ホーム > 特許ランキング > Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
特許7116126形質導入Ｔ細胞選択のためのトランケート上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-01
(45)【発行日】2022-08-09
(54)【発明の名称】形質導入Ｔ細胞選択のためのトランケート上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220802BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220802BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220802BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20220802BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220802BHJP
C07K 14/71 20060101ALN20220802BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220802BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N5/0783
C12N5/10
C12Q1/04
C07K16/28
C07K14/71
C07K14/705
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2020139041
(22)【出願日】2020-08-20
(62)【分割の表示】P 2019046818の分割
【原出願日】2010-11-03
(65)【公開番号】P2021006035
(43)【公開日】2021-01-21
【審査請求日】2020-09-18
(31)【優先権主張番号】61/257,567
(32)【優先日】2009-11-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】598004424
【氏名又は名称】シティ・オブ・ホープ
【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ
【住所又は居所原語表記】１５００ Ｅａｓｔ，Ｄｕａｒｔｅ Ｒｏａｄ，Ｄｕａｒｔｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９１０１０－０２６９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100091214
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 進介
(72)【発明者】
【氏名】ジェンセン，マイケル シー
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】特表２００３－５２２５２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００６／００９６９４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Annu. Rev. Biophys.，2008年，Vol. 37，pp. 353-373
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ －１５／９０
Ｃ０７Ｋ １４／７０５－１４／７４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＧＦＲドメインＩＩＩ、ＥＧＦＲドメインＩＶ及びＥＧＦＲ膜貫通ドメインを含むが、ＥＧＦＲドメインＩ、ＥＧＦＲドメインＩＩ、ＥＧＦＲ膜近傍ドメイン、及びＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインからなるドメインの全てを欠失した、改変上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲ）をコードする核酸分子を含むヒトＴ細胞を濃縮又は選択するインビトロでの方法であって、ここで、前記ＥＧＦＲには、（ｉ）内因性シグナル伝達機能又は輸送機能はなく；（ｉｉ）治療用抗ＥＧＦＲ抗体に結合し；（ｉｉｉ）内因性ＥＧＦＲリガンドに結合せず；かつ、（ｉｖ）マーカーとして作用し、かつ、ここで、前記方法は、前記核酸分子を含むヒトＴ細胞を含む細胞の集団を、前記ＥＧＦＲに結合する抗ＥＧＦＲ抗体と接触させるステップを含む、方法。
【請求項2】
核酸分子は、配列番号２の第６７～１０７１番目のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項3】
核酸分子は、配列番号３の第２３～３５７番目の残基を含むアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項4】
核酸分子は、さらに、ＧＭＣＳＦＲアルファ鎖シグナル配列を含む、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項5】
核酸分子は、配列番号２を含む、請求項４に記載のインビトロでの方法。
【請求項6】
核酸分子は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性があるアミノ酸配列をコードする、請求項４に記載のインビトロでの方法。
【請求項7】
核酸分子は、配列番号３を含むアミノ酸配列をコードする、請求項４に記載のインビトロでの方法。
【請求項8】
核酸分子は、ベクター内へ挿入される、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項9】
核酸分子は、腫瘍関連抗原に特異的なキメラ抗原レセプタにＣ末端２Ａ開裂性リンカを介して結合した改変ＥＧＦＲを含むコンストラクトの一部であり、前記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２からなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項10】
改変ＥＧＦＲは、コドン最適化抗ＣＤ１９共刺激キメラ抗原レセプタ（ＣＤ １９ＣＡＲ）及びＣ末端２Ａ開裂性リンカに結合する、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項11】
ＣＤ １９ＣＡＲ及びＣ末端２Ａ開裂性リンカに結合した改変上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲ）をコードする核酸分子を含むヒトＴ細胞を濃縮又は選択するインビトロでの方法であって、前記核酸分子は、配列番号６を含むアミノ酸配列をコードする、インビトロでの方法。
【請求項12】
核酸分子は、ヒトＴ細胞の集団にベクター内に挿入されて形質導入される、請求項１１に記載のインビトロでの方法。
【請求項13】
改変上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲ）をコードする核酸分子を含むヒトＴ細胞を含む細胞の集団を以前に投与された患者に、抗ＥＧＦＲ抗体を投与して、改変ＥＧＦＲをコードする核酸分子を含むヒトＴ細胞を枯渇させることにより、前記患者を治療するための、抗ＥＧＦＲ抗体を含む医薬組成物であって、
ここで、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、前記改変ＥＧＦＲに結合し；
ここで、前記改変ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲドメインＩＩＩ、ＥＧＦＲドメインＩＶ及びＥＧＦＲ膜貫通ドメインを含むが、ＥＧＦＲドメインＩ、ＥＧＦＲドメインＩＩ、ＥＧＦＲ膜近傍ドメイン、及びＥＧＦＲチロシンキナーゼドメインからなるドメインの全てを欠失し、かつ、（ｉ）内因性シグナル伝達機能又は輸送機能はなく；（ｉｉ）治療用抗ＥＧＦＲ抗体に結合し；（ｉｉｉ）内因性ＥＧＦＲリガンドには結合せず；かつ、（ｉｖ）マーカーとして作用する、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２００９年１１月３日に出願された米国仮特許出願番号６１／２５７、５６７の効果を主張するものであり、この出願の内容は参照され本明細書に援用される。
【0002】
本発明の物及び方法は免疫の分野及び遺伝子的改変細胞の精製の分野に関し、特に癌免疫療法での使用のための、セツキシマブと対形成するヒト上皮増殖因子レセプタ（ＥＧＲＦ）から誘導されるポリペプチドなどの、対応する抗体と対形成するトランケート又は改変されたレセプタに関する。
【背景技術】
【0003】
腫瘍を目標とするキメラ抗原レセプタ（ＣＡＲｓ）を均一に発現する免疫細胞物は、形質導入及び他の遺伝子改変手順に本質的である導入遺伝子発現物ごとの変化を除去することが適合性治療戦略の臨床評価にとっては望ましく、かつその後の選別をすることなく他の遺伝子的改変のために望ましいものである。遺伝子的に再構成された免疫細胞を用いる免疫治療は種々の癌患者の微小残存病変を治療するための魅力的な方法である。しかし、前記形質導入戦略の部分として抗生物質選択性蛋白を発現する細胞生成物の免疫拒絶反応がこの戦略を妨げる。ヒトリンパ球上に発現されない新規な選択マーカーは、内因性シグナル伝達機能又は輸送機能（以下「シグナル系」とする場合がある）を含まず、かつ知られた、好ましくは市販されている医薬品グレードの抗体試薬であって、インビボ追跡（トラッキング）で選択のために使用され、形質導入細胞を死滅させるために使用され得るものにより認識される新規な選択マーカーは、当該技術分野において重要な改良となるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、遺伝子組換え細胞物及びそのインビボ及びエクスビボでの両方での精製の方法が提供される。遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えにより改変、又は内因性ヌクレオチド配列を付加、欠失、置換又は中断する他のプロセスにより組み換えされ得る。遺伝子組み換細胞は、変化した免疫活性を含む、改変活性を有する形質導入Ｔ細胞であり得る。
【発明を実施するための手段】
【0005】
ここで記載される実施態様によると、免疫的磁気選別適用可能な非免疫選択エピトープは、細胞物の望ましくない免疫拒絶反応がなく（即ち、抗物質選別タンパク質の発現なしで）、癌患者への免疫治療を実施可能とする。これは前記タンパク質の特定のアミノ酸配列を除去することで調製される。ある実施態様では、前記非免疫的選択エピトープは、遺伝子がコードする内因性細胞表面分子であり、改変されトランケートされて、知られた抗体又はその機能的断片により認識され、かつ全てのシグナル系ドメイン及び／又は全ての前記知られた抗体により認識されない細胞外ドメインを除去し、かつ細胞外エピトープを維持するものである。前記シグナル系ドメイン及び／又は全ての前記知られた抗体により認識されないドメインの除去は、得られる内因性細胞表面分子を望ましい性質として不活性とする。前記非免疫性選別エピトープはまた、選別ツールや追跡（トラッキング）ツールとして使用され得る。
【0006】
前記改変内因性細胞表面分子には、限定されるものではないが全ての細胞表面に関連するレセプタ、リガンド、グリコプロテイン、細胞接着分子、抗原、インテグリン又はここで記載されるように改変された分化クラスタ（ＣＤ）が挙げられる。いくつかの実施態様では、前記改変内因性細胞表面分子は、トランケートされたチロシンキナーゼレセプタである。１つの側面では、前記トランケートされたチロシンキナーゼレセプタは、内皮増殖因子レセプタファミリ（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）の一つである。
【0007】
内皮増殖因子レセプタはまた、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１及びＨＥＲ１として知られ、細胞外リガンドの内皮増殖因子ファミリの一員の細胞表面レセプタである。ＥＧＦＲ活性の変化が、ある癌について関連付けられてきた。第１の側面では、遺伝子が提供され、前記遺伝子がコードするＥＧＦＲポリペプチドは、ヒト内皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲ）を含み、これは、膜遠位ＥＧＦ結合ドメインと細胞傷害シグナルテールを除去し（これを「トランケート」又は「トランケートされた」、又は「ＥＧＦＲｔ」とする）、しかし抗ＥＧＦＲ抗体により認識される細胞外膜近位エピトープは保持するように構成されるものである。好ましくは、前記抗体は、知られた、市販され利用可能な抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であり、例えばセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）又はパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）が挙げられる。
【0008】
ビオチン化セツキシマブを抗ビオチンミクロビーズと組み合わせて免疫的磁気選別に適用することで、レンチウイスルによる遺伝子組換えでＥＧＦＲｔ含有構成物を含むＴ細胞を２％程度の低い集団からより高い９０％以上の純度に、前記細胞調製に対して観察できるほどの毒性もなく濃縮される。この不活性ＥＧＦＲｔ分子の構成物発現は、Ｔ細胞型に変更を与えず又は協働的に発現されるキメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）であるＣＤ１９Ｒにより再構成されるようにエフェクタ機能に影響を与えない。フローサイトメトリ分析から、ＥＧＦＲｔはマウスのＴ細胞移植のインビボトラックマーカーとして利用することができることが分かった。さらに、ＥＧＦＲは、エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｒ）介在抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路を通じて自殺遺伝子としての可能性を有することが示された。従って、ＥＧＦＲｔは、免疫治療の可能性を有する遺伝子組換えＴ細胞の非免疫選別ツール、トラッキングマーカー及び自殺遺伝子として使用され得る。前記ＥＧＦＲｔ核酸はまた、本技術分野でよく知られる方法で検出され得る。
