特許 7116399 抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-02

(45)【発行日】2022-08-10

(54)【発明の名称】抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/06 20060101AFI20220803BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20220803BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20220803BHJP

   C12N 5/16 20060101ALI20220803BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20220803BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220803BHJP

   C07K 16/08 20060101ALI20220803BHJP

   C07K 16/12 20060101ALI20220803BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20220803BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20220803BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20220803BHJP

   A01K 67/027 20060101ALN20220803BHJP

   C12N 15/01 20060101ALN20220803BHJP

【ＦＩ】

C12N15/06 100

C07K16/42 ZNA

C12P21/08

C12N5/16

C07K17/00

G01N33/53 N

C07K16/08

C07K16/12

C07K16/18

C12N15/54

C07K1/22

A01K67/027

C12N15/01 Z

【請求項の数】 29

(21)【出願番号】P 2018539760

(86)(22)【出願日】2017-09-13

(86)【国際出願番号】 JP2017033126

(87)【国際公開番号】W WO2018052041

(87)【国際公開日】2018-03-22

【審査請求日】2020-07-03

(31)【優先権主張番号】P 2016179944

(32)【優先日】2016-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-02342

(73)【特許権者】

【識別番号】503359821

【氏名又は名称】国立研究開発法人理化学研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】000162478

【氏名又は名称】ミナリスメディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(74)【代理人】

【識別番号】100106574

【弁理士】

【氏名又は名称】岩橋 和幸

(72)【発明者】

【氏名】谷口 直之

(72)【発明者】

【氏名】顧 建国

(72)【発明者】

【氏名】小野 達也

(72)【発明者】

【氏名】椎田 真史

(72)【発明者】

【氏名】真木 賢太郎

【審査官】大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５３４３１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－２０９２６１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／４２

Ｃ０７Ｋ １／２２

Ｃ０７Ｋ １７／００

Ｃ１２Ｎ ５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／０２

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しないことを特徴とする、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片。

【請求項2】

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、請求項１に記載の抗体又は該抗体断片。

【請求項3】

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、請求項１又は２に記載の抗体又は該抗体断片。

【化1】

【請求項4】

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧが、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原と結合するヒト免疫グロブリンＧである、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体断片。

【請求項5】

抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又は該抗体断片。

【請求項6】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマにより産生される、請求項５に記載の抗体又は該抗体断片。

【請求項7】

請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。

【請求項8】

受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマ。

【請求項9】

以下の工程を含有することを特徴とする、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体の製造方法。
（１）コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、α１－６フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が欠損した非ヒト動物に免疫する工程；
（２）工程（１）で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る工程；
（３）工程（２）で得られるハイブリドーマを培養する工程；
（４）工程（３）で得られた培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；
（５）工程（４）で選択されたハイブリドーマを培養し、当該培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体を採取する工程。

【請求項10】

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、請求項９に記載の製造方法。

【請求項11】

コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、請求項９又は１０に記載の製造方法。

【化2】

【請求項12】

請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの測定方法。

【請求項13】

以下の工程を含有する、請求項１２に記載の測定方法。
（１）試料と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。

【請求項14】

以下の工程を含有する、請求項１２に記載の測定方法。
（１）試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。

【請求項15】

以下の工程を含有する、請求項１２に記載の測定方法。
（１）試料を、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、不溶性担体上に固定化された請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片と反応させ、該不溶性担体上に、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧとの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質の免疫複合体における標識化競合物質を測定する工程。

【請求項16】

以下の工程を含有する、請求項１２に記載の測定方法。
（１）試料を、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体、又は該抗体断片及び、不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質と反応させ、該不溶性担体上に、競合物質と抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した免疫複合体を測定する工程。

【請求項17】

以下の工程を含有する、請求項１２に記載の測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原とを反応させて、抗原とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗原、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。

【請求項18】

以下の工程を含有する、請求項１２に記載の測定方法。
（１）試料と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧとの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原とを反応させて、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ、及び、抗原の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。

【請求項19】

コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、請求項１７又は１８に記載の測定方法。

【請求項20】

請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体または該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬。

【請求項21】

さらに、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合する抗体を含む、請求項２０に記載の測定試薬。

【請求項22】

不溶性担体上に固定化された請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬。

【請求項23】

不溶性担体上に固定化されたコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの競合物質、及び、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬。

【請求項24】

さらに、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原を含む、請求項２０に記載の測定試薬。

【請求項25】

コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、請求項２４に記載の測定試薬。

【請求項26】

請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの精製方法。

【請求項27】

以下の工程を含む、請求項２６に記載の精製方法。
（１）試料と、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧと抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体から、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧを遊離させる工程；
（３）工程（２）で遊離したコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧを回収する工程。

【請求項28】

抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体上に固定化されている、請求項２６又は２７に記載の精製方法。

【請求項29】

請求項１～６のいずれか一項に記載の抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体の製造方法、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの測定方法、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬、コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの精製方法、及び、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体に関する。
本願は、２０１６年９月１４日に、日本に出願された特願２０１６－１７９９４４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの免疫グロブリンＧ（以下、ＩｇＧと記載する）は、獲得免疫機構において成熟したＢ細胞が血液中に分泌する糖蛋白質である。ヒトＩｇＧは２本の軽鎖（Ｌ鎖）と２本の重鎖（Ｈ鎖）からなる４量体で、４種類のサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、４）が存在する。２本の重鎖のＣ末端側ドメイン（Ｃ_Ｈ２ドメイン及びＣ_Ｈ３ドメイン）が構成するＦｃ領域（定常領域とも呼ぶ）に含まれる重鎖２９７番目のアスパラギン（Ｎ）には、いずれのサブクラスにおいても翻訳後修飾として糖鎖が付加される（図１）。このＩｇＧのＦｃ領域に含まれる重鎖２９７番目のアスパラギン（Ｎ）に結合した糖鎖をＮ結合型糖鎖という。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＮ結合型糖鎖は、２個のＮ－アセチルグルコサミンと３個のマンノースからなる５糖構造を核とし、これにＮ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸、フコースが付加される複合型２分岐糖鎖であり、各単糖の付加の有無や付加数、付加される位置の違いによって構造的多様性を示す（非特許文献１参照）。

【0003】

Ｆｃ領域に存在するＮ結合型糖鎖の構造は、ＩｇＧの機能に重要な影響を与えることが知られている。例えば、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＮ結合型糖鎖には、２９７番目のアスパラギンに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミン（還元末端ＧｌｃＮＡｃ）の６位と、フコースの１位とがα１－６結合した糖鎖構造が存在する（このフコースをコアフコースと呼ぶ）。このコアフコースが失われると、細胞傷害性リンパ球の１種であるナチュラルキラー細胞が細胞表面に発現するＦｃγレセプターＩＩＩ（別名ＣＤ１６）と、ＩｇＧ Ｆｃ領域との相互作用が強くなる（非特許文献２参照）。その結果、ヒトＩｇＧが結合した標的（がん細胞、ウイルス感染細胞など）に対して、このヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に結合したナチュラルキラー細胞が発揮する抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下、ＡＤＣＣと記載する）活性が劇的に増強される（非特許文献３、４参照）。

【0004】

この現象はＡＤＣＣ活性を薬効機序とした抗体医薬の開発に利用されており、コアフコースを持たないヒトＩｇＧ（以下、非コアフコシル化ヒトＩｇＧと記載する。）の様々な生産方法が報告されている。例えば、コアフコースの付加に関与する酵素であるα１－６フコシルトランスフェラーゼ（以下、Ｆｕｔ８と記載する。）をコードするすべての遺伝子を破壊した細胞を抗体生産細胞として利用する方法（非特許文献５参照）、Ｆｕｔ８をコードするメッセンジャーＲＮＡをｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で破壊する方法（非特許文献６参照）、抗体産生細胞を糖鎖修飾酵素（αマンノシダーゼＩ）の阻害剤存在下で培養し、結果的に非コアフコシル化ヒトＩｇＧを得る方法（非特許文献７参照）、バイセクティングＮ－アセチルグルコサミンの付加を促進する酵素（β１－４Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）を抗体産生細胞に人工的に発現させ、非コアフコシル化ヒトＩｇＧを得る方法（非特許文献８参照）などが挙げられる。

【0005】

一方、コアフコシル化ヒトＩｇＧの量が、疾患の有無やその病態の度合いに伴い変動する事が知られている。例えばＫｒａｔｚらは、男性不妊を呈する膿精子症（ｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｐｅｒｍｉａ）の患者において、精漿中に存在するコアフコシル化ヒトＩｇＧ量が減少していることを報告し、この変化が膿精子症の診断に有用である可能性を示唆している（非特許文献９参照）。またＫｏｄａｒらは、胃がん患者のがん進行度（がんステージ）に応じたコアフコシル化ヒトＩｇＧ量の変動を見出し、コアフコースを含むヒトＩｇＧの糖鎖構造の変化が、胃がんの悪性度や予後を予測する指標として有用である可能性を示唆している（非特許文献１０参照）。さらにＫａｐｕｒらは、妊娠中の母体由来の抗体が胎児に移行し、胎児が提示する同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）に反応することで発症する新生児同種免疫性血小板減少症（Ｎｅｏｎａｔａｌ ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ、ＮＡＩＴ）、及び新生児溶血性疾患（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｗｂｏｒｎ、ＨＤＮ）において、同種抗原を認識する母体由来のＩｇＧのコアフコースが特異的かつ顕著に減少していること、またこのコアフコース減少の程度が病態の重篤度と相関することを見出し、各疾患の発症予測や重篤度を予測する指標として有用であることを報告している（非特許文献１１、１２参照）。

【0006】

現在、研究及び臨床の現場において、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定は、質量分析機や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法（特許文献１、２参照）、あるいはコアフコースに親和性を示すレクチンを用いた方法（特許文献３、４参照）によって行われている。しかしながら、前者では、高額な測定機を準備する必要があり、また、糖鎖分解酵素や蛋白質分解酵素による試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの分解等の試料の前処理が必要であり、かつ、操作が非常に煩雑であり、効率性に欠けるという問題があり、後者では、レクチンのコアフコースに対する特異性が低いため、コアフコシル化ヒトＩｇＧの高感度測定、及び、効率的精製は難しいという問題がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】国際公開第２０１１／０２６６４０号

【文献】国際公開第２０１１／０３９１５０号

【文献】国際公開第２０１０／０１０６７４号

【文献】特開２００７－１６１６３３号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】Journal of Immunological Methods, http://dx.doi.org/10.1016/j.jim. 2014.12.004

【文献】Proceedings of the National Academy of Sciences, vol.108, p.12669～12674 (2011)

【文献】Journal of Biological Chemistry, vol.277, p.26733～26740 (2002)

【文献】Journal of Biological Chemistry, vol.278, p.3466～3473 (2003)

【文献】Biotechnology and Bioengineering, vol.87, p.614～622 (2004)

【文献】Biotechnology and Bioengineering, vol.88, p.901～908 (2004)

【文献】Biotechnology and Bioengineering, vol.99, p.652～665 (2008)

【文献】Nature Biotechnology, vol.17, p.176～180 (1999)

【文献】Glycoconjugate Journal, DOI 10.1007/s10719-013-9501-y (2013)

【文献】Glycoconjugate Journal, DOI 10.1007/s10719-011-9364-z (2012)

【文献】Blood, vol.123, p.471～480 (2014)

【文献】British Journal of Haematology, vol.166, p.936～945 (2014)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明の目的は、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合するが、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を提供することにある。また、本発明の目的は、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬、コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合するが、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の取得に成功し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の［１］～［３０］に関する。

【0011】

［１］ コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しないことを特徴とする、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片。
［２］ コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、［１］に記載の抗体又は該抗体断片。
［３］ コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、［１］又は［２］に記載の抗体又は該抗体断片。

【0012】

【化1】

【0013】

［４］ コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原と結合するヒトＩｇＧである、［１］～［３］のいずれかに記載の抗体又は該抗体断片。
［５］ 抗体が、モノクローナル抗体である、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又は該抗体断片。
［６］ 受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマにより産生される、［５］に記載の抗体又は該抗体断片。
［７］ ［５］に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
［８］ 受託番号ＮＩＴＥＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマ。
［９］ 以下の工程を含有することを特徴とする、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法。
（１）コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程；
（２）工程（１）で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る工程；
（３）工程（２）で得られるハイブリドーマを培養する工程；
（４）工程（３）で得られた培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；
（５）工程（４）で選択されたハイブリドーマを培養し、該培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する工程。
［１０］ 非ヒト動物が、α１－６フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が欠損した非ヒト動物である、［９］に記載の製造方法。
［１１］ コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、フコースが還元末端ＧｌｃＮＡｃとα１－６結合しているＮ結合型糖鎖である、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］ コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が、下記一般式（Ｉ）で表される糖鎖を含むＮ結合型糖鎖である、［９］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。

