特許 7116705 合成膜－レシーバー複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-02

(45)【発行日】2022-08-10

(54)【発明の名称】合成膜－レシーバー複合体

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/078 20100101AFI20220803BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220803BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220803BHJP

   C12N 9/82 20060101ALI20220803BHJP

【ＦＩ】

C12N5/078 ZNA

A61K35/12

A61P37/02

C12N9/82

【請求項の数】 23

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2019087057

(22)【出願日】2019-04-30

(62)【分割の表示】P 2016533105の分割

【原出願日】2014-11-12

(65)【公開番号】P2019142950

(43)【公開日】2019-08-29

【審査請求日】2019-04-30

(31)【優先権主張番号】61/962,867

(32)【優先日】2013-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/025,367

(32)【優先日】2014-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/919,432

(32)【優先日】2013-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/991,319

(32)【優先日】2014-05-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/006,829

(32)【優先日】2014-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/006,832

(32)【優先日】2014-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/973,764

(32)【優先日】2014-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/006,825

(32)【優先日】2014-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/059,100

(32)【優先日】2014-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516147420

【氏名又は名称】ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アバク カーベジアン

(72)【発明者】

【氏名】ジョルディ マタ－フィンク

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ラウンド

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド エー． ベリー

(72)【発明者】

【氏名】ノーバー ビー． アフェヤン

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】特表２００８－５１０３３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３２２４９５７（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／０７８

Ａ６１Ｋ ３５／１２

Ａ６１Ｐ ３７／０２

Ｃ１２Ｎ ９／８２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

除核赤血球系細胞であって、前記除核赤血球系細胞は、
アスパラギナーゼまたはその機能断片を含む外因性ポリペプチド少なくとも１，０００コピーをその表面上に含み、
前記外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸を有核赤血球系前駆細胞へ導入する工程を含む方法により調製される、除核赤血球系細胞。

【請求項2】

前記除核赤血球系細胞が、少なくとも１０，０００コピーの前記外因性ポリペプチドをその表面上に含む、請求項１に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項3】

前記外因性ポリペプチドがさらに膜貫通ドメインを含む、請求項１または２に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項4】

前記膜貫通ドメインは、２型膜貫通タンパク質の膜貫通領域を含む、請求項３に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項5】

前記膜貫通ドメインは、Ｋｅｌｌの膜貫通領域を含む、請求項３に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項6】

前記外因性ポリペプチドは、Ｋｅｌｌの７１アミノ酸Ｎ末端断片を含む、請求項３に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項7】

前記外因性ポリペプチドは、Ｋｅｌｌの７９アミノ酸Ｎ末端断片を含む、請求項３に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項8】

前記アスパラギナーゼまたはその機能断片は、前記膜貫通ドメインのＣ末端に融合される、請求項３に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項9】

前記膜貫通ドメインの前記Ｃ末端と、前記アスパラギナーゼまたはその機能断片との間に、リンカーが配置される、請求項８に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項10】

前記リンカーはポリグリシンポリセリンリンカーを含む、請求項９に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項11】

前記外因性ポリペプチドは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のアスパラギナーゼまたはその機能断片か、またはエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）のアスパラギナーゼまたはその機能断片を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項12】

前記除核赤血球系細胞は、単離非修飾の非培養赤血球系細胞と同じ浸透圧膜脆弱性を示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項13】

前記除核赤血球系細胞は赤血球である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項14】

前記外因性核酸はＤＮＡを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項15】

前記外因性核酸はＲＮＡを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項16】

前記除核赤血球系細胞はＡ抗原およびＢ抗原を欠く、請求項１～１５のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項17】

前記除核赤血球系細胞は胎児ヘモグロビンを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項18】

前記除核赤血球系細胞は低張負荷されたものではない、請求項１～１７のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。

【請求項19】

複数の請求項１～１８のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞を含む、医薬組成物。

【請求項20】

前記医薬組成物における少なくとも５０％の除核赤血球系細胞が前記外因性ポリペプチドを含む、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記医薬組成物における少なくとも６０％の細胞が除核赤血球系細胞である、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

処置が必要な対象の処置における使用のための、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項23】

除核赤血球系細胞の調製方法であって、前記除核赤血球系細胞は、アスパラギナーゼまたはその機能断片を含む外因性ポリペプチド少なくとも１，０００コピーをその表面上に含み、前記調製方法は、
前記外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸をインビトロで有核赤血球系前駆細胞へ導入する工程
を含む、調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野は、疾患及び障害の治療用医薬組成物である。

【背景技術】

【0002】

循環系では、血液及びリンパの循環により、例えば栄養素、酸素、二酸化炭素、細胞老廃物、ホルモン、サイトカイン、血液細胞、及び病原体を体内の細胞に運び込んだり、細胞から運び出したりすることが可能である。血液は、心臓によって脊椎動物の血管系を通じて循環する、例えば、血漿、赤血球、白血球、及び血小板を含む流体である。循環系は多くの毒素及び病原性分子にとって、それらの体内への取込み時又は体による産生時におけるリザーバとなる。循環系はまた、体内からの細胞分泌物又はデトリタスのリザーバとしても機能する。かかる分子及び実体が絶え間なく又は異常に循環及び増殖すると、疾患が引き起こされ、及び／又は既存の病態が増悪し得る。

【0003】

循環系に関連する疾患及び病態を軽減又は予防する治療組成物の有効性は、多くの場合にその半減期によって制限され、半減期は典型的には数日までである。半減期の短さから、反復注射及び入院が必要となる場合も多くある。短い半減期は、腎クリアランス（例えば６０ｋＤａより小さいタンパク質のもの）と、非腎クリアランス（例えば肝排泄又は免疫介在性の除去によるもの）との両方に起因し得ると考えられる。治療薬の活性はまた、多くの場合に治療薬に対して誘発される免疫反応によっても制限される（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００３，１７：１５８３を参照）。当該技術分野では、幾つかの手法が実践されている。

【0004】

１つの手法は、溶血赤血球から誘導される「赤血球ゴースト」の使用を含むものである。赤血球ゴーストの調製に際しては、赤血球に低張溶解を起こさせる。赤血球を低イオン強度緩衝液に曝露し、赤血球の破裂を生じさせる。得られた溶解細胞膜を遠心によって単離する。溶解した赤血球膜のペレットを、治療剤、例えば抗生物質又は化学療法剤などの存在下で低イオン強度緩衝液中に再懸濁し、インキュベートする。治療剤が細胞内に分布する。治療剤などのペイロードの封入に使用される赤血球ゴースト及び誘導体は、それらのペイロードを免疫系から遮蔽することができ、しかし赤血球ゴースト自体は細網内皮系による迅速なクリアランスに供される（例えば、Ｌｏｅｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９８７ Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５５（９）：２０７４を参照）。赤血球ゴーストもまた、哺乳類対象において免疫反応を誘発する。これらの小胞は、典型的には、通常細胞膜の内葉に見られる潜在的に多量のホスファチジルセリンを含め、脂質及びタンパク質の両方で構成される。これが、レシピエント哺乳類対象における潜在的な免疫反応につながる。これらの望ましくない効果が、赤血球ゴーストに基づく技術の治療上の適用可能性を著しく制限している。

【0005】

もう１つの薬物封入手法は、エキソソームの使用を含むものである。「エキソソーム」には、血液、尿、及び細胞培養物の培養培地を含めた、多くの、恐らくは全ての生物学的流体に存在する細胞由来の小胞が含まれる。エキソソームの報告されている直径は３０～１００ｎｍであり、これは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）より大きいが、例えば赤血球よりは小さい。エキソソームは多胞体が細胞膜に融合したときに細胞から放出されるか、或いは、原形質膜から直接放出される。エキソソーム送達方法については、エキソソームのバイオロジーの理解を深めると共に、産生、特徴付け、ターゲティング及びカーゴ負荷のナノテクノロジーを開発することが必要である。ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞（ｈＥＳＣ－ＭＳＣ）を使用してエキソソームを製造しようとする試みがなされている。しかしながら、ｈＥＳＣ－ＭＳＣは無限に拡大可能ではないため、エキソソームを大量生産するには、ｈＥＳＣからの誘導によるｈＥＳＣ－ＭＳＣの補充が必要となり、新規バッチ毎の試験及びバリデーションに繰り返し費用が発生し得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：４７）。エキソソームの精製及び負荷に好適な且つ拡張性のあるナノテクノロジーがないことによって、臨床解釈もまた妨げられる（Ｌａｋｈａｌ ａｎｄ Ｗｏｏｄ ２０１１ ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ３３（１０）：７３７）。現在の超遠心法プロトコルは、エキソソーム、他の細胞内小胞及び大分子複合体の不均一混合物を生じるため、商業的に再現性がない。従って、エキソソームの表面上における標的部分の発現など、特異的な所望のマーカーの使用に基づく精製方法が求められている。加えて、エキソソームへのｓｉＲＮＡ負荷は比較的効率が悪く費用非効率であり、ナノ粒子適用に合わせて調整されたトランスフェクション試薬を開発する必要性が浮き彫りとなる。さらに、エキソソームは循環から急速に除去され、実質的に投与２４時間以内に肝臓に蓄積するため（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１（１）：１８５）、対象の循環への長期薬物送達に対するそれらの適用は制限されている。

【0006】

現在、ポリエチレングリコール被覆リポソームがインビボ薬物送達の担体として使用されている。「リポソーム」には、ラメラ相脂質二重層で構成される人工的に調製された球形小胞が含まれる。リポソームは、栄養素及び医薬品の投与媒体として使用することができる。リポソームは、生体膜を例えば音波処理によって破壊することにより調製し得る。リポソームは多くの場合にホスファチジルコリンに富むリン脂質で構成され、卵ホスファチジルエタノールアミンなどの界面活性剤特性を有する混合脂質鎖もまた含有し得る。リポソーム設計は、標的、例えば非健常組織との結合に表面リガンドを用い得る。リポソームのタイプには、多層小胞（ＭＬＶ）、小型単層リポソーム小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、及び蝸牛状小胞が含まれる。アントラサイクリン系抗生物質の担体としてのリポソームは、数多くの研究の主題となっている。結果として、現在、ダウノルビシン（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（商標））及びドキソルビシン（Ｄｏｘｉｌ（商標））のリポソーム製剤が市販されている。リポソーム形態のアントラサイクリン系抗生物質の薬物動態は、ピーク濃度がより高く、且つ薬物の循環時間がより長い点でその遊離形態とは異なる。血漿からのＤａｕｎｏＸｏｍｅ及びＤｏｘｉｌのクリアランス動態は単一指数関数に近い。患者血漿中のＤａｕｍｏＸｏｍｅの半減期は数時間程度である。Ｄｏｘｉｌでは、ポリエチレングリコール被覆リポソームが使用される。免疫系はかかるリポソームを十分に認識しない；従ってＤｏｘｉｌの血漿中半減期は数十時間程度である。

【0007】

例えば毒性代謝産物を分解し又は生体異物を不活性化するために、薬物送達システムとして、ワクチン接種の抗原担体として、及び他の生物医学的応用において赤血球を使用することが考えられている（Ｍａｇｎａｎｉ Ｅｄ．２００３，Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）。これらの適用の多くは、赤血球膜に一過性に細孔を開ける手順を必要とする。一般的には薬物は、無培養で、低張ショックに基づく破壊的方法を用いて新鮮な単離赤血球に負荷されている。低張透析は、高い溶血程度、細胞形態の不可逆的な変形及びホスフォチジル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ）セリンの露出（これは未成熟赤血球の除去及び輸血関連病変の誘導に関連する重要なパラメータとして認識されている）を誘導し得る（Ｆａｖｒｅｔｔｏ ２０１３ Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ）。

【0008】

多くの薬物、特にタンパク質治療薬は、Ｂ細胞抗体産生、Ｔ細胞活性化、及びマクロファージの食作用を含む免疫原性反応を刺激する。免疫原性の原因はタンパク質にとって外因的でも又は内因的でもあり得る。外因的因子は、薬物製剤、凝集体形成、分解産物、夾雑物及び投薬である。投与方法、並びに薬物レジメンもまた、免疫原性がどのように評価されるかに強い影響を与える。即ち、急性適用で投与される薬物については、慢性疾患を治療する薬物と比較して免疫原性が異なる効果を有し得る。後者の場合、患者はより長期間にわたり薬物に曝露され、そのため完全寛解を得ることができる。ペグ化は、半減期を延長させると共に免疫原性反応を最小限に抑えるように設計される技術である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が非免疫原性で且つ非抗原性であるという仮定に反し、特定の動物試験は、ウリカーゼ、オボアルブミン及び他の幾つかのＰＥＧ化薬剤がＰＥＧに対する抗体形成（抗ＰＥＧ）を誘発し得ることを示している。ヒトでは、抗ＰＥＧは治療有効性を制限し、及び／又は急性リンパ芽球性白血病患者におけるＰＥＧ－アスパラギナーゼ（ＰＥＧ－ＡＳＮアーゼ）の忍容性及び慢性痛風患者におけるペグロチカーゼの忍容性を低下させ得るが、ｍＰＥＧ修飾型ブタクサ抽出物又はミツバチ毒によるアレルギー患者の減感作又はＣ型肝炎患者におけるＰＥＧ－ＩＦＮに対する応答を損なうことはなかった。抗ＰＥＧ抗体は健常供血者の２２～２５％に見られる。２０年前、発生率は０．２％であった。この増加は、抗体の検出限界が向上したこと、並びに化粧品、医薬品及び加工食品中のＰＥＧ及びＰＥＧ含有化合物への曝露が増したことに起因し得る。これらの結果は、一部の患者に対するＰＥＧコンジュゲート薬物の有効性に関して懸念を提起する（Ｇａｒａｙ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２０１２ ９（１１）：１３１９）。

【0009】

当該技術分野における受動的な半減期改善方法を構築しようとする試みは、薬物の見かけの流体力学半径を増加させることに着眼するものである。腎臓の糸球体ろ過装置は、血液成分をろ過する体内の主要部位である（参考として、例えば、Ｏｓｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ １９９７ ９３：６５及びＭｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９８２ ２１：６３３を参照）。ろ過の主な決定要因は、血中の分子の流体力学半径である；小さい分子（＜８０ｋＤａ）は大きい分子と比べてろ過によって血中から取り除かれる程度が大きい。研究者はこの一般原則を用いることにより、主にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子量水溶性ポリマーとの化学的コンジュゲーションによって、より大きい流体力学半径、ひいてはより長い半減期を呈するように薬物を修飾している。現在、臨床では数多くのＰＥＧ化タンパク質及び小分子治療薬が提供されている（Ｐａｓｕｔ ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，２００９ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ６１（１３）：１１７７；Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，２００８ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７（１０）：４１６７）。これらの方法は、多くの場合に、特にグラフト又は融合物の流体力学半径が増加するにつれ、循環半減期の増加に有効であるが（Ｇａｏ，Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．，２００９ ＰＮＡＳ １０６（３６）：１５２３１）、しかしながら生物学的エフェクター機能の製造及び管理上の課題をもたらす。コンジュゲーション反応の不均一性により、主に非部位特異的なケミストリーの利用に起因して様々な生物学的活性を有する複雑な生成物混合物が生じ得る。均一な治療薬製品を維持するには、多くの場合に緻密な精製方法に従い広範な生化学的特徴付けが行われる（Ｈｕａｎｇ，Ｇｏｕｇｈ，ｅｔ ａｌ，２００９ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８１（２）：５６７；Ｂａｉｌｏｎ，Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ １２（２）：１９５；Ｄｈａｌｌｕｉｎ，Ｒｏｓｓ，ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ １６（３）：５０４）。さらに、タンパク質の反応性領域に分枝状ＰＥＧなどの大型部分が結合することにより、受容体親和性が低下し得る（Ｆｉｓｈｂｕｒｎ，２００８ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ９７（１０）：４１６７）。

【0010】

薬物の循環を増加させるには、治療用タンパク質の結合にアルブミンが用いられてもよく（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，２００２ Ｊ Ｂｉｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３８）：３５０３５；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄｕｎｌｅｖｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｐｒｏｔ Ｅｎｇｒ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２３（４）：２７１）、それが血中の別のタンパク質を結合するように操作することにより、治療薬の見かけのサイズを増加させ得る。このように、薬物は血流中への投与後に限りその大きい分子サイズに達する。アフィニティー成熟血清アルブミン結合ペプチドを抗体断片に付加すると、マウスにおいてその循環時間が２４倍に増加した（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，２００２ Ｊ Ｂｉｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３８）：３５０３５）。この方法は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によるアルブミン再利用のダイナミクス及び機能性のためのシステイン拘束性環状ペプチドの使用によって複雑化する。或いは、タンパク質薬物に対して大型抗体断片の組換えによる付加が行われ得る。これは、例えば複雑な環状又は大型の機能性ドメインを使用するため、構造上並びに製造上の複雑さを引き起こし得る。アルブミンに対する高親和性にも関わらず、それらは使用前に環状構造を正しく形成する物理的拘束を必要とする。より大型の抗体断片を融合する方法は、折り畳み構造が既に複雑なタンパク質には適しないこともあり、又は低い発現収率となり得る。

【0011】

完全な且つ持続性のある反応を生じさせることにおけるキメラ抗原受容体Ｔ細胞治療薬、抗体カップリングＴ細胞受容体（ＡＣＴＲ）治療薬及び他の養子Ｔ細胞治療薬の潜在的能力が、複数の悪性疾患及び感染症で実証されている。しかしながら、より強力なＴ細胞の開発は、まれではあるが時に致命的となっているオンターゲット及びオフターゲット毒性の発生が浮き彫りにする安全上の懸念によって制限されている。有害事象の管理においては適時の薬理学的介入が有効となり得るが、養子性に移入されたＴ細胞は長期間持続し、望ましくない効果も伴い得る。分化抗原を標的化するＴ細胞は、同じ抗原を発現する非悪性細胞もまた認識し、有害事象をもたらすと予想され得る。例えば、ＭＡＲＴ－１及びｇｐ１００などのメラニン細胞分化抗原を標的化するＴ細胞で治療されるメラノーマ患者は、多くの場合に白斑及びブドウ膜炎を発症する。これらのオンターゲット毒性は、腫瘍浸潤細胞、インビトロ拡大Ｔ細胞クローン及びＴＣＲトランスジェニック細胞を含めたあらゆる形態の治療手法で観察されている。一般に、オンターゲット自己免疫は腫瘍退縮に関連し、有効性の高い治療手法ほどより顕著である。オンターゲットながらもオフ腫瘍の毒性は、直ちに生命を脅かし得る。例えば、肺転移及び肝転移を有する結腸直腸癌患者は、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞注入から１５分以内に呼吸窮迫を発症し得ると共に、続いて５日後に多臓器不全で死亡し得る。Ｔ細胞治療薬の有効性が高まるに従い、急性毒性もまた明白となりつつある。複数のＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞試験で、ＣＤ１９＋悪性細胞の認識時にＴ細胞が大量に活性化する結果として、発熱、悪寒、低血圧症及び低酸素症によって特徴付けられるサイトカイン放出症候群が観察されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

かかる疾患及び病態を軽減又は予防する循環系を介した治療組成物の提供が、継続的に必要とされている。さらに、かかる治療組成物の半減期、安全性プロファイル、及び／又は有効性を増加させる方法及び組成物が必要とされている。本発明の態様は、現在の方法及び組成物の欠点の１つ以上に対処する。

【課題を解決するための手段】

【0013】

一部の態様において、本明細書には、標的自己抗体の循環濃度を低減する方法が開示される。本方法は、自己抗体媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがあるヒト対象に、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、標的自己抗体の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。

【0014】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、対象の血漿量に等しい分布容積を有する。

【0015】

他の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する。

【0016】

特定の実施形態において、本方法は、自己抗体媒介性疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が軽減されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0017】

他の実施形態において、本方法は、自己抗体媒介性疾患、障害又は病態が予防されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0018】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的自己抗体の循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0019】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的自己抗体の循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それにより自己抗体媒介性疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され、又は遅延するように、医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0020】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的自己抗体の循環濃度が、ｉ）ヒト対象による標的自己抗体の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）ヒト対象による標的自己抗体の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように、医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0021】

一部の実施形態において、標的自己抗体の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0022】

他の実施形態において、標的自己抗体の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0023】

一部の実施形態において、本方法は、標的自己抗体の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0024】

他の実施形態において、本方法は、少なくとも治療期間中である間は標的自己抗体の循環濃度が実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0025】

一部の実施形態において、治療期間は、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である。

【0026】

一部の実施形態において、治療期間内の投与間の時間間隔は、循環中の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の数が投与医薬組成物中に存在する合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である。

【0027】

他の実施形態において、投与頻度は、標的自己抗体の循環濃度を、自己抗体媒介性疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。

【0028】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与するステップにより、対象の循環系における未結合標的自己抗体の濃度又は全標的自己抗体の濃度が減少する。

【0029】

一部の実施形態において、全標的自己抗体の濃度は、対象の循環系における未結合及び結合標的自己抗体の濃度に略等しい。

【0030】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に活性な薬剤をさらに含む。

【0031】

特定の実施形態において、本方法は、薬学的に活性な薬剤を投与するステップをさらに含み、ここで薬学的に活性な薬剤は医薬組成物の前に、その後に、又はそれと同時に投与される。

【0032】

一部の実施形態において、本医薬組成物は局所投与又は非経口投与される。

【0033】

一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される。

【0034】

一部の実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

【0035】

一部の実施形態において、本方法は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ループス、免疫性血小板減少性紫斑病、温式抗体溶血性貧血、寒冷凝集素症、グッドパスチャー症候群、抗リン脂質抗体症候群、及び膜性糸球体腎炎からなる群から選択される自己抗体媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む。

【0036】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は対象の循環系での短期持続時間用に製剤化される。

【0037】

他の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は対象の循環系での長期持続時間用に製剤化される。

【0038】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは対象の循環系において膜から実質的に解離しない。

【0039】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは循環系に少なくとも２１日間存在する。

【0040】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸を含む。

【0041】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ｉ）ＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片、又はｉｉ）細胞膜ポリペプチド、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方をさらに含む。

【0042】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ポリペプチド複合体が長期持続時間にわたり循環系に滞留するのに有効な量でＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片を含む。

【0043】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は実質的な量の複製核酸を含有しない。

【0044】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、又は１００，０００コピーのレシーバーポリペプチドを含み、及び／又は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸からなる群から選択される膜脂質に対してある比率のレシーバーポリペプチドを含む。

【0045】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、レシーバーポリペプチドに加えて少なくとも第２のポリペプチドを含む。

【0046】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、レシーバーポリペプチドとは無関係に２つ以上の基質に対する触媒活性を有する。

【0047】

一部の実施形態において、第２のポリペプチドは膜に会合している。

【0048】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは外因性核酸によってコードされる。

【0049】

特定の実施形態において、外因性核酸は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体によって実質的に保持されない。

【0050】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドの発現は有効に終結される。

【0051】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは膜に会合している。

【0052】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは融合物又はキメラである。

【0053】

一部の実施形態において、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含み、ここでＳドメインは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。

【0054】

一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは少なくとも６個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含む。

【0055】

特定の実施形態において、標的自己抗体は、糖タンパク質（ＧＰ Ｉｂ－ＩＸ、ＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＩＶ、又はＩａ－ＩＩａ）、コラーゲンα３（ＩＶ）のＮＣ１ドメイン、Ｂ２グリコプロテイン１、又はホスホリパーゼＡ２受容体を特異的に認識する。

【0056】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、糖タンパク質（ＧＰ Ｉｂ－ＩＸ、ＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＩＶ、又はＩａ－ＩＩａ）、コラーゲンα３（ＩＶ）のＮＣ１ドメイン、Ｂ２グリコプロテイン１、又はホスホリパーゼＡ２受容体からなる群から選択される抗原ポリペプチド、又はその抗原断片を含む。

【0057】

一部の実施形態において、Ｓドメインは抗原ポリペプチド又はその抗原断片を含む。

【0058】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される方法によって投与される医薬組成物が提供される。

【0059】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

【0060】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団を含む。

【0061】

一部の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも１×１０^５個の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む。特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で提供される。

【0062】

特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも１×１０^１１個の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む。特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で提供される。

【0063】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、長期保存用に製剤化された組成物である。

【0064】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、凍結された組成物である。

【0065】

一部の実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に活性な薬剤を含む。

【0066】

特定の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される。

【0067】

一部の態様において、本明細書には、静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化された本明細書に開示される組成物を含む剤形が提供される。

【0068】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される医薬組成物を保持する容器と、対象への医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具が提供される。

【0069】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される医薬組成物と、対象への医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キットが提供される。

【0070】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される方法によって投与される医薬組成物の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が提供される。

【0071】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるとおりの合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団が提供される。

【0072】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団は液体として製剤化される。

【0073】

他の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団は凍結される。

【0074】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるとおりの合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の単離レシーバーポリペプチドが提供される。

【0075】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるレシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸が提供される。

【0076】

一部の態様において、本明細書には、標的との相互作用能を有するレシーバーポリペプチドと、第２のポリペプチドを含む膜とを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が提供され、この合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、レシーバーとは無関係に触媒活性を有する。

【0077】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、哺乳類対象の循環系への静脈内投与用に製剤化され、哺乳類対象は例えばヒトであってもよい。

【0078】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、対象の循環系における未結合標的又は全標的の濃度を低減する能力を有する。

【0079】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、対象の血漿量と略等しい又は均等な分布容積を有する。

【0080】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する。

【0081】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、実質的に対象の循環系における合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の持続時間にわたり循環系に存在する。

【0082】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は対象の循環系での短期持続時間用に製剤化される。

【0083】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は対象の循環系での長期持続時間用に製剤化される。

【0084】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは循環系に少なくとも約２１日間存在する。

【0085】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸を含む。

【0086】

他の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片をさらに含む。

【0087】

他の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体が長期持続時間にわたり循環系に滞留するのに有効な量でＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片を含む。

【0088】

一部の実施形態において、複合体と標的の相互作用は、標的を結合し、分解し、切断し及び／又は隔絶することを含む。

【0089】

他の実施形態において、複合体と標的の相互作用は、標的の活性を改変することを含む。

【0090】

他の実施形態において、複合体と標的の相互作用は、標的の活性を低減することを含む。

【0091】

他の実施形態において、複合体と標的の相互作用は、標的を不活性化することを含む。

【0092】

一部の実施形態において、標的は、自己抗体、補体タンパク質、免疫複合体、血清アミロイドタンパク質、代謝産物又は毒素である。

【0093】

他の実施形態において、標的は、炎症分子、サイトカイン又はケモカインである。

【0094】

他の実施形態において、標的は、脂質又は炭水化物、アミノ酸である。

【0095】

他の実施形態において、標的は、ウイルス、ウイルス抗原、エンベロープ抗原又はカプシド抗原である。

【0096】

他の実施形態において、標的は、細菌、細菌性抗原、細菌性表面抗原、分泌細菌性毒素、又は分泌細菌性抗原である。

【0097】

他の実施形態において、標的は、真菌、真菌性抗原、真菌性細胞表面抗原、分泌真菌性毒素、又は分泌真菌性抗原である。

【0098】

他の実施形態において、標的はＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0099】

他の実施形態において、標的は、循環細胞、炎症細胞、腫瘍細胞、又は転移性癌細胞である。

【0100】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、補体受容体１（ＣＲ１）ポリペプチド、その変異体又は機能断片である。

【0101】

一部の実施形態において、ＣＲ１ポリペプチドは、１つ以上のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）及び／又はロング相同リピート（ＬＨＲ）を含む。

【0102】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、ダッフィ抗原受容体複合体（ＤＡＲＣ）、その変異体又は機能断片である。

【0103】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、抗体、一本鎖可変断片、ナノボディ、ダイアボディ、又はＤＡＲＰｉｎである。

【0104】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、リアーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はヌクレアーゼである。

【0105】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、合成レシーバーポリペプチド複合体の周りの環境に露出している。

【0106】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、合成レシーバーポリペプチド複合体の非露出側に位置する。

【0107】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは膜に会合している。

【0108】

他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは融合物又はキメラである。

【0109】

特定の実施形態において、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含み、ここでＳドメインは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。

【0110】

一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは少なくとも６個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含む。

【0111】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、又は１００，０００コピーのレシーバーポリペプチドを含み、及び／又は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸からなる群から選択される膜脂質に対してある比率のレシーバーポリペプチドを含む。

【0112】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは組換え核酸によってコードされる。

【0113】

特定の実施形態において、組換え核酸は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体によって保持されない。

【0114】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドの発現は有効に終結される。

【0115】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は実質的な量の複製核酸を含有しない。

【0116】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるとおりの合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が提供される。

【0117】

特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも１×１０^５個の合成膜－レシーバー複合体を含む。

【0118】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で提供される。

【0119】

特定の実施形態において、本医薬組成物は少なくとも１×１０^１１個の合成膜－レシーバー複合体を含む。

【0120】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で提供される。

【0121】

一部の実施形態において、本医薬組成物は、長期保存用に製剤化された組成物である。

【0122】

一部の実施形態において、本医薬組成物は、凍結された組成物である。

【0123】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に活性な薬剤を含む。

【0124】

一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される。

【0125】

一部の態様において、本明細書には、静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化された本明細書に開示される医薬組成物を含む剤形が提供される。

【0126】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される医薬組成物を保持する容器と、対象への医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具が提供される。

【0127】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される医薬組成物と、対象への医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キットが提供される。

【0128】

一部の態様において、本明細書には、哺乳類対象の循環系における標的の存在又は濃度に関連する疾患、障害又は病態を治療又は予防する方法が提供される。本方法は、本明細書に開示される医薬組成物を疾患、障害又は病態の治療又は予防に有効な量で対象に静脈内投与するステップを含む。

【0129】

特定の実施形態において、標的は疾患、障害又は病態に関連する。

【0130】

一部の態様において、本明細書には、標的の循環濃度をモジュレートする方法が提供される。本方法は、哺乳類対象の循環系における標的の存在、非存在、濃度上昇又は濃度低下に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象に、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を、標的の循環濃度を実質的にモジュレートするのに有効な量で投与するステップを含む。

【0131】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、対象の血漿量に等しい分布容積を有する。

【0132】

特定の実施形態において、循環中の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の量が、ｉ）初回に投与された複合体の濃度の５０％、又はｉｉ）循環中の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体のＣｍａｘの５０％に減少したとき、投与が繰り返される。

【0133】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は循環中の標的と相互作用する。

【0134】

特定の実施形態において、標的との相互作用は、標的を結合し、分解し、切断し及び／又は隔絶することを含む。

【0135】

他の実施形態において、標的との相互作用は、標的の活性を改変することを含む。

【0136】

他の実施形態において、標的との相互作用は、標的の活性を低減することを含む。

【0137】

他の実施形態において、標的との相互作用は、標的を不活性化することを含む。

【0138】

他の実施形態において、標的との相互作用は、標的を触媒的に変換することを含む。

【0139】

特定の実施形態において、モジュレートすることは、標的の循環濃度を低減することからなる。

【0140】

特定の実施形態において、対象の循環系における標的の存在又はレベル上昇は、疾患、障害又は病態に関連する。

【0141】

特定の実施形態において、本方法は、非標的化合物の循環濃度を増加させるステップをさらに含む。

【0142】

特定の実施形態において、対象の循環系における非標的化合物の非存在又はレベル低下は、疾患、障害又は病態に関連する。

【0143】

特定の実施形態において、標的は、生物学的化合物、無機化合物、有機化合物、気体化合物又は元素である。

【0144】

特定の実施形態において、標的は、１０００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、２５０Ｄａ未満、又は１００Ｄａ未満である。

【0145】

特定の実施形態において、標的は１ｋＤａより大きい。

【0146】

特定の実施形態において、標的は、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、アミノ酸、代謝産物、又は小分子である。

【0147】

他の実施形態において、標的は、抗体、補体因子、免疫複合体、血清アミロイドタンパク質、細菌性病原体、真菌性病原体、ウイルス性病原体、又は感染した、病原性の、アポトーシスを起こした、壊死した、異常な若しくは発癌性の哺乳類細胞である。

【0148】

他の実施形態において、標的はアミロイドポリペプチドである。

【0149】

他の実施形態において、標的は補体ポリペプチドである。

【0150】

特定の実施形態において、標的の循環濃度の実質的なモジュレーションは可逆的である。

【0151】

他の実施形態において、標的の循環濃度の実質的なモジュレーションは時間的に限定されている。

【0152】

他の実施形態において、標的の循環濃度の実質的なモジュレーションは空間的に限定されている。

【0153】

一部の態様において、本明細書には、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度を低減する方法が開示される。本方法は、合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物をアミロイドーシスに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある哺乳類対象に投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。

【0154】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、対象の血漿量に等しい分布容積を有する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する。

【0155】

特定の実施形態において、本方法は、アミロイドーシスが治療され又はその症状が軽減されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0156】

他の実施形態において、本方法は、アミロイドーシスが予防されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0157】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0158】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それによりアミロイドーシスの１つ以上の症状が予防され、軽減され又は遅延するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0159】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度が、ｉ）哺乳類対象による標的血清アミロイドタンパク質の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）哺乳類対象による標的血清アミロイドタンパク質の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0160】

一部の実施形態において、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0161】

他の実施形態において、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0162】

一部の実施形態において、本方法は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0163】

他の実施形態において、本方法は、少なくとも治療期間中である間は標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度が実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0164】

一部の実施形態において、治療期間は、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である。

【0165】

一部の実施形態において、治療期間内における投与間の時間間隔は、循環中の合成膜－レシーバー複合体の数が投与医薬組成物中に存在する合成膜－レシーバー複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である。

【0166】

他の実施形態において、投与頻度は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度を、アミロイドーシスの症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。

【0167】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与するステップにより、対象の循環系における未結合標的血清アミロイドタンパク質の濃度又は全標的血清アミロイドタンパク質の濃度が減少する。

【0168】

一部の実施形態において、全標的血清アミロイドタンパク質の濃度は、対象の循環系における未結合及び結合標的血清アミロイドタンパク質の濃度に略等しい。

【0169】

一部の実施形態において、本方法は、Ａアミロイドーシス（ＡＡ）、Ｉｇ軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシス、及びフィブリノゲンアミロイドーシスからなる群から選択されるアミロイドーシスに罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む。

【0170】

特定の実施形態において、標的血清アミロイドタンパク質は、アミロイドＰタンパク質、アミロイドＡタンパク質、軽鎖、ミスフォールドトランスサイレチン、及びフィブリノゲンα鎖からなる群から選択される。

【0171】

一部の実施形態において、レシーバーは膜に会合している。任意選択で、レシーバーは融合物又はキメラである。必要であれば、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含むことができ、ここでＳドメインは合成膜－レシーバー複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは合成膜－レシーバー複合体の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも６個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態において、Ｓドメインは抗原ポリペプチド又はその抗原断片を含む。

【0172】

一部の態様において、本明細書には、標的免疫複合体の循環濃度を低減する方法が開示される。本方法は、免疫複合体関連疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある哺乳類対象に、合成膜－補体受容体１（ＣＲ１）レシーバー複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、標的免疫複合体の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。

【0173】

特定の実施形態において、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体は、対象の血漿量に等しい分布容積を有する。一部の実施形態において、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体は０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する。

【0174】

特定の実施形態において、本方法は、免疫複合体関連疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が軽減されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0175】

他の実施形態において、本方法は、免疫複合体関連疾患、障害又は病態が予防されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0176】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的免疫複合体の循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0177】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的免疫複合体の循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それにより免疫複合体関連疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され又は遅延するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0178】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的免疫複合体の循環濃度が、ｉ）哺乳類対象による標的免疫複合体の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）哺乳類対象による標的免疫複合体の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0179】

一部の実施形態において、標的免疫複合体の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0180】

他の実施形態において、標的免疫複合体の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0181】

一部の実施形態において、本方法は、標的免疫複合体の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0182】

他の実施形態において、本方法は、少なくとも治療期間中である間は標的免疫複合体の循環濃度が実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0183】

一部の実施形態において、治療期間は、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である。

【0184】

一部の実施形態において、治療期間内における投与間の時間間隔は、循環中の合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体の数が投与医薬組成物中に存在する合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である。

【0185】

他の実施形態において、投与頻度は、標的免疫複合体の循環濃度を、免疫複合体関連疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。

【0186】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与するステップにより、対象の循環系における未結合標的免疫複合体の濃度又は全標的免疫複合体の濃度が減少する。

【0187】

一部の実施形態において、全標的免疫複合体の濃度は、対象の循環系における未結合及び結合標的免疫複合体の濃度に略等しい。

【0188】

一部の実施形態において、本方法は、ＩｇＡ腎症及びループス腎炎からなる群から選択される免疫複合体関連疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む。

【0189】

特定の実施形態において、標的免疫複合体は、ｉ）ＩｇＭ又はＩｇＧ、及びｉｉ）Ｃ３ｂ及び／又はＣ４ｂを含む。

【0190】

一部の実施形態において、レシーバーは膜に会合している。任意選択で、レシーバーは融合物又はキメラである。必要であれば、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含むことができ、ここでＳドメインは合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも６個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態において、Ｓドメインは抗原ポリペプチド又はその抗原断片を含む。

【0191】

特定の実施形態において、ＣＲ１レシーバーポリペプチドは、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、及び／又はロング相同リピート（ＬＨＲ）のいずれか１つの１つ以上を含む。

【0192】

一部の態様において、本明細書には、標的補体タンパク質の循環濃度を低減する方法が開示される。本方法は、補体タンパク質の調節異常に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある哺乳類対象に、合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、標的補体タンパク質の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。

【0193】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、対象の血漿量に等しい分布容積を有する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する。

【0194】

特定の実施形態において、本方法は、補体タンパク質の調節異常に関連する疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が軽減されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0195】

他の実施形態において、本方法は、補体タンパク質の調節異常に関連する疾患、障害又は病態が予防されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0196】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的補体タンパク質の循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0197】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的補体タンパク質の循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それにより補体タンパク質の調節異常に関連する疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され又は遅延するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0198】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的補体タンパク質の循環濃度が、ｉ）哺乳類対象による標的補体タンパク質の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）哺乳類対象による標的補体タンパク質の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0199】

一部の実施形態において、標的補体タンパク質の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0200】

他の実施形態において、標的補体タンパク質の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0201】

一部の実施形態において、本方法は、標的補体タンパク質の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0202】

他の実施形態において、本方法は、少なくとも治療期間中である間は標的補体タンパク質の循環濃度が実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0203】

一部の実施形態において、治療期間は、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である。

【0204】

一部の実施形態において、治療期間内における投与間の時間間隔は、循環中の合成膜－レシーバー複合体の数が投与医薬組成物中に存在する合成膜－レシーバー複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である。

【0205】

他の実施形態において、投与頻度は、標的補体タンパク質の循環濃度を、補体タンパク質の調節異常に関連する疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。

【0206】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与するステップにより、対象の循環系における未結合標的補体タンパク質の濃度又は全標的補体タンパク質の濃度が減少する。

【0207】

一部の実施形態において、全標的補体タンパク質の濃度は、対象の循環系における未結合及び結合標的補体タンパク質の濃度に略等しい。

【0208】

一部の実施形態において、本方法は、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢性黄斑変性症、自己免疫性溶血性貧血、補体因子Ｉ欠損症、及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される補体タンパク質の調節異常に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む。

【0209】

特定の実施形態において、標的補体タンパク質は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９からなる群から選択される。

【0210】

一部の態様において、本明細書には、標的代謝産物の循環濃度をモジュレートする方法が開示される。本方法は、代謝疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある哺乳類対象に、合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ここで医薬組成物は、標的代謝産物の循環濃度を実質的にモジュレートするのに有効な量で投与される。

【0211】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、対象の血漿量に等しい分布容積を有する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する。

【0212】

特定の実施形態において、本方法は、代謝疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が軽減されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0213】

他の実施形態において、本方法は、代謝疾患、障害又は病態が予防されるように医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む。

【0214】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的代謝産物の循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0215】

さらに他の実施形態において、本方法は、代謝産物の循環濃度が治療期間中に実質的に増加するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0216】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的代謝産物の循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それにより代謝疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され又は遅延するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0217】

さらに他の実施形態において、本方法は、代謝産物の循環濃度が治療期間中に実質的に増加し、それにより代謝疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され又は遅延するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0218】

さらに他の実施形態において、本方法は、標的代謝産物の循環濃度が、ｉ）哺乳類対象による標的代謝産物の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）哺乳類対象による標的代謝産物の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0219】

さらに他の実施形態において、本方法は、代謝産物の循環濃度が、ｉ）哺乳類対象による代謝産物の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）哺乳類対象による代謝産物の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で増加するように医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む。