【0009】
他の実施態様では、改変され、トランケートされ又は変更された内因性細胞表面分子であって、好ましくは市販されている以下記載される抗体に結合する内因性細胞表面分子を見出しかつ設計する方法が提供される。前記方法には、対象となるタンパク質のモデル化、及び抗体結合部分は変更せずに機能性タンパク質をトランケートすることが含まれる。得られる改変されたレセプタ又はリガンドは、ラベル化抗体を用いて選別（ソート）され、その後前記改変されたレセプタ又はリガンドの濃度が増加するように濃縮させることができる。
【0010】
他の実施態様では、改変され、トランケートされた又は変更された内因性細胞表面分子遺伝子配列（例えばトランケートされたＥＧＦＲ）を持つＴ細胞を遺伝子組換えし、その後前記遺伝子組換えＴ細胞へ前記改変されたリガンド又はレセプタ配列を結合する抗体を適用することを含む、遺伝子組換えＴ細胞を選別する方法が提供される。前記改変されたレセプタ配列がＥＧＦＲｔである場合、前記抗体は好ましくはビオチン化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。前記Ｔ細胞はその後、抗ビオチンミクロビーズを添加し、かつＴ細胞を免疫的磁気選別を用いて選択し、蛍光色素共役抗ビオチンを添加し、かつ蛍光活性化細胞選別（ソート）又はその他の全ての信頼性のある細胞ソート方法を用いてＴ細胞を選択することでソートされる。前記改変リガンド又はレセプタ配列、例えばＥＧＦＲｔ配列はレンチウイルスベクターなどの適切な移動体内に含まれ得る。
【0011】
本発明のこれら及びその他も実施態様は、以下図面と詳細な説明に基づきさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１は、結晶構造に基づくＥＧＦＲとＥＧＦＲｔの分子モデルを示す。左のＥＧＦＲ構造は完全長ＥＧＦＲを示し、４つの細胞外ドメイン（ドメインＩ～ＩＶ）構造を持つ。中間の構造はトランケートされたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）を示し、未変成ＥＧＦＲと比べて、ドメインＩ、ドメインＩＩ、膜近傍ドメイン及びチロシンキナーゼドメインを欠いている。右のＥＧＦＲｔは、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬからなるエルビタックス（Ｅｒｉｂｉｔｕｘ）（Ｒ）Ｆａｂに結合されたトランケート構造を示す。前記ドメインは点線で区切られている。
【図2A】図２Ａは、ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のビオチン化セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（図ではエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｒ）と記載される）選択を示し、セツキシマブのビオチン化及び再改質プロセスの模式図である。
【図2B】図２Ｂは、ビオチン化セツキシマブの滴定を示すグラフである。１０６ＥＧＦＲ＋細胞が、０μｇ（黒）、０．１４５μｇ（オレンジ）、１４．５ｎｇ（黄）、１．４５ｎｇ（緑）、０．１４５ｎｇ（青）又は１４．５ｐｇ（紫）のいずれかで染色され、その後０．５μｇのＰＥ共役ストレプトアビジンで処理され、フローサイトメトリで分析された。１４．５ｎｇ以上のビオチン化セツキシマブが将来の染色で十分であるように思われる。
【図2D】図２Ｄは、ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔを含む構成をレンチウイルスで遺伝子導入された種々のＴ細胞の免疫磁気的選択を示す。レンチウイルスベクターに含まれるＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（左）及びＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ－ＩＭＰＤＨ２ｄｍ（右）構成が、表面ＥＧＦＲｔ発現について上の対応する前及び後での選択フローサイトメトリ分析が示される。ＣＤ１９特異的コドン最適化配列、ＣＤ２８共刺激ＣＡＲ、さらに自己開裂Ｔ２Ａ、ＥＧＦＲｔ及びＩＭＰＤＨ２ｄｍ選別マーカーが示され、同時に伸長因子１プロモーター配列（ＥＦ－１ｐ）及びＧＣＳＦＲアルファ鎖シグナル配列（ＧＣＳＦＲｓｓであり、これは表面発現を構成する）が示される。ビオチン化セツキシマブ抗体及びＰＥ共役抗ビオチン抗体（黒ヒストグラム）で染色されたレンチウイルスによる遺伝子導入Ｔ細胞のフローサイトメトリが、前記インプットＴ細胞（ＰＲＥＳＬＸＮ）及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）から得られたポジティブ画分（ＰＯＳ ＦＲＸＮ）の両方で実施された。白ヒストグラムは、ＰＥ共役抗ビオチン抗体のみでの染色を表し、ポジティブ細胞パーセントがそれぞれのヒストグラムに示される。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｒ＋細胞株Ａの選別は、Ｔ細胞芽の遺伝子組換え後３日で行った。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｒ＋細胞株Ｂの選別は、トランケートされたＣＭＶｐｐ－６５特異的ＴＣＭ由来細胞の３回ＲＥＭ刺激の後で行った。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｃの選別は遺伝子組換えＣＤ８＋ＴＣＭ誘導細胞の２回ＲＥＭ刺激後に行った。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｄの選別は、遺伝子組換えＴＥＭ誘導細胞の１回ＲＥＭ刺激の後で行った。Ｃｄ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ＩＭＰＤＨ２ｄｍ＋細胞株Ｅの選別は、遺伝子組換えＴＣＭ誘導細胞の１回のＲＥＭ刺激の後に行った。
【図3A】図３は選別されたＴ細胞に発現されたＥＧＦＲｔが不活性であることを示す。図３Ａは、Ｔ細胞に発現されたＥＧＦＲｔがＥＧＦとのコインキュベートでリン酸化されないことを示す。ネガティブコントロールＴ細胞、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ａ細胞、又はＡ４３１細胞が、５分間、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ又はセツキシマブ（図ではＥｒｂｔｘと符号付されている）のいずれかとインキュベートし、その後ホスファターゼインヒビタの存在下で溶解させた。溶解物をウェスタンブロットし、その後βアクチン、ＥＧＦＲの細胞質ドメイン又はＥＧＦＲの１０６８位でリン酸化されたチロシンのいずれかに特異的な抗体を用いて立証された。
【図3B】図３Ｂは、ＥＧＦが、ＥＧＦＲｔ発現Ｔ細胞の表面に結合しないことを示す。Ａ４３１、細胞株Ａ４３１及びネガティブコントロールＴ細胞が、ＰＥ共役抗ＥＧＦＲ、又はビオチン化セツキシマブかビオチン化ＥＧＦのいずれかで染色され、続いてＰＥ共役ストレプトアビジン（黒ヒストグラム）対ＰＥ共役同位体コントロールＡｂ又はストレプトアビジンのみ（白ヒストグラム）をフローサイトメトリにより分析した。ポジティブ染色パーセントはそれぞれのヒスとグラムに示される。
【図4A】図４は選別されたＥＧＦＲｔ＋ＣＤ１９Ｒ＋Ｔ細胞が、エフェクタ細胞型を維持して増殖することができることを示す。図４Ａは、急速増殖媒体（ＲＥＭ）刺激がＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）選別（０日目、ここでＭＡＣＳは磁気活性化細胞選別を意味する）開始後１２日以上についてＥＧＦＲｔ選別Ｔ細胞の細胞株Ａ～Ｅの増殖を示す線グラフである。急速増殖培地（ＲＥＭ）でのＴ細胞増殖は、１０６Ｔ細胞を、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３８（ＯＫＴ３；Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）、５ｘ１０７の照射ＰＢＭＣ（３５００ｃＧｙ）、及び１０７Ｔ照射ＬＣＬ（８０００ｖＧｙ）を５０ｍＬのＣＭ中で、５０Ｕ／ｍＬのｒｈｌＬ－２及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｈｌＬ－１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を４８時間ごとに１日目から始めて添加してインキュベートすることを含む。Ｔ細胞はこの方法で１４日ごとに再刺激を行った。
【図4B】図４Ｂは、ＲＧＦＲｔ選別Ｔ細胞（刺激後１１～１３日）を表すヒストグラムであり、表面ＥＧＦＲ（即ち、ＥＧＦＲｔ、ビオチン化セツキシマブ）、Ｆｃ（即ち、ＣＡＲ）及びＴ細胞マーカーＣＤ４又はＣＤ８（黒ヒストグラム）対同位体コントロールＡｂ（白ヒストグラム）のフローサイトメトリ分析を示す。ポジティブ染色パーセントはそれぞれのヒストグラムに示される。「Ｎ．Ｄ．」はデータ無し、を意味する。
【図4C】図４Ｃは、細胞株Ａ～Ｅのそれぞれに対応する５つの線グラフである。ＥＧＦＲｔ選別Ｔ細胞（ＲＥＭ刺激後１１～１５日内）それぞれの細胞株は、示されるＥ：Ｔ比でターゲットとして、５１Ｃｒラベル化ＮＳ０、Ｕ２５１Ｔ、ＣＤ１９ｔ発現ＮＳ０、ＣＭＶｐｐ６５発現Ｕ２５１Ｔ、ＣＤ１９発現Ｄａｕｄｉ又はＳｕｐＢ１５、又はＯＫＴ３発現ＬＣＬ細胞と４時間インキュベートされた。クロム遊離は細胞傷害活性を決定するために測定された。
【図4D】図４Ｄは、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ＩＭＰＤＨ２ｄｍ＋細胞株ＥでのＭＰＡ抵抗を示すグラフである。ＩＭＰＤＨ２ｍｄを発現しないコントロールＴ細胞とＥＧＦＲｔ選別ＩＭＰＤＨ２ｄｍ発現細胞株Ｅ細胞は、１μＭのＭＰＡの存在下又は存在なしのいずれかで培養され、細胞数がモニタされた。
【図5】図５は、ＥＧＦＲｔ発現がインビボＴ細胞移植の追跡マーカーとして使用され得ることを示す。コントロールマウス又は１０７ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｃを受けたマウスから３６日目に取得された骨髄が、ＰｅｒＣＰ－共役抗ヒトＣＤ４５及びビオチン化セツキシマブ（「バイオエルブ（Ｂｉｏ－Ｅｒｂ）」）を用いて染色し、その後ＰＥ－共役ストレプトアビジンで染色された。４量体（Ｑｕａｄｒａｎｔｓ）が、同位体コントロール染色に基づき生成され、それぞれの４量体のポジティブ染色パーセントがそれぞれのヒストグラムに示される。
【図6】図６は、セツキシマブ（図ではエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｋ）（Ｒ）と符号付されている）介在ＡＤＣＣについてＥＧＦＲｔ発現ターゲットＴ細胞を示すグラフである。５１Ｃｒラベル化細胞株Ａ細胞は、エフェクタとしてヒトＰＢＭＣの添加に先立ちネガティブコントロールとして２０μｇ／ｍＬまでのセツキシマブ又はＣＤ２０特異的ｍＡｂリタキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）のいずれかとインキュベートされるか又はされなかった。
【図7】図７は、ＥＧＦＲｔにリンクされたＧＭＣＳＦＲアルファ鎖の、ヌクレオチド（センス鎖が配列番号ＮＯ：１、アンチセンス鎖が配列番号ＮＯ：２）及びアミノ酸（配列番号ＮＯ：３）配列を示す。ＧＭＳＣＳＦＲアルファ鎖シグナル配列は、表面提示するように構成され、ヌクレオチド１～６６でエンコードされる。ＥＧＦＲｔはヌクレオチド６７～１０７１でエンコードされる。
【図8】図８は、ＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（Ｃ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの、ヌクレオチド配列（センス鎖、配列番号ＮＯ：４、アンチセンス鎖、配列番号ＮＯ：５）及びアミノ酸配列（配列番号ＮＯ：６）を示す。ＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）はヌクレオチド１～２０４０でコードされ、Ｔ２Ａはヌクレオチド２０４１～２１１２でコードされ、ＧＭＣＳＦＲはヌクレオチド２１１３～２１７８でコードされ、ＥＧＦＲｔはヌクレオチド２１７９～３１８６でコードされる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の特定の実施態様が、具体的な例、配列及び図面に基づき記載される。種々の実施態様は本発明をこれらの実施態様に限定することを意図するものではない。むしろ本発明は、全ての変法・変更又はそれらの均等物をカバーすることを意図するものであり、これらは特許請求の範囲に定められる本発明の範囲に含まれる。当業者は、これらの記載されたのと類似又は均等な多くの方法及び材料が本発明を実施するために使用され得ることを認識するものである。
【0014】
エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｒ）は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブの登録商標であり、独立して、前記商標名製品処方、前記商標名製品の前記遺伝子医薬及び活性医薬成分を含む。
【0015】
用語「遺伝子改変］とは、内因性ヌクレオチド配列に付加、欠失、置換又は中断する全てのプロセスを意味し、限定されるものではないがウイルス介在遺伝子組換え、リポソーム介在遺伝子組換え、トラスフォーム、トランスフェクション及び形質導入、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイスル、アデノ関連ウイスル及びヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイスルに基づくベクターの使用などのウイスル介在遺伝子導入が挙げられる。
【0016】