【0014】

【化2】

【0015】

［１３］ ［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
［１４］ 以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［１５］ 以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［１６］ 以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料を、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質、及び、不溶性担体上に固定化された［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と反応させ、該不溶性担体上に、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧとの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質との免疫複合体における標識化競合物質を測定する工程。
［１７］ 以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料を、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、不溶性担体上に固定化されたコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と反応させ、該不溶性担体上に、競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で該不溶性担体上に生成した免疫複合体を測定する工程。
［１８］ 以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗原とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗原、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［１９］ 以下の工程を含有する、［１３］に記載の測定方法。
（１）試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧとの免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗原の免疫複合体を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体を測定する工程。
［２０］ コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、［１８］又は［１９］に記載の測定方法。
［２１］ ［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
［２２］ さらに、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含む、［２１］に記載の測定試薬。
［２３］ 不溶性担体上に固定化された［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識が結合した標識化競合物質を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
［２４］ 不溶性担体上に固定化されたコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、及び、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含むことを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
［２５］ さらに、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含む、［２１］に記載の測定試薬。
［２６］ コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が、自己抗原、同種抗原、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原からなる群より選ばれる少なくとも一種の抗原である、［２５］に記載の測定試薬。
［２７］ ［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いることを特徴とする、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法。
［２８］ 以下の工程を含む、［２７］に記載の精製方法。
（１）試料と、［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、コアフコシル化ヒトＩｇＧと抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体から、コアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させる工程；
（３）工程（２）で遊離したコアフコシル化ヒトＩｇＧを回収する工程。
［２９］ 抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体が不溶性担体上に固定化されている、［２７］又は［２８］に記載の精製方法。
［３０］ ［１］～［６］のいずれかに記載の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体。

【発明の効果】

【0016】

本発明により、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合するが、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が提供される。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法、コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬、コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ヒトＩｇＧの構造を模式的に示す。

【図2】ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域－ＦＬＡＧ融合蛋白質（以下、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧと記載する）を哺乳類培養細胞で発現させるためのベクターの構造を示す。

【図3】還元、非還元状態におけるｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す。

【図4】抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、各レクチン及び抗ＦＬＡＧ抗体の、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。図４において、「ＣＨＯ細胞由来」とはＣＨＯ細胞由来ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示し、「Ｆｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来」とはＦｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示している。

【図5】抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。図５において、「＋」とは、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示し、「－」とは、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを示している。

【図6】ビアコアによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。図６において、実線は、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示し、破線は、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示している。なお、右下の“抗ヒトＩｇＧ抗体とｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧとの反応”は、ビアコアによって評価した、センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体の、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧおよび非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を示す。

【図7】抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、天然コアフコシル化抗原に対する反応性を示す。

【図8】抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ヒトＩｇＧ、ヒト免疫グロブリンＡ、ヒト免疫グロブリンＭ、ウサギＩｇＧに対する反応性を示す。

【図9】ビアコアによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、ヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性を示す。なお、右下の“抗ヒトＩｇＧ抗体と各サブクラスヒトＩｇＧとの反応”は、ビアコアによって評価した、センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体の、各サブクラスのヒトＩｇＧに対する反応性を示す。

【図10】抗原固相ＥＬＩＳＡによって評価した、ＬＣＡレクチン及び抗ヒトＩｇＧ抗体の、過ヨウ素酸処理した各サブクラスのヒトＩｇＧ（図において「＋」と表示）、及び、過ヨウ素酸処理していない各サブクラスのヒトＩｇＧ（図において「－」と表示）に対する反応性を示す。

【図11】ビアコアによって評価した、取得したハイブリドーマ株が分泌するモノクローナル抗体の、過ヨウ素酸処理した各サブクラスのヒトＩｇＧ（破線）、及び、過ヨウ素酸処理していない各サブクラスのヒトＩｇＧ（実線）に対する反応性を示す。なお、最下段の３つの図は、ビアコアによって評価した、センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体の、各サブクラスのヒトＩｇＧに対する反応性を示す。

【図12】抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体が固定化された不溶性担体を含有するカラムで精製した、ヒトＩｇＧ由来のＮ結合型糖鎖のＭＳスペクトルを示す。

【図13】抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体カラムが固定化された不溶性担体を含有するカラムで精製する前の、ヒトＩｇＧ由来のＮ結合型糖鎖のＭＳスペクトルのスペクトラムを示す。

【図14】コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の標準曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

［１］抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体
本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体とは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない抗体である。

【0019】

本発明におけるコアフコースとは、ヒトＩｇＧの２つのＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ｎ）に結合しているＮ結合型糖鎖のうち該アスパラギンに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミン、すなわち、還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンの６位の炭素と、α１－６結合したフコースをいう。

【0020】

本発明における糖鎖とは、各種の単糖がグリコシド結合によって繋がった化合物をいう。単糖としては、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、シアル酸等が挙げられる。グリコシド結合とは、単糖のヘミアセタールと他の単糖のヒドロキシル基との間の結合をいい、例えば、２つのＮ－アセチルグルコサミンの間の結合、２つのマンノースの間の結合、マンノースとＮ－アセチルグルコサミンとの間の結合、Ｎ－アセチルグルコサミンとフコースとの間の結合等が挙げられ、これらの結合様式としてα１－３結合、α１－６結合、β１－４結合等が挙げられる。具体的には、２つのＮ－アセチルグルコサミンの間のβ１－４結合等が挙げられる。

【0021】

本発明におけるコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖とは、例えば、下記に示される式(I)～(VII)の構造で表されるＮ結合型糖鎖等が挙げられる。

【0022】

【化3】

【0023】

本発明におけるコアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖とは、ヒトＩｇＧの２つのＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ｎ）に糖鎖が結合したＮ結合型糖鎖であって、アスパラギンに直接結合しているＮ－アセチルグルコサミン、すなわち、還元末端Ｎ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖であり、例えば、下記に示される式(VIII)～(XIV)の構造で表されるＮ結合型糖鎖等が挙げられる。

【0024】

【化4】

【0025】

本発明におけるコアフコシル化ヒトＩｇＧは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであり、例えば図１に示すヒトＩｇＧ等が挙げられる。

【0026】

本発明におけるコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが結合する抗原としては、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが結合する抗原であれば特に制限はなく、例えば、自己抗原、同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）、ウイルス由来抗原、及び、細菌由来抗原等が挙げられる。自己抗原としては細胞核内抗原等が挙げられ、同種抗原としては主要組織適合遺伝子複合体抗原（ＭＨＣ抗原）等が挙げられ、ウイルス由来抗原としてはＢ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスのコア抗原等が挙げられ、細菌由来抗原としてはグラム陰性菌外膜のＯ抗原、百日咳菌の百日咳毒素等が挙げられる。

【0027】

本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体、抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換えモノクローナル抗体等が挙げられる。ハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体としては、例えば、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体等が挙げられる。

【0028】

本発明のハイブリドーマとしては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマであれば特に制限はなく、例えば、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として寄託されているハイブリドーマが挙げられる。

【0029】

本発明のハイブリドーマは、公知の方法、例えば、「モノクローナル抗体」（羊土社、１９９６年）等に記載されている方法等で製造することができる。

【0030】

また、本発明における抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の断片としては、例えば、抗体をパパイン処理することにより得られるＦａｂ、抗体をペプシン処理することにより得られるＦ（ａｂ’）_２、抗体をペプシン処理－還元処理することにより得られるＦａｂ’、抗体軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ領域）と抗体重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ領域）を人工的に１本のポリペプチドとして繋いだ１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ科動物等が保有する抗体軽鎖を持たない１本鎖抗体の抗体重鎖の可変領域（Ｖ_ＨＨ領域）断片等が挙げられる。

【0031】

本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の製造方法としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を製造し得る方法であれば特に制限はなく、例えば以下の工程を含む製造方法等が挙げられる。
[i] コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程；
[ii] 工程[i]で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを得る工程；
[iii] 工程[ii]で得られるハイブリドーマを培養する工程；
[iv] 工程[iii]で得られた培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程；
[v] 工程[iv]で選択されたハイブリドーマを培養し、該培養物から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する工程。

【0032】

（工程[i]）
工程[i]は、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を免疫原として用いて、非ヒト動物に免疫する工程であり、非ヒト動物に免疫する方法としては、調製した免疫原を、例えば、非ヒト動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバントとともに抗原を投与する方法等が挙げられる。

【0033】

免疫原としては、非ヒト動物に本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得る免疫原であれば特に制限はなく、例えばコアフコシル化ヒトＩｇＧ、又はコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片等が挙げられ、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、又はコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片にＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）やアルブミン等のキャリア蛋白質を結合させたものを用いていてもよい。アルブミンとしては、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン等が挙げられる。

【0034】

非ヒト動物としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生体内に生成し得るヒト以外の動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、アルパカ等が挙がられ、特に、コアフコースを含むエピトープに対する抗体が生じ易いことが期待される、α１－６フコシルトランスフェラーゼ（以下、Ｆｕｔ８と記載する）をコードする遺伝子が欠損したＦｕｔ８ノックアウトマウス（以下、Ｆｕｔ８ＫＯマウスと記載する）［Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.102，p.15791 (2005)］が好的に用いられる。

【0035】

アジュバントとしては、非ヒト動物に本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得るアジュバントであれば特に制限はなく、例えば、Freund’s Complete Adjuvant（ＦＣＡ）、Freund’s Incomplete Adjuvant（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント等が挙げられる。

【0036】

免疫原の調製方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又はそのＦｃ領域断片を調製し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、下記に示す、（a）コアフコシル化ヒトＩｇＧ若しくはそのＦｃ領域断片を遺伝子工学的に製造する方法、（b）ヒト血液試料等からコアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法、（c）ヒト血液試料等から精製したコアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理することでコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得る方法、（d）試験管内でコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を人工的に合成する方法等が挙げられる。

【0037】

（a）コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を遺伝子工学的に製造する方法
コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片は、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法等に従い、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを挿入した発現ベクター（以下、組換えベクターという）を作製した後、該組換えベクターを宿主細胞に導入することで形質転換体を作製し、該形質転換体にヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させることにより、製造することができる。具体的には以下の（a‐1）～（a‐3）の手順で行うことができる。

【0038】

（a‐1）ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターの作製
ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターは、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡ断片を、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製することができる。

【0039】

ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡは、以下の方法により取得することができる。
ヒト末梢血から単離した白血球から全ＲＮＡを調製し、該全ＲＮＡからｍＲＮＡを抽出した後、該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。該ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを増幅するように設計したプライマーを用いてpolymerase chain reaction（ＰＣＲ）を行い、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを増幅する。ｃＤＮＡ断片がコードするヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片のサブクラスは、ＩｇＧ１～４のいずれでもよい。また該ｃＤＮＡ断片に必要に応じてＨｉｓ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧ等のエピトープタグをコードする配列を付加してもよい。

【0040】

全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]、又はOligo-dT30<Super> mRNA Purification Kit（タカラバイオ社製）等のキットを用いて行うことができる。また、Fast Track mRNA Isolation Kit（インビトロジェン社製）、又はQuickPrep mRNA Purification Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等のキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。

【0041】

ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、PrimeScript（登録商標） II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ社製）等のキットを用いて行うことができる。

【0042】

（a‐2）形質転換体の作製
（a‐1）で作製した組換えベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する形質転換体を得ることができる。
組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、エレクトロポレーション法[Cytotechnology，vol.3，p.133(1990)]、リン酸カルシウム法（特開平２－２２７０７５号公報）、リポフェクション法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.84，p.7413 (1987)]などが挙げられる。

【0043】

コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を得るための宿主細胞としては、導入した発現ベクターがコードするヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現できる動物細胞、酵母、昆虫細胞等であって、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖を付加する能力を有するものであればいずれをも用いることができる。なお、該宿主細胞には、遺伝子改変によりコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖を付加する能力を獲得した宿主細胞も含まれる。

【0044】

動物細胞としては、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７細胞（特開昭６３－２９９号公報）等が挙げられる。酵母としては、例えばサッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物等が挙げられる。具体的には、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等がそれぞれ挙げられる。昆虫細胞としては、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞［Current Protocols in Molecular Biology，Baculovirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)］及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビトロジェン社製）等が挙げられる。