【0220】

一部の実施形態において、標的代謝産物の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0221】

一部の実施形態において、代謝産物の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超増加する。

【0222】

他の実施形態において、標的代謝産物の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0223】

他の実施形態において、代謝産物の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超増加する。

【0224】

一部の実施形態において、本方法は、標的代謝産物の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0225】

一部の実施形態において、本方法は、代謝産物の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に増加するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0226】

他の実施形態において、本方法は、少なくとも治療期間中である間は標的代謝産物の循環濃度が実質的に低下するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0227】

他の実施形態において、本方法は、少なくとも治療期間中である間は代謝産物の循環濃度が実質的に増加するように、医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む。

【0228】

一部の実施形態において、治療期間は、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である。

【0229】

一部の実施形態において、治療期間内における投与間の時間間隔は、循環中の合成膜－レシーバー複合体の数が投与医薬組成物中に存在する合成膜－レシーバー複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である。

【0230】

他の実施形態において、投与頻度は、標的代謝産物の循環濃度を、代謝疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である。

【0231】

他の実施形態において、投与頻度は、代謝産物の循環濃度を、代謝疾患、障害又は病態の症状に関連するレベルを超えて有効に増加させるのに十分である。

【0232】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与するステップにより、対象の循環系における未結合標的代謝産物の濃度又は全標的代謝産物の濃度が減少する。

【0233】

一部の実施形態において、全標的代謝産物の濃度は、対象の循環系における未結合及び結合標的代謝産物の濃度に略等しい。

【0234】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与するステップにより、対象の循環系における未結合代謝産物の濃度又は全代謝産物の濃度が増加する。

【0235】

一部の実施形態において、本方法は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症－重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）、原発性高シュウ酸尿症、アルカプトン尿症、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）からなる群から選択される代謝疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む。

【0236】

特定の実施形態において、標的代謝産物は、フェニルアラニン、アデノシン、チミジン、デオキシウリジン、オキサレート、ホモゲンチジン酸、フォン・ヴィレンブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｎｂｒａｎｄ）因子からなる群から選択される。

【0237】

一部の実施形態において、レシーバーは膜に会合している。任意選択で、レシーバーは融合物又はキメラである。必要であれば、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含むことができ、ここでＳドメインは合成膜－レシーバー複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは合成膜－レシーバー複合体の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは異なるポリペプチド由来である。一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも６個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態において、Ｓドメインは抗原ポリペプチド又はその抗原断片を含む。

【0238】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、チミジンホスホリラーゼ、グリオキサル酸レダクターゼ、ホモゲンチジン酸レダクターゼ、ＡＤＡＭＴＳ１３からなる群から選択される。

【0239】

本発明の態様は、核酸、脂質、炭水化物及び／又は小分子などの非ポリペプチドレシーバーを含む合成膜レシーバー複合体に関する。一部の実施形態において、レシーバーは膜に会合している。任意選択で、レシーバーは、ポリペプチドを含む融合物又はキメラである。必要であれば、融合物又はキメラは、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含むことができ、ここでＳドメインは合成膜－レシーバー複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、Ｕドメインは合成膜－レシーバー複合体の非露出側に向いており、Ｓドメイン、Ａドメイン、及び／又はＵドメインは由来が異なる。一部の実施形態において、Ｓドメイン及び／又はＡドメインは、少なくとも６個又は少なくとも３０個のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。一部の実施形態において、Ｓドメインは抗原ポリペプチド又はその抗原断片を含む。

【0240】

特定の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも１×１０^５個の合成膜－レシーバー複合体など、合成膜－レシーバー複合体の集団を、任意選択で約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、少なくとも１×１０^１１個の合成膜－レシーバー複合体など、合成膜－レシーバー複合体の集団を、任意選択で約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で含む。

【0241】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示される方法によって投与される医薬組成物の合成膜－レシーバー複合体が提供される。

【0242】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるとおりの合成膜－レシーバー複合体の集団が提供される。任意選択で、合成膜－レシーバー複合体の集団は液体として製剤化される。或いは、合成膜－レシーバー複合体の集団は凍結される。

【0243】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるとおりの合成膜－レシーバー複合体の単離レシーバーが提供される。

【0244】

一部の態様において、本明細書には、本明細書に開示されるレシーバーをコードする外因性核酸が提供される。

【0245】

一部の態様において、本明細書には、標的との相互作用能を有するレシーバーと、レシーバーでないポリペプチドを含む膜とを含む合成膜－レシーバー複合体が提供され、ここで合成膜－レシーバー複合体は、レシーバーとは無関係に触媒活性を有する。

【0246】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ポリペプチドでないレシーバーを含む。

【0247】

一部の実施形態において、本明細書に記載される任意の合成膜－レシーバー複合体は、ポリペプチドレシーバーを含むものを含め、任意選択で治療剤などのペイロードを含む。

【0248】

本発明の態様は、対象の循環系に除核赤血球系細胞が投与されたときに機能的に活性なレシーバーポリペプチドを含む単離された除核赤血球系細胞に関する。一部の実施形態において、赤血球系細胞はヒト細胞である。

【0249】

本発明の態様は、外因性核酸によってコードされるレシーバーポリペプチドを含む単離された機能性赤血球系前駆細胞に関し、ここでレシーバーポリペプチドの発現は、機能性赤血球系前駆細胞が分化するときのＧＰＡ、ｃＫｉｔ、及びＴＲからなる群から選択される表面マーカーの発現；機能性赤血球系前駆細胞が最終成熟するときの除核速度；及び／又は機能性赤血球系前駆細胞が培養下で拡大するときの拡大速度を実質的に改変せず、ここで改変は、ポリペプチドレシーバーを含まない同じ細胞期及び系統の単離非培養赤血球系前駆細胞と比較するものである。

【0250】

本発明の態様は、赤血球系細胞の外表面に局在するレシーバーポリペプチドを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む単離された赤血球系細胞集団に関し、ここで集団は、非赤血球系細胞を実質的に含まない。一部の実施形態において、この集団は５～９５％超の除核赤血球系細胞を含む。

【0251】

本発明の態様は、外因性核酸によってコードされるレシーバーポリペプチドを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む単離された赤血球系細胞集団に関し、ここで除核中、レシーバーポリペプチドは赤血球系細胞によって保持される一方、外因性核酸は保持されない。一部の実施形態において、この集団は、任意選択でｉ）濃縮ステップ及び／又はｉｉ）非赤血球系細胞との共培養がない中で５～９５％超の除核赤血球系細胞を含む。

【0252】

本発明の態様は、外因性核酸によってコードされるレシーバーポリペプチドを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む単離された赤血球系細胞集団に関し、ここで除核中、レシーバーポリペプチドは赤血球系細胞によって保持される一方、外因性核酸は保持されず、及び得られた機能性除核赤血球系細胞は、ポリペプチドレシーバーを含まない単離非培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。

【0253】

本発明の態様は、実質的に同じ分化段階及び／又は細胞周期段階にある複数の機能性赤血球系前駆細胞を含む単離された赤血球系細胞集団に関し、ここで前駆細胞は、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸を含み、及び赤血球前駆細胞の大部分は、外因性核酸を保持することなくレシーバーポリペプチドを保持する成熟赤血球への分化能を有する。

【0254】

本発明の態様は、レシーバーポリペプチドを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む単離された赤血球系細胞集団に関し、ここでレシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸は、培養された又は新鮮に単離された赤血球系細胞前駆体に導入され、及び外因性核酸の導入後、この前駆細胞から機能性赤血球系細胞が培養下で２０，０００倍超に拡大する。一部の実施形態において、この集団は、任意選択でｉ）濃縮ステップ及び／又はｉｉ）非赤血球系細胞との共培養がない中で５～９５％超の除核赤血球系細胞を含む。

【0255】

本発明の態様は、外因性核酸を含む機能性赤血球前駆細胞から培養される単離された赤血球系細胞集団に関し、この集団はピレノサイト（ｐｙｒｅｎｏｃｙｔｅ）と機能性有核赤血球系細胞と機能性除核赤血球系細胞とを含み、ここで機能性有核赤血球系細胞及び機能性除核赤血球系細胞は、外因性核酸によってコードされるレシーバーポリペプチドを含み、及びレシーバーポリペプチドが機能性除核赤血球系細胞によって保持される一方、外因性核酸は除核赤血球系細胞によって保持されない。一部の実施形態において、除核機能性赤血球系細胞は、ポリペプチドレシーバーを含まない単離非培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。

【0256】

一部の実施形態において、本明細書に記載される赤血球系細胞集団は、１％超、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％超の胎児ヘモグロビンを含む。

【0257】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、１細胞当たり少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、又は１００，０００コピーのレシーバーポリペプチドを呈する。

【0258】

特定の実施形態において、複数の機能性赤血球系細胞が、対象の循環系に投与された後にその細胞膜の実質的な部分を喪失する。

【0259】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、標的と相互作用するレシーバーポリペプチドを含む。一部の実施形態において、標的との相互作用には、標的に結合すること、標的を分解すること、標的を切断すること、及び／又は標的を隔絶することが含まれる。

【0260】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは細胞表面上に提示される。他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは機能性赤血球系細胞の内部に局在する。

【0261】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、抗体、一本鎖可変断片、ナノボディ、ダイアボディ、ダルビン（ｄａｒｂｉｎ）、リアーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、及びＤＮアーゼからなる群から選択されるレシーバーポリペプチドを含む。

【0262】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、免疫複合体、炎症分子、炎症細胞、脂質、炭水化物、アミノ酸、ウイルス、細菌、細菌性毒素、真菌、真菌性毒素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、循環細胞、腫瘍細胞、転移性癌細胞、代謝産物、植物性毒素、サイトカイン、ケモカイン、補体カスケード因子、及び凝固カスケード因子からなる群から選択される標的と相互作用するレシーバーポリペプチドを含む。

【0263】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、内因性ポリペプチドに融合したレシーバーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、内因性ポリペプチドは細胞内ポリペプチドである。一部の実施形態において、内因性ポリペプチドは細胞外ポリペプチドである。一部の実施形態において、内因性ポリペプチドは膜結合型である。

【0264】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、内因性細胞外ポリペプチドに融合したレシーバーポリペプチドを含む。

【0265】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、赤血球系細胞にコンジュゲートしたレシーバーポリペプチドを含む。

【0266】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、細胞間で標的と相互作用するレシーバーポリペプチドを含む。

【0267】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、赤血球系細胞のサイトゾルに局在するレシーバーポリペプチドを含む。

【0268】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、赤血球系細胞の細胞膜に位置するレシーバーポリペプチドを含む。

【0269】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は複数のレシーバーポリペプチドを含む。一部の実施形態において、第１のレシーバーポリペプチドは機能性赤血球系細胞のサイトゾルに位置し、第２のレシーバーポリペプチドは機能性赤血球系細胞の細胞表面上に位置する。

【0270】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ボツリヌス毒素を結合する抗体のＦｖ部分であるレシーバーポリペプチドを含み、標的はボツリヌス毒素である。

【0271】

他の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、補体受容体１であるレシーバーポリペプチドを含み、標的は循環免疫複合体である。

【0272】

さらに他の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ダッフィ抗原受容体複合体（ＤＡＲＣ）であるレシーバーポリペプチドを含み、標的は循環ケモカインである。

【0273】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）であるレシーバーポリペプチドを含み、標的はフェニルアラニンである。

【0274】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、細胞質βグロビンタンパク質のＣ末端の融合物として発現するレシーバーポリペプチドを含む。

【0275】

他の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、エキソヌクレアーゼであるレシーバーポリペプチドを含み、及び標的は循環無細胞ＤＮＡ分子である。

【0276】

さらに他の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、内因性グリコホリンＡのＮ末端の融合物として発現するレシーバーポリペプチドを含む。

【0277】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、共有結合形成によって赤血球系細胞上に細胞外で結合するレシーバーポリペプチドを含む。一部の実施形態において、共有結合はイソペプチダーゼによって形成される。一部の実施形態において、イソペプチダーゼはＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは細胞の表面上に発現する。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは膜貫通タンパク質の細胞外末端に融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは複数回膜貫通タンパク質の細胞外領域におけるインフレーム融合物である。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇはＧＰＩ結合型タンパク質に融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒはレシーバーポリペプチドに融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合したレシーバーポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現するのと同じ機能性赤血球系細胞において発現し、及び／又は分泌される。一部の実施形態において、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合したレシーバーポリペプチドは外因性タンパク質産生系によって発現し、次に、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現する機能性赤血球系細胞と接触する。一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに置き換えられ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒがＳｐｙＴａｇに置き換えられる。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは共有結合形成によって機能性赤血球系細胞の細胞内にアンカリングされる。一部の実施形態において、共有結合はイソペプチダーゼによって形成される。一部の実施形態において、イソペプチダーゼはＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは細胞の細胞内空間で発現する。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは膜タンパク質の細胞内末端に融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは複数回膜貫通タンパク質の細胞内領域にあるインフレーム融合物である。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは内因性細胞内タンパク質に融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＴａｇは細胞骨格タンパク質に融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒはレシーバーポリペプチドに融合する。一部の実施形態において、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合したレシーバーポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現するのと同じ機能性赤血球系細胞の細胞内空間で発現する。一部の実施形態では、ＳｐｙＴａｇがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに置き換えられ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒがＳｐｙＴａｇに置き換えられる。

【0278】

本発明の態様は、レシーバーポリペプチドを含む機能性赤血球系細胞を作成する方法に関し、本方法は、赤血球系細胞をレシーバーと接触させるステップと、赤血球系細胞を制御された細胞傷害に供するステップとを含む。特定の実施形態において、制御された細胞傷害は、細胞変形、電気穿孔、ソノポレーション、リポソームトランスフェクション、又は塩ベースのトランスフェクションである。一部の実施形態において、細胞は、レシーバーポリペプチドをコードするｍＲＮＡと接触させる。一部の実施形態において、この接触させるステップにより、レシーバーポリペプチドをコードするｍＲＮＡが赤血球系細胞又は赤血球系細胞前駆体によって取り込まれて翻訳される。

【0279】

特定の実施形態において、本明細書に記載される赤血球系細胞の集団はインビトロで維持及び／又は増殖される。他の実施形態において、本明細書に記載される赤血球系細胞の集団は凍結乾燥される。さらに他の実施形態において、本明細書に記載される赤血球系細胞の集団は凍結される。

【0280】

本発明の態様は、標的を接触させる方法に関し、本方法は、本明細書に記載される赤血球系細胞集団を生物学的試料又は対象に導入するステップと、集団の機能性赤血球系細胞が試料又は対象中の標的と相互作用するのに十分な時間にわたり赤血球系細胞集団と試料又は対象との接触を維持するステップとを含む。一部の実施形態において、標的との相互作用には、標的に結合すること、標的を分解すること、標的を切断すること、及び／又は標的を隔絶することが含まれる。特定の実施形態において、標的を接触させる方法はインビトロで実施される。他の実施形態において、標的を接触させる方法はインビボで、例えば動物において実施される。一部の実施形態において、標的を接触させる方法は、標的をアッセイ可能部分と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態において、アッセイ可能部分を使用することにより、機能性赤血球系細胞と標的との間の相互作用の速度及び／又は程度が決定される。

【0281】

本発明の態様は、本明細書に記載されるレシーバーを含む機能性赤血球系細胞を含む赤血球系細胞集団を含む医薬組成物に関する。任意選択で、赤血球系細胞集団を含む医薬組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含む。任意選択で、赤血球系細胞集団を含む医薬組成物は治療剤をさらに含む。

【0282】

本発明の態様は、疾患又は病態を治療し、予防し、又は管理する方法に関し、本方法は、かかる治療、予防又は管理を必要としている対象に、レシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団を含む医薬組成物の治療上又は予防上有効な量を投与するステップであって、それにより疾患又は病態を治療し、予防し、又は管理するステップを含む。

【0283】

本発明の態様は、本明細書に記載される治療又は予防方法のいずれかで使用されるレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、対象の循環系に滞留する標的と相互作用する。一部の実施形態において、標的の存在、非存在、レベル上昇又はレベル低下が疾患、障害又は病態に関連する。一部の実施形態において、標的との相互作用には、標的に結合すること、標的を分解すること、標的を切断すること、及び／又は標的を隔絶することが含まれる。一部の実施形態において、レシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団を含む医薬組成物の投与により、対象の循環系における標的の濃度又は数が実質的に減少する。

【0284】

本発明の態様は、レシーバーポリペプチドを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む医薬組成物に関し、ここで赤血球系細胞は細胞内又は細胞上にレシーバーポリペプチドを呈示し、及び対象の循環系に機能性赤血球系細胞が投与されたときのレシーバーポリペプチドは：対照動物における非修飾赤血球系細胞と比較したとき、機能性赤血球系細胞の循環クリアランス時間に実質的に影響を及ぼさず、及び／又は非修飾赤血球系細胞と比較してフィブリノゲン崩壊（フィブリノペプチドＡ及び／又はフィブリノペプチドＢの循環レベルによって計測される）を活性化しない。

【0285】

本発明の態様は、本明細書に記載される機能性赤血球系細胞集団を培養する方法に関し、本方法は、幹細胞因子、ＩＬ－３、ＩＬ－６、インスリン、トランスフェリン、エリスロポエチン、ヒドロコルチゾン、及びエストロゲンからなる群から選択される１つ以上の培養因子を使用して機能性赤血球系細胞を培養するステップを含む。

【0286】

本発明の態様は、同じ血液型の少なくとも１０％の網赤血球を含む少なくとも１０^１０個の細胞の集団に関し、ここで複数の網赤血球がレシーバーポリペプチドを含む。

【0287】

本発明の態様は、本明細書に開示される疾患、障害、又は病態のいずれかの治療において使用される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物に関する。

【0288】

本発明の態様は、哺乳類対象の循環系における標的の存在又は濃度に関連する疾患、障害、又は病態の治療において使用される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物に関する。

【0289】

本発明の態様は、標的の循環濃度のモジュレーションにおいて使用される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物に関する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
標的自己抗体の循環濃度を低減する方法であって、自己抗体媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがあるヒト対象に、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む方法であって、前記医薬組成物が、前記標的自己抗体の前記循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される、方法。
（項目２）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記対象の血漿量に等しい分布容積を有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記自己抗体媒介性疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が軽減されるように前記医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記自己抗体媒介性疾患、障害又は病態が予防されるように前記医薬組成物を治療期間にわたって少なくとも２回投与するステップを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記標的自己抗体の前記循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記標的自己抗体の前記循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それにより前記自己抗体媒介性疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され、又は遅延するように、前記医薬組成物を前記治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記標的自己抗体の前記循環濃度が、ｉ）前記ヒト対象による前記標的自己抗体の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）前記ヒト対象による前記標的自己抗体の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように、前記医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記標的自己抗体の前記循環濃度が、前記治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する、項目６～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記標的自己抗体の前記循環濃度が、前記投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する、項目６～８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記標的自己抗体の前記循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、前記医薬組成物を治療期間に十分な回数投与するステップを含む、項目４～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
少なくとも治療期間中である間は前記標的自己抗体の前記循環濃度が実質的に低下するように、前記医薬組成物を前記治療期間に十分な回数投与するステップを含む、項目４～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記治療期間が、１年、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、１日以下である、項目４～１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記治療期間内の投与間の時間間隔が、循環中の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の数が前記投与医薬組成物中に存在する合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である、項目４～１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
投与頻度が、前記標的自己抗体の前記循環濃度を、前記自己抗体媒介性疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分である、項目９又は１０に記載の方法。
（項目１６）
前記医薬組成物を投与するステップにより、前記対象の循環系における未結合標的自己抗体の濃度又は全標的自己抗体の濃度が減少する、項目９又は１０に記載の方法。
（項目１７）
前記全標的自己抗体の濃度が、前記対象の前記循環系における未結合及び結合標的自己抗体の濃度に略等しい、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記医薬組成物が、薬学的に活性な薬剤をさらに含む、項目１～１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
薬学的に活性な薬剤を投与するステップをさらに含み、前記薬学的に活性な薬剤が前記医薬組成物の前に、その後に、又はそれと同時に投与される、項目１～１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記医薬組成物が局所投与又は非経口投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記薬学的に活性な薬剤が、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される、項目１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記医薬組成物が、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、ループス、免疫性血小板減少性紫斑病、温式抗体溶血性貧血、寒冷凝集素症、グッドパスチャー症候群、抗リン脂質抗体症候群、及び膜性糸球体腎炎からなる群から選択される自己抗体媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそのリスクがある対象を治療のために選択するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が前記対象の循環系での短期持続時間用に製剤化される、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が前記対象の循環系での長期持続時間用に製剤化される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
レシーバーポリペプチドが前記対象の前記循環系において膜から実質的に解離しない、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
レシーバーポリペプチドが前記循環系に少なくとも２１日間存在する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、ｉ）ＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片、又はｉｉ）細胞膜ポリペプチド、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記ポリペプチド複合体が長期持続時間にわたり前記循環系に滞留するのに有効な量でＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が実質的な量の複製核酸を含有しない、項目１～３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、５００，０００コピー、１，０００，０００コピー、又は２，０００，０００コピーの前記レシーバーポリペプチドを含み、及び／又は前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、少なくとも１：１０，０００の前記レシーバーポリペプチドと、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸からなる群から選択される膜脂質との比を含む、項目１～３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記レシーバーポリペプチドに加えて少なくとも第２のポリペプチドを含む、項目１～３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記レシーバーポリペプチドとは無関係に２つ以上の基質に対する触媒活性を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第２のポリペプチドが前記膜に会合している、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記レシーバーポリペプチドが外因性核酸によってコードされる、項目１～３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記外因性核酸が前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体によって実質的に保持されない、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記レシーバーポリペプチドの発現が有効に終結される、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記レシーバーポリペプチドが前記膜に会合している、項目１～３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記レシーバーポリペプチドが融合物又はキメラである、項目１～３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記融合物又はキメラが、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含み、前記Ｓドメインが前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、前記Ａドメインがアンカーであり、前記Ｕドメインが前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の非露出側に向いており、前記Ｓドメイン、前記Ａドメイン、及び／又は前記Ｕドメインが異なるポリペプチド由来である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記Ｓドメイン及び／又は前記Ａドメインが少なくとも６個のアミノ酸を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記Ｓドメイン及び／又はＡドメインが少なくとも３０個のアミノ酸を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記標的自己抗体が、糖タンパク質（ＧＰ Ｉｂ－ＩＸ、ＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＩＶ、又はＩａ－ＩＩａ）、コラーゲンα３（ＩＶ）のＮＣ１ドメイン、Ｂ２グリコプロテイン１、又はホスホリパーゼＡ２受容体を特異的に認識する、項目１～４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記レシーバーポリペプチドが、糖タンパク質（ＧＰ Ｉｂ－ＩＸ、ＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＩＶ、又はＩａ－ＩＩａ）、コラーゲンα３（ＩＶ）のＮＣ１ドメイン、Ｂ２グリコプロテイン１、又はホスホリパーゼＡ２受容体からなる群から選択される抗原ポリペプチド、又はその抗原断片を含む、項目１～４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記Ｓドメインが前記抗原ポリペプチド又はその抗原断片を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
項目１に記載の方法によって投与される医薬組成物。
（項目４８）
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、項目４７に記載の医薬組成物。
（項目４９）
合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団を含む、項目４７又は４８に記載の医薬組成物。
（項目５０）
少なくとも１×１０^５個の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む、項目４９に記載の医薬組成物。
（項目５１）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で提供される、項目５０に記載の医薬組成物。
（項目５２）
少なくとも１×１０^１１個の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む、項目４９に記載の医薬組成物。
（項目５３）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で提供される、項目５２に記載の医薬組成物。
（項目５４）
長期保存用に製剤化される、項目４７～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５５）
凍結される、項目４７～５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５６）
薬学的に活性な薬剤を含む、項目４７～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目５７）
前記薬学的に活性な薬剤が、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される、項目５６に記載の医薬組成物。
（項目５８）
静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化された項目４７～５７のいずれか一項に記載の組成物を含む剤形。
（項目５９）
項目４７～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物を保持する容器と、対象への前記医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具。
（項目６０）
項目４７～５７のいずれか一項に記載の医薬組成物と、対象への前記医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キット。
（項目６１）
項目１に記載の方法によって投与される医薬組成物の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体。
（項目６２）
項目６１に記載の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団。
（項目６３）
液体として製剤化された項目６２に記載の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団。
（項目６４）
凍結される、項目６２に記載の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団。
（項目６５）
項目６１に記載の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の単離レシーバーポリペプチド。
（項目６６）
項目６５に記載のレシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸。
（項目６７）
標的との相互作用能を有するレシーバーポリペプチドと、
第２のポリペプチドを含む膜と
を含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体であって、
レシーバーとは無関係に触媒活性を有する、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体。
（項目６８）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、哺乳類対象の循環系への静脈内投与用に製剤化される、項目６７に記載の複合体。
（項目６９）
前記哺乳類対象がヒトである、項目６８に記載の複合体。
（項目７０）
前記レシーバーポリペプチドが、前記対象の前記循環系における未結合標的又は全標的の濃度を低減する能力を有する、項目６７～６９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目７１）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記対象の血漿量と略等しい又は均等な分布容積を有する、項目６８又は６９に記載の複合体。
（項目７２）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が０．０９ｌ／ｋｇ未満の分布容積を有する、項目６８又は６９に記載の複合体。
（項目７３）
前記レシーバーポリペプチドが、実質的に前記対象の前記循環系における前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の持続時間にわたり前記循環系に存在する、項目６８又は６９に記載の複合体。
（項目７４）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が前記対象の前記循環系での短期持続時間用に製剤化される、項目６８又は６９に記載の複合体。
（項目７５）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が前記対象の前記循環系での長期持続時間用に製剤化される、項目６８又は６９に記載の複合体。
（項目７６）
前記レシーバーポリペプチドが前記循環系に少なくとも約２１日間存在する、項目７５に記載の複合体。
（項目７７）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸を含む、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、ＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片をさらに含む、項目７５に記載の複合体。
（項目７９）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記複合体が長期持続時間にわたり前記循環系に滞留するのに有効な量でＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片を含む、項目７８に記載の複合体。
（項目８０）
標的と相互作用することが、前記標的を結合し、分解し、切断し及び／又は隔絶することを含む、項目６７～７９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８１）
標的と相互作用することが、前記標的の活性を改変することを含む、項目６７～７９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８２）
標的と相互作用することが、前記標的の活性を低減することを含む、項目６７～７９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８３）
標的と相互作用することが、前記標的を不活性化することを含む、項目６７～７９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８４）
前記標的が、自己抗体、補体タンパク質、免疫複合体、血清アミロイドタンパク質、代謝産物又は毒素である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８５）
前記標的が、炎症分子、サイトカイン又はケモカインである、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８６）
前記標的が、脂質又は炭水化物、アミノ酸である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８７）
前記標的が、ウイルス、ウイルス抗原、エンベロープ抗原又はカプシド抗原である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８８）
前記標的が、細菌、細菌性抗原、細菌性表面抗原、分泌細菌性毒素、又は分泌細菌性抗原である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目８９）
前記標的が、真菌、真菌性抗原、真菌性細胞表面抗原、分泌真菌性毒素、又は分泌真菌性抗原である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９０）
前記標的がＤＮＡ又はＲＮＡである、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９１）
前記標的が、循環細胞、炎症細胞、腫瘍細胞、又は転移性癌細胞である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９２）
前記レシーバーポリペプチドが、補体受容体１（ＣＲ１）ポリペプチド、その変異体又は機能断片である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９３）
前記ＣＲ１ポリペプチドが、１つ以上のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）及び／又はロング相同リピート（ＬＨＲ）を含む、項目９２に記載の複合体。
（項目９４）
前記レシーバーポリペプチドが、ダッフィ抗原受容体複合体（ＤＡＲＣ）、その変異体又は機能断片である、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９５）
前記レシーバーポリペプチドが、抗体、一本鎖可変断片、ナノボディ、ダイアボディ、又はＤＡＲＰｉｎである、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９６）
前記レシーバーポリペプチドが、リアーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はヌクレアーゼである、項目６７～８３のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９７）
前記レシーバーポリペプチドが、前記合成レシーバーポリペプチド複合体の周りの環境に露出している、項目６７～９６のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９８）
前記レシーバーポリペプチドが、前記合成レシーバーポリペプチド複合体の非露出側に位置する、項目６７～９６のいずれか一項に記載の複合体。
（項目９９）
前記レシーバーポリペプチドが前記膜に会合している、項目９７又は９８に記載の複合体。
（項目１００）
前記レシーバーポリペプチドが融合物又はキメラである、項目６７～９９のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１０１）
前記融合物又はキメラが、Ｓドメイン、Ａドメイン又はＵドメインのうちの少なくとも１つを含み、前記Ｓドメインが前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の周りの前記環境に露出した表面ドメインであり、前記Ａドメインがアンカーであり、前記Ｕドメインが前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の前記非露出側に向いており、前記Ｓドメイン、前記Ａドメイン、及び／又は前記Ｕドメインが異なるポリペプチド由来である、項目１００に記載の複合体。
（項目１０２）
前記Ｓドメイン及び／又は前記Ａドメインが少なくとも６個のアミノ酸を含む、項目１０１に記載の複合体。
（項目１０３）
前記Ａドメインが少なくとも３０個のアミノ酸を含む、項目１０１に記載の複合体。
（項目１０４）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、少なくとも１０コピー、１００コピー、１，０００コピー、１０，０００コピー、２５，０００コピー、５０，０００コピー、又は１００，０００コピー、５００，０００コピー、１，０００，０００コピー、又は２，０００，０００コピーのレシーバーポリペプチドを含み、及び／又は前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、少なくとも１：１０，０００の前記レシーバーポリペプチドと、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸からなる群から選択される膜脂質との比を含む、項目１に記載の複合体。
（項目１０５）
前記レシーバーポリペプチドが組換え核酸によってコードされる、項目１～１０４のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１０６）
前記組換え核酸が前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体によって保持されない、項目１０５に記載の複合体。
（項目１０７）
前記レシーバーポリペプチドの発現が有効に終結される、項目１０５に記載の複合体。
（項目１０８）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が実質的な量の複製核酸を含有しない、項目６７～１０７のいずれか一項に記載の複合体。
（項目１０９）
項目６７～１０８のいずれか一項に記載の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
（項目１１０）
少なくとも１×１０^５個の合成膜－レシーバー複合体を含む、項目１０９に記載の医薬組成物。
（項目１１１）
前記合成膜－レシーバー複合体が、約１０ｎｌ、１００ｎｌ、１μｌ、１０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、又は５０ｍｌの容積で提供される、項目１１０に記載の医薬組成物。
（項目１１２）
少なくとも１×１０^１１個の合成膜－レシーバー複合体を含む、項目１０９に記載の医薬組成物。
（項目１１３）
前記合成膜－レシーバー複合体が、約１ｍｌ、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、又は５００ｍｌの容積で提供される、項目１１２に記載の医薬組成物。
（項目１１４）
長期保存用に製剤化される、項目１０９～１１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１１５）
凍結される、項目１０９～１１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１１６）
薬学的に活性な薬剤を含む、項目１０９～１１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目１１７）
前記薬学的に活性な薬剤が、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤から選択される、項目１１６に記載の医薬組成物。
（項目１１８）
静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化された項目１０９に記載の医薬組成物を含む剤形。
（項目１１９）
項目１０９に記載の医薬組成物を保持する容器と、対象への前記医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具。
（項目１２０）
項目１０９に記載の医薬組成物と、対象への前記医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キット。
（項目１２１）
哺乳類対象の循環系における標的の存在又は濃度に関連する疾患、障害又は病態を治療又は予防する方法であって、項目１０９～１１７のいずれか一項に記載の医薬組成物を疾患、障害又は病態の治療又は予防に有効な量で前記対象に静脈内投与するステップを含む方法。
（項目１２２）
前記標的が前記疾患、障害又は病態に関連する、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
標的の循環濃度をモジュレートする方法であって、哺乳類対象の循環系における前記標的の存在、非存在、濃度上昇又は濃度低下に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある前記対象に、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を、前記標的の前記循環濃度を実質的にモジュレートするのに有効な量で投与するステップを含む方法。
（項目１２４）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、前記対象の血漿量に等しい分布容積を有する、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
循環中の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の量が、ｉ）初回に投与された前記複合体の濃度の５０％、又はｉｉ）循環中の前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体のＣｍａｘの５０％に減少したとき、投与が繰り返される、項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
前記合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が循環中の前記標的と相互作用する、項目１２３～１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記標的と相互作用することが、前記標的を結合し、分解し、切断し及び／又は隔絶することを含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記標的と相互作用することが、前記標的の活性を改変することを含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１２９）
前記標的と相互作用することが、前記標的の活性を低減することを含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１３０）
前記標的と相互作用することが、前記標的を不活性化することを含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１３１）
前記標的と相互作用することが、前記標的を触媒的に変換することを含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１３２）
モジュレートすることが、前記標的の前記循環濃度を低減することからなる、項目１２３～１３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
前記対象の前記循環系における前記標的の存在又はレベル上昇が、前記疾患、障害又は病態に関連する、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
非標的化合物の循環濃度を増加させるステップをさらに含む、項目１３２に記載の方法。
（項目１３５）
前記対象の前記循環系における前記非標的化合物の非存在又はレベル低下が、前記疾患、障害又は病態に関連する、項目１３４に記載の方法。
（項目１３６）
前記標的が、生物学的化合物、無機化合物、有機化合物、気体化合物又は元素である、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記標的が、１０００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、２５０Ｄａ未満、又は１００Ｄａ未満である、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記標的が１ｋＤａより大きい、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
前記標的が、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、アミノ酸、代謝産物、又は小分子である、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記標的が、抗体、補体因子、免疫複合体、血清アミロイドタンパク質、細菌性病原体、真菌性病原体、ウイルス性病原体、又は感染した、病原性の、アポトーシスを起こした、壊死した、異常な若しくは発癌性の哺乳類細胞である、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４１）
前記標的がアミロイドポリペプチドである、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
前記標的が補体ポリペプチドである、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
前記標的の前記循環濃度の実質的なモジュレーションが可逆的である、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
前記標的の前記循環濃度の実質的なモジュレーションが時間的に限定されている、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４５）
前記標的の前記循環濃度の実質的なモジュレーションが空間的に限定されている、項目１２３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４６）
本明細書に開示される疾患、障害、又は病態のいずれかの治療において使用される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物。
（項目１４７）
哺乳類対象の循環系における標的の存在又は濃度に関連する疾患、障害、又は病態の治療において使用される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物。
（項目１４８）
標的の循環濃度のモジュレーションにおいて使用される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物。

【0290】

図は、本発明の１つ以上の特徴、態様、又は実施形態の例示を目的とするものであり、限定することは意図されない。

【図面の簡単な説明】

【0291】

【図1】リポソーム内に封入された蛍光標識ＩｇＧと接触させた赤血球の一連のフローサイトメトリープロットである。リポソーム無し（左）、低用量のリポソーム（中央）、及び高用量のリポソーム（左）と共にインキュベートした細胞が示される。下段のヒストグラムには、蛍光を示す細胞の割合が示される。

【図2】定量的フローサイトメトリーによって評価した細胞表面発現レベルのプロットである。このプロットは、赤血球系細胞分化の過程における種々の細胞表面受容体－グリコホリンＡ（塗り潰した三角形）、ｃＫＩＴ（破線上の四角形）、トランスフェリン受容体（点線上の菱形）－及び外因性表面トランス遺伝子（白色の丸）を示す。

【図3-1】図３Ａ－図３ＡＶは、３つの細胞型、除核赤血球系細胞、有核赤血球系前駆細胞、及び赤白血病細胞における、表面上での、細胞質における、融合物としての、及びインタクトなタンパク質としての多数の例示的レシーバーの発現を実証する一連のフローサイトメトリープロット及びウエスタンブロットである。図３Ａ－図３Ｓは、除核培養赤血球系細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３Ａ－共翻訳されるＧＦＰの発現によって評価した、細胞質Ｃ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｂ－抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列と遺伝子本体との間のＮ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｃ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有する約７０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。図３Ｆ－抗ＨＡ染色によって評価した、グリコホリンＡに対するＮ末端融合としての抗体ｓｃＦｖの発現。図３Ｉ－抗ＨＡ染色によって評価した、７１アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３Ｊ－抗ＨＡ染色によって評価した、７９アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３Ｋ－抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５５の発現。図３Ｌ－抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５９の発現。図３Ｍ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、３７アミノ酸のＣＤ５５由来断片のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３Ｏ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約４０ｋＤａ。図３Ｐ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約３３ｋＤａ。

【図3-2】図３Ａ－図３ＡＶは、３つの細胞型、除核赤血球系細胞、有核赤血球系前駆細胞、及び赤白血病細胞における、表面上での、細胞質における、融合物としての、及びインタクトなタンパク質としての多数の例示的レシーバーの発現を実証する一連のフローサイトメトリープロット及びウエスタンブロットである。図３Ａ－図３Ｓは、除核培養赤血球系細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３Ｔ－図３ＡＯは、有核培養赤血球系前駆細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３Ｑ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、アデノシンデアミナーゼ及びＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。図３Ｒ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約５５ｋＤａ。図３Ｓ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約５０ｋＤａ。図３Ｔ－共翻訳されるＧＦＰの発現によって評価した、細胞質Ｃ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｕ－抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列と遺伝子本体との間のＮ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡの発現。図３Ｖ－抗ＣＲ１染色によって評価した、補体受容体１の過剰発現。図３Ｗ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有する約７０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。図３Ｘ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有する約２１０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。図３Ｙ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡのＮ末端に融合した約２３０ｋＤａの補体受容体１由来断片の発現。図３Ｚ－抗ＨＡ染色によって評価した、グリコホリンＡに対するＮ末端融合としての抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＡ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｋｅｌｌの細胞外Ｃ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。予想サイズ約１０８ｋＤａ。図３ＡＢ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｋｅｌｌの細胞外Ｃ末端に融合したＨＡタグの発現。図３ＡＣ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｃ（細胞外）末端にＨＡタグを有する７１アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片の発現。図３ＡＤ－抗ＨＡ染色によって評価した、Ｃ末端にＨＡタグを有する７９アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片の発現。図３ＡＥ－抗ＨＡ染色によって評価した、７１アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＦ－抗ＨＡ染色によって評価した、７９アミノ酸のＫｅｌｌ由来断片のＣ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。

【図3-3】図３Ａ－図３ＡＶは、３つの細胞型、除核赤血球系細胞、有核赤血球系前駆細胞、及び赤白血病細胞における、表面上での、細胞質における、融合物としての、及びインタクトなタンパク質としての多数の例示的レシーバーの発現を実証する一連のフローサイトメトリープロット及びウエスタンブロットである。図３Ａ－図３Ｓは、除核培養赤血球系細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３Ｔ－図３ＡＯは、有核培養赤血球系前駆細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３ＡＧ－抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５５の発現。図３ＡＨ－抗ＨＡ染色によって評価した、リーダー配列後の細胞外Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するＣＤ５９の発現。図３ＡＩ－抗ＨＡ染色によって評価した、３７アミノ酸のＣＤ５５由来断片のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＪ－抗ＨＡ染色によって評価した、ＣＤ５９のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＫ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約４０ｋＤａ。図３ＡＬ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約３３ｋＤａ。図３ＡＭ－共翻訳されるＧＦＰからの蛍光についてフローサイトメトリーによって評価した、アデノシンデアミナーゼ及びＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。図３ＡＮ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約５５ｋＤａ。図３ＡＯ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、グリコホリンＡの細胞内Ｃ末端に融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約５０ｋＤａ。図３ＡＰ－図３ＡＵは、Ｋ５６２赤白血病細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。図３ＡＰ－抗ＣＲ１染色によって評価した、補体受容体１の過剰発現。図３ＡＱ－抗ＨＡ染色によって評価した、グリコホリンＡに対するＮ末端融合としての抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＲ－抗ＨＡ染色によって評価した、３７アミノ酸のＣＤ５５由来断片のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＳ－抗ＨＡ染色によって評価した、ＣＤ５９のＮ末端に融合した抗体ｓｃＦｖの発現。図３ＡＴ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したアデノシンデアミナーゼの細胞質発現。予想サイズ約４０ｋＤａ。図３ＡＵ－抗ＨＡウエスタンブロットによって評価した、ＨＡタグに融合したフェニルアラニンヒドロキシラーゼの細胞質発現。予想サイズ約３３ｋＤａ。