用語「抗体」とは、ヒト、マウス、ヒト化、キメラ又はその他の種から誘導される、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマ、マルチマ、多重特異的抗体及び抗体断片が含まれる。用語「モノクローナル抗体」とは、特定の抗原サイトに対して向けられた実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を意味する。
【0017】
「バリアント」とは、天然の配列ポリペプチドからいくらか異なるアミノ酸配列を持つポリペプチドを意味する。通常は、アミノ酸バリアントは、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％配列相同性の同一性を保持するものである。アミノ酸配列バリアントは、前記参照アミノ酸配列内のいくつかの位置で、置換、欠失及び／又は付加を含むことができる。
【0018】
「パーセント同一性」とは、最大の配列同一性を達成するために前記配列を最善整列させた（必要ならばギャップを挿入して）後、同一であるアミノ酸配列の残部のパーセントとして定められる。前記整列のための方法及びコンピュータプログラムは本技術分野で知られている。かかるプログラムには、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＡｌｉｇｎ２が含まれる。
【0019】
用語「抗体依存性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」とは細胞介在反応であって、ナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージなどのＦｃレセプタを発現する非特異的細胞傷害細胞が、目標細胞上に結合された抗体を認識し、前記目標細胞の溶解を起こすものである。ＡＤＣＣ活性は、米国特許番号第５、８２１ 、３３７に記載される方法を用いて評価され得る。
【0020】
「エフェクタ細胞」とは、１以上の定常領域のレセプタを発現し、エフェクタ機能を実行する白血球である。
【0021】
用語、癌などの疾患、傷害を「処置」することは、前記疾患、傷害を軽減し緩和するために治療措置又は予防措置のいずれかを取ることを意味する。かかる処理には、症状の予防、緩和、範囲及び／又は鎮静の低減又は安定化を含む。
【0022】
用語「治療的有効量」とは、疾患、傷害を治療するための有効な化合物又は分子の量を意味する。
【0023】
用語「癌」とは、制御されていない細胞増殖を行なっている細胞を意味する。癌の例には、大腸癌及び頭頸部癌が含まれる。
【0024】
「サイトカイン」とは、細胞間介在物（メディエータ）として他の細胞に作用するために１つの細胞により放出されるタンパク質である。
【0025】
「非免疫性物」とは、免疫応答を開始、停止又はそれに影響されない物質であり、前記免疫応答に適応免疫応答及び／又は自然免疫応答が含まれる。
【0026】
用語「遺伝子」とは、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡの断片を意味し；これにはコード領域の前部と後部コード領域「リーダーとテーラー」を含み、同じく個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。いくつかの遺伝子は、イントロンを、全部又は一部欠失して伸展され得る。いくつかのリーダー配列は、前記核酸のポリペプチドへの翻訳を強化する。
【0027】
用語「単離」とは、前記材料がその当初の環境（例えば、その材料が天然由来であれば、自然環境）から除かれることを意味する。例えば、生動物内の天然由来のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されないが、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、前記天然系で共存する材料のいくつか又は全てから分離された単離される。かかるポリヌクレオチドはベクター及び／又はポリヌクレオチドの一部であり得る。又はポリペプチドは組成物の一部であり得る。またかかるベクターや組成物が天然環境の一部ではない場合にも単離され得る。
【0028】
用語「ベクター」とは、核酸を輸送し得る又は宿主細胞に維持できる全ての試薬であり得る。これには、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイリスベクター、又はアデノ関連ウイルスベクター）、プラスミド、ネイキド核酸、ポリペプチド又は他の分子と複合した核酸及び固体相粒子上に固定化された核酸などが含まれる。適切なＤＮＡが、種々の手順により前記ベクター内へ挿入され得る。一般的に、ＤＮＡ配列は、当該技術分野において知られた手順により適切な制限エンドヌクレアーゼサイトに挿入される。かかる手順及びその他の手順は、当該技術分野における技術の範囲内のものである。高等真核生物による本発明にポリペプチドをエンコードするＤＮＡの翻訳は、前記ベクター内へエンハンサ配列を挿入することで増加される。エンハンサはＤＮＡのシス（ｃｉｓ）作用要素であり、その転写を増加させるためのプロモーター上で作用する通常は約１０から３００ｂｐである。例としては、１００から２７０ｂｐの複製起源の後側でのＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ、前記複製起源の後側でのポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサが含まれる。
【0029】
「レセプタ」とは、分子に特異的に結合することができるポリペプチドを意味する。多くのレセプタは通常前記細胞表面上で作用することができる一方、いくつかのレセプタは、前記細胞内に位置される場合にリガンドと結合し、又は主に細胞間に存在しかつそこでリガンドに結合し得る。
【0030】
「抗体又はその機能的断片」とは、特定の抗原又はエピトープに特異的に結合するか又は免疫的に反応する免疫グロブリン分子を意味し、かつポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含む。用語「抗体」には、遺伝子工学的又はその他の方法で改変された免疫グロブリンの形であり、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、ヒト化抗体及びヘテロ共役抗体（例えば、バイスペシフィック抗体、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディなど）が含まれる。用語「機能的抗体断片」には、抗体の抗原結合断片を含み、これには例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒｌｇＧ、及びｓｃＦｖ断片が含まれる。用語ｓｃＦｖとは単鎖Ｆｖ抗体を意味し、これは、従来の２つの鎖抗体の前記重鎖及び前記軽鎖の変動ドメインが結合して１つの鎖を形成したものである。
【0031】
１つの実施態様において、遺伝子コード改変内因性細胞表面分子であって、免疫磁気選別と適合可能な非免疫性選択エピトープとして使用され得る遺伝子コード改変内因性細胞表面分子が提供される。かかる非免疫性選択エピトープは、細胞物の望ましくない免疫拒絶反応がなく、癌患者の免疫治療を実施することができる。内因性細胞表面分子は、知られた抗体又はその機能性断片により認識される細胞外エピトープを保持し、かつシグナル系ドメイン及び／又は前記知られた抗体により認識されない全ての細胞外ドメインを除去するように改変又はトランケートされ得る。シグナル系ドメイン及び／又は前記知られた抗体により認識されない全ての細胞外ドメインを欠く改変された内因性細胞表面分子は不活性にされる。
【0032】
前記改変された内因性細胞表面分子には、限定されるものではないが、全ての非免疫性細胞表面関連レセプタ、グリコプロテイン、細胞接着分子、抗原、インテグリン又はここで記載されるように改変される分化クラスタ（ＣＤ）が含まれる。かかる細胞表面分子の改変は、知られた抗体又はその機能的断片により認識されるエピトープを保持し；かつシグナル系ドメイン及び／又は知られた抗体により認識されない全ての細胞外ドメインを除去することで、達成される。前記シグナル系ドメイン及び／又は知られた抗体により認識されない全ての細胞外ドメインを除去することで、前記内因性細胞表面分子を、非免疫性及び／又は不活性にする。
【0033】
ここで記載される実施態様による改変され又はトランケートされる内因性細胞表面分子には、限定されるものではないが、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えばインテグリンανβ３、α４、αＩＩβ３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦレセプタスーパーファミリ（例えばＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＰＤＧＦレセプタ、インターフェロンレセプタ、葉酸レセプタ、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ－１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ－７２、ＩＬ－６レセプタ、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、又は分化クラスタ（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ－１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥレセプタ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、Ｄ３１９／ＳＬＡＭＦ７）が挙げられる。
【0034】
改変又はトランケートされた細胞表面分子を認識するために使用され得る対応する市販抗体には、限定されるものではないが、３Ｆ８、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アルツモマブペンテタート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アナツモマブマフェナトックス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリツマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アルシツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（＝トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ））、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベンラリズマブ（ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベシレソマブ（ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、カンツズマブメルタンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カプロマブペンチタイド（ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ＣＣ４９、セデリツマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルモロイキン（ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、シタツズマブボダトックス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、クレノリキシマブ（ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン（ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、ＣＮＴＯ－９５、コナツムマブ（ｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダセツズマブ（ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エドロコロマブ（ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エンリモマブペゴル（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エピツモマブシツキセタン（ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファノレソマブ（ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ９、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファレツズマブ（ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガビリモマブ（ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、グレムバツムマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴミリキシマブ（ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、イバリズマブ（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イブンツモマブチウキセタン（ｉｂｎｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン（ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ケルキシマブ（ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ（ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、リンツズマブ（ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、レキサツムマブ（ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキイシマブ（ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マパツムマブ（ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マスリモマブ（ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、ミラツズマブ（ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、ムロモマブ－ＣＤ３、ナプツモマブエスタフェナトックス（ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オデュリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトックス（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、 