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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-01
(45)【発行日】2022-08-09
(54)【発明の名称】ペプチドワクチン製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/02 20060101AFI20220802BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20220802BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20220802BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20220802BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220802BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20220802BHJP
A61J 1/20 20060101ALI20220802BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20220802BHJP
【ＦＩ】
A61K38/02
A61K39/12 ZNA
A61K39/39
A61P31/12
A61K47/10
A61K47/12
A61K47/34
A61K9/107
A61J1/20 314C
A61K39/00
【請求項の数】
25
(21)【出願番号】P 2019518137
(86)(22)【出願日】2017-06-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-09-12
(86)【国際出願番号】 EP2017064882
(87)【国際公開番号】W WO2017220463
(87)【国際公開日】2017-12-28
【審査請求日】2020-06-16
(31)【優先権主張番号】16175215.9
(32)【優先日】2016-06-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】514084004
【氏名又は名称】アイエスエー ファーマシューティカルズ ビー．ヴイ．
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｂ．Ｖ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ミュルデル， グウェン エフェリーネ
【審査官】藤井 美穂
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５０７４８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３０３６２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Anti-cancer Drugs, 1999, Vol.10, pp.879-887
【文献】LUWEI ZHAO，STABILIZATION OF EPTIFIBATIDE BY COSOLVENTS，INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS，2001年05月，VOL:218, NR:1-2，PAGE(S):43 - 56，http://dx.doi.org/10.1016/S0378-5173(01)00618-4
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００ － ３８／５８
Ａ６１Ｋ ４７／００ － ４７／６９
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
乾燥されたペプチドを再構築するための組成物であって、６０～８０％ｖ／ｖの、０．０５～０．２５Ｍ濃度の有機酸を含む水溶液と、５～１０％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、１０～２０％ｖ／ｖの低級アルコールと、５～１０％ｖ／ｖの非イオン性親水性界面活性剤と、を含むか、又はこれらからなる組成物であり、
前記有機酸が、１～４のｐＫａを有する有機酸であり、
前記低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群より選択され、
前記非イオン性親水性界面活性剤が、
ａ．モノグリセリド、ジグリセリド若しくはトリグリセリドであるか、及び／又は
ｂ．９～１４のＨＬＢ値を有するものである、組成物。
【請求項2】
前記有機酸がクエン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記有機酸が０．０５～０．１Ｍの濃度で水溶液中に存在する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記低級アルコールがエタノールである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記非イオン性親水性界面活性剤が、エトキシル化ヒマシ油又はエトキシル化トリグリセリドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記非イオン性親水性界面活性剤が、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
７５％ｖ／ｖの、０．１Ｍ濃度のクエン酸を含む水溶液と、６．２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、１２．５％ｖ／ｖのエタノールと、６．２５％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）と、を含むか、又はこれらからなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物と、ペプチドとを含む、医薬組成物。
【請求項9】
前記ペプチドが、１５～１００アミノ酸長のペプチドである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
油性アジュバントをさらに含む、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
少なくとも３つの異なるペプチドを含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記ペプチドが、少なくとも１つのタンパク質抗原に由来する、請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
以下の特性の両方を満たすペプチドを含まない、請求項８～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。ａ．塩基性アミノ酸残基のパーセンテージが酸性アミノ酸残基のパーセンテージと等しい。
ｂ．疎水性アミノ酸残基のパーセンテージが４８％以上である。
【請求項14】
前記ペプチドが、ＨＰＶ免疫原性領域Ｅ６及び／又はＥ７内の連続配列を含むか、又は該連続配列からなる、請求項８～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記ペプチドが、配列番号２０～１０４によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列を含むエピトープを含む、請求項８～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記ペプチドが、配列番号１～５から選択される配列を含むか若しくは該配列からなるペプチドの少なくとも２、３、４若しくは５個；配列番号１～６によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列を含むか若しくは該配列からなるペプチドの少なくとも２、３、４、５若しくは６個；又は配列番号７～１３によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列を含むか若しくは該配列からなるペプチドの少なくとも２、３、４、５、６若しくは７個を有するペプチドのミックスである、請求項８～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
４０～６０％ｖ／ｖの、１～２ｍｇ／ｍＬのペプチドを含む再構築組成物と、４０～６０％ｖ／ｖのモンタニドＩＳＡ５１ＶＧと、を含むか又はこれらからなり、前記ペプチドが、配列番号１～５、配列番号１～６又は配列番号７～１３によって表される異なるペプチドの混合物である、請求項８～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記ペプチドが、配列番号１～５によって表される５つの異なるペプチドの混合物又は配列番号７～１３によって表される７つの異なるペプチドの混合物からなる、請求項８～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記ペプチドが、ａ．配列番号１０９～１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又は該配列からなる、
ｂ．配列番号１４８～１６７によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか若しくは該ペプチドからなるか、又は配列番号１４８～１６７から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の異なるペプチドのミックスである、
ｃ．配列番号１６８～１６９から選択されるＴｈエピトープを含む、
ｄ．配列番号１９１～２１１によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか若しくは該ペプチドからなり、又は配列番号１９１～２１１から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１個の異なるペプチドのミックスである、或いは、
ｅ．配列番号２１３～２３２によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか若しくは該ペプチドからなり、又は配列番号２１３～２３２から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０個の異なるペプチドのミックスである、
請求項８～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
薬剤として使用するための、請求項８～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項21】
前記薬剤が、前記ペプチドの少なくとも１つのエピトープに対してＴ細胞応答を誘導するためのワクチンである、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項22】
乾燥されたペプチドを再構築するための方法であって、ａ）乾燥されたペプチドを含むバイアルを用意するステップと、
ｂ）前記ペプチドを解凍するステップと、
ｃ）請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物を、前記ペプチドを含む前記バイアルに添加するステップと、
ｄ）混合するステップと、
ｅ）透明溶液が得られるまで渦流するステップと、
を含む、方法。
【請求項23】
医薬組成物を調製するための方法であって、（ｉ）請求項２２に記載の方法によって得ることができる再構築されたペプチドを、第１のシリンジに収集するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記第１のシリンジを、油性アジュバントを含む第２のシリンジに、コネクタを使用して接続するステップと、
（ｉｉｉ）前記第１のシリンジの内容物を、前記第２のシリンジへ押し出し、そして逆方向に押し出すステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を合計で１０～５０回、１０～５０秒で、繰り返すステップと、
を含む、方法。
【請求項24】
乾燥されたペプチドを含む第１のバイアルと、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を含む第２のバイアルと、を備えるキット。
【請求項25】
油性アジュバントを含む第３のバイアルを更に備える、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［発明の分野］
本発明は、医学及び免疫学の分野にある。本発明は、特に、ワクチン接種用のペプチドを再構築するための新規組成物に関する。この組成物は、特に、油性アジュバントをさらに含む、薬学的なペプチドベースのワクチンを調製するために適切である。
本発明は、医学及び免疫学の分野にある。本発明は、特に、ワクチン接種用のペプチドを再構築するための新規組成物に関する。この組成物は、特に、油性アジュバントをさらに含む、薬学的なペプチドベースのワクチンを調製するために適切である。
【0002】
［発明の背景］
臨床結果は、治療的ワクチン接種の成功の時代が到来したことを示している。ＨＰＶによって引き起こされる前悪性病変について、病変の退縮が示され、長期生存の臨床的有用性が確立されている。最適なワクチンプラットフォームの中には、合成長鎖ペプチドに基づくワクチンがある。ペプチドワクチン又はペプチドベースのワクチンが、持続的感染及び癌の処置のために、好ましくはウイルス抗原、癌抗原及び／又はネオ抗原を発現する細胞を取り除くための免疫系を標的とする処置のために開発されている。有効な細胞免疫応答（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘発することができるペプチドベースのワクチンが、抗原発現細胞を取り除くことができる抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を標的とすることは当技術分野で理解されている。一般的に選択される抗原には、変異配列、選択された癌精巣抗原及びウイルス抗原が含まれる（総説について、Melief et al., 2016 Journal of Clinical Investigation, Vol 125(9)pages 3401-3412を参照）。
臨床結果は、治療的ワクチン接種の成功の時代が到来したことを示している。ＨＰＶによって引き起こされる前悪性病変について、病変の退縮が示され、長期生存の臨床的有用性が確立されている。最適なワクチンプラットフォームの中には、合成長鎖ペプチドに基づくワクチンがある。ペプチドワクチン又はペプチドベースのワクチンが、持続的感染及び癌の処置のために、好ましくはウイルス抗原、癌抗原及び／又はネオ抗原を発現する細胞を取り除くための免疫系を標的とする処置のために開発されている。有効な細胞免疫応答（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答）を誘発することができるペプチドベースのワクチンが、抗原発現細胞を取り除くことができる抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞を標的とすることは当技術分野で理解されている。一般的に選択される抗原には、変異配列、選択された癌精巣抗原及びウイルス抗原が含まれる（総説について、Melief et al., 2016 Journal of Clinical Investigation, Vol 125(9)pages 3401-3412を参照）。
【0003】
ペプチドベースのワクチンの難題の１つは、物理的に及び化学的に安定な注射溶液を提供することである。このことは特に、複数のペプチドと油性アジュバントとを含むペプチドベースのワクチンエマルジョンについて難題である。注射ワクチン溶液は、典型的には、患者への投与の約１～３時間前に、乾燥された、多くは凍結乾燥されたペプチドを出発材料として使用して、現場で調製される。したがって、乾燥されたペプチドを迅速に再構築することができる適切な再構築組成物であって、そのペプチドがその後、油性アジュバントと容易に混合され、患者に投与される前に室温で少なくとも２～３時間保存するために物理的及び化学的に安定であるエマルジョンを生じることが可能な再構築組成物が必要とされている。
【0004】
［発明の詳細な説明］
再構築組成物
ワクチン接種用のペプチドを再構築するための新規組成物が提供される。この再構築組成物は、有機酸を含む約６０～８０％ｖ／ｖの水溶液と、約５～１０％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約１０～２０％ｖ／ｖの低級アルコールと、約５～１０％ｖ／ｖの非イオン性親水性界面活性剤とを含むか、又はこれらからなる。
再構築組成物
ワクチン接種用のペプチドを再構築するための新規組成物が提供される。この再構築組成物は、有機酸を含む約６０～８０％ｖ／ｖの水溶液と、約５～１０％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約１０～２０％ｖ／ｖの低級アルコールと、約５～１０％ｖ／ｖの非イオン性親水性界面活性剤とを含むか、又はこれらからなる。
【0005】
有機酸は、カルボン酸などの弱有機酸であることが好ましい。弱有機酸は、－２～１２のｐＫａ（対数酸解離定数）を有する有機酸として本明細書で理解される。弱有機酸は、１～１０、又は２～５、さらには３～４のｐＫａを有することが好ましい。弱有機酸は、限定されないが、シュウ酸（エタン二酸）、クエン酸（２－ヒドロキシプロパン－１，２，３－トリカルボン酸）、リンゴ酸（２－ヒドロキシブタン二酸）、炭酸（ヒドロキシメタン酸）、安息香酸（ベンゼンカルボン酸又はフェニルメタン酸）、ギ酸（メタン酸）、乳酸（２－ヒドロキシプロパン酸）、酢酸（エタン酸）、酪酸（ブタン酸）、吉草酸（ペンタン酸）、カプロン酸（ヘキサン酸）、プロピオン酸（プロパン酸）からなる群から選択される任意のカルボン酸であり得る。有機酸は、クエン酸であることが最も好ましい。
【0006】
有機酸は、約０．００８～０．２５Ｍ、又は約０．０１～０．２Ｍ、又は０．０５～０．１Ｍの濃度で水溶液中に存在し得る。上記水溶液を６０～８０％、又は６５～７５％、又は６７～７２％、又は約７０％含む本発明の再構築組成物は、好ましくは、上記有機酸の得られる濃度が０．０５～０．２Ｍ、０．００６～０．１６Ｍ、０．００８～０．１２Ｍ、０．０３～０．０８Ｍ、又は好ましくは０．０４～０．６Ｍの範囲である。
【0007】
低級アルコールは、低級アルキル又は低級置換アルキル基の飽和炭素原子に結合されたヒドロキシル官能基を有する有機化合物として本明細書で理解され、ここで低級アルキル又は低級置換アルキル基は最大で６個の炭素原子を有するものであり、好ましくはＣＨ３－（ＣＨ２）ｎ－ＯＨ（式中、ｎ＝１、２、３、４又は５）の構造を有する。低級アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群から選択されることが好ましく、低級アルコールがエタノールであることが最も好ましい。
【0008】
非イオン性親水性界面活性剤は、親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）値が９～１４であることが好ましく、１２～１４であることがより好ましい。この界面活性剤は、ソルビタンのエトキシル化脂肪酸モノ（特に、５エトキシル基）、ジ－又はトリ－（特に、２０エトキシル基）エステル（脂肪酸は、オレエート（例えば、エトキシル化ソルビタンモノオレエート、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８１（登録商標）及び／又はエトキシル化ソルビタントリオレエート、例えばツイーン８５（登録商標））、パルミテート、ステアレート（例えば、エトキシル化ソルビタントリステアレート、例えばツイーン６５（登録商標））、イソステアレート、ラウレート及びそれらの組合せ；エトキシル化脂肪アルコール（特に５～１０エトキシル基）（例えば、ブリッジ（Ｂｒｉｊ）７６（登録商標）、ブリッジ５６（登録商標）、ブリッジ９６（登録商標））、エトキシル化脂肪酸（特に５～１０エトキシル基）（例えば、シムルゾル（Ｓｉｍｕｌｓｏｌ）２５９９（登録商標）、Ｍｙｒｊ４５（登録商標））、エトキシル化ヒマシ油（特に、２５～３５エトキシル基）（例えば、アルラトーン（Ａｒｌａｔｏｎｅ）６５０（登録商標）、アルラトーンＧ（登録商標）、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（登録商標））及びそれらの組合せであり得るが、それらに限定されない。
【0009】
本発明の組成物の一実施形態では、非イオン性親水性界面活性剤は、
ａ．モノ－、ジ－若しくはトリグリセリド、好ましくは、エトキシル化トリグリセリドである、及び／又は
ｂ．９～１４の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する。
ａ．モノ－、ジ－若しくはトリグリセリド、好ましくは、エトキシル化トリグリセリドである、及び／又は
ｂ．９～１４の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する。
【0010】
ＨＬＢ値は、式ＨＬＢ＝２０（１－Ｉｓ／Ｉａ）を使用して計算され、式中、Ｉｓは、上記界面活性剤又は界面活性剤の混合物のけん化インデックス又はけん化価を表し、Ｉａは、上記界面活性剤又は界面活性剤の上記混合物の酸インデックス又は酸価を表す。これらの２つのインデックス、けん化価及び酸価は、欧州薬局方（第８．８版、それぞれ第２．５．６章及び第２．５．１章）に記載された方法によって決定される。
【0011】
好ましい実施形態では、非イオン性親水性界面活性剤は、エトキシル化ヒマシ油、より特には、ポリオキシル３５硬化ヒマシ油、又はヒマシ油を酸化エチレンと１：３５のモル比で反応させることによって得られるポリオキシエチル化トリグリセリドの混合物であるポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）（例えばクレモフォールＥＬ（登録商標））である。
【0012】
本発明の再構築組成物は、約０．１Ｍのクエン酸を水中に含む約７５％ｖ／ｖの水溶液と、約６．２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約１２．５％ｖ／ｖのエタノールと、約６．２５％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）とを含むか、又はこれらからなることが好ましい。別言すると、再構築組成物は、水中に、約０．０７５Ｍのクエン酸と、約６．２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約１２．５％ｖ／ｖのエタノールと、約６．２５％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）とを含むか、又はこれらからなる。
【0013】
約０．１Ｍのクエン酸を水中に含む約７５％ｖ／ｖの水溶液と、約６．２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約１２．５％ｖ／ｖのエタノールと、約６．２５％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）と、２０μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６とを含むか、又はこれらからなる再構築組成物、或いは、水中に、約０．０７５Ｍのクエン酸と、約６．２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約１２．５％ｖ／ｖのエタノールと、約６．２５％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）と、２０μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６とを含むか、又はこれらからなる再構築組成物も好ましい。
【0014】
再構築組成物は、下記の医薬組成物において、本明細書で定義される保存されたペプチド、つまり、好ましくは１５～１００のアミノ酸長を有する保存されたペプチドを再構築するために特に適している。上記で定義された長さのペプチドの再構築の場合に安定な溶液を形成することが難しいことは、当技術分野で理解されており、特に異なるペプチド、つまり異なるアミノ酸配列を有するペプチドであり、したがって様々な化学的特性を有し、物理的に異なる挙動をする場合、それが難しいことが理解されている。結果的に、１つの同じ溶液中でそれらを再構築することは困難である。その上、これらのペプチドのうちの１つ又は複数がシステインを含む場合に、ＳＳ架橋を形成する傾向に対処することが必要となる。分子内ジスルフィド結合は、免疫原性とするためにワクチンペプチドで必要な場合はあるものの、分子間ジスルフィド架橋の形成は、不安定な溶液に至ることから望ましくない。
【0015】
本発明者らは、次に，再構築されたペプチドの免疫原性を損なうことなく、分子間ジスルフィド架橋の量が最少化された、非常に安定な再構築ペプチド組成物を形成するために、本発明の再構築組成物が特に適していることを同定した。したがって、本発明の再構築組成物は、本明細書でさらに定義される再構築されるペプチドの分子間ジスルフィド形成を、これらのペプチドの免疫原性を損なうことなく、抑制する。
【0016】
