に基づいてヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からマクロファージを作製するためにフィーダーおよび血清不含プロトコールを最適化した（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｏｎｇｔｅｒｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｐａｒｔｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄａｎｄｆｕｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ８，ｅ７１０９８，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７１０９８（２０１３））。ヒト人工多能性幹細胞株、ＳＦＣｉ５５は社内で作製し、多能性であり、正常な核型を有することが確認された（Ｙａｎｇ，Ｃ－Ｔ．，Ｍａ，Ｒ．，Ａｘｔｏｎ，Ｒ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｍ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｈ．，Ｆｉｄａｎｚａ，Ａ．，Ｍａｒｅｎａｈ，Ｌ．，Ｆｒａｙｎｅ，Ｊ．，Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ，Ｊ＆Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ，Ｌ．Ｍ．（２０１６）．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＫＬＦ１ＥｎｈａｎｃｅｓｔｈｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄＭａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓｆｒｏｍＨｕｍａｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ１０．１００２／ｓｔｅｍ．２５６２）。それらは、ＳｔｅｍＰｒｏサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．８％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性ＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＭＥＭ／Ｆ１２に追加することによって調製したＳｔｅｍＰｒｏ培地中で維持した。ｉＰＳＣをマクロファージに分化させるための方法は、ｖａｎＷｉｌｇｅｎｂｕｒｇらから適応させた。第０日に、使用済み培地を６ウェルプレートの１つのコンフルエントウェルから除去し、サイトカインミックス１（５０ｎｇ／ｍＬＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍＬＶＥＧＦおよび２０ｎｇ／ｍＬＳＣＦ）を追加した２ｍＬＳｔｅｍＰｒｏ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と交換した。細胞をＥＺＰａｓｓａｇｅ（商標）ツールを用いて切り、パスツールピペットで穏やかに除去した。それらを超低接着性６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の２つのウェルに等分し、サイトカインミックス１入りの２ｍＬＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地を各ウェルに添加した。胚様体（ＥＢ）を形成させるために、（第２日にサイトカインを補給しながら）３日間懸濁状態で細胞を培養した。第４日に、ＥＢを持ち上げ、サイトカインミックス２（１００ｎｇ／ｍＬＭ－ＣＳＦ、２５ｎｇ／ｍＬＩＬ－３、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５５Ｍ β－メルカプトエタノール）を追加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中、ゼラチン被覆組織培養グレード６ウェルプレートに移した。各ウェルにおよそ３０個のＥＢを播種した。プロトコールの残りの期間、この培地中でＥＢを維持し、使用済み培地を３～４日ごとに新鮮培地と交換した。約２週間後、ＥＢは培養上清中にマクロファージ前駆体を産生し、これを回収し、サイトカインミックス３（１００ｎｇ／ｍＬＭ－ＣＳＦ、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）を追加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地中、１０ｃｍ^２細菌学用皿培地に移し、５～７日間成熟させてｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ－ＤＭ）にした。マクロファージ前駆細胞は、およそ２か月間、週に２回、回収し得た。

【0163】

生成されたヒトｉＰＳＣ由来マクロファージ（ｉＰＳＣ－ＤＭ）は、成熟マクロファージ特異的細胞表面マーカー２５Ｆ９およびＣＤ１１ｂの両方を発現し（図１８Ｂ）、単球マーカーＣＤ９３を発現しなかった（図２６Ａ）。ｉＰＳＣ由来マクロファージはまた、ＣＤ４５、ＣＤ１６９、ＣＤ１６３、ＣＤ１４、ＣＤ４３、ＣＤ２０６、ＣＤ１１５、ＣＤ８６、ＣＸＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ８も発現する（図２７および２８）。ごく一部のｉＰＳＣには、低レベルのＶＣＡＭおよびＣＤ１５がある（図２７Ｆ、Ｇ）。ｉＰＳＣＤＭはＨＬＡ－ＤＲを発現しない（図２８Ｄ）。ヒトｉＰＳＣ－ＤＭは刺激に反応した：Ｍ１関連遺伝子ＣＤ４０およびＣＤ８０はＬＰＳ－ＩＦＮγによって活性化されると上方制御され、一方でＭ２関連遺伝子ＴＧＭ２およびＭＲＣ１遺伝子発現はＩＬ４に反応して上昇した（図２６Ｃ～Ｆ）。

【0164】

本発明者らは、自身らのライブイメージング食作用アッセイにおいて、ナイーブおよび極性化ヒトｉＰＳＣ－ＤＭをヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）と比較した。ヒトｉＰＳＣ－ＤＭは、ヒトＭＤＭと同じ傾向を辿り、「ナイーブ」およびＩＬ－４処理マクロファージは、ＬＰＳ－ＩＦＮγ処理マクロファージよりも食作用性が強いことが分かった（図２６Ｇ、Ｈ）。しかし、マウスＥＳＤＭにおける本発明者らの観察を連想させるように、ヒトｉＰＳＣ－ＤＭは、それらの「ナイーブ」ならびに極性化状態においてヒトＭＤＭよりも貪食が少なく、このことから、それらが有する表現型はより炎症性が低いことが示される。