【0045】

発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。

【0046】

動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３－２２９７９号公報；Cytotechnology，vol.3，p.133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（特開平２－２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature，vol.329，p.840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J.Biochemistry，vol.101，p.1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［国際公開第１９９７／１０３５４号］等が挙げられる。

【0047】

酵母を宿主として用いる場合の発現ベクターとして、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等が挙げられる。

【0048】

昆虫細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとして、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等が挙げられる。

【0049】

動物細胞用の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）のプロモーター及びエンハンサー等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。

【0050】

酵母用の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、酵母中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１ プロモーター及びＣＵＰ １プロモーター等が挙げられる。

【0051】

昆虫細胞用の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、昆虫細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等が挙げられる。

【0052】

（a‐3）形質転換体からコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造する方法
（a‐2）で得られる形質転換体を培地で培養し、培養物中にコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産させ、該培養物から採取することにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造することができる。
培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ_２存在下等の条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【0053】

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association，vol.199，p.519 (1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science，vol.122，p.501 (1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology，vol.8，p.396 (1959)］、１９９培地［Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，vol.73，p.1 (1950)］又はこれら培地にウシ胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等を用いることができる。酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばＹＰＤ培地等が挙げられる。昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばグレース昆虫培地等が挙げられる。

【0054】

形質転換体を用いてコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞を変えることにより、適切な方法を選択することができる。

【0055】

コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産方法として、宿主細胞内に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外膜上に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外に分泌させる方法としては、例えば特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第１９９４／２３０２１号等に記載の方法等が挙げられる。

【0056】

宿主細胞から生産されたコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片は、例えば、以下のようにして、調製することができる。
コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のタンパク質の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製品を得ることができる。

【0057】

コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体を回収する。回収したコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を正常な立体構造に戻した後、前記と同様の調製法によりコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を得ることができる。

【0058】

（b）ヒト血液試料等からコアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法
ヒト血液試料等からコアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法としては、例えば、ヒトから採取した血液を遠心分離することによって得られる血清から、前述の（a‐3）に記載の通常のタンパク質の単離精製法を用いて、コアフコシル化ヒトＩｇＧを調製する方法等が挙げられる。

【0059】

（c）ヒト血液試料等から調製したコアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理することによりコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得る方法
ヒト血液試料等から調製したコアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理することによりコアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得る方法としては、例えば、前述（b）記載の方法により調製したコアフコシル化ヒトＩｇＧを、プロテアーゼにより可変領域とＦｃ領域とに切断した後、前述の（a‐3）に記載の通常のタンパク質の単離精製法を用いて、該Ｆｃ領域断片を調製する方法等が挙げられる。プロテアーゼとしては、例えばペプシン、パパイン等が挙げられる。コアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理する時間としては、コアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得ることができる時間であれば特に制限はなく、通常、１～４８時間であり、２～２４時間が好ましい。コアフコシル化ヒトＩｇＧをプロテアーゼ処理する温度は、コアフコシル化ヒトＩｇＧのＦｃ領域断片を得ることができる温度であれば特に制限はなく、通常、０～５０℃であり、５～４５℃が好ましく、２０～４０℃が特に好ましい。

【0060】

（d）試験管内でコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を人工的に合成する方法
試験管内でコアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を人工的に合成する方法としては、例えば、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖が結合したアスパラギンを用いたペプチドの固相合成法［J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1，vol.3，p.549 (1998)］等により作製したコアフコースが結合したＮ結合型糖鎖が結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片と、それ以外の部分のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片とをネイティブケミカルライゲーション法［Science，vol.226，p.5186 (1994)］等を用いて連結する方法等が挙げられる。

【0061】

（工程[ii]）
工程[ii]は、工程[i]で免疫した非ヒト動物より得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合し、ハイブリドーマを作製する工程である。

【0062】

抗体産生細胞としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得る抗体産生細胞であれば特に制限はなく、例えば、免疫原を免役した非ヒト動物の脾臓、リンパ節、又は末梢血から得られるＢ細胞等が挙げられる。

【0063】

ミエローマ細胞としては、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を生成し得るミエローマ細胞であれば特に制限はなく、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology，vol.18，p.1 (1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１－Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology，vol.6，p.511 (1976）］、ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature，vol.276，p.269 (1978)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J.Immunology，vol.123，p.1548 (1979)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature，vol.256，p.495 (1975)］等が挙げられる。

【0064】

細胞の融合方法としては、抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合できる方法であれば特に制限はなく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、電気パルス法等が挙げられる。

【0065】

（工程[iii]）
工程[iii]は、工程［ii］で作製したハイブリドーマを培養する工程であり、ハイブリドーマを培養する方法としては、例えば、選択培地［１０％（ｖ／ｖ） ＢＭ－ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１、２％（ｖ／ｖ） ＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）］を用い、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。

【0066】

（工程[iv]）
工程[iv]は、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマのみを選択する工程であり、当該ハイブリドーマのみを選択する方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。

【0067】

コアフコシル化ヒトＩｇＧ又は非コアフコシル化ヒトＩｇＧを固相化したマイクロタイタープレートの各ウェルに、工程[iii]記載のハイブリドーマの培養方法によって得られる培養上清を分注し２５℃で反応させる。各ウェルを洗浄液［０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液］で洗浄した後、酵素等で標識した抗ＩｇＧ抗体を分注して反応させる。各ウェルを洗浄液で洗浄後、各ウェルの標識量を測定することにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、培養上清中の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体、及び標識化抗ＩｇＧ抗体からなる免疫複合体Ａ、又は、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ、培養上清中の抗非コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体、及び標識化抗ＩｇＧ抗体からなる免疫複合体Ｂが形成したウェルを検出することができ、培養上清に含まれるモノクローナル抗体が、コアフコシル化ヒトＩｇＧ又は非コアフコシル化ヒトＩｇＧに結合するか否かを判定することができる。この結果から、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマのみを選択することができる。

【0068】

ハイブリドーマの選択に用いるコアフコシル化ヒトＩｇＧは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであり、例えば、前述の工程（i）の（a）～（d）の方法等により製造することができる。

【0069】

ハイブリドーマの選択に用いる非コアフコシル化ヒトＩｇＧは、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであり、例えば、下記に示す、（e）遺伝子工学的に非コアフコシル化ヒトＩｇＧを製造する方法、（f）化学合成法等の方法により製造することができる。

【0070】

（e）遺伝子工学的に非コアフコシル化ヒトＩｇＧを製造する方法
非コアフコシル化ヒトＩｇＧは、例えば、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法等に従い、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターを作製した後、該組換えベクターを宿主細胞に導入した形質転換体を作製し、該形質転換体に非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させることにより、製造することができる。具体的には、以下の（e‐1）～（e‐3）の手順で行うことができる。

【0071】

（e‐1）非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターの作製
非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現させるための組換えベクターは、前述の（a‐1）の方法により作製することができる。

【0072】

（e‐2）形質転換体の作製
（e‐1）で得られた組換えベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する形質転換体を得ることができる。

【0073】

組換えベクターを宿主細胞へ導入する方法としては、組換えベクターを宿主細胞へ導入し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、前述の（a‐2）に記載の方法等が挙げられる。

【0074】

宿主細胞としては、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産し得る宿主細胞であれば特に制限はなく、例えば、Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素の活性を低下又は欠損させた動物細胞、糖鎖付加能のない原核細胞等が挙げられる。

【0075】

Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素としては、例えば、Ｆｕｔ８等が挙げられる。

【0076】

Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素の活性を低下又は欠損させた動物細胞としては、Ｎ結合型糖鎖にコアフコースを結合させる酵素の活性が低下又は欠損した動物細胞であれば特に制限はなく、例えば、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したＣＯＳ細胞、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したＣＨＯ細胞、Ｆｕｔ８活性が低下又は欠損したＨＢＴ５６３７細胞等が挙げられる。

【0077】

Ｆｕｔ８活性を低下又は欠損させる方法としては、アンチセンス法、リボザイム法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.96，p.1886 (1999)]、相同組換え法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1994)；Gene Targeting,A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press (1993)］、RNA-DNA oligonucleotide（ＲＤＯ）法、RNA interference（ＲＮＡｉ）法[Nature，vol.391，p.806 (1998)；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.95，p.15502 (1998)；Nature，vol.395，p.854 (1998)；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.96，p.5049 (1999)；Cell，vol.95，p.1017 (1998)；Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.96，p.1451 (1999)；Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，vol.95，p.13959 (1998)；Nature Cell Biol.，vol.2，p.70 (2000)]、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法[Nature Genetics，vol.25，p.35 (2000)]等が挙げられる。

【0078】

糖鎖付加能のない原核細胞を有する原核生物としては、例えばエシェリヒア属等に属する微生物等が挙げられ、エシェリヒア属等に属する微生物としては、例えば、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、大腸菌ＤＨ５α等が挙げられる。

【0079】

動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターは、使用する宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込が可能で、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものを用いることができる。

【0080】

動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、前述の（a‐2）に記載の発現ベクター等が挙げられる。

【0081】

動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、前述の（a‐2）に記載のプロモーター等が挙げられる。

【0082】

動物細胞を宿主として用いる場合の組換えベクターにおけるヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とするヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産率を向上させることができる。さらに、前記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

【0083】

糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列を含む発現ベクターを用いることができる。リボソーム結合配列としては、例えばシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列等が挙げられる。また、該発現ベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。

【0084】

糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を発現し得る発現ベクターであれば特に制限はなく、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもロシュ社製）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry，vol.48，p.669 (1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric.Biol.Chem.，vol.53，p.277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.82，p.4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（アジレント・テクノロジー社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J.Bacteriol.，vol.172，p.2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３（東洋紡社製）等が挙げられる。

【0085】

糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターにおけるプロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮し得るものであれば特に制限はなく、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが挙げられる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃ Ｔ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

【0086】

糖鎖付加能のない原核細胞を宿主細胞として用いる場合の組換えベクターにおいて、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したものを用いることが好ましい。

【0087】

前記組換えベクターにおけるヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片をコードするｃＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とする非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産率を向上させることができる。さらに、前記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

【0088】

（e‐3）形質転換体から非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造する方法
（e‐2）で得られる形質転換体を培地で培養し、培養物中に非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産させ、該培養物から採取することにより、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を製造することができる。

【0089】

動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、前述の（a‐3）に記載の培地等が挙げられる。

【0090】

糖鎖付加能のない原核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＬＢ培地等が挙げられる。

【0091】

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した該原核生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した該原核生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した該原核生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

【0092】

遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。

【0093】

非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、及び宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞を変えることにより、適切な方法を選択することができる。

【0094】

非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の生産方法として、宿主細胞内に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外膜上に生産させる方法としては、例えばポールソンらの方法[J.Biol.Chem.，vol.264，p.17619 (1989)]、ロウらの方法[Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.86，p.8227 (1989)；Genes Develop.，vol.4，p.1288 (1990)]等が挙げられ、宿主細胞外に分泌させる方法としては、例えば特開平５－３３６９６３号公報、国際公開第１９９４／２３０２１号等に記載の方法等が挙げられる。

【0095】

形質転換体を用いて、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を生産する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。

【0096】

非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独又は組み合わせて用い、精製品を得ることができる。

【0097】

非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体を回収する。回収した非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片を正常な立体構造に戻した後、前記と同様の単離精製法により非コアフコシル化ヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域断片の精製標品を得ることができる。

【0098】

（f）非コアフコシル化ヒトＩｇＧの化学合成法
非コアフコシル化ヒトＩｇＧの化学合成法としては、例えば、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖が結合したアスパラギンを用いたペプチドの固相合成法［J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1，vol.3，p.549 (1998)］等により作製したコアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖が結合したヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片と、それ以外の部分のヒトＩｇＧ又はそのＦｃ領域のペプチド断片とをネイティブケミカルライゲーション法［Science，vol.226，p.5186 (1994)］等を用いて連結する方法等が挙げられる。

【0099】

（工程[v]）
工程[v]は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する工程である。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体を採取する方法としては、例えば、前述の工程[iv]の方法で選択されたハイブリドーマを工程[iii]の方法で培養し、得られる培養上清中から、抗体に結合する分子を用いて、該抗体を採取する方法等が挙げられる。

【0100】

工程[v]における抗体に結合する分子としては、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体に結合できる分子であれば特に制限はなく、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に結合する抗体等が挙げられる。

【0101】

［２］コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法
本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いるコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法である。本発明の測定方法の具体的態様を以下に示す。