本発明の再構築組成物は、対象、つまり哺乳動物種又はヒトへの非経口投与のために適切な滅菌及び／又は医薬等級又は臨床等級の組成物であることが好ましい。本発明の再構築組成物は、適正製造基準（ＧＭＰ）を使用して製造され、欧州医薬品庁及び食品医薬品局の両方で定義されるようにＧＭＰ品質を有することが好ましい。本発明の再構築組成物は、バイアル中にパッケージされていてもよい。また本発明は、本明細書でさらに定義される一回医薬投薬単位又は複数回医薬投薬単位を再構築するために適切な再構築組成物の体積、つまり２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はより多くの医薬投薬単位を再構築するために適切な体積を含むバイアルを提供する。上記バイアルは、再構築組成物が、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、又は１年、さらには２年安定である温度で保存することが好ましい。上記温度は、－２５～２５℃、又は－２３～－１８℃、又は０～１０℃、又は２～８℃、又は１８～２３℃であることが好ましい。
【0017】
バイアル中に存在する本発明の再構築組成物の体積は、最大で５０ｍＬ、好ましくは０．１～１０ｍＬ、好ましくは１～１０ｍＬ、例えば０．５、１、２、３、４、５若しくは１０ｍＬ又はその間の任意の値であることが好ましい。バイアルは、任意の形状を有し得る容器として本明細書で理解される。任意選択で、バイアルは、シリンジとして本明細書で理解される。
【0018】
医薬組成物
本発明の再構築組成物は、薬剤又は医薬組成物の調製のためにペプチドを再構築するために特に適している。そのような医薬組成物は、ワクチン、好ましくはペプチドワクチンであり得る。「ワクチン」は、持続的感染及び／又は異形成及び／又は形成異常及び／又は新生物に関連する状態などの疾患の予防及び／又は処置のための免疫を生成するための、抗原性化合物を含む組成物、任意選択でさらに免疫刺激化合物で補完された組成物として、本明細書で理解される。「ペプチドベースのワクチン」又は「ペプチドワクチン」（これらの用語は本明細書で互換的に使用される）は、ペプチドが、有効成分、つまり抗原性化合物を構成しているワクチンとして本明細書で理解される。そのようなペプチドは、合成長鎖ペプチドであることが好ましい。ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）エピトープを含むことがより好ましい。
本発明の再構築組成物は、薬剤又は医薬組成物の調製のためにペプチドを再構築するために特に適している。そのような医薬組成物は、ワクチン、好ましくはペプチドワクチンであり得る。「ワクチン」は、持続的感染及び／又は異形成及び／又は形成異常及び／又は新生物に関連する状態などの疾患の予防及び／又は処置のための免疫を生成するための、抗原性化合物を含む組成物、任意選択でさらに免疫刺激化合物で補完された組成物として、本明細書で理解される。「ペプチドベースのワクチン」又は「ペプチドワクチン」（これらの用語は本明細書で互換的に使用される）は、ペプチドが、有効成分、つまり抗原性化合物を構成しているワクチンとして本明細書で理解される。そのようなペプチドは、合成長鎖ペプチドであることが好ましい。ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することができるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）エピトープを含むことがより好ましい。
【0019】
そのように、本発明の再構築組成物で再構築されたペプチドを含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、ワクチン、好ましくはペプチドベースのワクチンであることが好ましい。そのようなペプチドベースのワクチンは、持続的感染、前癌性状態及び癌を処置するため、好ましくは、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、癌精巣抗原及び／又は腫瘍特異的抗原など、発癌性若しくは非発癌性ウイルス抗原及び／又はＤＮＡ変異から生じるネオ抗原などを発現する感染細胞、前癌性細胞及び／又は癌細胞を取り除くために細胞性免疫系を活性化するために使用され得る。
【0020】
医薬組成物は、対象、好ましくはヒト又は動物対象への投与用であることが好ましく、したがって、それに適切であるように製剤化されることが好ましい。投与は、非経口投与、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、真皮内、皮内、及び／又は腫瘍内投与、つまり注射による投与であることが好ましい。
【0021】
本発明者らは、再構築されたペプチドを含む再構築組成物が、油性アジュバントと混合するために特に適しており、化学的及び物理的に安定なペプチド－ワクチン溶液が得られることを見い出した。
【0022】
「化学的に安定」とは、ペプチド溶液及び／又はペプチド－ワクチン組成物の文脈において本明細書で参照され、許容されない程度まで、例えば分子内又は分子間ジスルフィド架橋の形成による、化学的な劣化又は分解がない、つまり、溶液及び／又は組成物中の劣化、分解及び／又は反応していないペプチドの量が、室温で少なくとも約０．５、１、１．５、２又は少なくとも３時間、溶液又は組成物を保存した後に、その元の量と比較して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％である、ペプチドを含む溶液又は組成物として本明細書で理解される。化学的安定性は、当技術分野で公知の任意の適切な技術を使用して、例えば、本明細書で例示されるようなＵＰＬＣ／ＭＳを使用して、評価することができる。ＵＰＬＣ／ＭＳを使用するとき、溶液／組成物は、室温で少なくとも約０．５、１、１．５、２又は少なくとも３時間保存した後に現れる新たなピークの総面積％が、同じ条件下で測定するとき、その元の溶液と比較して最大で２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％である場合に、化学的に安定であるとして定義される。ここで新たなピークは、同じ条件下で測定するときの、元の溶液のＵＰＬＣクロマトグラムでは同定されていなかった、保存溶液のＵＰＬＣクロマトグラムのピークと理解される（本明細書では、「元の溶液」は、調製直後の新たに調製された溶液として理解される）。室温で３時間保存後に現れる新たなピークの総面積％は、同じ条件下で測定するときの、その元の溶液と比較して、最大で２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％、好ましくは最大で１０％、であることが好ましい。
【0023】
「物理的に安定」は、ペプチド溶液及び／又はペプチド－ワクチン組成物の文脈において本明細書で参照され、沈殿又は再分散しないペプチドを含む溶液又は組成物として本明細書で理解される。物理的安定性は、当技術分野で公知の任意の適切な技術を使用して、例えば、目視検査によって、又は本明細書で例示されるようなマルバーン・マスターサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ）を使用して、平均粒径がＤ（０．５）で表される、粒度分布によって、評価することができる。本明細書で例示されるように、マルバーン・マスターサイザーを使用して物理的安定性を評価するとき、溶液／組成物は、室温で少なくとも約０．５、１、１．５、２又は少なくとも３時間保存後の平均Ｄ（０．５）が、その元の溶液（つまり、調製直後の新たに調製された溶液）と比較して、増加が最大で５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％である場合に、物理的に安定であるとして定義される。溶液／組成物は、室温で３時間保存後の平均Ｄ（０．５）が、その元の溶液と比較して、増加が最大で５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％、好ましくは最大で２０％である場合に、物理的に安定であるとして定義されることが好ましい。
【0024】
本発明の医薬組成物は、アジュバントをさらに含むことが好ましい。「アジュバント」という用語は、免疫増強作用を有し、対象に投与されたときに抗原性物質に対して免疫学的応答を強化、誘導、誘発及び／又は調節するために抗原性物質に添加され又は共に製剤化される物質を指すために本明細書で使用される。油性アジュバントは、エマルジョン（例えば、油中水型又は水中油型エマルジョン）を形成するために使用することができ、免疫応答を増強及び指示することが当技術分野で理解されている。治療ワクチン中にそのようなアジュバントが存在することは非常に有益である。したがって、本発明はまた、本発明の再構築組成物と、再構築されたペプチドと、油性アジュバントとを含むか、又はこれらからなる医薬組成物又は薬剤を提供し、より特に、本発明は、約４０～６０％ｖ／ｖの本発明の再構築組成物中の約０．５～１０ｍｇ／ｍＬペプチドと約４０～６０％ｖ／ｖの油性アジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【0025】
油性アジュバントは、当技術分野で公知の任意の鉱油性又は非鉱油性アジュバントであり得る。油性アジュバントは、鉱油性アジュバントであることが好ましい。油性アジュバントの非限定的な例としては、生物系油のアジュバント（植物油／魚油等に基づくもの）、スクアレン系アジュバント（例えば、ＭＦ５９）、Ｓｙｎｔｅｘアジュバント製剤（ＳＡＦ；Lidgate, Deborah M, Preparation of The Syntex Adjuvant Formulation（ＳＡＦ、ＳＡＦ－ｍ及びＳＡＦ－１）、In: Vaccine Adjuvants, Volume 42 of The series Methods in MolecularMedicine（商標）p229-237, ISSN1543-1894）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、落花生油に基づくアジュバント（例えば、アジュバント６５）、リポバント（Ｌｉｐｏｖａｎｔ）（Byars, N.E., Allison, A.C., 1990. Immunologic adjuvants: generalproperties, advantages, and limitations. In: Zola, H.(Ed.), Laboratory Methodsin Immunology. p39-51）、ＡＳＯ４（A. Tagliabue, R. RappuoliVaccine adjuvants: the dream becomes real Hum. Vaccine, 4(5), 2008, p347-349）、高度に精製されたマンニッドモノオレエートと乳化された精製スクアレン及びスクアレンに基づくモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）アジュバント（例えば、モンタニドＩＳＡ２５ＶＧ、２８ＶＧ、３５ＶＧ、５０Ｖ、５０Ｖ２、５１ＶＧ、６１ＶＧ、７０ＶＧ、７０ＭＶＧ、７１ＶＧ、７２０ＶＧ、７６０ＶＧ、７６３ＡＶＧ、７７５ＶＧ、７８０ＶＧ、２０１ＶＧ、２０６ＶＧ、２０７ＶＧ）が挙げられる。油性アジュバントは、鉱油性アジュバントであることが好ましい。油性アジュバントは、Ｄｒａｋｅｏｌ ＶＲとマンニッドモノオレエートとの混合物であるモンタニドＩＳＡ５１ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ）であることが、より好ましい。
【0026】
医薬組成物は、医薬投薬単位を構成するペプチドの量を含むか、又はこれらからなることが好ましい。医薬投薬単位は、所与の時間点で対象に適用される有効成分の量（つまり、ペプチドベースのワクチンにおけるペプチドの総量）として本明細書で定義される。医薬投薬単位は、一回体積、つまりシングルショットで対象に適用されてもよく、又は、好ましくは身体の異なる位置、例えば左右の手足に適用される２、３、４、５又はより多くの別個の体積又はショットで、対象に適用されてもよい。一回の医薬投薬単位を別個の体積で適用する理由は、複数ある場合があり、例えば、負の副作用の回避、抗原の競合の回避、及び／又は組成物の分析上の考慮などがある。別個の体積の医薬投薬は、組成が異なってもよく、つまり、異なる種類又は組成の有効成分及び／又はアジュバントを含んでもよいことが、本明細書で理解されるべきである。本発明の利点の１つは、本発明の再構築組成物が、異なるペプチド混合物の再構築及びそれに続く油性アジュバントを使用した乳化に適しているということであるので、全医薬投薬単位内の全ての有効成分（抗原性ペプチド）について、単一の再構築組成物が使用されると理解されるべきである。単一の再構築組成物、及び好ましくは単一の油性アジュバントは、再構築及び乳化の人為的失敗の可能性を最少化する。
【0027】
合計医薬投薬量又は実質的に同じ時間点で適用される複数のショットの場合はその一部の量を含んでいる一回の注射の体積又はショット（つまり、ある時間点で１箇所に適用される体積）は、１００μＬ～２ｍＬ又は１００μＬ～１ｍＬであり得る。一回注射体積は、１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬ、１ｍＬ、１．１ｍＬ、１．２ｍＬ、１．３ｍＬ、１．４ｍＬ、１．５ｍＬ、１．６ｍＬ、１．７ｍＬ、１．８ｍＬ、１．９ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ又はその間の任意の値であり得る。
【0028】
医薬投薬単位は、有効量又は有効量の一部であり得る。「有効量」は、疾患（例えば、慢性感染、前癌性状態及び／又は癌）の症状を、未処置の患者と比較して予防及び／又は減少するために必要な有効成分の量又は用量として本明細書で理解される。疾患又は状態の予防及び／又は治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物（複数可）の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重、及び全体的健康状態に応じて変動する。最終的には、担当の医師又は獣医師が、適切な量及び投与計画を決定する。そのような量は「有効」量と呼ばれる。この有効量は、処置される対象に有効な細胞性Ｔ細胞応答、より好ましくは有効な全身性細胞性Ｔ細胞応答を誘導することができる量であり得る。
【0029】
所与の時間点で対象に適用される医薬投薬単位又はペプチドの総量は、一回又は特定の時間点での複数回の注射のいずれかで、０．１μｇ～２０ｍｇの範囲のペプチドの量、例えば、約０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、５．５ｍｇ、６ｍｇ、６．５ｍｇ、７ｍｇ、７．５ｍｇ、８ｍｇ、８．５ｍｇ、９ｍｇ、９．５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ若しくは約２０ｍｇ、又はその間の任意の量のペプチドを含むことが好ましい。医薬投薬単位の好ましい範囲は、０．１μｇ～２０ｍｇ、１μｇ～１０ｍｇ、１０μｇ～５ｍｇ、０．５ｍｇ～２ｍｇ、０．５ｍｇ～１０ｍｇ、又は１ｍｇ～５ｍｇ又は２～４ｍｇである。
【0030】
医薬組成物は、約１～２ｍｇ／ｍＬのペプチドを含む約４０～６０％ｖ／ｖの上記で定義された再構築組成物と、約４０～６０％ｖ／ｖの油性アジュバントとを含むか、又はこれらからなることが好ましい。医薬組成物は、約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５６％、５７％、５８％、５９％又は６０％ｖ／ｖの油性アジュバントを含み得るか又は油性アジュバントからなり得る。医薬組成物は、約１～２ｍｇ／ｍＬのペプチドを含む約５０％ｖ／ｖの上記で定義された再構築組成物中と、約５０％ｖ／ｖの油性アジュバント、好ましくはモンタニドＩＳＡ５１ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ）とを含むか、又はこれらからなることが好ましい。別言すると、医薬組成物は、水中に、約１～２ｍｇ／ｍＬのペプチドと、０．０３８Ｍのクエン酸と、約３．１３％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、約６．２５％ｖ／ｖのエタノールと、約３．１３％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６）と、約５０％の油性アジュバント、好ましくはモンタニドＩＳＡ５１ＶＧ（Ｓｅｐｐｉｃ）とを含むか、又はこれらからなることが好ましい。
【0031】
本発明の医薬組成物は、１つ又は複数のさらなる免疫応答刺激化合物又はアジュバントを含んでもよい。本発明による薬剤は、１つ又は複数の合成アジュバントを追加的に含み得ることが有利である。そのようなさらなる免疫応答刺激化合物又はアジュバントは、（ｉ）ペプチドの再構築、及び任意選択で上記に定義される油性アジュバントとの乳化後に、本発明による医薬組成物と混合されてもよく、（ｉｉ）上記で定義される本発明の再構築組成物の一部であってもよく、（ｉｉｉ）再構築されるペプチド（複数可）と物理的に結合していてもよく、又は（ｉｖ）処置される対象、哺乳動物若しくはヒトに、別個に投与されてもよい。本明細書において、免疫応答刺激化合物は、本発明による薬剤と混合されるときはアジュバントとして示され、別個に投与されるときは、免疫調節剤又は免疫調節因子という本明細書で互換的に使用される用語で示されると解釈されるべきである。Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する、及び／又はＲＩＧ－Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子１）タンパク質を介して作用する、及び／又はエンドセリン受容体を介して作用することが既知のアジュバントが特に好ましい。先天性免疫系を活性化することが可能な免疫修飾化合物は、ＴＬＲ１～１０を含むＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して特に良く活性化することができる。ＴＬＲ受容体を活性化することができる化合物並びにその修飾体及び誘導体は、当技術分野において文書でよく示されている。ＴＬＲ１は、細菌リポタンパク質及びそのアセチル化形態によって活性化することができ、ＴＬＲ２は、加えて、グラム陽性細菌の糖脂質ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、線毛、外膜タンパク質、細菌又は宿主由来の熱ショックタンパク質、及びマイコバクテリアのリポアラビノマンナンによって活性化することができる。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡ、特にウイルス起源のｄｓＲＮＡによって、又は、化合物ポリ（Ｉ：Ｃ）によって活性化することができる。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主又は細菌起源の熱ショックタンパク質、ウイルスコート又はエンベロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、ヒアルロナン含有オリゴ糖及びフィブロネクチンによって活性化することができる。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛又はフラジェリンで活性化することができる。ＴＬＲ６は、マイコバクテリアリポタンパク質及びＢ群連鎖球菌熱不安定可溶性因子（ＧＢＳ－Ｆ）又はブドウ球菌モジュリンによって活性化することができる。ＴＬＲ７は、イミキモド、レシキモド、及びイミキモド若しくはレシキモドの誘導体（例えば、３Ｍ－０５２）などのイミダゾキノリンによって活性化することができる。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ又はクロマチン－ＩｇＧ複合体によって活性化することができる。特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する先天性免疫応答の媒介において重要な役割を果たし、これらの受容体を活性化することができる化合物は、本発明の組成物又は医薬において特に好ましい。特に好ましいアジュバントには、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリＩ：ＣＬＣ、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体を誘発する非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニスト、モンタニドＩＳＡ－５１、モンタニドＩＳＡ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ（フランス）製のアジュバント）を含むがこれらに限定されない、合成により製造された化合物が挙げられる。ＲＩＧ－Ｉタンパク質は、ＴＬＲ３のように、ｄｓ－ＲＮＡによって活性化されることが公知である（Kato et al., (2005) Immunity, 1: 19-28）。特に好ましいＴＬＲリガンドは、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／又はその誘導体、好ましくはｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド又はそのバリアント若しくは誘導体、好ましくは、例えば、国際公開第２０１３／０５１９３６号に記載されているもの、より好ましくはＵ－Ｐａｍ１２又はＵ－Ｐａｍ１４又はＡＭＰＬＩＶＡＮＴ（登録商標）である。さらに好ましいアジュバントは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びポリ－ＩＣＬＣである。好ましい実施形態では、本発明のアジュバントは、非天然アジュバント、例えば、国際公開第２０１３／０５１９３６号に記載されるｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド誘導体、ポリ－ＩＣＬＣ、イミキモド、レシキモド又はその誘導体などのイミダゾキノリン、非天然配列を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）又は非天然アミノ酸を含む破傷風トキソイドペプチドなどのペプチドベースのアジュバントである。アジュバントは、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イムファクト（ＩｍｕＦａｃｔ）ＥＶ１Ｐ３２１、ＩＳパッチ（ＩＳ Ｐａｔｃｈ）、ＩＳＳ、イスコマトリックス（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ジュヴイミューン（ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ）、リポバック（ＬｉｐｏＶａｃ）、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ．ＲＴＭ、ベクター系、ＰＬＧＡ微粒子、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、Ｐａｍ３Ｃｙｓ－ＧＤＰＫＨＰＫＳＦ、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、ＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロン（ｓｔｉｍｕｌｏｎ）、バディメザン（ｖａｄｉｍｅｚａｎ）、ＡｓＡ４０４（ＤＭＸＡＡ）、ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子）アゴニスト（例えば、ｃ－ジ－ＧＭＰ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標））、ＰＣＩ、ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ細胞）アゴニスト（例えば、α－ガラクトシルセラミド又はα－ＧａｌＣｅｒ、ＲＮＡｄｊｕｖａｎｔ（登録商標）（Ｃｕｒｅｖａｃ）、レチノイン酸誘導タンパク質Ｉリガンド（例えば、３ｐＲＮＡ又は５’－三リン酸ＲＮＡ）からなる群から選択されることがさらに好ましい。
【0032】
上記のように、アジュバントは、再構築されるペプチド（複数可）に物理的に結合していてもよい。アジュバントと共刺激化合物又は本明細書で下記に定義する抗原性ペプチドに対する官能基との物理的結合は、抗原を内在化、代謝及び提示する抗原提示細胞、特に樹状細胞への標的化を改善することによって、またそのような細胞を同時に刺激して様々な共刺激分子の発現を上方制御し、それにより細胞を誘導及び増強する効率的なＴ細胞応答とすることによって、増強された免疫応答を提供する。別の好ましい免疫修飾化合物は、エンドセリン受容体の阻害剤、例えばＢＱ－７８８（Buckanovich RJ et al., (2008) Nature Medicine 14:28; Ishikawa K, (1994)PNAS 91: 4892）及び／又はその誘導体である。ＢＱ－７８８は、Ｎ－ｃｉｓ－２，６－ジメチルピペリジノカルボニル－Ｌ－γ－メチルロイシル－Ｄ－１－メトキシカルボニルトリプトファニル－Ｄ－ノルロイシンである。別の好ましい免疫応答刺激化合物又はアジュバントは、インターフェロンα（ＩＦＮα）、より好ましくはペグ化インターフェロンαである。さらに、国際公開第９９／６１０６５号及び国際公開第０３／０８４９９９号に示されるような抗原提示細胞（共）刺激分子を本発明のペプチド及び組成物と組み合わせて使用することが好ましい。特に、４－１ＢＢ及び／又はＣＤ４０リガンド、アゴニスト抗体、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド又はそれらの機能的フラグメント及び誘導体並びに同様のアゴニスト活性を有する合成化合物の使用が、対象における最適な免疫応答のマウンティングをさらに刺激するために、本発明のペプチドと別個に又は組み合わせて、処置される対象に、好ましく投与される。
【0033】