オテリキシズマブ（ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、プリリキシマブ（ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、 ＰＲＯ １４０、フツキシマブ（ｈｔｕｘｉｍａｂ）、レベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ラプリズマブ（ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サツモマブペンデタイド（ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、シプリズマブ（ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、タドシズマブ（ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タプリツモマブパプトックス（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チシリマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（＝トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ））、チガツズマブ（ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（＝アトリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ））、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、トコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、ベドリツマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベツツズマブ（ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ビシリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、ボロキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ジラリムマブ（ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾリモマブアリトックス（ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）が挙げられる。
【0035】
いくつかの実施態様では、改変内因性細胞表面分子は改変又はトランケートされたチロシンキナーゼレセプタ遺伝子によりエンコードされる。ここで記載される実施態様による改変又はトランケートされ得るチロシンキナーゼレセプタの例には、限定されるものではないが、内皮増殖因子レセプタファミリ（ＥＧＲＦ／ＥｂＢ１／ＨＥＲ１；ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３；ＥｒＢＢ４／ＨＥＲ４）、ヘパトサイト増殖因子レセプタ（ＨＧＦＲ／ｃ－ＭＥＴ）及びインシュリン様増殖因子レセプタ－１（ＩＧＦ－１Ｒ）が挙げられる。いくつかの実施態様によると、改変チロシンキナーゼレセプタは、知られる抗体又はその機能的断片により認識される細胞外エピトープを保持し、かつ少なくともチロシンキナーゼドメインを欠失する。チロシンキナーゼドメインを欠失する改変チロシンキナーゼレセプタはレセプタを不活性なものとする。
【0036】
改変チロシンキナーゼレセプタを認識するために使用される市販の抗体には、限定されるものではないが、ＡＭＧ－１０２、ＡＭＧ－４７９、ＢＩＩＢ０２２ＯＡ－５Ｄ５、ＣＰ－７５１、８７１、ＩＭＣ－Ａ１２、Ｒ１５０７、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、シクツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、フィジツムマブ（ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ネシツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ニモツズマブ（ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）が含まれる。
【0037】
１つの実施態様では、前記改変内因性細胞表面分子はトランケートされたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）であって、膜遠位ＥＧＦ－結合ドメイン及び細胞傷害シグナル系をトランケートされているが、知られた抗体又はその機能断片（例えばセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、マツズマブ（ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、ネクツムマブ（ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）又はパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ））により認識される細胞外膜遠位エピトープを保持する。他の実施態様では、前記ｔＥＧＦＲはドメインＩ、ドメインＩＩ、膜近傍ドメイン及びチロシンキナーゼドメインを、改変しないＥＧＦＲに比較して欠失している（図１）。
【0038】
改変内因性細胞表面分子は、遺伝子的に改変された免疫細胞集団のための細胞選別マーカー又は濃縮マーカーとして使用され得る。前記改変内因性細胞表面分子は、遺伝子コード腫瘍目標キメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）と結合し得る。これらの遺伝子は、ベクターに挿入されて遺伝子的に改変されるＴ細胞の集団を遺伝子組換えする。遺伝子組換え後、遺伝子組換えされたＣＡＲと改変内因性細胞表面分子を発現する細胞は、全ての適切な精製方法で濃縮される。例えば、前記遺伝子組換え細胞により発現された改変内因性細胞表面分子を認識する市販抗体を用いて、抗ビオチンミクロビーズを用いる免疫磁気精製又は蛍光励起細胞選別するために蛍光色素共役抗ビオチンが挙げられる。
【0039】
他の実施態様では、遺伝子コードトランケートされたヒト内皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）であって膜遠位ＥＧＦ結合ドメインと細胞傷害シグナル系を欠失するが、ＦＤＡ認可抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）セツキシマブ又は他の抗ＥＧＲＦ抗体により認識される細胞外膜近位エピトープを保持する。ＥＧＦＲｔは、腫瘍関連抗原に特異的にキメラ抗原レセプタと結合され得る。前記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、 ＣＤ２０、又はＣＤ２２又は他の腫瘍関連抗原、好ましくはＣＤ１９ （ＣＤ１９ＣＡＲ）であり得る。腫瘍関連抗原には、Ｃ－末端２Ａ開裂リンカとＥＧＦＲｔのコード配列が続く。ビオチン化セツキシマブは、腫瘍関連抗原／ＣＡＲ発現遺伝子産物の免疫的精製の目的のために市販の抗ビオチンミクロビーズと共役されて使用され得る。この例では、腫瘍関連抗原はＣＤ１９であり、産物はＣＤ１９Ｒ発現遺伝子組換え産物である。又は、ビオチン化セツキシマブは、蛍光励起細胞ソートのために蛍光色素共役抗ビオチンと共役されて使用され得る。
【0040】
他の実施態様では、改変内因性細胞表面分子は、インビボＴ細胞移植のためのマーカーとして使用され得る。例えば、前記改変内因性細胞表面分子がＥＧＦＲｔである場合、ＥＧＦＲｔはＴ細胞であって、Ｔ細胞の細胞機能に影響せずインビボで移植されるＴ細胞の取り込みの追跡（トラック）、又は前記Ｔ細胞が目標とされる、例えば臓器移植の場合の骨髄細胞などの細胞の取り込みの追跡に使用され得る。ｓｒ３９ＴＫなどのプローブ又はレセプタ遺伝子と共役されるセツキシマブの使用は、ＰＥＴ画像化技術を介して患者へのＥＧＦＲｔ発現細胞の追跡能力を改良するために使用され得る。
【0041】
別の実施態様では、改変内因性細胞表面分子は細胞自殺を誘起するために使用され得る。例えば、ＥＧＦＲｔは、セツキマブ介在補助物及び／又は抗体依存細胞介在細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路を介して自殺遺伝子として使用され得る。ゼツキシマブが治療用ＦＤＡ認可抗体であるという事実はさらに、前記医療設定でのＥＧＦＲｔの自殺遺伝子の可能性をもたらす。
【0042】
他の実施態様では、トランケートされた内皮増殖因子レセプタ（ＥＧＦＲｔ）選別エピトープ又は他の改変細胞表面分子が、他の配列に付けられる。１つの例示的配列はＧＭＣＳＦＲアルファ鎖シグナル配列であり、これは表面発現するようにＥＧＲＦｔに付されている。ＧＭＣＳＦＲはヌクレオチド１－６６によりエンコードされ、ＥＧＦＲｔは配列番号ＮＯ：１のヌクレオチド６７－１０７１でエンコードされている（図７参照のこと）。図７にはまた、ＥＧＦＲｔにリンクされたＧＭＣＳＦＲアルファ鎖シグナル配列のアンチセンス鎖（配列番号ＮＯ：２）及びアミノ酸（配列番号ＮＯ：３）が示される。他のかかる配列は、抗ＣＤ１９共刺激キメラ抗原レセプタ（ＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡ配列及び開裂性Ｔ２Ａリンカである。細胞質ＣＤ３ζドメインに融合された細胞質共刺激（ＣＤ２８）ドメインを介してシグナルを送るＣＤ１９特異的キメラ抗原レセプタを発現するように改変された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、優れた抗腫瘍性を示し、ＣＤ２８介在生存及びサイトカイン生産増加に寄与する。この構成物はさらにセツキシマブ－ビオチン／抗ビオチンミクロビーズを用いてＣＡＲ発現遺伝子組み換え産物の免疫的磁気精製のために、Ｃ末端２Ａ開裂性リンカが導入され、さらに前記リンカの後にトランケートされたヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）のコード配列を導入するように改変され得る。図８はＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの配列が示される。またそれぞれ配列番号ＮＯ：４（ヌクレオチドセンス鎖）、５（ヌクレオチドアンチセンス鎖）及び６（タンパク質）である。プライマリヒトＴ細胞をこのコドン最適化ｃＤＮＡでレンチウイルス遺伝子組換え物は、前記ＣＡＲとＥＧＦＲｔの協働発現をするようにされる（図９）。
【0043】
遺伝子組換え手順に本質的である遺伝子組み換え発現産物間の変動を続く選択を行うことなく除去するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて免疫的磁気選別を適用可能な非免疫的選択エピトープＥＧＦＲｔが開発された。例えば、ＥＧＦＲｔはトランケートされたヒト内皮増殖因子レセプタであって膜遠位ＥＧＦ結合ドメインとシグナル系を欠失するが、市販抗ＥＧＦＲｍＡｂセツキシマブで認識される細胞外膜近位エピトープは保持するものである（図１参照）。ビオチン化セツキシマブは、抗ビオチンミクロビーズ（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と組み合わせて免疫的磁気選別に適用される。レンチウイルスを用いてＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ（ＣＯ）－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔで遺伝子組換えされたヒトＯＫＴ３芽（ｂｌａｓｔｓ）が、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＡｕｔｏＭＡＣＳ装置を用いて免疫的磁気選別の対象とされ、ＥＧＦＲｔ＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞のくり返しにより、２２％（選別前）から９９％（選別後）まで、細胞調製に対して観察できるほどの傷害を示さずに濃縮された（図３）。免疫的磁気選別（ソート）に代えて、又は加えてＥＧＦＲｔは蛍光系細胞選別技術を用いて選別されることができる。
【0044】
ＥＧＦ結合ドメイン及び細胞間シグナルドメインが欠失していることは、Ｔ細胞により発現される場合不活性となる。重要なことは、前記ＥＧＦＲｔ選別Ｔ細胞はその望ましいエフェクタ細胞型－前記ＥＧＦＲｔと共に協働的に発現されるキメラ抗原レセプタにより介在される腫瘍細胞傷害活性を含む－を維持し、かつ確立された拡張プロトコルに従う、ということである。
【0045】