【図4】蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトした初代血小板における蛍光を計測する一連のフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ａ）非トランスフェクト血小板。（Ｂ）３ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板。（４Ｃ）６．８ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板。

【図5】培養下のトランスジェニック赤血球系細胞のタンパク質発現及び酵素活性を示す。（Ａ）は、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたって抗ＨＡ抗体で検出した外因的に発現するアデノシンデアミナーゼのウエスタンブロットである。（Ｂ）は、インタクトなアデノシンデアミナーゼ発現２９３Ｔ細胞によってアデノシンから産生されるイノシンの棒グラフである。（Ｃ）は、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたって種々の時点で抗ＨＡ抗体で検出した外因的に発現するフェニルアラニンヒドロキシラーゼのウエスタンブロットである。（Ｄ）は、培養フェニルアラニンヒドロキシラーゼ発現除核赤血球系細胞のライセートによってフェニルアラニンから産生されるチロシンの棒グラフである。

【図6】補体受容体１（ＣＲ１）を過剰発現する培養赤血球系細胞による免疫複合体の捕捉及びマクロファージへのトランスファーを示す。（Ａ）は、ＣＲ１を過剰発現する培養赤血球系細胞による蛍光免疫複合体（白色のヒストグラム）及び補体欠損免疫複合体（網掛けのヒストグラム）の捕捉を示すフローサイトメトリープロットである。（Ｂ）は、マクロファージ（左のセット）又はＣＲ１を過剰発現する培養赤血球系細胞と共にインキュベートしたマクロファージ（右のセット）による蛍光免疫複合体（斜線網掛けのバー）、補体欠損免疫複合体（灰色のバー）、又は免疫複合体無し（黒色のバー）の取込みを評価するフローサイトメトリーデータの棒グラフである。

【図7】培養赤血球系細胞の表面上のＢ型肝炎表面抗原を結合する抗体ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）の活性を示す。（Ａ）は、４５０ｎＭ抗原（白色のヒストグラム）又は抗原無し（灰色のヒストグラム）の結合を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。（Ｂ）は、様々な抗原濃度についてフローサイトメトリーによって評価した結合シグナルのタイトレーションである。（Ｃ～Ｄ）は、蛍光抗原及びｓｃＦｖを発現しない（Ｃ）又は発現する（Ｄ）培養赤血球系細胞を注射したマウスからの血液細胞のフローサイトメトリープロットである。ｙ軸は抗原蛍光を表す。ｘ軸は培養細胞の蛍光を表す。

【図8】インビボで膜－レシーバー複合体によって媒介される循環抗体の特異的クリアランスを示す。（Ａ）は、表面上にＨＡエピトープタグを発現しない（上）、或いは発現する（下）レシピエントマウスから単離したＣＦＳＥ標識培養ヒト赤血球系細胞に対する循環Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０標識マウス抗ＨＡ抗体の結合無し（上）及び結合（下）を示す一組のフローサイトメトリープロットである。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ＨＡ抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０蛍光を表す。（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体（白色の丸、実線）、抗ＨＡ抗体と、続いてＨＡエピトープタグを発現しない培養ヒト赤血球系細胞（破線）、又は抗ＨＡ抗体と、続いてＨＡエピトープタグを発現する培養ヒト赤血球系細胞（点線）を注射したマウスから採取した血漿中の経時的な抗ＨＡ抗体レベルを比較するＨＡエピトープタグ基質ＥＬＩＳＡからのデータである。（Ｃ）は、表面上でビオチンにコンジュゲートしていない（上）、或いはコンジュゲートしている（下）ＣＦＳＥ標識初代ヒト赤血球に対するＤｙｌｉｇｈｔ６５０標識マウス抗ビオチン抗体の結合無し（上）及び結合（下）を示す一組のフローサイトメトリープロットである。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ビオチン抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０蛍光を表す。（Ｄ）は、抗ビオチン抗体（白色の丸、実線）、抗ビオチン抗体と、続いてビオチンにコンジュゲートしていない培養ヒト赤血球系細胞（破線）、又は抗ビオチン抗体と、続いてビオチンにコンジュゲートしている培養ヒト赤血球系細胞（点線）を注射したマウスから採取した血漿中の経時的な抗ビオチン抗体レベルを比較するビオチン基質ＥＬＩＳＡからのデータである。

【図9】マウスにおける培養ヒト赤血球系細胞のクリアランス速度を示す。（Ａ）は、ヒトグリコホリンＡ（ｙ軸）及びＣＦＳＥ（ｘ軸）について染色した採取血液の代表的なフローサイトメトリードットプロットであり、ここではヒト培養細胞がダブルポジティブである。（Ｂ）は、ＮＳＧマウスにヒト赤血球（塗り潰しの丸）、培養除核赤血球系細胞（破線上の菱形）、細胞内外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（点線上の四角形）及び表面外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（白色の三角形）を注射した後に残るダブルポジティブ細胞の割合としての経時的なクリアランス速度のプロットである。

【図10】培養ヒト赤血球系細胞をマウスに注射した後の有害事象の評価である。（Ａ～Ｂ）は、（１）ヒト赤血球、（２）培養ヒト赤血球系細胞、（３）外因性細胞質タンパク質を発現する培養ヒト赤血球系細胞、（４）外因性表面トランス遺伝子を発現する培養ヒト赤血球系細胞、又は（５）組換えタンパク質の注射後２０分（黒色）、６時間（灰色）、及び４８時間（白色）にマウスから採取した血漿中のＥＬＩＳＡによって評価した（Ａ）フィブリノペプチドＡ及び（Ｂ）フィブリノペプチドＢのレベルを示す。（Ｃ～Ｄ）は、（Ｃ）培養ヒト赤血球系細胞及び（Ｄ）組換えタンパク質を注射したマウスに関する脾臓の組織染色切片の顕微鏡像を示す。

【図11】循環中の培養赤血球系細胞上での外因性タンパク質の発現を追跡する。（Ａ）は、外因性表面タンパク質を発現する培養ヒト赤血球系細胞を注射したマウスから採取した血液のフローサイトメトリーデータであり、経時的なＨＡ陽性の培養ヒト赤血球系細胞のパーセントを示す。（Ｂ）は、２匹のマウスから採取した血液のウエスタンブロットであり、ここで一方のマウスには外因性細胞質タンパク質を発現する培養ヒト赤血球系細胞を注射し、他方のマウスには細胞の非存在下で精製組換え産生外因性タンパク質を注射しており、経時的な血中ＨＡ含有タンパク質レベルを示す。

【図12】培養ヒト赤血球系細胞の拡大及び分化の評価である。（Ａ）は、トランス遺伝子を含有するインビトロ分化赤血球系細胞（破線及び点線）及びトランス遺伝子を含有しない細胞（実線）の個別的な培養物に関する拡大速度のプロットである。（Ｂ）は、トランス遺伝子を含有しない（左）又は含有する（右）培養ヒト赤血球系細胞の個別的な培養物に関する細胞表面マーカーＧＰＡ及びＣＫＩＴのフローサイトメトリープロットである。（Ｃ）は、トランス遺伝子を含有しない（左）又は含有する（右）培養ヒト赤血球系細胞のフローサイトメトリープロットであり、ここで細胞はＤＮＡ染色剤ＤＲＡＱ５（ｙ軸）及び抗グリコホリンＡ（ｘ軸）で染色し、これによって（１）除核細胞、（２）有核細胞、及び（３）核の個別的な集団が同定される。

【図13】図１３Ａは、レシーバーポリペプチドを含む合成膜－レシーバー複合体の概略図である。左側のパネルは、合成膜－レシーバー複合体の膜を越える標的基質のフラックスを描く。標的基質は、内部に局在する酵素的レシーバーポリペプチドによって改変され、得られる酵素反応の産物は、合成膜－レシーバー複合体内に残るか、又は膜を通って出るかのいずれかである。右側のパネルは、１つが表面上に局在し、１つが内部に局在する少なくとも２つのレシーバー（例えば、レシーバーポリペプチド）を含有する合成膜－レシーバー複合体を描く。この例では、表面局在レシーバーが、例えば輸送体機能を果たすことにより、基質が合成膜－レシーバー複合体に入るのを促進する。内部に局在する第２のレシーバーは、基質を酵素的に改変する。得られる酵素反応の産物は、合成膜－レシーバー複合体内に残るか、又は任意選択で最初の表面局在レシーバーによって補助されて、膜を通って出るかのいずれかである。図１３Ｂは、レシーバーポリペプチドを含む別の合成膜－レシーバー複合体の概略図である。１３Ｂは、合成膜－レシーバー複合体の表面上に局在するレシーバーポリペプチドを描く。図示されるとおり、標的基質はレシーバーによる作用を直接受け得る。この例示される構成では、標的基質が産物に酵素的に変換されるために膜を通過する必要はない。任意選択で、表面局在酵素レシーバーポリペプチドは、例えば複合体が特定の微小環境に入った場合に切断可能であるように作られてもよい。そのような場合、レシーバーポリペプチドは切断され、細胞外空間で活性になり得る。図１３Ｃは、レシーバーを含むさらに別の合成膜－レシーバー複合体の概略図である。１３Ｃは、内部に局在するレシーバー（例えば、ポリペプチド）と、種々の刺激によって生じ得る任意選択のペイロード（例えば治療剤）とを含有する合成膜－レシーバー複合体の溶解を描く。溶解すると、内部に局在するレシーバー及び任意選択のペイロードが微小環境中に放出され、そこで標的基質に作用し得る。

【図14】図１４Ａは、合成膜－レシーバー複合体にレシーバーが局在し得る３つの方法の概略図である。図１４Ｂは、合成膜－レシーバー複合体内又はその上に局在するレシーバーが循環中の標的に作用し得る３つの方法の概略図である。図１４Ｃは、ＳｐｙＴａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ機構を利用したレシーバーとの内因性ポリペプチドアンカーの自己触媒融合の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0292】

これまで、患者への医薬薬物などの治療の送達における課題の幾つかに対処するため循環薬剤を利用しようと試みる治療技術が開発されている。いずれも、本明細書に提供される合成膜－レシーバー複合体の特徴及び利点を１つとして具えていない。本発明の態様は、これまで取り組みがなされていない生物化学的及び生物物理学的機構を利用する、複数の個別的な有用性の能力を有する組成物を提供する。本発明の態様は、例えば循環クリアランスに関する機能及び代謝酵素送達に関する機能を果たすための組成物及び方法、並びに種々の疾患、障害及び病態を治療又は予防するための方法に関する。従って、本明細書に開示される組成物及び方法は、とりわけ、望ましくない免疫反応、循環からの急速なクリアランスに起因する短い半減期、及びオフターゲット効果などの、これまでの手法に付随する欠点を回避する、半減期、安全性プロファイル、及び／又は有効性が増加した循環系を通じて分布する治療組成物という長らく求められている必要性に対処する。

【0293】

循環クリアランスに関する機能は、例えば、本明細書に記載されるとおりの標的との相互作用能を有するレシーバーを含む合成膜－レシーバー複合体による対象の循環系の標的（例えば、病原性物質又は毒性分子）の特異的結合、分解、及び／又は隔絶によって特徴付けられる活性を含む。合成膜－レシーバー複合体は対象の循環に導入されるか、又は導入可能である。一部の実施形態において、結合した又は隔絶された標的は、肝臓、脾臓、又は任意の他の部位にガイドされ、そこで標的は循環系から取り除かれ得る。

【0294】

代謝酵素送達に関する機能は、例えば、レシーバーポリペプチドが標的と相互作用してそれを修飾するように複合体内部又は複合体の表面上に例えば１つ以上の代謝酵素レシーバーポリペプチドを含む本明細書に記載されるとおりの合成膜－レシーバー複合体による対象の循環中の標的（例えば、病原性物質又は毒性分子）の除去によって特徴付けられる活性を含む。標的の修飾には、例えば、標的のバイオアベイラビリティの改変、レシーバーによる標的の切断、分解、及び／又は他の方法での不活性化が含まれる。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドが免疫系から保護される。一部の実施形態では、対象への投与時に酵素の半減期が延長され、及び／又は免疫原性反応が低減される。

【0295】

本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的システムに限定されず、それらは当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語法は特定の態様を説明することを目的にしているに過ぎず、限定する意図はないことも理解されるべきである。

【0296】

本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示される各々の特徴は、同じ、均等な、又は類似した目的を果たす代替的な特徴に置き換えることができる。従って、特に明示的に述べられない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の均等な又は類似した特徴の一例に過ぎない。

【0297】

前述の説明及び関連する図面に提供される教示を利用して、これらの発明が関係する技術分野の当業者には、本明細書に示される発明の多くの変形形態及び他の実施形態が容易に想起されるであろう。従って、本発明は開示される具体的な実施形態に限定されないこと、並びに変形形態及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれるものと意図されることが理解されるべきである。本明細書では特定の用語が用いられているが、それらは一般的且つ説明的な意味で用いられているに過ぎず、限定を目的とするものではない。

【0298】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容上特に明確に指示されない限り複数形の参照を含む。

【0299】

選択肢（例えば、「又は」）の使用は、それらの選択肢の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するものと理解されなければならない。

【0300】

用語「約」は、本明細書で使用されるとき、量、時間的な持続期間などの計測可能な値を参照する場合に、指定された値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、及びなおもより好ましくは±０．１％の変動を包含するように意図され、従って変動は本開示の方法を実施するのに妥当である。

【0301】

本明細書で使用されるとき、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲、又は整数範囲は、特に指示されない限り、記載される範囲内にある任意の整数の値、及び適切な場合にはその分率（整数の１０分の１及び１００分の１）を含むものと理解されるべきである。

【0302】

「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「～を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、本明細書で使用されるとき、「～を備える（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「～を備えている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を備える（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「～を含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「～を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義語であり、次に続くもの、例えば構成要素の存在を特定し、且つ当該技術分野において公知の又はそこに開示されている追加的な記載されていない構成要素、特徴、要素、メンバー、ステップの存在を排除又は除外しない包括的な又はオープンエンド形式の用語である。

【0303】

本明細書で使用されるとき、用語「など」、「例えば」等は、例示的実施形態を指し、本開示の範囲を限定することは意図されない。

【0304】

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本発明を試験するための実施においては、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な任意の方法及び材料を使用し得るが、本明細書には好ましい材料及び方法が記載される。

【0305】

本明細書に引用される全ての刊行物及び特許出願は、個別の刊行物又は特許出願がそれぞれあらゆる目的で参照によって援用されることが具体的且つ個別的に示されたものとして、本明細書においてあらゆる目的で全体として参照により援用される。本明細書で考察される刊行物は、本願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる事項も、先行発明であることに基づき又は任意の他の理由で本明細書に記載される本発明者らにかかる開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されてはならない。

【0306】

定義：
「投与」、「投与する」及びそれらの変形は、組成物、例えば合成膜－レシーバー複合体、又は薬剤を対象に導入することを意味し、組成物又は薬剤の同時の及び逐次的な導入が含まれる。対象への組成物又は薬剤の導入は、経口、経肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、経直腸、リンパ内、又は局所を含めた任意の好適な経路による。投与には、自己投与及び他人による投与が含まれる。投与経路が好適であれば、組成物又は薬剤はその意図された機能を果たすことができる。例えば、好適な経路が静脈内である場合、対象の静脈中に組成物又は薬剤を導入することによって組成物が投与される。投与は任意の好適な経路によって実施することができる。

【0307】

「アンカー」又は「アンカードメイン」又は「Ａドメイン」は、融合又はキメラレシーバーポリペプチドを含めたレシーバーポリペプチドのうち合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の脂質層と接触している一部分を指して使用される。レシーバーポリペプチドは、リン脂質テール挿入、脂質層構成物との共有結合、イオン結合、水素結合を介するか、或いは脂質層の１つ以上を通過する一回又は複数回膜貫通ポリペプチドドメインを介して脂質層と相互作用し得る。

【0308】

本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、天然か、それとも一部若しくは全てが合成的に産生されるかに関わらず、免疫グロブリン、及びその断片を包含する。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同な結合ドメインを有する任意のタンパク質も含む。これらのタンパク質は天然の供給源に由来してもよく、又は一部若しくは全てが合成的に産生されてもよい。「抗体」には、抗原に特異的に結合してそれを認識する免疫グロブリン遺伝子又はその断片由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドがさらに含まれる。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、それらの断片を含み、さらに、一本鎖抗体、ヒト化抗体；マウス抗体；キメラ、マウス－ヒト、マウス－霊長類、霊長類－ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片など、ダイアボディ、及び抗体関連ポリペプチドを含むことが意図される。抗体には、所望の生物学的活性又は機能を呈する限りにおいて二重特異性抗体及び多重特異性抗体が含まれる。

【0309】

本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、インタクトな免疫グロブリンの断片、及び抗原との特異的結合能を有する抗原結合領域を含むポリペプチドの任意の一部を指す。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片であってもよく、しかしこれらに限定されるものではない。Ｆａｂ断片は１つの抗原結合部位を有し、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、並びに重鎖の第１定常領域ＣＨ１を含む。Ｆａｂ’断片はＦａｂ断片と比べて、Ｆａｂ’断片が重鎖ＣＨ１領域のＣ末端にある少なくとも１つのシステイン残基を含む重鎖のヒンジ領域をさらに含む点で異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片のシステイン残基がヒンジ領域でジスルフィド結合によってつなぎ合わされて作製される。Ｆｖ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小抗体断片であり、Ｆｖ断片を作製する組換え技術は当該技術分野において周知である。二重鎖Ｆｖ断片は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域と非共有結合によって連結された構造を有し得る。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は概して二重鎖Ｆｖ断片にあるような二量体構造を有し、ここでは重鎖可変領域がペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合的に結合しているか、又は重鎖及び軽鎖可変領域がそれらのＣ末端で互いに直接連結している。抗原結合断片はプロテアーゼを使用して得られてもよく（例えば、全抗体がパパインで消化されることによりＦａｂ断片が得られ、及びペプシンで消化されることによりＦ（ａｂ’）２断片が得られる）、及び遺伝子組換え技術によって調製されてもよい。ｄＡｂ断片はＶＨドメインからなる。一本鎖抗体分子は複数の個々の分子を含むポリマー、例えば、二量体、三量体又は他のポリマーを含み得る。

【0310】

「アプリケーター」は、対象につなぐために使用される任意の装置を指す。これには、例えば、針、カニューレ、カテーテル、及びチュービングが含まれる。

【0311】

「～と会合する」は、複数の化合物又は分子の間の関係を記載するために使用されるとき、例えば、レシーバーと標的との間又は合成膜－レシーバー複合体と標的との間の任意の相互作用などを包含する。これには、酵素的相互作用、イオン結合、共有結合、非共有結合、水素結合、ロンドン力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、親油性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが含まれる。

【0312】

「～に関連する」は、標的、実体、化合物、薬剤、又は分子と、疾患、障害、病態、症状又は表現型との間の関係を記載するために使用されるとき、疾患、障害、病態、症状又は表現型の原因となるか否かに関わらず、因果的関連付け、又は統計的に有意な関連付け、実験的に確立された関連付け、示唆される関連付けを含めた、それらの間に妥当に設けられ得る任意の関連付けである。

【0313】

「自己免疫障害」は、概して、対象の免疫系が自身の体の細胞を攻撃して組織破壊を引き起こす病態である。自己免疫障害は、血液検査、脳脊髄液分析、筋電図（筋機能を計測する）、及び脳の磁気共鳴画像法を用いて診断することができ、しかし血中の自己抗体（ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｂｏｄｙ）（又は自己抗体（ａｕｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ））についての抗体検査が特に有用である。通常、自己免疫疾患にはＩｇＧクラス抗体が関連する。

【0314】

「結合する」は、化合物又は分子の間、例えば、レシーバーと標的との間又は合成膜－レシーバー複合体と標的との間に、例えば、イオン結合、静電相互作用、水素結合、ロンドン力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、親油性相互作用などを含めた共有結合又は非共有結合によって生じる相互作用を表す。

【0315】

「ポリペプチドの生物学的活性」は、ポリペプチド、例えばレシーバーポリペプチドによって生じる任意の分子活性又は表現型（例えば、結合、シグナル伝達、触媒等）を指す。

【0316】

本明細書で使用されるとき、用語「生物学的試料」は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、及びタンパク質を含めた、対象から単離された生物学的起源の任意のタイプの材料を指す。用語「生物学的試料」には、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体が含まれる。生物学的試料には、例えば、限定はされないが、全血、血漿、血清、精液、唾液、涙、尿、糞便物質、汗、口腔液、皮膚、脳脊髄液、骨髄、胆汁、毛髪、筋肉生検、臓器組織又は当業者に公知の生物学的起源の他の材料が含まれる。生物学的試料は、例えば内臓器官の生検から、又は癌から得ることができる。生物学的試料は診断若しくは研究用に対象から得ることができ、又は対照として若しくは基礎研究のため、健常対象から得ることができる。

【0317】

「クリアランス速度」は、本明細書で使用されるとき、例えば、対象の循環系に残る標的、レシーバー、標的－レシーバー、又は合成膜－レシーバー複合体の量又は濃度を経時的に計測することによって計算される。例えば、第１の試料中に検出される標的の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％が、１時間、５時間、１０時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週間、３週間、４週間、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、２年、３年、４年、又は５年後に採取した第２の試料中になおも検出され得る。クリアランス速度は、或いは単位時間当たり（例えば１日当たり）の実体（例えば、標的／レシーバー）の数として表されてもよい。クリアランス速度の増加は、未治療の又は健常な好適な対照対象で示された速度を上回る速度である。クリアランス速度の低下は、未治療の又は健常な好適な対照対象で示された速度未満の速度である。この増加又は低下は、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、１０００％であってもよく、又は１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、又は１０００倍であってもよい。標的のクリアランス速度の増加には、例えば、標的の蓄積速度が落ちること、生成と分解とが新しく平衡に達すること、及び蓄積が逆転すること、例えば循環中の標的の数又は濃度が低下することが含まれる。

【0318】

「開裂する」は、本明細書で使用されるとき、標的、例えばポリペプチド又は核に存在する結合相互作用を分断させるプロセスであって、例えばそれにより、開裂後に互いに分離し得る２つ以上の実体が生じるプロセスである。分離には、例えば、イオン結合、共有結合、極性共有結合、非極性共有結合、又は金属結合を分断させることが関与し得る。開裂がポリペプチド標的に適用されるとき、開裂には、１つ以上のペプチド結合の破壊が関与し得る。開裂が小分子標的に適用されるとき、開裂には、１つ以上の炭素結合又はスルフィド結合の破壊が関与し得る。開裂がヌクレオチド配列に適用されるとき、開裂には、１つ以上のリン酸ジエステル結合の破壊が関与し得る。開裂が微生物、例えば、細菌、真菌、又はウイルスに適用されるとき、開裂には、膜又はカプシド構造の溶解が関与し得る。開裂は、酵素、例えば触媒活性レシーバーポリペプチドによって行われ得る。レシーバーは、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、又はプロテアーゼ活性を含み得る。

【0319】

「対象の循環系」は、本明細書で使用されるとき、血漿及び全ての循環細胞及び分子を含め、ヒトにおいて全血及び任意選択でリンパ系によって占有され、且つ動脈、静脈、毛細血管、及びリンパ管の全てにわたって分布する空間を包含する。「循環濃度」は、循環系として定義される空間にある標的、例えば、細胞、ポリペプチド（抗体、病原性抗原等など）、治療剤、小分子、代謝産物又は他の実体、レシーバー又は合成膜－レシーバー複合体の濃度である。特定の実施形態において、濃度は、所与の容積中にある遊離（未結合）実体の数として定義され得る。他の実施形態において、濃度は、所与の容積中にある実体の総数として定義され得る。

【0320】

本明細書で使用される用語「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の可変領域に見られるアミノ酸配列を指す。ＣＤＲは抗体の特異性を決定し、抗原の特定のエピトープに結合するための接触残基を提供し得る。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３、並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）を含み得る。ＣＤＲと比べてより高度に保存されたアミノ酸配列を有する４つのフレームワーク領域が、ＶＨ又はＶＬにおいてＣＤＲ領域を分ける。

【0321】

「複合体」は、本明細書で使用されるとき、２つ以上の実体が結び付いたものを含む。複合体は、１つ以上のポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、無機化合物、有機化合物などを含み得る。複合体は機能性（マルチユニットポリペプチド）又は非機能性（例えば、凝集物又は沈殿物）であってよく、有益又は有害な特性を有し得る（例えば、免疫複合体）。複合体は天然に存在するものであってもよく、又は人工若しくは合成のものであってもよい。合成複合体には、それが合成化合物又は分子を含む場合には、高次の実体、例えば細胞内構造及び細胞が含まれる。例えば、合成膜－レシーバー複合体は、レシーバーを含む細胞を含む。

【0322】

アミノ酸配列に関して、コード配列における単一のアミノ酸又はごく一部のアミノ酸を改変し、付加し又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、改変が化学的に同様のアミノ酸によるアミノ酸置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることは、当業者であれば認識するであろう。本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の群の各々の範囲内におけるアミノ酸間の置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びスレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リジン、アルギニン及びヒスチジン。

【0323】

「低下する」は、治療される疾患、障害又は病態の症状との関連では、症状として現れる疾患又は病態に関連する計測可能又は伝達可能なパラメータの減少を指す。計測可能なパラメータの例は、対象の体温の減少、対象から採取した試料中の標的濃度の減少、炎症の強度又は炎症範囲のサイズの減少、浸潤細胞数の減少、疾患、障害又は病態に関連するエピソード数の減少、臓器サイズの増加／低下、体重増加／減少等である。伝達可能なパラメータの例は、例えば、対象によるウェルビーイング及びクオリティオブライフの自己評価である。例えば、自己抗体媒介性疾患について、低下は以下のパラメータの１つ、又はそれらの組み合わせとして定量化され得る：炎症減少、突然の再発の減少、疲労減少、血液凝固減少、腫脹減少、エネルギー増加、又は発毛増加等。定量化され得るパラメータは、治療下の特定の疾患、障害又は病態を評価するのに適切なものである。遅延は、治療される疾患、障害又は病態の症状との関連では、本来増悪するようになり得る管理可能な健康状態を治療を用いて大幅に延長することを指す。

【0324】

「分解する」は、標的が、直接、或いは間接的に、減少し、不活性化され、分割され、解体され、溶解され、溶け、壊れ、少なくなり、損なわれ、弱まり、劣化し、小さくなり、又は分配されるプロセスとして定義される。

【0325】

「異なるポリペプチド由来」は、ポリペプチドをコードする遺伝子配列、ポリペプチド、又はその一部分の供給源となる生物又は種を指す。特定の実施形態において、異なるポリペプチド由来のポリペプチドを含む融合物は、ヒトアデノシンデアミナーゼの遺伝子配列及びクロモバクテリウム・ビオラセウム（ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のフェニルアラニンヒドロキシラーゼの遺伝子配列によってコードされるレシーバーポリペプチドを含み得る。

【0326】

「ドメイン」は、ポリペプチド、例えばレシーバーポリペプチドのうち概して三次元構造を有し、且つ個別的な活性、機能、例えば、触媒的、酵素的、構造的役割、又は結合機能を呈し得る一部である。

【0327】

持続時間は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一部分が特定の組織又は全体として生物に存在する期間を指す。これは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の初期用量又は濃度の０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に該当する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は長期持続時間用に製剤化される。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は短期持続時間用に製剤化される。

【0328】

「濃厚細胞集団」とは、実質的に特定の目的細胞を含む細胞の集団を意味する。濃厚集団では、集団中の細胞の５０％以上、例えば、集団中の細胞の５０％、６０％、７０％、通例では８０％、８５％、９０％、より通例では９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、時には１００％が目的細胞である。細胞の複合混合物又は不均一培養物からの目的細胞の分離は、当該技術分野において公知の任意の好都合な手段、例えば、アフィニティー試薬でコーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、又は固体マトリックス、例えばプレートに付着させたアフィニティー試薬による「パニング」などのアフィニティー分離技術、又は他の好都合な技術によって行われ得る。正確な分離を提供する他の技術としては、マルチカラーチャネル、小角及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネル等、精巧さの程度が様々であり得る蛍光活性化セルソーターが挙げられる。細胞は、死細胞に関連する色素を用いることにより、死細胞に対して選択され得る。所望の細胞の生存能に過度に有害でない任意の技術が用いられ得る。

【0329】

「除核」は、核の不活性化又は除去のいずれかによって細胞を非複製状態にすることである。

【0330】

「エピトープ」は、抗体又は他のリガンド又は結合分子が結合する抗原上の任意のセグメントを含む。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有し得る。一部の実施形態において、レシーバーは特定のエピトープを含む。一部の実施形態において、標的は特定のエピトープを含む。

【0331】

「赤血球系細胞」は、本明細書で使用されるとき、有核赤血球、赤血球前駆体、及び除核赤血球並びに表２に掲載されるものを含む。例えば、赤血球系細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ－Ｓ）細胞、骨髄球系共通前駆細胞（ＣＭＰ）細胞、未分化胚芽細胞コロニー形成細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ－Ｅ）、巨核球－赤芽球系前駆（ＭＥＰ）細胞、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｅ）、網赤血球、赤血球、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態において、赤血球系細胞は不死細胞又は不死化細胞である。例えば、不死化赤芽球細胞は、ＣＤ３４＋造血前駆細胞のレトロウイルス形質導入によりＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現させ、及びＴＰ５３を抑制することにより作成し得る（例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３、印刷版に先立つ電子版、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３に記載されるとおり）。加えて、細胞は自己使用が意図され、又は同種血輸血源を提供し得る。赤血球系細胞をレシーバーと接触させることにより合成膜－レシーバー複合体を作成することができる。レシーバーを含む赤血球系細胞は、合成膜－レシーバー複合体の一例である。一部の実施形態では、赤血球系細胞は培養される。一部の実施形態では、赤血球前駆細胞をレシーバーと接触させることにより合成膜－レシーバー複合体が作成される。

【0332】

本明細書で使用されるとき、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに促進するため医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類及び各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、抗凝固薬、及びポリエチレングリコールが挙げられる。

【0333】

レシーバーは、レシーバーポリペプチドを含め、「外因性」又は「異種」であり、従って、レシーバーは、異なるポリペプチド又は種由来のドメインを含む融合物又はキメラなど、天然に存在しないものであり得るか、レシーバーは、非修飾赤血球又は血小板など、天然に存在する細胞中に天然に存在しないものであり得るか、レシーバーは天然に存在するポリペプチドが機能するのと同じようには機能しないものであり得るか、或いはレシーバーは、例えば、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が、非修飾細胞における天然に存在するポリペプチドの発現と比較したとき過剰発現する細胞由来ポリペプチドレシーバーである実施形態において、レシーバーポリペプチドが存在する量では天然に存在しないものであり得る。一部の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは外因性核酸から発現する。一部の実施形態において、レシーバーは供給源から単離され、合成膜－レシーバー複合体に負荷されるか、又はそれとコンジュゲートされる。

【0334】

用語「外因性」は、核酸との関連で使用されるとき、トランス遺伝子及び組換え核酸を含む。

【0335】

本明細書で使用されるとき、用語「発現」は、転写及び翻訳を含めた、ポリペプチド、例えばレシーバーポリペプチドを産生するためのプロセスを指す。発現は、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の数を増加させること、遺伝子の転写を（その遺伝子を構成的プロモーターの制御下に置くなどして）増加させること、遺伝子の翻訳を増加させること、競合遺伝子をノックアウトすること、又はこれらの組み合わせ及び／又は他の手法を含め、幾つかの手法によって増加させ得る。

【0336】

「長期持続時間用に製剤化された」合成膜－レシーバー複合体は、一部の実施形態において、集団の実質的な割合が１０日間より長く、例えば、１５、２１、２５、３５、４５、５０、６０、９０、１００、１１０、又は１２０日間循環系に滞留する合成膜－レシーバー複合体の集団の一部であるものである。一部の実施形態において、集団は、長期持続時間用に製剤化されたとき、製剤化されていない複合体の集団が示す持続時間と比較して半減期が増加してもよく、例えば、循環中にある時間が１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍長くてもよい。一部の実施形態において、レシーバーなどの実体は、長期持続時間用に製剤化されたとき、その実体が非修飾状態で示すであろう持続時間と比較して半減期が増加してもよく、例えば、循環中にある時間が１．５倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍長くてもよい。

【0337】

「短期持続時間用に製剤化された」合成膜－レシーバー複合体は、一部の実施形態において、集団の実質的な割合が１０日未満、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２日、１日、１２時間、又は６時間循環系に滞留する合成膜－レシーバー複合体の集団の一部であるものである。一部の実施形態において、集団は、短期持続時間用に製剤化されたとき、製剤化されていない複合体の集団が示す持続時間と比較して半減期が減少してもよく、例えば、循環中にある時間が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％短くてもよい。一部の実施形態において、レシーバーなどの実体は、短期持続時間用に製剤化されたとき、その実体が非修飾状態で示すであろう持続時間と比較して半減期が低下してもよく、例えば、循環中にある時間が５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％短くてもよい。

【0338】

「循環系における滞留用に製剤化された」は、本明細書で使用されるとき、対象の循環系への投与用に製剤化された実体、例えば合成膜－レシーバー複合体に対する１つ以上の修飾であって、循環系の構成要素（例えば、循環免疫細胞、抗体、酵素活性）による実体の認識、修飾、分解、及び／又は破壊を実質的に低下させて、それにより非修飾実体と比較したときのその実体の半減期を増加させる修飾を記載する。

【0339】

「機能性」レシーバー又は合成膜－レシーバー複合体は、酵素活性、触媒活性又は代謝活性、構造的完全性、免疫原性の補完性、標的結合、及び正しい局在化を含めた所望の又は特異的な活性又は特性を呈するか、或いは所望の又は特異的な効果又は表現型を促進する能力を有する合成膜－レシーバー複合体又はレシーバーを指す。

【0340】

「融合物又はキメラ」は、天然では一緒に見られることのない２つ以上の配列の組み合わせから誘導されるポリペプチド配列、又は対応するコードヌクレオチド配列として定義される。これは、同じゲノム内の別個の遺伝子に由来するか、又は明確に異なる種のゲノムに由来する異種遺伝子に由来する別個の配列の組み合わせであってもよい。

【0341】

「遺伝物質」は、遺伝子をコードする能力を有するアデノシン、チミン、ウラシル、シトシン、及びグアニンのヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。

【0342】

本明細書で使用される用語「重鎖」は、抗原に対する特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＨ）と、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する定常領域とを含む完全長重鎖、及びその断片を含むものと理解される。加えて、本明細書で使用される用語「軽鎖」は、抗原に対する特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域（ＶＬ）と定常領域（ＣＬ）とを含む完全長軽鎖、及びその断片を含むものと理解される。

【0343】

用語「相同体」は、その一次、二次又は三次構造において対応する位置に同じ又は保存された残基を有するレシーバーポリペプチドを含めたポリペプチドを示す。機能性相同体には、同様の機能及び／又は（例えば特定の標的に対して）特異性を呈するレシーバー及び他のポリペプチドが含まれる。

【0344】

天然に存在するインタクトな抗体、又は免疫グロブリンは、４つのポリペプチド、即ち２つの完全長軽鎖及び２つの完全長重鎖を含み、ここで各軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖と連結している。各重鎖は定常領域と可変領域とを有する。同様に、各軽鎖が定常領域と可変領域とを有する。５つの重鎖クラス（アイソタイプ）、即ちガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、又はイプシロン（ε）があり、さらに幾つかのサブクラス、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）がある。軽鎖定常領域はカッパ（κ）型又はラムダ（λ）型のいずれかであり得る。可変領域は抗体間で配列が異なり、所与の抗体の、その特定の抗原に対する結合及び特異性に用いられる。

【0345】

本明細書で使用されるとき、用語「増加させる」、「増強する」、「刺激する」、及び／又は「誘導する」（及び類似の用語）は、概して、天然、予想、若しくは平均と比べて、又は対照条件と比べて濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を直接、或いは間接的に改善し又は増加させる行為を指す。

【0346】

本明細書で使用されるとき、用語「阻害する」、「抑制する」、「低下させる」、「妨害する」、及び／又は「低減する」（及び類似の用語）は、概して、天然、予想、若しくは平均と比べて、又は対照条件と比べて濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を直接、或いは間接的に低減する行為を指す。

【0347】

「ライブラリ」は、本明細書で使用されるとき、多様な核酸配列を有する核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のコレクション、遺伝的に多様なクローンコレクション、多様なポリペプチドのコレクション、多様な細胞コレクション等を含む。

【0348】

本明細書で使用されるとき、「哺乳類対象」には、あらゆる哺乳動物、例えば限定されることなく、ヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコなど）、農業動物（例えば、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が含まれる。用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書では同義的に使用され、診断、処置、又は治療が所望される任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。本明細書に記載される方法はヒト治療及び獣医学適用の両方に適用可能である。一部の実施形態において、対象は哺乳動物であり、他の実施形態では対象はヒトである。

【0349】

「医療器具」は、所定用量の合成膜－レシーバー複合体及び／又は治療剤の送達に用いられる任意の装置、器具又は機械を指す。これは、容器、ボトル、バイアル、シリンジ、バッグ、カートリッジ、カセット、マガジン、シリンダ、又はキャニスターを含む。

【0350】

「医療用キット」は、医療器具、アプリケーター、任意選択で治療剤を含む合成膜－レシーバー複合体の適切な投薬量、及び関連する表示及び説明書を含む包装されたユニットを指す。

【0351】

本明細書で使用されるとき、用語「モジュレートする」、「モジュレートしている」、「修飾する」、及び／又は「モジュレーター」は、概して、特定の濃度、レベル、発現、機能又は挙動を増加又は低下により、例えば、直接又は間接的に促進し／刺激し／上方調節し又は妨害し／阻害し／下方調節することにより改変する能力、例えば拮抗薬又は作動薬として作用する能力を指す。場合によっては、モジュレーターは、対照と比べて、又は一般に予想し得る平均活性レベルと比べて、又は対照活性レベルと比べて特定の濃度、レベル、活性又は機能を増加及び／又は低下させ得る。

【0352】

「膜」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上の生物学的化合物、典型的には脂質と、任意選択でポリペプチドとを含む、内部空間を外部空間と分ける境界層である。膜は脂質二重層であってもよい。特定の実施形態において、膜は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸の１つ以上を含む。一部の実施形態において、膜は、アンキリン及び補酵素Ｑ１０などの１つ以上のポリペプチドを含む。膜の定義には、例えばリン脂質二重層及び細胞膜結合ポリペプチドを含む細胞膜が含まれる。合成膜－レシーバー複合体は、本明細書に定義するとおりの膜を含む。

【0353】

語句「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを指す。核酸分子には、組換えであってもよい、且つ核酸が細胞に導入されたときにそこから外因性ポリペプチドが発現し得る染色体ＤＮＡ及び自己複製プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等が含まれる。

【0354】

オルソログは、共通の先祖遺伝子から種分化によって進化した異なる種の遺伝子として定義される。

【0355】

用語「薬学的に許容可能な」及びその文法上の変化形は、組成物の投与が禁忌となり得る程の望ましくない生理学的作用を生じることのない、対象に又は対象に対して投与可能な組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す。例えば、「薬学的に許容可能な賦形剤」には、概して安全で非毒性の、且つ望ましい医薬組成物の調製において有用な賦形剤が含まれ、及び動物への使用並びにヒト医薬品への使用が許容される賦形剤が含まれる。かかる賦形剤は、固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。

【0356】

本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション、例えば油／水又は水／油、及び各種の湿潤剤などの任意の標準的医薬担体を含む。この用語はまた、ヒトを含む動物での使用に関して米国連邦政府の規制当局によって承認されているか又は米国薬局方に掲載されている任意の薬剤、並びに対象に重大な刺激作用を引き起こさず、且つ投与化合物の生物学的活性及び特性を消失させることのない任意の担体又は希釈剤も包含する。

【0357】

一部の薬剤は、例えば無機酸及び有機酸から調製される「薬学的に許容可能な塩」として投与され得る。無機酸から誘導される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。塩はまた、無機塩基及び有機塩基から調製することもできる。無機塩基から誘導される塩には、単に例として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、限定はされないが、第一級、第二級及び第三級アミンの塩が含まれる。当業者であれば、過度の実験を行うことなく、この発明の実施に適した薬学的に許容可能な担体、その薬学的に許容可能な塩をどのように選択するべきかは分かるであろう。

【0358】

本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、例えば、１つ以上の他の化学的構成要素、例えば、生理学的に許容可能な担体及び賦形剤と混合されるか若しくは混ぜ合わされ、又はそれに懸濁される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体などの、本明細書に記載される化合物の１つ以上を指す。医薬組成物の１つの目的は、対象への化合物の投与を促進することである。