本発明の再構築組成物で再構築されるペプチド及び／又は本発明の医薬組成物内に含まれるペプチドは、約１５～約１００個のアミノ酸の長さを有することが好ましい。再構築されるペプチドは、１５～１００アミノ酸長、又は１５～９５アミノ酸長、１５～９０アミノ酸長、１５～８５アミノ酸長、１５～７０アミノ酸長、１５～６５アミノ酸長、１５～６０アミノ酸長、１５～５５アミノ酸長、１５～５０アミノ酸長、１５～４５アミノ酸長、１５～４０アミノ酸長、１７～３９アミノ酸長、１９～４３アミノ酸長、２２～４０アミノ酸長、２２～４５アミノ酸長、又は２８～４０アミノ酸長、若しくは３０～３９アミノ酸長であることが好ましい。再構築されるペプチドは、最大で１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０アミノ酸であることが好ましい。再構築されるペプチドは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５個のアミノ酸であることが好ましい。再構築されるペプチドは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５個のアミノ酸で且つ１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０アミノ酸以下であり、又はこれらの下限及び上限の任意の組合せであることが好ましい。
【0034】
本発明の再構築組成物で再構築されるペプチド及び／又は本発明の医薬組成物内に含まれるペプチドは、タンパク質抗原由来のペプチドであり得る。「タンパク質抗原」は、宿主の動物又はヒトで免疫応答を誘導することができる抗原領域を含むタンパク質又はポリペプチドとして本明細書で理解される。感染細胞、前癌性細胞及び／又は癌細胞によって特異的に発現されるタンパク質抗原は、治療用ワクチンの適切な標的である。そのようなタンパク質抗原は、ウイルス又は非ウイルス抗原であってもよい。予防的及び治療的ワクチンのための標的であるウイルス抗原の例は、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒ）ウイルス誘導リンパ腫のウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＶＣ）、ＫＳＶ及びメルケル細胞癌ウイルス由来の抗原である。ウイルスタンパク質抗原の非限定的な例は、ＥＢＶ由来のタンパク質抗原、例えば、ＬＭＰ１又は後期膜タンパク質１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０３２３０）及びＬＭＰ２又は後期膜タンパク質２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１３２８５）；ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ由来のタンパク質抗原、例えば、Ｔａｘタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１４０７９；Ｐ０Ｃ２１３；Ｐ０３４０９）；ＨＢＶ、例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ由来のタンパク質抗原、例えば、タンパク質ＨＢｓＡｇ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ７７３Ｓ４）、Ｘ－タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ８Ｖ１Ｈ６）、ラージエンベロープタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０３１３８）及びカプシドタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０３１４７）；ＨＣＶ由来のタンパク質抗原、例えば、ゲノムポリタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ２６６６３；Ｑ９９ＩＢ８；Ａ３ＥＺＩ９）及びＨＣＶタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９９３９８）；ＨＰＶ由来のタンパク質抗原、例えば、発癌遺伝子型６、１１、１６又は１８、例えば、Ｅ６発癌性タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０３１２６；Ｐ０６４６３）及びＥ７発癌性タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０３１２９；Ｐ０６７８８）、ＫＳＨＶ由来のタンパク質抗原、例えば、タンパク質ＯＲＦ３６（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｆ５ＨＧＨ５）、コア遺伝子ＵＬ４２ファミリータンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ７７ＺＧ５）、ビリオン放出タンパク質ＵＬ３１ホモログ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｆ５Ｈ９８２）、トリプレックスキャプシドタンパク質ＶＰ１９Ｃホモログ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｆ５Ｈ８Ｙ５）、ウイルス性マクロファージ炎症性タンパク質２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９８１５７）、ｍＲＮＡ輸送因子ＩＣＰ２７ホモログ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２ＨＲ７５）、ＯＲＦ５２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｆ５ＨＢＬ８）、ウイルスＩＲＦ４様タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２ＨＲ７３）、Ｂｃｌ－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ７６ＲＩ８）、ラージテグメントタンパク質ｄｅｎｅｄｄｙｌａｓｅ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ２ＨＲ６４）、Ｖ－サイクリン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ４０９４６）、ＶＩＲＦ－１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｆ５ＨＦ６８）及びＥ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＭＩＲ１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ９０４９５）及び抗原タンパク質メルケル細胞癌ウイルス、例えば、ラージＴタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｅ２ＩＰＴ４；Ｋ４Ｐ１５９）、例えば、スモールＴタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｂ６ＤＶＸ０；Ｂ６ＤＶＸ６）である。
【0035】
予防的及び治療的ワクチンの適切な標的である非ウイルス抗原は、腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍関連抗原であってもよい。腫瘍特異的抗原は、他の任意の細胞でなく腫瘍細胞によって専ら発現される抗原であり、多くは変異したタンパク質であり、例えば、ＫｒａｓＧ１２Ｄ及び変異体Ｐ５３、又はＤＮＡ突然変異及び誤動作のＤＮＡ修復メカニズムによって追って発生するネオ抗原である。腫瘍関連抗原は、腫瘍及び正常細胞の両方に存在する内在性抗原であるが、その発現又は細胞局在が異常調節されている抗原であり、例えば、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ受容体である。治療用ワクチンの標的であり得るそのような非ウイルス抗原の非限定的な例は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ（又はＥｒｂＢ－２、ヒト上皮増殖因子受容体２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０４６２６）；ＷＴ－１又はウィルムス腫瘍タンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１９５４４）；ＮＹ－ＥＳＯ－１又は癌／精巣抗原１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ７８３５８）；ＭＡＧＥ－Ａ３又はメラノーマ関連抗原－Ａ３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４３３５７）；ＢＡＧＥ又はＢメラノーマ抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３０７２）；ＣＥＡ又は癌胎児性抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３９８４）；ＡＦＰ又はα－フェトタンパク質（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０２７７１）；ＸＡＧＥ－１Ｂ又はＸ抗原ファミリーメンバー１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＨＤ６４）；サバイビン又はＢＩＲＣ５、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有タンパク質５（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ１５３９２）；Ｐ５３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０４６３７）；ｈ－ＴＥＲＴ又はテロメラーゼ逆転写酵素（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ１４７４６）；メソテリン（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｈ３ＢＲ９０）；ＰＲＡＭＥ又は腫瘍において優先的に発現されるメラノーマ抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ７８３９５）；ＭＵＣ－１又はムチン－１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１５９４１）；Ｍａｒｔ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ又はＴ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１６６５５）；ＧＰ－１００又はメラノサイトタンパク質ＰＭＥＬ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４０９６７）；チロシナーゼ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｕ３Ｍ８Ｎ０）；チロシナーゼ関連タンパク質－１（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ１７６４３）；チロシナーゼ関連タンパク質－２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｏ７５７６７）；ＰＡＰ又はＰＡＰＯＬＡ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼα（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ５１００３）；ＰＳＡ又は前立腺特異的膜抗原（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０７２８８）；ＰＳＭＡ又は前立腺特異的膜抗原又はグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ２（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０４６０９）である。
【0036】
ペプチド－ワクチンのための好ましい腫瘍特異的抗原標的は、ウイルス癌遺伝子及びネオ抗原である。「ネオ抗原」は、ゲノムがコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させる腫瘍特異的変異（複数可）から生じる腫瘍抗原として本明細書で理解される。ネオ抗原は、個々の患者の癌（又は新生物又は腫瘍）に特有に存在する全て又はほぼ全ての変異ネオ抗原を解明する全ゲノム配列決定によって同定し得る。この変異ネオ抗原のコレクションは、患者の癌の処置のためのパーソナライズされた癌ワクチンの開発のための抗原の供給源として使用するための、変異ネオエピトープの特定の最適化されたサブセットを同定するために分析され得る。そのようなネオ抗原を同定するための方法は、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１６８８７４号に記載されている。
【0037】
抗原タンパク質に「由来」するペプチドは、抗原タンパク質から選択される連続するアミノ酸配列であって、１つ又は複数のアミノ酸の欠失又は置換によって、Ｎ－及び／又はＣ－末端で追加のアミノ酸又は官能基での延長によって、修飾されていてもよく、バイオアベイラビリティ、Ｔ細胞への標的化を改善し得る、又はアジュバント若しくは（共）刺激機能を提供する免疫調節物質を含む若しくは放出し得る、連続アミノ酸配列を含むものものとして、本明細書で理解される。
【0038】
医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、天然にない長さの合成の結果として、又はペプチドが由来するタンパク質抗原に由来しない追加のアミノ酸を含む結果として、並びに／又は修飾アミノ酸及び／若しくは非天然アミノ酸及び／若しくはフッ素化基、フルオロカーボン基、ヒトＴｏｌｌ様受容体リガンド及び／若しくはアゴニスト、オリゴヌクレオチド結合体、ＰＳＡ、糖鎖又はグリカン、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／若しくはその誘導体、好ましくは国際公開第２０１３／０５１９３６号に記載されているもの、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＤＣパルスカセット、破傷風毒素由来ペプチド、ヒトＨＭＧＢ１由来ペプチドなどの共有結合的に連結される官能基を、上記に示されるようにペプチド内に又はペプチドへの付加のいずれかで含む結果として、非天然配列を含むか、又は非天然配列からなるものでもよい。本発明のペプチドは、２－アミノイソ酪酸（Ａｂｕ、システインの同配体）を含んでもよい。本発明のペプチドのシステインが、Ａｂｕで置換されていてもよい。
【0039】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、単離されたペプチドであることが好ましく、ここで「単離された」は、ペプチドが精製される程度を反映するものではないが、ペプチドが天然の環境から取り出されている（つまり、ヒトの操作を受けている）ことを示し、組換え的に産生されたペプチド又は合成的に製造されたペプチドであり得る。
【0040】
比較的短いペプチドの使用は、およそ１００個のアミノ酸、つまり９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５個のアミノ酸より大きい天然タンパク質では成り立たず又は経済的でないｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に合成可能であることから、医療目的のために非常に好ましい。ペプチドの化学合成は日常的に行われており、種々の適切な方法が当業者に知られている。またペプチドの化学合成は、標準化が困難で大規模な精製及び品質管理手段が必要になる組換えによる完全なタンパク質の産生に関連する問題を克服する。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩエピトープの長さを超える長さを有するペプチド（例えば、本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドに関して本明細書で説明された長さを有するもの）は、国際公開第０２／０７０００６号に説明されるようなプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に、樹状細胞（ＤＣ）によって取り込まれるために十分な大きさであり、含有されているＨＬＡクラスＩ提示及びＨＬＡクラスＩＩ提示エピトープの細胞表面提示が行われる前にＤＣでプロセシングされることから、ワクチン成分として使用するために、特に有利である。それゆえ、非抗原提示細胞上の最小限のＨＬＡクラスＩ提示エピトープの全身提示によるＴ細胞寛容の不都合な誘導（Ｔｏｅｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９６）ＵＳＡ ９３（１５）：７８５５及びＴｏｅｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９６）１５６（１０）：３９１１）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩエピトープの長さを超えるペプチドを適用することによって（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６９：３５０～３５８）に示されるように）予防される。全長タンパク質を用いた治療ワクチン接種は、本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドに関して本明細書で説明した長さを有するペプチドを用いたワクチン接種と比較して、あまり強力でない可能性が高い（Ｒｏｓａｌｉａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１３）４３：２５５４～２５６５）。
【0041】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、それぞれが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩ提示エピトープの長さを超える、本明細書で長鎖ペプチドとも称される約１５～約１００アミノ酸長のペプチドであり、それ自体で又は混合物のいずれかで、治療的に有効で患者において高いパーセンテージで治癒を誘発するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答組合せを誘導するペプチドであることが好ましい。本発明の長鎖ペプチドは、本明細書で合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）と称される合成ペプチドであることが好ましい。
【0042】
「ＣＴＬエピトープ」は、プロテアソーム媒介性タンパク質分解切断によってタンパク質源から放出され、その後に抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくはヒト抗原提示細胞の細胞表面にＨＬＡクラスＩ分子によって提示される、ポリペプチド抗原の線状断片として本明細書で理解される。本発明のＣＴＬエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化できることが好ましい。ＣＴＬエピトープは、典型的に、少なくとも８個から最大１２個まで、又は例外的に１３又は１４個のアミノ酸を含む。ＣＴＬエピトープは、８～１４個のアミノ酸からなり、つまり、少なくとも８個から最大１４個のアミノ酸の長さを有することが好ましい。
【0043】
「Ｔｈ細胞エピトープ」は、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって認識される線形ペプチド断片であると本明細書で理解される。Ｔｈ細胞エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導することができる。ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）エピトープは、典型的に１５から最大２０個又は例外的にさらに多くのアミノ酸を含む。ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープは、１０～２０個又は１０～１５個のアミノ酸を含むことが好ましい。
【0044】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドのＴｈ細胞エピトープは、ＣＤ４＋メモリーヘルパーＴ及び／又はＣＤ４＋エフェクターヘルパーＴ応答の活性化、つまりＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化が可能であることが最も好ましい。このことは、ＤＣのＣＤ４０トリガーを介してシグナルを「殺すためのライセンス」によって（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３９３：４１３）、より強固なＣＤ８＋エフェクター及びメモリ細胞障害性Ｔ細胞応答を導く。別の状況では、活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、免疫系の非ＨＬＡ拘束性キラー細胞を活性化し得る。
【0045】
本発明の文脈において、「タンパク質抗原由来の最大で１００個の連続アミノ酸を含むペプチド」は、タンパク質抗原に由来し、本明細書で定義されるペプチドに存在する連続アミノ酸の数が、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０アミノ酸以下であることを意味する。本発明の文脈において、「タンパク質抗原由来の少なくとも１５個の連続アミノ酸を含むペプチド」は、タンパク質抗原に由来し、本明細書で定義されるペプチドに存在する連続アミノ酸の数が、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５個又はより多くのアミノ酸であることを意味する。本発明の文脈において、「タンパク質抗原由来の１５～１００個の連続アミノ酸を含むペプチド」は、タンパク質抗原に由来し、本明細書で定義されるペプチドに存在する連続アミノ酸の数が、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５個のアミノ酸、且つ１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０アミノ酸以下であることを意味する。より好ましくは、再構築されるペプチド内に含まれるタンパク質抗原由来の連続アミノ酸配列の長さは、１５～１００個のアミノ酸、又は好ましくは１５～９５個のアミノ酸、又は１５～９０個のアミノ酸、又は１５～８５個のアミノ酸、又は１５～７０個のアミノ酸、又は１５～２５個のアミノ酸、又は１５～６０個のアミノ酸、又は１５～５５個のアミノ酸、又は１５～５０個のアミノ酸であることがより好ましく、１５～４５個のアミノ酸であることがさらにより好ましく、１５～４０個のアミノ酸であることがさらにより好ましく、１７～３９個であることがさらにより好ましく、１９～４３個のアミノ酸であることがさらにより好ましく、２２～４０個のアミノ酸であることがさらにより好ましく、２８～４０個であることがさらにより好ましく、３０～３９個のアミノ酸であることがさらにより好ましい。
【0046】
本発明による医薬組成物は、以下の特性
ａ．塩基性アミノ酸残基のパーセンテージが酸性アミノ酸残基のパーセンテージと等しい、及び
ｂ．疎水性アミノ酸残基のパーセンテージが４８％以上である
の両方を満たすペプチドを含まないことが好ましい。
ａ．塩基性アミノ酸残基のパーセンテージが酸性アミノ酸残基のパーセンテージと等しい、及び
ｂ．疎水性アミノ酸残基のパーセンテージが４８％以上である
の両方を満たすペプチドを含まないことが好ましい。
【0047】
この実施形態の目的について、アミノ酸残基は、以下の通り、「酸性」、「塩基性」、「疎水性」又は「中性」として分類される：
【0048】
【表1】
【0049】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、好ましくは抗原性ペプチドである。「抗原性ペプチド」は、（高度に）免疫原性であり、対象、好ましくはヒト又は動物対象へワクチン組成物として投与されたときに強力な抗原指向性ＣＤ４＋ヘルパーＴ及びＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞応答の組合せを誘導することができるものとして、本明細書で理解される。ペプチドは、免疫原性であることが予測されるものでもよく、及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏアッセイを使用して、若しくは免疫原性を確立するために当技術分野で認識されているｉｎ ｖｉｖｏ試験を行うことによって、免疫原性であることが証明されるものでもよい。ペプチドは、好ましくは
免疫系の活性化若しくは誘導、及び／又はエリスポットアッセイによって若しくはＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞のテトラマー染色によって確立される末梢血若しくは組織中の抗原特異的活性化ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、又は処置の少なくとも１週間後のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって確立されるこれらのＴ細胞により産生されるサイトカインの増加；並びに／或いは
抗原関連感染の増殖の阻害、又は抗原発現細胞の検出可能な減少、又は抗原発現細胞の細胞生存率の減少；並びに／或いは
抗原発現細胞の細胞死の誘導又は細胞死の増加の誘導；並びに／或いは
抗原発現細胞の増加の阻害又は予防
によって検出できるように、対象における抗原関連疾患又は状態の予防、部分的クリアランス及び／又は処置、又は完全クリアランスに有効に使用することができることが好ましい。
免疫系の活性化若しくは誘導、及び／又はエリスポットアッセイによって若しくはＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞のテトラマー染色によって確立される末梢血若しくは組織中の抗原特異的活性化ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、又は処置の少なくとも１週間後のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって確立されるこれらのＴ細胞により産生されるサイトカインの増加；並びに／或いは