すなわち、このＥＧＦＲｔは、これまで報告されてきたその他の選別マーカーと比較して、免疫治療のための種々の利点を有する。特に、トランケートされたＣＤ４及びＣD１９とは異なり、これはリンパ球のサブ集団により外因的に発現されたものではないということである。さらに、トランケートされたＣＤ３４及び低親和性の神経細胞増殖因子レセプタと比較して、免疫細胞産物に悪い影響を与え得るいかなる活性も有しないことである。最後に、これはこれ自体で、知られた、好ましくは市販の医薬品グレードの抗体医薬、例えばセツキシマブにより結合／認識され得るものである。また、これらは、ＥＧＦＲｔをすべてのトランスフェクション／形質転換系のための優れた１つの選択肢であり、適合可能な免疫療法のための細胞産物の生成に適用され得る。従って、ＥＦＧＲｔは、レンチウイルスにより遺伝子組換えされた免疫治療に関連するＴ細胞のための選択マーカーとして好ましく使用され得る。
【0046】
また、新規な治療用細胞産物を同定するための方法が適用され、この方法は次の基準を有する：改変された内因性細胞表面分子、リガンド又はレセプタであって、改変されても、治療用に使用されるべき対象体中で外因性的に発現されず、前記産物又は産物が投与される対象体の機能を阻害する免疫活性又はその他の機能的活性を持たず、かつ知られた抗体により認識される、ものである。
【0047】
これまで本発明は実施態様及び例を示すことで記載されてきたが、当業者は、記載され例示された本発明の変更もまた、本明細書に開示されるように本発明の本質及び範囲から離れるものではないことを、理解するであろう。以下の例は本発明を理解するためのものであり、いかなるようにも本発明の範囲を限定するように解釈されることを意図するものではない。例は従来技術の方法の詳細な説明は含まない。そのような方法は当業者にはよく知られており多くの文献に記載されている。
【0048】
例１： ＥＧＦＲｔの生成及びＥＧＦＲｔ発現Ｔ細胞の免疫的磁気選別
材料及び方法
抗体及びフローサイトメトリ
ＦＩＴＣ－、ＰＥ－及びＰｅｒＣＰ－共役アイソタイプコントロール、ＰｅｒＣＰ－共役抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ４、ＰＥ－共役抗ＩＦＮγ、ＰｅｒＣＰ－共役抗ＣＤ４５及びＰＥ－共役ストレプトアビジンは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手した。ビオチン化抗Ｆｃは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。ＰＥ－共役抗ビオチンはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）から購入した。ビオチン化ＥＧＦはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｒ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＰＥ－共役抗ＥＧＦＲはＡｂｅａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。全ての抗体及びビオチンＥＧＦは製造者の指示書に沿って使用した。フローサイトメトリデータ取得は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、分析の領域での細胞パーセントは、 ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖ３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いて計算した。
材料及び方法
抗体及びフローサイトメトリ
ＦＩＴＣ－、ＰＥ－及びＰｅｒＣＰ－共役アイソタイプコントロール、ＰｅｒＣＰ－共役抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ共役抗ＣＤ４、ＰＥ－共役抗ＩＦＮγ、ＰｅｒＣＰ－共役抗ＣＤ４５及びＰＥ－共役ストレプトアビジンは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手した。ビオチン化抗Ｆｃは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入した。ＰＥ－共役抗ビオチンはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）から購入した。ビオチン化ＥＧＦはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｒ）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手した。ＰＥ－共役抗ＥＧＦＲはＡｂｅａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入した。全ての抗体及びビオチンＥＧＦは製造者の指示書に沿って使用した。フローサイトメトリデータ取得は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、分析の領域での細胞パーセントは、 ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖ３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）を用いて計算した。
【0049】
ビオチン化セツキシマブの生成のために、２００ｍｇのセツキシマブ（エルブタックス（Ｒ））を、ＭｉｄＧｅｅフープカートリッジ（ＵＦＰ－３０－Ｅ－Ｈ４２ＬＡ）を用いてＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ、ｐＨ７．５±０．１）５２７ｍｌを用いてバッファ交換した（１９時間）。前記材料２ｍｇ／Ｌを、スルホ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンを用いて２０：１で改変した。反応は１時間室温及びその後過剰ビオチンを限外濾過で除去する反応であった。前記ビオチン化セツキシマブの２００ｍｇをその後、ＭｉｄＧｅｅ フープカートリッジ（ＵＦＰ－３０－Ｅ－Ｈ４２ＬＡ）を用いてＰＢＳ（Ｄ－ＰＢＳ、ｐＨ７．５±０．１）５３３ｍｌを用いてバッファ交換した（１８時間）。グリセロールを最終濃度２０％となるように添加し、得られた材料バイアル中で凍結させた。
【0050】
細胞株
特に記載されない限り、全ての細胞は、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５ｍＭのＮ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１０％加熱－不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、 Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を加えたＲＰＭＩ１６４０ （Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）中（以下培養培地（ＣＭ）とする）で保存された。
特に記載されない限り、全ての細胞は、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２５ｍＭのＮ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００ Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び１０％加熱－不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ、 Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を加えたＲＰＭＩ１６４０ （Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）中（以下培養培地（ＣＭ）とする）で保存された。
【0051】
Ｔ細胞を調製するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ－ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌに基づき参加の同意を得た健康なドナーから得られたヘパリン化末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて密度勾配遠心分離により分離された。細胞株Ａの調製のため、洗浄されたＰＢＭＣを２５Ｕ／ｍＬのＩＬ－２及び１：１（細胞：ビーズ）比のダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（Ｒ）ヒトＴ細胞増殖ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で刺激した。他の細胞株の調製のために、洗浄されたＰＢＭＣは最初に、製造者の指示書に沿って抗ＣＤ４５ＲＡビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてａｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）で除去され、その後いくつかの場合ではまた抗ＰＥ－ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共にＰＥ－共役抗ＣＤ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて除去された。得られた細胞はその後ビオチン化ＤＲＥＧ５６（抗ＣＤ６１Ｌ）と抗ビオチンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてａｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）ポジティブ選別が実施されて精製ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＴＣＭを生成する。ＣＤ８＋細胞はさらに、いくつかの場合には製造者の指示書に沿ってＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて選別される。ＣＭＶ特異的細胞は、非特定刺激を避けるためにＦＣＳの代わりに１０％ヒト血清を用いて、５Ｕ／ｍｌ ｌＬ－２（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）及び自己照射ウイルス抗原提示細胞を４：１（応答：刺激）比で週に一度で３週間Ｔ細胞を刺激した。ウイルス抗原提示細胞は、ＣＭＶｐｐ６５抗原を発現するように遺伝子組換えされたＰＢＭＣから誘導された。
【0052】
ＰＢＭＣを、Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を用いて核感染溶液中に再分散させ、５ｘ１０７細胞を、１０μｇのＨｙｇｒｏＲ－ｐｐ６５＿ｐＥＫ（又はトランスフェクションコントロールとして、Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．から入手されたｐｍａｘＧＦＰ）を最終容積１００μＬ／キュベットとして０．２ｃｍキュベット内に入れ、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｉ（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．）を用いてプログラムＵ－１４によりエレクトロポレートし、その後細胞をγ照射（１２００ｃＧｙ）する前に回復させるために３７℃で６時間保持した。
【0053】
ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０２１０４）及びＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ－Ｔ２Ａ－ＩＭＰＤＨ２ｄｍ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０２１１１）レンチウイルス構成物は、（ａ）キメラ抗原レセプタ（ＣＡＲ）であって、ＣＤ１９特異的ＦｍＣ６３ｍＡｂ、ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、供刺激分子ＣＤ２８の膜間及び細胞質シグナルドメイン、及びＣＤ３ζ鎖［１０］のＶＨ及びＶＬ遺伝子断片；（ｂ）自己開裂性Ｔ２Ａ配列［１１］；（ｃ）トランケートされたＥＧＦＲ配列（図１参照）；及び（ｄ）示されるようにＭＰＡ抵抗性を与えるＩＭＰＤＨ２二重変異を含む。レンチウイルス形質変換は、Ｔ細胞で行われ、３０ｎｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３８（ＯＫＴ３； Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）（即ち細胞株Ａ）、又はヒトＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓ（１：１０比（即ち細胞株Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）と２５ＵのＩＬ２／ｍｌのいずれかで刺激された。細胞は、レンチウイルスを３から５μｇ／ｍｌポリイブレンのＭＯＩで添加する前に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｒ）（５０ｕｇ／ｍｌ）コーティングプレート上で３７℃で２時間培養された。４時間後、暖かい培地を加えて容積を３倍とし、前記細胞を洗浄し、４８時間後新鮮な培地へ移された。ＥＧＦＲｔ発現細胞のＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）ソートが、ビオチン化セツキジマブ及び抗ビオチンミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて製造者の指示書に沿って実施された。迅速増殖媒体（ＲＥＭ）中のＴ細胞の増殖は１０６Ｔ細胞を３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ε（ＯＫＴ３； Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）、５ｘ１０７γ照射ＰＢＭＣ（３５００ｃＧｙ）、及び１０７γ照射ＬＣＬ（８０００ｃＧｙ）でインキュベートすることを含み；５０Ｕ／ｍｌ ｒｈｌＬ－２及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｈｌＬ－１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を第１日から始めて４８時間ごとに添加する。Ｔ細胞はこの方法で１４日ごとに再刺激する。