【0359】

特定の実施形態は、所望の機能又は活性に関連する配列を有する様々なポリペプチド分子、例えばレシーバーポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、翻訳後修飾（例えば、リン酸化又はグリコシル化）及び／又はさらなるポリペプチドとの複合体形成、核酸及び／又は炭水化物、又は他の分子とのマルチサブユニット複合体への合成に関わらず、アミノ酸残基の鎖を指す用語である。従ってプロテオグリカンもまた、本明細書ではポリペプチドと称される。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はポリペプチドレシーバーを含み、「合成膜－レシーバーポリペプチド複合体」と称される。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、任意選択で膜結合性の、且つレシーバーとは無関係に触媒活性及び／又は代謝活性を呈する１つ以上の非レシーバーポリペプチドを含む。例えば、非レシーバーポリペプチドは、代謝産物を含めた有機化合物に対する触媒活性を有し得る。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、代謝経路を補助するのに十分な数の非レシーバーポリペプチド（及び任意選択で非タンパク質補因子）を含む。

【0360】

用語「薬学的に活性な薬剤」又は「医薬品」は、対象への投与時に対象に対して計測可能又は伝達可能な効果を有する任意の化合物、例えば、小分子薬物、又は生物製剤（例えば、ポリペプチド薬物又は核酸薬物）として定義され、例えばそれは、疾患、障害又は病態の症状を緩和し又は軽減させる。一部の実施形態において、医薬品は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の送達前に、その送達と組み合わせて、又はその送達後に投与され得る。一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体との相乗的治療効果を及ぼす。一部の実施形態において、薬学的に活性な薬剤は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体との相加的治療効果を及ぼす。

【0361】

「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸の転写を指図する一連の核酸制御配列として定義される。プロモーターは、転写開始部位近傍に必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、任意選択で、遠位エンハンサー又はリプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境及び発生条件下で活性を有するプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境又は発生調節下で活性を有するプロモーターである。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモーター、又は一連の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列との間の機能的連結を指し、ここで発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指図する。

【0362】

「レシーバー」は、本明細書で使用されるとき、標的との相互作用能を有して、例えば標的と会合し又はそれに結合する実体である。レシーバーはポリペプチドを含むか、又は本質的にポリペプチドからなり得る。一部の実施形態において、レシーバーは、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、小分子、又はそれらの組み合わせを含む。レシーバーが天然に存在する化合物又は分子である実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体におけるその存在に関してそれが外因性又は異種化合物又は分子であるという意味において「合成」である。他の実施形態では、レシーバーは、それが人工化合物又は分子、例えば融合物又はキメラ、天然に存在しないポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、又はそれらの組み合わせ、又は人工小分子又は他の治療剤であるという意味において「合成」である。例えば、レシーバーは、Ｓドメイン、Ａドメイン及びＵドメインのうちの１つ以上を含む融合物又はキメラを含み得る。Ｓドメインは、対象の循環系など、合成膜－レシーバー複合体の周りの環境に露出した表面ドメインである。Ａドメインは、Ｓドメインを合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の合成膜に取り付けるアンカードメインである。Ｕドメインは合成膜－レシーバー複合体の非露出側に向いているか、又はその中、即ち対象の循環系の外部環境に露出していない側に位置している。いかなるドメインとも無関係に、レシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に位置してもよく、又は複合体の中に位置してもよい。レシーバーは合成膜－レシーバー複合体の膜と会合してもよく、例えばレシーバーは膜にアンカリングするか、コンジュゲートするか、又は他の方法で結合する。一部の実施形態において、レシーバーは化学的又は酵素的コンジュゲーションによって合成膜－レシーバー複合体の膜にコンジュゲートし得る。他の実施形態において、レシーバーは膜にコンジュゲートしない。一部の実施形態において、レシーバーは合成膜－レシーバー複合体の膜と会合せず、複合体の膜に囲まれた容積の中に位置する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の中に位置するレシーバーは実質的に複合体から拡散して出ることはなく、及び／又は膜を透過しないこともある。他の実施形態において、レシーバーは実質的に複合体から拡散して出ることもあり、及び／又は膜を透過することもある。一部の実施形態において、レシーバーは合成膜－レシーバー複合体に負荷され、例えば導入され、又はそこに置かれる。負荷されるレシーバーは合成膜－レシーバー複合体によって生物学的に合成されるものではない。負荷に好適なレシーバーは、例えば、細胞ベースの発現系において産生されるか、生物学的試料から単離されるか、又は化学的若しくは酵素的に合成され、次に合成膜－レシーバー複合体内に、又はその上に負荷され得る。一部の実施形態において、レシーバーは負荷後に合成膜－レシーバー複合体によってさらに修飾され得る。他の実施形態において、レシーバーは負荷後に修飾されない。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは複合体上又はその中に負荷されない。一部の実施形態において、レシーバーは合成膜－レシーバー複合体によって作られ、例えば生物学的に合成される。典型的には、レシーバーポリペプチドは、複合体に導入された外因性核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）から合成膜－レシーバー複合体によって発現される。レシーバーは標的に結合し、及び／又は標的を隔絶し得る。それに代えて又は加えて、レシーバーは標的に対して触媒活性を呈してもよく、例えばレシーバーは標的を変換若しくは修飾してもよく、又は標的を分解してもよい。次には任意選択でレシーバーから産物が放出され得る。

【0363】

合成膜－レシーバー複合体の「滞留性」は、それが生理学的位置で費やす期間を指す。合成膜－レシーバー複合体の具体的な位置は、その寿命中に変化することもあり、「滞留性」は、血管循環、末梢組織、毛細血管、消化器系、肺系統、鼻組織、表皮表面、及び間質組織を含めた様々な環境で費やされる期間に適用される。具体的な実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は対象の循環系に滞留する。

【0364】

「複製核酸」は、ＤＮＡのコピー数を増加させることに特化した酵素によってコピーされることが可能なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指す。通常、ＤＮＡ複製は、１つの元のＤＮＡ分子から２つの同一の複製物の産生をもたらす。ＤＮＡ複製は、鋳型鎖に適合するＤＮＡポリメラーゼによってリン酸ジエステル結合の作成を介して成長するＤＮＡ鎖にヌクレオチドが１つずつ取り込まれることを含む。

【0365】

「隔絶する」は、標的を閉じ込めること、塞ぐこと、分離すること、隔離すること、隠すこと、遮断すること、又は孤立させること、及び標的がその環境と自由に相互作用するのを阻止することとして定義される。

【0366】

「特異的に結合する」又は「特異的に相互作用する」は、本明細書で使用されるとき、これらの用語が化学及び生化学技術分野の当業者によって理解されるとおり、可飽和の、多くの場合に可逆的で、従って競合的な２つの実体（例えば、標的とレシーバー、例えば、抗体と抗原、受容体とリガンド、酵素と基質、ビオチンとアビジン等）の間の任意の相互作用を記載する。例えば、生体分子、例えばタンパク質、ペプチド及び核酸などが関与する特異的結合は、結合対の一方のメンバーが、その部位とのコグネイトリガンドの相互作用が有利なエネルギー論（即ち、負の結合自由エネルギー）によって特徴付けられるような荷電、極性、又は疎水性部分の形状及び分布を備える部位を有するときに起こる。相互作用の特異性は結合定数（Ｋｄ）として計測又は表現され得る。Ｋｄは、μＭ範囲及びｎＭ範囲を含め、ｍＭ範囲～ｐＭ範囲の範囲であってもよい。典型的なＫｄ値は、約１０^－６Ｍ未満、約１０^－７Ｍ未満、約１０^－８Ｍ未満、及び一部の実施形態では約１０^－９Ｍ未満である。

【0367】

本明細書で使用されるとき、用語「実質的に」又は「実質的な」は、例えば、特定の空間にある実体の存在、レベル、又は濃度、１つの実体がもう１つの実体に及ぼす効果、又は治療の効果を指す。例えば、実体の活性、レベル又は濃度は、増加がベースラインと比べて２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、又は１０００倍である場合に実質的に増加する。実体の活性、レベル又は濃度はまた、増加がベースラインと比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、又は５００％である場合に実質的に増加する。実体は、それを当該技術分野において公知の方法によって検出することができる場合に特定の空間に実質的に存在し得る。実体は、それが当該技術分野において公知のアッセイ及び方法の検出限界未満のレベルで存在する場合、特定の空間に実質的に存在しないとし得る。一部の実施形態において、実体は、それがほとんど検出不能であるが、表現型を生じさせたり又はそれを変化させたりすることのない非機能的な量又は微量で検出可能である場合、特定の空間に実質的に存在しないとし得る。他の実施形態において、実体は、それが集団を構成する構成成分の少数、例えば、集団の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満又は１％、０．５％、０．１％未満の構成成分のみに存在し、検出することができる場合、特定の集団に実質的に存在しないとし得る。例えば、外因性核酸は除核時に保持されないこともあり、細胞が非複製にされ、及び除核細胞は、その外因性核酸によってコードされるレシーバーポリペプチドを継続的に発現する能力を有しない。細胞が外因性ポリペプチドを有意に翻訳し続ける能力を失うと、タンパク質発現は「事実上終結する」。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、実質的に自己複製能、例えば核酸の複製能を有しない。例えば、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、取込みアッセイで標識ヌクレオシド、例えばチミジンと接触させた場合に実質的にヌクレオシドを取り込まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は実質的な量の自己複製核酸を含まない。ポリヌクレオチド又は核酸配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも２５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。或いは、同一性パーセントは２５％～１００％の任意の整数であり得る。より好ましい実施形態は、本明細書に記載されるプログラム；好ましくは標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴを使用して参照配列と比較して少なくとも：２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を含む。

【0368】

「合成」は、人工の、或いは天然に存在しない化合物又は分子、又はそれが天然に存在する場合、自然には存在しないコンテクスト又は位置に置かれているか、又はそれがそのコンテクスト又は位置に自然に存在する場合、自然にはそのコンテクスト又は位置に存在しない純度状態であるか、又はそのような量、濃度又は数で存在する化合物又は分子を指す。合成実体は、任意選択でその自然状態から化学的又は酵素的に修飾されている単離又は精製化合物、外因性核酸、外因性（異種）レシーバーなどであってもよい。本明細書に定義するとおりの、任意の実体における合成化合物又は分子の存在は、実体全体を「合成」にする。例えば、レシーバーを含む細胞は、合成細胞である。

【0369】

「標的」は、本明細書で使用されるとき、レシーバーとの相互作用能を有して、例えばレシーバーと会合し又はそれに結合する実体である。「標的」には、限定はされないが、ポリペプチド（例えば、抗体又は抗体関連ポリペプチド、補体構成成分、アミロイドタンパク質、病原体、毒素、プリオン）、分子（例えば、代謝産物、ステロイド、ホルモン、炭水化物；オリゴ糖；化学的；多糖、ＤＮＡ；ＲＮＡ；脂質、アミノ酸、エレメント、毒素又は病原体）、複合体（例えば、免疫複合体）、又は細胞（例えば、癌細胞、マクロファージ、細菌、真菌、ウイルス、又は寄生虫）が含まれる。標的は、本明細書に提供される方法によって検出され、診断され、弱められ、破壊され又は改変される（例えば、機能的に補完される）ことが意図される。特定の標的は遊離して存在してもよく、又は対象の循環系における他の実体と会合している。

【0370】

「標的自己抗体」は、本明細書で使用されるとき、自己免疫疾患に関連する自己抗体である。かかる自己抗体は、対象の抗体を対象自身の組織の試料、通常は甲状腺、胃、肝臓、及び腎臓組織と接触させることを含む抗体結合試験を用いて検出及び分析され得る。「自己」組織（自己抗原を含む）に結合する抗体は、自己免疫障害を示す。

【0371】

「トランス遺伝子」又は「外因性核酸」は、合成膜－レシーバー複合体に導入される外来性又は天然ヌクレオチド配列を指す。トランス遺伝子と外因性核酸とは本明細書では同義的に使用され、組換え核酸を包含する。

【0372】

本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療している」、及び／又は「治療」は、有益な又は所望の臨床結果、薬理的及び／又は生理的効果、例えば、症状の緩和を達成し、前記症状を予防し又は解消するための手法であり、特定の疾患、障害又は病態の療法的治療及び予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）治療の両方を指す。有益な又は所望の臨床結果、薬理的及び／又は生理的効果としては、限定はされないが、疾患、障害又は病態に罹り易いこともあるが、未だ疾患の症状を起こしていない又は呈していない対象における疾患、障害又は病態の発生の防止（予防的治療）、疾患、障害又は病態の症状の緩和、疾患、障害又は病態の程度の縮小、疾患、障害又は病態の安定化（即ち、悪化させないこと）、疾患、障害又は病態が広がることの防止、疾患、障害又は病態の進行の遅延又は緩徐化、疾患、障害又は病態の改善又は寛解、及びそれらの組み合わせ、並びに治療を受けない場合の予想生存時間と比較した生存時間の延長が挙げられる。

【0373】

「治療剤」又は「治療用分子」は、有効量で存在するとき、それを必要としている対象に所望の治療効果、薬理的及び／又は生理的効果を生じる化合物又は分子を含む。

【0374】

用語「治療有効量」又は「有効量」は、有益な又は所望の臨床結果、薬理的及び／又は生理的効果を生じさせるのに十分である、対象に投与される薬剤の量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。有効量は、典型的には、病状の進行を緩和し、改善し、安定化させ、逆転させ、緩徐化し又は遅延させるのに十分である。従って有効量とは、所望の治療的及び／又は予防的効果を妥当に実現するのに十分な薬剤の量又は薬剤の特定の量の投与頻度を指す。例えば、有効量は、治療下の疾患又は病態、例えば標的ポリペプチドに関連する疾患又は医学的病態に関連する症状の予防、治療、又は低下をもたらす量を含み得る。対象に投与される治療組成物の量は、疾患のタイプ及び重症度並びに個体の特徴、例えば、全般的な健康、病的状態、食事、年齢、性別、体重及び薬物に対する忍容性に依存し得る。その量はまた、疾患の程度、重症度及びタイプにも依存し得る。さらに、有効量は、用いられる製剤化及び投与方法、例えば、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感受性に依存し得る。当業者は、これら及び他の要因に応じて適切な投薬量を決定することができるであろう。組成物はまた、１つ以上のさらなる治療化合物と組み合わせて投与することもできる。医薬組成物の望ましい投薬量は、成人について約０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。一例において、静脈内投与は最低限有効な用量で開始し、好ましい効果が観察されるまで、予め選択された時間経過にわたり用量を増加させる。続いて、現れ得る任意の有害作用を考慮しながら、対応する効果の増加が生じるレベルに限定して投薬量を漸増させる。好適な投薬量の非限定的な例は、例えば、１×１０^１０～１×１０^１４、１×１０^１１～１×１０^１３、又は５×１０^１１～５×１０^１２個の本発明の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の範囲であり得る。具体的な例としては、約５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２個、又はそれを超える本発明の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が挙げられる。合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の各用量は、１日１回、週１回、週２回、月１回、又は月２回などの間隔で投与することができる。

【0375】

「未結合」は、レシーバーが相互作用することが可能な標的の状態を指す。未結合標的は、別の実体又はレシーバーとは会合していない。未結合レシーバーは別の実体又は標的と会合していない。標的は、それがレシーバー又は別の実体と会合した時点で「結合している」と見なされる。未結合標的は、循環中の可溶性形態の標的を含む。結合標的は、循環又は末梢組織中の実体に埋め込まれ、それと会合し、それに連結し、又は他の方法でそれと相互作用している標的を含む。標的が相互作用し得る実体には、循環細胞、末梢内皮組織、免疫複合体、糖脂質、微生物、免疫グロブリン、血清アルブミン、凝固因子、リポタンパク質、及び電解質が含まれる。

【0376】

「変異体」は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、又は他の修飾だけ元のタンパク質と異なるポリペプチドである。これらの修飾は、元のタンパク質の生物学的活性を大きく変化させることはない。多くの場合に、変異体は元のタンパク質の生物学的活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％を保持している。変異体の生物学的活性はまた、元のタンパク質より高くてもよい。変異体は、アレル変異又は多型などによる天然に存在するものであってもよく、又は意図的に操作されてもよい。

【0377】

変異体のアミノ酸配列は元のタンパク質と実質的に同一である。多くの実施形態において、変異体は元のタンパク質と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれを超える大域的配列同一性又は類似性を共有する。配列同一性又は類似性は、ベーシックローカルアラインメントツール（ＢＬＡＳＴ）、ドットマトリクス解析、又は動的計画法などの、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて決定することができる。一例において、配列同一性又は類似性は、ジェネティクスコンピュータグループ（ＧＣＧ）プログラムＧＡＰ（ニードルマン－ブンシュアルゴリズム）を使用して決定される。変異体及び元のタンパク質のアミノ酸配列は１つ以上の範囲で実質的に同一であり得るが、他の領域では相違があり得る。

【0378】

本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、挿入された核酸分子、例えばトランス遺伝子又は外因性核酸を宿主細胞に及び／又はそれらの間で移動させ及び／又は複製する核酸分子、好ましくは自己複製核酸分子である。ベクターには、そのゲノムに組換えＤＮＡの断片が挿入され、且つ合成膜－レシーバーポリペプチド複合体への組換えＤＮＡ又はトランス遺伝子の導入に用いられるプラスミド又はウイルス染色体が含まれる。

【0379】

「分布容積」（ＶＤ）は、血漿中にあるときと同じ濃度を提供するために投与薬物の総量が（それが一様に分布したとして）占有しなければならない薬理学的な理論上の容積である。血漿より高いＶＤは、身体の残りの部分の組織に薬剤が分布していることを示す。ＶＤは、溶解度、電荷、サイズ等の影響を受ける。概して、高い脂質溶解度を有する非極性薬剤、低いイオン化率又は低い血漿結合能力を有する薬剤は、より極性が高い薬剤、より高度にイオン化される薬剤、又は高い血漿結合を呈する薬剤と比べて高い分布容積を有する。分布容積は以下の式によって与えられる：Ｖ_Ｄ＝体内の薬物総量／薬物血漿濃度。
分布容積の単位は典型的には（ｍｌ又はリットル）／ｋｇ体重で報告される。「血漿量に等しい」分布容積は、循環細胞を除いた循環系の容積と比べたものである。

【0380】

合成膜－レシーバー複合体
本明細書には、合成膜－レシーバー複合体、集団、医薬組成物、及びその剤形、並びに合成膜－レシーバー複合体の製剤を含む医療器具及びキットが提供される。

【0381】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は、標的との相互作用能を有するレシーバー（例えば、ポリペプチド）を含み、さらに、レシーバーでないポリペプチドを含む膜を含む。合成膜－レシーバー複合体はレシーバーとは無関係に触媒活性を有する。任意選択で、合成膜－レシーバー複合体はペイロード、例えば治療剤を含む。

【0382】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、供給源材料として細胞を使用して作成される。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の作成は、赤血球系細胞及び血小板をレシーバーと接触させるステップを含む。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の作成は、造血幹細胞に由来する細胞をレシーバーと接触させるステップを含む。

【0383】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ヒトなどの哺乳類対象の循環系に例えば静脈内に投与される。一部の実施形態において、膜－レシーバー複合体は、レシーバー及び任意選択でペイロード（例えば治療剤）と免疫系との間に天然の障壁を提供する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、対象の循環系に長時間滞留する能力を有し、現在用いられている他の方法による送達で実現し得るものと比べてより長時間にわたる治療効果の送達を可能にする。

【0384】

合成膜－レシーバー複合体は、対象の循環系にある標的と相互作用し得る。一部の実施形態において、対象の循環系における未結合標的又は全標的の濃度は、合成膜－レシーバー複合体内又はその上に呈示されるレシーバーとのその相互作用の後に低下する。特定の実施形態では、循環中の標的の存在又は濃度上昇が疾患、障害又は病態に関連付けられ、標的の濃度が低下すると疾患の負担が低減され、疾患の症状が緩和され得るか、又は他の何らかの治療効果を有する。一部の実施形態において、標的の濃度が低下すると疾患、障害又は病態の発症が予防される。

【0385】

体内分布は、薬物送達及び有効性における大きい障害である。薬物は、体循環に入った後、体組織に分布する。血液灌流、組織結合（例えば、脂質含量に起因する）、局所的ｐＨ、及び細胞膜の透過性には差があるため、分布は概して不均等である。薬物が組織に流入する速度は、組織への血流速度、組織質量、及び血液と組織との間での分配特性に依存する。十分に血管化した範囲では、細胞膜を通じた拡散が律速段階にない限り、血液と組織との間でより速く分布平衡（流入速度と流出速度とが同じであるとき）に達する。平衡後、組織中及び細胞外液中の薬物濃度が血漿濃度に反映される。分布と同時に代謝及び排泄が起こるため、このプロセスは動的で複雑である。

【0386】

合成膜－レシーバー複合体は、対象の循環系への投与に好適な医薬組成物に製剤化されるとき、対象の血漿量に等しい分布容積を有し得る。合成膜－レシーバー複合体の分布容積特性の利点としては、合成膜－レシーバー複合体として対象の循環系に投与されたときのレシーバーの体内分布を正確に予測し得ること、及び／又はレシーバーの有害な血管外効果の可能性（例えば、炎症反応、免疫応答、毒性等）が実質的に低減されることが挙げられる。

【0387】

血流から出て周囲組織に入る治療組成物の分布により、見かけの分布容積が増加し、対象の血漿量より高くなる。血流から出て周囲組織、例えば脂肪組織又は筋肉と相互作用する治療組成物は予測不可能な方法で組織と相互作用し、有害事象を引き起こし得る。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を含む組成物などの、分布容積が対象の血漿量を実質的に超えない治療組成物は、典型的には、大きい分布容積を有する治療組成物より優れた安全性プロファイルを有する。さらに、有効となるために負荷されなければならない治療組成物の量（有効量）は、一部には、治療組成物のバイオアベイラビリティに依存する。バイオアベイラビリティは、組成物のプロファイル及び血管外組織への分布速度、ひいてはその分布容積に関係する。正確且つ予測可能な分布容積を維持することにより、典型的には治療組成物、例えば本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を含む組成物は、正確さ及び予測可能性が低い分布容積を有する治療組成物と比べて正確さ及び予測可能性が高い用量効果関係を有することになる。

【0388】

例えば、多くの組織の間質液についての薬物分布速度は、主に灌流によって決定される。灌流し難い組織（例えば、筋肉、脂肪）については、特に組織が薬物に対して高親和性を有する場合に、分布は極めて緩徐である。血管内壁の内皮細胞は、アドヘレンス結合、タイト結合及びギャップ結合でつながっている。これらの結合複合体は、上皮ジャンクションに見られるものに関係しているが、特定の分子及び構成の点で顕著な違いがある。内皮結合タンパク質は組織完全性において、また血管透過性、白血球血管外遊走及び血管新生においても、重要な役割を果たす。小分子、タンパク質治療薬、及びウイルスは１～３０ｎｍの大きさがあり、親油性、血漿タンパク質との結合能力、及び電荷に基づき血管系をはるかに超えて拡散する能力を有する。血管系に限定されている薬物は、占有する組織容積が少なく、従って有効な治療濃度に留まり得る。加えて、薬物は末梢組織と相互作用することができず、オフターゲット毒性効果の可能性が抑えられる。より大きい循環薬剤（例えば、１ミクロン～２０ミクロン）は、幅が１００ｎｍ未満である内皮タイトジャンクションを通過せず、内皮細胞はそのサイズの薬剤のトランスサイトーシスを促進する能力を有しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は１ミコン（ｍｉｃｏｎ）～２０ミクロンの大きさである。これらの薬剤の血管特性は血流へのその拡散能力を制限し、任意のレシーバー又はペイロードの治療効果を濃縮する。

【0389】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は、一部の実施形態において、有利なクリアランス特性を呈する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、天然の分解プロセスを用いて、細網内皮系を通じて分解され得る。かかる分解は、典型的には副作用を全く又はほとんど引き起こさない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体上に提示されるレシーバーは、細網内皮系の臓器によって選択的に捕捉され得る。

【0390】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は、一部の実施形態において、自己複製能を有しない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は自己複製核酸を含まない。従って、かかる複合体は、制御されない細胞分裂、望ましくないタンパク質発現及び／又はサイトカイン放出症候群を惹起する可能性のリスクを伴わない。

【0391】

合成膜－レシーバー複合体の膜組成
１．脂質
一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、約１×１０^－１２ｇの質量及び約１．１５ｇ／ｃｍ^３の密度を有する膜を含む。膜成分の質量は、弱アルカリ性緩衝液の低張液を使用してそれを複合体の残りの部分と分離することにより評価し得る。例えば、Ｄｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ １９６３，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １００：１１９のプロトコルを参照されたい。

【0392】

合成膜－レシーバー複合体は膜を含む。一部の実施形態において、膜は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸を含む。一部の実施形態において、膜は細胞膜である。

【0393】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、コリンリン脂質、酸性リン脂質、及びホスファチジルエタノールアミンのクラスの脂質分子を含む。

【0394】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸を含む。

【0395】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、又は６５％の近似量でコリンリン脂質を含む。

【0396】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％の近似量で酸性リン脂質を含む。

【0397】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して１０％超、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、又は５０％超の量でホスファチジルコリンを含む。

【0398】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して１０％超、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、又は５０％超の量でスフィンゴミエリンを含む。

【0399】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して０．１％超、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又は１０％超の量でリゾホスファチジルコリンを含む。

【0400】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して１０％超、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、又は５０％超の量でホスファチジルエタノールアミンを含む。

【0401】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して１％超、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、又は５０％超の量でホスファチジルセリンを含む。

【0402】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して０．１％超、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又は１０％超の量でホスファチジルイノシトールを含む。

【0403】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、複合体の総脂質含量に対して０．１％超、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、又は１０％超の量でホスファチジン酸を含む。

【0404】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、以下の分子クラス、例えば、限定はされないが、コリンリン脂質、酸性リン脂質、及びホスファチジルエタノールアミンのうちの少なくとも１つ、２つ、又は３つからの分子を含む。

【0405】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中のコリンリン脂質と酸性リン脂質とのモル比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、又は約１０００：１超である。

【0406】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中のコリンリン脂質とホスファチジルエタノールアミンとのモル比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、又は約１０００：１超である。

【0407】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中のホスファチジルエタノールアミンと酸性リン脂質とのモル比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、又は約１０００：１超である。

【0408】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、以下の分子クラス、例えば、限定はされないが、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジン酸のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つからの分子を含む。

【0409】

合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の脂質組成は、例えば、ガス液体クロマトグラフィー又は薄層クロマトグラフィーを含めた、当該技術分野において公知の方法を用いて実験的に計測することができる。例えば、Ｄｏｄｇｅ＆Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ １９６７ ８：６６７を参照されたい。

【0410】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、内葉と外葉とで構成される脂質二重層を含む。内葉及び外葉の組成は、当該技術分野において公知の二重層内外層間分布（ｔｒａｎｓｂｉｌａｙｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）アッセイにより決定することができる。例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９８５ ８１９：１７０を参照されたい。一実施形態において、外葉の組成は、約７０～９０％のコリンリン脂質、約０～１５％の酸性リン脂質、及び約５～３０％のホスファチジルエタノールアミンである。一実施形態において、内葉の組成は、約１５～４０％のコリンリン脂質、約１０～５０％の酸性リン脂質、約３０～６０％のホスファチジルエタノールアミンである。

【0411】

２．コレステロール
一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体はコレステロールを含む。一実施形態において、コレステロール含量は１０^７個の複合体当たり約３．０～５．５ｎｍｏｌのコレステロールである。一実施形態において、コレステロール含量は１０^７個の複合体当たり約１．８～３．５ｎｍｏｌのコレステロールである。一実施形態において、複合体中のコレステロールとリン脂質とのモル比は約０．５～１．５である。好ましい実施形態において、コレステロールとリン脂質とのモル比は約０．８～１．２である。好ましい実施形態において、コレステロールとリン脂質とのモル比は約０．８４～０．９である。好ましい実施形態において、コレステロールとリン脂質とのモル比は約０．５～０．７５である。好ましい実施形態において、コレステロールとリン脂質とのモル比は約０．５５～０．６である。

【0412】

３．脂質、タンパク質、及び炭水化物
一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、レシーバーポリペプチド以外のポリペプチドを含む。一実施形態において、膜質量の約５２％がタンパク質であり、約４０％が脂質であり、及び約８％が炭水化物である。一実施形態において、炭水化物含量の約７％がスフィンゴ糖脂質を含み、及び炭水化物含量の約９３％が膜結合ポリペプチド上のＯ－結合型及びＮ－結合型オリゴ糖類を含む。

【0413】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中の脂質とタンパク質との質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、又は約１０００：１超である。

【0414】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中の脂質と炭水化物との質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、又は約１０００：１超である。

【0415】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中の炭水化物とタンパク質との質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、又は約１０００：１超である。

【0416】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中のタンパク質の面積占有率は約２３％であり、及び合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中の脂質の面積占有率は約７７％である。

【0417】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、以下のリストから選択されるポリペプチド、例えば限定はされないが、スペクトリン、ミオシン様ポリペプチド、バンド３、ＳＬＣ４Ａ１、アクチン、アクチン様ポリペプチド、グリセルアルデヒド３－Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）を含む。

【0418】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、以下のリストから選択されるポリペプチド、例えば限定はされないが、スペクトリン、ミオシン様ポリペプチド、バンド３、ＳＬＣ４Ａ１、アクチン、アクチン様ポリペプチド、グリセルアルデヒド３－Ｐデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤ）のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つを含む。

【0419】

４．さらなるポリペプチド
一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、レシーバーでない少なくとも１個のポリペプチドを含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、レシーバーでない少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個のポリペプチドを含む。場合によっては、このポリペプチドは、レシーバーとは無関係に酵素機能又は触媒機能の能力を有する。非レシーバーポリペプチドは合成膜－レシーバー複合体の膜と会合していてもよい。

【0420】

一部の実施形態において、非レシーバーポリペプチドは、例えば、合成膜－レシーバー複合体を安定化させ、合成膜－レシーバー複合体を特定の細胞及び組織に標的化し、細網内皮系と結合し、合成膜－レシーバー複合体をマクロファージ及び他の食細胞から保護し、及び／又は自然免疫系の他の成分を回避し得る。好適なポリペプチドとしては、例えば、補体調節ポリペプチド、細胞媒介性分解の阻害因子（例えば、ＣＤ４７、ＣＤ５５、及びＣＤ５９）、及び抗炎症性ポリペプチドが挙げられる。それに代えて又は加えて、非レシーバーポリペプチドは、マクロファージ又は他の食細胞に標的化することを含め、複合体の半減期を短縮又は制御し得る。好適な非レシーバーポリペプチドはアポトーシスを促進し、又は他の方法でオプソニン化を引き起こし得る。一部の実施形態において、非レシーバーポリペプチドはポリペプチド担体、ポンプ、及びチャネル；Ｇｌｕｔ１、バンド３、アクアポリン１、ＲｈＡＨ、ＮＡ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、Ｃａ ＡＴＰアーゼ、Ｎａ－Ｈ交換輸送体、ＫＣａ３．１、ＫＣｌ共輸送体、及び補酵素Ｑ１０を含む。

【0421】

多くの薬物は血液循環系に全身送達されるため、有効な薬物送達の問題に対する回答は、多くの場合に薬物を血中に長時間維持することに重点が置かれる。従って、血中で長時間にわたりバイオアベイラビリティを保つ長時間循環型の（長時間半減期の）治療薬の開発が必要とされており、しかし未だ対処されていない。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は、その循環中の半減期が増加又は低下するように修飾され得る。一部の実施形態において、循環中のレシーバー及び任意選択でペイロードの半減期は、合成膜－レシーバー複合体の半減期を改変することにより修飾されてもよい。場合によっては、半減期は増加され、その増加は、例えば、血清中半減期における約１．５倍～２０倍の増加であってもよい。

【0422】

一部の実施形態において、レシーバーは循環中に滞留してもよく、実質的に循環中における合成膜－レシーバー複合体の持続時間にわたり機能性及び活性のままであってもよい。一部の実施形態において、レシーバーは循環中に滞留してもよく、及び循環中で２１日超にわたり機能性及び活性のままであってもよい。場合によっては、合成膜－レシーバー複合体及びレシーバーは、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く循環中に滞留し得る。他の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体及びレシーバーは数時間～数日間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０日間循環中に滞留し得る。循環系における滞留は、特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体における特定のポリペプチドの存在又は非存在によって決定される。例えば、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＤ４７、ＣＤ５５、若しくはＣＤ５９ポリペプチド又はその機能断片を含み得る。

【0423】

ＣＤ４７は、例えばマクロファージ上に存在する骨髄抑制性免疫受容体ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ又はＳＨＰＳ－１とも称される）と相互作用する膜タンパク質である。ＣＤ４７がＳＩＲＰαに結合すると、宿主細胞の食作用を阻害する下方調節シグナルが提供される。例えば、高レベルのＣＤ４７は、高レベルのカルレティキュリンなど食作用促進シグナルの存在にも関わらず、癌細胞が食作用を回避することを可能にする。ＣＤ４７はまた、さらに、例えば血小板上のＴＨＢＳ１に対する接着受容体として作用することによる、細胞付着における役割、及びインテグリンのモジュレーションにおける役割も有する。さらに、ＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用すると、未成熟樹状細胞の成熟が妨げられ、成熟樹状細胞によるサイトカイン産生が阻害される。ＣＤ４７がＳＩＲＰγと相互作用すると、細胞間接着が媒介され、スーパー抗原依存的Ｔ細胞媒介性増殖が増進され、及びＴ細胞活性化が共刺激される。

【0424】

ＣＤ４７は、細胞外Ｎ末端ＩｇＶドメイン、５個の膜貫通ドメイン、及び短いＣ末端細胞内テールを有する５０ｋＤａの膜受容体である。その細胞質テールの長さのみが異なる４つの選択的にスプライスされたＣＤ４７アイソフォームがある。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、細胞外Ｎ末端ＩｇＶドメイン、１個、２個、３個、４個、又は５個の膜貫通ドメイン、及び／又は短いＣ末端細胞内テールのうちの１つ以上を含むＣＤ４７又はその機能断片を含み得る。細胞質テールは、４～３６アミノ酸の範囲の４つの異なるスプライスアイソフォームとして見られ得る。１６アミノ酸フォーム２は、造血起源のあらゆる細胞並びに内皮細胞及び上皮細胞で発現する。３６アミノ酸フォーム４は主としてニューロン、腸、及び精巣で発現する。４アミノ酸フォーム１は上皮細胞及び内皮細胞に見られる。２３アミノ酸フォーム３の発現パターンはフォーム４の発現パターンと似ている。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、フォーム１、フォーム２、フォーム３、又はフォーム４のうちの１つであるＣＤ４７又はその機能断片を含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はフォーム２を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＤ４７ポリペプチド又はその機能性ポリペプチド断片を、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに十分な量又はコピー数で含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、コンホメーション変化など、修飾されたＣＤ４７を含む。例えば、ＣＤ４７のコンホメーション変化は、修飾ＣＤ４７がＴＳＰ－１との相互作用能を有するように導入される。一実施形態において、コンホメーション変化を含む修飾ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαに対する異なる結合部位を作り出す。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、コンホメーション変化を含む修飾ＣＤ４７ポリペプチド又はその機能性ポリペプチド断片を、循環中に１０日未満の間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、又は１日未満の間滞留するのに十分な量又はコピー数で含む。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＤ４７アイソフォームと天然赤血球ポリペプチドの細胞外ドメインとの融合物を含む。例えば、グリコホリンＡのＮ末端がＣＤ４７ポリペプチド又はその機能断片と融合されてもよく、これにより、合成膜－レシーバー複合体を貪食するようマクロファージに送られるＳＩＲＰα媒介性シグナルが減少し得る。

【0425】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の作成には、レシーバー（例えばポリペプチド）を細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板と接触させるステップが含まれる。赤血球及び血小板ではＣＤ４７が発現して食作用を媒介する。一部の実施形態では、赤血球又は血小板における天然のＣＤ４７レベルが、例えば、外因性核酸（例えば、発現ベクター、ＣＤ４７ ｍＲＮＡ、ＣＤ４７ ｓｉＲＮＡなど）の導入など、任意の好適な方法を用いたＣＤ４７発現の過剰発現又は阻害によって改変される。一部の実施形態では、天然のＣＤ４７レベルは、合成膜－レシーバー複合体が循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するように改変される。一部の実施形態では、天然のＣＤ４７レベルは、合成膜－レシーバー複合体が循環中に１０日未満の間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、又は１日未満の間滞留するように改変される。

【0426】

例えば、対象に投与される合成膜－レシーバー複合体は、好適な対照の天然レベルと比較したとき上昇したＣＤ４７レベルを含み得る。ＣＤ４７レベルの上昇は、例えば、合成膜－レシーバー複合体による外因性核酸からのＣＤ４７の外因性発現によるか、複合体へのＣＤ４７ ｍＲＮＡの負荷によるか、又は複合体の表面に対するＣＤ４７ポリペプチドのコンジュゲーションによって実現し得る。ＣＤ４７レベルの上昇は、対象の循環系における合成膜－レシーバー複合体の集団の半減期を増加させるのに有用である。合成膜－レシーバー複合体は、レシーバーと、任意選択で治療剤などのペイロードとを含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の半減期が増加すると、循環中のレシーバー及び／又は任意選択のペイロードの半減期が増加し、それによりレシーバー及び／又はペイロードが活性である治療ウィンドウが潜在的に増加する。一例では、１０^１１個の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団が、その表面上にアデノシンデアミナーゼレシーバーと外因性ＣＤ４７ポリペプチドとを含む。ＡＤＡ－ＳＣＩＤなどの酵素欠損症の対象に投与したとき、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の半減期は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含まない複合体の半減期を超えて延長され、対象が必要とする投与頻度が減る。半減期の延長は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含まない現在の酵素治療薬と比較したとき特に有利である。

【0427】

一部の実施形態において、ＣＤ４７がヘパリン及び／又はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖によって改変される。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はＣＤ４７をプロテオグリカンとして発現する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、複合体にコンジュゲートしたＣＤ４７プロテオグリカンを含む。一実施形態において、ＣＤ４７プロテオグリカンはヘパリン及び／又はコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を含む。一実施形態において、そのＣＤ４７プロテオグリカンは、１５０ｋＤａ超、２００ｋＤａ、又は２５０ｋＤａ超のサイズを有する。一実施形態において、ＣＤ４７はＳｅｒ６４に１つ以上のＧＡＧ鎖を含む。

【0428】

一部の実施形態において、例えば赤血球系細胞又は血小板を使用して作成された合成膜－レシーバー複合体の滞留は、合成膜－レシーバー複合体の膜における酸化脂質の量又は数を変化させることによってさらにモジュレートし得る。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、循環中に１０日未満の間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、又は１日未満の間滞留するのに有効な量で酸化脂質を含む。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに有効な量で酸化脂質を含む。一部の実施形態において、膜中の酸化脂質の量は、ＣＤ４７の移動度が増加するか又は低下し、それによりＣＤ４７が膜上でクラスターを形成する能力をそれぞれ促進するか又は妨げるように改変される（Ｏｌｓｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｍｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｍｅａ，Ｓｗｅｄｅｎ，２００８を参照）。

【0429】

ＣＤ５５は、補体崩壊促進因子又はＤＡＦとしても知られ、７０ｋＤａの膜タンパク質である。ＣＤ５５は、Ｃ４（古典補体経路及びレクチン経路）及びＣ３（第二補体経路）活性化の間に作られる補体系のＣ４ｂ及びＣ３ｂ断片を認識する。ＣＤ５５が細胞結合型Ｃ４ｂ及びＣ３ｂタンパク質と相互作用すると、Ｃ２及びＢ因子から活性Ｃ２ａ及びＢｂへの変換を触媒するその能力が妨げられ、それにより補体カスケードの増幅コンバターゼであるＣ４ｂ２ａ及びＣ３ｂＢｂの形成が防止されると考えられる。ＣＤ５５は膜侵襲複合体の形成を阻止すると考えられる。ＣＤ５５は補体カスケードによる溶解を防ぎ得る。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はＣＤ５５ポリペプチド又はその機能性ポリペプチド断片を、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに十分な量又はコピー数で含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は外因性ＣＤ５５ポリペプチド及び外因性ＣＤ４７ポリペプチド又はそれらの機能性ポリペプチド断片を、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに十分な量、コピー数及び／又は比で含む。