抗原関連感染の増殖の阻害、又は抗原発現細胞の検出可能な減少、又は抗原発現細胞の細胞生存率の減少；並びに／或いは
抗原発現細胞の細胞死の誘導又は細胞死の増加の誘導；並びに／或いは
抗原発現細胞の増加の阻害又は予防
によって検出できるように、対象における抗原関連疾患又は状態の予防、部分的クリアランス及び／又は処置、又は完全クリアランスに有効に使用することができることが好ましい。
【0050】
好ましい実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ペプチドの上記組合せであって、処置されるヒト対象の集団において優性であるＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡクラスＩ分子の少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を包含するペプチドの組合せを含む。ＨＬＡ対立遺伝子は、処置されるヒト対象の集団で優性である。本発明によるペプチドにおける好ましいＨＬＡクラスＩエピトープは、ＨＬＡ－Ａ０１０１；ＨＬＡ－Ａ０２０１；ＨＬＡ－Ａ０２０６；ＨＬＡ－Ａ０３０１；ＨＬＡ－Ａ１１０１；ＨＬＡＡ２３０１；ＨＬＡ－Ａ２４０２；ＨＬＡ－Ａ２５０１；ＨＬＡ－Ａ２６０１；ＨＬＡ－Ａ２９０２；ＨＬＡ－Ａ３００１；ＨＬＡＡ３００２；ＨＬＡ－Ａ３１０１；ＨＬＡ－Ａ３２０１；ＨＬＡ－Ａ３３０３；ＨＬＡ－Ａ６８０１；ＨＬＡ－Ａ６８０２；ＨＬＡＡ７４０１；ＨＬＡ－Ｂ０７０２；ＨＬＡ－Ｂ０８０１；ＨＬＡ－Ｂ１３０１；ＨＬＡ－Ｂ１３０２；ＨＬＡ－Ｂ１４０２；ＨＬＡＢ１５０１；ＨＬＡ－Ｂ１５０２；ＨＬＡ－Ｂ１５２５；ＨＬＡ－Ｂ１８０１；ＨＬＡ－Ｂ２７０２；ＨＬＡ－Ｂ２７０５；ＨＬＡＢ３５０１；ＨＬＡ－Ｂ３５０３；ＨＬＡ－Ｂ３７０１；ＨＬＡ－Ｂ３８０１；ＨＬＡ－Ｂ３９０１；ＨＬＡ－Ｂ４００１；ＨＬＡＢ４００２；ＨＬＡ－Ｂ４４０２；ＨＬＡ－Ｂ４４０３；ＨＬＡ－Ｂ４６０１；ＨＬＡ－Ｂ４８０１；ＨＬＡ－Ｂ４９０１；ＨＬＡＢ５００１；ＨＬＡ－Ｂ５１０１；ＨＬＡ－Ｂ５２０１；ＨＬＡ－Ｂ５３０１；ＨＬＡ－Ｂ５５０１；ＨＬＡ－Ｂ５６０１；ＨＬＡＢ５７０１；ＨＬＡ－Ｂ５８０１及びＨＬＡ－Ｂ５８０２に結合することができるエピトープである。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、処置されるヒト対象の集団において優性であるＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡクラスＩ分子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を包含し、ここで「ＨＬＡクラスＩ分子を包含する」とは、上記ＨＬＡクラスＩ分子への結合親和性、好ましくは中間の結合親和性、より好ましくは高い結合親和性を示すＣＴＬエピトープを含むものとして本明細書において理解される。本発明のペプチドは、ＨＬＡ－Ａ０１０１；ＨＬＡ－Ａ０２０１；ＨＬＡ－Ａ０２０６；ＨＬＡ－Ａ０３０１；ＨＬＡ－Ａ１１０１；ＨＬＡ－Ａ２３０１；ＨＬＡ－Ａ２４０２；ＨＬＡ－Ａ２５０１；ＨＬＡ－Ａ２６０１；ＨＬＡ－Ａ２９０２；ＨＬＡ－Ａ３００１；ＨＬＡ－Ａ３００２；ＨＬＡ－Ａ３１０１；ＨＬＡ－Ａ３２０１；ＨＬＡ－Ａ３３０３；ＨＬＡ－Ａ６８０１；ＨＬＡ－Ａ６８０２；ＨＬＡ－Ａ７４０１；ＨＬＡ－Ｂ０７０２；ＨＬＡ－Ｂ０８０１；ＨＬＡ－Ｂ１３０１；ＨＬＡ－Ｂ１３０２；ＨＬＡ－Ｂ１４０２；ＨＬＡ－Ｂ１５０１；ＨＬＡ－Ｂ１５０２；ＨＬＡ－Ｂ１５２５；ＨＬＡ－Ｂ１８０１；ＨＬＡ－Ｂ２７０２；ＨＬＡ－Ｂ２７０５；ＨＬＡ－Ｂ３５０１；ＨＬＡ－Ｂ３５０３；ＨＬＡ－Ｂ３７０１；ＨＬＡ－Ｂ３８０１；ＨＬＡ－Ｂ３９０１；ＨＬＡ－Ｂ４００１；ＨＬＡ－Ｂ４００２；ＨＬＡ－Ｂ４４０２；ＨＬＡ－Ｂ４４０３；ＨＬＡ－Ｂ４６０１；ＨＬＡ－Ｂ４８０１；ＨＬＡ－Ｂ４９０１；ＨＬＡ－Ｂ５００１；ＨＬＡ－Ｂ５１０１；ＨＬＡ－Ｂ５２０１；ＨＬＡ－Ｂ５３０１；ＨＬＡ－Ｂ５５０１；ＨＬＡ－Ｂ５６０１；ＨＬＡ－Ｂ５７０１；ＨＬＡ－Ｂ５８０１及びＨＬＡ－Ｂ５８０２からなるＨＬＡクラスＩ分子の群の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を包含することが好ましい。
【0051】
再構築組成物は、単一の種類のペプチド（つまり、全てが実質的に同じ又は同じアミノ酸配列を有するペプチド）を再構築するために、又は異なるアミノ酸配列を有する異なるペプチドの混合物のために使用することができる。本発明の医薬組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２個、最大で３３個の異なるペプチドを含むことが好ましい。「異なるペプチド」は、その全長にわたって決定される配列同一性が、好ましくは６０％、５０％、４０％未満、又は好ましくは３０％未満の異なるアミノ酸配列を有するものとして本明細書で理解される。本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる異なるペプチドは、これらのペプチドが誘導されるタンパク質抗原の全アミノ酸配列と一緒に重複している、本明細書で上記に定義した長さを有するペプチドであり得る。しかしながら、一部の場合には、タンパク質抗原の全長にわたる重複（合成）長鎖ペプチドの完全なセットで免疫化することは実現不可能であり、選択がなされる必要がある。ワクチンにおけるペプチドの数を絞り込むために、最も免疫原性の長鎖ペプチドであって、患者の最も高いパーセンテージによって認識されるペプチドを選択し、組み込むことが好ましい。
【0052】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドの少なくとも１つは、分子間ジスルフィド架橋が可能な少なくとも１つのシステイン残基を有してもよく、又は分子内及び分子間ジスルフィド架橋を形成することができる少なくとも２つのシステイン残基を有してもよい。本発明によるワクチン組成物は、ペプチドの組合せであって、本明細書で上記に定義した処置されるヒト対象の集団において優性であるＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡクラスＩ分子の少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を包含するペプチドの上記組合せを含むことが好ましい。
【0053】
本発明の再構築組成物における再構築されるペプチドの量は、好ましくは、医薬投薬単位及び／又は本明細書で上記に定義した一回単位で注射される量である。
【0054】
乾燥されたペプチドは、さらなる成分を含まないペプチドであってもよいが、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの緩衝成分、ナトリウム、カリウム又はリン酸塩のような塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＮａＰＯ４）を含むものでもよい。さらなる成分の量は、再構築される乾燥ペプチドの総重量の好ましくは３０％未満であり、より好ましくは２５％未満である。乾燥された、再構築されるペプチドは、限定されないが、ローター蒸発、凍結乾燥（フリーズドライ）、及び噴霧乾燥などのプロセスによって取得できるような物理的に乾燥された状態であってもよい。
【0055】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドが誘導される好ましいタンパク質抗原は、本明細書で以下に定義される。
【0056】
ＨＰＶ由来ペプチド
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、初期ＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。連続アミノ酸配列は、高リスクＨＰＶ血清型、例えば血清型１６、１８、３１、３３又は４５由来のＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質の全長アミノ酸配列から選択されることが好ましく、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７血清型１６、１８、３１又は３３のアミノ酸配列から選択されることがより好ましく、血清型１６又は１８のアミノ酸配列から選択されることが最も好ましく、中でも１６のアミノ酸配列が最も好ましい。ＨＰＶ血清型１６ Ｅ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１２０）、Ｅ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１２６）及びＥ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１２９）タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４～１６に示されている。ＨＰＶ血清型１８Ｅ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７９０）、Ｅ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６４６３）及びＥ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７８８）タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７～１９に示されている。
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、初期ＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ２、Ｅ６又はＥ７から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。連続アミノ酸配列は、高リスクＨＰＶ血清型、例えば血清型１６、１８、３１、３３又は４５由来のＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質の全長アミノ酸配列から選択されることが好ましく、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７血清型１６、１８、３１又は３３のアミノ酸配列から選択されることがより好ましく、血清型１６又は１８のアミノ酸配列から選択されることが最も好ましく、中でも１６のアミノ酸配列が最も好ましい。ＨＰＶ血清型１６ Ｅ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１２０）、Ｅ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１２６）及びＥ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１２９）タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４～１６に示されている。ＨＰＶ血清型１８Ｅ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７９０）、Ｅ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６４６３）及びＥ７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０６７８８）タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７～１９に示されている。
【0057】
本発明の医薬組成物で再構築され及び／又はそれに含まれ、ＨＰＶ Ｅ６及びＥ７タンパク質から誘導される好ましいペプチド及びペプチドミックスは、国際公開第００／７５３３６号で定義される通りである。好ましいペプチドは、配列番号２０～２６のいずれか１つによって表される免疫原性領域内の連続配列を含むか、又は該連続配列からなるペプチドである。
【0058】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる１つ又は複数のペプチドは、配列番号２７～６７によって表される群から選択されるＣＴＬエピトープを含むことが好ましい。
【0059】
本発明の医薬組成物で再構築され及び／又はそれに含まれ、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質から誘導される好ましいペプチド及びペプチドミックスは、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００２／０７０００６号及び国際公開第２００２／０９０３８２号で定義される通りである。好ましいペプチドは、ＨＰＶ免疫原性領域Ｅ２（３１～１２０）；Ｅ２（１５１～１９５）；Ｅ２（２７１～３６５）；Ｅ６（８１～１５８）；Ｅ７（３１～７７）、好ましくはＨＰＶ１６血清型のそれらの免疫原性領域であって、それぞれ配列番号６８～７２によって定義される領域内の連続配列を含むか、又は該連続配列からなるペプチドである。
【0060】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる１つ又は複数のペプチドは、ＤＲ１／Ｅ２ ３５１～３６５、ＤＲ２／Ｅ２ ３１６～３３０、ＤＲ２／Ｅ２ ３４６～３５５、ＤＲ４／Ｅ２ ５１～７０、Ｅ２ ６１～７６、ＤＱ６／Ｅ２ ３１１～３２５、ＤＲ１５／Ｅ７ ５０～６２、ＤＲ３／Ｅ７ ４３～７７、ＤＱ２／Ｅ７ ３５～５０及びＤＲ１／Ｅ６ １２７～１４２（それぞれ配列番号７３～８２によって本明細書で表される）から選択されるＴｈエピトープを含むことが好ましい。
【0061】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞によって、又は子宮頸部腫瘍性病変から排出され、骨盤領域のリンパ節に存在する若しくはそれから単離されるＴ細胞によって認識される少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むことが好ましい。Ｔ細胞エピトープは、転移性腫瘍細胞を含む流入領域リンパ節に存在する又はそれから単離されたものであることが好ましい。そのようなエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１４７１８７号、米国特許出願公開第２００６／０１８２７６２号、国際公開第２００６／０１３３３６号、国際公開第２００９／１４８２３０号、国際公開第２００９／１４８２２９号、国際公開第２００２／０４４３８４号に開示されている。
【0062】
さらに、本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる好ましいペプチドでは、連続アミノ酸配列は、子宮頸部腫瘍性病変に浸潤するＴ細胞によって又は流入領域リンパ節からのＴ細胞によって認識されるＴ細胞エピトープであることが証明されている配列番号８３～１０４によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列からなる群から選択されるエピトープを含む。
【0063】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドに含まれる好ましいクラスＩＩ ＣＤ４＋Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号８３～９９によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列からなる群から選択される。
【0064】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドに含まれる好ましいクラスＩ ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞エピトープは、配列番号８５、８２、１００～１０４によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列からなる群から選択される。
【0065】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる好ましいペプチドは、配列番号１～１３によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列を含むか、又は該配列からなる。
【0066】
本発明のワクチン組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる好ましいペプチドのミックスは、配列番号１～５から選択される配列を含むか若しくは該配列からなるペプチドの少なくとも１、２、３、４若しくは５個；配列番号１～６によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列を含むか若しくは該配列からなるペプチドの少なくとも１、２、３、４、５若しくは６個；又は配列番号７～１３によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択される連続アミノ酸配列を含むか若しくは該配列からなるペプチドの少なくとも１、２、３、４、５、６若しくは７個を有するペプチドのミックスである。医薬組成物は、配列番号１～５、配列番号１～６、又は配列番号７～１３を有するペプチドの混合物を含むことが好ましい。混合物中の異なるペプチドは、実質的に等しい比率で医薬組成物中に存在していることが好ましい。
【0067】
ＨＢＶ由来ペプチド
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、例えば、配列番号１０５～１０８によって本明細書で表される、ＨＢＶ－Ａタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１５９）、ＨＢＶコアタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ｃ６２５）、ＨＢＶ Ｘタンパク質、及びＨＢＶラージ表面タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１４１）に由来する、様々な遺伝子型から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１８７００９号、国際公開第２０１４／１０２５４０号、国際公開第９３／０３７５３号、国際公開第９５／０３７７７号、米国特許出願公開第２０１０／００６８２２８号、米国特許出願公開第２００９／０３１１２８３号に開示されている。
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、例えば、配列番号１０５～１０８によって本明細書で表される、ＨＢＶ－Ａタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１５９）、ＨＢＶコアタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０Ｃ６２５）、ＨＢＶ Ｘタンパク質、及びＨＢＶラージ表面タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０３１４１）に由来する、様々な遺伝子型から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１８７００９号、国際公開第２０１４／１０２５４０号、国際公開第９３／０３７５３号、国際公開第９５／０３７７７号、米国特許出願公開第２０１０／００６８２２８号、米国特許出願公開第２００９／０３１１２８３号に開示されている。
【0068】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる１つ又は複数のペプチドは、配列番号１０９～１４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又は該配列からなることが好ましい。
【0069】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号１０９、１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３４、１３５、１３８及び１４２からなる群から選択される、より好ましくは、配列番号１０９、１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３５、１３８及び１４２からなる群から選択される、さらにより好ましくは、配列番号１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３４、１３５及び１４２からなる群から選択される、さらにより好ましくは配列番号１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３５及び１４２からなる群から選択される、さらにより好ましくは配列番号１１８、１２１、１２９、１３２、１３３及び１４２からなる群から選択される、最も好ましくは配列番号１３３、１４２及び１２１の群から選択されるペプチドを含むか又は該ペプチドからなることが好ましい。本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる１つ又は複数のペプチドは、配列番号１０９、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２～１３５からなる群から選択されるペプチドを含むか又は該ペプチドからなることが好ましい。本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる１つ又は複数のペプチドは、配列番号１２２、１２９及び１３３からなる群から選択されるペプチドを含むか又は該ペプチドからなることが好ましい。
【0070】
本発明のワクチン組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドの好ましいミックスは、配列番号１０９～１４６からなる群から選択される、より好ましくは配列番号１０９、１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３４、１３５、１３８及び１４２からなる群から選択される、より好ましくは配列番号１０９、１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３５、１３８及び１４２からなる群から選択される、さらにより好ましくは配列番号１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３４、１３５及び１４２からなる群から選択される、さらにより好ましくは配列番号１１３、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２、１３３、１３５及び１４２からなる群から選択される、さらにより好ましくは配列番号１１８、１２１、１２９、１３２、１３３及び１４２からなる群から選択される、最も好ましくは配列番号１３３、１４２及び１２１の群から選択されるペプチドを含むか又は該ペプチドからなるペプチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２個、最大で３３個の異なるペプチドのミックスである。配列番号１０９、１１８、１２１、１２２、１２６、１２９、１３２～１３５からなる群から選択される、より好ましくは配列番号１２１、１２９及び１３３からなる群から選択されるペプチドを含むか又は該ペプチドからなるペプチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２個、最大で３３個の異なるペプチドを含む組成物がさらに好ましい。本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるさらに好ましいミックスは、配列番号１２１のペプチドと配列番号１３９、１４０、１３３、１３９、１４２、１１８、１２９の少なくとも１つを含むか、又はそれからなるペプチドとの組合せを含むか、又は該組合せからなるペプチドを含むミックス；及び配列番号１３３のペプチドと配列番号１３９、１４０、６３、１３９、１４２、１１８、１２９の少なくとも１つを含むか、又はそれからなるペプチドとの組合せを含むか、又は該組合せからなるペプチドを含むミックスである。混合物中の異なるペプチドは、実質的に等しい比率で医薬組成物中に存在していることが好ましい。
【0071】
ＰＲＡＭＥ由来ペプチド
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号１４７によって本明細書で表されるＰＲＡＭＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８３９５）から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１１８０１７号に開示されている。再構築されるペプチドのうちの１つ又は複数は、配列番号１４８～１６７によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか、又は該ペプチドからなることが好ましい。本発明のワクチン組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドの好ましいミックスは、配列番号１４８～１６７から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の異なるペプチドのミックスである。