【0054】
ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）は既に記載されたようにＰＢＭＣから調製された［１３］。ＬＣＬ－ＯＫＴ３細胞は、ＬＣＬを核感染溶液中で、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ Ｔを用いてＯＫＴ３－２Ａ－Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ＿ｐＥＫ（ｐＪ０１６０９）プラスミドを５μｇ／１０７で細胞を添加して再懸濁させ、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｉを用いてプログラムＴ－２０によりエレクトロポレートすることで調製した。得られたＬＣＬ－ＯＫＴ３－２Ａ－ハイグロマイシン＿ｐＥＫ（ｃＪ０３９８７）は、０．４ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン含有ＣＭ中で成長させた。マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｄｕａｒｔｅ、 ＣＡのＡｎｄｒｅｗ Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋから譲渡）を核感染キットＴ（Ａｍａｘａ Ｉｎｃ．、 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を用いて核感染溶液中で再分散させ、ＣＤ１９ｔ－ＤＨＦＲｄｍ－２Ａ－ＩＬ１２＿ｐＥＫ（ｐＪ０１６０７）又はＧＦＰ－ＩＭＰＤＨ２ｄｍ－２Ａ－ＩＬ１５＿ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｐＪ０１０４３）プラスミドを５μｇ／５ｘ１０６細胞で添加し、及び細胞をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｉを用いてプログラムＴ－２７を用いてエレクトロポレートした。得られたＮＳ０－ＣＤ１９ｔ－ＤＨＦＲｄｍ－２Ａ－ＩＬ１２＿ｐＥＫ（ｃＪ０３９３５）及びＮＳ０－ＧＦＰ：ＩＭＰＤＨ２－ＩＬ１５（ＩＬ２ｓｓ）＿ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｃＪ０２０９６）は、１０％加熱不活性化ＦＳＣ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ及び２ｍＭＬ－グルタミンで０．０５μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）又は６μＭミコフェノール酸（ＭＰＡ）のいずれかの存在下で補助されたＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、 Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）中で増殖させた。Ｕ２５１の腫瘍細胞株はＵ２５１Ｔと参照され、 Ｗａｌｄｅｍａｒ Ｄｅｂｉｎｓｋｉ博士（Ｗａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＮＣ）から親切にも譲渡された。Ｕ２５１Ｔ－ｐｐ６５は、Ｕ２５１Ｔをｐｐ６５－２Ａ－ｅＧＦＰ－ｆｆｌｕｃ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０１９２８）を用いてＭＯＩが１でレンチウイルスを用いて調製された。得られたＵ２５１Ｔ－ｐｐ６５－２Ａ－ｅＧＦＰ－ｆｆｌｕｎ＿ｅｐＨＩＶ７はその後ＧＦＰ＋集団についてＦＡＣＳソートされた （ｃＪ０５０５８）。ダウジ（Ｄａｕｄｉ）リンパ球細胞株はＡＴＣＣから購入し、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％の加熱不活性化ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含む媒体中で増殖させた。ＳｕｐＢ１５急性リンパ芽球性白血病細胞及びＡ４３１表皮類似癌細胞はＡＴＣＣから購入した。
【0055】
タンパク質分析
細胞（１０７まで）を、ホスファターゼインヒビタカクテルＩＩ８０μＬを含む１％トリトン－Ｘ溶解バッファ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（インヒビタ対バッファ容積比１：２０）で溶解させた。５０μｇのタンパク質をそれぞれのレーンに載せ、ウェスタンブロットを、プローブとしてホスフォ－ＥＧＦレセプタ抗体サンプルキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を用いて行い、続いて山羊抗ウサギ抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）共役ＩＲＤｙｅ（ＴＭ）６８０ＣＷ又は８００ＣＷと、同様に抗ベータアクチン抗体 （ＬＩ－ＣＯＲ）共役ＩＲＤｙｅ（ＴＭ） ８００を、製造者の指示書に沿って用いて行った。ブロットはＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ）で画像化させた。
細胞（１０７まで）を、ホスファターゼインヒビタカクテルＩＩ８０μＬを含む１％トリトン－Ｘ溶解バッファ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（インヒビタ対バッファ容積比１：２０）で溶解させた。５０μｇのタンパク質をそれぞれのレーンに載せ、ウェスタンブロットを、プローブとしてホスフォ－ＥＧＦレセプタ抗体サンプルキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を用いて行い、続いて山羊抗ウサギ抗体（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）共役ＩＲＤｙｅ（ＴＭ）６８０ＣＷ又は８００ＣＷと、同様に抗ベータアクチン抗体 （ＬＩ－ＣＯＲ）共役ＩＲＤｙｅ（ＴＭ） ８００を、製造者の指示書に沿って用いて行った。ブロットはＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ－ＣＯＲ）で画像化させた。
【0056】
クロム遊離アッセイ
Ｔ細胞の細胞溶解活性が、４時間クロム遊離アッセイ（ＣＲＡ）で決定された。ここでエフェクタ細胞は５ｘ１０３のＣｒ５１ラベル化ターゲットＴ細胞（Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４；５ｍＣｉ／ｍｌ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むＶ底９６ウェルマイクロプレートの３重ウェルに播種され、５％ＣＯ２中３７℃で種々のＥ：Ｔ比で２００μＬのＣＭ中で４時間インキュベートされた。プレートを遠心分離し、上澄みの１００μｌをそれぞれのウェルから除いてγカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ ＩＩ、 Ｄｏｗｎｅｒ’ｓ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて遊離クロムを評価した。 特定溶解パーセントは次のように計算された：１００ｘ（実験的遊離－自発的遊離）／（最大遊離－自発的遊離）。最大遊離は、２％ＳＤＳで溶解されたラベル化標的を含むウェルのＣｒ含有量の測定から決定された。
Ｔ細胞の細胞溶解活性が、４時間クロム遊離アッセイ（ＣＲＡ）で決定された。ここでエフェクタ細胞は５ｘ１０３のＣｒ５１ラベル化ターゲットＴ細胞（Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４；５ｍＣｉ／ｍｌ）；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含むＶ底９６ウェルマイクロプレートの３重ウェルに播種され、５％ＣＯ２中３７℃で種々のＥ：Ｔ比で２００μＬのＣＭ中で４時間インキュベートされた。プレートを遠心分離し、上澄みの１００μｌをそれぞれのウェルから除いてγカウンタ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａ ＩＩ、 Ｄｏｗｎｅｒ’ｓ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて遊離クロムを評価した。 特定溶解パーセントは次のように計算された：１００ｘ（実験的遊離－自発的遊離）／（最大遊離－自発的遊離）。最大遊離は、２％ＳＤＳで溶解されたラベル化標的を含むウェルのＣｒ含有量の測定から決定された。
【0057】
抗体依存性細胞傷害は、５ｘ１０３の５１Ｃｒラベル化ターゲットＴ細胞を用いて上のようにクロム遊離により決定された。ここで５１Ｃｒラベル化ターゲットＴ細胞はセツキシマブ又はリツキシマブ（ＣＤ特異的ｍＡｂ）のいずれかの１０μｇ／ｍＬまで９０分間前インキュベートし、洗浄しその後５ｘ１０５の新たに単離されたＰＢＭＣでコインキュベートした。
【0058】
インビボでのＴ細胞移植及びセツキシマブ介在自殺
Ｔ細胞移植のために、６から１０週齢ＮＯＤ／ＳｃｉｄＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスに、１０７Ｔ細胞（細胞株Ｃ）が０日に静脈内に注射された。２ｘ１０７照射（８０００ラド）ＮＳＯ－ＧＦＰ：ＩＭＰＤＨ２－ＩＬ１５（ＩＬ２ｓｓ）＿ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｃＪ０２０９６）細胞が、インビボでヒトＩＬ－１５の系統的供給を与えるために０日で週３回腹腔内投与される。骨髄を安楽死させた動物から採取しフローサイトメトリで分析した。抗体依存性細胞傷害アッセイは、ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞に対するセツキシマブの活性を決定することで実施される。
Ｔ細胞移植のために、６から１０週齢ＮＯＤ／ＳｃｉｄＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスに、１０７Ｔ細胞（細胞株Ｃ）が０日に静脈内に注射された。２ｘ１０７照射（８０００ラド）ＮＳＯ－ＧＦＰ：ＩＭＰＤＨ２－ＩＬ１５（ＩＬ２ｓｓ）＿ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｃＪ０２０９６）細胞が、インビボでヒトＩＬ－１５の系統的供給を与えるために０日で週３回腹腔内投与される。骨髄を安楽死させた動物から採取しフローサイトメトリで分析した。抗体依存性細胞傷害アッセイは、ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞に対するセツキシマブの活性を決定することで実施される。
【0059】
結果
ＥＧＦＲｔ発現Ｔ細胞の免疫的磁気選別
トランケートヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）は、全長ＥＧＦＲの膜間ドメインと細胞外ドメインＩＩＩ及びＩＶのみを含み、免疫的磁気選別と適合して非免疫的磁気選択エピトープとして調製された。図１の分子モデルに示されるように、ＥＧＦＲｔはセツキシマブにより結合され得る機能を保持するが、細胞間ドメインの欠失により全てのシグナル系を欠いている。さらに、これはＥＧＦ結合に必要なＮ末端ドメインを欠いている。
ＥＧＦＲｔ発現Ｔ細胞の免疫的磁気選別
トランケートヒトＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）は、全長ＥＧＦＲの膜間ドメインと細胞外ドメインＩＩＩ及びＩＶのみを含み、免疫的磁気選別と適合して非免疫的磁気選択エピトープとして調製された。図１の分子モデルに示されるように、ＥＧＦＲｔはセツキシマブにより結合され得る機能を保持するが、細胞間ドメインの欠失により全てのシグナル系を欠いている。さらに、これはＥＧＦ結合に必要なＮ末端ドメインを欠いている。
【0060】
ＥＧＦＲｔ発現細胞のための免疫的磁気選別のために、ビオチン化セツキシマブが調製され（図２Ａ、Ｂ）、市販抗ビオチンミクロビーズとＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）分離装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とを利用することができる（図２Ｃ）。種々のＴ細胞株をＥＧＦＲｔ含有構成物（ここでＥＧＦＲｔ遺伝子は自己開裂性Ｔ２Ａ配列を持つ１端又は両端で対象となる他の遺伝子から分離された）でレンチウイルスによる遺伝子組換え物は、一定して前記細胞の４０％未満のＥＧＦＲｔ分子の表面検出を与える結果となった。表面検出はまた、ＥＧＦＲｔ－ｓｒ３９ＴＫ融合でも達成され得る（図２Ｄ）。免疫的磁気選別はＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞集団の９０％を超える純度で回収することを可能とした。この遺伝子組換え及び選別手順を行ったＴ細胞集団は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ刺激Ｔ細胞ブラスト（細胞株Ａ）、中心メモリ（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ）誘導Ｔ細胞（細胞株Ｂ、Ｃ及びＥ）であり、これらはある場合にはまたＣＭＶ特異性について前選別されている（外因性ＴＣＲ、細胞株Ｂ）又はＣＤ８発現について前選別されており（細胞株Ｃ）、同様にエフェクタメモリ（ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＴＥＭ）誘導Ｔ細胞（細胞株Ｄ）である。これらのデータは、ＥＧＦＲｔが種々のＴ細胞形質導入物の選別マーカーとして使用され得ることを示し、これは最初の形質導入効果がたかだか２％であってもそうである。
【0061】
選別Ｔ細胞のＥＧＦＲｔの不活性