【0102】

・測定方法１（サンドイッチ法１）
以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体１を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体１と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体の免疫複合体２を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体２を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体２の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体２の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。

【0103】

工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体２の標識物質を測定すればよい。

【0104】

抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ａ－ａの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体。

【0105】

・測定方法２（サンドイッチ法２）
以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体３を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体３と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体４を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体４を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体４の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体４の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。

【0106】

工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体４の標識物質を測定すればよい。

【0107】

Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が不溶性担体に固定化されている場合、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｂ－ｂの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体のＦｃ領域－Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体のＦｃ領域と結合する抗体。

【0108】

・測定方法３（競合法１）
以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質、及び、不溶性担体上に固定化された本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させ、不溶性担体上に、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質の免疫複合体５、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体６を生成させる工程；
（２）工程（１）で不溶性担体上に生成した、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と標識化競合物質の免疫複合体５における標識物質を測定する工程；
（３）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（２）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と標識物質の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４）工程（３）で作成された検量線と、工程（２）で測定された標識物質の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。

【0109】

工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。
工程（１）において、試料と、不溶性担体上に固定化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させた後、該反応の反応液に該標識化競合物質を添加してもよい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｃ－ｃの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合する抗体。

【0110】

・測定方法４（競合法２）
以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料を、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と反応させ、不溶性担体上に、競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体７を生成させる工程；
（２）工程（１）で不溶性担体上に生成した免疫複合体７を測定する工程；
（３）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（２）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体７の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（４）工程（３）で作成された検量線と、工程（２）で測定された免疫複合体７の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。

【0111】

工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていてもよい。標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる場合には、工程（２）において、免疫複合体７の標識物質を測定すればよい。

【0112】

工程（１）において、試料と、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させた後、該反応の反応液に、不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を添加してもよい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｄ－ｄの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン。

【0113】

・測定方法５（抗原特異的なコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法１）
以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗原と試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体８を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体８と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗原、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体９を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体９を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体９の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体９の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。

【0114】

工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体９の標識物質を測定すればよい。

【0115】

コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が不溶性担体に固定化されている場合、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｅ－ｅの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン。

【0116】

・測定方法６（抗原特異的なコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法２）
以下の工程を含有する、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法。
（１）試料と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの免疫複合体１０を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体１０と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原とを反応させて、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコシル化ヒトＩｇＧ、及び、抗原の免疫複合体１１を生成させる工程；
（３）工程（２）で生成した免疫複合体１１を測定する工程；
（４）試料の代わりに既知濃度のコアフコシル化ヒトＩｇＧを用いて前記工程（１）～（３）を行い、コアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度と免疫複合体１１の測定値との関係を表す検量線を作成する工程；
（５）工程（４）で作成された検量線と、工程（３）で測定された免疫複合体１１の測定値とから、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を決定する工程。

【0117】

工程（１）及び工程（２）は順次行っても、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）の間に洗浄工程を挿入してもよい。また、工程（２）と工程（３）の間に洗浄工程を挿入してもよい。工程（１）において、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、固定化されていることが好ましい。コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、標識物質で標識化されていても、標識化されていなくてもよいが、標識化されていることが好ましい。標識化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を用いる場合には、工程（３）において、免疫複合体１１の標識物質を測定すればよい。

【0118】

抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体とを抗原抗体反応の反応液中で反応させることにより、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体を抗原抗体反応の反応液中で生成させることができる。Ｆ－ｆの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体。

【0119】

本発明の測定方法における試料としては、本発明の測定方法を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血（血液）、血球、血清、血漿、髄液、尿、精漿、羊水、唾液、組織、培養細胞が挙げられ、血清及び血漿が好ましい。

【0120】

本発明における、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧとしては、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧであれば特に制限はなく、例えばコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧ、及び、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが含まれる。

【0121】

本発明における、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧのいずれかの部分と結合する抗体であれば特に制限はなく、例えばコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗Ｎ結合型糖鎖抗体等が挙げられる。

【0122】

本発明における、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧの競合物質としては、本発明の前記競合法１又は２による測定方法を可能とする競合物質であれば特に制限はなく、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体が認識するエピトープの構造と同じ構造を有している物質が好ましく、さらに本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体に対する結合の強さが、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体に対するコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧの結合の強さと同程度であるものが好ましい。このような競合物質としては、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧそのものが例示される。

【0123】

コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原としては、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧが結合し得る抗原であれば特に制限はなく、例えば、前述の抗原等が挙げられる。

【0124】

本発明の測定方法は、ドライケミストリーでも溶液中の反応でも適用可能である。本発明の測定方法において、抗原抗体反応、すなわち、測定方法１、２、５、６における工程（１）及び工程（２）、並びに、測定方法３、４における工程（１）における反応温度としては、本発明の測定方法を可能とする反応温度であれば特に制限はなく、通常、０～５０℃であり、４～４０℃が好ましい。反応時間としては、本発明の測定方法を可能とする反応時間であれば特に制限はなく、通常、１分間～７２時間であり、５分間～２０時間が好ましい。

【0125】

洗浄工程において使用される洗浄液としては、本発明における抗原抗体反応の反応液を除去し得る洗浄液であれば特に制限はなく、例えばリン酸緩衝化生理食塩水［０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（以下、ＰＢＳと記す。）］、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等を挙げることができる。該界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。

【0126】

本発明の測定方法における不溶性担体としては、本発明の測定方法を可能とする不溶性担体であれば特に制限はない。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等が挙げられ、９６ウェル／枚のポリスチレン製マイクロタイタープレート等が好ましい。

【0127】

本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の不溶性担体との結合、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と不溶性担体との結合、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と不溶性担体との結合、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と不溶性担体との結合としては、物理吸着、化学結合等が挙げられる。物理吸着としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。

【0128】

本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質は、前述の物理吸着及び／又は化学結合を利用して、直接、不溶性担体に固定化してもよく、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。

【0129】

本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を直接、不溶性担体に固定化する方法としては、例えば本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質の溶液を、不溶性担体であるポリスチレン製マイクロタイタープレートに具備されているウェルに添加して、１時間から１日間、４～３０℃でインキュベートすることにより、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質をウェルに物理吸着させて固定化する方法等が挙げられる。

【0130】

本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を、間接的に不溶性担体に固定化する方法としては、例えばビオチンとアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）との特異的結合を介して、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を不溶性担体に固定化する方法等が挙げられる。また、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。

【0131】

リンカーとしては、例えば、不溶性担体表面の官能基と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が有する官能基の両者を共有結合できる分子であれば特に制限はなく、例えば、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体表面の官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、又は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質の官能基及び不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、例えばカルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えばアリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。

【0132】

測定方法１、２、５及び６における工程（３）において、各測定方法における工程（２）で生成した各免疫複合体（免疫複合体２；免疫複合体４；免疫複合体９；免疫複合体１１）を測定する方法は、各測定方法における工程（２）で生成した各免疫複合体を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、水晶振動子を用いる方法、電極を用いる方法、凝集を測定する方法等が挙げられる。また、測定方法１の工程（２）におけるＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が、標識物質で標識化されたＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体である場合、測定方法２及び測定方法５の工程（２）における本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が、標識物質で標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片である場合、及び、測定方法６の工程（２）におけるコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が、標識物質で標識化されたコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原である場合、工程（３）において、各測定方法における工程（２）で生成した免疫複合体を測定する方法としては、各測定方法における工程（２）で生成した各免疫複合体中の標識物質を測定する方法等が挙げられる。

【0133】

測定方法３における工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体５を測定する方法は、工程（１）で生成した免疫複合体５を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、水晶振動子を用いる方法、電極を用いる方法、凝集を測定する方法、標識物質を測定する方法等が挙げられる。

【0134】

測定方法４における工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体７を測定する方法は、工程（１）で生成した免疫複合体７を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば、水晶振動子を用いる方法、電極を用いる方法、凝集を測定する方法等が挙げられる。また、工程（１）における本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が、標識物質で標識化された抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片である場合、工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体７を測定する方法としては、工程（１）で生成した免疫複合体中の標識物質を測定する方法等が挙げられる。

【0135】

標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等が挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、FITC（フルオレッセイン イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ－イソチオシアナート）等が挙げられる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ［Science，vol.281，p.2016-2018 (1998)］、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質が挙げられる。発光物質としては、例えば、アクリジニウム及びその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem.，vol.37(9)，p.1534-1539 (1991)に示されたものが好ましい。放射性同位元素としては、例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ等が挙げられる。

【0136】

タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、His His His His His His）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等が挙げられる。

【0137】

Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧの競合物質、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原の各物質の標識物質による標識化は、該各物質の官能基と標識物質の官能基との間で、リンカーを介して又は介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等が挙げられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。

【0138】

リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ等のカルボジイミド化合物を用いる方法等が挙げられる。この場合、NHS又はその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性～弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。

【0139】

リンカーとしては、例えば、該各物質の官能基に反応する官能基と、標識物質の官能基に反応する官能基の両方の官能基を分子内に有するものが挙げられ、第２抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子が好ましく、その中でも、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基である分子が特に好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基が挙げられる。

【0140】

放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、例えば文献［Antibody Immunoconj. Radiopharm.，vol.3，p.60 (1990)］記載の方法が挙げられる。

【0141】

標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術［Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)］に従って、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体及び標識物質をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ等でクローニングし、それぞれのＤＮＡをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。

【0142】

検出工程、すなわち、測定方法１、２、５及び６の工程（３）、及び、測定方法３及び４の工程（２）において、測定方法１、２、５及び６の工程（２）で生成した免疫複合体中の標識物質の量、及び、測定方法３及び４の工程（１）で生成した免疫複合体中の標識物質の量を測定する場合、標識物質の量の測定は、標識物質に応じて適切な方法を選択することができる。標識物質が発色物質、すなわち、ある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ－ウェルカウンター等により測定することができる。

【0143】

標識物質が酵素である場合、標識物質の量の測定とは、酵素活性を測定することを意味する。酵素の基質を該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、酵素活性、すなわち、標識物質の量を測定することができる。酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法、発光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素及び酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。

【0144】

ロイコ型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ－フェニレンジアミン、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。

【0145】

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及びペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、３－メチル－２－ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－メチルアニリン、Ｎ，Ｎ－ジ（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ’－アセチルエチレンジアミン、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（Ｆ－ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４－クロロフェノール、３－メチルフェノール、３－ヒドロキシ－２，４，６－トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。

【0146】

蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素及び蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等が挙げられる。該蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。

【0147】

発光法によるペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素及び発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等が挙げられる。該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等が挙げられる。

【0148】

酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば３－（２'－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３'－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２－クロロ－５－｛４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２'－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン］－４－イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ－Ｓｔａｒ（登録商標））、３－｛４－メトキシスピロ［１，２－ジオキセタン－３，２'－（５'－クロロ）トリシクロ［３．３．１．１^３，７］デカン］－４－イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤ（登録商標））、９－［（フェニルオキシ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］－１０－メチルアクリダン・二ナトリウム、９－［（４－クロロフェニルチオ）（ホスホリルオキシ）メチリデン］－１０－メチルアクリダン・二ナトリウム（Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標） ＡＰＳ－５）等が挙げられる。

【0149】

酵素がβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法又は蛍光法等によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、β－Ｄ－ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としては、例えば、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等が挙げられる。発光法によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ－Ｄ－ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン－プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］又はその類似化合物等が挙げられる。蛍光法によりβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ－Ｄ－ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。β－Ｄ－ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド等が挙げられる。

【0150】

酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等が挙げられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等が挙げられる。

【0151】

標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素及び酵素以外の物質（物質Ａとする）である場合は、物質Ａに特異的に結合する物質（物質Ｂ）を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識化物質Ｂと、検出工程で生成した物質Ａを含有する免疫複合体とを反応させて、物質Ａ及び標識化物質Ｂを含有する免疫複合体を生成させて、生成したこの免疫複合体中の標識化物質Ｂの量を前述の方法により測定することにより、試料中の測定対象成分を測定することができる。物質Ｂとしては、例えば物質Ａに対する抗体、アビジン（物質Ａが、ビオチンの場合）、ストレプトアビジン（物質Ａが、ビオチンの場合）、ビオチン（物質Ａが、アビジン、ストレプトアビジンの場合）等が挙げられる。物質Ａに対する抗体としては、抗体フラグメントでもよく、抗体フラグメントとしては、例えば前述のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’等が挙げられる。