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号１４７によって本明細書で表されるＰＲＡＭＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ７８３９５）から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１１８０１７号に開示されている。再構築されるペプチドのうちの１つ又は複数は、配列番号１４８～１６７によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか、又は該ペプチドからなることが好ましい。本発明のワクチン組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドの好ましいミックスは、配列番号１４８～１６７から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の異なるペプチドのミックスである。
【0072】
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれる１つ又は複数のペプチドは、配列番号１６８～１６９から選択されるＴｈエピトープを含むことが好ましい。
【0073】
Ｐ５３由来ペプチド
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号１９０によって本明細書で表されるＰ５３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０４６３７）から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１４７１８６号に開示されている。再構築されるペプチドのうちの１つ又は複数は、配列番号１９１～２１１によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチド、より好ましくは配列番号１９１～２０４によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか、又は該ペプチドからなることが好ましい。
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号１９０によって本明細書で表されるＰ５３（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０４６３７）から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１４７１８６号に開示されている。再構築されるペプチドのうちの１つ又は複数は、配列番号１９１～２１１によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチド、より好ましくは配列番号１９１～２０４によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか、又は該ペプチドからなることが好ましい。
【0074】
本発明のワクチン組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドの好ましいミックスは、配列番号１９１～２１１から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の異なるペプチドのミックスである。
【0075】
ＰＳＭＡ由来ペプチド
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号２１２によって本明細書で表されるＰＳＭＡ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０４６０９）から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／００６０５０号に開示されている。再構築されるペプチドのうちの１つ又は複数は、配列番号２１３～２３２によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか、又は該ペプチドからなることが好ましい。
本発明の医薬組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドは、配列番号２１２によって本明細書で表されるＰＳＭＡ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ０４６０９）から誘導されるペプチド（のミックス）であり得る。好ましいペプチド、ペプチドミックス、及びこれらのペプチド内に存在するエピトープは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／００６０５０号に開示されている。再構築されるペプチドのうちの１つ又は複数は、配列番号２１３～２３２によって定義されるアミノ酸配列からなる群から選択されるペプチドを含むか、又は該ペプチドからなることが好ましい。
【0076】
本発明のワクチン組成物で再構築される及び／又はそれに含まれるペプチドの好ましいミックスは、配列番号２１３～２３２から選択される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個の異なるペプチドのミックスである。
【0077】
本明細書で定義される特定の抗原タンパク質、ペプチド及びエピトープのいずれかと実質的同一性を示す抗原タンパク質、ペプチド及びエピトープも、好ましい抗原タンパク質、再構築されるペプチド及びこれらのペプチド内のエピトープの中に含まれる。配列同一性は、配列の比較によって決定される、２つ以上のアミノ酸配列（ポリペプチド又はタンパク質）間の関係によって、本明細書で定義される。当技術分野において、「同一性」は、そのような配列の文字列間の一致によって決定されるアミノ酸配列間の配列類縁性の程度も意味する。配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つのペプチド配列のアラインメントによって決定することができる。同等の長さの配列は、全体の長さにわたって最適に配列を整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列させることが好ましく、一方で、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列させることが好ましい。次いで、配列は、それらが（デフォルトパラメータを使用して、例えば、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合に）少なくともある特定の最小パーセンテージの配列同一性（下記に定義される）を共有するとき、「実質的に同一」として参照され得る。ＧＡＰは、２つの配列を、それらの全体の長さ（全長）にわたって一致の数を最大にし、ギャップの数を最少化して整列させるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用する。グローバルアラインメントは、２つの配列が同等の長さを有する場合に配列同一性を決定するために使用することが適切である。一般に、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ生成ペナルティー＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティー＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用される。タンパク質について、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Henikoff&Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919）。配列同一性パーセンテージのための配列アラインメント及びスコアは、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USAから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータープログラムを使用して、或いは、プログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルのＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）又は「ｗａｔｅｒ」（ローカルのＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）などのオープンソースソフトウェアを、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０で、上記ＧＡＰと同じパラメータを用いて、又はデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について、デフォルトギャップオープニングペナルティーは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは０．５である：デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてＢｌｏｓｓｕｍ６２である）を用いて使用することにより、決定してもよい。配列が、実質的に異なる全長を有するとき、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するアラインメントが好ましい。
【0078】
代替的に、同一性パーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用して、公的データベースに対して検索を行うことによって、決定し得る。したがって、本発明のタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公的データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＢＬＡＳＴｐ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施してもよい。比較のためのギャップアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるギャップＢＬＡＳＴを利用してもよい。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｐ）のデフォルトパラメータを使用することができる。米国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照のこと。
【0079】
本明細書で定義されるその関連抗原タンパク質、ペプチド又はエピトープに実質的な同一性を示す抗原タンパク質、ペプチド又はエピトープは、上記特定の配列の全長に基づいて（つまりその全長にわたって又は全体として）、本明細書で参照される特定の配列のいずれか１つに少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有すると本明細書で理解される。
【0080】
医学的用途
持続的又は慢性感染、前癌性障害及び／又は癌を予防又は処置するための方法が提供される。別言すると、薬剤として使用するための、好ましくは持続的又は慢性感染、前癌性障害及び／又は癌の予防又は処置のための、本明細書で上記に定義した本発明の医薬組成物が提供される。そのような方法又は使用は、そのような予防及び／又は処置を必要とする対象に、本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。予防及び／又は処置を必要とする対象は、患者を指すこともあり、動物、例えば哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ若しくはネコを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指すこともある。
持続的又は慢性感染、前癌性障害及び／又は癌を予防又は処置するための方法が提供される。別言すると、薬剤として使用するための、好ましくは持続的又は慢性感染、前癌性障害及び／又は癌の予防又は処置のための、本明細書で上記に定義した本発明の医薬組成物が提供される。そのような方法又は使用は、そのような予防及び／又は処置を必要とする対象に、本発明の医薬組成物を投与するステップを含む。予防及び／又は処置を必要とする対象は、患者を指すこともあり、動物、例えば哺乳動物、例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ若しくはネコを含むがこれらに限定されない哺乳動物を指すこともある。
【0081】
本明細書で上記に定義した医薬投薬単位が提供されることが好ましい。また本明細書で上記に示されるように、この医薬投薬単位は、シングルショットで１回与えられてもよく、又は複数の体積として異なる位置に投与されてもよい。例えば、医薬投薬単位を、２つのショットに分割し、処置される対象の２本の脚又は腕の１本にそれぞれ投与してもよい。２つのショットは、同じ又は異なるペプチドミックスを含み得る。例えば、第１のショットが、配列番号１～５又は配列番号１～６を含み、第２のショットが配列番号７～１３を含んでもよく、ここで両方のショットは、１つ又は実質的に１つの時間点で投与される。ここで実質的に１つの時間点とは、最大で約１５分以内、好ましくは最大で２分以内と理解される。
【0082】
単一又は複数のショットの投与は、１回で実施してもよく、又は、その後に繰り返してもよく、例えば、限定されないが、毎日、隔週、毎週、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、１年に１回、２年に１回、５年に１回、又は１０年に１回、繰り返してもよい。
【0083】
医薬組成物は、本明細書で上記に定義した有効量で投与されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、静脈内、皮下、又は筋肉内投与用であることが好ましいが、他の投与経路、例えば、粘膜投与又は真皮内及び／若しくは皮内投与又は腫瘍内投与の、例えば注射による、投与経路も想定され得る。本発明の医薬組成物は、単独投与によって投与され得る。代替的に、投与は、必要に応じて繰り返してもよく、及び／又は異なるペプチド又はペプチドミックスを含む別個のペプチド又はペプチドミックス又は組成物を順次投与してもよく、ここで順次は、時間的及び／又は位置的であり得る。
【0084】
医薬組成物は、ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープに対してＴ細胞応答を誘導するためのワクチン組成物であることが好ましい。ワクチンは、対象における疾患又は状態、例えば持続的感染、癌（新生物）又は前癌性障害、好ましくは
免疫系の活性化若しくは誘導、及び／又はエリスポットアッセイによって若しくはＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞のテトラマー染色によって確立される末梢血若しくは組織中の抗原特異的活性化ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、又は処置の少なくとも１週間後のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって確立されるこれらのＴ細胞により産生されるサイトカインの増加；並びに／或いは
抗原関連感染の増殖の阻害、又は抗原発現細胞の検出可能な減少、又は抗原発現細胞の細胞生存率の減少；並びに／或いは
抗原発現細胞の細胞死の誘導又は細胞死の増加の誘導；並びに／或いは
抗原発現細胞の増加の阻害又は予防
によって検出される疾患又は状態に関連する抗原の予防、部分的クリアランス及び／又は処置、又は完全クリアランスのためのワクチンであることが好ましい。
免疫系の活性化若しくは誘導、及び／又はエリスポットアッセイによって若しくはＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞のテトラマー染色によって確立される末梢血若しくは組織中の抗原特異的活性化ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、又は処置の少なくとも１週間後のフローサイトメトリーにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって確立されるこれらのＴ細胞により産生されるサイトカインの増加；並びに／或いは
抗原関連感染の増殖の阻害、又は抗原発現細胞の検出可能な減少、又は抗原発現細胞の細胞生存率の減少；並びに／或いは
抗原発現細胞の細胞死の誘導又は細胞死の増加の誘導；並びに／或いは
抗原発現細胞の増加の阻害又は予防
によって検出される疾患又は状態に関連する抗原の予防、部分的クリアランス及び／又は処置、又は完全クリアランスのためのワクチンであることが好ましい。
【0085】
本発明の方法を介して予防及び／又は処置される癌の例には、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、膣上皮内新生物（ＶａＩＮ）、肛門上皮内新生物（ＡＩＮ）、陰茎上皮内新生物（penal intraepithelial neoplasia）（ＰＩＮ）、子宮頸部、外陰部、膣、肛門、陰茎、気道トラック及び頭頸部の癌、肝臓癌、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びに固形腫瘍、例えば肉腫及び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、多発性骨髄腫、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫（oligodenroglioma）、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
本発明の方法は、別個の処置として又は本発明の医薬組成物に加えて提供され得る併用療法の一部であってもよい。本発明の方法は、チェックポイント制御ブロッカー、選択されたＴＮＦ受容体ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＯＸ－４０／ＣＤ１３４、及びＣＤ２７）を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β及びＩＬ－６）及び／又はγＣサイトカイン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１又はＩＬ－２）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ）阻害剤、サリドマイド及び／又はその誘導体、さらなる免疫調節剤（例えば、免疫抑制性Ｔｒｅｇ及び／又はＭＤＳＣを枯渇することが既知の化合物）、標準の治療的処置、例えば、化学療法、放射線療法、外科手術、ＩＦＮ－αコンディショニング、抗ウイルス療法、抗菌療法、紫外線療法、抗炎症療法などと組み合わせてもよい。前癌性障害又は癌の処置又は予防の場合には、ペプチドベースのワクチンは、放射線療法及び／又は化学療法、例えばカルボプラチン、パクリタキセル、ＣａｒｂｏＴａｘｏｌ（カルボプラチン、パクリタキセルの組合せ）及び／又はシスプラチンなどの処置と組み合わせてもよい。例えば、本発明の方法は、化学療法が３週間ごとに１回適用される化学療法投与計画の一部であり得る。本発明の医薬組成物の第１の医薬投薬単位は、化学療法の第２又は第３サイクル後に２週間、投与されることが好ましい。
【0087】
再構築のための方法
乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドを再構築するための方法であって、
ａ）乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドを含むバイアルを用意するステップと、
ｂ）上記ペプチドを、好ましくは約５～３０分、解凍するステップと、
ｃ）本発明の再構築組成物を、上記ペプチドを含む上記バイアルに、好ましくは上記バイアルを渦流させることなく、添加するステップと、
ｄ）好ましくは約０．５～５分、混合するステップと、
ｅ）透明溶液が得られるまで、好ましくは約１～３分、渦流するステップと、
を含む方法も提供される。
乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドを再構築するための方法であって、
ａ）乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドを含むバイアルを用意するステップと、
ｂ）上記ペプチドを、好ましくは約５～３０分、解凍するステップと、
ｃ）本発明の再構築組成物を、上記ペプチドを含む上記バイアルに、好ましくは上記バイアルを渦流させることなく、添加するステップと、
ｄ）好ましくは約０．５～５分、混合するステップと、
ｅ）透明溶液が得られるまで、好ましくは約１～３分、渦流するステップと、
を含む方法も提供される。
【0088】
ステップｂ）～ｅ）は、室温で実施することが好ましい。
【0089】
医薬組成物を調製するための方法であって、
（ｉ）上記で定義された、乾燥されたペプチドを再構築するための方法によって得ることができる再構築されたペプチドを、第１のシリンジに収集するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の上記第１のシリンジを、油性アジュバントを含む第２のシリンジに、コネクタを使用して接続するステップと、
（ｉｉｉ）上記第１のシリンジの内容物を、上記第２のシリンジへ押し出し、そして逆方向に押し出すステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を合計で約１０～５０回、約１０～５０秒で、繰り返すステップと、
を含む方法がさらに提供される。
（ｉ）上記で定義された、乾燥されたペプチドを再構築するための方法によって得ることができる再構築されたペプチドを、第１のシリンジに収集するステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の上記第１のシリンジを、油性アジュバントを含む第２のシリンジに、コネクタを使用して接続するステップと、
（ｉｉｉ）上記第１のシリンジの内容物を、上記第２のシリンジへ押し出し、そして逆方向に押し出すステップと、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）を合計で約１０～５０回、約１０～５０秒で、繰り返すステップと、
を含む方法がさらに提供される。
【0090】
ステップ（ｉ）～（ｉｖ）は、室温で実施することが好ましい。
【0091】
乾燥されたペプチドを再構築するための方法のステップｅ）で得られる透明溶液は、出発材料、つまり医薬組成物を調製するための方法のステップ（ｉ）で「再構築されたペプチド」として使用することができる再構築されたペプチドを含む再構築組成物として、本明細書で理解される。
【0092】
乾燥されたペプチドを再構築するための方法におけるステップａ）の出発材料として使用される、バイアル中の乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドは、本発明の医薬組成物で再構築されるペプチド及び／又は本発明の医薬組成物に含まれるペプチドとして本明細書で上記に定義したペプチドであることが好ましい。上記バイアルは、予防及び／又は処置のための方法における、好ましくは本明細書で定義される処置及び／又は予防方法における、一回体積として、つまり一回の医薬投薬単位として又は実質的に同じ時間点で対象の身体の異なる位置に複数注射する場合はその一部として注射される量でペプチドを含むことが好ましい。或いは、ステップａ）のバイアルにおける乾燥されたペプチドの量は、上記方法の一回体積としての注射の量を超えている。例えば、バイアル内のペプチドの量は、一回体積としての注射の量の２倍であり得る。後者の場合に、方法又は処置又は予防における注射のための医薬組成物の一回体積でまとめるために、再構築された体積の量の半分を、医薬組成物、例えば本発明の医薬組成物を調製するための方法における油性アジュバントのある量と混合してもよく、又は、代替的に、再構築された体積の総量を、注射のための医薬組成物の二倍体積でまとめるために、油性アジュバントのある量と混合してもよい。
【0093】
ペプチドを再構築するための方法のステップｂ）におけるペプチドは、室温で、約５～３０分又は１０～３０分、例えば５、１０、１５、２０、２５、又は３０分、又はそれらの間の任意の値で解凍されることが好ましい。
【0094】
ペプチドを再構築するための方法におけるステップｄ）の混合は、実質的にバイアルを渦流（swirling）又は撹拌することなく、好ましくは室温で約０．５～２分、例えば０．５、１、１．５、又は２分行うことが好ましい。別言すると、ステップｄ）のペプチドは、再構築組成物を放置したまま、混合されることが好ましい。
【0095】
ペプチドを再構築するための方法のステップｅ）における渦流は、透明溶液が得られるまで渦流することにより実施される。示されるように、この渦流は、好ましくは約１～３分実施される。しかしながら、一部のペプチドのために、より長い又は短い渦流時間が要求される。しかしながら、透明溶液は、好ましくは、２０分以内に取得可能になるべきである。それゆえ、渦流は、１～２０分、１～１０分、１～５分又は１～３分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０分、又はそれらの間の任意の値で行われ、好ましくは、目視検査で透明溶液が得られるまで行い得る。
【0096】
ペプチドを再構築するための方法のステップｃ）の再構築組成物、及び医薬組成物を調製するための方法のステップ（ｉｉ）の油性アジュバントは、本明細書で先に定義される通りである。ステップｃ）の再構築組成物の量は、約０．５～２ｍＬの範囲、好ましくは１ｍＬであることが好ましい。ステップ（ｉ）で再構築されたペプチドの量は、ステップｅ）後に得られる再構築されたペプチドの総量、つまりステップｅ）後に得られる透明溶液内の再構築されたペプチドの総量であることが好ましい。しかしながら、上記で例示されるように、任意選択で、より少ない量が使用される。この再構築組成物の体積は、ステップ（ｉｉ）～（ｉｖ）の油性アジュバントと、再構築組成物：油性アジュバントの比率が約２：１～約１：２の範囲、例えば２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．１：１、１：１、１：１．９、１：１．８、１：１．７、１：１．６、１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、又は１：１．１、好ましくは１：１で混合されることが好ましい。