ＥＧＦＲｔが不活性であることを確認するために、ＥＧＦＲリン酸化についてのウェスタン免疫ブロット分析を、ＥＧＦＲｒ選別Ｔ細胞でＥＧＦ又はセツキシマブで培養後に行った。予想の通り、セツキシマブはバックグラウンド以上のＥＧＦＲリン酸化を誘導せず、ＥＧＦＲ＋細胞株Ａ４３１でさえもそうであった（図３Ａ）。さらに、Ａ４３１細胞で見られたこととは対照的に、ＥＧＦとコインキュベート後の細胞株Ａの溶解物でもリン酸化は見られなかった。実際、ビオチン化ＥＧＦを用いてフローサイトメトリ分析では、ＥＧＦはＥＧＦＲｔ選別Ｔ細胞には結合せず（図３Ｂ）、これはそのＮ、末端をトランケートされていることによると予想される。これらのＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞はまた、セツキシマブとは異なる他の抗ＥＧＦＲ抗体でも認識されなかった。
ＥＧＦＲｔが不活性であることを確認するために、ＥＧＦＲリン酸化についてのウェスタン免疫ブロット分析を、ＥＧＦＲｒ選別Ｔ細胞でＥＧＦ又はセツキシマブで培養後に行った。予想の通り、セツキシマブはバックグラウンド以上のＥＧＦＲリン酸化を誘導せず、ＥＧＦＲ＋細胞株Ａ４３１でさえもそうであった（図３Ａ）。さらに、Ａ４３１細胞で見られたこととは対照的に、ＥＧＦとコインキュベート後の細胞株Ａの溶解物でもリン酸化は見られなかった。実際、ビオチン化ＥＧＦを用いてフローサイトメトリ分析では、ＥＧＦはＥＧＦＲｔ選別Ｔ細胞には結合せず（図３Ｂ）、これはそのＮ、末端をトランケートされていることによると予想される。これらのＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞はまた、セツキシマブとは異なる他の抗ＥＧＦＲ抗体でも認識されなかった。
【0062】
増殖ＥＧＦＲｔＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞でのエフェクタ細胞型の維持
ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）分離の直後、選別されたＴ細胞は、ＯＫＴ３、照射ＰＢＭＣフィーダー及びＬＣＬ、ＩＬ－２及びＯＬ－５でのＲＥＭ刺激の後１２日以内に３０倍以上に増殖した（図４Ａ）。得られた増殖ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析はさらに、それらがＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ８、ＴＣＲ、ＣＤ３、パーホリン、グランザイムなどのＴ細胞マーカーを発現していることが確認された（図４Ｂ）。さらに、これらのＥＧＦＲｔ選別細胞株のＣＤ１９ＣＡＲによる細胞活性は、ＣＤ１９発現腫瘍ターゲットを用いて遊離クロムアッセにより明らかである（図４Ｃ）。細胞株Ｅとその非選別又は「親の」細胞株のＣＤ１９特異的反応性の直接比較は、ＥＧＦＲｔ選別において強化されたＣＤ１９ＣＡＲ介在細胞傷害性があることを示す。さらに、ＣＭＶ特的ＴＣＭ－誘導ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｂ細胞はまた、ターゲット発現ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原に対するこれらの外因性Ｔ細胞レセプタを介して細胞傷害性を示す。
ＡｕｔｏＭＡＣＳ（ＴＭ）分離の直後、選別されたＴ細胞は、ＯＫＴ３、照射ＰＢＭＣフィーダー及びＬＣＬ、ＩＬ－２及びＯＬ－５でのＲＥＭ刺激の後１２日以内に３０倍以上に増殖した（図４Ａ）。得られた増殖ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のフローサイトメトリ分析はさらに、それらがＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ８、ＴＣＲ、ＣＤ３、パーホリン、グランザイムなどのＴ細胞マーカーを発現していることが確認された（図４Ｂ）。さらに、これらのＥＧＦＲｔ選別細胞株のＣＤ１９ＣＡＲによる細胞活性は、ＣＤ１９発現腫瘍ターゲットを用いて遊離クロムアッセにより明らかである（図４Ｃ）。細胞株Ｅとその非選別又は「親の」細胞株のＣＤ１９特異的反応性の直接比較は、ＥＧＦＲｔ選別において強化されたＣＤ１９ＣＡＲ介在細胞傷害性があることを示す。さらに、ＣＭＶ特的ＴＣＭ－誘導ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｂ細胞はまた、ターゲット発現ＣＭＶ－ｐｐ６５抗原に対するこれらの外因性Ｔ細胞レセプタを介して細胞傷害性を示す。
【0063】
また、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ＩＭＰＤＨ２ｄｍ＋細胞株Ｅについて、イノシンモノホスフェートデヒドロゲネース２二重変異体（ＩＭＰＤＨ２ｄｍ）がＩＭＰＤＨ２インヒビターミコフェノール酸（ＭＰＡ；臓器移植で拒絶反応を抑制するために使用される共通の免疫抑制剤）への抵抗性を与える可能性が試験された。１μＭＭＰＡ中での培養で、細胞株Ｅ、細胞の生存及び／又は増殖は抑制されなかった（図４Ｄ）。これは、ＩＭＰＤＨ２ｄｍ伝子発現を欠くコントロールＴを細胞株で見られる抑制効果と対照的である。これらのデータはさらに、ＥＧＦＲｔ介在選別が、Ｔ細胞を遺伝子組換えするために使用されるレンチウイルス内に存在する他の遺伝子の選別に対応するという証拠を示す。
【0064】
インビボでＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のトラッキング（追跡）
インビボでの移植Ｔ細胞を検出する可能性を試験するために、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｃで移植させたマウスから集めた骨髄細胞が、ビオチン化セツキシマブを用いてフローサイトメトリで分析された（図５）。Ｔ細胞を受けていないコントロールマウスは、マウスＥＧＦＲに対してある程度のセツキシマブの交差反応があることを示した。従って、移植細胞株Ｃ細胞の検出を可能とするためには、ヒトＣＤ４５及びＥＧＦＲｔの両方の二重染色が必要であることが決定された。細胞はまた、免疫組織化学を用いて、生検材料をスクリーニングするための可能性を決定するために分析され得る。
インビボでの移植Ｔ細胞を検出する可能性を試験するために、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞株Ｃで移植させたマウスから集めた骨髄細胞が、ビオチン化セツキシマブを用いてフローサイトメトリで分析された（図５）。Ｔ細胞を受けていないコントロールマウスは、マウスＥＧＦＲに対してある程度のセツキシマブの交差反応があることを示した。従って、移植細胞株Ｃ細胞の検出を可能とするためには、ヒトＣＤ４５及びＥＧＦＲｔの両方の二重染色が必要であることが決定された。細胞はまた、免疫組織化学を用いて、生検材料をスクリーニングするための可能性を決定するために分析され得る。
【0065】
ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のセツキシマブ介在細胞傷害
セツキシマブはＥＧＦＲ発現細胞を、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して溶解することが知られていることから、ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞に対するセツキシマブの活性を決定するためにアッセイを行った（図６）。５１Ｃｒラベル化細胞株Ａ細胞をターゲットとし、新たに単離したヒトＰＢＭＣをエフェクタとして用いて、セツキシマブは、ＣＤ２０特異的ヒト化ｍＡｂリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）を用いた場合を超える有意にクロム遊離を介在することが見出された。
セツキシマブはＥＧＦＲ発現細胞を、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して溶解することが知られていることから、ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞に対するセツキシマブの活性を決定するためにアッセイを行った（図６）。５１Ｃｒラベル化細胞株Ａ細胞をターゲットとし、新たに単離したヒトＰＢＭＣをエフェクタとして用いて、セツキシマブは、ＣＤ２０特異的ヒト化ｍＡｂリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）を用いた場合を超える有意にクロム遊離を介在することが見出された。
【0066】
ＥＧＦＲｔ＋Ｔを細胞の治療的使用の例
高リスクの中間悪性度Ｂ細胞リンパ腫を持つ大人の対象体は、自己骨髄破壊的幹細胞移植の候補者であり、適合的に転移された自己ＴＣＭ－誘導ＣＤ１９Ｒ＋ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞移植物による移植後免疫治療を受け得る。
それぞれの患者から集めた白血球分離物が、ＴＣＭ選別され、医療グレードのＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で遺伝子組換えされ、その後選別され閉鎖系内でＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の増殖を行う。得られた細胞物は品質管理試験（殺菌及び腫瘍特異的細胞傷害性試験）を経て、凍結保存される。一方で、白血球除去輸血後に、研究参加者は、腫瘍低減化学療法及びＧ－ＣＳＦとの自動ＨＳＣ収集のための動員とともに標準のサルベージ化学的治療を開始する。ＥＧＦＲｔ選別、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞はまた、通常のＣＤ２０＋（ＣＤ１９＋）Ｂ細胞もターゲットとするものであり、遺伝子改変ＣＴＬを受ける際に患者の炎症応答を低減させ、およびまた直ぐに目標のリンパ球へ注射されたＴ細胞を増加させるために、リツキシマブ（ＴＭ）を用いて最初Ｂ細胞数を低減させることができる。さらに、リツキシマブ（ＴＭ）は、遺伝子組換えＴ細胞に対してホルモン性免疫応答を遅らせる可能性がある。リツキシマブ（ＴＭ）が、前記サルベージ／プライミング治療戦略の一部として与えられない場合には、研究参加者はリツキシマブ（ＴＭ）（キメラ抗ＣＤ２０抗体）を３７５ｍｇ／ｍ２で計画された自動ＨＳＣＴ手順の４週間内に１回の静脈注射を受けることができる。リツキシマブ注射は標準方法で実行され得る。これにはジフェンヒドラミン及びアセトアミノフェン及びヒドロコルチゾンの前投与が含まれる。ＨＳＣＴ後の２日目と３日目で、自己凍結保存ＣＤ１９Ｒ＋ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞物が輸送され、患者の側で解凍される。研究参加者はＴ細胞注射の少なくとも３０分前に、１５ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェン経口（最大６５０ｍｇ）及び１５～１ｍｇ／ｋｇ静脈注射（最大投与５０ｍｇ）のジフェンヒドラミンが前投与され得る。臨床及び実験室の相互関連フォローアップ研究は、医師の裁量で実施され得る。これには、ＣＤ１９発現リンパ球細胞及び／又は適合性遺伝子組換えＴ細胞の適量的ＲＴ－ＰＣＲ研究；ＦＤＧ－ＰＥＴ及び／又はＣＴスキャン；疾患特異的病理学的評価のための骨髄検査；リンパ節生検；及び／又は長期間フォローアップであり、ＦＤＡのＢｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより設定されたガイドラインの沿った遺伝子組み換え研究に適用されるものが含まれる。図１０は本発明に係る物及び方法の臨床試験のための可能なスキームを与える。
高リスクの中間悪性度Ｂ細胞リンパ腫を持つ大人の対象体は、自己骨髄破壊的幹細胞移植の候補者であり、適合的に転移された自己ＴＣＭ－誘導ＣＤ１９Ｒ＋ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞移植物による移植後免疫治療を受け得る。
それぞれの患者から集めた白血球分離物が、ＴＣＭ選別され、医療グレードのＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７で遺伝子組換えされ、その後選別され閉鎖系内でＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の増殖を行う。得られた細胞物は品質管理試験（殺菌及び腫瘍特異的細胞傷害性試験）を経て、凍結保存される。一方で、白血球除去輸血後に、研究参加者は、腫瘍低減化学療法及びＧ－ＣＳＦとの自動ＨＳＣ収集のための動員とともに標準のサルベージ化学的治療を開始する。ＥＧＦＲｔ選別、ＣＤ１９特異的Ｔ細胞はまた、通常のＣＤ２０＋（ＣＤ１９＋）Ｂ細胞もターゲットとするものであり、遺伝子改変ＣＴＬを受ける際に患者の炎症応答を低減させ、およびまた直ぐに目標のリンパ球へ注射されたＴ細胞を増加させるために、リツキシマブ（ＴＭ）を用いて最初Ｂ細胞数を低減させることができる。さらに、リツキシマブ（ＴＭ）は、遺伝子組換えＴ細胞に対してホルモン性免疫応答を遅らせる可能性がある。リツキシマブ（ＴＭ）が、前記サルベージ／プライミング治療戦略の一部として与えられない場合には、研究参加者はリツキシマブ（ＴＭ）（キメラ抗ＣＤ２０抗体）を３７５ｍｇ／ｍ２で計画された自動ＨＳＣＴ手順の４週間内に１回の静脈注射を受けることができる。リツキシマブ注射は標準方法で実行され得る。これにはジフェンヒドラミン及びアセトアミノフェン及びヒドロコルチゾンの前投与が含まれる。ＨＳＣＴ後の２日目と３日目で、自己凍結保存ＣＤ１９Ｒ＋ＣＤ８＋ＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞物が輸送され、患者の側で解凍される。研究参加者はＴ細胞注射の少なくとも３０分前に、１５ｍｇ／ｋｇのアセトアミノフェン経口（最大６５０ｍｇ）及び１５～１ｍｇ／ｋｇ静脈注射（最大投与５０ｍｇ）のジフェンヒドラミンが前投与され得る。臨床及び実験室の相互関連フォローアップ研究は、医師の裁量で実施され得る。これには、ＣＤ１９発現リンパ球細胞及び／又は適合性遺伝子組換えＴ細胞の適量的ＲＴ－ＰＣＲ研究；ＦＤＧ－ＰＥＴ及び／又はＣＴスキャン；疾患特異的病理学的評価のための骨髄検査；リンパ節生検；及び／又は長期間フォローアップであり、ＦＤＡのＢｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより設定されたガイドラインの沿った遺伝子組み換え研究に適用されるものが含まれる。図１０は本発明に係る物及び方法の臨床試験のための可能なスキームを与える。