【0152】

本発明の測定方法において、抗原抗体反応、すなわち、測定方法１、２、５及び６の工程（１）及び工程（２）、及び、測定方法３及び４の工程（１）は水性媒体中で行われてもよい。また、本発明の測定方法において、検出工程は水性媒体中で行われてもよい。本発明の測定方法において使用される水性媒体としては、本発明の測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１～１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。

【0153】

グッド緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２－［Ｎ－（２－アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２－｛Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（２－スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３－［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２－ヒドロキシ－３－｛［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパン－３－スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ’－（３－スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３－（Ｎ－シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。

【0154】

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１～０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。

【0155】

本発明の測定方法においては、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を共存させることができる。金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等が挙げられる。糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等が挙げられる。蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等が挙げられる。蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等が挙げられる。

【0156】

［３］コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬
本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬は、本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの測定方法に用いられる試薬であり、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有することを特徴とする試薬である。本発明の測定試薬の具体的態様を以下に示す。

【0157】

・測定試薬１
本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。

【0158】

・測定試薬２
不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｇ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｇ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｇとｇの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチン－アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）；
・アビジン類（アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等）－ビオチン；
・抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域－Ｆｃ領域と結合する抗体。

【0159】

・測定試薬３
本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。

【0160】

・測定試薬４
不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、標識物質により標識化されていることが好ましい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ａとａの組み合わせとしては、例えば前述のＡとａの組み合わせ等が挙げられる。

【0161】

・測定試薬５
不溶性担体に固定化された、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、及び、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていることが好ましい。また、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体は、試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とが含まれる。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｂとｂの組み合わせとしては、例えば前述のＢとｂの組み合わせ等が挙げられる。

【0162】

・測定試薬６
不溶性担体上に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｃとｃの組み合わせとしては、例えば前述のＣとｃの組み合わせ等が挙げられる。

【0163】

・測定試薬７
不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、及び、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていてもよい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば前述のＤとｄの組み合わせ等が挙げられる。

【0164】

・測定試薬８
本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。

【0165】

・測定試薬９
不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、及び、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体は、試料と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＥとｅの組み合わせ等が挙げられる。

【0166】

・測定試薬１０
不溶性担体上に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、及び、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含む、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定試薬。
コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定試薬には、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体の代わりに、一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体とが含まれる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば前述のＦとｆの組み合わせ等が挙げられる。

【0167】

本発明の測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点から、キットの形態を取ることもできる。キットの形態としては、例えば２試薬系キット、３試薬系キット等が挙げられる。本発明の測定キットの具体的態様を以下に示す。

【0168】

・測定キット１
本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第２試薬とを含むキット。

【0169】

・測定キット２
不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第２試薬とを含むキット。
Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体は、標識物質により標識化されていることが好ましい。抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット３の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ａとａの組み合わせとしては、例えば前述のＡとａの組み合わせ等が挙げられる。

【0170】

・測定キット３
一組の親和性物質の片方（Ａ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ａ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第３試薬とを含むキット。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ａとａの組み合わせとしては、例えば前述のＡとａの組み合わせ等が挙げられる。

【0171】

・測定キット４
不溶性担体に固定化された、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第１試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第２試薬とを含むキット。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていることが好ましい。Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体が固定化された不溶性担体は、試料と、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット５の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｂとｂの組み合わせとしては、例えば前述のＢとｂの組み合わせ等が挙げられる。

【0172】

・測定キット５
一組の親和性物質の片方（Ｂ）が結合した、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｂ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第３試薬とを含むキット。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｂとｂの組み合わせとしては、例えば前述のＢとｂの組み合わせ等が挙げられる。

【0173】

・測定キット６
不溶性担体に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質を含む第２試薬とを含有するキット。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット７の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｃとｃの組み合わせとしては、例えば前述のＣとｃの組み合わせ等が挙げられる。

【0174】

・測定キット７
一組の親和性物質の片方（Ｃ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｃ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質に標識物質が結合した標識化競合物質を含有する第３試薬とを含むキット。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｃとｃの組み合わせとしては、例えば前述のＣとｃの組み合わせ等が挙げられる。

【0175】

・測定キット８
不溶性担体に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を含有する第１試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第２試薬とを含むキット。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質により標識化されていてもよい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質が固定化された不溶性担体は、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット９の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば前述のＤとｄの組み合わせ等が挙げられる。

【0176】

・測定キット９
一組の親和性物質の片方（Ｄ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｄ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第３試薬とを含むキット。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｄとｄの組み合わせとしては、例えば前述のＤとｄの組み合わせ等が挙げられる。

【0177】

・測定キット１０
本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第２試薬とを含むキット。

【0178】

・測定キット１１
不溶性担体上に固定化された、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第１試薬と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第２試薬とを含むキット。
抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原が固定化された不溶性担体は、試料とコアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット１２の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＥとｅの組み合わせ等が挙げられる。

【0179】

・測定キット１２
一組の親和性物質の片方（Ｅ）が結合した、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｅ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第３試薬とを含むキット。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｅとｅの組み合わせとしては、例えば前述のＥとｅの組み合わせ等が挙げられる。

【0180】

・測定キット１３
不溶性担体上に固定化された、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第２試薬とを含有するキット。
コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原は、標識物質で標識化されていることが好ましい。また、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化された不溶性担体は、試料と抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片との反応の反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の測定キットには、一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体とがそれぞれ別の試薬に含まれることが好ましく、例えば測定キット１４の態様が挙げられる。一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば前述のＦとｆの組み合わせ等が挙げられる。

【0181】

・測定キット１４
一組の親和性物質の片方（Ｆ）が結合した抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を含有する第１試薬と、一組の親和性物質のもう一方（ｆ）が結合した不溶性担体を含有する第２試薬と、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原を含有する第３試薬とを含むキット。
一組の親和性物質の組み合わせ、すなわち、Ｆとｆの組み合わせとしては、例えば前述のＦとｆの組み合わせ等が挙げられる。
本発明の測定試薬及び測定キットにおける抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、標識物質、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、不溶性担体としては、例えば前述の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片、Ｎ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒトＩｇＧに結合する抗体、コアフコシル化ヒトＩｇＧの競合物質、標識物質、コアフコシル化ヒトＩｇＧが反応する抗原、不溶性担体がそれぞれ挙げられる。

【0182】

本発明の測定試薬及び測定キットは、必要に応じて、水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を含有することができる。水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤としては、例えば前述の水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等がそれぞれ挙げられる。本発明の測定試薬及び測定キットの形態としては、本発明の測定方法を可能とする形態であれば特に制限はなく、例えば溶液形態、凍結乾燥形態等の形態を取ることができる。

【0183】

［４］コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法
本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いる精製方法である。本発明のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製方法は、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片を用いて、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製できれば特に制限はなく、例えば以下の工程を含む精製方法等が挙げられる。
（１）試料と、本発明の抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片とを反応させて、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧと抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を生成させる工程；
（２）工程（１）で生成した免疫複合体から、コアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させる工程；
（３）工程（２）で遊離したコアフコシル化ヒトＩｇＧを回収する工程。

【0184】

抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片は、不溶性担体に固定化されていても、固定化されていなくてもよいが、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。すなわち、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化されている不溶性担体は、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧの精製に好適に使用される。試料としては、例えば前述の試料等が挙げられる。不溶性担体としては、例えば前述の不溶性担体等が挙げられる。

【0185】

抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、工程（１）と工程（２）の間に、抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が固定化されている不溶性担体に結合した試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ以外の物質を洗浄液で洗い流す工程が含まれていてもよい。洗浄液としては、不溶性担体上に生成した、コアフコシル化ヒトＩｇＧと抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片の免疫複合体を安定に保持し、不溶性担体から該免疫複合体を遊離させることなく、試料中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ以外の物質を洗い流すことができる洗浄液であれば特に制限はなく、例えばＰＢＳ緩衝液等が挙げられる。

【0186】

抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体又は該抗体断片が不溶性担体に固定化されている場合、工程（２）において、工程（１）で生成した免疫複合体からコアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させるために溶離液が使用される。溶離液としては、工程（１）で生成した免疫複合体を遊離させることなく、該免疫複合体からコアフコシル化ヒトＩｇＧを遊離させる溶液であれば特に制限はなく、例えばグリシン－塩酸溶液等が挙げられる。

【0187】

工程（３）において、遊離したコアフコシル化ヒトＩｇＧを回収し、精製されたコアフコシル化ヒトＩｇＧを得ることができる。

【実施例】

【0188】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、以下の実施例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。

【0189】

Ｔｒｉｓ（和光純薬工業社製）、ＥＤＴＡ（同仁化学研究所社製）、塩化カリウム（和光純薬工業社製）、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、リン酸水素二ナトリウム（関東化学社製）、リン酸二水素ナトリウム（関東化学社製）、リン酸二水素カリウム（和光純薬工業社製）、塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）、クマシー・ブリリアント・ブルー（ナカライテスク社製）、ＢＳＡ（プロライアント社製）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート；関東化学社製）、ＴＭＢ－ＯＮＥ（主成分：３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン；ケム・エン・テック社製）、０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸（和光純薬工業社製）、過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、エチレングリコール（和光純薬工業社製）、グリシン（関東化学社製）、炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、クエン酸（和光純薬工業社製）、クエン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）、重炭酸アンモニウム（和光純薬工業社製）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール；シグマアルドリッチ社製）、ヨードアセトアミド（和光純薬工業社製）、塩酸（和光純薬工業社製）、酢酸（和光純薬工業社製）、アセトニトリル（和光純薬工業社製）、グアニジン（和光純薬工業社製）、トリエチルアミン（和光純薬工業社製）、メタノール（和光純薬工業社製）、無水酢酸（和光純薬工業社製）、ＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）、ＭＴＴ（１－メチル－３－ｐ－トリルトリアゼン、東京化成工業社製）。

【0190】

［参考例１］抗原の調製
（１）抗原発現ベクターの調製
（１－１）変異型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を有するベクターｐＢＳｈＣγ４ＳＰの構築
国際公開第１９９７／１０３５４号に記載の野生型ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＳｈＣγ４を用いて、野生型ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域（ヒンジ領域）の１０８番目のＳｅｒがＰｒｏに置換された変異型ヒトＩｇＧ４サブクラスの定常領域を有するプラスミドｐＢＳｈＣγ４ＳＰを構築した。
本改変を行うことによりＩｇＧヒンジ領域を介した２量体形成が安定化することが知られている（モレキュラー・イムノロジー、３０，１０５，１９９３）。

【0191】

鋳型としてプラスミドｐＢＳｈＣγ４の１ｎｇを含む５０μＬの反応液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ ゼラチン、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、０．５μＭ Ｐｒｉｍｅｒ１、０．５μＭ Ｐｒｉｍｅｒ２及び２ｕｎｉｔｓのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］を調製し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（パーキンエルマー社製）を用いて９４℃にて２分間、５５℃にて２分間、７２℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行った。

【0192】

該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従い精製した後、制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉ（タカラバイオ社製）で処理し、０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて添付の使用説明書に従い、増幅断片を回収した。

【0193】

プラスミドｐＢＳｈＣγ４を制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉで切断後、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ社製）処理により５’末端のリン酸を除去し、同様に０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて添付の使用説明書に従い、プラスミド断片を回収した。前記で回収した増幅断片とプラスミドｐＢＳｈＣγ４由来のプラスミド断片を連結し、目的のｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳｈＣγ４ＳＰを構築した。

【0194】

（１－２）ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域の部分配列を含むｃＤＮＡのクローニング
以下に示すＰＣＲを行うことにより、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩサイト、３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域をコードするＤＮＡ断片を増幅した。０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウムを含む反応液に、前記（１－１）で構築したｐＢＳｈＣγ４ＳＰ ２５ ｎｇ、１μｍｏｌ／Ｌ 前記の制限酵素サイトを有するヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域をコードするＤＮＡ断片を特異的に増幅する２種類のプライマー、及び２．５単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲを行った。

【0195】

反応条件は９８℃ １５秒間、６８℃ ３０秒間のサイクルを２５サイクルで行った。該反応液を２％アガロースゲル電気泳動で分離後、約７００ ｂｐのＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて添付の使用説明書に従ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔベクターに導入した。本プラスミドをｐＣＲＩｇＧ４ＦｃＮｏｔＩＢａｍＨＩとした。

【0196】

（１－３）ＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡの合成
５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素サイトを有するＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ断片を、固相合成法により合成した。

【0197】

（１－４）動物細胞用発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ ＸｈｏＩ／ＳａｌＩの構築
国際公開第１９９７／１０３５４号に記載されているヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＸｈｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約９．８ ｋｂｐのプラスミド断片を回収した。回収したＤＮＡ断片の５’及び３’末端をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。