【0097】
（ｉｉ）のコネクタは、Ｔ字型コネクタ及びＩ字型コネクタが挙げられるがこれらに限定されない、２つのシリンジの間で流体が交換されるように２つのシリンジを接続するための、当技術分野で適切な任意のコネクタであり得る。繰り返し（ｉｖ）は、約１０～５０回、例えば、限定されないが、１０、１５、２０、２５、３０、４５、５０回又はそれらの間の任意の値であり得る。
【0098】
キットオブパーツ
さらに、
１．乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドを含む第１のバイアルであり、好ましくは、ペプチドが、本明細書で上記に定義したペプチドである、第１のバイアルと、
２．本発明の再構築組成物を含む、第２のバイアルと、任意選択で、
３．好ましくは本明細書で上記に定義した油性アジュバントを含む第３のバイアルと、
を備えるキットオブパーツが提供される。
さらに、
１．乾燥された、好ましくは凍結乾燥された、ペプチドを含む第１のバイアルであり、好ましくは、ペプチドが、本明細書で上記に定義したペプチドである、第１のバイアルと、
２．本発明の再構築組成物を含む、第２のバイアルと、任意選択で、
３．好ましくは本明細書で上記に定義した油性アジュバントを含む第３のバイアルと、
を備えるキットオブパーツが提供される。
【0099】
全ての成分、つまり、乾燥されたペプチド、再構築組成物及び油性アジュバントは、滅菌及び／又は医薬等級又は臨床等級であることが好ましい。これらの成分は、適正製造基準（ＧＭＰ）を使用して製造され、欧州医薬品庁及び食品医薬品局の両方で定義されるようにＧＭＰ品質を有することが好ましい。
【0100】
第１のバイアルは、再構築組成物が、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、又は１年、又はさらには２年安定である温度で保存することが好ましい。上記温度は、－２５～２５℃、又は－２３～－１８℃、又は０～１０℃、又は２～８℃、又は１８～２３℃であることが好ましい。第２のバイアルは、再構築組成物が、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、又は１年、又はさらには２年安定である温度で保存することが好ましい。上記温度は、－２５～２５℃、又は－２３～－１８℃、又は０～１０℃、又は２～８℃、又は１８～２３℃であることが好ましい。第３のバイアルは、再構築組成物が、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、又は１年、又はさらには２年安定である温度で保存することが好ましい。上記温度は、－２５～２５℃、又は－２３～－１８℃、又は０～１０℃、又は２～８℃、又は１８～２３℃であることが好ましい。第１、第２及び第３のバイアルは、同じ温度で保存されることが好ましい。
【0101】
任意選択で、上記キットオブパーツは、本明細書で上記に定義した乾燥されたペプチドを再構築するための方法、保存条件、本明細書で上記に定義した医薬組成物を調製するための方法を記載したマニュアル、並びに／又は、第１、第２及び／若しくは第３のバイアルを保存するためのマニュアルをさらに備える。さらに、キットオブパーツは、調製された医薬組成物を投与するためのマニュアルを備えてもよい。第１、第２及び／又は第３のバイアルの体積は、最大で５０ｍＬ、好ましくは０．１～１０ｍＬ、好ましくは１～１０ｍＬ、例えば０．５、１、２、３、４、５、又は１０ｍＬ、又はそれらの間の任意の値であることが好ましい。バイアルは、任意の形状を有し得る容器として、本明細書で理解される。任意選択で、バイアルはシリンジとして本明細書で理解される。任意選択で、第１のバイアルは、再構築組成物にペプチドと接触させてそれを溶解させる（dissolute）ための第２のバイアルと、能動処理プロセスによりコネクタを介して接続してもよい。任意選択で、第２のバイアルは、次いで、ペプチドを含む再構築組成物を油性アジュバントと混合させるための第３のバイアルと接続してもよい。任意選択で、キットオブパーツは、１つ又は複数のコネクタ、例えばＴ字型コネクタ及び／又は注射ユニット、例えば針をさらに含む。第１のファイルにおけるペプチドの量、第２のファイルにおける再構築組成物の量、及び／又は第３のファイルにおける油性アジュバントの量は、本明細書で先に定義したペプチドを再構築するための方法及び／又は医薬組成物を調製するための方法で定義した通りであることが好ましい。
【0102】
本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「を含む」及びその結合語は、その語に続く項目が非限定的な観念で含まれ、詳細に言及されていない項目が排除されないことを意味する。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への参照は、文脈が明確に１つ及び要素のうちの１つのみであることを要求していない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【0103】
「約」又は「およそ」という語は、数値と関連して使用されるとき（例えば、約１０）、好ましくは、所与の値（１０）の０．１％多い又は少ない値であり得ることを意味する。
【0104】
本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基の算入を必要とするように狭く解釈されるべきではない。当業者は、そのような誤って同定された塩基を同定することができ、そのような誤りを訂正する方法も知っている。
【0105】
本明細書で引用される全ての特許及び文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0106】
【図1】溶解及び室温で保存後２時間の３つの異なる溶媒混合物中のＤＰ－６Ｐ（配列番号１～６によって表されるＳＬＰを含む）のＵＰＬＣクロマトグラム。Ａ）０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬと、クレモフォールＥＬとの混合物に溶解させたＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｂ）２０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／水に溶解させたＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｃ）１０ｍＭ ＤＴＴを含む２０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／水に溶解させたＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）。
【図2】２つの異なる溶媒混合物中の、溶解後２つの時間点（ｔ＝０及びｔ＝２ｈ）のＤＰ－６Ｐ（配列番号１～６によって表されるＳＬＰを含む）のＵＰＬＣクロマトグラム。溶媒混合物は両方とも、プロピレングリコールと、エタノールと、水と、安定化剤又は還元剤とを含有している。Ａ）６００μＬの水と、２６７μＬのプロピレングリコールと、１３３μＬのエタノールと、１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸との混合物に溶解させたｔ＝０のＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｂ）６００μＬのＷＦＩと、２６７μＬのプロピレングリコールと、１３３μＬのエタノールと、１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸との混合物に溶解させたｔ＝２ｈのＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｃ）０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬとの混合物に溶解させたｔ＝０のＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｄ）０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬとの混合物に溶解させたｔ＝２ｈのＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）。
【図3】２つの異なる溶媒混合物中のＤＰ－６Ｐ（配列番号１～６によって表されるＳＬＰを含む）のＵＰＬＣクロマトグラム。全ての溶媒混合物は、１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、ツイーン２０又はクレモフォールＥＬ（６２．５μＬ）のいずれかとを含む。Ａ）ツイーン２０を含む溶媒混合物に溶解させたｔ＝０のＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｂ）ツイーン２０を含む溶媒混合物に溶解させたｔ＝２ｈのＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｃ）クレモフォールＥＬを含む溶媒混合物に溶解させたｔ＝０のＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）；Ｄ）クレモフォールＥＬを含む溶媒混合物に溶解させたｔ＝２ｈのＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）。
【図4】再構築及びモンタニドＩＳＡ５１ＶＧとの乳化後のＤＰ－６Ｐ（配列番号１～６によって表されるＳＬＰを含む）及びＤＰ－７Ｐ（配列番号７～１３によって表されるＳＬＰを含む）のＵＰＬＣクロマトグラム。再構築のための溶媒混合物は、１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、クレモフォールＥＬ（６２．５μＬ）とを含む。分析前に、過剰の溶媒混合物を添加し、遠心分離で相分離させることによって、ペプチドをエマルジョンから抽出した。Ａ）クレモフォールＥＬを含む１ｍＬの溶媒混合物に溶解させたｔ＝０（ワクチン調製及び抽出の直後）のＤＰ－６Ｐ（２．４ｍｇの総ペプチド）；Ｂ）クレモフォールＥＬを含む１ｍＬの溶媒混合物に溶解させたｔ＝２ｈ（ワクチン生成物を２時間保存し、抽出した後）のＤＰ－６Ｐ（２．４ｍｇの総ペプチド）；Ｃ）クレモフォールＥＬを含む１ｍＬの溶媒混合物に溶解させたｔ＝０（ワクチン調製及び抽出の直後）のＤＰ－７Ｐ（２．８ｍｇの総ペプチド）；Ｄ）クレモフォールＥＬを含む１ｍＬの溶媒混合物に溶解させたｔ＝２ｈ（ワクチン生成物を２時間保存し、抽出した後）のＤＰ－７Ｐ（２．８ｍｇの総ペプチド）。
【図5】２つの異なるクエン酸濃度を使用するＤＰ－６Ｐエマルジョン間の粒径分布比較（オーバーレイ）。０．０５Ｍ又は０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬとを含む混合物に溶解させ、続けて１ｍＬのモンタニドＩＳＡ５１ＶＧと乳化させたＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）。
【図6】ＤＰ－６Ｐエマルジョン（配列番号１～６によって表されるＳＬＰを含む）間の粒径分布比較（オーバーレイ）。ＤＰ－６Ｐ（２．４０ｍｇの総ペプチド）を、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬとを含む混合物に溶解させ、続けて１ｍＬのモンタニドＩＳＡ５１ＶＧと乳化させた。Ａ）乳化方法のロバスト性を示す、ｔ＝０の３つの独立した（反復）調製物（調製物１、調製物２、及び調製物３）。Ｂ）乳化方法のロバスト性と、室温で少なくとも２時間のエマルジョンの使用中の物理的安定性との両方を示す、ｔ＝０（調製物１ｔ０ｈ及び調製物１ｔ２ｈ）並びにｔ＝２ｈ（調製物２ｔ０ｈ及び調製物２ｔ２ｈ）の２つの独立した（反復）調製物。
【図7】ＴＣ－１腫瘍実験についてのタイムライン。
【図8】（Ａ）モンタニドと１：１で乳化させた４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩのみ（ＤＭＳＯ）、（Ｂ）モンタニドと１：１で乳化させた再構築（Ｒｅｃ．）組成物（０．１Ｍのクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）のみ（Ｒｅｃ．組成物）、（Ｃ）モンタニドと１：１で乳化させた４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩ中に溶解させた配列番号６によって表されるＳＬＰ及びＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（ＤＭＳＯ＋ＳＬＰ）、又は（Ｄ）モンタニドと１：１で乳化させた再構築（Ｒｅｃ．）組成物（０．１Ｍのクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）中に溶解させた配列番号６によって表されるＳＬＰ及びＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（Ｒｅｃ．組成物＋ＳＬＰ）のいずれかでワクチン接種したマウスにおけるＴＣ－１腫瘍の伸長。
【図9】ＴＣ－１腫瘍でチャレンジし、次いでモンタニドと１：１で乳化させた４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩのみ（ＤＭＳＯ）でワクチン接種した第１群のマウス、ＴＣ－１腫瘍でチャレンジし、次いでモンタニドと１：１で乳化させた再構築組成物（０．１Ｍのクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）のみ（Ｒｅｃ．組成物）でワクチン接種した第２群のマウス、ＴＣ－１腫瘍でチャレンジし、次いでモンタニドと１：１で乳化させた４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩ中に溶解させた配列番号６によって表されるＳＬＰ及びＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（ＤＭＳＯ＋ＳＬＰ）でワクチン接種した第３群のマウス、並びにＴＣ－１腫瘍でチャレンジし、次いでモンタニドと１：１で乳化させた再構築組成物（０．１Ｍのクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）中に溶解させた配列番号６によって表されるＳＬＰ及びＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（Ｒｅｃ．組成物＋ＳＬＰ）でワクチン接種した第４群のマウスの、カプラン・マイヤープロット（生存）（Ａ）及び誘導されたＤｂ－ＲＡＹＮＩＶＴＦ（テトラマー）陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ（Ｂ）。アスタリスクは有意差を示す（対応のないｔ検定、ｐ＝０．０２２）；ｎｓは有意ではない差を示す（ｐ＝０．２１）。
【図10】Ｐ５３ ＤＰ－５Ｐ（配列番号１９１、１９３、１９４、２０１及び２０３によって表されるＳＬＰを含む）のＵＰＬＣクロマトグラム。Ｐ５３ ＤＰ－５Ｐを、１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、クレモフォールＥＬ（６２．５μＬ）とを含む溶媒混合物で再構築した。分析前に、過剰の溶媒混合物を添加し、遠心分離で相分離させることによって、ペプチドを最終生成エマルジョンから抽出した。Ａ）クレモフォールＥＬを含む１ｍＬの溶媒混合物に溶解させたｔ＝０（ワクチン調製及び抽出の直後）のＰ５３ ＤＰ－５Ｐ（２．０ｍｇの総ペプチド）；Ｂ）クレモフォールＥＬを含む１ｍＬの溶媒混合物に溶解させたｔ＝２ｈ（ワクチン生成物を２時間保存し、抽出した後）のＰ５３ ＤＰ－５Ｐ（２．０ｍｇの総ペプチド）。
【実施例】
【0107】
実施例１
序論
この試験の目的は、ペプチド薬剤生成物ＨＰＶ－ＤＰ－６Ｐ及びＨＰＶ－ＤＰ－７Ｐの溶解、その後のモンタニドＩＳＡ５１ＶＧとの乳化を含む、マルチペプチドＨＰＶワクチン生成物の適切な再構築方法を見つけることであった。以前の研究で、ＤＭＳＯ／ＷＦＩ製剤中では、１つ又は複数のシステイン残基を含有するペプチドがジスルフィドを形成する傾向が強いことが示されている。薬剤生成物の化学的安定性を改善し、ペプチドのジスルフィド形成を防止するために、新たなＤＭＳＯ不含再構築溶液が、両方の薬剤生成物を再構築するために開発された。この新たな再構築溶液は、薬剤生成物を溶解し、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧと安定なエマルジョンを生じることができるべきである。ジスルフィド形成は最小限にされるべきである。
序論
この試験の目的は、ペプチド薬剤生成物ＨＰＶ－ＤＰ－６Ｐ及びＨＰＶ－ＤＰ－７Ｐの溶解、その後のモンタニドＩＳＡ５１ＶＧとの乳化を含む、マルチペプチドＨＰＶワクチン生成物の適切な再構築方法を見つけることであった。以前の研究で、ＤＭＳＯ／ＷＦＩ製剤中では、１つ又は複数のシステイン残基を含有するペプチドがジスルフィドを形成する傾向が強いことが示されている。薬剤生成物の化学的安定性を改善し、ペプチドのジスルフィド形成を防止するために、新たなＤＭＳＯ不含再構築溶液が、両方の薬剤生成物を再構築するために開発された。この新たな再構築溶液は、薬剤生成物を溶解し、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧと安定なエマルジョンを生じることができるべきである。ジスルフィド形成は最小限にされるべきである。
【0108】
この試験は、４レベルの分析で構成されている。
１．薬剤生成物を再構築するために適切な溶媒組合せのための、目視によってペプチドの溶解をモニタリングする、スクリーニング。
２．モンタニドとの薬剤生成物エマルジョンのエマルジョン安定性のモニタリング。安定性は、目視によって及びエマルジョン液滴の粒径の分析によって評価する。
３．レベル１及び２に成功した溶媒で再構築した後の薬剤生成物の化学的安定性の分析。
４．レベル１、２及び３に成功した溶媒を使用した再構築及び乳化後の薬剤生成物の化学的安定性の分析。この目的のため、ペプチドを溶解し、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧと乳化し、次いでエマルジョンから抽出して、ペプチド組成物を分析する。
１．薬剤生成物を再構築するために適切な溶媒組合せのための、目視によってペプチドの溶解をモニタリングする、スクリーニング。
２．モンタニドとの薬剤生成物エマルジョンのエマルジョン安定性のモニタリング。安定性は、目視によって及びエマルジョン液滴の粒径の分析によって評価する。
３．レベル１及び２に成功した溶媒で再構築した後の薬剤生成物の化学的安定性の分析。
４．レベル１、２及び３に成功した溶媒を使用した再構築及び乳化後の薬剤生成物の化学的安定性の分析。この目的のため、ペプチドを溶解し、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧと乳化し、次いでエマルジョンから抽出して、ペプチド組成物を分析する。
【0109】
材料
次の凍結乾燥されたペプチド組成物を使用した：配列番号１～５によって本明細書で表される、１バイアルあたり正味重量０．４０ｍｇの各ペプチドを等しく混合したペプチド（１バイアルあたりのタンパク質の総量は２．００ｍｇ）と、１バイアルあたり０．５６ｍｇのＴＦＡとを含むＤＰ－５Ｐ；配列番号１～６によって本明細書で表される、１バイアルあたり正味重量０．４０ｍｇの各ペプチドを等しく混合したペプチド（１バイアルあたりのタンパク質の総量は２．４０ｍｇ）と、１バイアルあたり０．６７ｍｇのＴＦＡとを含むＤＰ－６Ｐ；及び配列番号７～１３によって本明細書で表される、１バイアルあたり正味重量０．４０ｍｇの各ペプチドを等しく混合したペプチド（１バイアルあたりのタンパク質の総量は２．８０ｍｇ）と、１バイアルあたり０．９６ｍｇのＴＦＡとを含むＤＰ－７Ｐ。
次の凍結乾燥されたペプチド組成物を使用した：配列番号１～５によって本明細書で表される、１バイアルあたり正味重量０．４０ｍｇの各ペプチドを等しく混合したペプチド（１バイアルあたりのタンパク質の総量は２．００ｍｇ）と、１バイアルあたり０．５６ｍｇのＴＦＡとを含むＤＰ－５Ｐ；配列番号１～６によって本明細書で表される、１バイアルあたり正味重量０．４０ｍｇの各ペプチドを等しく混合したペプチド（１バイアルあたりのタンパク質の総量は２．４０ｍｇ）と、１バイアルあたり０．６７ｍｇのＴＦＡとを含むＤＰ－６Ｐ；及び配列番号７～１３によって本明細書で表される、１バイアルあたり正味重量０．４０ｍｇの各ペプチドを等しく混合したペプチド（１バイアルあたりのタンパク質の総量は２．８０ｍｇ）と、１バイアルあたり０．９６ｍｇのＴＦＡとを含むＤＰ－７Ｐ。
【0110】
次の化学物質を使用した：クレモフォールＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＥＬ、Ｃ５１３５）；プロピレングリコール又はＰＧ（≧９９．５％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｗ２９４００４）エタノール又はＥｔＯＨ（無水、ＶＷＲ Ｅｍｐｒｏｖｅ（登録商標）Ｐｈ Ｅｕｒ、ＢＰ、ＵＳＰ． Ａｒｔｉｃｌｅ＃ １．００９８６．１０００）；クエン酸又はＣＡ（≧９９％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ１９０９）；ミリＱ（Ｍｉｌｌｉ Ｑ）水（ＥＱＰ－０６３より）；滅菌モンタニドＩＳＡ５１ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ、バッチ＃１４Ｖ０１１）。
【0111】
次の機器を使用した：シリンジ押出装置（Ｄｉｓｃｏｆｉｘ－３ Ｔ字型コネクタ、Ｂ． Ｂｒａｕｎ）；ＤＭＳＯ耐性シリンジ（２ｍＬ ＮＯＲＭ－ＪＥＣＴ Ｌｕｅｒ Ｌｏｃｋ、Ｈｅｎｋｅ Ｓａｓｓ Ｗｏｌｆ）；Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ／ＭＳシステム；マルバーン・マスターサイザー２０００；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＭＦＩ５２００フローセル。
【0112】
方法
溶解
有機溶媒及び水性溶媒を混合して再構築組成物を調製した後、凍結乾燥された薬剤生成物に加えた。１ｍＬの様々な再構築組成物を薬剤生成物に加え、溶液を数回渦流させる一方、混合物を５分間、放置した。物理的安定性を、目視検査で評価した。化学的安定性を、ＵＰＬＣ／ＭＳを使用して評価した（下記の薬剤生成物溶液の化学的安定性を参照）。
溶解
有機溶媒及び水性溶媒を混合して再構築組成物を調製した後、凍結乾燥された薬剤生成物に加えた。１ｍＬの様々な再構築組成物を薬剤生成物に加え、溶液を数回渦流させる一方、混合物を５分間、放置した。物理的安定性を、目視検査で評価した。化学的安定性を、ＵＰＬＣ／ＭＳを使用して評価した（下記の薬剤生成物溶液の化学的安定性を参照）。
【0113】
モンタニドを用いた乳化
視覚的に透明な薬剤生成物溶液が得られた溶媒の組合せを、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧとの乳化実験に使用した。特に明記しない限り、表１のプロトコルに従って再構築及び乳化を実施した。示されている場合、シリンジＡ及びＢの内容物の混合は、別々に実施した。表３の手順におけるこれらの適応は、表４及び表５における結果の項目に示される。
視覚的に透明な薬剤生成物溶液が得られた溶媒の組合せを、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧとの乳化実験に使用した。特に明記しない限り、表１のプロトコルに従って再構築及び乳化を実施した。示されている場合、シリンジＡ及びＢの内容物の混合は、別々に実施した。表３の手順におけるこれらの適応は、表４及び表５における結果の項目に示される。
【0114】
【表2】
【0115】
エマルジョン安定性を試験するためのレーザー回折実験
エマルジョン安定性を、目視と、マルバーン・マスターサイザー２０００を使用した粒径分布分析との両方によってモニタリングした。
粒径分析について、所望のレベルのオブスキュレーションを得るために、水を用いて又は０．０１Ｍクエン酸水溶液を用いて、エマルジョンの希釈を行った。モンタニドを、再構築されたＤＰを含む再構築組成物と、１７５０ｒｐｍの速度で撹拌機を使用して混合し、１．４６の屈折率を適用した。粒径分布を、体積基準分布でのＤ（０．５）及びＤ（０．９）で表した。
エマルジョン安定性を、目視と、マルバーン・マスターサイザー２０００を使用した粒径分布分析との両方によってモニタリングした。
粒径分析について、所望のレベルのオブスキュレーションを得るために、水を用いて又は０．０１Ｍクエン酸水溶液を用いて、エマルジョンの希釈を行った。モンタニドを、再構築されたＤＰを含む再構築組成物と、１７５０ｒｐｍの速度で撹拌機を使用して混合し、１．４６の屈折率を適用した。粒径分布を、体積基準分布でのＤ（０．５）及びＤ（０．９）で表した。
【0116】
エマルジョン安定性を試験するためのマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）
エマルジョン安定性を評価するための粒径分析のための第２の技術として、マイクロフローイメージングを使用した。分析の前に、エマルジョンの１滴を１０ｍＬの０．０１Ｍクエン酸水溶液に加え、均質になるまで混合し、次いでこの溶液を水で１：１００希釈することによって、エマルジョンの希釈液を調製した。試料を、１回の単独のランで０．６８分の期間に対して又は１００万個の粒子あたり０．２０ｍＬのパージ体積で測定した。結果を円相当径（ＥＣＤ）で表す。
エマルジョン安定性を評価するための粒径分析のための第２の技術として、マイクロフローイメージングを使用した。分析の前に、エマルジョンの１滴を１０ｍＬの０．０１Ｍクエン酸水溶液に加え、均質になるまで混合し、次いでこの溶液を水で１：１００希釈することによって、エマルジョンの希釈液を調製した。試料を、１回の単独のランで０．６８分の期間に対して又は１００万個の粒子あたり０．２０ｍＬのパージ体積で測定した。結果を円相当径（ＥＣＤ）で表す。
【0117】