【0430】

ＭＡＣ阻害タンパク質（ＭＡＣ－ＩＰ）、反応性細胞融解の膜阻害因子（ＭＩＲＬ）、プロテクチン、又はＨＲＦとしても知られるＣＤ５９糖タンパク質は、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して宿主細胞に結合するタンパク質である。補体活性化によりＣ５ｂ６７８が宿主細胞に付着すると、ＣＤ５９はＣ９の重合及び補体膜侵襲複合体形成を妨げ得る。ＣＤ５９は補体カスケードによる溶解を防ぎ得る。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はＣＤ５９ポリペプチド又はその機能性ポリペプチド断片を、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに十分な量又はコピー数で含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は外因性ＣＤ５９ポリペプチド及び外因性ＣＤ４７ポリペプチド又はそれらの機能性ポリペプチド断片を、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに十分な量、コピー数及び／又は比で含む。

【0431】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、外因性ＣＤ５５ポリペプチド、外因性ＣＤ５９ポリペプチド及び／又は外因性ＣＤ４７ポリペプチド又はそれらの機能性ポリペプチド断片の１つ以上を、循環中に１５日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、１００日間、１２０日間、又はそれより長く滞留するのに十分な量、コピー数及び／又は比で含む。

【0432】

ＣＤ４７、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の有効量としては、１個の合成膜－レシーバー複合体当たり１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^９個のポリペプチドが挙げられる。或いは、有効量は、その合成膜－レシーバーポリペプチド複合体がポリペプチド無しに呈するであろう半減期と比べて合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の半減期を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、４００％、８００％、１，０００％、又は１０，０００％延長することが可能な量である。

【0433】

レシーバー
本明細書には、合成膜－レシーバー複合体によって呈示されるレシーバーが提供される。一部の実施形態において、レシーバーは標的との相互作用能を有して、例えば標的と会合し、又はそれに結合する。レシーバーはポリペプチドを含むか、又は本質的にポリペプチドからなり得る。一部の実施形態において、レシーバーは、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、小分子、又はそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態において、レシーバーは標的と相互作用せず、しかし合成膜－レシーバー複合体によって細胞、組織又は対象の体内の他の部位に送達されるペイロードとして機能する。

【0434】

一部の実施形態において、レシーバーはポリペプチドを含む。レシバー（ｒｅｃｉｖｅｒ）ポリペプチドはサイズが６アミノ酸～３０００アミノ酸の範囲であってもよく、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００アミノ酸超、又は５００アミノ酸超であり得る。レシバー（ｒｅｃｉｖｅｒ）ポリペプチドはサイズが約２０アミノ酸～約５００アミノ酸、約３０アミノ酸～約５００アミノ酸又は約４０アミノ酸～約５００アミノ酸の範囲であってもよい。

【0435】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、２つ以上の個別的なタンパク質ドメインを含み得るキメラ又は融合タンパク質を含む。これらのキメラレシーバーは、種々のドメインが異なる供給源に由来し、従って天然で一緒に見られることはないという意味で異種又は外因性であり、例えば外因性核酸によってコードされ得る。レシーバーポリペプチドは幾つかの方法によって作製することができ、その多くは当該技術分野で周知であり、また本明細書にも記載される。例えば、レシーバーポリペプチドは、抽出によるか（例えば、単離細胞から）、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸の発現によるか、又は化学合成によって得ることができる。レシーバーポリペプチドは、例えば、組換え技術によって、及びポリペプチドをコードする発現ベクターを、コードされるレシーバーポリペプチドの発現用宿主細胞に（例えば、形質転換又はトランスフェクションによって）導入することにより作製し得る。

【0436】

概して活性を変えることなくアミノ酸配列に加え得る種々の保存的な変化がある。これらの変化は保存的置換又は突然変異と称される；即ち、特定のサイズ、電荷又は他の特性を有するアミノ酸分類に属するアミノ酸によって別のアミノ酸を置換することができる。アミノ酸配列の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、及びチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。かかる改変は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は等電点によって決定するときの見かけの分子量に実質的に影響を及ぼさないものと思われる。保存的置換はまた、配列の光学異性体による他の光学異性体の置換、具体的には配列の１つ以上の残基に関するＤアミノ酸によるＬアミノ酸の置換も含む。さらに、配列中の全てのアミノ酸がＤ異性体からＬ異性体への置換を受けてもよい。例示的な保存的置換としては、限定はされないが、正電荷を維持するＡｒｇに対するＬｙｓ及びその逆；負電荷を維持するＡｓｐに対するＧｌｕ及びその逆；遊離～ＯＨを維持するためのＴｈｒに対するＳｅｒ；及び遊離ＮＨ_２を維持するＡｓｎに対するＧｌｎが挙げられる。さらに、ポリペプチド配列又は対応する核酸配列の点突然変異、欠失、及び挿入が、ある場合には、ポリペプチド又は核酸断片の機能喪失なく作製されてもよい。置換は、例えば、１個、２個、３個、又はそれを超える残基を含み得る。具体的なアミノ酸配列又はポリペプチドをコードする外因性核酸の任意の教示又はそれらの名称の名称の教示には、ポリペプチド又は核酸断片の機能喪失なく作製することのできる、それらのポリペプチド配列又は対応する核酸配列並びにそのタンパク質又は遺伝子についてデータベースに寄託された任意の配列の任意の保存的置換、点突然変異、欠失、及び挿入が含まれる。

【0437】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の膜と会合している。他の実施形態において、レシーバーポリペプチドは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の膜と会合していない。

【0438】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中の脂質とレシーバーとの質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、約１，０００，０００：１、約１０，０００，０００：１、約１００，０００，０００：１、約１，０００，０００，０００：１又は約１，０００，０００，０００：１超である。

【0439】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中の非レシーバーポリペプチドとレシーバーとの質量比は１：１０００未満、約１：１０００、約１：５００、約１：２５０、約１：１００、約１：５０、約１：２５、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２５：１、約５０：１、約１００：１、約２５０：１、約５００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、約１，０００，０００：１、約１０，０００，０００：１、約１００，０００，０００：１、約１，０００，０００，０００：１又は約１，０００，０００，０００：１超である。

【0440】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に位置し、その周りの環境に露出している。一部の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の内部に位置し、その非露出側に向いている。

【0441】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは以下のドメイン、即ち、Ｓドメイン（表面）、Ａドメイン（アンカー）、及び／又はＵドメイン（非露出）のうちの少なくとも１つを含み、ここでＳドメインは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の周りの環境に露出した表面ドメインであり、Ａドメインはアンカーであり、及びＵドメインは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の内部に位置し及び／又はその非露出側に向いている。

【0442】

任意選択でレシーバーポリペプチドは、ｉ）Ｓ’ドメインと称される１つ以上の追加的なＳドメイン、又はｉｉ）Ｕ’ドメインと称される１つ以上の追加的なＵドメインを含む。

【0443】

一部の実施形態において、ＳドメインとＡドメインとは、同じポリペプチド鎖の一部を形成する。

【0444】

一部の実施形態において、ＡドメインとＵドメインとは、同じポリペプチド鎖の一部を形成する。

【0445】

一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体に外部的に加えられる。

【0446】

一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体内で作製される。

【0447】

一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上はポリペプチドである。

【0448】

一部の実施形態において、Ｓ、Ａ、Ｕドメインの任意の１つ以上はポリペプチドでない。

【0449】

合成膜－レシーバー複合体内又はその上にあるレシーバーの例示的構造の概略図を図１４Ａ、図１４Ｂ、及び図１４Ｃに示す。

【0450】

１．Ａドメイン
特定の実施形態において、Ａドメインは膜ポリペプチドである。Ａドメインは、例えば、内在性膜ポリペプチド又は膜結合ポリペプチドであり得る。

【0451】

Ａドメインは、以下のクラス、限定はされないが、例えば、αヘリックスバイトピック、αヘリックスポリトピック、βバレル膜貫通、全αモノトピック／末梢、全βモノトピック／末梢、α／βモノトピック／末梢、α＋βモノトピック／末梢、αヘリックスペプチド、βヘアピンペプチド、βヘリックスペプチド、１型膜貫通タンパク質（Ｎ末端細胞外）、２型膜貫通タンパク質（Ｎ末端細胞内）、３型膜貫通タンパク質、４Ａ型膜貫通タンパク質、４Ｂ型膜貫通タンパク質、脂質アンカー型タンパク質、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質、プレニル鎖アンカー型タンパク質、又は非定型構造のペプチドの１つから選択され得る。

【0452】

特定の実施形態において、Ａドメインは内因性であり、例えば、赤血球系細胞、血小板、又は造血細胞にとって内因性である。一部の実施形態において、Ａドメインは哺乳類細胞にとって内因性である。

【0453】

特定の実施形態において、Ａドメインは外因性であり、例えば、赤血球系細胞、血小板、又は造血細胞にとって外因性である。一部の実施形態において、Ａドメインは哺乳類細胞にとって外因性である。

【0454】

Ａドメインは、以下の分子又はその断片、例えば限定はされないが、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗ１８６、ＣＤ１９５、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２０９、ＣＤ２０２ａ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ２７９、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０９、ＣＤ３２６、Ｒａｓ関連タンパク質１Ａ、セマポリン７Ａ（ｓｅｍａｐｏｒｉｎ ７Ａ）前駆体、カルシウム及びインテグリン結合タンパク質１、５５ｋＤａ赤血球膜タンパク質、フロチリン－１、フロチリン－２、赤血球膜結合性タンパク質、真核生物翻訳開始因子２Ｃ ２、シトクロムｂ５レダクターゼ、細胞分裂制御タンパク質４２ホモログ、ＫＩＡＡ１３６３タンパク質、バンド３、アネキシンＶＩＩ、アクアポリン、エクトＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ４、Ｋｅｌｌ、ＬＦＡ－３、溶質キャリアファミリー２メンバー１、ＬＧＡＬＳ３タンパク質、尿素輸送体、Ｒｈ血液型ＣＥ抗原ポイペプチド（ｐｏｙｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｒｈ関連糖タンパク質、デマチン、ＡＢＯ血液型、アクアポリン３、オベルジェ、バンド３、ベイシジン、Ｃ４１、ＣＤ４４、シスＡＢ、コルトン抗原、補体成分４、ＣＲ１、ＤＡＦ、ディエゴ、ダッフィ、Ｈｈ／ボンベイ抗原、ｉｉ抗原、インド人血液型、Ｋｅｌｌ、Ｋｉｄｄ、ルイス抗原、ルセラン抗原、ＭＮＳ抗原系、コスト（Ｃｏｓｔ）型、Ｅｒ型、デマチン、ストマチン、トロポミオシン、グルコース輸送体、アデュシン、ラブフィリン、Ｃ１テトラヒドロ葉酸シンターゼ、ヴェル（Ｖｅｌ）型、Ｌａｎ抗原、Ａｔ抗原、Ｊｒ抗原、ＡｎＷｊ抗原、Ｓｄ抗原、バッティ（Ｂａｔｔｙ）、ビルケス（Ｂｉｌｋｅｓ）、ボックス（Ｂｏｘ）、クリスチャンセン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ）、ＨＪＫ、ＨＯＦＭ、ＪＦＶ、ＪＯＮＥｓ、イェンゼン（Ｊｅｎｓｅｎ）、カタギリ（Ｋａｔａｇｉｒｉ）、リブセイ（Ｌｉｖｅｓａｙ）、ミルン（Ｍｉｌｎｅ）、オルデイド（Ｏｌｄｅｉｄｅ）、ピータース（Ｐｅｔｅｒｓ）、ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、リード（Ｒｅｉｄ）、ＲＥＩＴ、ＳＡＲＡ、リーサス血液型Ｄ、アルドラーゼ、トロポモジュリン、アルギナーゼ、クレアチンキナーゼ、Ｂ－Ｃａｍタンパク質、Ｒａｐ１Ａ、ベネット－グッドスピード（Ｂｅｎｎｅｔｔ－Ｇｏｏｄｓｐｅｅｄ）、Ｐ抗原系、Ｒｈ血液型Ｘｇ抗原系、ＸＫタンパク質、Ｙｔ／カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）抗原系、ＣＤ５８、Ｒｈ、シアンナ（Ｓｃｉａｎｎａ）、ラディン（Ｒａｄｉｎ）、ＤＡＲＣ（ダッフィ）、ＣＲ１クノップス－マコイ（Ｋｎｏｐｓ－ＭｃＣｏｙ）、ＤＡＦクローマー（Ｃｒｏｍｅｒ）、ゲルビッヒ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）（ＧＹＰＣ）、ＣＤ４７、グリコホリンＡ、バンド３（ＡＥ３）、ＧＹＰＢ Ｓｓ、Ｃ４Ａ、Ｃ４Ｂチド（Ｃｈｉｄｏ）、ロジャース（Ｒｏｄｇｅｒｓ）Ｃ４補体成分、ＨＬＡ Ｂｇ ＨＬＡクラスＩ、ＲＨＡＧ Ｒｈ関連アンモニウム輸送体、糖タンパク質、コルトン（Ｃｏ）ウォーターチャネルタンパク質、ＡＣＨＥカートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）（Ｙｔ）アセチルコリンエステラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、グリコホリンＣ、アクアポリン、赤芽球関連膜タンパク質、ＣＤ４４、シナプトブレビン２、リボヌクレアーゼ、十二指腸シトクロムＢ、ＡＢＯグリコシルトランスフェラーゼ、ＣＤ５９、ＣＤ４４インド人（Ｉｎ）、ＡｎＷｊ接着受容体、ＭＥＲ２、ＤＯＫドンブロックＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ、ＳＥＭＡ７Ａ ＪＭＨ推定接着受容体、ＵＭＯＤ Ｓｄａタム－ホースフォールタンパク質（ウロモジュリン）、ディエゴ（Ｄｉ）、ライト（Ｗｒ）アニオンチャネルタンパク質（バンド３、ＡＥ１）、キッド（Ｊｋ）尿素輸送体、ＦＵＴ３ルイス（Ｌｅ）α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ、ＯＫ Ｏｋａニューロテリン、推定接着分子、ＬＷ接着受容体、ＦＵＴ２分泌型（Ｓｅ）α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ、ＦＵＴ１ Ｈｈ α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ、ＬＵ ルセラン（Ｌｕ）接着受容体、Ｐ１グリコシルトランスフェラーゼ、ＸＫ Ｋｘ推定神経伝達物質輸送体、ＸＧ Ｘｇ旧称ＰＢＤＸ、ＭＩＣ２、ヘモグロビン、アンキリン、スペクトリン、ＫＥＬ Ｋｅｌｌ（フォームＫ、ｋ、Ｋｐ、Ｊｓ）メタロプロテイナーゼ、トルキルドセン抗原、補酵素Ｑ１０、Ｒａｂ ３５、ＲａｌＡ結合タンパク質、透明帯結合タンパク質、ＬｙｎＢタンパク質、ＫＩａａ１７４１タンパク質、ＤＣ３８、カルシウム輸送ＡＴＰアーゼ、ＧＰＩＸ、ＧＰＩｂａ、ＧＰＩｂｂ、ＧＰＶ、ＧＰＩｂ－ＩＸ－Ｖ、ＧＰＶＩ、ＧＰＩａ－ＩＩａ、ＧＰＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＧＰＶ／ＩＩａから選択され得る。

【0455】

２．Ｓドメイン
一部の実施形態において、Ｓドメインはタンパク質又はポリペプチドである。他の実施形態において、Ｓドメインは核酸である。一部の実施形態において、Ｓドメインは化学物質である。特定の実施形態において、Ｓドメインは小分子である。

【0456】

一部の実施形態において、Ｓドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、可動性リンカー、エピトープタグ、酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、レシーバー、抗体様分子、抗体のリガンド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、成長因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、酵素認識配列、トランスペプチダーゼ認識配列、プロテアーゼ認識配列、切断可能ドメイン、インテイン、ＤＮＡ結合タンパク質、及びＲＮＡ結合タンパク質、補体調節分子、補体カスケード分子、凝固カスケード分子、キレーター、補体調節ドメイン、ＳＣＲドメイン、ＣＣＰドメイン、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメイン、アルマジロリピート、ロイシンジッパー、デルス（ｄｅａｌｔｈ）エフェクタードメイン、カドヘレイン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）リピート、ＥＦハンド、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、ＳＣＲ相同性２ドメイン、ジンクフィンガードメイン、環状ペプチド、細胞透過性ペプチドから選択されるか、又はそれに由来するポリペプチドである。

【0457】

一部の実施形態において、Ｓドメインは非ポリペプチド分子、例えば核酸、炭水化物、又は小分子である。一部の実施形態において、Ｓドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡプローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、ｍＲＮＡ、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドから選択される核酸である。一部の実施形態において、Ｓドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、キレーター、ＤＯＴＡ、放射性核種、同位体、造影剤、蛍光分子、化学発光分子、気体から選択される小分子である。

【0458】

３．Ｕドメイン
一部の実施形態において、Ｕドメインはタンパク質又はポリペプチドである。他の実施形態において、Ｕドメインは核酸である。一部の実施形態において、Ｕドメインは化学物質である。特定の実施形態において、Ｕドメインは小分子である。

【0459】

一部の実施形態において、Ｕドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、可動性リンカー、エピトープタグ、酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、レシーバー、抗体様分子、抗体のリガンド、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、成長因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、酵素認識配列、トランスペプチダーゼ認識配列、プロテアーゼ認識配列、切断可能ドメイン、インテイン、ＤＮＡ結合タンパク質、及びＲＮＡ結合タンパク質、補体調節分子、補体カスケード分子、凝固カスケード分子、キレーター、補体調節ドメイン、ＳＣＲドメイン、ＣＣＰドメイン、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様ドメイン、アルマジロリピート、ロイシンジッパー、デルス（ｄｅａｌｔｈ）エフェクタードメイン、カドヘレイン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎ）リピート、ＥＦハンド、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同ドメイン、ＳＣＲ相同性２ドメイン、ジンクフィンガードメイン、環状ペプチド、細胞透過性ペプチド、キナーゼドメイン、ホスファターゼドメイン、細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質と相互作用するタンパク質、Ｇタンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ、ＩＴＩＭドメイン、ＩＴＡＭドメインから選択されるか、又はそれに由来するポリペプチドである。

【0460】

一部の実施形態において、Ｕドメインは非ポリペプチド分子、例えば核酸、炭水化物、又は小分子である。一部の実施形態において、Ｕドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡプローブ、一本鎖ＤＮＡプローブ、ｍＲＮＡ、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドから選択される核酸である。一部の実施形態において、Ｕドメインは、以下のクラスの１つ以上、例えば限定はされないが、キレーター、ＤＯＴＡ、放射性核種、同位体、造影剤、蛍光分子、化学発光分子、気体から選択される小分子である。

【0461】

レシーバーポリペプチドの例
レシーバーポリペプチドの例としては、以下が挙げられる：ポリペプチドレシーバーは、Ｎ末端にＨＡエピトープタグを有するグリコホリンＡを含む；ポリペプチドレシーバーは、グリコホリンＡのリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、及びグリコホリンＡの本体配列を含む；ポリペプチドレシーバーは、補体受容体１（ＣＲ１）を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＲ１のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、ＣＲ１の本体配列を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＲ１のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、ＣＲ１のＬＨＲ－Ａ及びＬＨＲ－Ｂの６つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜貫通領域、及びＣＲ１の細胞内領域を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＲ１のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、ＣＲ１のＬＨＲ－Ａ及びＬＨＲ－Ｂ及びＬＨＲ－Ｃの９つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜貫通領域、及びＣＲ１の細胞内領域を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＲ１のリーダー配列、ＣＲ１のＬＨＲ－Ａ、ＣＲ１のＬＨＲ－Ｂ、ＣＲ１のＬＨＲ－Ｃ、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、ＣＲ１の膜貫通領域、及びＣＲ１の細胞内領域を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＲ１のリーダー配列、ＣＲ１のＬＨＲ－Ａ、ＣＲ１のＬＨＲ－Ｂ、ＣＲ１のＬＨＲ－Ｃ、ＣＲ１の膜近位の２つのＳＣＲドメイン、グリコホリンＡの膜貫通領域及び細胞内領域を含む；ポリペプチドレシーバーは、グリコホリンＡのリーダー配列、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ）、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ＨＡエピトープタグ、及びグリコホリンＡの本体を含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ＨＡエピトープタグ、及びｓｃＦｖを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌ及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌの７１アミノ酸Ｎ末端断片及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌの７１アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌの７９アミノ酸Ｎ末端断片及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌの７９アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌの７１アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ｓｃＦｖ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、Ｋｅｌｌの７９アミノ酸Ｎ末端断片、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、ｓｃＦｖ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＤ５５のリーダー配列、ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５５の末端３７アミノ酸を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＤ５５のリーダー配列、ＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５５の本体を含む。一実施形態において、ポリペプチドレシーバーは、ＣＤ５９のリーダー配列、ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５９の本体を含む；ポリペプチドレシーバーは、ＣＤ５９のリーダー配列、及びＨＡエピトープタグ、及びＣＤ５９の本体を含む；ポリペプチドレシーバーは、アデノシンデアミナーゼ及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、アデノシンデアミナーゼ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２可動性リンカー、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、グリコホリンＡ、細胞質Ｃ末端のアデノシンデアミナーゼ、及びＨＡエピトープタグを含む；ポリペプチドレシーバーは、グリコホリンＡ、細胞質Ｃ末端のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、及びＨＡエピトープタグを含む。

【0462】

特定の実施形態において、レシーバーはマクロファージとの相互作用能を有する。レシーバーポリペプチドは以下の１つ以上を含み得る：補体受容体（Ｒｉｅｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２７：２０８１－２０９１（１９９４））、スカベンジャー受容体（Ｂｒａｓｓｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６９：３４５－３５２（１９９９））、トランスフェリン受容体（Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９：４８２－４８９（１９９８）；Ｈａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２６：４５５６（１９９４））；Ｆｃ受容体（Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１７３１－１７３３（１９９４））；及びマンノース受容体（Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３００：２５１－２５８（１９９７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３７：３５８－３６４（１９９０））。

【0463】

マクロファージとの相互作用能を有する他のレシーバーには、以下が含まれる：低密度リポタンパク質（Ｍａｎｋｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４０：１１２－１１５（１９９７）；ｖｏｎ Ｂａｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３１：３８２－３８６（１９９３））、超低密度リポタンパク質（Ｔａｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５：１５４７－１５６０（１９９１））、マンノース残基及び他の炭水化物部分（Ｐｉｔｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２：３５５－３６５（１９９５））、ポリカチオン性分子、例えばポリ－Ｌ－リジン（Ｈａｍｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２６：４５－５６（１９９４））、リポソーム（Ｂａｋｋｅｒ－Ｗｏｕｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．２：３６３－３７１（１９９４）；Ｂｅｔａｇｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：４８－５３（１９９３））及び２－マクログロブリン（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１５３８－１５４５（１９９４））。

【0464】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＨＩＶ共受容体の細胞外ドメインを含むレシーバーを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ウイルスとの結合能を有するレシーバーを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＤ４を含むレシーバーを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＨＩＶ共受容体を含むレシーバーを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ６、ＧＰＲ１５、ＡＰＪ、ＣＭＫＬＲ１、又はＣＸ３ＣＲ１又はそれらの組み合わせを含むレシーバーを含まない。

【0465】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、アデノシンデアミナーゼレシーバーをコードする外因性核酸を含有しない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を含むレシーバーを含まない。

【0466】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、癌遺伝子をコードする外因性核酸を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、癌遺伝子を含むレシーバーを含まない。

【0467】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ｃｄｘ１、ｃｄｘ２、又はｃｄｘ４をコードする外因性核酸を含有しない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ｃｄｘ１、ｃｄｘ２、又はｃｄｘ４、又はそれらの組み合わせを含むレシーバーを含まない。

【0468】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、リガンド結合ドメインを含むキメラポリペプチドを含むレシーバーを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、リガンドとの結合能を有するＳドメインを含むレシーバーを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－３受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－１１受容体、ＩＬ－１３受容体、ＧＭ－ＣＳＦ受容体、ＬＩＦ受容体、ＣＮＴＦ受容体、オンコスタチンＭ受容体、ＴＧＦ－β受容体、ＥＧＦ受容体、ＡＴＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｃ－ｅｒｂＢ－３、Ｘｍｒｋ、インスリン受容体、ＩＧＦ－１受容体、ＩＲＲ、ＰＤＧＦ受容体、ＣＳＦ－１受容体、ｃ－ｋｉｔ、ＳＴＫ－１／ｆｌｋ－２、ＦＧＦ受容体、ｆｌｇ、ｂｅｋ、ＮＧＦ受容体、Ｒｏｒ１及びＲｏｒ２を含むレシーバーを含まない。

【0469】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ヒトパピローマウイルスのＥ６又はＥ７遺伝子を含むレシーバーを含まない。

【0470】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、腫瘍抗原を含むレシーバーを含まない。

【0471】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、グルコセレブロシダーゼを含むレシーバーを含まない。

【0472】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、アスパラギナーゼを含むレシーバーを含まない。

【0473】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、アルギニンデイミナーゼを含むレシーバーを含まない。

【0474】

本明細書には、ｉ）同じ系統の天然赤血球系細胞に存在しないか、又はｉｉ）レシーバーを含む赤血球系細胞と比較したとき低下したレベル又は低下した活性レベルで同じ系統の天然赤血球系細胞に存在するかのいずれかである機能活性を有するレシーバーを含む機能性赤血球系細胞を含有する組成物が提供される。かかる機能活性には、補体阻害、免疫複合体クリアランス、人工抗原提示、凝固カスケードのモジュレーション、酸素移動、薬物送達、細胞毒吸着、食作用の回避、及び循環時間の延長が含まれる。

【0475】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ＣＲ－１レシーバーを含むため、同じ系統の天然赤血球系細胞と比べてより高いレベルの補体受容体ポリペプチド、例えばＣＲ１を有する。代替的実施形態において、レシーバーを含む機能性赤血球系細胞は、限定はされないが、表７及び表１０に掲載するポリペプチドを含めた、同じ系統の天然赤血球系細胞と比べてより高いレベルの補体受容体作動薬ポリペプチド又は補体関連ポリペプチドを有する。補体受容体レシーバーポリペプチドは、ヒト補体受容体１（ＣＲ１）ポリペプチド、その変異体、又は機能断片を含む。ＣＲ１レシーバーポリペプチドはＣＲ１の天然アレル、例えば、Ａアレル（Ｆアレル又はＣＲ１＊１アレルとも称される）、Ｂアレル（Ｓアレル又はＣＲ１＊２アレルとも称される）、Ｃアレル（Ｆ’アレル又はＣＲ１＊３アレルとも称される）、又はＤアレル（ＣＲ１＊４アレルとも称される）の１つ又は２つ以上に由来し得る。これらの天然型の配列及びデータベース受託番号は、表４に提供される。一部の実施形態において、ＣＲ１レシーバーポリペプチドは、ＣＲ１ポリペプチドのドメインを含有する。例えば、ＣＲ１ポリペプチドは、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール又はＳｕｓｈｉドメインとも称される１つ以上のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）ドメイン、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＶ６５５７７．１を含み得る。一実施形態において、ＣＲ１レシーバーポリペプチドは、１個以上のショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４個又は４４個超のＳＣＲを含む。別の実施形態では、ＣＲ１レシーバーポリペプチドは、ＣＲ１の１個以上のロング相同リピート（ＬＨＲ）単位、例えば、ＬＨＲ－Ａ、ＬＨＲ－Ｂ、ＬＨＲ－Ｃ、又はＬＨＲ－Ｄ、例えば、１、２、３、４、５、６個又は６個超のＬＨＲドメインを含む。別の実施形態では、ＣＲ１レシーバーポリペプチドは、別の細胞膜タンパク質、例えば、グリコホリンＡ、グリコホリンＢ、グリコホリンＣ、グリコホリンＤ、ｋｅｌｌ、バンド３、アクアポリン１、ｇｌｕｔ １、キッド抗原タンパク質、リーサス抗原、例えば、限定はされないが、表１及び表７に掲載する細胞表面部分に融合したＣＲ１の１つ又は２つ以上の細胞外ドメインを含み得る。

【0476】

一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、補体受容体レシーバーポリペプチド、又はそれに代えて又は組み合わせで、限定はされないが、表１０に掲載するポリペプチド、及びポリペプチドに対する作動薬を含めた、補体受容体作動薬レシーバーポリペプチド又は補体関連レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸を含有する。一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、外因性崩壊促進因子（ＣＤ５９、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＧ４６５２３．１）ポリペプチド、又は外因性膜補因子（ＣＤ４６、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１２２２４．１）ポリペプチド、又はその変異体若しくは機能断片、又はそれらの組み合わせをさらに含有する。

【0477】

ＣＲ１活性には、Ｃ３ｂ含有免疫複合体との結合及び循環から細網内皮系の肝臓及び脾臓マクロファージへのそれらの免疫複合体のシャトリングが含まれる。細網内皮系の細胞と遭遇すると、免疫複合体は食細胞によってエンドサイトーシスで取り込まれるが、赤血球は回避して循環し続ける。免疫複合体の除去により、時にＣＲ１が赤血球の表面からタンパク質分解によって切断されることもある。結合活性を計測するには、赤血球系細胞と免疫複合体との間のインビトロ結合アッセイを実施することができる。赤血球系細胞の回避を計測するには、食細胞及び免疫複合体が負荷された赤血球系細胞によるインビトロ食作用アッセイを実施することができる。肝臓への循環免疫複合体のインビボクリアランスを計測するには、放射性標識免疫複合体を使用してクリアランス及び体内分布アッセイを実施することができる。

【0478】

レシーバーポリペプチドを含まない同じ系統の造血細胞より高いレベルで天然ポリペプチドを含むレシーバーを含有する機能性赤血球系細胞を含有する組成物が提供される。例えば、機能性赤血球系細胞の集団は、ＣＲ１レシーバーポリペプチドを欠く同じ系統の対応する造血細胞より少なくとも約１．１、例えば、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００倍、又は１００００倍超高いレシーバー、例えば補体受容体１レベルを有する。網赤血球及び赤血球のＣＲ１レベルは、典型的には１細胞当たり５０～２０００個の分子である（Ｌａｃｈ－Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９，１６２：７５４９）。ＣＲ１レベルが１細胞当たり少なくとも約２５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、４００００、５００００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００、８０００００、９０００００、１００００００個、又は１００００００個超の分子である機能性赤血球系細胞の集団を含む組成物が提供される。野生型及び合成膜－レシーバーポリペプチド複合体のＣＲ１レベルは、例えば、ＣＲ１に特異的な抗体によるフローサイトメトリーによって計測及び定量化することができる。

【0479】

一部の実施形態において、レシーバーは循環病原体、例えばウイルス又は細菌と相互作用する。一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、循環病原体に特異的な抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディをコードする外因性遺伝子を発現する。抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態では、抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディレシーバー又は循環病原体に対して親和性を有する別のレシーバーが赤血球系細胞内又はその上に負荷される。抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディレシーバー又は循環病原体に対して親和性を有する他のレシーバーは細胞内又は細胞外に局在し得る。一部の実施形態において、レシーバーは、表面抗原、エンベロープ抗原又はカプシド抗原などのウイルス抗原又は細菌抗原に特異的である。

【0480】

一部の実施形態において、レシーバーは、毒素、好ましくは病原体に由来するか又はその他に環境に由来するなどの外来性毒素と相互作用する。一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、アミロイドＰ成分、又はカチオン性タンパク質に由来するアミノ酸配列を含むレシーバーをコードする外因性遺伝子を発現する。毒素結合レシーバーは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、毒素結合レシーバーは赤血球系細胞内又はその上に負荷され得る。毒素結合レシーバーは細胞内又は細胞外に局在し得る。一部の実施形態において、毒素結合レシーバーはボツリヌス又は炭疽などの細菌性毒素に特異的である。

【0481】

さらに、合成膜－レシーバー複合体は、標的を隔絶するその能力を増進させる能力を有するレシーバーを発現し得る。潜在的な隔絶増進レシーバーには、限定はされないが表１にあるものを含めた、ポリペプチド輸送体が含まれる。

【0482】

一実施形態において、レシーバーは、ダッフィ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ダッフィ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）に由来するアミノ酸配列をコードする外因性遺伝子を発現する。ＤＡＲＣレシーバーは完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。ＤＡＲＣは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、ＤＡＲＣタンパク質は赤血球系細胞内又はその上に負荷される。一部の実施形態において、負荷されたＤＡＲＣはさらに機能化されるか、又は他の方法で修飾される。ＤＡＲＣレシーバー分子は細胞内又は細胞外に局在し得る。

【0483】

ＤＡＲＣは、強力なマルチリガンドケモカイン受容体として同定された。ＤＡＲＣはロドプシン様７本ヘリックス膜貫通タンパク質ファミリーに属する。赤血球に加えて、ＤＡＲＣは、多くの組織における白血球遊出の原発部位である後毛細管細静脈内皮細胞で発現する。ＤＡＲＣは、ＣＣ及びＣＸＣケモカインの両方に対して高度に特異的な結合部位を提供する。ＤＡＲＣは、ＥＬＲモチーフＣＸＣケモカインに対してより高い親和性を有すると考えられている。ＣＸＣケモカインは好中球化学誘引物質であり、潜在的に血管新生促進性であり得る。

【0484】

ＤＡＲＣとＣＸＣＬ８との間の相互作用では、５ｎｍｏｌ／Ｌの解離定数（Ｋｄ）及び１個の赤血球当たり１０００～９０００個と推定される受容体結合部位が示されている（Ｈａｄｌｅｙ，Ｂｌｏｏｄ，１９９７）。他の７回膜貫通型ケモカイン受容体と異なり、ＤＡＲＣは、２番目の細胞質ループに位置する高度に保存されたＧタンパク質共役モチーフを欠いている（Ｍｅｎｙ，Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１０）。ＤＡＲＣはＧタンパク質共役型ではなく、既知の選択的シグナル伝達機構を有しない。ＤＡＲＣの生物学的な役割は完全には解明されていない。ＤＡＲＣは、ａ）多重特異的であり；ｂ）細胞内シグナルを惹起する能力を有しないと考えられており、及びｃ）赤血球表面に結合したケモカインにその通常の標的炎症細胞は到達できないと考えられる（Ｎｅｏｔｅ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９３）。赤血球は炎症過程の調節においてＤＡＲＣの存在を用いて役割を果たし得る。

【0485】

サイトカインなどの炎症シグナル伝達分子は、高濃度で存在するとき、局所的及び全身的な組織損傷を引き起こし得る。サイトカインのバーストは、細菌性敗血症、関節リウマチ、及び他の幾つかの炎症性疾患の病因に結び付けられている。天然サイトカイン受容体又は合成抗体様受容体模倣体を外因的に発現する機能性赤血球系細胞は、炎症性サイトカインを隔絶することができる。例示的ケモカイン受容体はＤＡＲＣである。本明細書には、限定はされないがＤＡＲＣを含めた、サイトカイン受容体又はケモカイン受容体であるレシーバーを含む機能性赤血球系細胞が提供される。例えば、ＤＡＲＣレシーバーを発現する（それにより天然赤血球上に存在する量を増加させる）機能性赤血球系細胞を使用して、循環中及び／又は体の末梢組織内のケモカインレベルをモジュレートし得る。ＤＡＲＣレシーバーを含む機能性赤血球系細胞は、破壊を特徴とし得るか、或いは炎症性メディエーターを緩徐に放出して循環中に、但し低い拡散濃度で戻し得る。ケモカイン又はサイトカイン受容体を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞は、シグナル伝達ペプチドのリザーバとして機能し得る。

【0486】

一実施形態において、レシーバーは、抗体に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、抗体に由来するアミノ酸配列をコードする外因性遺伝子を発現する。抗体レシーバーは完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。抗体は融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、抗体タンパク質は赤血球系細胞内又はその上に負荷される。一部の実施形態において、負荷された抗体はさらに機能化されるか、又は他の方法で修飾される。抗体レシーバーは細胞内又は細胞外に局在し得る。一実施形態において、レシーバーは、所望の標的に特異的な抗体アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗体はｓｃＦｖである。他の実施形態において、抗体はナノボディである。

【0487】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、標的に特異的な抗体又はその断片を含み且つ細胞表面上に位置するレシーバーを含む。例えば、ボツリヌス毒素結合に特異的な抗体の可変断片（Ｆｖ）が、赤血球系細胞の表面上で発現する。ボツリヌス毒素結合抗体は当該技術分野において公知であり（Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，Ｉｎｆ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７）、抗体のＦｖ部分の発現も同様に公知である（Ｈｏｅｄｅｍａｅｋｅｒ，Ｊｏｕｒｎ ｏｆ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７）。結合すると、毒素はＦｖ領域を介して赤血球系細胞に保持され、隔絶され、体からのクリアランスのため循環系を通じて肝臓へとシャトルされる。

【0488】

一実施形態において、レシーバーは、ｓｃＦｖ抗体に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ｓｃＦｖ抗体に由来するアミノ酸配列をコードする外因性遺伝子を発現する。ｓｃＦｖ抗体レシーバーは完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。ｓｃＦｖ抗体は融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、ｓｃＦｖタンパク質は赤血球系細胞内又はその上に負荷される。機能性赤血球系細胞によって発現され得る好適なｓｃＦｖレシーバーポリペプチドとしては、限定はされないが、表７に掲載されるものが挙げられる。

【0489】

ｓｃＦｖ抗体は、主にハイブリドーマ、免疫化マウス由来の脾臓細胞、及びヒト由来Ｂリンパ球から構築されている。抗体の可変領域は、Ｖ（Ｈ）及びＶ（Ｌ）ドメインの可変ドメインの非共有結合性ヘテロ二量体によって形成され、これが次には組換えｓｃＦｖ抗体の構築に用いられ得る。

【0490】

ｓｃＦｖの作製は当該技術分野において公知であり、ｍＲＮＡを初めにハイブリドーマから（又は脾臓、リンパ球、及び骨髄からも）単離し、続いて抗体遺伝子増幅（ＰＣＲ）の鋳型として機能するようにｃＤＮＡに逆転写する必要がある。この方法によれば、抗体由来のｓｃＦｖの多様な集合（ｓｃＦｖがモデル化された元の抗体と同等の集合）を有する大規模ライブラリを作成することができる。

【0491】

ｓｃＦｖレシーバーは、限定はされないが表５にあるものを含め、任意の標的分子に特異的となるようにされ得る。

【0492】

一例において、機能性赤血球系細胞上で炭疽毒素に特異的なｓｃＦｖレシーバーを発現させてもよい。それを必要としている対象に投与すると、炭疽毒素に特異的なレシーバー分子を含む赤血球系細胞の集団の有効用量を使用して炭疽毒素を捕捉し、隔絶することができる。赤血球系細胞は肝臓に遊走し、そこでクリアランスが起こる。

【0493】

特定の実施形態において、赤血球は、細胞の表面上で発現するラクダ科動物由来のナノボディを含むレシーバーを含む。ナノボディは通常１２～１５ｋＤａである。ナノボディは抗体及びｓｃＦｖと比べてかなり小さい。従ってナノボディはトランスフェクトし易く、ナノボディレシーバーは発現、翻訳及び／又は赤血球系細胞の細胞表面への輸送がより容易なものとなり得る。特定の実施形態では、ナノボディレシーバーを用いることにより、特定のレシーバーによって引き起こされる免疫原性効果が最小限に抑えられる。ナノボディは、そのサイズの小ささから、潜在的な免疫原性の低下をもたらし得る。特定の実施形態において、レシーバーナノボディは、それが機能性赤血球系細胞の原形質膜の機械的及び形態学的挙動の変化を抑えることが理由で用いられる。これにより、機能性赤血球系細胞が通常の循環赤血球の挙動を呈することが可能となり得る。特定の実施形態において、レシーバーナノボディは、それが標準的な抗体と比較して隠れた又はまれなエピトープを認識する高い能力を有することが理由で用いられる。例えば、レシーバーナノボディは、標的の小さい酵素空洞に結合し、標的の分子挙動をモジュレートすることができる。

【0494】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ヒト補体系の分子の標的エピトープに対して特異性を有するレシーバーナノボディを含む。かかる機能性赤血球系細胞は、それを必要としている対象に投与されると、補体系の１つ以上の過活性因子を選択的に枯渇させ得る。例えば、Ｃ５は、対象への細胞の投与時に、Ｃ５の標的エピトープに対して特異性を有するレシーバーナノボディを含む赤血球系細胞によって標的化され、赤血球系細胞によってその系から除去され得る。この手法は、例えば発作性夜間ヘモグロビン尿症などの補体障害に対して治療効果をもたらすのに好適である。特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、限定はされないが、表５に掲載されるものを含めた、分子の標的エピトープに対して特異性を有するレシーバーナノボディを含む。