【0198】

得られた複数のアンピシリン耐性コロニーより、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて組換えプラスミドＤＮＡを単離し、抗体軽鎖の発現ユニットが除かれていることを制限酵素ＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）及びＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）消化により確認した。該プラスミドをｐＫＡＮＴＥＸ ＸｈｏＩ／ＳａｌＩと命名した。

【0199】

（１－５）ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧの作製
前記（１－２）で作製したｐＣＲＩｇＧ４ＦｃＮｏｔＩＢａｍＨＩを、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化することにより得られる断片、及び、前記（１－３）で作製した、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩサイト、３’末端にＳａｌＩ制限酵素サイトを有するＦＬＡＧタグをコードするＤＮＡ断片を、前記（１－４）で得られたｐＫＡＮＴＥＸ ＸｈｏＩ／ＳａｌＩをＮｏｔＩ及びＳａｌＩ消化して得られる約８．８ｋｂｐのＤＮＡ断片に連結することにより、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に、該ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域のＣ末端にＦＬＡＧタグを付加した融合蛋白質を発現するためのプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを得た（図２）。

【0200】

該ｐＫＡＮＴＥＸ ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを、公知の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）で大腸菌ＤＨ５αに導入した。アンピシリン耐性を獲得した大腸菌ＤＨ５αを１００ｍＬのＬＢ培地（ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス社製）に播種し、３７℃で１２時間培養を行った後に菌体を回収し、Ｑｉａｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ(キアゲン社製)を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。該プラスミドＤＮＡ ３０μｇを、制限酵素ＢｓｐＥＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いて３７℃で１２時間反応させ、線状化した。線状化後、フェノール・クロロフォルム抽出処理及びエタノール沈殿を行い、回収した該線状化ＤＮＡを、プラスミド溶解液［１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ］に溶解し、抗原発現ベクターを調製した。

【0201】

（２）抗原ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧの発現
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，８７，６１４（２００４）に記載の方法に従い、ＣＨＯ細胞のゲノム上のすべてのＦｕｔ８をコードする遺伝子をすべて破壊したＦｕｔ８ノックアウトＣＨＯ細胞（以下、Ｆｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞と記載する）を樹立した。樹立したＦｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞及びその親株であるＣＨＯ細胞に、エレクトポレーション法により（１）で調製した抗原発現ベクター、すなわち、線状化プラスミドＤＮＡ ｐＫＡＮＴＥＸ ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを導入した。エレクトロポレーション法による遺伝子導入は以下の手順で行った。基本培地［１０％（ｖ／ｖ） ウシ胎児血清（インビトロジェン社製)、５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）］で継代した各ＣＨＯ細胞を、Ｋ－ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カリウム、２．７ ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、８．１ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸水素二ナトリウム、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸二水素カリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウム］に懸濁して８×１０^６個／ｍＬとし、細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液２００μＬ（１．８×１０^６個）を前記（１）で調製した線状化プラスミドＤＮＡ ｐＫＡＮＴＥＸ ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ １０μｇと混合した。この細胞－ＤＮＡ混合液を電極間距離が２ｍｍであるＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ(バイオラッド社製)へ移した後、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ(バイオラッド社製)を用いて、パルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。この細胞懸濁液を基本培地１０ｍＬに混和し、７５ｃｍ^２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター内で培養を行った。３日間培養した後、Ｇ４１８（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して、さらに１０日間培養した。１０日後、１８２ｃｍ^２接着細胞用フラスコ（グライナー社製）に継代し、コンフルエントになるまで培養を続けた。コンフルエントになった時点で、ＣＨＯ細胞用無血清培地Ｈｙｃｌｏｎｅ ＣＤＭ４ＣＨＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に培地交換を行い、１週間培養後に培養上清を回収した。

【0202】

（３）抗原ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧの精製
（２）で培養を行った培養上清を、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心分離し、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径セルロースアセテートメンブレン（コーニング社製）を用いて上清を濾過した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）をＰＢＳ緩衝液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含有する、１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）］で平衡化後、濾過済み培養上清をカラムに通塔し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａに結合したｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを０．１ｍｏｌ／Ｌ グリシン－ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを含む溶出液の溶媒を、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）でＰＢＳ緩衝液に置換後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧのアミノ酸配列から導かれるモル吸光係数を用いてｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ濃度を算出した。ＣＨＯ細胞及びＦｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞の約３００ｍＬの培養上清から、それぞれ約５ｍｇのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを得た。精製したｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ ２．５μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動し、クマシー・ブリリアント・ブルーで染色した結果を図３に示す。いずれの細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧも、還元条件下においては分子量約３０ｋＤａの位置にバンドが観察された。また非還元条件においては、還元条件でみられたバンドの約２倍の分子量を示す位置にバンドが観察されたことから、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧは２量体として存在していることがわかった。

【0203】

（４）精製ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧのレクチン反応性
前記（３）で精製した、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ及びＦｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにおけるＮ結合型糖鎖及びコアフコースの有無を確認するため、ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する各種レクチンの反応性を解析した。それぞれのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧをＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルのＥＩＡ用プレート（ヌンク社製）に該ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置し、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相化されたウェル、又はＦｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相化されたウェルを作製した。この際、ＰＢＳ緩衝液のみを５０μＬ分注したウェルを用意し、ブランク用ウェルとした。ついで、各ウェルにブロッキング液［１％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含有する、１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）］を２００μＬ／ウェル分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。その後ブロッキング液を捨て、３５０μＬの洗浄液［０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウムを含有する、１０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）］で３回洗浄した後、試料希釈液［ブロッキング液を洗浄液で１０倍に希釈した溶液］で５，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識レンズマメレクチン（以下、ＬＣＡレクチンと記載する。Ｊ－オイルミルズ社製）、又は５，０００倍希釈したビオチン標識ヒイロチャワンタケレクチン（以下、ＡＡＬレクチンと記載する。Ｊ－オイルミルズ社製）、又は２，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識コンカナバリンＡレクチン（以下、ＣｏｎＡレクチンと記載する。Ｊ－オイルミルズ社製）、又は１，０００倍に希釈したぺルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体（シグマアルドリッチ社製）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１時間静置した。ビオチン標識ＡＡＬレクチンを分注したウェルについてのみ、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１時間静置した。その後、全てのウェルを３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダー（Ｅｍａｘ、モレキュラーデバイス社製）を用いて反応の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。結果を図４に示す。本実験で使用したＬＣＡレクチン及びＡＡＬレクチンはコアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖に結合する性質を有し、ＣｏｎＡレクチンはコアフコースの有無に関わらずＮ結合型糖鎖に結合する性質を有する。図４において、ＣｏｎＡレクチンはいずれのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにも反応し、ＬＣＡレクチン、ＡＡＬレクチンはＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにのみ反応したことから、いずれのｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにもＮ結合型糖鎖は存在するが、コアフコースはＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにのみ存在し、Ｆｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧには存在しない事がわかった。すなわち、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧは、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖を持ち、Ｆｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧはコアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖を持つことが判明した。以下、ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧをコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、Ｆｕｔ８ＫＯ ＣＨＯ細胞由来のｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧと称する。

【0204】

［実施例１］抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の産生
（１）動物への免疫と抗体産生細胞の調製
Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，vol.102，p.15791 (2005)に記載の方法に従い、ゲノム上のすべてのＦｕｔ８をコードする遺伝子を破壊したＦｕｔ８ＫＯマウスを作出し、このＦｕｔ８ＫＯマウスを免疫対象動物として使用した。参考例１で調製したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ ５０μｇを、２ｍｇのアルミニウムゲル（コスモ・バイオ社製）及び百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０^９細胞とともに、作出した６週齢のＦｕｔ８ＫＯマウスに投与し、さらに２週間後、３週間後、４週間後に５０μｇのコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを１回ずつ投与した（計４回投与）。免疫を終了したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。脾臓をＲＰＭＩ培地（ギブコ社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍ、５分間、２５℃で遠心分離した後、上清を捨て、赤血球溶解バッファー（シグマアルドリッチ社製）で１～２分間処理して赤血球を除去し、ＲＰＭＩ培地で３回洗浄して脾臓細胞を取得し、細胞融合に用いた。

【0205】

（２）マウス骨髄腫細胞の調製
マウス骨髄腫細胞として８－アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｕ１を用意し、ＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）を用いて２×１０^７個以上の細胞が得られるまで培養した。

【0206】

（３）細胞融合
前記（１）で得られた脾臓細胞と前記（２）で得られた骨髄腫細胞とを、１０：１の細胞数の比になるよう混合した後、該細胞混合液を１２００ｒｐｍ、５分間、２５℃で遠心分離した。該細胞混合液から上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした。この細胞混合液を２５℃で攪拌しながら、該細胞混合液に１ｍＬのＰＥＧ１５００（ロシュ社製）を１分間かけて添加した。その後、１分間毎にＲＰＭＩ培地１～２ｍＬを４回加えた後、全量が５０ｍＬになるようにＲＰＭＩ培地を加えた。該細胞液を９００ｒｐｍ、５分間、２５℃で遠心分離した後、上清を捨て、細胞を３７℃に温めた選択培地［１０％（ｖ／ｖ） ＢＭ－ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（ロシュ社製）、２％（ｖ／ｖ） ＨＡＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×、ギブコ社製）を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業社製）］１００ｍＬ中で穏やかに懸濁した。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃ で１０～１４日間培養した。

【0207】

（４）ハイブリドーマ株の選択
参考例１で取得したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ及び非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で 各５μｇ／ｍＬに調製し、９６ウェルＥＩＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注した。２５℃で１２時間静置し、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相化されたウェル、及び非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧが固相されたウェルを作製した。この際、ＰＢＳ緩衝液のみを５０μＬ分注したウェルを用意し、ブランク用ウェルとした。抗原溶液を除去した後、参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェルで分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、参考例１（４）記載の試料希釈液で１００倍に希釈したハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し、２５℃で１時間静置した。希釈ハイブリドーマ培養上清を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、２５℃で１時間静置した。標識抗体希釈液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸を５０μＬ／ウェル添加した後、プレートリーダーを用いて反応液の吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを固相したウェルで強く発色し、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを固相したウェルで弱く、あるいは発色しないハイブリドーマ株を選択し、限界希釈法により２回のクローニングを繰り返した。その結果、ハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－４Ｅ１１、１８－４Ｆ１１、１８－６Ａ７、１８－６Ｄ４、１８－６Ｆ９、１８－９Ｅ１０、１８－１０Ｇ１、１８－１１Ｅ５、１８－１２Ｆ７、２５－４Ｆ５、２５－４Ｈ７、２５－４Ｈ８の１４株を得た。ハイブリドーマ株１８－３Ｄ１１は、２０１６年８月３０日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ－０２３４２として寄託され、２０１７年８月４日付で受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２３４２として受託されている。プレートに固相したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する各ハイブリドーマ株培養上清の反応性を図５に示す。なお、図５に示した「抗ＦＬＡＧ抗体」のグラフは、ハイブリドーマ株上清及びペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに、ペルオキシダーゼ標識抗ＦＬＡＧ抗体を用いた結果を示したグラフであり、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧがほぼ同量プレートに固相されていることを示している。

【0208】

（５）抗体クラス・サブタイプ・軽鎖タイプの同定
（４）で取得したハイブリドーマ株の培養上清を用いて、各ハイブリドーマ株が産出する抗体の抗体クラス（アイソタイプ）、サブクラス、軽鎖タイプを、ＩｓｏＱｕｉｃｋモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット マウス用（シグマアルドリッチ社製）を用いて判定した。判定結果を表１に示す。

【0209】

【表1】

【0210】

［実施例２］抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の反応性解析
（１）ビアコアによるｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性解析
蛋白質は、プレートに固相することで変性し、特殊な立体構造をとることが一般的に知られている。そのため、プレートに固相した抗原には反応するものの、非固相状態の抗原（すなわち、プレートに固相化せずに、溶液中に存在する抗原）には反応しない抗体を取得してしまうことが度々生じる。実施例１で取得したハイブリドーマ株が産生する抗体が、非固相状態のコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧにも反応するか、加えて非固相状態においてもコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧと非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを明確に区別する抗体であるか、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００ （ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を使用し、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）により解析した。