薬剤生成物溶液の化学的安定性
完全な溶解及び＞２時間のエマルジョン安定性を示す試料について、薬剤生成物溶液（追加の希釈なし）の化学的安定性を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙカラム（ＢＥＨ１３０型、Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用してＷａｔｅｒｓＴＱＤ質量分析計に結合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムでＵＰＬＣ／ＭＳによりモニタリングした。データ処理は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ４．１ソフトウェアで行った。ＵＶ検出は２２０ｎｍで実施し、移動相は、０．３ｍＬ／分の流量で、水中０．０５％ＴＦＡ及び１％のＡＣＮ（緩衝液Ａ）及びＡＣＮ中０．０５％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）であった。カラム温度は６５℃であり、オートサンプラー温度は５℃であった。５μＬの注入容積を使用し、表２の勾配プロファイルを適用した。
ＵＶ検出は、勾配の全長の間で行い、質量分析は、ポジティブモードで２～３０分行った。
薬剤生成物溶液の化学的安定性を分析するため、試料を、少なくとも溶解後２時間まで、様々な時間点で分析した。
完全な溶解及び＞２時間のエマルジョン安定性を示す試料について、薬剤生成物溶液（追加の希釈なし）の化学的安定性を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙカラム（ＢＥＨ１３０型、Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を使用してＷａｔｅｒｓＴＱＤ質量分析計に結合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムでＵＰＬＣ／ＭＳによりモニタリングした。データ処理は、Ｍａｓｓｌｙｎｘ４．１ソフトウェアで行った。ＵＶ検出は２２０ｎｍで実施し、移動相は、０．３ｍＬ／分の流量で、水中０．０５％ＴＦＡ及び１％のＡＣＮ（緩衝液Ａ）及びＡＣＮ中０．０５％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）であった。カラム温度は６５℃であり、オートサンプラー温度は５℃であった。５μＬの注入容積を使用し、表２の勾配プロファイルを適用した。
ＵＶ検出は、勾配の全長の間で行い、質量分析は、ポジティブモードで２～３０分行った。
薬剤生成物溶液の化学的安定性を分析するため、試料を、少なくとも溶解後２時間まで、様々な時間点で分析した。
【0118】
【表3】
【0119】
ＨＰＶ－ＤＰ－６Ｐ及びＨＰＶ－ＤＰ－７Ｐワクチンエマルジョンの使用中の化学的安定性
完全な溶解、＞２時間のエマルジョン安定性、及び＞２時間の薬剤生成物溶液（追加の希釈なし）の化学的安定性を示す試料について、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧを用いたワクチンエマルジョンの使用中の化学的安定性をＵＰＬＣ／ＭＳでモニタリングした。再構築された及び乳化された薬剤生成物の化学的安定性を分析するため、試料を少なくとも溶解後２時間まで、様々な時間点で分析した。ＵＰＬＣ／ＭＳ分析は、薬剤生成物溶液の化学的安定性について上記した方法に従って、ワクチンエマルジョンからペプチドを抽出するための追加の試料調製ステップを使用して実施した。乳化生成物の試料を調製するために、以下のステップを適用した。
完全な溶解、＞２時間のエマルジョン安定性、及び＞２時間の薬剤生成物溶液（追加の希釈なし）の化学的安定性を示す試料について、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧを用いたワクチンエマルジョンの使用中の化学的安定性をＵＰＬＣ／ＭＳでモニタリングした。再構築された及び乳化された薬剤生成物の化学的安定性を分析するため、試料を少なくとも溶解後２時間まで、様々な時間点で分析した。ＵＰＬＣ／ＭＳ分析は、薬剤生成物溶液の化学的安定性について上記した方法に従って、ワクチンエマルジョンからペプチドを抽出するための追加の試料調製ステップを使用して実施した。乳化生成物の試料を調製するために、以下のステップを適用した。
【0120】
３００μＬの再構築溶液を取り、これを１５ｍＬのＧｒｅｉｎｅｒ管に加える；
１００μＬのヘプタンを加える；
２００μＬの薬剤生成物エマルジョンを加える。溶液をピペッティングして３回上下する；
混合物を３０秒間ボルテックスする：
混合物を５分間４４００ｒｐｍで遠心分離して二相系を得る；
２０～２００μＬのピペットで、１００μＬの試料を最下層から取り、総回収ＵＰＬＣバイアルに移す；
薬剤生成物溶液の化学的安定性について記載した方法に従ってＵＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳで分析する。
１００μＬのヘプタンを加える；
２００μＬの薬剤生成物エマルジョンを加える。溶液をピペッティングして３回上下する；
混合物を３０秒間ボルテックスする：
混合物を５分間４４００ｒｐｍで遠心分離して二相系を得る；
２０～２００μＬのピペットで、１００μＬの試料を最下層から取り、総回収ＵＰＬＣバイアルに移す；
薬剤生成物溶液の化学的安定性について記載した方法に従ってＵＰＬＣ／ＵＶ／ＭＳで分析する。
【0121】
結果
再構築及び乳化のための溶媒スクリーニング
凍結乾燥されたペプチドを再構築し、モンタニドと化学的及び物理的に安定なエマルジョンを形成するために適した水性及び有機画分の両方を含む再構築組成物を定義するために、溶媒をスクリーニングした。下記の全ての実験は、ＤＰ－６Ｐを用いて実施した。実験は、ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐを使用して確認したが、データは非常に匹敵していたため、ＤＰ－６Ｐに関するデータのみを示している。このスクリーニングで、再構築されたタンパク質及びエマルジョンの物理的安定性は、目視検査によって評価した。
再構築及び乳化のための溶媒スクリーニング
凍結乾燥されたペプチドを再構築し、モンタニドと化学的及び物理的に安定なエマルジョンを形成するために適した水性及び有機画分の両方を含む再構築組成物を定義するために、溶媒をスクリーニングした。下記の全ての実験は、ＤＰ－６Ｐを用いて実施した。実験は、ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐを使用して確認したが、データは非常に匹敵していたため、ＤＰ－６Ｐに関するデータのみを示している。このスクリーニングで、再構築されたタンパク質及びエマルジョンの物理的安定性は、目視検査によって評価した。
【0122】
有機画分として、多種多様な有機溶媒を試験した。ＷＦＩ（注射用水）と混合したとき、ＤＰ－６Ｐを完全に溶解することができる唯一の単独の有機溶媒は、ＮＭＰであった（表３）。しかしながら、再構築組成物としてＮＭＰ／ＷＦＩを使用するとき、モンタニドとの安定なエマルジョンは得られなかった。ＷＦＩの代わりに生理食塩水を使用した場合はわずかにエマルジョン安定性が改善したが、≧２ｈの安定性を有するエマルジョンは、再現可能な方法では依然として得ることができなかった。
【0123】
【表4】
【0124】
再構築における有機溶媒混合物
単独の有機溶媒では、ＷＦＩと組み合わせてＤＰ－６Ｐの完全な溶解をもたらす溶媒は同定されなかった。したがって、プロピレングリコールと他の溶媒との組合せを、再構築組成物における有機画分としてスクリーニングした。物理的安定性は、目視検査で評価した。化学的安定性は、ＵＰＬＣ／ＭＳを用いて評価した。
単独の有機溶媒では、ＷＦＩと組み合わせてＤＰ－６Ｐの完全な溶解をもたらす溶媒は同定されなかった。したがって、プロピレングリコールと他の溶媒との組合せを、再構築組成物における有機画分としてスクリーニングした。物理的安定性は、目視検査で評価した。化学的安定性は、ＵＰＬＣ／ＭＳを用いて評価した。
【0125】
ＤＰ－６Ｐの完全な溶解は依然として観察されなかったが、ＤＰ－６Ｐの溶解について同定された最も随意な溶媒の組合せは、エタノール、プロピレングリコール、及び乳化剤としてのクレモフォールＥＬとＷＦＩとの混合物であった（図１）。
【0126】
ジスルフィド形成を制限しながら溶解プロセスをさらに改善するために、溶媒混合物（エタノールと、プロピレングリコールと、クレモフォールＥＬと、ＷＦＩとの混合物）及びペプチド溶液へのいくつかの抗酸化剤及び還元剤の添加の効果を評価した。化学的安定性は、ジスルフィド形成の程度をモニタリングするためのＵＰＬＣ／ＭＳで分析した。ＤＴＴ（ペプチドに対して３５モル当量）又はアスコルビン酸（ＷＦＩ中の０．１～１％溶液）の添加は、ジスルフィド形成の減少をもたらさなかったが、０．０５～０．１Ｍのクエン酸水溶液の溶媒混合物への添加は、薬剤生成物の溶解後２時間でＤＰ－６Ｐの溶解の改善とジスルフィドあたり≦１％の面積％値の限定されたジスルフィド形成をもたらした。ｐＨ３及び０．０５～０．１Ｍの濃度でのクエン酸緩衝液は、ペプチドの溶解が乏しいため、乳化に使用できなかった（データ示さず）。図２は、０．１Ｍのクエン酸水溶液とプロピレングリコールとエタノールとクレモフォールＥＬとの混合物と対比して１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸水溶液とプロピレングリコールとエタノールとの混合物で再構築されたＤＰの時間（ｔ＝０及びｔ＝２ｈ）での化学的安定性を示す。
【0127】
再構築後及びそれに続く乳化後の再構築組成物の試験
乳化剤としてクレモフォールＥＬは、ワクチン製剤においてあまり好ましくないが、その理由は、より高い用量で副作用が報告されているためである。しかしながら、クレモフォールＥＬの代替としての、ツイーン８０、シクロデキストリン及びトリトンＸ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）の溶解及び乳化特性は不十分であった（データ示さず）。目視検査では、有望な結果が、プロピレングリコールとエタノールとＷＦＩ中のクエン酸と２％のツイーン２０との組合せで得られた。表４にまとめられた乳化実験の結果は、クレモフォールＥＬ又はツイーン２０のいずれかと組み合わされたプロピレングリコール及びエタノールを含むエマルジョンが、最も安定なエマルジョンを生じることを示している。しかしながら、ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐの両方の溶液における化学的安定性は、クレモフォールＥＬに代えてツイーン２０を存在させることで顕著に悪化し、つまり、薬剤生成物の溶解後２時間でジスルフィドあたり５％を超える面積％値であった（ＤＰ－６ＰのＵＰＬＣクロマトグラムについて図３を参照；ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐについての結果は非常に類似していた（データ示さず）。
乳化剤としてクレモフォールＥＬは、ワクチン製剤においてあまり好ましくないが、その理由は、より高い用量で副作用が報告されているためである。しかしながら、クレモフォールＥＬの代替としての、ツイーン８０、シクロデキストリン及びトリトンＸ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）の溶解及び乳化特性は不十分であった（データ示さず）。目視検査では、有望な結果が、プロピレングリコールとエタノールとＷＦＩ中のクエン酸と２％のツイーン２０との組合せで得られた。表４にまとめられた乳化実験の結果は、クレモフォールＥＬ又はツイーン２０のいずれかと組み合わされたプロピレングリコール及びエタノールを含むエマルジョンが、最も安定なエマルジョンを生じることを示している。しかしながら、ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐの両方の溶液における化学的安定性は、クレモフォールＥＬに代えてツイーン２０を存在させることで顕著に悪化し、つまり、薬剤生成物の溶解後２時間でジスルフィドあたり５％を超える面積％値であった（ＤＰ－６ＰのＵＰＬＣクロマトグラムについて図３を参照；ＤＰ－５Ｐ及びＤＰ－７Ｐについての結果は非常に類似していた（データ示さず）。
【0128】
まとめると、表４及び図３に示されるデータから、生成物の物理的及び化学的安定性の両方に基づいて、モンタニドとのＤＰ－６Ｐエマルジョンのための乳化剤として、クレモフォールＥＬが好ましいと結論づけることができる。
【0129】
溶液中の薬剤生成物の化学的安定性について得られた結果が、ワクチンエマルジョンにおける薬剤生成物の使用中の化学的安定性に変換できることを実証するために、ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐワクチンエマルジョンの使用中の安定性を試験し、結果を図４Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。これらの結果は、乳化ステップ後に、ワクチン調製物における薬剤生成物の化学的安定性が保持されていることを確認する。
【0130】
【表5】
【0131】
乳化におけるロバスト性のための微調整
ペプチド溶解性及びエマルジョン安定性
ＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬの比率を変化させ、２つの異なる濃度のクエン酸溶液を試験し、異なる乳化方法を適用し、混合物の有機成分対水性成分の比率を変化させる一連の実験を実施した。全体的に、有機溶媒及び水性溶媒を混合して１ｍＬの再構築組成物を調製した後、それを凍結乾燥された薬剤生成物に加えた。次いで、表５及び６に示す異なる混合ステップ及び／又はコネクタを使用して、１ｍＬのモンタニドを、１ｍＬのペプチド水溶液に加えることによって、エマルジョンを調製した。
ペプチド溶解性及びエマルジョン安定性
ＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬの比率を変化させ、２つの異なる濃度のクエン酸溶液を試験し、異なる乳化方法を適用し、混合物の有機成分対水性成分の比率を変化させる一連の実験を実施した。全体的に、有機溶媒及び水性溶媒を混合して１ｍＬの再構築組成物を調製した後、それを凍結乾燥された薬剤生成物に加えた。次いで、表５及び６に示す異なる混合ステップ及び／又はコネクタを使用して、１ｍＬのモンタニドを、１ｍＬのペプチド水溶液に加えることによって、エマルジョンを調製した。
【0132】
【表6】
【0133】
より詳細なペプチドエマルジョン安定性：レーザー回折によるＰＳＤ分析
５つの異なる再構築組成物について、粒径に対する異なる乳化方法の影響を、マルバーン・マスターサイザー２０００を使用したレーザー回折法で分析した。全ての試料について、有機溶媒及び水性溶媒を混合して１ｍＬの再構築組成物を調製した後、それらを凍結乾燥された薬剤生成物に加えた。次いで、１ｍＬのモンタニドを、１ｍＬのペプチド水溶液に添加することによって、エマルジョンを調製した。有機相及び水相の混合は３つの異なる方法で行った：
Ｔ字型コネクタプロセスを使用して、表６に示す混合サイクルを行う、
Ｉ字型コネクタを使用して、表６に示す混合サイクルを行う；又は
１ｍＬのモンタニドを、再構築組成物中にペプチド溶液を含有するバイアルに加え、混合物を３０秒間ボルテックスする。
５つの異なる再構築組成物について、粒径に対する異なる乳化方法の影響を、マルバーン・マスターサイザー２０００を使用したレーザー回折法で分析した。全ての試料について、有機溶媒及び水性溶媒を混合して１ｍＬの再構築組成物を調製した後、それらを凍結乾燥された薬剤生成物に加えた。次いで、１ｍＬのモンタニドを、１ｍＬのペプチド水溶液に添加することによって、エマルジョンを調製した。有機相及び水相の混合は３つの異なる方法で行った：
Ｔ字型コネクタプロセスを使用して、表６に示す混合サイクルを行う、
Ｉ字型コネクタを使用して、表６に示す混合サイクルを行う；又は
１ｍＬのモンタニドを、再構築組成物中にペプチド溶液を含有するバイアルに加え、混合物を３０秒間ボルテックスする。
【0134】
結果の概要を表６に示す。Ｄ（０．５）の近似値を示している（体積基準分布）。
【0135】
【表7】
【0136】
表５及び表６の両方から、異なる混合方法及び／又は異なる使用コネクタの種類の間でエマルジョン安定性の差異が観察されなかったことが分かる。しかしながら、コネクタの使用に代えて混合物をボルテックスすることは、非常に大きな粒径を有し、安定性が不利なエマルジョンを生じた。全体的に、粒径が小さいエマルジョンほど、より安定であった。
【0137】
さらに、エマルジョン安定性は、再構築組成物の総体積における有機画分（混合物）のパーセンテージを増加させることによって改善した。しかしながら、ここで試験した有機含有量のうちの最高体積（３００～４００μＬ）で、薬剤生成物の溶解性の減少が生じた。したがって、最適な有機含有量は、再構築組成物１ｍＬあたり２００～３００μＬ（約２５０μＬ）であった。さらに、クエン酸（０．０５又は０．１Ｍ）溶液の濃度の変化はエマルジョン安定性に影響を与えていないようであったが、０．１Ｍのクエン酸溶液を使用したとき、ＤＰ－６Ｐの溶解がわずかに良好であった。
【0138】
マイクロフローイメージングを使用する粒径分析
エマルジョンの安定性及び粒径に対するクエン酸濃度の影響をより詳細に研究するために、追加の粒径分析実験を、１ｍＬのモンタニドと乳化した後に最小の粒径を生じた溶媒、つまり有機相：水相の比率が１：３であって有機相がＰＧ、ＥｔＯＨ及びクレモフォールＥＬをＰＧ：ＥｔＯＨ：クレモフォールＥＬの比率１：２：１で含む再構築組成物（表６）、を使用して比較した。水相におけるクエン酸のモル量を変化させる（０．０５及び０．１Ｍクエン酸、つまり再構築組成物中のクエン酸の最終濃度がそれぞれ０．０３８及び０．０７５Ｍクエン酸）直接比較により実験を行った。ＤＰ－６Ｐを、１ｍＬのそのような再構築組成物に溶解し、次いで、Ｔ字型コネクタプロセスを使用し、５０回の高速混合サイクルを行って、１ｍＬのモンタニドと乳化した。これらの実験では、薬剤生成物の溶解並びに粒径及びエマルジョン安定性の両方を分析した。読み出しとして、不規則性を視覚的に試験できるように、カメラで粒子を視覚化するためにＭＦＩ５２００を使用したマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）を行った。０．０５Ｍ及び０．１Ｍクエン酸のクエン酸再構築組成物のＰＳＤ比較を図５に示す。
エマルジョンの安定性及び粒径に対するクエン酸濃度の影響をより詳細に研究するために、追加の粒径分析実験を、１ｍＬのモンタニドと乳化した後に最小の粒径を生じた溶媒、つまり有機相：水相の比率が１：３であって有機相がＰＧ、ＥｔＯＨ及びクレモフォールＥＬをＰＧ：ＥｔＯＨ：クレモフォールＥＬの比率１：２：１で含む再構築組成物（表６）、を使用して比較した。水相におけるクエン酸のモル量を変化させる（０．０５及び０．１Ｍクエン酸、つまり再構築組成物中のクエン酸の最終濃度がそれぞれ０．０３８及び０．０７５Ｍクエン酸）直接比較により実験を行った。ＤＰ－６Ｐを、１ｍＬのそのような再構築組成物に溶解し、次いで、Ｔ字型コネクタプロセスを使用し、５０回の高速混合サイクルを行って、１ｍＬのモンタニドと乳化した。これらの実験では、薬剤生成物の溶解並びに粒径及びエマルジョン安定性の両方を分析した。読み出しとして、不規則性を視覚的に試験できるように、カメラで粒子を視覚化するためにＭＦＩ５２００を使用したマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）を行った。０．０５Ｍ及び０．１Ｍクエン酸のクエン酸再構築組成物のＰＳＤ比較を図５に示す。
【0139】
図５に見られるように、クエン酸溶液の濃度は、エマルジョンのＰＳＤに影響を与えない。しかしながら、薬剤生成物の溶解は、０．１Ｍクエン酸を使用したときの方がわずかに良かった。図６は、ＤＰ－６Ｐエマルジョンの３つの独立した調製物（図６、パネルＡ）又は調製後の２つの異なる時間点で分析した２つの独立した調製物（図６、パネルＢ）のＭＦＩの結果を示し、ここで薬剤生成物は、同じ溶媒の組合せ（７５０μＬの０．０５Ｍクエン酸＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬ）を使用して再構築されたものである。非常にロバストなＰＳＤ結果が得られた。さらに、エマルジョンは全て少なくとも２時間安定であった。
【0140】
ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐに対する好ましい再構築溶媒及び乳化方法の適用
７５０μＬのクエン酸溶液＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬが、ＤＰ－６Ｐエマルジョンに対してロバストなＰＳＤ結果を示し、０．１Ｍクエン酸の使用が薬剤生成物の最も良好な溶解をもたらしたことから、この溶媒の組合せを、ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐエマルジョンの調製について広範に試験した。
７５０μＬのクエン酸溶液＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬが、ＤＰ－６Ｐエマルジョンに対してロバストなＰＳＤ結果を示し、０．１Ｍクエン酸の使用が薬剤生成物の最も良好な溶解をもたらしたことから、この溶媒の組合せを、ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐエマルジョンの調製について広範に試験した。
【0141】
ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐエマルジョンを、表１の手順に従って調製した。簡単に述べると、１ｍＬの再構築組成物（７５０μＬの０．１Ｍクエン酸＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬ）を凍結乾燥された薬剤生成物に加え、得られた溶液を、Ｔ字型コネクタを使用し、５０回の高速混合サイクルを適用して、１ｍＬのモンタニドと混合した。ＭＦＩ分析のためのＰＳＤ値をＥＣＤ（円相当径）で示し、個数基準分布を示す。ＭＦＩ、レーザー回折は補完的技術であることに留意すべきである。したがって、レーザー回折によって得られる平均粒径値とＭＦＩによって得られる平均粒径値との直接比較は行うことができない。
【0142】
【表8】
【0143】
【表9】
【0144】
表７及び８は、７５０μＬの０．１Ｍクエン酸＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬ（つまり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）を含む再構築組成物を使用して、ＤＰ－６Ｐ及びＤＰ－７Ｐエマルジョンの両方について、少なくとも３時間安定なエマルジョンを調製することができることを示している。
【0145】
実施例２
導入
ＣｐＧ１８２６と組み合わせたＳＬＰワクチン接種の治療的有効性は、ＨＰＶ１６の発癌性Ｅ６及びＥ７タンパク質を発現する樹立されたＴＣ－１腫瘍を保持するマウスにおいて以前に実証されている（Zwaveling et al., J. Immunol. (2002) 169: 350-358）。ＳＬＰが、実施例１で同定された最適な製剤（７５０μＬの０．１Ｍクエン酸＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬ）で機能性を保持しているかを評価するために、ＤＭＳＯ／ＷＦＩ又は新規再構築組成物のいずれかで再構築されたＤｂ拘束性ＣＴＬエピトープＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号６７によって本明細書で表される）を保有するＳＬＰを用いて、ＴＣ－１腫瘍を担持するマウスに、治療的にワクチン接種した。全てのワクチンをその後にモンタニドと乳化した。腫瘍伸長を、７５日間モニタリングした。ワクチン誘導Ｔ細胞応答のピークで、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ及び表現型を血液中で決定した。ＤＭＳＯ／ＷＦＩ及び新規再構築組成物で再構築されたＳＬＰは、ＴＣ－１腫瘍退縮の誘導において同様の効力を示した。新規溶液で再構築されたＳＬＰでワクチン接種したマウスは、血液中のＲＡＨＹＮＩＶＴＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージがより高かった。
導入
ＣｐＧ１８２６と組み合わせたＳＬＰワクチン接種の治療的有効性は、ＨＰＶ１６の発癌性Ｅ６及びＥ７タンパク質を発現する樹立されたＴＣ－１腫瘍を保持するマウスにおいて以前に実証されている（Zwaveling et al., J. Immunol. (2002) 169: 350-358）。ＳＬＰが、実施例１で同定された最適な製剤（７５０μＬの０．１Ｍクエン酸＋２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬ）で機能性を保持しているかを評価するために、ＤＭＳＯ／ＷＦＩ又は新規再構築組成物のいずれかで再構築されたＤｂ拘束性ＣＴＬエピトープＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号６７によって本明細書で表される）を保有するＳＬＰを用いて、ＴＣ－１腫瘍を担持するマウスに、治療的にワクチン接種した。全てのワクチンをその後にモンタニドと乳化した。腫瘍伸長を、７５日間モニタリングした。ワクチン誘導Ｔ細胞応答のピークで、ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ及び表現型を血液中で決定した。ＤＭＳＯ／ＷＦＩ及び新規再構築組成物で再構築されたＳＬＰは、ＴＣ－１腫瘍退縮の誘導において同様の効力を示した。新規溶液で再構築されたＳＬＰでワクチン接種したマウスは、血液中のＲＡＨＹＮＩＶＴＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージがより高かった。
【0146】
材料
【0147】
【表10】
【0148】
方法
ワクチン調製
以下のマウスの群を試験に含めた。
ワクチン調製
以下のマウスの群を試験に含めた。