【0495】

一部の実施形態において、レシーバーは、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ（スクラーゼ）又はヒドロラーゼ（ＤＮアーゼ、リパーゼ）のうちの１つに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ（スクラーゼ）又はヒドロラーゼ（ＤＮアーゼ、リパーゼ）のうちの１つに由来するアミノ酸配列をコードする外因性遺伝子を発現する。レシーバープロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ及びヒドロラーゼは完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。レシーバープロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ及びヒドロラーゼは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、レシーバープロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼは赤血球系細胞内又はその上に負荷される。一部の実施形態において、負荷されたレシーバープロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼはさらに機能化されるか、又は他の方法で修飾される。レシーバープロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼレシーバー分子は細胞内又は細胞外に局在し得る。

【0496】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼを含むレシーバーを含む。プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼレシーバーを含む機能性赤血球系細胞は、例えば肝臓のマクロファージによる循環クリアランスとは無関係に赤血球系細胞上の標的を分解する能力を有する。特定の実施形態において、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、リアーゼ又はヒドロラーゼを含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞がそれを必要としている対象に投与されると、癌細胞成長に必須の代謝産物の選択的な分解によって癌が治療され得る。例えば、アスパラギナーゼを使用して局所アスパラギンレベルを低下させることにより、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄性白血病が治療される。好適なレシーバーには、例えば、標的分子の分解能を有する２つの主要な酵素クラス、リアーゼ及びヒドロラーゼの一方又は両方が含まれ得る。特定の実施形態において、限定はされないが表７に掲載されるものを含めた分子を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞が提供される。

【0497】

特定の実施形態において、赤血球は、リアーゼを含むレシーバーを含む。一実施形態において、リアーゼはバリンデカルボキシラーゼである。バリンデカルボキシラーゼレシーバーは赤血球系細胞の細胞内空間の中で発現し得る。バリンデカルボキシラーゼレシーバーを含む機能性赤血球系細胞がそれを必要としている対象に投与されると、血中のバリンレベルがモジュレートされ得る。バリンデカルボキシラーゼレシーバーを含む赤血球系細胞は、血中のアミノ酸バリンレベルが増加する遺伝性障害であるバリン血症の治療に好適である。罹患者は、典型的には嘔吐、成長障害、知的障害、及び疲労を発症する。バリン血症はバリントランスアミナーゼ酵素の欠損によって引き起こされ、常染色体劣性遺伝パターンを有する。

【0498】

特定の実施形態において、赤血球は、ヒドロラーゼを含むレシーバーを含む。一実施形態において、ヒドロラーゼはデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮアーゼＩ）である。ＤＮアーゼＩレシーバーは赤血球系細胞の表面上で発現し得る。ＤＮアーゼＩレシーバーを含む機能性赤血球系細胞がそれを必要としている対象に投与されると、ピリミジンヌクレオチドに隣接するリン酸ジエステル結合で循環ＤＮＡが優先的に切断され、３’位に遊離ヒドロキシル基を有する５’－リン酸末端ポリヌクレオチドが生じる。平均してテトラヌクレオチドが産生される。ＤＮアーゼＩレシーバーを含む赤血球系細胞は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの、循環中の高レベルの免疫原性ＤＮＡによって増悪する病態の治療に好適である。

【0499】

特定の実施形態では、レシーバーは、例えばリガンドとの結合時又は刺激との接触時に外部刺激に応答する能力を有し、ここで応答は、例えば、移動、再折り畳み、コンホメーションの変化、二量体の形成、ホモ二量体の形成、ヘテロ二量体の形成、多量体の形成、シグナル伝達、検出可能な形態のエネルギー（例えば蛍光）の放出、別のレシーバーとの機能的相互作用、又は非レシーバーポリペプチドとの機能的相互作用を伴う。

【0500】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ｉ）レシーバーとは異なる標的細胞、及び／又はｉｉ）レシーバーとは無関係に機能する標的細胞（ここでレシーバーは標的との相互作用能を有する）と合成膜－レシーバー複合体との融合を促進する能力を有する融合分子を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、シンシチン－１を含むレシーバーを含まない。

【0501】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、例えば光子又は消光性化合物によって活性化され得る化合物などの感光性合成化合物を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、検出可能な反応を生じる能力を有する活性化可能分子検出剤を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は診断用化合物を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はウイルス又は細菌を含まない。

【0502】

レシーバー接触
特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体内で発現する。ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されてもよく、又は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体内にあってもよい。

【0503】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体とコンジュゲートされる。ポリペプチドレシーバーは、通常、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面にコンジュゲートされる。コンジュゲーションは、当該技術分野において公知の方法及び本明細書に記載される方法によって化学的又は酵素的に実現し得る。非ポリペプチドレシーバーもまた合成膜－レシーバー複合体にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態において、レシーバーは合成膜－レシーバー複合体にコンジュゲートされない。

【0504】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体中に負荷される。非ポリペプチドレシーバーもまた合成膜－レシーバー複合体内に負荷され得る。一部の実施形態において、レシーバーは合成膜－レシーバー複合体内又はその上に負荷されない。

【0505】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、任意選択で外因性核酸から発現するレシーバー、複合体にコンジュゲートされるレシーバー、複合体内又はその上に負荷されるレシーバー、及びそれらの任意の組み合わせのレシーバーを含む。任意選択で、合成膜－レシーバー複合体は治療剤又は他のペイロードを含む。

【0506】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、好適な単離細胞、例えば、赤血球系細胞、網赤血球、赤血球系細胞前駆体、血小板、又は血小板前駆体を、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることによって作成される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドはＤＮＡによってコードされ、ＤＮＡは有核赤血球系前駆細胞又は有核血小板前駆細胞に接触する。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドはＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡは血小板、有核赤血球系細胞、有核血小板前駆細胞、又は網赤血球に接触する。一部の実施形態において、レシーバーはポリペプチドであり、ポリペプチドは初代血小板、有核赤血球系細胞、有核血小板前駆細胞、網赤血球、又は赤血球に接触する。

【0507】

レシーバーポリペプチドは、電気穿孔、化学的又は重合的トランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊、又は他の方法によって赤血球系細胞に導入されたトランス遺伝子から発現し得る；電気穿孔、化学的又は重合的トランスフェクション、ウイルス形質導入、機械的膜破壊、又は他の方法によって細胞に導入されるｍＲＮＡから発現するレシーバーポリペプチド；外部因子、例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、又は分泌経路エンハンサーの導入によって天然遺伝子座から過剰発現するレシーバーポリペプチド；及び／又は産生細胞又は他の外部システムから合成され、抽出され、又は産生され、且つ赤血球系細胞に導入されるレシーバーポリペプチド。

【0508】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体内で発現する。ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されてもよく、又は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体内にあってもよい。

【0509】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、レシーバーポリペプチドを発現する細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板である。レシーバーポリペプチドは、遺伝子の単一又は複数のコピーのトランスフェクション、ウイルスによる形質導入、又はＤＮＡ又はＲＮＡの存在下での電気穿孔によって導入することができる。哺乳類細胞において外因性タンパク質を発現させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、造血細胞における外因性第ＩＸ因子の発現が、ＣＤ３４＋前駆細胞のウイルス形質導入によって誘導される。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００６，２４：１０１７を参照されたい。

【0510】

レシーバーポリペプチドを産生するためのＤＮＡ発現ベクター又はｍＲＮＡなどの核酸が、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の産生に好適な前駆細胞（例えば、赤血球系細胞前駆体又は血小板前駆体など）に導入されてもよい。前駆細胞は元の供給源から単離することができ、又は拡大した前駆細胞集団から本明細書に提供されるとおりのルーチンの組換え技術によって得ることができる。場合によっては、発現ベクターは、当該技術分野において公知の方法による相同組換え又は非相同組換えによって細胞のゲノムに組み込むことができるように設計し得る。

【0511】

場合により、例えばレシーバーポリペプチドを含む赤血球系細胞である合成膜－レシーバーポリペプチド複合体については、ゲノムを選択的に標的化して切断し得る非レシーバーポリペプチド、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又はジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸を使用して、レシーバーポリペプチドをコードする発現ベクターの外因性核酸が特定のゲノム位置、例えばＣＲ１遺伝子座（１ｑ３２．２）、ヘモグロビン遺伝子座（１１ｐ１５．４）、又は限定はされないが、表１及び表３に掲載されるものを含めた別の赤血球関連タンパク質に挿入されるように誘導する。

【0512】

場合によっては、外因性核酸は、標的遺伝子の発現をサイレンシングし又は抑制するＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子である。例えば、分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ分子、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子であってもよい。

【0513】

本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の産生に好適な前駆細胞に発現ベクターを移入させる方法としては、限定はされないが、ウイルス媒介性遺伝子移入、リポソーム媒介性移入、形質転換、遺伝子銃、トランスフェクション及び形質導入、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスなどのＤＮＡウイルスをベースとするベクター、並びにレトロウイルスベースのベクターの使用などのウイルス媒介性遺伝子移入が挙げられる。遺伝子移入方法の例には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ_４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、及び細胞マイクロインジェクションが含まれる。

【0514】

ポリペプチドレシーバーをコードする外因性核酸の移入に供される前駆細胞は、成熟除核赤血球への分化を可能にする好適な条件下、例えば本明細書に記載されるインビトロ培養プロセスで培養することができる。得られる除核赤血球は、成熟赤血球に関連するタンパク質、例えば、ヘモグロビン、グリコホリンＡ、及びレシーバーポリペプチドを示し、これらは標準方法（例えば、ウエスタンブロッティング又はＦＡＣＳ分析）によってバリデート及び定量化し得る。レシーバーを含む単離成熟除核赤血球及びレシーバーを含む血小板は、本発明の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の２つの例である。

【0515】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸を網赤血球と接触させることによって作成される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドはＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡは網赤血球に接触する。一部の実施形態において、レシーバーは、網赤血球に接触するポリペプチドである。

【0516】

合成膜－レシーバー複合体を作成するため、単離網赤血球に、レシーバーポリペプチドをコードするｍＲＮＡがトランスフェクトされてもよい。メッセンジャーＲＮＡは、レシーバーポリペプチドに対応するコード配列を含むｃＤＮＡプラスミドコンストラクトのインビトロ転写によって得られ得る。例えば、レシーバーポリペプチドに対応するｃＤＮＡ配列が、特定のＲＮＡポリメラーゼと適合するプロモーター配列を含むクローニングベクターに挿入されてもよい。例えば、クローニングベクターＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｐＢＫ－ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）は、それぞれＴ３及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと適合するＴ３及びＴ７プロモーター配列を含む。センスｍＲＮＡのインビトロ転写について、プラスミドはレシーバーポリペプチドのコード配列の終端に対応する終止コドンの下流の制限部位で線状化される。ｍＲＮＡは、例えば、ＲＮＡＭａｘｘ（登録商標）高収率転写キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）などの市販のキットを使用して線状ＤＮＡ鋳型から転写される。場合によっては、５’－ｍ７ＧｐｐｐＧ－キャッピング型ｍＲＮＡを作成することが望ましいこともある。従って、線状化ｃＤＮＡ鋳型の転写は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．、ＵＳＡ）からのｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ高収率転写キットを使用して実施し得る。転写は２０～１００μｌの反応容積において３７℃で３０分間～４時間実施し得る。転写されたｍＲＮＡはＤＮアーゼＩで短時間処理することにより反応混合物から精製して線状ＤＮＡ鋳型を除去した後、続いて塩化リチウム、酢酸ナトリウム又は酢酸アンモニウムの存在下で７０％エタノール沈殿を行う。転写されたｍＲＮＡの完全性は、アガロース－ホルムアルデヒドゲル又は市販のＮｏｖｅｘプレキャストＴＢＥゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）による電気泳動法を用いて評価し得る。

【0517】

レシーバーポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡは、例えばリポフェクション及び電気穿孔を含めた種々の手法を用いて網赤血球に導入し得る（ｖａｎ Ｔａｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：４９－５６（２００１））。リポフェクションに関しては、例えば、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中の５μｇのインビトロ転写ｍＲＮＡをカチオン性脂質ＤＭＲＩＥ－Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：４比で５～１５分間インキュベートする。或いは、例えば、ＤＯＴＡＰ、様々な形態のポリエチレンイミン、及びポリＬ－リジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）、及びＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ；例えば、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：３８８２－３８９１（２００１）を参照）を含めた種々の他のカチオン性脂質又はカチオン性ポリマーを使用して細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトし得る。得られるｍＲＮＡ／脂質複合体は細胞（１～２×１０^６細胞／ｍｌ）と共に３７℃で２時間インキュベートし、洗浄し、培養に戻す。電気穿孔に関しては、例えば、５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）中の約５～２０×１０^６個の細胞を約２０μｇのインビトロ転写ｍＲＮＡと混合し、０．４ｃｍキュベットにおいて、例えばＥａｓｙｊｅｃｔ Ｐｌｕｓ装置（ＥｑｕｉＢｉｏ、Ｋｅｎｔ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して電気穿孔処理する。場合によっては、網赤血球への特定のｍＲＮＡのトランスフェクションに有用な条件を決定するため、様々な電圧、キャパシタンス及び電気穿孔処理容積を試験することが必要となり得る。一般に、細胞にｍＲＮＡを効率的にトランスフェクトするために必要な電気穿孔パラメータは、ＤＮＡの電気穿孔に必要なものと比べて、細胞にとって有害性が低いように見える（ｖａｎ Ｔａｎｄｅｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９８：４９－５６（２００１））。

【0518】

或いは、ｍＲＮＡは、ペプチド媒介性ＲＮＡ送達戦略を用いて網赤血球にトランスフェクトしてもよい（例えば、Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：３８８２－３８９１（２００１）を参照）。例えば、カチオン性脂質ポリエチレンイミン２ｋＤＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）をメリチンペプチド（Ａｌｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）と組み合わせて、ｍＲＮＡトランスフェクションの効率を特に有糸分裂後初代細胞において増加させてもよい。メリチンペプチドは、ジスルフィド架橋剤、例えばヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネートなどを使用してＰＥＩにコンジュゲートさせ得る。インビトロ転写ｍＲＮＡをメリチン－ＰＥＩと共に５～１５分間プレインキュベートすると、ＲＮＡ／ペプチド／脂質複合体が形成される。次にこの複合体を無血清培養培地中の細胞に５％ＣＯ_２加湿環境において３７℃で２～４時間加え、次に取り出して、そのトランスフェクト細胞を引き続き培養下で成長させる。

【0519】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、好適な単離赤血球系細胞前駆体又は血小板前駆体を、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸と接触させることにより作成される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドはＤＮＡによってコードされ、ＤＮＡは有核赤血球系前駆細胞又は有核血小板前駆細胞に接触させる。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドはＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡは血小板、有核赤血球系細胞、又は有核血小板前駆細胞に接触する。

【0520】

レシーバーは、最終分化の前に、一過性の又は安定的なトランスフェクション及び遺伝子療法手法を含めた種々のＤＮＡ技法を用いて赤血球系細胞前駆体、血小板前駆体、又は有核赤血球系細胞に遺伝的に導入され得る。レシーバーポリペプチドは成熟赤血球又は血小板の表面上及び／又は細胞質内で発現し得る。

【0521】

レシーバーポリペプチドをコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトするため、ウイルス遺伝子移入を用い得る。遺伝子移入媒体として、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ １）などのレンチウイルス、及び泡沫状ウイルスなどのスプーマウイルスを含め、幾つものウイルスが用いられ得る（例えば、Ｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＨＥＰ １７８：１７７－２０２（２００７）を参照）。例えばレトロウイルスは、ヒト細胞を含め哺乳類細胞を効率的に形質導入し、染色体にインテグレートすることで、安定的な遺伝子移入をもたらす。

【0522】

レシーバーポリペプチドは、赤血球系細胞前駆体、血小板前駆体、又は有核赤血球系細胞にトランスフェクトされ、発現し、続いて成熟赤血球又は血小板に保持され及び呈示され得る。好適なベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ベクター骨格である（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９１：２６６４－２６７１（１９９８））。現在、遺伝子療法臨床試験で発癌レトロウイルスのＭＭＬＶベースのベクターが使用されている（Ｈｏｓｓｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃｉ．１７：８７－９２（２００２））。例えば、レシーバーポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡコンストラクトを、標準的な分子生物学的技術を用いてＭＭＬＶベクター骨格で作成することができる。このコンストラクトが例えばＰＡ３１７細胞などのパッケージング細胞株にトランスフェクトされ、そのウイルス上清を使用して例えばＰＧ１３細胞などの産生細胞がトランスフェクトされる。ＰＧ１３ウイルス上清は、本明細書に記載されるとおり単離及び培養されるか、又は新鮮に単離された赤血球系細胞前駆体、血小板前駆体、又は有核赤血球系細胞と共にインキュベートされる。レシーバーポリペプチドの発現は、それが合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に位置する場合には、例えばレシーバーポリペプチドに特異的な蛍光標識抗体によるＦＡＣＳ分析（蛍光活性化細胞選別）を用いてモニタし得る。同様の方法を用いて、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の内部に位置するレシーバーポリペプチドを発現させてもよい。

【0523】

任意選択で、蛍光トラッキング分子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などが、ウイルスベースの手法を用いてトランスフェクトされてもよい（Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：６７０－６７８（２００７））。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（例えば、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ）をコードするＤＮＡを含むエコトピック（Ｅｃｏｔｏｐｉｃ）レトロウイルスベクターが、例えばＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞株（Ｏｒｂｉｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から）などのパッケージング細胞を使用してパッケージされる。パッケージング細胞株は、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを含む適切なウイルスパッケージングに必要なウイルスタンパク質を安定に発現する。ウイルス粒子がシェディングされているＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ細胞からの上清を使用して、例えば、赤血球系細胞前駆体、血小板前駆体、又は有核赤血球系細胞が形質導入される。場合によっては、レトロウイルス媒介性遺伝子移入（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の効率を向上させるため、形質導入は特別にコーティングされた表面上、例えば、組換えフィブロネクチンの断片上で行われてもよい。細胞は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティングプレートにおいて、レトロウイルスＰｈｏｅｎｉｘ－Ｅｃｏ上清と、加えて好適な補因子と共にインキュベートする。翌日に形質導入を繰り返してもよい。この場合に、ＥＧＦＰ又はＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓを発現する細胞の割合は、ＦＡＣＳによって評価し得る。形質導入効率の評価に用い得る他のレポーター遺伝子としては、例えば、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及びルシフェラーゼ並びに低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、及びヒト細胞表面ＣＤ２４抗原が挙げられる（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：６０５－６１３（１９９９））。

【0524】

非ウイルスベクターを使用して好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体に遺伝物質を導入し、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を作成してもよい。非ウイルス媒介性遺伝子移入はウイルス媒介性遺伝子移入と異なり、プラスミドベクターがタンパク質を含まず、低毒性でスケールアップが容易であり、且つ宿主細胞の選好性を有しない。プラスミドベクターの「ネイキッドＤＮＡ」自体は、レシーバーポリペプチドをコードする遺伝物質を細胞に送達するのに効率が悪く、従って細胞への侵入を可能にする遺伝子送達方法と組み合わされる。幾つもの送達方法が、化学的及び物理的方法を含め、非ウイルスベクターを好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体に移入させるために用いられ得る。

【0525】

レシーバーポリペプチドをコードする非ウイルスベクターは、カチオン性脂質及びポリマーなどの合成高分子を使用して好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体に導入し得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。例えばカチオン性リポソームは、電荷相互作用によってＤＮＡと複合体を形成する。正電荷のＤＮＡ／脂質複合体は負の細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。この手法は、例えば造血細胞のトランスフェクションに用いられ得る（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９３１－９３８（１９９９）を参照）。赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体については、プラスミドＤＮＡ（２５～１００μＬの無血清培地、例えばＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）中約０．５μｇ）を市販のトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）などのカチオン性リポソーム（２５μＬの無血清培地中約４μｇ）と混合して少なくとも２０分間インキュベートさせると、複合体が形成される。このＤＮＡ／リポソーム複合体を好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体に加え、５～２４時間インキュベートさせておき、その時間が経った後、トランス遺伝子発現又はレシーバーポリペプチドをアッセイし得る。或いは、他の市販のリポソームトランスフェクション剤を用いてもよい（例えば、Ｉｎ ｖｉｖｏ ＧｅｎｅＳＨＵＴＴＬＥ（商標）、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）。

【0526】

任意選択で、赤血球系細胞前駆細胞、例えば造血系及び臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を効率的にトランスフェクトするため、カチオン性ポリマー、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などが用いられ得る（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７２５：３７７－３８４（２００５）を参照）。ヒトＣＤ３４＋細胞をヒト臍帯血から単離し、２００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子及び２０％熱失活ウシ胎仔血清を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地で培養する。レシーバーポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを０．８Ｋ～７５０Ｋの様々なサイズの分枝状又は直線状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ；Ｆｅｒｍｅｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）と共にインキュベートする。ＰＥＩは、４．２ｍｇ／ｍｌ蒸留水のストック溶液として調製し、ＨＣｌを使用してｐＨ５．０に微酸性にする。１μｇのＤＮＡが３ｎｍｏｌのリン酸を含有し、且つ１μｌのＰＥＩストック溶液が１０ｎｍｏｌのアミン窒素を含有するという計算に基づく様々な窒素／リン酸比でＤＮＡをＰＥＩと室温で３０分間合わせ得る。単離ＣＤ３４＋細胞にＤＮＡ／カチオン性複合体を播種し、２８０×ｇで５分間遠心し、レシーバーポリペプチドの遺伝子発現が評価されるまで培養培地中で４時間以上インキュベートする。

【0527】

粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、微粒子銃、又は粒子ボンバードメント技術などの物理的方法を用いてプラスミドベクターを好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体に導入し得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０）。この場合、レシーバーポリペプチドをコードするＤＮＡを金粒子上に吸着させて、粒子銃によって細胞に投与する。この手法は、例えば赤血球前駆細胞、例えば臍帯血由来の造血幹細胞のトランスフェクションに用いられ得る（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：６９２－６９９（１９９８）を参照）。従って、臍帯血を単離し、リン酸緩衝生理食塩水中に３倍希釈する。ＣＤ３４＋細胞は、二次抗体でコーティングされた磁気マイクロビーズ及び磁気分離システムと組み合わせて抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を使用して精製する（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭｉｎｉＭａｃシステム、Ａｕｂｕｒｎ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）。ＣＤ３４＋濃縮細胞は、本明細書に記載されるとおり培養し得る。トランスフェクションのため、レシーバーポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを塩化カルシウム及びスペルミジンによる処理で粒子、例えば金ビーズ上に沈着させる。ＤＮＡコーティングビーズをエタノールで洗浄した後、例えばＢｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ－１０００／Ｈｅシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用してビーズを培養細胞に送達し得る。レポーター遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、又は緑色蛍光タンパク質などを使用してトランスフェクションの効率を評価し得る。

【0528】

任意選択で、電気穿孔方法を用いてプラスミドベクターを好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体に導入してもよい。電気穿孔は細胞膜に一過性の細孔を作り出し、例えばＤＮＡ及びＲＮＡを含む細胞並びに抗体及び薬物への様々な分子の導入を可能にする。従って、ＣＤ３４＋細胞を単離し、本明細書に記載されるとおり培養する。電気穿孔の直前、２５０×ｇ、室温で１０分間遠心して細胞を単離し、電気穿孔緩衝液、例えば、１．０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充したＸ－ＶＩＶＯ １０などの中に０．２～１０×１０^６生細胞／ｍｌで再懸濁する。適切な電気穿孔キュベットに５００μｌの細胞懸濁液と共にプラスミドＤＮＡ（１～５０μｇ）を加える。電気穿孔は、例えばＥＣＭ ６００エレクトロポレーター（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して、２００Ｖ～２８０Ｖの電圧範囲及び２５～７０ミリ秒の範囲のパルス長で行い得る。幾つもの代替的な電気穿孔機器が市販されており、この目的に用いることができる（例えば、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．；Ｃｅｌｌｊｅｃｔ Ｄｕｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）。或いは、以下のパラメータを使用して単離ＣＤ３４＋細胞の効率的な電気穿孔を実施し得る：４ｍｍキュベット、１６００μＦ、５５０Ｖ／ｃｍ、及び１×１０^５細胞／ｍｌの細胞５００μｌ当たり１０μｇのＤＮＡ（Ｏｌｄａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ ４９：６２５－６３２（２００２））。

【0529】

電気穿孔の一形態であるヌクレオフェクションもまた、好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体のトランスフェクションに用い得る。この場合、トランスフェクションは、ＤＮＡ（又は他の試薬）を核に直接輸送することを可能にし、ひいては細胞質で分解される可能性があるリスクを低減する細胞型特異的な溶液で電気的パラメータを使用して実施される。例えば、ヒトＣＤ３４ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット（ａｍａｘａ ｉｎｃ．から）が、好適な赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体のトランスフェクションに用いられ得る。この場合、ヒトＣＤ３４ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液中の１～５×１０^６個の細胞を１～５μｇのＤＮＡと混合し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）機器において、製造者が決定するとおりの予めプログラムされた設定を使用してトランスフェクトする。

【0530】

赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体には、ゲノムに組み込まれない限り哺乳類細胞での自己複製物能を有しない従来の発現ベクターを非ウイルス的にトランスフェクトし得る。或いは、赤血球系細胞、血小板又はそれらの前駆体には、宿主核において染色体に組み込まれることなく自己複製遺伝単位として生き残り得るエピソームベクターをトランスフェクトしてもよい（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１１８－Ｓ１３０（２００５））。これらのベクターは、例えば、ＥＢＶ、ヒトポリオーマウイルスＢＫ、ウシパピローマウイルス－１（ＢＰＶ－１）、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）など、通常、潜伏感染時に細胞において染色体外で複製しているウイルス由来の遺伝エレメントを利用する。哺乳類人工染色体もまた非ウイルス遺伝子移入に用いることができる（Ｖａｎｄｅｒｂｙｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３３：１４７０－１４７６（２００５））。

【0531】

ポリペプチドレシーバーをコードする外因性核酸は、当該技術分野において公知の標準的な分子生物学的方法、例えば、制限消化、オーバーラップ伸長ＰＣＲ、及びギブソンアセンブリによって発現ベクターにアセンブルし得る。

【0532】

外因性核酸は、通常は細胞表面上（例えば赤血球系細胞の）で発現しないポリペプチドレシーバーをコードする遺伝子を、内因性又は天然膜タンパク質をコードする遺伝子に融合して含み、従ってレシーバーポリペプチドが細胞表面上で発現する。例えば、レシーバーポリペプチドをコードする外因性遺伝子は、１型膜タンパク質のリーダー配列に続くＮ末端、２型膜タンパク質のＣ末端、又はＧＰＩ結合型膜タンパク質のＧＰＩ結合部位の上流にクローニングすることができる。

【0533】

標準的なクローニング方法を使用して、２つの融合遺伝子の間に可動性アミノ酸リンカーを導入することができる。例えば、可動性リンカーは、完全長抗体からの一本鎖抗体断片の作成において一般的に使用される［Ｇｌｙ４Ｓｅｒ］３などのポリグリシンポリセリンリンカー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｌｏ ２００４）、又は単鎖Ａｒｃリプレッサーの作成に使用されるものなどのａｌａ－ｇｌｙ－ｓｅｒ－ｔｈｒポリペプチド（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ＆Ｓａｕｅｒ，ＰＮＡＳ １９９８）である。一部の実施形態において、可動性リンカーは、可動性リンカーを有しない均等なコンストラクトと比べてより可動性及び立体的自由度の高いレシーバーポリペプチドをもたらす。この追加的な可動性は、標的、例えば抗体若しくはタンパク質との結合、又は活性部位が基質（例えば、標的）にとって接触可能でなければならないレシーバーの酵素反応が必要な適用において有用である。

【0534】

２つの融合遺伝子の間には、エピトープタグ、例えば、ＨＡエピトープタグ－アミノ酸ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４）、ＣＭｙｃタグ－アミノ酸ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号５）、又はＦｌａｇタグ－アミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号６）をコードする核酸配列が置かれてもよい。エピトープタグを用いることにより、エピトープタグに対する抗体を使用したフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、又は免疫沈降による発現の検出及び定量化が容易になり得る。

【0535】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチドはレシーバーポリペプチドと少なくとも１つの他の異種ポリペプチドとを含む。第２のポリペプチドは蛍光タンパク質であってもよい。蛍光タンパク質は、形質導入効率を評価するためのレポーターとして使用することができる。一部の実施形態において、蛍光タンパク質は、両方が同じ転写物から作られる場合にレシーバーポリペプチドの発現レベルを評価するためのレポーターとして使用される。一部の実施形態において、この少なくとも１つの他のポリペプチドは異種であり、例えば、複数の抗原、複数の捕捉標的、酵素カスケードなどの機能を提供する。一実施形態において、組換え核酸は、レシーバー及び第２の遺伝子をコードする遺伝子を含み、ここで第２の遺伝子は、翻訳後に切断されて２つの成熟タンパク質となるウイルス由来のＴ２Ａ配列（ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号７））によって、レシーバーをコードする遺伝子と分けられる。

【0536】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは補体受容体１（ＣＲ－１）である。補体受容体１の遺伝子配列は、ＰＣＲを用いて増幅される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸は、Ｋｅｌｌの配列の３’末端に融合したＢ型肝炎抗原に対するｓｃＦｖの遺伝子配列を含み、ＰＣＲを用いて増幅される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸は、後ろにＫｅｌｌの配列の３’末端が続く、ポリグリシン／セリンリンカーに融合したＢ型肝炎抗原に対するｓｃＦｖの遺伝子配列を含み、ＰＣＲを用いて増幅される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸は、以下のうちの１つ、又はそれらの組み合わせであってもよいエピトープタグ配列に融合したＢ型肝炎抗原に対するｓｃＦｖの遺伝子配列の３’末端を含む；ＨＡタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、Ｍｙｃタグ、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＦＬＡＧタグ、Ｖ５タグ、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、Ｅタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ－１、Ｓｏｆｔａｇ－３、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、イソペプタグ（Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ）、ＳｐｙＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質、Ｎｕｓタグ、Ｆｃタグ、又はＴｙタグ。コンストラクト全体は、Ｋｅｌｌの配列の３’末端に融合し、次にＰＣＲを用いて増幅される。様々なレシーバーポリペプチドをコードする外因性遺伝子コンストラクトは、例えば、続いてレンチウイルスベクターに負荷され、ＣＤ３４＋細胞集団の形質導入に用いられる。

【0537】

一実施形態では、アデノシンデアミナーゼレシーバーを含む遺伝子がｐＳＰ６４ベクターに置かれる。このベクターは線状化され、レシーバーポリペプチドをコードするｍＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼによって生成される。一実施形態では、１０、１００、１，０００、１０，０００ＴＵ／ｍｌのｍＲＮＡがＧｌｕＮ１レシーバーの表面発現をコードして合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が作成されるように、Ｉｎｇｅｎｉｏ電気穿孔キットを使用して好中球の集団を電気穿孔処理する。一実施形態では、血小板細胞の集団をＴｒａｎｓ－ＩＴ ｍＲＮＡ及びチミジンホスホリラーゼタンパク質レシーバーをコードする１０、１００、又は１０００ＴＵ／ｍｌ（形質導入単位／ｍｌ）のｍＲＮＡと共にインキュベートして、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を作成する。一実施形態では、赤血球系細胞の集団を、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸を含むレンチウイルスベクター（その具体的なプラスミドとしては以下が挙げられる；ｐＬＫＯ．１ ｐｕｒｏ、ＰＬＫＯ．１－ＴＲＣクローニングベクター、ｐＳｉｃｏ、ＦＵＧＷ、ｐＬＶＴＨＭ、ｐＬＪＭ１、ｐＬｉｏｎＩＩ、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＩ－ＶＳＶＧ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．２ ｄｖｐｒ、ｐｓＰＡＸ２、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、及びｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ）と共にインキュベートして、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を作成する。ベクターは、１０、１００、１，０００、１０，０００ｐｆｕで投与し、１２時間インキュベートし得る。

【0538】

一実施形態では、赤血球系細胞の集団をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及びオキサラーゼレシーバーをコードする１０、１００、又は１０００ＴＵ／ｍｌ（形質導入単位／ｍｌ）のＤＮＡと共にインキュベートする。

【0539】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体にコンジュゲートされる。ポリペプチドレシーバーは、通常、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面にコンジュゲートされる。コンジュゲーションは化学的又は酵素的に実現し得る。非ポリペプチドレシーバーもまた合成膜－レシーバー複合体にコンジュゲートされ得る。

【0540】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、化学的にコンジュゲートされたレシーバーを含む。レシーバーの化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用を伴い及び／又は伴わず、レシーバーを別の分子と共有結合させることによって達成し得る。かかるコンジュゲーションの形成は当業者の技術の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための様々な技法が公知であり、特定の技法の選択については、コンジュゲートする材料が指針となる。ポリペプチド（Ｃ末端又はＮ末端）に対して、イオン性側鎖を含み（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、ヒスチジン、又はチロシン）、且つポリペプチド配列の活性部分に含まれないアミノ酸を付加すると、そのプロトン化されていない状態では、ポリマー、例えばホモ又はヘテロ二官能性ＰＥＧに結合した反応基との様々なバイオコンジュゲーション反応に関与する強力な求核剤として役立つ（例えば、Ｌｕｔｏｌｆ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００３；４：７１３－２２，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ；１９９６）。レシーバーコンジュゲーションは、ポリペプチド、例えば、ペプチドリガンド、抗体、抗体断片、又はアプタマーに限定されず、非ポリペプチドレシーバー、例えば、脂質、炭水化物、核酸、及び小分子にも適用可能である。

【0541】

ある実施形態において、レシーバーは、ビオチン－ストレプトアビジン架橋を介して合成膜－レシーバー複合体の表面に結合し得る。例えば、ビオチン化抗体レシーバーが、ストレプトアビジン架橋を介して合成膜－レシーバー複合体の非特異的にビオチン化された表面に連結されてもよい。抗体は、幾つかの化学的手段によってビオチンにコンジュゲートすることができる（例えば、Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：１３５－１５４（２００４）を参照）。合成膜－レシーバー複合体の任意の表面膜タンパク質を、アミン反応性ビオチン化試薬、例えば、ＥＺ－Ｌｉｎｋスルホ－ＮＨＳ－ＳＳ－ビオチン（スルホスクシンイミジル２－（ビオチンアミド）－エチル－１，３－ジチオプロピオネート；Ｐｉｅｒｃｅ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ；例えば、Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：４７－５１（２００３）を参照）を使用してビオチン化し得る。例えば、単離赤血球系細胞をリン酸緩衝生理食塩水中の１ｍｇ／ｍｌのスルホ－ＮＨＳ－ＳＳ溶液において４℃で３０分間インキュベートし得る。細胞をトリス緩衝生理食塩水で洗浄することにより過剰のビオチン試薬を除去する。次にストレプトアビジンの存在下でビオチン化細胞をビオチン化抗体レシーバーと反応させると、合成膜－レシーバー複合体が形成される。

【0542】

別の実施形態では、レシーバーが二重特異性抗体を有する例えば赤血球系細胞又は血小板の表面に結合して、合成膜－レシーバー複合体を作成し得る。例えば、この二重特異性抗体は、赤血球系細胞又は血小板及びレシーバーに特異性を有し得る。

【0543】

別の実施形態では、レシーバーが共有結合によって例えば赤血球系細胞又は血小板に結合して、合成膜－レシーバー複合体を作成する。例えば、レシーバーを誘導体化し、求電子基を含有するカップリング化合物を使用して、その求電子基が赤血球系細胞又は血小板上の求核剤と反応して相互に結合した関係を形成することで、赤血球系細胞又は血小板に結合させてもよい。これらの求電子基の代表的なものは、α，β不飽和カルボニル、ハロゲン化アルキル及び置換マレイミドなどのチオール試薬である。加えて、カップリング化合物は、アミノ基、カルボキシル基及びトリオシン（ｔｒｙｏｓｉｎｅ）基などの、ポリペプチド中の官能基の１つ以上を介してレシーバーポリペプチドとカップリングすることができる。そのためには、カップリング化合物が、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基、芳香族アミノ基、及び酵素官能基との反応能を有する他の基を含有しなければならない。高電荷レシーバーもまた調製することができ、これが静電結合を介して例えば赤血球系細胞又は血小板に固定化されて、合成膜－レシーバー複合体が作成される。これらの誘導体の例には、ポリリシル及びポリグルタミル酵素が含まれ得る。

【0544】

誘導体に具体化する反応基の選択は、固定化のための求電子剤と赤血球系細胞又は血小板上の求核基とのカップリングに用いられる反応条件に依存する。制御の要点は、赤血球系細胞又は血小板に結合することによって固定化されるレシーバーのカップリング前にカップリング剤が不活性化することのないようにしたいという要求である。かかるカップリング固定化反応は、幾つもの方法で進めることができる。典型的には、カップリング剤を使用してレシーバーと赤血球系細胞又は血小板との間に架橋が形成され得る。この場合、カップリング剤は、レシーバーとの反応を生じさせることのできるカルボキシル基などの官能基を有しなければならない。コンジュゲーション用のレシーバーを調製する１つの方法は、カップリング剤中のカルボキシル基を利用して、レシーバーと反応する混合無水物を形成することを含み、ここでは混合無水物の形成能を有するアクチベーターが使用される。かかるアクチベーターの代表的なものはクロロギ酸イソブチル又はその他の、５，５’－（ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｐ－クロロメルクリベンゾエート（ＣＭＢ）、又はｍ－マレイミド安息香酸（ＭＢＡ）などのカップリング剤との混合無水物をもたらすクロロホルメートである。カップリング剤の混合無水物がレシーバーと反応すると反応性誘導体が得られ、次にはそれが赤血球系細胞又は血小板上の求核基と反応することでレシーバーが固定化され得る。

【0545】

レシーバーポリペプチド上の官能基、例えばカルボキシル基は、カルボジイミド及び同様のアクチベーターで活性化させることができる。続いて、架橋試薬上の官能基、例えばアミノ基が、レシーバーポリペプチド上の活性化された基と反応して反応性誘導体を形成することになる。加えて、カップリング剤が第２の反応基を有しなければならず、これが赤血球系細胞又は血小板上の適切な求核基と反応して架橋を形成することになる。かかる反応基の典型的なものは、アルキル化剤、例えばヨード酢酸、α，β不飽和カルボニル化合物、例えばアクリル酸など、チオール試薬、例えば水銀剤、置換マレイミドなどである。

【0546】

或いは、レシーバー上の官能基は、架橋形成化合物の必要性をなくすため、例えば赤血球系細胞又は血小板上の求核剤と直接反応するように活性化させることができる。このために、混合無水物と区別されるものとして、レシーバーにおけるカルボキシル基がエノールエステルとなる形成をもたらすアクチベーター、例えばウッドワード試薬Ｋなどの試薬が使用される。続いてレシーバーのエノールエステル誘導体が例えば赤血球系細胞又は血小板上の求核基と反応してレシーバーの固定化が生じ、それにより合成膜－レシーバー複合体が作り出される。

【0547】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、赤血球系細胞をレシーバー及び任意選択でペイロードと接触させることにより作成され、ここで接触は、バンド３（ＣＤ２３３）、アクアポリン－１、Ｇｌｕｔ－１、キッド抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｌｉ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｌｉ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコホリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、ケル（ＣＤ２３８）、ダッフィ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ－４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ－ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロテリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）、ドンブロック、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、シアンナ（Ｓｃｉａｎｎａ）、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ－１（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９、又はＨ抗原（ＣＤ１７３）を含む結合部位を使用してレシーバーを赤血球系細胞にコンジュゲートすることは含まない。

【0548】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、酵素的にコンジュゲートされるレシーバーを含む。