【0211】

Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に同封のＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ） ａｎｔｉｂｏｄｙを、添付のプロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に固定化した。参考例１で取得したコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ、又は非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧを、固定化したＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ） ａｎｔｉｂｏｄｙに捕捉させた後、ハイブリドーマ株の培養上清をセンサーチップ上に流し、センサーチップ上に捕捉された各ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧに対する反応性を評価した。結果を図６に示す。（４）の結果と同様に、いずれのハイブリドーマ株由来の抗体も、コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ（実線）に反応するが、非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ（破線）には反応しないことが判明した。なお、図６の右下に示した「抗ヒトＩｇＧ抗体とｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧとの反応」のグラフは、センサーチップ上に固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体に捕捉されたコアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ量及び非コアフコシル化ｈＩｇＧ４Ｆｃ－ＦＬＡＧ量がほぼ同量であることを示している。

【0212】

（２）天然コアフコシル化抗原に対する反応性
実施例１で取得したハイブリドーマ株の培養上清を用いて、各ハイブリドーマ株が産生する抗体の、天然コアフコシル化抗原に対する反応性を抗原固相ＥＬＩＳＡで評価した。
天然コアフコシル化抗原として、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖で修飾されていることが公知である、ヒト母乳由来ラクトフェリン（シグマアルドリッチ社製）、ウシ血液由来サイログロブリン（シグマアルドリッチ社製）、ヒト血液由来ＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）を用いた。該天然コアフコシル化抗原を、参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調製し、参考例１と同様の方法で、各抗原が固相化されたウェルを作製した。参考例１（４）記載の試料希釈液で１００倍希釈したハイブリドーマ株の培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。希釈されたハイブリドーマ培養上清を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。標識抗体希釈液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸を５０μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。結果を図７に示す。取得したハイブリドーマ株が生産する抗体は、天然ヒトＩｇＧのコアフコースには反応するが、ヒトラクトフェリン、ウシサイログロブリンのコアフコースには反応しないことが判明した。なお、図７に示した「ＬＣＡレクチン」のグラフは、ペルオキシダーゼ標識ＬＣＡレクチンをハイブリドーマ培養上清及びペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに用いた結果を示す。

【0213】

（３）抗体クラス（アイソタイプ）に対する反応性
ヒトの抗体クラス（アイソタイプ）、ウサギＩｇＧに対する反応性を抗原固相ＥＬＩＳＡで評価した。ヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）、ヒト免疫グロブリンＡ（リーバイオソリューションズ社製）、ヒト免疫グロブリンＭ（イムノリージェント社製）、ウサギＩｇＧ（ダコ社製）を参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調整した。この各抗原溶液を９６ウェルのＥＩＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置して抗原をプレートに固相した。抗原溶液を除去し、次いで参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェル分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、参考例１（４）記載の試料希釈液で１０倍希釈したハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－１２Ｆ７の培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。希釈したハイブリドーマ培養上清を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。標識抗体希釈液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。結果を図８に示す。評価したハイブリドーマ株が生産する抗体は、ヒトＩｇＧのコアフコースには反応するが、ヒト免疫グロブリンＡ、ヒト免疫グロブリンＭ、ウサギＩｇＧのコアフコースには反応しないことが判明した。なお、図８に示した「ＬＣＡレクチン」のグラフは、ペルオキシダーゼ標識ＬＣＡレクチンをハイブリドーマ培養上清及びペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりに用いた結果を示す。

【0214】

（４）ヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性
ヒトＩｇＧの各サブクラスに対する反応性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を使用し、表面プラズモン共鳴法にて解析した。Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔに同封のＡｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ） ａｎｔｉｂｏｄｙを添付プロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップに固定化した。ヒトＩｇＧ１（フィッツジェラルド社製）、ヒトＩｇＧ２（フィッツジェラルド社製）、ヒトＩｇＧ３（フィッツジェラルド社製）、ヒトＩｇＧ４（フィッツジェラルド社製）をセンサーチップ上に固定化したマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体に捕捉させた後、ハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－１２Ｆ７の培養上清をセンサーチップ上に流し、各ヒトＩｇＧサブクラスに対する反応性を評価した。結果を図９に示す。いずれのハイブリドーマ株由来の抗体も、すべてのヒトＩｇＧサブクラスに結合することが判明した。なお、図９に示した「抗ヒトＩｇＧ抗体と各サブクラスヒトＩｇＧとの反応」のグラフは、センサーチップ上に固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体に捕捉された各ヒトＩｇＧサブクラス抗原量を示している。

【0215】

（５）過ヨウ素酸ナトリウムによる、コアフコースを変性させたヒトＩｇＧの調製
前記（２）、（３）、（４）で明らかになった、天然ヒトＩｇＧに対する反応性が、コアフコースに依存したものであるかを確認するため、以下のようにして過ヨウ素酸ナトリウム処理によりコアフコースのジオール構造を酸化開裂し、コアフコースを変性させたヒトＩｇＧを調製した。

【0216】

参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で調製した２ｍｇ／ｍＬの各サブクラスのヒトＩｇＧ（ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４）溶液１００μＬに、２００ｍｍｏｌ／Ｌ 過ヨウ素酸ナトリウム溶液を１０μＬ、ＰＢＳ緩衝液を９０μＬ加え、４℃で１２時間インキュベートした。その後、エチレングリコール溶液を２００μＬ加えて反応を停止した。過ヨウ素酸ナトリウム処理によるコアフコースの変性を確認するため、ＬＣＡレクチンの反応性を評価した。過ヨウ素酸ナトリウム処理した各サブクラスのヒトＩｇＧをＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルのＥＩＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置して抗原をプレートに固相した。抗原溶液を除去し、次いで参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェル分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、参考例１（４）記載の試料希釈液で１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ＬＣＡレクチン、あるいは試料希釈液で１０，０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェル分注し、２５℃で１時間静置した。希釈標識レクチン、抗体溶液を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回洗浄した後、ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。得られた結果を図１０に示す。過ヨウ素酸ナトリウム処理により、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４へのＬＣＡレクチン反応性がほぼ消失したことがわかった。これにより、過ヨウ素酸ナトリウム処理により、コアフコースが変性したヒトＩｇＧが調製されたことが確認された。

【0217】

（６）過ヨウ素酸ナトリウム処理したヒトＩｇＧに対する反応性
前記（５）で調製した過ヨウ素酸ナトリウム処理した各ヒトＩｇＧ各サブクラス抗原、すなわちコアフコースが変性したヒトＩｇＧを用いて、実施例１で取得したハイブリドーマ株が産生する抗体のヒトＩｇＧに対する反応性が、コアフコース依存的であるかを、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００を使用し、表面プラズモン共鳴法により解析した。Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔに同封のマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体を添付プロトコールに従い、アミンカップリング法によりＣＭ５センサーチップに固定化した。過ヨウ素酸ナトリウム処理した、あるいは処理していないヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４を、センサーチップ上に固定化したマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体に捕捉させた後、ハイブリドーマ株１８－２Ｄ３、１８－３Ｄ１１、１８－１２Ｆ７の培養上清をセンサーチップ上に流し、過ヨウ素酸ナトリウム処理された、あるいはされていない各ヒトＩｇＧサブクラス抗原に対する反応性を評価した。結果を図１１に示す。いずれのハイブリドーマ株由来の抗体においても、コアフコースが変性したヒトＩｇＧに対する反応性はほぼ消失、あるいは大きく減衰した。なお、図１１の最下段に示した「抗ヒトＩｇＧ抗体と各サブクラスヒトＩｇＧとの反応」のグラフは、センサーチップ上に固定化したヒトＩｇＧのＦｃ領域に対する抗体に捕捉された、過ヨウ素酸ナトリウム処理された各サブクラスのヒトＩｇＧ、及び、過ヨウ素酸ナトリウム処理されていない各サブクラスのヒトＩｇＧの量を示す。これにより、実施例１で取得したハイブリドーマ株が産生するモノクローナル抗体が、コアフコース依存的にヒトＩｇＧに反応する抗体であることが確認された。

【0218】

［実施例３］コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製
（１）抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の精製
実施例１で取得したハイブリドーマ株の内、１８－３Ｄ１１株を５２０ｍＬのハイブリドーマ用無血清培地Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＦＭ４ＭＡｂ－Ｕｔｉｌｉｔｙ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で培養し、培養上清を回収した。３０００ｒｐｍ、１０分間、２５℃で遠心分離を行い、上清を回収した後、０．２２μｍ孔径セルロースアセテートメンブレンを用いて上清を濾過し、最終濃度３ｍｏｌ／Ｌとなる様に塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）を添加し、ｐＨ８．９に調整した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で平衡化した後、濾過済みの前記上清をカラムに通塔した。その後、ＰＢＳ緩衝液でカラムを洗浄し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａに結合した１８－３Ｄ１１株由来の抗体（以下、１８－３Ｄ１１抗体と記載する）を、０．１ｍｏｌ／Ｌ グリシン－ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．７）を通過させることによりで溶出した。その後、ＰＤ－１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いて、１８－３Ｄ１１抗体を含む溶出液の溶媒をＰＢＳ緩衝液に置換した後、ＰＢＳ緩衝液に置換された１８－３Ｄ１１抗体溶液の２８０ｎｍの吸光度を吸光光度計（Ｕ－３０００、日立製作所社製）で測定し、モル吸光係数１．４として１８－３Ｄ１１抗体濃度を算出し、約２．５ｍｇの１８－３Ｄ１１抗体を得た。

【0219】

（２）コアフコシル化ヒトＩｇＧ親和性精製カラムの調製
コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の標準物質として用いるコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製するための親和性カラムを以下のようにして調製した。前記（１）で精製した１８－３Ｄ１１抗体２ｍｇを、ＰＤ－１０カラムを用いてカップリング溶液［０．２ｍｏｌ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．３］に置換し、１．６８ｍｇ／ｍＬの抗体溶液を調製した。「はじめてのリガンドカップリングハンドブック」（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）に記載の方法に従い、この抗体溶液１ｍＬをＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）にカップリングした。算出したカップリング効率は９０．３％であった。

【0220】

（３）コアフコシル化ヒトＩｇＧの精製
前記（２）で調製したアフィニティーカラムを用いて、ヒト血液から精製されたヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）から、以下のようにしてコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製した。アフィニティーカラムを１０ｍＬの参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で平衡化し、ＰＢＳ緩衝液で１．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整したヒトＩｇＧ６ｍＬをカラムに添加した。１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液でカラムを洗浄後、５ｍＬのクエン酸緩衝液［０．１ｍｏｌ／Ｌ クエン酸（和光純薬工業社製）溶液と０．１ｍｏｌ／Ｌ クエン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）溶液をｐＨ３．７になる様に混合した緩衝液］をカラムに添加し、カラムに結合したコアフコシル化ヒトＩｇＧを溶出した。この操作を複数回繰り返し、最終的に約２８０μｇのコアフコシル化ヒトＩｇＧを精製した。

【0221】

［実施例４］コアフコシル化ヒトＩｇＧの糖鎖構造解析
（１）コアフコシル化ヒトＩｇＧからのＮ結合型糖鎖の分離
実施例３で精製したコアフコシル化ヒトＩｇＧの溶媒を、ＰＤ－１０カラムを用いて参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液に置換した後、限外濾過により濃縮して２．１ｍｇ／ｍＬのコアフコシル化ヒトＩｇＧ溶液を調製した。このコアフコシル化ヒトＩｇＧ試料５０μＬに、５μＬの１ｍｏｌ／Ｌ 重炭酸アンモニウム水溶液、５μＬの１２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ水溶液を添加してよく撹拌した後、６０℃で３０分間インキュベートした。その後、１０μＬの１２３ｍｍｏｌ／Ｌ ヨードアセトアミド水溶液を添加し、遮光下、２５℃で1時間インキュベートした。その後、１ｍｍｏｌ／Ｌ 塩酸で４０ユニット／μＬに調整した蛋白質分解酵素トリプシン（シグマアルドリッチ社製）を１０μＬ添加し、３７℃、１時間反応させ、コアフコシル化ヒトＩｇＧをペプチドに消化した。反応終了後、９０℃、５分間の熱処理によりトリプシンを失活させた後、Ｎ結合型糖鎖の還元末端を切断するＮ-グリコシダーゼＦ（ロシュ社製）を５ユニット添加し、３７℃、１２時間反応させることでペプチドからＮ結合型糖鎖を遊離させた。