【0149】
第１群：（ｎ＝５）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩ
第２群：（ｎ＝５）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した再構築組成物（１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）
第３群：（ｎ＝１０）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩに溶解させたＳＬＰ ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ及び２０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６／マウス。
第４群：（ｎ＝１０）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した再構築組成物（１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）に溶解させたＳＬＰ ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（配列番号６）及び２０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６／マウス。
第２群：（ｎ＝５）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した再構築組成物（１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）
第３群：（ｎ＝１０）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した４０％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ／ＷＦＩに溶解させたＳＬＰ ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ及び２０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６／マウス。
第４群：（ｎ＝１０）モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と１：１で乳化した再構築組成物（１ｍＬあたり、０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、６２．５μＬのプロピレングリコールと、１２５μＬのエタノールと、６２．５μＬのクレモフォールＥＬ）に溶解させたＳＬＰ ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ（配列番号６）及び２０μｇのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６／マウス。
【0150】
第１群のマウスのために、４００μＬのＤＭＳＯと６００μＬのＷＦＩとを混合し、続いて渦流することによって、溶液を調製した。溶液を、２ｍＬのＬｕｅｒ－Ｌｏｃｋシリンジ（シリンジＡ）に取った。別の２ｍＬのＬｕｅｒ－Ｌｏｃｋシリンジ（シリンジＢ）に、１ｍＬのモンタニドＩＳＡ ＶＧ５１を取り、その後、両方のシリンジを、Ｔ字型コネクタに接続した。内容物を前後に広く混合させることによって、エマルジョンを作製した。混合後、シリンジを取り外し、２５Ｇ針を、エマルジョンを含むシリンジに配置した。マウス毎に１００μＬを左脇腹の皮下に注射した。
【0151】
第２群のワクチンは、ＤＭＳＯ及びＷＦＩに代えて、再構築組成物（０．１Ｍクエン酸を含む７５０μＬの水と、２５０μＬの１：２：１のＰＧ／ＥｔＯＨ／クレモフォールＥＬ、つまり、水中に、０．０７５Ｍのクエン酸と、６．２５％ｖ／ｖのプロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７－５５－６）と、１２．５％ｖ／ｖのエタノールと、６．２５％ｖ／ｖのポリオキシエチレングリセロールトリリシノレエート３５（ＣＡＳ番号６１７９１－１２－６））を使用することで異なる以外は、同一の様式で調製した。第３群のワクチンは、最初に、配列番号６（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ）によって本明細書で表される１．５ｍｇのＳＬＰを含有するバイアルの内容物を、４００μＬのＤＭＳＯに溶解することによって調製した。ＳＬＰは、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, W. C. Chan,P.D. White Eds, Oxford Univ. Press 2000）を介して製造した。次いで、５２０μＬのＷＦＩ及び８０μＬのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（ストック５ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＭＳＯ中のペプチドに加えた。この溶液を２ｍＬのＬｕｅｒ－Ｌｏｃｋシリンジに取った後、モンタニドＩＳＡ ＶＧ５１と乳化することによって、第１群と同様のワクチン調製プロトコルに従った。第４群についてのワクチン調製は、第１のステップで１．５ｍｇのＳＬＰ配列番号６を含むバイアルの内容物を９２０μＬの再構築組成物に溶解させ、８０μＬのＣｐＧ ＯＤＮ１８２６を加えたこと（ストック５ｍｇ／ｍｌ）で異なる以外は、第３群のプロトコルと同一であった。
【0152】
治療用ワクチン接種
ＨＰＶ１６の発癌性Ｅ６及びＥ７タンパク質を発現するＴＣ－１腫瘍細胞を、４００μｇ／ｍｌのジェネティシンを補充した完全ＩＭＤＭ培養培地で培養した。０日目に、ＴＣ－１細胞を、トリプシンを使用して採集し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。採集直後に、１００，０００個のＴＣ－１細胞を、４０匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射した。８日目に、全てのマウスの左脇腹に、ワクチン調製の項目に記載したように、ワクチンを皮下接種した。全てのマウスの腫瘍の大きさを、腫瘍チャレンジ後７５日目まで、カリパスを使用して、１週間に少なくとも２回モニタリングした。図７に示すように試験を行った。
ＨＰＶ１６の発癌性Ｅ６及びＥ７タンパク質を発現するＴＣ－１腫瘍細胞を、４００μｇ／ｍｌのジェネティシンを補充した完全ＩＭＤＭ培養培地で培養した。０日目に、ＴＣ－１細胞を、トリプシンを使用して採集し、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。採集直後に、１００，０００個のＴＣ－１細胞を、４０匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射した。８日目に、全てのマウスの左脇腹に、ワクチン調製の項目に記載したように、ワクチンを皮下接種した。全てのマウスの腫瘍の大きさを、腫瘍チャレンジ後７５日目まで、カリパスを使用して、１週間に少なくとも２回モニタリングした。図７に示すように試験を行った。
【0153】
血液中のＴ細胞応答の強度の測定
ワクチン接種後９日目に、血液を、全てのマウスの尾静脈から採取した。血液試料を９６ウェル培養プレートに移し、１６００ｒｐｍで５分間遠心分離した。赤血球を、橙色の着色が観察されるまで、溶解緩衝液中に血液細胞ペレットを懸濁することによって溶解した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液において洗浄し、上記の材料の項目で述べた蛍光抗体Ｄｂ－ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ－ＡＰＣテトラマー及び７－ＡＡＤで染色した。氷上で３０分インキュベーションした後、細胞を洗浄し、ライデン大学医療センター（リウマチ学部門）のＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
ワクチン接種後９日目に、血液を、全てのマウスの尾静脈から採取した。血液試料を９６ウェル培養プレートに移し、１６００ｒｐｍで５分間遠心分離した。赤血球を、橙色の着色が観察されるまで、溶解緩衝液中に血液細胞ペレットを懸濁することによって溶解した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液において洗浄し、上記の材料の項目で述べた蛍光抗体Ｄｂ－ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ－ＡＰＣテトラマー及び７－ＡＡＤで染色した。氷上で３０分インキュベーションした後、細胞を洗浄し、ライデン大学医療センター（リウマチ学部門）のＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【0154】
結果
ワクチン接種群間で類似の腫瘍伸長
少なくとも週二回、腫瘍の大きさをモニタリングすることによって、それぞれの個々のマウスについて増殖曲線を作成することができた。図８に、腫瘍の伸長を種々の群について示す。腫瘍退縮は、ＳＬＰ６及びＣｐＧ１８２６でワクチン接種した全てのマウスで観察される。ＤＭＳＯ／ＷＦＩとモンタニド又は再構築組成物とモンタニドのいずれかでビヒクルのみを受けた対照群では、腫瘍は急速に増殖する。自然変動のほかには、両方のＳＬＰ－ワクチン接種群の間で明確な差異は観察されなかった。ワクチン接種群間で差異がないことを示すカプラン・マイヤー生存プロットについて図９Ａを参照。
ワクチン接種群間で類似の腫瘍伸長
少なくとも週二回、腫瘍の大きさをモニタリングすることによって、それぞれの個々のマウスについて増殖曲線を作成することができた。図８に、腫瘍の伸長を種々の群について示す。腫瘍退縮は、ＳＬＰ６及びＣｐＧ１８２６でワクチン接種した全てのマウスで観察される。ＤＭＳＯ／ＷＦＩとモンタニド又は再構築組成物とモンタニドのいずれかでビヒクルのみを受けた対照群では、腫瘍は急速に増殖する。自然変動のほかには、両方のＳＬＰ－ワクチン接種群の間で明確な差異は観察されなかった。ワクチン接種群間で差異がないことを示すカプラン・マイヤー生存プロットについて図９Ａを参照。
【0155】
ワクチン誘導テトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞
図９Ｂは、誘導されたＤｂ－ＲＡＹＮＩＶＴＦ（テトラマー）陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。第４群（Ｒｅｃ．組成物＋ＳＬＰ）におけるマウスは、増強されたテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、特定のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングにおいて、再構築組成物で製剤化されたＳＬＰ及びＣｐＧが、ＤＭＳＯ／ＷＦＩとモンタニドのエマルジョンで製剤化されたＳＬＰ及びＣｐＧより有効であることを示唆している。群あたりの平均パーセンテージ及び標準偏差について表９を参照。
図９Ｂは、誘導されたＤｂ－ＲＡＹＮＩＶＴＦ（テトラマー）陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。第４群（Ｒｅｃ．組成物＋ＳＬＰ）におけるマウスは、増強されたテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、特定のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングにおいて、再構築組成物で製剤化されたＳＬＰ及びＣｐＧが、ＤＭＳＯ／ＷＦＩとモンタニドのエマルジョンで製剤化されたＳＬＰ及びＣｐＧより有効であることを示唆している。群あたりの平均パーセンテージ及び標準偏差について表９を参照。
【0156】
対応のないｔ検定を使用して有意差を決定し、第３群と第４群との間のｐ＝０．０２２のｐ値を得た。
【0157】
ＫＬＲＧ１及びＣＤ６２Ｌの発現は、ＳＬＰ６でワクチン接種後の、良好な抗腫瘍発現プロファイルを示す。
【0158】
Ｖａｎ Ｄｕｉｋｅｒｅｎらによる研究（J Immunol, 2012; 189(7):3397-403）は、有効な抗腫瘍応答の誘導と相関するパラメータを特定することを目的としている。そのようなバイオマーカーを同定することによって、腫瘍モデルの予後値を有する非腫瘍担持マウスにおいて、異なるワクチン組成物を試験することができる。著者は、一方でＫＬＲＧ１の発現とＣＤ６２Ｌ発現欠如との相関関係を見い出し、他方で効果的な抗腫瘍免疫応答を見い出した。ワクチン接種後９日目のワクチン接種マウスの血液中のＫＬＲＧ１－及びＣＤ６２Ｌ－発現Ｄｂ－ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用して決定した。ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ特異的ＫＬＲＧ１＋ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージの差異は、第３群と第４群との間で観察されない。ビヒクルのみでワクチン接種したマウスの群（第１群及び第２群）では、ＫＬＲＧ１及びＣＤ６２Ｌの発現を確実に試験できるような十分なＲＡＨＹＮＩＶＴＦ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は検出されなかった。群あたりの平均パーセンテージ及び標準偏差について表１０を参照。
【0159】
【表11】
【0160】
考察
ＤＭＳＯ／ＷＦＩ又は再構築組成物のいずれかに溶解させたＳＬＰ６でワクチン接種したマウスの群の間で全体的な腫瘍の伸長の差異は観察されなかった。ＤＭＳＯ／ＷＦＩに溶解させたＳＬＰでワクチン接種したマウスの群と比較して、再構築組成物に溶解させたＳＬＰでワクチン接種したマウスの群における特定のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導増強が観察された。
ＤＭＳＯ／ＷＦＩ又は再構築組成物のいずれかに溶解させたＳＬＰ６でワクチン接種したマウスの群の間で全体的な腫瘍の伸長の差異は観察されなかった。ＤＭＳＯ／ＷＦＩに溶解させたＳＬＰでワクチン接種したマウスの群と比較して、再構築組成物に溶解させたＳＬＰでワクチン接種したマウスの群における特定のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導増強が観察された。
【0161】
モンタニドのアジュバント特性は、抗原提示細胞の成熟を促進する抗原デポーの形成並びに局所炎症及び細胞死の誘導に起因している。再構築組成物に溶解させたＳＬＰでワクチン接種したマウスの群におけるテトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導増強は、この溶液とモンタニドとの組合せが、抗原放出特性又は抗原提示細胞の局所刺激に有益なエマルジョンを構成していることを示唆する。ＫＬＲＧ１発現及びＣＤ６２Ｌの非存在の好ましいプロファイルは、ＳＬＰでワクチン接種したマウス群の両方で同様であった。データは、本発明の再構築組成物で再構築されたＳＬＰが、使用された元の再構築組成物（ＤＭＳＯ／ＷＦＩ）と比較して、その免疫原性能力を維持していることを実証している。
【0162】
実施例３
材料
以下の凍結乾燥されたペプチド組成物を使用した：
Ｐ５３ ＤＰ５Ｐ：配列番号１９１、１９３、１９４、２０１及び２０３によって本明細書で表されるペプチドを含む。
材料
以下の凍結乾燥されたペプチド組成物を使用した：
Ｐ５３ ＤＰ５Ｐ：配列番号１９１、１９３、１９４、２０１及び２０３によって本明細書で表されるペプチドを含む。
【0163】
次の化学物質を使用した：クレモフォールＥＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ． Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＥＬ）；プロピレングリコール（≧９９．５％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；エタノール（無水、ＶＷＲ Ｅｍｐｒｏｖｅ（登録商標）Ｐｈ Ｅｕｒ． ＢＰ．ＵＳＰ）；クエン酸（≧９９％、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；ミリＱ水；滅菌モンタニドＩＳＡ５１ＶＧ（ＳＥＰＰＩＣ．）
次の機器を使用した：シリンジ押出装置（Ｄｉｓｃｏｆｉｘ－３ Ｔ字型コネクタ。Ｂ． Ｂｒａｕｎ）；ＤＭＳＯ耐性シリンジ（２ｍＬ ＮＯＲＭ－ＪＥＣＴ Ｌｕｅｒ Ｌｏｃｋ． Ｈｅｎｋｅ Ｓａｓｓ Ｗｏｌｆ）；Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ／ＭＳシステムＥＱＰ－００４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＭＦＩ５２００
次の機器を使用した：シリンジ押出装置（Ｄｉｓｃｏｆｉｘ－３ Ｔ字型コネクタ。Ｂ． Ｂｒａｕｎ）；ＤＭＳＯ耐性シリンジ（２ｍＬ ＮＯＲＭ－ＪＥＣＴ Ｌｕｅｒ Ｌｏｃｋ． Ｈｅｎｋｅ Ｓａｓｓ Ｗｏｌｆ）；Ｗａｔｅｒｓ ＵＰＬＣ／ＭＳシステムＥＱＰ－００４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＭＦＩ５２００
【0164】
方法
ワクチンエマルジョン及びプラセボエマルジョンの調製を表１に記載されるように実施した。
ワクチンエマルジョン及びプラセボエマルジョンの調製を表１に記載されるように実施した。
【0165】
化学的安定性の分析は、実施例１で、ワクチンエマルジョンからのペプチドの抽出を含め、ＨＰＶ－ＤＰ－６Ｐ及びＨＰＶ－ＤＰ－７Ｐワクチンエマルジョンの使用中の化学的安定性の分析のための方法を説明している項目に記載されているように、ＵＰＬＣ－ＭＳによって実施した。
【0166】
粒径分析は、マイクロフローイメージングによって実施した。分析の前に、１０μＬのエマルジョンを１０ｍＬの再構築溶液に加え、均質になるまで混合し、次いでこの溶液を再構築溶液で１：５００希釈することによって、ワクチンエマルジョンの希釈液を調製した。
【0167】
ＭＦＩ５２００の分析設定：
方法：ＤＳ５００．２
試料体積：１ｍＬ
パージ体積：０．２０ｍＬ
分析：０．６８分又は１．０００．０００個の粒子
連続ラン：１
結果は円相当径（ＥＣＤ）で表し、個数基準分布を示す。≧１５μｍの粒径は、エマルジョン粒子ではなくアーティファクトであることが既知であるので、結果から除外した。
方法：ＤＳ５００．２
試料体積：１ｍＬ
パージ体積：０．２０ｍＬ
分析：０．６８分又は１．０００．０００個の粒子
連続ラン：１
結果は円相当径（ＥＣＤ）で表し、個数基準分布を示す。≧１５μｍの粒径は、エマルジョン粒子ではなくアーティファクトであることが既知であるので、結果から除外した。
【0168】
結果
再構築された薬剤生成物の純度
異なる時間点での薬剤生成物の純度を以下のように計算した。
純度（％）＝１００％－不純物の合計≧０．０５％面積
Ｐ５３－ＤＰ－５Ｐワクチン生成物の使用中の純度の概要を（エラー！参照元が見つかりません）に示す。
再構築された薬剤生成物の純度
異なる時間点での薬剤生成物の純度を以下のように計算した。
純度（％）＝１００％－不純物の合計≧０．０５％面積
Ｐ５３－ＤＰ－５Ｐワクチン生成物の使用中の純度の概要を（エラー！参照元が見つかりません）に示す。
【0169】
【表12】
【0170】
（エラー！参照元が見つかりません）から分かるように、薬剤生成物の純度はゆっくりと低下するが、ワクチン調製後２時間、依然として≧９０．０％である。ｔ＝０及びｔ＝２ｈでのワクチンのＵＰＬＣ分析の例示的なクロマトグラムを図１０に示す。
【0171】
主ピーク及び面積≧１．０％の面積を有する不純物の同定を、質量分析法を用いて実施した。面積≧１．０％の面積を有する全ての関連物質を、ペプチド配列の分子質量を用いた尺度ｍ／ｚ値及びそれらの既知及び予測される修飾を比較することによって報告し、同定する。Ｐ５３－ＤＰ－５Ｐの３時間までの使用中の保存について関連物質の結果の概要を表１２に示す。
【0172】
【表13】
【0173】
エマルジョンからの薬剤生成物の回収
Ｐ５３－ＤＰ－５Ｐに存在する、エマルジョンからの５つの個々のペプチドの回収を、乳化及び非乳化試料のシグナルの比較によって検証した。結果の概要を（エラー！参照元が見つかりません）に示す。
Ｐ５３－ＤＰ－５Ｐに存在する、エマルジョンからの５つの個々のペプチドの回収を、乳化及び非乳化試料のシグナルの比較によって検証した。結果の概要を（エラー！参照元が見つかりません）に示す。
【0174】
【表14】
【0175】
物理的安定性
物理的安定性を、ＭＦＩを用いた粒径分析によって分析した。結果を円相当径（ＥＣＤ）で示す。個数基準分布から計算された平均粒径値を表１４に示す。
物理的安定性を、ＭＦＩを用いた粒径分析によって分析した。結果を円相当径（ＥＣＤ）で示す。個数基準分布から計算された平均粒径値を表１４に示す。
【0176】
【表15】
【0177】
結論
溶解は、Ｐ５３抗原（Ｐ５３ ＤＰ－５Ｐ）から誘導される５つのＳＬＰを含む混合物について首尾よく実施された。
溶解は、Ｐ５３抗原（Ｐ５３ ＤＰ－５Ｐ）から誘導される５つのＳＬＰを含む混合物について首尾よく実施された。
【0178】
ワクチン生成物の化学的及び物理的な使用中の安定性の両方を試験した。表１１に要約されるＰ５３ ＤＰ－５Ｐについての関連物質の分析及び純度の計算は、ワクチン調製後２時間、薬剤生成物の純度が≧９０．０％であることを示す。≧１％のピーク面積％を有する１つの関連物質のみを観察した。ＭＳ同定は、このピークが、配列番号２０３で示されるペプチドの分子内ジスルフィドであることを示した。
【0179】
Ｐ５３ ＤＰ－５Ｐワクチン生成物の物理的安定性を、ＭＦＩでその粒径をモニタリングすることによって試験した。粒径分析の結果を表１４にまとめる。その結果は、ワクチン調製後３時間まで粒径が変化していないことを示している。さらに、全てのワクチン生成物を安定性試験の間、目視検査によってモニタリングしたが、相分離はどの時間点でも観察されなかった。
【0180】
実施例４
材料及び方法
以下の凍結乾燥されたペプチド組成物を使用した：
配列番号１５３、１５５、１５６、１６０及び１６６によって示されるペプチドを含むＰＲＡＭＥ ＤＰ５Ｐ：
５つのＰＲＡＭＥ由来ペプチドのセットを、ＵＰＬＣ保持時間、アミノ酸組成の変動、及び目視検査によって決定される再構築溶液の溶解性に基づいて選択した。
材料及び方法
以下の凍結乾燥されたペプチド組成物を使用した：
配列番号１５３、１５５、１５６、１６０及び１６６によって示されるペプチドを含むＰＲＡＭＥ ＤＰ５Ｐ：
５つのＰＲＡＭＥ由来ペプチドのセットを、ＵＰＬＣ保持時間、アミノ酸組成の変動、及び目視検査によって決定される再構築溶液の溶解性に基づいて選択した。
【0181】
使用した他の材料及び方法は、実施例３と同様であった。
【0182】
結果
再構築された薬剤生成物の純度
異なる時間点での薬剤生成物の純度を以下のように計算した。
純度（％）＝１００％－不純物の合計≧０．０５％面積
ＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐワクチン生成物の使用中の純度の概要を表１５に示す。凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐの純度が既に９０％未満であることに留意すべきである。それにもかかわらず、長期間での純度の減少が非常に限られていることは、この再構築された薬剤生成物の良好な化学的安定性を示している。
再構築された薬剤生成物の純度
異なる時間点での薬剤生成物の純度を以下のように計算した。
純度（％）＝１００％－不純物の合計≧０．０５％面積
ＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐワクチン生成物の使用中の純度の概要を表１５に示す。凍結乾燥されたＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐの純度が既に９０％未満であることに留意すべきである。それにもかかわらず、長期間での純度の減少が非常に限られていることは、この再構築された薬剤生成物の良好な化学的安定性を示している。
【0183】
【表16】
【0184】
長期間で純度の低下が低いことは、化学的安定性が高いことを示す。ＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐにおいて面積≧１．０％の面積を有する不純物が、再構築前に混合物中に既に存在していた。この安定性試験でこれらの不純物の顕著な増加は観察されなかったことから、不純物の同定は実施しなかった。ＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐの３時間までの使用中の保存について関連物質の結果の概要を表１６に示す。
【0185】
【表17】
【0186】
エマルジョンからの薬剤生成物の回収
エマルジョンからのＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐに存在する５つの個々のペプチドの回収を、乳化及び非乳化試料シグナルの比較によって検証した。結果の概要を表１７に示す。
エマルジョンからのＰＲＡＭＥ－ＤＰ－５Ｐに存在する５つの個々のペプチドの回収を、乳化及び非乳化試料シグナルの比較によって検証した。結果の概要を表１７に示す。
【0187】
【表18】
【0188】
結論
ＰＲＡＭＥ ＤＰ－５Ｐの純度は、完全に満足というわけではない（＜９０％）が、再構築ワクチン生成物の純度の低下は非常に限定されており（純度Ｔ＝０ ８２．９％、Ｔ＝３ｈ ８２．２％）、本明細書に記載の組成物の利点が確認される。
ＰＲＡＭＥ ＤＰ－５Ｐの純度は、完全に満足というわけではない（＜９０％）が、再構築ワクチン生成物の純度の低下は非常に限定されており（純度Ｔ＝０ ８２．９％、Ｔ＝３ｈ ８２．２％）、本明細書に記載の組成物の利点が確認される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【配列表】