【0549】

具体的な実施形態では、限定はされないが、表９に掲載されるものを含めた様々な化学的及び酵素的手段によってレシーバーを例えば赤血球系細胞又は血小板の表面にコンジュゲートして、合成膜－レシーバー複合体を作成することができる。これらの方法には、二官能性架橋剤、例えばＮＨＳエステル－マレイミドヘテロ二官能性クロスリンカーなどで第一級アミン基を還元型チオール基に結合させる化学的コンジュゲーションが含まれる。これらの方法にはまた、例えば、アクセプター配列ＬＰＸＴＧ又はＬＰＸＴＡを含む１つのポリペプチドを、Ｎ末端ドナー配列ＧＧＧを含むポリペプチドに結合させるソルターゼ酵素によって媒介されるトランスペプチダーゼ反応など、酵素的戦略も含まれる。例えば、Ｓｗｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３を参照されたい。こうした方法にはまた、例えば、それぞれ抗原及び細胞上のクリックケミストリーハンドル（アジド及びアルキン）のソルターゼ媒介性コンジュゲーションと、続く抗原を細胞に化学的に結合する環化付加反応など、組み合わされた方法も含まれる。例えば、Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１３を参照されたい。

【0550】

必要であれば、触媒的結合形成ポリペプチドドメインは、例えば赤血球系細胞又は血小板上又はその中において、細胞内で、或いは細胞外で発現させることができる。多くの触媒的結合形成ポリペプチドが存在し、トランスペプチダーゼ、ソルターゼ、及びイソペプチダーゼ、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から分離されたタンパク質であるＳｐｙ０１２８に由来するものが挙げられる。

【0551】

Ｓｐｙ０１２８の自己触媒的イソペプチド結合形成サブユニット（ＣｎａＢ２ドメイン）を分割すると、互いに対して特異性を有する触媒活性を保持した２つの個別的なポリペプチドが生じることが実証されている。このシステムのポリペプチドは、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと称される。混合すると、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒはＳｐｙＴａｇ上のＡｓｐ１１７とＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ上のＬｙｓ３１との間でイソペプチド結合形成を起こす（Ｚａｋｅｒｉ ａｎｄ Ｈｏｗａｒｔｈ，ＪＡＣＳ ２０１０，１３２：４５２６）。この反応は細胞環境と適合性があり、タンパク質／ペプチドコンジュゲーションに高度に特異的である（Ｚａｋｅｒｉ，Ｂ．；Ｆｉｅｒｅｒ，Ｊ．Ｏ．；Ｃｅｌｉｋ，Ｅ．；Ｃｈｉｔｔｏｃｋ，Ｅ．Ｃ．；Ｓｃｈｗａｒｚ－Ｌｉｎｅｋ，Ｕ．；Ｍｏｙ，Ｖ．Ｔ．；Ｈｏｗａｒｔｈ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１２，１０９，Ｅ６９０－Ｅ６９７）。ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは、エラスチン様タンパク質における翻訳後のトポロジー修飾を誘導することが示されている。例えば、ＳｐｙＴａｇをＮ末端に置き、及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをＣ末端に置くと、環状エラスチン様タンパク質の形成が誘導される（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１３）。

【0552】

構成要素ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒは交換することができ、従って分子ＡがＳｐｙＴａｇに融合して且つ分子ＢがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合するシステムは、分子ＡがＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合して且つ分子ＢがＳｐｙＴａｇに融合するシステムと機能的に均等である。本明細書の目的上、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒが使用されるとき、その相補的分子を代わりに置き換え得ることが理解されるべきである。

【0553】

ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムなどの触媒的結合形成ポリペプチドを使用してレシーバーを例えば赤血球系細胞の表面に結合させることにより、合成膜－レシーバー複合体を作成することができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は赤血球系細胞の細胞外表面上で発現し得る。ＳｐｙＴａｇポリペプチドは、例えば、１型又は３型膜貫通タンパク質、例えばグリコホリンＡのＮ末端に融合するか、２型膜貫通タンパク質、例えばＫｅｌｌのＣ末端に融合するか、複数回膜貫通タンパク質、例えばバンド３の細胞外末端又は細胞外ループにインフレームで挿入するか、ＧＰＩ－アクセプターポリペプチド、例えばＣＤ５５又はＣＤ５９に融合するか、脂質鎖アンカー型ポリペプチドに融合するか、又は末梢膜タンパク質に融合することができる。ＳｐｙＴａｇ融合物をコードする核酸配列は、合成膜－レシーバー複合体内で発現することができる。レシーバーポリペプチドはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現するのと同じ赤血球系細胞で発現し、分泌され得る。或いは、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列は、例えば、細菌、真菌、昆虫、哺乳類、又は無細胞産生システムで外因的に産生されてもよい。ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると共有結合が形成され、それによってレシーバーが赤血球系細胞の表面に結合することで合成膜－レシーバー複合体が形成される。このレシーバーポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートされたレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一例である。

【0554】

一実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドが赤血球系細胞においてＧａｔａ１プロモーターの制御下でグリコホリンＡのＮ末端に対する融合物として発現し得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合したレシーバーポリペプチド、例えば補体受容体１及び表７に掲載されるレシーバーが、同じ赤血球系細胞においてＧａｔａ１プロモーターの制御下で発現し得る。両方の融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド間にイソペプチド結合が形成されて、赤血球系細胞表面とレシーバーポリペプチドとの間に共有結合が形成される。このレシーバーポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートされたレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一例である。

【0555】

別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドが赤血球系細胞においてＧａｔａ１プロモーター制御下でグリコホリンＡのＮ末端に対する融合物として発現し得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド配列に融合したレシーバーポリペプチド、例えば補体受容体１が、好適な哺乳類細胞発現系、例えばＨＥＫ２９３細胞で発現し得る。赤血球系細胞上でＳｐｙＴａｇ融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合ポリペプチドが細胞と接触し得る。好適な反応条件下では、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド間にイソペプチド結合が形成されて、赤血球系細胞表面とレシーバーポリペプチドとの間に共有結合が形成される。このレシーバーポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートされたレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一例である。

【0556】

ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムなどの触媒的結合形成ポリペプチドを使用して、レシーバー分子を赤血球系細胞の細胞内空間にアンカリングすることができる。ＳｐｙＴａｇポリペプチド配列は、トランス遺伝子の直接的な発現、内因性細胞内タンパク質、例えばヘモグロビンとの融合、内因性細胞表面タンパク質、例えば、バンド３、グリコホリンＡ、Ｋｅｌｌの細胞内ドメインとの融合、又は赤血球細胞骨格の構造成分との融合を含めた幾つもの方法によって赤血球系細胞の細胞内空間で発現させることができる。ＳｐｙＴａｇ配列はポリペプチド末端に限定されず、ポリペプチド翻訳及び局在化が妨害されることのないように内因性ポリペプチドの内部配列内にインテグレートされてもよい。レシーバーポリペプチドはＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合することができる。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ融合物をコードする核酸配列は、ＳｐｙＴａｇ融合物を発現するのと同じ赤血球系細胞内で発現することができる。ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが反応すると共有結合が形成され、これが赤血球系細胞の細胞内空間にレシーバーポリペプチドをアンカリングする役割を果たす。このレシーバーポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートされたレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一例である。

【0557】

一実施形態において、赤血球系細胞は、細胞内でヘモグロビンβに融合したＳｐｙＴａｇを発現し得る。赤血球系細胞は、翻訳時に細胞内βグロビンがそのＣ末端でＳｐｙＴａｇに融合するように、ヘモグロビンプロモーター、βグロビン遺伝子及びＳｐｙＴａｇ配列を含む遺伝子配列で遺伝子修飾されてもよい。加えて、赤血球系細胞は、翻訳時に細胞内ＰＡＨがそのＮ末端でＳｐｙＣａｔｃｈｅｒに融合するように、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）発現を駆動するＳｐｙＣａｔｃｈｅｒをコードするＧａｔａ１プロモーター誘導遺伝子を発現する。両方の融合タンパク質の発現により、ＳｐｙＴａｇ結合βグロビンが細胞内空間でイソペプチド結合を介してＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ結合ＰＡＨに連結され、βグロビンに対するＰＡＨのアンカリング及び成熟中の保持が可能となる。このレシーバーポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートされたレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一例である。

【0558】

別の実施形態では、ＳｐｙＴａｇポリペプチドが赤血球系細胞内でレシーバーポリペプチドに対する融合物として発現し得る。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチドが、同じ赤血球系細胞内でグリコホリンＡのＣ末端（細胞内）に対する融合物として発現し得る。両方の融合ポリペプチドが発現すると、ＳｐｙＴａｇ及びＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリペプチド間にイソペプチド結合が形成されて、膜アンカー型内因性赤血球ポリペプチドとレシーバー分子との間に共有結合が形成される。このレシーバーポリペプチド融合物を含む赤血球系細胞は、コンジュゲートされたレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の一例である。

【0559】

ポリペプチド間に他の分子融合物が形成されてもよく、直接的又は間接的なコンジュゲーションを含み得る。ポリペプチドは互いに直接コンジュゲートし得るか、又はリンカーを介して間接的にコンジュゲートし得る。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、又は核酸であってもよい。ポリマーは、例えば、天然、合成、直鎖状、又は分枝状であってもよい。レシーバーポリペプチドは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む異種融合タンパク質を含むことができ、ここで融合タンパク質は、互いに直接つながるか、又は介在するリンカー配列及び／又はさらなる配列と一端又は両端でつながるポリペプチドを含んでいる。リンカーとのコンジュゲーションは共有結合又はイオン結合によるものであってよい。

【0560】

特定の実施形態において、ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体に負荷される。非ポリペプチドレシーバーもまた合成膜－レシーバー複合体内に負荷され得る。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、例えば赤血球系細胞又は血小板に１つ以上のレシーバーを負荷し、１つ以上のレシーバーを赤血球系細胞又は血小板内にインターナライズさせることによって作成される。任意選択で、赤血球系細胞又は血小板には、例えば治療剤などのペイロードがさらに負荷され得る。

【0561】

幾つもの方法を用いて例えば赤血球系細胞又は血小板にレシーバー及び任意選択でペイロード（例えば治療剤）を負荷することができる。好適な方法としては、例えば、低張溶解、低張透析、浸透、浸透圧パルス印加、浸透圧ショック、イオン泳動、電気穿孔、音波処理、マイクロインジェクション、カルシウム沈殿、膜インターカレーション、脂質媒介性トランスフェクション、デタージェント処理、ウイルス感染、拡散、受容体媒介性エンドサイトーシス、タンパク質形質導入ドメインの使用、粒子射撃、膜融合、凍結融解、機械的破壊、及びろ過が挙げられる。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成に、いずれか１つのかかる方法又はそれらの組み合わせを用い得る。

【0562】

低張溶解については、例えば、赤血球系細胞を低イオン強度緩衝液に曝露し、それにより赤血球系細胞を破裂させる。レシーバー又はペイロード（例えば治療剤）は細胞内に分布する。赤血球系細胞、特に赤血球は、単離赤血球のペレットに３０～５０倍容積過剰の５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）を加えると、低張で溶解し得る。得られる溶解した細胞膜を遠心によって単離する。溶解赤血球膜のペレットを再懸濁し、低イオン強度緩衝液中、レシーバー及び／又は治療剤の存在下で例えば３０分間インキュベートする。或いは、溶解赤血球膜は、赤血球系細胞を効率的に負荷すると決定される最良の条件に応じて僅か１分程度の間だけ又は数日にも及ぶ間にわたりレシーバー又はペイロード（例えば治療剤）と共にインキュベートしてもよい。

【0563】

或いは、赤血球系細胞、特に赤血球には、低張液に対する制御された透析を用いて細胞を膨潤させ、細胞膜に細孔を作り出すことにより、レシーバー及び任意選択でペイロード（例えば治療剤）を負荷し得る（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号明細書；同第５，７５３，２２１号明細書；及び同第６，４９５，３５１号明細書を参照）。例えば、単離赤血球のペレットを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、ｐＨ７．４に再懸濁し、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、２０ｍＭグルコース、及び４ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有するｐＨ７．４の低イオン強度緩衝液に対して透析する。３０～６０分後、赤血球をさらに、レシーバー又はペイロード（例えば治療剤）を含有する１６ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４溶液に対してさらに３０～６０分間透析する。これらの手順は全て、有利には、４℃の温度で実施され得る。場合によっては、透析手法によって多量の赤血球系細胞、特に赤血球に治療剤を負荷することが有益となることもあり、この目的で設計された特殊な器具を用い得る（例えば、米国特許第４，３２７，７１０号明細書、同第６，１３９，８３６号明細書及び同第６，４９５，３５１ Ｂ２号明細書を参照）。

【0564】

負荷した赤血球系細胞、特に赤血球は、例えば、０．９％生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、細胞培養培地、血漿又はリンパ液などの生理溶液の存在下で穏やかに加熱することによって再び密閉し得る。例えば、破壊された赤血球系細胞、特に赤血球を、例えば１００ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭ塩化ナトリウムの１５０ｍＭ塩溶液中、６０℃の温度で１～２分間処理すると、十分に密閉された膜が生じ得る。或いは、細胞は、２５～５０℃の温度で３０分間～４時間インキュベートしてもよい（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２４３１３７ Ａ１号明細書を参照）。或いは、破壊された赤血球は、５ｍＭアデニン、１００ｍＭイノシン、２ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭグルコース、１００ｍＭ ピルビン酸Ｎａ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１９４ｍＭ ＮａＣｌ、１．６Ｍ ＫＣｌ、及び３５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．４中、３７℃の温度で２０～３０分間インキュベートすることによって再び密閉し得る（例えば、米国特許第５，７５３，２２１号明細書を参照）。

【0565】

電気穿孔については、例えば、赤血球系細胞又は血小板を電界に曝露し、それにより細胞膜に一過性の穴を生じさせて、レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）が細胞内に拡散することを可能にする（例えば、米国特許第４，９３５，２２３号明細書を参照）。例えば、赤血球系細胞、特に赤血球を生理的且つ導電性の媒体、例えば無血小板血漿中に再懸濁し、そこにレシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）を加える。０．２～１．０ｍｌの範囲の容積のこの混合物を電気穿孔キュベットに入れ、氷上で１０分間冷却する。キュベットを、例えばＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ製、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）などの電気穿孔器具に置く。細胞を約２．４ミリ秒長及び約２．０ｋＶ／ｃｍの電界強度の単一パルスで電気穿孔処理する。或いは、赤血球系細胞、特に赤血球の電気穿孔は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓａｒ器具（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して、０．２５μＦで供給される２．２ｋＶの二重パルスを使用して行ってもよく、６０％を超える負荷能力を達成し得る（Ｆｌｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．８２：２２５－２２９（１９９４））。キュベットを氷浴に１０～６０分間戻し、次に３７℃の水浴に置き、細胞膜の再密閉を誘導する。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適な電気穿孔方法を用い得る。

【0566】

音波処理については、赤血球系細胞を例えば高強度音波に曝露し、それにより細胞膜の一過性の破壊を生じさせて、レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）が細胞内に拡散することを可能にする。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適な音波処理方法を用い得る。

【0567】

デタージェント処理については、例えば赤血球系細胞を中性デタージェントで処理し、それにより穴を生じさせて細胞膜を一過性に傷付けることで、それらの穴からレシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）が拡散し得る。細胞への負荷後、デタージェントは細胞から洗い落とされる。例えば、デタージェントはサポニンであってもよい。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適なデタージェント処理方法を用い得る。

【0568】

受容体媒介性エンドサイトーシスについては、例えば赤血球系細胞が表面受容体を有し、それがレシーバー又はペイロード（例えば治療剤）の結合時に受容体及び会合したレシーバー又はペイロード（例えば治療剤）のインターナリゼーションを誘導する。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適なエンドサイトーシス方法を用い得る。

【0569】

一部の実施形態において、レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）は、細胞膜を通過又は移行する能力を有するタンパク質及び／又はポリペプチドにレシーバー又はペイロードを融合させ又はコンジュゲートすることにより、例えば赤血球系細胞又は血小板に負荷され得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１５１００４ Ａ１号明細書を参照）。細胞膜を移行する能力を有するタンパク質ドメイン及び配列の例には、例えば、ＨＩＶ－１トランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）、ショウジョウバエアンテナペディアホメオドメインタンパク質、単純ヘルペス１型ウイルスＶＰ２２タンパク質、及び神経ペプチドガラニンとスズメバチ毒ペプチドマストパランとの間の融合物であるトランスポーチン由来の配列が含まれる。例えば、ペイロードがＴＡＴペプチドの全て又は一部に融合され、又はコンジュゲートされてもよい。ＴＡＴペプチドの全て又は一部を含有するレシーバー融合タンパク質及び／又はＴＡＴペプチドの全て又は一部とペイロード（例えば、抗体、酵素、又はペプチドなどの治療剤）とを含有する融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて作成し得る。或いは、ＴＡＴペプチドの全て又は一部（ＴＡＴペプチドの全て又は一部を含むレシーバーを含む）は、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基又はアミノ基など、ペイロード（例えば治療剤）に関連する官能基に化学的にカップリングしてもよい。場合によっては、ＴＡＴペプチドとペイロードとの間の連結はｐＨ感受性であってもよく、従ってコンジュゲート又は融合物が細胞内環境に入るとＴＡＴペプチドから治療剤が分離する。

【0570】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、細胞を溶解させたり及び再密閉したりすることなく赤血球系細胞をレシーバー及び任意選択でペイロードと接触させてレシーバー及び／又はペイロードを取り込ませることにより作成される。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、赤血球系細胞をレシーバー及び任意選択でペイロードと接触させることにより作成され、ここで接触には低張透析は含まれない。

【0571】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、赤血球系細胞をレシーバー及び任意選択でペイロードと接触させることにより作成され、ここで接触には、赤血球系細胞内又はその上にレシーバー及び／又はペイロードを負荷することは含まれない。一部の実施形態において、レシーバーは、接触させる赤血球系細胞でない実体に作成され、及び／又はレシーバーは、接触させる赤血球系細胞を含まない試料から単離される。例えば、ポリペプチドレシーバーについて、好適な実体には、細胞株、インビトロ発現系、細菌発現系等が含まれる。

【0572】

機械的射撃については、例えば赤血球系細胞に、重い粒子又は荷電粒子、例えば金マイクロキャリアなどに取り付けられたレシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）を撃ち込むことができ、それらが機械的又は電気的に加速されることで細胞膜を通り抜ける。微粒子ボンバードメントは、例えば、Ｈｅｌｉｏｓ Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ（例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して達成し得る。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適な微粒子ボンバードメント方法を用い得る。

【0573】

一部の実施形態において、赤血球系細胞又は血小板には、例えばリポソームなどの合成小胞との融合によってレシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）が負荷され得る。この場合、本明細書に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法の１つ以上を用いて小胞自体にレシーバー及び任意選択のペイロードが負荷される。或いは、レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）は小胞形成中に小胞に負荷されてもよい。負荷された小胞は、次に細胞融合を増進する条件下で赤血球系細胞又は血小板と融合させる。リポソームの、例えば細胞との融合は、様々な誘導剤、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びウイルスエンベロープタンパク質を使用するか、又はｐＨなどの培地条件を変化させることにより促進し得る（例えば、米国特許第５，６７７，１７６号明細書を参照）。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適なリポソーム融合方法を用い得る。

【0574】

ろ過については、赤血球系細胞又は血小板及びレシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）を細胞より小さい細孔径のフィルタに押し通し、それにより細胞膜の一過性の破壊を生じさせて、レシーバー及び任意選択の治療剤が細胞に入ることを可能にする。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適なろ過方法を用い得る。

【0575】

凍結融解については、赤血球系細胞を数回の凍結融解サイクルに供し、それにより細胞膜破壊を生じさせる（例えば、米国特許出願公開第２００７／０２４３１３７ Ａ１号明細書を参照）。この場合、濃厚赤血球のペレット（０．１～１．０ｍｌ）を、レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）を含有する等容積（０．１～１．０ｍｌ）の等張液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）と混合する。細胞及びレシーバー及び任意選択のペイロードが入ったチューブを液体窒素に浸して赤血球を凍結する。或いは、細胞は、チューブを－２０℃又は－８０℃のフリーザーに置くことによって凍結してもよい。次に細胞を、例えば２３℃の水浴中で解凍し、負荷を増加させる必要があればサイクルを繰り返す。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適な凍結融解方法を用い得る。

【0576】

レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）は可溶化形態で細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板に負荷されてもよく、例えば、赤血球系細胞又は血小板への負荷前に適切な緩衝液に可溶化され得る。

【0577】

或いは、レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）は固形微粒子としての粒子形態で細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板に負荷してもよい（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７６８６１ Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００６／０２７００３０ Ａ１号明細書を参照）。この場合、レシーバー又はペイロードは難水溶性で、溶解度が１～１０ｍｇ／ｍｌ未満であり得る。難水溶性レシーバー又はペイロードのマイクロパーティクルは、例えば、エネルギー付加法、例えば、ミリング（例えば、パールミリング、ボールミリング、ハンマーミリング、流体エネルギーミリング、ジェットリング）、湿式粉砕、マイクロフルイダイザーによるキャビテーション又はせん断、及び音波処理；沈殿法、例えば、微量沈殿、乳剤沈殿、溶媒－逆溶媒沈殿、転相沈殿、ｐＨシフト沈殿、注入沈殿、温度シフト沈殿、溶媒蒸発沈殿、反応沈殿、圧縮流体沈殿、タンパク質ミクロスフェア沈殿；及び他の技法、例えば低温流体中への噴霧など、種々の技法を用いて１０μｍ未満で作ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７６８６１ Ａ１号明細書を参照）。水溶性レシーバー又はペイロードもまた、例えば、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリシアノアクリレート、アルブミン、及び／又はデンプンなどの様々なポリマーの存在下で固形マイクロパーティクルの形成に使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２７６８６１ Ａ１号明細書を参照）。或いは、水溶性レシーバー又はペイロードを小胞に封入してマイクロパーティクルを形成してもよい。レシーバー及び任意選択のペイロード（例えば治療剤）を含むマイクロパーティクルは、本明細書に記載される方法を用いて赤血球系細胞又は血小板などの細胞に組み込み得る。

【0578】

具体的な実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は赤血球から作成される。例えば、制御された細胞傷害によって赤血球にレシーバーポリペプチド又はレシーバーポリペチド（ｐｏｌｙｐｅｔｉｄｅ）をコードするｍＲＮＡを負荷し得る。細胞傷害は、例えば、機械的歪み又はせん断力によって生じる圧力によるか、細胞を変形、狭窄、急激な延伸、急激な圧縮、又は高せん断速度のパルスに供することによって生じさせ得る。制御された細胞傷害により、材料、例えばレシーバー及び任意選択でペイロードが周囲の細胞媒体から細胞の細胞質に取り込まれる。本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体の作成には、任意の好適な制御された傷害方法を用い得る。

【0579】

制御された細胞変形（例えば、細胞が狭窄部を通過することに伴う細胞の機械的変形）に基づく制御された細胞傷害を使用すると、材料、例えばレシーバー及び任意選択でペイロードは、エンドサイトーシスよりむしろ、拡散によって取り込まれる。材料、例えばレシーバー及び任意選択でペイロードは、制御された傷害に伴い細胞に取り込まれた後にはエンドソームよりむしろ細胞質に存在し、従って細胞にとってその材料が容易に利用可能になる。例えば制御された変形による制御された細胞傷害は、細胞の生存率を維持する（例えば、５０％超、７０％、又は９０％超）。特定の実施形態において、例えば制御された変形による制御された細胞傷害は、細胞分化及び活性の状態を維持する。必要であれば、組み合わせの処理、例えば、変形による制御された傷害と、それに続く又はそれに先行する例えば電気穿孔又は別の細胞膜透過性増加方法が用いられる。任意選択で、界面活性剤が用いられてもよい。

【0580】

機械的変形方法は、他の膜透過性増加方法を十分に耐容しない細胞、例えば、かかる方法の実施後に生存能の低下又は異なる分化状態を示す細胞に特に好適である。機械的変形方法はまた、他の膜透過性増加方法を十分に耐容しない材料、例えばレシーバー及び任意選択でペイロードにも好適である。それに代えて又は加えて、レシーバー又はペイロードは、例えば、ペイロードの例えば電荷、疎水性、又はサイズが原因で、代替的方法を用いると細胞に十分に導入されないこともある。

【0581】

変形による制御された傷害の１つの例示的な方法及びかかる方法に好適な装置が、例えば、国際公開第２０１３０５９３４３号パンフレット「ＩＮＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＤＥＬＩＶＥＲＹ」（参照により本明細書に援用される）に記載されている。

【0582】

具体的な実施形態において、制御された変形による制御された細胞傷害に供されてレシーバーが導入された、それにより合成膜－レシーバー複合体を作成する網赤血球の集団が提供される。細胞は、例えば、個々の網赤血球より小さい直径を有するマイクロチャネルに通過させることにより圧縮して変形させることができ、それにより細胞膜に摂動が生じて膜が多孔質になる。細胞は、加えられる圧力によってチャネル又は導管を通じて進み、例えば押し通される。圧縮及び変形は、例えば、レシーバーポリペプチド又はオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）及び任意選択でペイロードを含む送達媒体中で起こる。例えば、送達媒体は、限定はされないが、表７に掲載されるもの又はそのコードｍＲＮＡを含むレシーバーを含み得る。変形することで、網赤血球は外因性材料を取り込み、保持する。狭窄、延伸、及び／又は高せん断速度のパルスで細胞に制御された傷害を与えた後、任意選択で細胞を、材料、例えばレシーバー及び任意選択でペイロードを含有する送達媒体中でインキュベートする。細胞は送達媒体中に数分間維持し、狭窄部を通過して生じた傷害を回復させ、例えば閉鎖し得る。これは室温で行われ得る。

【0583】

本明細書で使用されるとき、制御された細胞傷害には、ｉ）ウイルス媒介性トランスフェクション（例えば、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、又はシンドビスウイルス）、ｉｉ）化学的に媒介されるトランスフェクション、例えば、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、ポリマー、及びナノ粒子、例えば、シクロデキストリン、リポソーム、カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリブレン、リン酸カルシウム、リポフェクチン、ＤＯＴＡＰ、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、ＣＴＡＢ／ＤＯＰＥ、ＤＯＴＭＡ；及びｉｉｉ）マイクロニードル、ナノニードル、フェムトシリンジ、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）ティップ、遺伝子銃（例えば、金ナノ粒子）、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、光トランスフェクション（多光子レーザー）、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、及びマグネトフェクションによって例示されるとおりの、物理的に媒介されるトランスフェクション、例えば直接注入、微粒子銃粒子送達、電気穿孔、レーザー照射、ソノポレーション、磁気ナノ粒子、及び制御された変形（例えば、細胞の締め付け）、並びに当該技術分野において公知の他の好適な方法が含まれる。任意の好適な方法を使用して、１つ以上のＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、レシーバーポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、又はレシーバーポリペプチド及び任意選択でペイロード（例えば治療剤）を含む本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を得ることができる。

【0584】

ポリペプチドレシーバーは合成膜－レシーバー複合体上に検出することができる。レシーバーポリペプチドの存在は、標準的な分子生物学的方法、例えば、ウエスタンブロッティング又はＦＡＣＳ分析を用いて確認し、定量化することができる。細胞内環境に存在するレシーバーポリペプチドは、細胞溶解時に又は蛍光検出を用いて定量化し得る。

【0585】

例えば、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔタンパク質トランスフェクション試薬キットを使用して赤血球系細胞の集団にアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を負荷することにより、合成膜－ＡＤＡレシーバー複合体を作成し得る。次にＬＣＭＳを用いてアデノシン及びイノシンを定量化することにより、合成膜－ＡＤＡレシーバー複合体の集団を活性酵素の負荷に関して特徴付ける。

【0586】

或いは、赤血球系細胞の集団は、１０ｍＭ、１００ｍＭ、５００ｍＭクロルプロマジン及び０．０１、０．１、１．０、１０、１００ｍｇ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）の溶液中でインキュベートする。次に合成膜－ＡＤＡレシーバー複合体の集団を洗浄し、蛍光イメージングを用いてＡＤＡ負荷を定量化する。

【0587】

一実施形態では、０．０１、０．１、１．０、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のアスパラギナーゼを含有する低張塩溶液中で赤血球の集団をインキュベートすることにより、合成膜－アスパラギナーゼレシーバー複合体を作成する。細胞集団は１時間インキュベートし、次に高張溶液中で１０分間インキュベーションすることによって遊離させる。次にこの合成膜－アスパラギナーゼレシーバー複合体の集団をアスパラギン溶液中で１時間インキュベートし、ＬＣＭＳを用いてアスパラギン及びアスパラギン酸濃度を定量化する。

【0588】

合成膜－チミジンホスホリラーゼレシーバー複合体を作成するには、Ｃ末端及びＮ末端の両方で１つ以上の細胞透過性ペプチド（ペネトラチン、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＰＴＤ－４、ＰＴＤ－５、ＦＨＶ Ｃｏａｔ－（３５－４９）、ＢＭＶ Ｇａｇ－（７－２５）、ＨＴＬＶ－ＩＩ Ｒｅｘ－（４－１６）、Ｄ－ＴＡＴ、Ｒ９－Ｔａｔ、トランスポータン、ＭＡＰ、ＳＢＰ、ＦＢＰ、ＭＰＧ ａｃ、ＭＰＧ（ＮＬＳ）、Ｐｅｐ－１、Ｐｅｐ－２、ポリアルギニン、ポリリジン、（ＲＡｃａ）６Ｒ、（ＲＡｂｕ）６Ｒ、（ＲＧ）６Ｒ、（ＲＭ）６Ｒ、Ｒ１０、（ＲＡ）６Ｒ、Ｒ７が挙げられる）に融合した０．０１、０．１、１．０、１０ｍｇ／ｍｌの濃度のチミジンホスホリラーゼを含有するＰＢＳ溶液中で赤血球の集団をインキュベートする。インキュベーション後、合成膜－チミジンホスホリラーゼレシーバー複合体をチミジン溶液中に１時間置き、ＬＣＭＳを用いて試料のチミン及びチミジン含量を定量化する。

【0589】

細胞はマイクロ流体装置を使用して負荷することができ、この装置は細胞を一過性に穿孔して、細胞が圧力を受けてそのシステムを通るときにペイロードが侵入することを可能にする。一実施形態では、０．０１、０．１、１．０、１０ｍｇ／ｍｌのフェニルアラニンアンモニアヒドロキシラーゼを含有する緩衝溶液中で赤血球の集団をマイクロ流体チャネルのシステムに圧力で通す。次にＬＣＭＳを用いて細胞懸濁液の酵素活性を特徴付け、フェニルアラニン及びｔｒａｎｓ－ケイ皮酸を定量化する。

【0590】

一実施形態では、合成細胞膜－レシーバー複合体は、１ｍＭのアデノシンデアミナーゼを含有する低張液中で１時間インキュベートする。次に合成膜－レシーバー複合体を等張液に移して平衡化させ、可溶性タンパク質中に密閉する。

【0591】

合成膜－レシーバー複合体のペイロード
合成膜－レシーバー複合体には、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、及び他の高分子及び治療用小分子などのペイロードを任意選択で負荷し得る。一部の実施形態において、ペイロードは、細胞に所定の時間にわたり制御された傷害を加えることによって細胞膜に摂動を生じさせ、ペイロードを細胞の内部（例えば細胞質）に送達し得るようにすることで、細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板に移入される。

【0592】

ペイロードは、種々の既知の小分子医薬品から選択される治療剤であってもよい。或いは、ペイロードは、例えば、不活性ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドアプタマー、干渉性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）、ペプチド、又はタンパク質などの種々の高分子から選択される治療剤であってもよい。

【0593】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は網赤血球から作成される。例えば、網赤血球に、治療用外因性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを制御された細胞傷害によって負荷し得る。ｍＲＮＡは、所望に応じてネイキッドであっても、又は修飾されていてもよい。ｍＲＮＡ安定性を改善し及び／又は免疫原性を低下させるｍＲＮＡ修飾としては、例えば、ＡＲＣＡ：抗リバースキャップ類似体（ｍ_２ ^{７．３’－Ｏ}ＧＰ_３Ｇ）、ＧＰ_３Ｇ（非メチル化キャップ類似体）、ｍ^７ＧＰ_３Ｇ（モノメチル化キャップ類似体）、ｍ_３ ^{２．２．７}ＧＰ_３Ｇ（トリメチル化キャップ類似体）、ｍ５ＣＴＰ（５’－メチルシチジン三リン酸）、ｍ６ＡＴＰ（Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸）、ｓ２ＵＴＰ（２－チオウリジン三リン酸）、及びΨ（プソイドウリジン三リン酸）が挙げられる。

【0594】

合成膜－レシーバー複合体は、２つ以上のペイロード、例えば、本明細書に開示されるとおりの原子、分子等の混合物、融合物、組み合わせ及びコンジュゲート、例えば、限定はされないが、ポリペプチドと組み合わせた核酸；互いにコンジュゲートした２つ以上のポリペプチド；生物学的に活性な分子（これはプロドラッグなどの小分子であり得る）にコンジュゲートしたタンパク質などを含み得る。

【0595】

一部の実施形態において、本医薬組成物は１つ以上の治療剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体とを含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は１つ以上の別個の治療剤と共投与され、ここで共投与は、合成膜－レシーバー複合体の投与前、その投与後又はその投与と同時に別個の治療剤を投与することを含む。

【0596】

好適なペイロードとしては、限定されることなく、薬理活性薬物及び遺伝的に活性の分子、例えば、抗新生物剤、抗炎症剤、ホルモン又はホルモン拮抗薬、イオンチャネル修飾薬、及び神経活性剤が挙げられる。治療剤である好適なペイロードの例としては、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，（１９９６），Ｎｉｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎの以下の節：Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ａｔ Ｓｙｎａｐｔｉｃ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｉｔｅｓ；Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｕｔａｃｏｉｄｓ：Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；Ｗａｔｅｒ，Ｓａｌｔｓ ａｎｄ Ｉｏｎｓ；Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｒｅｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｒｕｇｓ；Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｉｃ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｄｒｕｇｓ Ｕｓｅｄ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ Ｂｌｏｏｄ－Ｆｏｒｍｉｎｇ ｏｒｇａｎｓ；Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ；Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；及びＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（全て参照により本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。好適なペイロードとしては、さらに、毒素、並びに生物及び化学兵器剤が挙げられる。例えばＳｏｍａｎｉ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照されたい。

【0597】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、合成三リン酸化ヌクレオシド類似体を含むペイロードを含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、２’，３’－ジデオキシシチジン－５’－三リン酸（ｄｄＣＴＰ）及び／又は３’－アジド－３’－デオキシチミジン－５’－三リン酸（ＡＺＴ－ＴＰ）を含むペイロードを含まない。

【0598】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ビスホスホネートを含むペイロードを含まない。

【0599】

一部の実施形態において、ペイロードは、小分子薬物又は大分子生物製剤などの治療剤である。大分子生物製剤としては、限定はされないが、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、例えば、限定はされないが、構造タンパク質、酵素、サイトカイン（インターフェロン及び／又はインターロイキンなど）、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はそれらの有効な一部、例えばＦｖ断片（これらの抗体又はその一部は天然であっても、合成であっても又はヒト化されていてもよい）、ペプチドホルモン、受容体、又はシグナル伝達分子が挙げられる。

【0600】

大分子生物製剤は、細胞内環境で抗原と結合する能力を有する免疫グロブリン、抗体、Ｆｖ断片等である。この種の分子は「イントラボディ」又は「細胞内抗体」として知られる。「細胞内抗体」又は「イントラボディ」には、細胞の環境内で、又は細胞内の環境を模倣する環境においてその標的又はコグネイト抗原に結合する能力を有する抗体が含まれる。かかる「イントラボディ」を直接同定するための選択方法は、哺乳類細胞の内部で抗原に結合する能力を備えた抗体を選択するインビボ２ハイブリッド法の使用を含む。かかる方法は、ＰＣＴ／ＧＢ００／００８７６号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されている。細胞内抗体、例えば抗β－ガラクトシダーゼｓｃＦｖの作製技法はまた、Ｍａｒｔｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８０：１１７－１２７（１９９８）及びＶｉｓｉｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１７２３－１７２８（１９９９）にも記載されている。

【0601】

大分子生物製剤には、限定はされないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、修飾アミノ酸類似体、ステロイド、プロテオグリカン、脂質及び炭水化物又はそれらの組み合わせ（例えば、タンパク質及びＤＮＡ成分又は一対の若しくは一組のエフェクターの両方を含む染色体物質、ここで１つ以上はもう１つを活性型に、例えば触媒的に変換する）の少なくとも１つが含まれる。

【0602】

大分子生物製剤には、核酸、例えば、限定はされないが、オリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、人工又は天然染色体（例えば、酵母人工染色体）又はそれらの一部、ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ又はリボザイム、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）；ウイルス又はウイルス様粒子；ヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの合成類似体（これは修飾されていても又は非修飾されていなくてもよい）が含まれ得る。

【0603】

大分子生物製剤はまた、アミノ酸又はその類似体（これは修飾されていても又は非修飾されていなくてもよい）又は非ペプチド（例えばステロイド）ホルモン；プロテオグリカン；脂質；又は炭水化物であってもよい。大分子生物製剤がポリペプチドである場合、それは、本明細書に記載される方法に従い例えば赤血球系細胞又は血小板に直接負荷することができる。或いは、ポリペプチドをコードする外因性核酸であって、標的部位にある細胞で活性を示す転写及び翻訳調節エレメントに作動可能に連結されている配列を有する核酸が負荷されてもよい。

【0604】

無機及び有機化学物質を含めた小分子もまた、本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体のペイロードとして使用し得る。

【0605】

一部の実施形態において、小分子は薬学的に活性な薬剤である。薬学的に活性な薬剤の有用なクラスとしては、限定はされないが、抗生物質、抗炎症薬、血管新生剤又は血管作用剤、成長因子及び化学療剤（抗新生物剤）（例えば腫瘍抑制剤）が挙げられる。

【0606】

プロドラッグが不活性形態で合成膜－レシーバー複合体に負荷される場合、往々にして、不活性プロドラッグを活性薬物形態に変換する活性化ポリペプチドなどのレシーバーが合成膜－レシーバー複合体にさらに含まれることが有用である。ある実施形態において、活性化レシーバーポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスチミジンキナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０２２２４によってコードされる）、カルボキシペプチダーゼＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２７７１７によってコードされる）、α－ガラクトシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１３５７１によってコードされる）、β－グルウクロニダーゼ（β－ｇｌｕｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１５１８２によってコードされる）、アルカリホスファターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０３２５２ Ｊ０３５１２によってコードされる）、又はシトクロムＰ－４５０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｄ００００３ Ｎ００００３によってコードされる）、プラスミン、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトシンデアミナーゼ、グルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アゾレダクターゼ、ｔ－グタミル（ｇｕｔａｍｙｌ）トランスフェラーゼ、β－ラクタマーゼ、及びペニシリンアミダーゼが挙げられる。

【0607】

合成膜－レシーバー複合体の作成には、例えば赤血球系細胞又は血小板にレシーバーポリペプチド又はそれをコードする外因性遺伝子のいずれを負荷してもよい。プロドラッグ及び活性化レシーバーポリペプチドの両方が、同じ外因性核酸上の遺伝子によってコードされてもよい。さらに、プロドラッグ又はプロドラッグの活性化レシーバーポリペプチドのいずれも、合成膜－レシーバー複合体において遺伝子導入で発現させることができる。

【0608】

合成膜－レシーバー複合体はまた、１つ以上の陽性マーカーで標識してもよく、陽性マーカーを使用して、個体の血液循環中の合成膜－レシーバー複合体の数又は濃度を経時的にモニタすることができる。合成膜－レシーバー複合体の総数は、最初の注入後、時間と共に減衰し得る。一部の実施形態において、１つ以上の陽性マーカーからのシグナルは、活性化した分子マーカーのシグナルと相関し、循環中に残る合成膜－レシーバー複合体の数とは無関係なシグナルの比例関係を生じる。好適な蛍光化合物には、限定はされないが、フルオレセイン、インドシアニングリーン、及びローダミンＢを含めた、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ＆Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によってヒトへの使用が承認されているものが含まれる。例えば、合成膜－レシーバー複合体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；Ｂｒａｔｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ４６：３５１－３５６（２００１））で非特異的に標識してもよい。例えば、０．２ｍＭのフッ化フェニルメチスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｓｕｌｆｏｎｙｌ）（ＰＭＳＦ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＦＩＴＣ標識レクチンの溶液を、同じ緩衝液中の等容積の単離赤血球系細胞又は血小板に加える。細胞をＦＩＴＣ標識レクチンと共に暗所４℃で１時間インキュベートする。レクチンは、赤血球系細胞の表面上にあるシアル酸及びβ－ガラクトシル残基に結合する。