【0222】

（２）Ｎ結合型糖鎖の捕捉とシアル酸の保護
糖鎖精製標識化キットＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（住友ベークライト社製）を用い、キットに付属の糖鎖結合性ポリマービーズに純水５００μＬを加え、よく撹拌した後、５０μＬのポリマービーズ分散液を分取し、キットに付属の反応用チューブの底部に注入した。卓上遠心機で数秒間遠心分離して水を排出し、白色に乾いたポリマービーズに１８０μＬの２％ 酢酸／アセトニトリル溶液［２％（ｖ／ｖ） 酢酸、９８％（ｖ／ｖ） アセトニトリル］と、前記（１）の反応液２０μＬを添加し、チューブの蓋をあけた状態で８０℃、1時間インキュベートし、Ｎ結合型糖鎖をポリマービーズに結合させた。溶媒が完全に蒸発し、ポリマービーズが乾燥していることを確認後、２００μＬの２ｍｏｌ／Ｌ グアニジンで２回、２００μＬの純水で２回、２００μＬの１％ トリエチルアミン／メタノール溶液［１％（ｖ／ｖ） トリエチルアミン、９９％（ｖ／ｖ） メタノール］で２回、ポリマービーズを洗浄した。次に１００μＬの１０％ 無水酢酸／メタノール溶液［１０％（ｖ／ｖ） 無水酢酸、９０％（ｖ／ｖ） メタノール］を加え、２５℃で３０分間インキュベートして、ポリマービーズ上の官能基をキャッピングした。卓上遠心機で数秒間遠心分離して１０％ 無水酢酸／メタノール溶液を排出した後、２００μＬの１０ ｍｍｏｌ／Ｌ 塩酸で２回、２００μＬのメタノールで２回、２００μＬのＤＭＳＯで２回洗浄した。次に１００μＬのＭＴＴ／ＤＭＳＯ溶液［ＭＴＴ ７４．６ｍｇを１ｍＬのＤＭＳＯで溶解］を添加し、チューブの蓋をあけた状態で６０℃、１時間インキュベートし、Ｎ結合型糖鎖に存在するシアル酸をメチルエステル化して保護した。卓上遠心機で数秒間遠心分離してＭＴＴ／ジメチルスルホキシド溶液を排出した後、２００μＬのメタノールで２回、２００μＬの純水で２回、ポリマービーズを洗浄した。

【0223】

（３）Ｎ結合型糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ測定用標識化
次に、前記（２）で得られたポリマービーズに、２０μＬのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ用標識化合物溶液［２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（住友ベークライト社製、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットに付属）］を添加し、続いて１８０μＬの２％ 酢酸／アセトニトリル溶液を添加して、チューブの蓋をあけた状態で８０℃、１時間インキュベートした。これによりポリマービーズから糖鎖を遊離させ、その還元末端をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ用標識化合物で標識化した。溶媒が完全に蒸発し、ポリマービーズが乾燥していることを確認後、５０μＬの純水を加え、卓上遠心機で数秒間遠心分離して標識化Ｎ結合型糖鎖を回収した。

【0224】

（４）未反応のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ用標識化合物の除去
キットに付属のクリーンアップカラム（未反応のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ用標識化合物除去用カラム）を２００μＬの純水で１回、２００μＬのアセトニトリルで２回洗浄後、回収した標識化Ｎ結合型糖鎖溶液５０μＬに９５０μＬのアセトニトリルを加えた試料を全量添加し、１０分間自然落下によりクリーンアップカラムを通過させた。卓上遠心機で数秒間遠心分離して残りの溶液を通過させた後、３００μＬのアセトニトリルで２回クリーンアップカラムを洗浄した。卓上遠心機で数秒間遠心分離し、クリーンアップカラムからアセトニトリルを完全に除去した後、純水５０μＬを添加し、さらに数秒間遠心分離して標識化Ｎ結合型糖鎖溶液を回収した。

【0225】

（５）ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析
ＭＡＬＤＩマトリックスグレードの２，５－ジヒドロキシ安息香酸（和光純薬工業社製）１０ｍｇに、３００μＬのアセトニトリル、７００μＬの純水を加えて溶解し、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液１μＬに、（４）で回収した標識化Ｎ結合型糖鎖溶液１μＬを混合した。ＭＡＬＤＩターゲットプレートにこの混合液１μＬをスポットし、静置して乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ｓｍａｒｔｂｅａｍ（ブルカー・ダルトニクス社製）でＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析を行った。得られたＭＳスペクトルを図１２に示す。また糖鎖構造推定ソフトＧｌｙｃｏＭｏｄ Ｔｏｏｌ［Proteomics，vol.1，p.340 (2001)］を用いて各質量ピークに推定された糖鎖構造を表２に示す。一方、比較対象として同様に分析した、実施例１で得られた抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）で精製する前のヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）から得られたＭＳスペクトルを図１３に、推定されたＮ結合型糖鎖構造を表３に示す。表中、質量電荷比（ｍ／ｚ）はピーク毎の実測イオン質量、「ｄｍａｓｓ」は推定されたＮ結合型糖鎖構造の理論イオン質量と実測イオン質量の差を示す。また推定糖鎖構造において、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミン、「Ｍａｎ」はマンノース、「ＮｅｕＡｃ」はＮ－アセチルノイラミン酸、「Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ」はフコース、「ＨｅｘＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン、「Ｈｅｘ」はマンノース又はガラクトースを示す。抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）で精製する前のヒトＩｇＧ（イノベーティブリサーチ社製）においては、実測イオン質量（ｍ／ｚ）１７４６．６９２、１９０８．７５６、２０７０．８１８、２３７５．９４０、２６８１．０２６にフコース（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）を含まないＮ結合型糖鎖構造による微小ピークが検出されたのに対し、抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）で精製した後のヒトＩｇＧではこれらのピークが消失し、推定されたＮ結合型糖鎖構造すべてがフコース（Ｄｅｏｘｙｈｅｘｏｓｅ）を持つことが判明した。このことから、抗コアフコシル化ＩｇＧ抗体（１８－３Ｄ１１）を用いた精製により取得したヒトＩｇＧは、ほぼ１００％コアフコシル化ヒトＩｇＧであり、コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の標準物質として適当であることが判明した。

【0226】

【表2】

【0227】

【表3】

【0228】

［実施例５］コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の構築
（１）抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体固相化プレートの調製
９６ウェルのＥＩＡ用プレートに、参考例１（３）記載のＰＢＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈した抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃で１２時間静置して抗体をプレートに固相した。抗体溶液を除去後、参考例１（４）記載のブロッキング液を２００μＬ／ウェルで分注し、２５℃で２時間静置してプレートをブロッキングした。ブロッキング液を除去後、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定に使用した。

【0229】

（２）ぺルオキシダーゼ標識抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体の調製
実施例３（１）で精製した２００μｇの１８－３Ｄ１１抗体を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ_２（同仁化学研究所社製）を用いて、添付マニュアルに従いぺルオキシダーゼで標識した。キットに付属のＳｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒでぺルオキシダーゼ標識１８－３Ｄ１１抗体を懸濁し、これをぺルオキシダーゼ標識抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体溶液とした。

【0230】

（３）標準物質の調製
実施例３（３）で精製したコアフコシル化ヒトＩｇＧを、参考例１（４）記載の試料希釈液で７２５．５ｎｇ／ｍＬ、３６２．８ｎｇ／ｍＬ、１８１．４ｎｇ／ｍＬ、９０．７ｎｇ／ｍＬ、４５．４ｎｇ／ｍＬ、２２．７ｎｇ／ｍＬ、１１．３ｎｇ／ｍＬの各濃度に調整した。この２倍希釈系列を標準曲線を得るための標準物質とし、コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定に使用した。

【0231】

（４）コアフコシル化ヒトＩｇＧの測定
前記（１）で調製した抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体固相化プレートに、前記（３）で調製した標準物質、あるいは参考例１（４）記載の試料希釈液で１００，０００倍あるいは２００，０００倍に希釈したヒト血清検体を５０μＬ／ウェルずつ分注した。２５℃で１時間静置した後、試料を除去し、３５０μＬの参考例１（４）記載の洗浄液で３回ウェルを洗浄した。次に（２）で調製したペルオキシダーゼ標識抗コアフコシル化ヒトＩｇＧ抗体溶液を試料希釈液で１０，０００倍に希釈し、この溶液を５０μＬ／ウェルずつ分注した。２５℃で１時間静置した後、標識抗体溶液を除去し、３５０μＬの洗浄液で３回ウェルを洗浄した。ＴＭＢ－ＯＮＥを５０μＬ／ウェルで添加し、２５℃で２０分間静置した。停止液として０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸を５０μＬ／ウェル添加し、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍで測定した。得られた標準曲線を図１４に示す。ヒト血清検体中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度は、得られた吸光度を標準曲線で換算し、検体希釈液による希釈率を補正して算出した。

【0232】

［実施例６］コアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の性能評価
（１）希釈直線性試験
実施例５で構築したコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の希釈直線性試験を実施した。３種類の健常人血清検体（検体Ｉ～III）（アリエス社製）を準備し、各々を参考例１（４）記載の試料希釈液で１００，０００倍希釈した。この希釈検体と試料希釈液を、その混合比が１０容：０容（希釈率：１０／１０）、９容：１容希釈率：９／１０）、８容：２容希釈率：８／１０）、７容：３容（希釈率：７／１０）、６容：４容（希釈率：６／１０）、５容：５容（希釈率：５／１０）、４容：６容（希釈率：４／１０）、３容：７容（希釈率：３／１０）、２容：８容（希釈率：２／１０）、１容：９容（希釈率：１／１０）となるように混合し、１０段階希釈系列を調製した。これらのコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を実施例５（４）記載の方法で測定し、１００，０００倍希釈検体のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度の実測値と、希釈倍率から理論的に算出される理論濃度とから対理論率［対理論率（％）＝実測値（ｎｇ／ｍＬ）／理論値（ｎｇ／ｍＬ）×１００］を算出した。結果を表４に示す。いずれの検体、いずれの希釈率においても対理論率は９０～１１０％の範囲内であり、本測定系は良好な希釈直線性を示した。希釈直線性は、検体中のコアフコシル化ヒトＩｇＧ以外の物質を非特異的に測り込む等により不良となることから本測定系はコアフコシル化ヒトＩｇＧを特異的に測定することができることが判明した。

【0233】

【表4】

【0234】

（２）添加回収試験
実施例５で構築したコアフコシル化ヒトＩｇＧ測定系の添加回収率を評価するため、３種類の検体に、それぞれ２種類の標準物質（標準物質ａ、標準物質ｂ）を添加した検体を調製し、該検体を用いて添加回収試験を実施した。本試験において、標準物質（ａ）として７２５．５ｎｇ／ｍＬのコアフコシル化ヒトＩｇＧ溶液、標準物質（ｂ）として１８１．４ｎｇ／ｍＬのコアフコシル化ヒトＩｇＧ溶液を用いた。

【0235】

３種類の健常人血清検体（検体Ｉ～III）（アリエス社製）を準備し、各々を参考例１（４）記載の試料希釈液で２００，０００倍希釈した。この２００，０００倍希釈検体９容に試料希釈液１容を混合した検体試料（以下、Ａと記載する）を調製した。標準物質（ａ）又は標準物質（ｂ）の標準物質溶液１容に試料希釈液９容を混合した標準物質試料（以下、Ｂと記載する）を調製した。さらに２００，０００倍希釈検体９容に標準物質（ａ）又は標準物質（ｂ）の標準物質溶液１容を混合した添加検体試料（以下、Ｃと記載する）を調整した。これら試料のコアフコシル化ヒトＩｇＧ濃度を実施例５（４）記載の方法で測定し、検体に添加した標準物質の回収率［添加回収率（％）＝Ｃ（ｎｇ／ｍＬ）／｛Ａ（ｎｇ／ｍＬ）＋Ｂ（ｎｇ／ｍＬ）｝×１００］を算出した。結果を表５に示す。いずれの検体、いずれの標準物質添加量においても添加回収率は９０～１１０％の範囲内に収束しており、本測定系は良好な添加回収率を示した。添加回収率は、検体中に含まれる多様な成分（マトリックス）の影響を測定系が受けると不良となることから、本測定系は検体成分の影響を受けずに、コアフコシル化ヒトＩｇＧを正確に測定することができることが判明した。

【0236】

【表5】

【産業上の利用可能性】

【0237】

本発明により、コアフコースが結合しているＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧに結合し、コアフコースが結合していないＮ結合型糖鎖をＦｃ領域に含むヒト免疫グロブリンＧには結合しない、抗コアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体の製造方法、該抗体を用いるコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの測定方法、該抗体を含有するコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧ測定試薬、該抗体を用いるコアフコシル化ヒト免疫グロブリンＧの精製方法、及び、該抗体が固定化された不溶性担体が提供される。これらは、臨床診断において有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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