【0067】
本発明は例で示された特定の実施態様に限定されるものではない。これら実施態様は本発明のいくつかの側面を説明することを意図するものであり、これらの実施態様と機能的に均等な全ては本発明の範囲に含まれる。実際に、当業者には、ここで示されたこれらの実施態様の種々の変更・変法が添付された特許請求の範囲の範囲内であることが意図されていることは明らかであろう。
【0068】
本明細書において引用される全ての特許、特許出願及び参考文献の内容は、参照されて本明細書に援用される。
【0069】
参考文献
１ ． Ｂｅｒｇｅｒ、Ｃ、Ｆｌｏｗｅｒｓ、ＭＥ、Ｗａｒｒｅｎ、ＥＨ、ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ、ＳＲ（２００６）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈａｔ ｌｉｍｉｔ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＨＳＶ－ＴＫ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １０７：２２９４－３０２．
２． Ｔｅｙ、ＳＫ、Ｄｏｔｔｉ、Ｇ、Ｒｏｏｎｅｙ、ＣＭ、Ｈｅｓｌｏｐ、ＨＥ、ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ、ＭＫ（２００７）．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３：９１３－２４．
３． Ｆｅｈｓｅ、Ｂ、Ｒｉｃｈｔｅｒｓ、Ａ、Ｐｕｔｉｍｔｓｅｖａ－Ｓｃｈａｒｆ、Ｋ、Ｋｌｕｍｐ、Ｈ、Ｌｉ、Ｚ、Ｏｓｔｅｒｔａｇ、Ｗ、 ｅｔ ａｌ．（２０００）．ＣＤ３４ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ：ａｎ ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｖ．４４８－５６．
４． Ｇａｉｎｅｓ、Ｐ、ａｎｄ Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ、ＤＭ（１９９９）．ｐｌＲＥＳ－ＣＤ４ｔ、ａ ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ＭＡＣＳ－ｏｒＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２６：６８３－８．
５． Ｆｅｈｓｅ、Ｂ、Ｕｈｄｅ、Ａ、Ｆｅｈｓｅ、Ｎ、Ｅｃｋｅｒｔ、ＨＧ、Ｃｌａｕｓｅｎ、Ｊ、Ｒｕｇｅｒ、Ｒ、ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｄｅｌｔａＬＮＧＦＲ）ｇｅｎｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：１８１５－２４．
６． Ｌｅｍｏｉｎｅ、ＦＭ、Ｍｅｓｅｌ－Ｌｅｍｏｉｎｅ、Ｍ、Ｃｈｅｒａｉ、Ｍ、Ｇａｌｌｏｔ、Ｇ、Ｖｉｅ、Ｈ、Ｌｅｃｌｅｒｃｑ、Ｖ、ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｔｈｙ１／ＨＳＶ１－ＴＫ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｕｍａｎ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６：３７４－８６．
７． Ｌｉ、Ｓ、Ｓｃｈｍｉｔｚ、ＫＲ、Ｊｅｆｆｒｅｙ、ＰＤ、Ｗｉｌｔｚｉｕｓ、ＪＪ、Ｋｕｓｓｉｅ、Ｐ、ａｎｄ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＫＭ（２００５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７：３０１－１１．
８． Ｄａｗｓｏｎ、ＪＰ、Ｂｅｒｇｅｒ、ＭＢ、Ｌｉｎ、ＣＣ、Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｊ、Ｌｅｍｍｏｎ、ＭＡ、 ａｎｄ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＫＭ（２００５）．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅ ｌｉｇａｎｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５：７７３４－４２．
９． Ｌａｎｇｅ、Ｃ、Ｌｉ、Ｚ、Ｆａｎｇ、Ｌ、Ｂａｕｍ、Ｃ、ａｎｄ Ｆｅｈｓｅ、Ｂ（２００７）．ＣＤ３４ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １６：２９７－３０４．
１０． Ｋｏｗｏｌｉｋ、ＣＭ、Ｔｏｐｐ、ＭＳ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｓ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、Ｔ、Ｏｌｉｖａｒｅｓ、Ｓ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｎ、ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＣＤ２８ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１０９９５－１００４．
１１． Ｓｚｙｍｃｚａｋ、ＡＬ、Ｗｏｒｋｍａｎ、ＣＪ、Ｗａｎｇ、Ｙ、Ｖｉｇｎａｌｉ、ＫＭ、Ｄｉｌｉｏｇｌｏｕ、Ｓ、Ｖａｎｉｎ、ＥＦ、ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ’ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ’ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：５８９－９４．
１２． Ｙａｍ、Ｐ、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｍ、Ａｋｋｉｎａ、Ｒ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｖｉｌｌａｃｒｅｓ、ＭＣ、Ｗｕ、Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００６）． Ｅｘ ｖｉｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ ａｆｔｅｒ ＨＩＶ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、 ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、ａｎｄ ＣＤ３４＋ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：２３６－４４．
１３． Ｐｅｌｌｏｑｕｉｎ、Ｆ、Ｌａｍｅｌｉｎ、ＪＰ、ａｎｄ Ｌｅｎｏｉｒ、ＧＭ（１９８６）．Ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２２：６８９－９４．
１ ． Ｂｅｒｇｅｒ、Ｃ、Ｆｌｏｗｅｒｓ、ＭＥ、Ｗａｒｒｅｎ、ＥＨ、ａｎｄ Ｒｉｄｄｅｌｌ、ＳＲ（２００６）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｈａｔ ｌｉｍｉｔ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＨＳＶ－ＴＫ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｏｎｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ １０７：２２９４－３０２．
２． Ｔｅｙ、ＳＫ、Ｄｏｔｔｉ、Ｇ、Ｒｏｏｎｅｙ、ＣＭ、Ｈｅｓｌｏｐ、ＨＥ、ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ、ＭＫ（２００７）．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ ９ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３：９１３－２４．
３． Ｆｅｈｓｅ、Ｂ、Ｒｉｃｈｔｅｒｓ、Ａ、Ｐｕｔｉｍｔｓｅｖａ－Ｓｃｈａｒｆ、Ｋ、Ｋｌｕｍｐ、Ｈ、Ｌｉ、Ｚ、Ｏｓｔｅｒｔａｇ、Ｗ、 ｅｔ ａｌ．（２０００）．ＣＤ３４ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ：ａｎ ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｖ．４４８－５６．
４． Ｇａｉｎｅｓ、Ｐ、ａｎｄ Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ、ＤＭ（１９９９）．ｐｌＲＥＳ－ＣＤ４ｔ、ａ ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ＭＡＣＳ－ｏｒＦＡＣＳ－ｂａｓｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２６：６８３－８．
５． Ｆｅｈｓｅ、Ｂ、Ｕｈｄｅ、Ａ、Ｆｅｈｓｅ、Ｎ、Ｅｃｋｅｒｔ、ＨＧ、Ｃｌａｕｓｅｎ、Ｊ、Ｒｕｇｅｒ、Ｒ、ｅｔ ａｌ．（１９９７）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍａｔｉｃａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｄｅｌｔａＬＮＧＦＲ）ｇｅｎｅ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：１８１５－２４．
６． Ｌｅｍｏｉｎｅ、ＦＭ、Ｍｅｓｅｌ－Ｌｅｍｏｉｎｅ、Ｍ、Ｃｈｅｒａｉ、Ｍ、Ｇａｌｌｏｔ、Ｇ、Ｖｉｅ、Ｈ、Ｌｅｃｌｅｒｃｑ、Ｖ、ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｔｈｙ１／ＨＳＶ１－ＴＫ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｈｕｍａｎ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６：３７４－８６．
７． Ｌｉ、Ｓ、Ｓｃｈｍｉｔｚ、ＫＲ、Ｊｅｆｆｒｅｙ、ＰＤ、Ｗｉｌｔｚｉｕｓ、ＪＪ、Ｋｕｓｓｉｅ、Ｐ、ａｎｄ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＫＭ（２００５）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ７：３０１－１１．
８． Ｄａｗｓｏｎ、ＪＰ、Ｂｅｒｇｅｒ、ＭＢ、Ｌｉｎ、ＣＣ、Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｊ、Ｌｅｍｍｏｎ、ＭＡ、 ａｎｄ Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＫＭ（２００５）．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅ ｌｉｇａｎｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｍｅｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５：７７３４－４２．
９． Ｌａｎｇｅ、Ｃ、Ｌｉ、Ｚ、Ｆａｎｇ、Ｌ、Ｂａｕｍ、Ｃ、ａｎｄ Ｆｅｈｓｅ、Ｂ（２００７）．ＣＤ３４ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ １６：２９７－３０４．
１０． Ｋｏｗｏｌｉｋ、ＣＭ、Ｔｏｐｐ、ＭＳ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｓ、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ、Ｔ、Ｏｌｉｖａｒｅｓ、Ｓ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ、Ｎ、ｅｔ ａｌ．（２００６）．ＣＤ２８ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１０９９５－１００４．
１１． Ｓｚｙｍｃｚａｋ、ＡＬ、Ｗｏｒｋｍａｎ、ＣＪ、Ｗａｎｇ、Ｙ、Ｖｉｇｎａｌｉ、ＫＭ、Ｄｉｌｉｏｇｌｏｕ、Ｓ、Ｖａｎｉｎ、ＥＦ、ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ’ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ’ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：５８９－９４．
１２． Ｙａｍ、Ｐ、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｍ、Ａｋｋｉｎａ、Ｒ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊ、Ｖｉｌｌａｃｒｅｓ、ＭＣ、Ｗｕ、Ｊ ｅｔ ａｌ．（２００６）． Ｅｘ ｖｉｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２ ａｆｔｅｒ ＨＩＶ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、 ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ、ａｎｄ ＣＤ３４＋ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４：２３６－４４．
１３． Ｐｅｌｌｏｑｕｉｎ、Ｆ、Ｌａｍｅｌｉｎ、ＪＰ、ａｎｄ Ｌｅｎｏｉｒ、ＧＭ（１９８６）．Ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２２：６８９－９４．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】