【0165】

それぞれマウスＢＭＤＭおよびヒトＭＤＭと直接比較した場合、それらは食作用が少なく、抗炎症性表現型に偏っていたことが分かった。

【0166】

実施例３－パラセタモール（ＡＰＡＰ）誘発性急性肝損傷（ＡＰＡＰ－ＡＬＩ）をマウスに注射した後の選択的活性化マクロファージの転写プロファイルの決定。

【0167】

方法：

【0168】

ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡＲＩＡＩＩ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介した選別後に溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に直接回収したことを除き、上記のようにＣＦＳＥ染色ＡＡＭを健常マウスおよびＡＰＡＰ中毒マウスの消化肝臓から回収した。細胞収量は、４．３ｘ１０^４～５．６ｘ１０^５個の範囲であった。製造者の説明書に従って、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを用いて溶解物をホモジナイズ処理した。ＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを得て、その後、ＲＴ^２ＰｒｅＡＭＰｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて予備増幅を行った。ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＩＩＰＣＲ装置（３８４ウェル方式、Ｒｏｃｈｅ）を備えたカタログ化ＲＴ^２プロファイラーＰＣＲアレイ（０７７ＺＧ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて増幅ｃＤＮＡをアッセイした。ＧｅｎｅＧｌｏｂｅオンラインポータル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてデータを分析した。試料は全て、データ品質管理基準に合格した。Ｃ_Ｔカットオフは３５に設定した。正規化は、Ａｃｔｂ、ＧｕｓｂおよびＨｓｐ９０ａｂ１の算術平均を用いて行った。ボルケーノプロットは倍単位の変化（２^{＾－ΔＣｔ}）対ｐ値（ｎ＝３回反復のスチューデントのｔ検定に基づいて計算）をプロットすることによって作成した。処置群および対照群は、それぞれＡＰＡＰ処置マウスおよびＰＢＳ処置マウスからのＡＡＭであった。

【0169】

結果

【0170】

以下の遺伝子を分析した：Ｃ３，Ｃ３ａｒ１，Ｃ４ｂ，Ｃｃｌ１，Ｃｃｌ１１，Ｃｃｌ１２，Ｃｃｌ１７，Ｃｃｌ１９，Ｃｃｌ２，Ｃｃｌ２０，Ｃｃｌ２２，Ｃｃｌ２４，Ｃｃｌ２５，Ｃｃｌ３，Ｃｃｌ４，Ｃｃｌ５，Ｃｃｌ７，Ｃｃｌ８，Ｃｃｒ１，Ｃｃｒ２，Ｃｃｒ３，Ｃｃｒ４，Ｃｃｒ７，Ｃｄ１４，Ｃｄ４０，Ｃｄ４０ｌｇ，Ｃｅｂｐｂ，Ｃｒｐ，Ｃｓｆ１，Ｃｘｃｌ１，Ｃｘｃｌ１０，Ｃｘｃｌ１１，Ｃｘｃｌ２，Ｃｘｃｌ３，Ｃｘｃｌ５，Ｃｘｃｌ９，Ｃｘｃｒ１，Ｃｘｃｒ２，Ｃｘｃｒ４，Ｆａｓｌ，Ｆｏｓ，Ｉｆｎｇ，Ｉｌ１０，Ｉｌ１０ｒｂ，Ｉｌ１７ａ，Ｉｌ１８，Ｉｌ１ａ，Ｉｌ１ｂ，Ｉｌ１ｒ１，Ｉｌ１ｒａｐ，Ｉｌ１ｒｎ，Ｉｌ２２，Ｉｌ２３ａ，Ｉｌ２３ｒ，Ｉｌ５，Ｉｌ６，Ｉｌ６ｒａ，Ｉｌ７，Ｉｌ９，Ｉｔｇｂ２，Ｋｎｇ１，Ｌｔａ，Ｌｔｂ，Ｌｙ９６，Ｍｙｄ８８，Ｎｆｋｂ１，Ｎｏｓ２，Ｎｒ３ｃ１，Ｐｔｇｓ２，Ｒｉｐｋ２，Ｓｅｌｅ，Ｔｉｒａｐ，Ｔｌｒ１，Ｔｌｒ２，Ｔｌｒ３，Ｔｌｒ４，Ｔｌｒ５，Ｔｌｒ６，Ｔｌｒ７，Ｔｌｒ９，Ｔｎｆ，Ｔｎｆｓｆ１４，Ｔｏｌｌｉｐ，Ａｃｔｂ，Ｂ２ｍ，Ｇａｐｄｈ，Ｇｕｓｂ，Ｈｓｐ９０ａｂ１およびＨｓｐ９０ａｂ１。

【0171】

図２９から分かり得るように、ＡＡＭは一般に、それらの抗炎症表現型を保持し、分析した９５％の遺伝子は、ＡＰＡＰ処置マウスとＰＢＳ処置マウスとの間で変化はなかった。したがって、結果から、ＡＡＭが炎症促進性環境においてそれらのＭ２表現型を保持することが示された。

【0172】

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