【0609】

ヒト及び非ヒト循環中の合成膜－レシーバー複合体のトラッキングに、他の色素が有用であり得る。合成膜－レシーバー複合体を非特異的に標識するため、幾つかの試薬を使用し得る。例えば、赤血球系細胞又は血小板をＰＫＨ２６レッドで標識し得る（例えば、Ｂｒａｔｏｓｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３０：２６９－２７４を参照）。赤血球系細胞又は血小板（１～３×１０^７細胞）を１ｍｌの希釈剤に懸濁し、同じ希釈剤に溶解した１ｍｌ又は２μＭのＰＫＨ２６に速やかに加える。この混合物を穏やかなピペッティングによって混合し、常に撹拌しながら２５℃で２～５分間インキュベートする。標識処理は、等容積のヒト血清又は適合性タンパク質溶液（例えば１％ウシ血清アルブミン）を加えて停止させることができる。さらに１分後、等容積の細胞培養培地を加え、２０００×ｇで５分間遠心して細胞を単離する。細胞培養培地中への懸濁及び遠心を繰り返すことにより、細胞を３回洗浄する。ＰＨＫ２６標識合成膜－レシーバー複合体は５５１ｎｍの最大励起波長及び５６７ｎｍの最大発光波長でモニタし得る。

【0610】

合成膜－レシーバー複合体は、６７０±５ｎｍのピーク励起波長及び６８８±５ｎｍのピーク発光波長の近赤外蛍光色素であるＶｉｖｏＴａｇ ６８０（ＶＴ６８０；ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）を使用してインビボでトラッキングし得る。ＶＴ６８０はアミン反応性ＮＨＳエステルもまた含むため、タンパク質及びペプチドと架橋させることが可能である。細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板の表面をＶＴ６８０で標識してもよい（例えば、Ｓｗｉｒｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＰｌｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ１０７５を参照）。例えば、完全培養培地に０．３～３００μｇ／ｍｌの最終濃度で希釈したＶＴ６８０と共に４×１０^６細胞／ｍｌを３７℃で３０分間インキュベートする。標識後、細胞を完全培養培地で２回洗浄する。細胞は、合成膜－レシーバー複合体の表面上に発現するタンパク質に基づき非特異的に標識し得る。或いは、特異的タンパク質、例えばレシーバーをＶＴ６８０で標識してもよい。一部の実施形態において、タンパク質又はペプチドはエキソビボでＶＴ６８０によって直接標識し、続いて本明細書に記載される方法を用いて細胞の表面に結合させるか、又は細胞の内部に組み込むことができる。例えば、背側皮下脂肪を使用してインビボモニタリングを実施し得る。例えばＯｌｙｍｐｕｓ ＩＶ １００を使用してレーザー走査顕微鏡法を実施してもよく、ここでＶＴ６８０は６３７ｎｍの赤色レーザーダイオードで励起され、６６０／ＬＰフィルタで検出される。或いは、例えば２０×／０．９５ＮＡ対物レンズ及び８２０ｎｍに同調したパルスＴｉ：サファイアレーザーを備えるＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１を中心に置いたＢｉｏＲａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２１００ＭＰを使用して、多光子顕微鏡法を実施してもよい。同調波長は、ＶＴ６８０がその二光子断面で８２０ｎｍでピークを有するという理由で選択される。

【0611】

それに代えて又は加えて、合成膜－レシーバー複合体は、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７などのシアニン色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）及び／又は種々のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を含めた他の赤色色素及び／又は近赤外色素で標識してもよい。さらなる好適なフルオロフォアとしては、ＩＲＤ４１及びＩＲＤ７００（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、Ｎｅｂｒ．、ＵＳＡ）、ＮＩＲ－１及び１Ｃ５－ＯＳｕ（デジンド（Ｄｅｊｉｎｄｏ）、熊本、日本）、ラホーヤブルー（ＬａＪｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）（Ｄｉａｔｒｏｎ、Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．、ＵＳＡ）、ＦＡＲ－Ｂｌｕｅ、ＦＡＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ、及びＦＡＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｔｗｏ（Ｉｎｎｏｓｅｎｓｅ、Ｇｉａｃｏｓａ、イタリア）、ＡＤＳ ７９０－ＮＳ及びＡＤＳ ８２１－ＮＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｙｅ Ｓｏｕｒｃｅ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。様々な発光／励起特性の量子ドット（Ｑｄｏｔ）もまた、合成膜－レシーバー複合体の標識に使用し得る（例えば、Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：４７－５１（２００３）を参照）。これらのフルオロフォアの多くは商業的供給元から、一次又は二次抗体に結合しているか、或いはアミン反応性スクシンイミジル又はモノスクシンイミジルエステルとして、例えば、合成膜－レシーバー複合体の表面上又はその内部のいずれの１つ又は複数のタンパク質にも直ちにコンジュゲートし得る状態で入手することができる。

【0612】

磁気ナノ粒子を使用すると、高分解能ＭＲＩを用いてインビボで合成膜－レシーバー複合体をトラッキングし得る（Ｍｏｎｔｅｔ－Ａｂｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ４：１６５－１７１（２００５））。磁性粒子は幾つかの機構によってインターナライズされ得る。磁性粒子は液相ピノサイトーシス又は食作用によって細胞、例えば赤血球系細胞又は血小板に取り込まれ得る。或いは、磁性粒子が、例えばインターナリゼーションを促進する膜移行ＨＩＶ ＴＡＴペプチドなどの表面薬剤を含むように修飾されてもよい。場合によっては、例えばＦＤＡ承認済みの磁気共鳴造影試薬であるＦｅｒｉｄｅｘ ＩＶ（登録商標）などの磁気ナノ粒子が、トランスフェクション剤、例えば、硫酸プロタミン（ＰＲＯ）、ポリリジン（ＰＬＬ）、及びリポフェクタミン（ＬＦＡ）などと併せて例えば赤血球系細胞又は血小板にインターナライズされてもよい。

【0613】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、赤血球系細胞をポリペプチドなどのレシーバーと接触させるステップを含んで作成される。一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドは外因性核酸によってコードされ、赤血球系細胞によって発現する。一部の実施形態において、天然に存在する赤血球系細胞はレシーバーを含まない。例えば、天然に存在する赤血球系細胞は、レシーバーポリペプチドと構造及び機能が同じである内因性ポリペプチドを発現しない。一部の実施形態において、赤血球系細胞は、過剰発現するレシーバーを含む。例えば、レシーバーは、天然に存在する赤血球系細胞によって内因的に発現した場合と比べて実質的により高いコピー数で存在する。一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、赤血球系細胞をレシーバーに接触させた後、細胞をインビトロ又はインビボで分化させ、成熟させることによって作成される。当該技術分野においては、赤血球が前駆細胞から分化するに従い複雑な成熟プロセスを受けることが知られている。この成熟プロセスには、実質的な細胞骨格及び膜の再編成及び非必須ポリペプチドの分解又は排除が含まれる。例えば、Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１０）：２０２１－２０２７；及びＬｏｄｉｓｈ ＨＦ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７（１）：５９を参照）。天然に存在する赤血球では、この成熟プロセスはインビボで、初めは骨髄において、次に循環中で、網赤血球が赤血球に成熟するに従い起こる。培養赤血球では、この成熟プロセスはエキソビボ、培養下、及びインビボの循環中のいずれでも、培養網赤血球が赤血球に成熟するに従い起こる（例えば、Ｎｅｉｌｄｅｚ－Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：４６７を参照）。一部の実施形態において、赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、インビトロ又はインビボで成熟プロセス中にそのレシーバーを保持し、レシーバーが失われることはない。一部の実施形態において、赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、成熟後もそのレシーバーを保持している。一部の実施形態において、赤血球系細胞から作成される完全に成熟した合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、そのレシーバーを保持している。レシーバーは、インビトロ、例えば培養下で保持されてもよく、及び／又は例えば対象の循環系への投与後に、インビボで保持されてもよい。一部の実施形態において、レシーバーは、循環中で合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の寿命が続く限り複合体によって保持され得る。当該技術分野ではレシーバーが成熟プロセスの間に赤血球系細胞から排除されると提唱されたことを考えると、これらの知見は意外である。さらに、赤血球系細胞から作成された合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を対象の循環系に投与したときにレシーバーが保持され、機能的に活性であることは予想外であった。一部の実施形態において、レシーバーを含む赤血球系細胞を培養することにより、非培養赤血球の単離及び修飾に頼る方法で達成される場合と比べて実質的により均一な及び／又は実質的により拡張性のある治療用合成膜－レシーバー複合体集団を作製する方法がもたらされる。ヒト赤血球系細胞ベースの治療及び予防方法が大いに必要とされ、且つ当該技術分野でその価値が認識されているにも関わらず、これまで修飾培養細胞に由来するシステムは作成されておらず、又は循環中におけるレシーバー活性の保持が示されたことはなく、当該技術分野では、かかるシステムは実現不可能であろうことが提唱されていた。これまでに培養ヒト赤血球がヒト対象に実験的に投与された場合、それらは非修飾であった（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１）。

【0614】

標的
本明細書には、標的との相互作用能を有するレシーバーポリペプチドを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が提供される。本明細書にはさらに、標的との相互作用能を有する非ポリペプチドレシーバーを含む合成膜－レシーバー複合体が提供される。合成膜－レシーバー複合体は、対象の循環系に滞留する標的の量又は濃度をモジュレートするため、それを必要としている対象に投与され得る。好適なレシーバーは、特定の標的と相互作用するように選択され得る。好適な標的には、特定の疾患、障害、又は病態に関連する実体が含まれる。しかしながら、標的はまた、特定の疾患、障害、又は病態とは無関係に選択されてもよい。

【0615】

一部の実施形態において、標的は抗体又は抗体様分子、例えば自己免疫性抗体又は自己抗体、又は外来抗体、又は治療用抗体であり、限定はされないが、例えば、β－２グリコプロテイン１に対する抗体、Ｉ／ｉ抗原に対する抗体、コラーゲンａ３（ＩＶ）のＮＣ１ドメインに対する抗体、血小板糖タンパク質に対する抗体、ホスホリパーゼＡ２受容体に対する抗体、赤血球グリコホリンＡ、Ｂ、若しくはＣに対する抗体、又は赤血球Ｒｈ抗原に対する抗体が挙げられる。

【0616】

一部の実施形態において、標的は補体カスケードの分子、例えば、Ｃ１、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ１ｑ、Ｃ２、Ｃ２ａ、Ｃ２ｂ、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ３ｂＢｂ、Ｃ３ｂＢｂ３ｂ、Ｃ４ｂ２ｂ、Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ポリＣ９、膜侵襲複合体、Ｂ因子、Ｄ因子、プロパージン、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄｋ、Ｃ３ｅ、Ｂｂ、Ｉ因子、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ４、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２、Ｃ４ｂｐ、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ１（ＭＡＳＰ１）、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｃ３ａＲ、Ｃ３ｅＲ、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、ＣＤ５９、Ｃ３β鎖受容体、Ｃ１インヒビター、Ｃ４結合タンパク質、Ｉ因子、Ｈ因子である。

【0617】

一部の実施形態において、標的は免疫複合体、例えばＩｇＧ免疫複合体、ＩｇＡ免疫複合体、ＩｇＭ免疫複合体である。

【0618】

一部の実施形態において、標的は、アミロイド斑、例えばβアミロイド、ＩＡＰＰ（アミリン）、α－シヌクレイン、ＰｒＰｓｃ、ハンチンチン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、アポリポタンパク質ＡＩ、血清アミロイドＡ、メジン（ｍｅｄｉｎ）、プロラクチン、トランスサイレチン、リゾチーム、β２ミクログロブリン、ゲルゾリン、ケラトエピテリン、シスタチン、免疫グロブリン軽鎖ＡＬ、Ｓ－ＩＢＭを含む斑である。

【0619】

一部の実施形態において、標的は細菌、例えばエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、又はマイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）である。菌血症がある程度報告されている他の病原体としては、以下が挙げられる：リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クラミジア属（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；赤痢菌属（ｓｈｉｇｅｌｌａ）；エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）；蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）；ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。

【0620】

一部の実施形態において、標的はウイルスであり、限定はされないが、その感染に細胞表面受容体との結合時における宿主細胞への遺伝物質の注入が関わるもの、その感染が細胞表面受容体によって媒介されるウイルスが挙げられる。これらのウイルスの非限定的な例は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルス又はルブラウイルス）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノウイルス）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどのアレナウイルス）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス又はウマ動脈炎ウイルス）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、フレボウイルス又はハンタウイルス）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ノーウォークウイルス）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス又はトロウイルス）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラ様ウイルス）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ヘパシウイルス又はフラビウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、又はリンホクリプトウイルス）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス又はトゴトウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パルボウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エンテロウイルス又はヘパトウイルス）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、又はレポリポックスウイルス）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レンチウイルス又はスプーマウイルス）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ロタウイルス）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、又はベシクロウイルス）、及びトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アルファウイルス又はルビウイルス）から選択することができる。これらのウイルスの具体的な例としては、ヒト呼吸器コロナウイルス、Ａ型～Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ～Ｇ型肝炎ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１～９型が挙げられる。

【0621】

一部の実施形態において、標的は寄生虫であり、限定はされないが、例えば、腸内寄生虫又は血液感染性の寄生虫、原虫、トリパノソーマ；マラリアを引き起こす能力を有する血液原虫及び寄生虫；腸内条虫及びテニア科条虫を含めた全身性条虫；腸内コクシジウム；腸内鞭毛原虫；糸状線虫；胃腸管線虫並びに全身性線虫及び鉤虫が挙げられる。

【0622】

一部の実施形態において、標的は真菌であり、限定はされないが、例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、Ｔ．グラブラタ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、及びＣ．パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）が挙げられる。

【0623】

一部の実施形態において、標的は細菌性毒素であり、限定はされないが、例えば、ＡＢ毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、バクテリオシン、ボツリヌス毒素、コレステロール依存性細胞溶解素、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｃ３毒素、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）エンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）アルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ベータ毒素、コードファクター、Ｃｒｙ１Ａｃ、クリプトフィシン、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシンＢ型、発赤毒素、表皮剥脱素、ヘモリシンＥ、易熱性エンテロトキシン、耐熱性エンテロトキシン、溶血素、ロイコシジン、リポ多糖、リステリオリシンＯ、ミクロシン、パントン－バレンタインロイコシジン、病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、ポア形成毒素、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、ＲＴＸ毒素、サカシン（ｓａｋａｃｉｎ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）アルファ毒素、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ベータ毒素、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）デルタ毒素、ストレプトリジン、シンプロカミドＡ（Ｓｙｍｐｌｏｃａｍｉｄｅ Ａ）、タブトキシン、テタノリジン、テタノスパスミン、チオール活性化細胞溶解素、トラアシン、毒素性ショック症候群毒素、トキソフラビン、トレハロースジミコレート、ベロ毒素、及びビブリオシンが挙げられる。

【0624】

一部の実施形態において、標的はプリオンタンパク質であり、限定はされないが、例えば、ＰＲＰ、ＰＲＰｃ、ＰｒＰｓｃ、ＰＲＰｒｅｓが挙げられる。

【0625】

一部の実施形態において、標的はサイトカイン又はケモカイン又は成長因子であり、限定はされないが、例えば、アシル化刺激タンパク質、アディポカイン、アルブインターフェロン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、コロニー刺激因子、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、エリスロポエチン、Ｇｃ－ＭＡＦ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ＩＬ １０ファミリー、ＩＬ １７ファミリー、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、インターフェロン、インターフェロンβ １ａ、インターフェロンβ １ｂ、インターフェロンγ、Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、ＩＩＩ型インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン１ファミリー、インターロイキン１受容体拮抗薬、インターロイキン１０、インターロイキン１２、インターロイキン１２サブユニットβ、インターロイキン１３、インターロイキン１６、インターロイキン２、インターロイキン２３、インターロイキン２３サブユニットα、インターロイキン３４、インターロイキン３５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン－３６、白血病抑制因子、白血球促進因子、リンホカイン、リンホトキシン、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性タンパク質、マクロファージ活性化因子、モノカイン、ミオカイン、ミオネクチン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、オンコスタチンＭ、オプレルベキン、血小板第４因子、炎症誘発性サイトカイン、プロメガポエチン、ＲＡＮＫＬ、ストロマ細胞由来因子１、タリモジェン・ラヘルパレプベク（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、アンギオポエチン、塩基性線維芽細胞成長因子、ベータセルリン、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、ＣＣＮ細胞間シグナル伝達タンパク質、ＣＴＧＦ、ダルベポエチンα、エンドグリン、上皮成長因子、エポエチンα、エポエチンβ、エリスロポエチン、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１５／１９、線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子２３、フィルグラスチム、グリア成熟因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長分化因子－９、ヘバープロットＰ（ｈｅｂｅｒｐｒｏｔ－Ｐ）、造血成長因子、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２、ケラチノサイト成長因子、ミオスタチン、神経成長因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、オンコモジュリン、骨新生促進剤（ｏｓｔｅｏｐｒｏｍｏｔｉｖｅ）、パリフェルミン、ＰＤＧＦＢ、胎盤成長因子、血小板アルファ顆粒、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子受容体、増殖指数、トロンボポエチン、形質転換成長因子、血管内皮増殖因子が挙げられる。

【0626】

一部の実施形態において、標的は小分子、例えば、化学物質、アミノ酸、原子、元素、有機酸、＜２０００Ｄａ、＜１０００Ｄａ、＜５００Ｄａであり、限定はされないが、例えば、鉄、銅、カルシウム、カリウム、エタノール、メタノール、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。

【0627】

一部の実施形態において、標的は、脂質、脂質複合体、プロテオリピド複合体、又はコレステロールであり、限定はされないが、例えば、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬ、ＨＤＬ２Ｂ、トリグリセリド類、ＬＰ（ａ）、コレステロールが挙げられる。

【0628】

一部の実施形態において、標的は哺乳類細胞であり、限定はされないが、例えば、ヒト細胞、循環細胞、免疫細胞、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、γ－δＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、マクロファージ、クッパー細胞、樹状細胞、癌細胞、癌幹細胞、循環腫瘍細胞、以下に挙げる癌、即ち、限定はされないが、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、原発不明癌、骨転移癌、脳転移癌、肝転移癌、肺転移癌、カルチノイド、子宮頸癌、絨毛癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、妊娠性絨毛性腫瘍（ＧＴＴ）、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、メラノーマ性皮膚癌、中皮腫、男性癌、奇胎妊娠、口腔・中咽頭癌、骨髄腫、鼻腔・副鼻腔癌、鼻咽腔癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道癌、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、前立腺癌、希少癌、直腸癌、唾液腺癌、二次癌、皮膚癌（非メラノーマ性）、軟部組織肉腫、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、原発不明癌、子宮癌、腟癌、及び外陰癌のうちの１つからの癌細胞が挙げられる。

【0629】

供給源
合成膜－レシーバー複合体は、本明細書に記載される任意の方法によって作成することができる。一部の実施形態において、そのステップには、造血幹細胞に由来する任意選択で培養した単離細胞をレシーバーと接触させるステップが含まれる。造血幹細胞は、ミエロイド（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）及びリンパ球系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含めた、哺乳類血液に見られるあらゆる血液細胞型を生じさせる。造血幹細胞は、例えば、大腿骨、寛骨、肋骨、又は胸骨を含めた成人骨の骨髄から単離され得る。細胞は殿部から直接、例えば針及びシリンジによる吸引を用いて骨髄から細胞を取り出すことによって得られてもよい。或いは、造血幹細胞は、サイトカイン、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などによる前処理後の正常末梢血から単離されてもよい。Ｇ－ＣＳＦは、骨髄コンパートメントから末梢循環への細胞の放出を動員する。他の造血幹細胞源としては、臍帯血及び胎盤が挙げられる。

【0630】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は巨核球又は血小板から作成される。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、赤血球系細胞、例えば赤血球又は網赤血球から作成される。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、好中球、好酸球、又は好塩基球からは作成されない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、単球又はマクロファージからは作成されない。

【0631】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ＣＤ３４^＋Ｔｈｙ－１^＋造血幹細胞又はＣＤ３４^＋Ｌｉｎ^－又はＣＤ３４^＋Ｔｈｙ－１^＋Ｌｉｎ^－細胞がエンリッチされた細胞集団からは作成されない。

【0632】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は自己ＣＤ３４＋細胞からは作成されず、又はそれを含まない。

【0633】

単離造血幹細胞をエキソビボで培養し、拡大し及び分化させて種々の供給源材料をもたらすことにより、合成膜－レシーバー複合体を作成し得る。例えば、骨髄、サイトカイン刺激末梢血又は臍帯血から単離された造血幹細胞をエキソビボで拡大して成熟赤血球に分化させてもよい（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９－７４（２００５）；米国特許出願公開第２００７／０２１８５５２号明細書）。従って、例えば磁気マイクロビーズ選択法及びＭｉｎｉ－ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して骨髄又は末梢血又は臍帯血からＣＤ３４＋細胞を単離する。一例では、続いて細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１２０μｇ／ｍｌ鉄飽和ヒトトランスフェリン、９００ｎｇ／ｍｌ硫酸第一鉄、９０ｎｇ／ｍｌ硝酸第二鉄及び１０μｇ／ｍｌインスリンを補充した改良無血清培地で培養し、５％二酸化炭素空気中で３７℃に維持する。細胞培養物の拡大及び分化は多段階で起こり得る。例えば、単離後の最初の成長段階では、細胞は、例えば、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子、ＩＬ－３、及びエリスロポエチンを含めた複数の成長因子の存在下に本明細書に記載される培地で拡大し得る。第２の段階では、任意選択で、細胞はエリスロポエチンの存在下に例えば付着間質細胞層上で共培養し得る。第３の段階では、細胞は外的因子の非存在下に培養培地中の付着間質細胞層上で培養し得る。付着間質細胞層は、例えばマウスＭＳ－５間質細胞であってもよい。或いは、付着間質細胞層は、成体骨髄に由来する間葉間質細胞であってもよい。付着間質細胞は、例えば１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ中に維持し得る。一部の実施形態において、赤血球系前駆細胞及びそれから得られる細胞集団は、非赤血球系細胞、例えば付着間質細胞層と共培養されず、即ち非赤血球系細胞の非存在下で培養される。一部の実施形態において、レシーバーを含む赤血球系細胞は非赤血球系細胞の非存在下で培養され、分化すると赤血球系細胞の１０％超、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％超が除核され、この除核細胞の集団は、除核細胞を選択するための重力分離、磁気又は蛍光選別、照射、有核細胞の中毒化などの濃縮ステップを用いずに得られる。

【0634】

場合によっては、インビトロでＣＤ３４＋造血幹細胞を拡大して部分的に分化させて、インビボで成熟赤血球への最終分化を生じさせることが望ましいこともある（例えば、Ｎｅｉｌｄｅｚ－Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４６７－４７２（２００２）を参照）。単離ＣＤ３４＋造血幹細胞はインビトロで、例えばＦｌｔ３リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、及びインスリン成長因子を含めた種々の因子を含有する培地において付着間質細胞層の非存在下に拡大し得る。得られる赤血球系前駆細胞はＣＤ３６及びＧＰＡの表面発現によって特徴付けることができ、対象に注入して、そこで成熟赤血球への最終分化を生じさせ得る。

【0635】

一部の実施形態において、赤血球系細胞集団は、除核中に保持されるレシーバーポリペプチドを含む複数の除核された機能性赤血球系細胞を含む。これにより得られるレシーバーポリペプチドを含む単離除核機能性赤血球系細胞は、対応する単離非修飾非培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。

【0636】

一部の実施形態において、赤血球系細胞集団は、実質的に同じ分化段階及び／又は細胞周期段階にある複数の赤血球前駆細胞を含み、ここで前駆細胞は、レシーバーをコードする外因性核酸を含む。レシーバーをコードする外因性核酸を含む赤血球前駆細胞の大部分は、外因性核酸を保持せずにレシーバーを保持する成熟機能性赤血球に分化する能力を有する。

【0637】

一部の実施形態において、初代細胞は、静脈穿刺、毛細血管穿刺、又は動脈穿刺によって採取し得る。次に、採取された全血、赤血球、血小板又は他の細胞から、血漿枯渇、密度勾配、ヘタスターチ、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ－ＣＢ、及び遠心を含む技法の１つ、又は組み合わせを用いて単離し得る。

【0638】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の作成は、対象にとって自己の及び／又は同種の任意選択で培養されている単離細胞をレシーバーに接触させることを含む。例えば、対象にとって同種の赤血球には、血液型特異的赤血球の１つ以上又は１つ以上の万能ドナー赤血球が含まれる。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、赤血球の融合、例えば、対象にとって自己性の赤血球と１つ以上の同種赤血球、リポソーム、及び／又は人工小胞との間の融合によって作成し得る。

【0639】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の自己輸血には、対象から赤血球、網赤血球又は造血幹細胞を単離すること、その細胞を本明細書に記載される方法によってレシーバーと接触させて好適な合成膜－レシーバー複合体を作成すること、及びその合成膜－レシーバー複合体を同じ対象に（例えば輸血によって）投与することが含まれる。

【0640】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の同種血輸血には、ドナーから赤血球、網赤血球又は造血幹細胞を単離すること、その細胞を本明細書に記載される方法によってレシーバーと接触させて好適な合成膜－レシーバー複合体を作成すること、及びその合成膜－レシーバー複合体をドナーとは異なる対象に（例えば輸血によって）投与することが含まれる。輸血に同種細胞が使用される場合、適合性ＡＢＯ血液型を使用して、補体活性化及び不適合赤血球の溶解によって特徴付けられる急性血管内溶血性輸血反応を防ぐように注意を払う必要がある。ＡＢＯ血液型は、血液型抗原Ａ及びＢが存在するか否か、赤血球の表面上の糖タンパク質及び糖脂質類に関連するオリゴ糖鎖の末端に見られる単糖糖鎖構造に基づき定義される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４－４６４（２００７）にレビューされている）。Ｏ型赤血球はこれらの抗原性単糖構造のいずれをも欠いている。Ａ型赤血球の対象は、Ｂ型赤血球に対する天然に存在する抗体を有し、一方、Ｂ型赤血球の対象は、Ａ型赤血球に対する抗体を有する。血液型ＡＢの対象はいずれの抗体も有さず、及び血液型Ｏの個体は両方を有する。抗Ａ抗体及び／又は抗Ｂ抗体のいずれかを有する対象は、対応する抗原を含有する血液の輸血を受けることができない。Ｏ型赤血球はＡ抗原もＢ抗原も含まないため、いずれのＡＢＯ血液型のレシピエントにも、例えば、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、又はＯ型レシピエントに安全に輸血することができる。Ｏ型赤血球は万能と考えられ、あらゆる輸血に使用し得る。対照的に、Ａ型赤血球はＡ型及びＡＢ型レシピエントに提供することができ、Ｂ型赤血球はＢ型及びＡＢ型レシピエントに提供することができ、及びＡＢ型赤血球はＡＢ型レシピエントにのみ提供することができる。赤血球又はその前駆体をレシーバーと接触させることによって合成膜－レシーバー複合体が作成される実施形態では、供給源となる赤血球又はその前駆体は、レシピエントと適合するようにマッチングされる。場合によっては、非Ｏ型赤血球を含む合成膜－レシーバー複合体を万能血液型に変換することが有益であり得る。Ａ型及びＢ型赤血球の表面上にある免疫優性単糖類の酵素的除去を用いて、Ｏ型様合成膜－レシーバー複合体の集団を作成し得る（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４－４６４（２００７）を参照）。Ｂ型合成膜－レシーバー複合体は、生コーヒー豆に由来するα－ガラクトシダーゼを使用して変換し得る。それに代えて又は加えて、Ｅ．メニンゴセプチカム（Ｅ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌に由来するα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ及びα－ガラクトシダーゼ酵素活性を使用して、それぞれ免疫優性Ａ抗原及びＢ抗原を（合成膜－レシーバー複合体上に存在する場合には）除去し得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４－４６４（２００７））。一例では、本明細書に記載されるとおり単離した濃厚赤血球をα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ及びα－ガラクトシダーゼ（約３００μｇ／ｍｌ濃厚赤血球）のいずれかの存在下に２００ｍＭグリシン（ｐＨ６．８）及び３ｍＭ ＮａＣｌ中、２６℃で６０分間インキュベートする。処理後、赤血球を生理食塩水で遠心して３～４回リンスすることによって洗浄し、標準的な血液バンキング技術によってＡＢＯ型を決定する。

【0641】

具体的な実施形態において、本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は以下の方法で作成し得る。初めに、赤血球系前駆細胞を単離する。或いは、これらの細胞は患者の自己細胞であるか、又は実質的に万能なドナー血液由来であってもよい。例えば、細胞は、ＡＢＯ型Ｏ、リーサス因子Ｒｈ ｒ／ｒ、ダッフィ－／－、及び大型Ｋｅｌｌ抗原Ｋ１陰性であってもよい。赤血球系前駆細胞から赤血球系細胞への分化の過程で、レシーバーをコードする外因性核酸が導入される。このレシーバーをコードする外因性核酸は、ＧＡＴＡ－１プロモーターなどの赤血球特異的プロモーターの制御下にあり得る（例えば、Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５，１４０：２３０を参照）。レシーバーをコードする外因性核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法で、例えばプラスミドＤＮＡ、ウイルス、又はｍＲＮＡとして導入することができる。核酸導入は、種々の標準方法、例えば、トランスフェクション、形質導入、又は電気穿孔によって達成することができる。

【0642】

具体的な実施形態において、本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は、血小板をレシーバーと接触させることによって作成し得る。成人ヒトは、毎日２×１０^１１個の赤血球、及び約半分の白血球及び血小板を産生する。ヒトでは略全ての血液細胞産生が赤色髄で起こり、赤色髄は、各系列に関係した造血幹細胞、中間レベルの前駆体及び成熟細胞を含む階層的な発生系に相当する。

【0643】

主要な血液細胞型はいずれも、それらの初期発生段階を通じて同様の形態であるが、血小板産生に関係する細胞である巨核球は、他の多くの骨髄及び血液細胞の直径の１０倍のサイズに成長し、且つ通常の染色体補体の最大１２８倍を含有する、芽細胞の分化レベルを超えた明らかな構造的及び機能的逸脱によって特徴付けられ、これらの細胞は血小板を生じる。一連の通常の細胞分裂を経た後、発生中の巨核球前駆体は、短時間（約１時間）のＧ１期と、典型的な（７時間）Ｓ期と、極めて短時間（約４５分）のＧ２期と、続く核内有糸分裂期（中断するＭ期）とによって特徴付けられるユニークな細胞周期に入る。細胞に高倍数性の核が発達すると、細胞にはまた、細胞質の断片化に必要な分画膜も発達する。このイベントには、糖タンパク質ＧＰＩＩｂＩＩＩａ（血小板フィブリノゲン受容体；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２４：６６０－９，１９９６）及びＧＰＩｂ（フォン・ヴィリブランド（Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄ）因子受容体；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６８－５７１，１９９４）、顆粒であって、ＡＤＰ、セロトニン、－トロンボグロブリンを含有する顆粒、及び成熟血小板機能に不可欠な他の物質の発現が付随する。最後に、高倍数性の巨核球が細胞質の分割を起こし、数千個の血小板が放出される（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８５：４０２－４１３，１９９５；Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８９：２３３６－２３４６，１９９７）。

【0644】

全ての血液細胞前駆体と同様に、巨核球は、広範な自己複製能又は血液のあらゆる成分への分化能を保持している多能性骨髄幹細胞から生じる。血小板産生は、一部には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）とその細胞受容体ＴＰＯＲ／ＭＰＵｃ－ＭＰＬとが相互作用して誘導されるシグナル伝達機構によって調節される。

【0645】

トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、巨核球形成及び血小板産生の刺激に関与する造血成長因子である。ＴＰＯは肝臓及び腎臓で発現し、血小板要求量に応じて骨髄微小環境でその発現が下方調節され得る（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１６：３２２－３２８，１９９８；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８６：３６６８－３６７５，１９９５）。ＴＰＯ発現は主として構成的であるため、ＴＰＯレベルは血小板による隔絶によって調節されると考えられる（Ｆｉｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８７：２１５４，１９９６）。

【0646】

ＴＰＯをコードする遺伝子はクローニングされ、特徴付けられている（Ｋｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１１１０４－１１１０８，１９９４；Ｂａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７７：１１１７－１１２４，１９９４；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５６８－５７１，１９９４；Ｗｅｎｄｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５７１－５７４，１９９４、及びｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９：５３３－５３８，１９９４）。ヒトＴＰＯ（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡは３５３アミノ酸長のポリペプチドをコードする。シグナルペプチドの切断後に哺乳類細胞から分泌される完成長ｈＴＰＯは、３３２アミノ酸からなる。このタンパク質の予測分子質量は３８ｋＤであるが、組換え細胞からの血清中又は培養液中の材料の計測から報告されている分子質量は１８ｋＤ～８５ｋＤで異なる（グリコシル化、及び翻訳後タンパク質分解プロセシング）。

【0647】

ＴＰＯ（ＴＰＯＲ／ＭＰＬ／ｃ－ＭＰＬ）に対する細胞表面受容体は、汎骨髄性障害を引き起こすことが示されている骨髄増殖性白血病ウイルス（ＭＰＬＶ）のエンベロープタンパク質ｖ－ｍｐｌの相同体である癌原遺伝子ｃ－ｍｐｌの産物である（Ｗｅｎｄｌｉｎｇ，Ｖｉｒｏｌ．，１４９：２４２－２４６，１９８６）。ヒトｃ－ｍｐｌ遺伝子は、７１ｋＤの予測分子量を有する６３５アミノ酸のタンパク質をコードする（Ｖｉｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５６４０－４４，１９９２；Ｍｉｇｎｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０：５－１２，１９９４）。

【0648】

ＴＰＯ又はその受容体（ＴＰＯＲ／ＭＰＬ／ｃ－ＭＰＬ）のいずれかの発現をヌルにされたマウスは、重度の血小板減少性の表現型を示す（Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：１４４５，１９９４；Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：１６８３，１９９５；ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：６５１，１９９６）。

【0649】

複数のサイトカイン（例えば、幹細胞因子［ＳＣＦ］、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、白血病抑制因子［ＬＩＦ］、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ｋｉｔリガンド、及び－インターフェロン）が、血小板新生活性を有することが示されている。

【0650】

得られる血小板は小さい円盤形の細胞断片であり、これは血管損傷部位に遭遇すると急速な形質転換を起こす。血小板はより球状になり、偽足を突き出し、そのフィブリノゲン受容体が活性されて凝集が起こると共に、血小板はその顆粒含有物を放出し、最終的には一次止血に関与する血栓を形成する（Ｓｉｅｓｓ，Ｗ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：５８－１７８，１９８９）。血小板の活性化はまた、不安定狭心症、心筋梗塞及び脳卒中の病因に関与するともされている（Ｐａｃｋｈａｍ，Ｍ．Ａ．，Ｃａｎ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７２：２７８－２８４）。

【0651】

血小板の活性化には、内皮下表面に露出しているコラーゲン、凝固カスケードによって生成されるトロンビン、並びに活性化した血小板から放出されるトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ_２）及びＡＤＰなどの幾つかの生理的物質が関わる。コラーゲンは、インテグリンα２β１を含む幾つかの血小板膜タンパク質に結合して、ＴＸＡ_２及びＡＤＰの放出による血小板の活性化をもたらす（Ｓｈａｔｔｉｌ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：６９５－７０４，１９９４）。対照的に、トロンビン、ＴＸＡ_２、及びＡＤＰはＧタンパク質共役受容体を直接活性化し、血小板凝集及び顆粒放出を誘導する（Ｈｏｕｒａｎｉ，Ｓ．Ｍ，ａｎｄ Ｃｕｓａｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４３：２４３－２９８，１９９１）。血小板活性化に関わる主要なイベントは、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）のβ－アイソフォームが活性化する結果であると考えられ、これはイノシトール１，４，５三リン酸及びジアシルグリセロールの生成をもたらす。血小板は主に２つのアイソフォーム、ＰＬＣ－β２及びＰＬＣ－β３を含む。

【0652】

血小板粘着及び凝集を媒介する血小板受容体は、２つの主要な血小板表面糖タンパク質複合体上に位置する。これらの複合体は、糖タンパク質Ｉｂ－ＩＸ複合体（これはフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）との結合によって血小板粘着を促進する）、及び糖タンパク質ＩＩｂ－ＩＩＩａ複合体（これはフィブリノゲンに結合することによって血小板を連結して凝集体となる）である。先天性出血性障害であるベルナール・スーリエ症候群の患者は、ｖＷＦを結合する糖タンパク質Ｉｂ－ＩＸ複合体の欠損に起因する不十分な血小板粘着、軽度血小板減少症、及び大型リンパ様血小板を示す。

【0653】

糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）は、主要な（約１２，０００分子／血小板）、高度にグリコシル化された血小板膜タンパク質（分子量８２，０００）である。血小板がトロンビンに曝露されると、ＧＰＶｆｌと呼ばれる６９ｋＤａの可溶性断片が遊離する。ＧＰＶはＧＰＩｂ－ＩＸ複合体（ＧＰＩｂ（１４５ｋＤａのタンパク質ＧＰＩｂαが２４ｋＤａのタンパク質ＧＰＩｂβとジスルフィド結合したものからなる）とＧＰＩＸ（２２ｋＤａのタンパク質）との非共有結合性の会合によって形成される複合体）と非共有結合的に相互作用することができる。ＧＰＩｂ－ＩＸ複合体上のフォン・ヴィレブランド因子の結合部位及びトロンビンの結合部位の位置がＧＰＩｂα上に特定されている。ここでトロンビンは、Ｇタンパク質共役受容体であるトロンビン受容体（Ｖｕ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６４：１０５７－１０６８（１９９０））を切断することによって血小板を活性化することが分かっているため、トロンビンがＧＰＶを切断するのはトロンビンがＧＰＩｂαに結合する結果として偶発的であるのかどうか、又はこの切断に生理学的役割があるのかどうかは不明である。ＧＰＩＢα、ＧＰＩＢβ、及びＧＰＩＸは１つ以上の相同な２４アミノ酸ロイシンリッチドメインを含む。これらのドメインはまた、大型のロイシンリッチ糖タンパク質（ＬＲＧ）ファミリーにも見られる。

【0654】

ＧＰＶは、巨核球細胞系統のマーカーである。ＧＰＶに特異的なモノクローナル抗体（ＳＷ１６）は、赤血球、白血球、内皮細胞、又は血小板巨核球マーカーを発現することが知られるＨＥＬ又はＭＥＧ－０１などの細胞株には結合しない。

【0655】

成熟ＧＰＶは、単一の膜貫通ドメインと、短い細胞質ドメイン（１６残基）と、８個の潜在的なＮ－グリコシル化部位を有する大きい細胞外ドメインとを含有する５４３アミノ酸を含む。細胞外ドメインの分析から、ＧＰＩｂαと相同性を有する２４アミノ酸の１５個のタンデムなＬｅｕリッチリピートの存在が明らかにされ、フィブリノゲンのＡα鎖と相同性を有するＣ末端近傍のトロンビンの切断部位が同定された。

【0656】

培養
本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を作成するための供給源には、赤血球系細胞などの循環細胞が含まれる。好適な細胞供給源は、本明細書に記載されるとおり対象から単離するか、患者由来の造血前駆細胞又は赤血球前駆細胞からか、固定化した赤血球系細胞株から誘導するか、又は任意選択で培養して分化させた人工多能性幹細胞から誘導し得る。細胞培養技法を用いて赤血球を生成する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１３，ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ３、又はＫｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８：ｅ５９８９０である。プロトコルは、成長因子、出発細胞株、培養期間、及び得られる細胞を特徴付ける形態学的形質に応じて異なる。培養システムはまた、ドナー輸血の代用となり得る血液製造用に確立されている（Ｆｉｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｂｌｏｏｄ ７３：１００）。最近では、ＣＤ３４＋細胞が網赤血球段階に分化されており、続くヒト対象への輸血が成功した（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１）。

【0657】

本明細書には、赤血球系細胞の培養方法及び赤血球系細胞から得られる合成膜－レシーバー複合体が提供される。赤血球系細胞は、例えばＣＤ３４＋造血前駆細胞（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１８：５０７１）、人工多能性幹細胞（Ｋｕｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８：ｅ５９８９０）、及び胚性幹細胞（Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １：４９９）を含めた造血前駆細胞から培養することができる。前駆細胞を拡大し及び分化させるのに好適な成長因子及び分化因子のカクテルは、当該技術分野において公知である。好適な拡大及び分化因子の例としては、限定はされないが、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＧＭ－ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｆｌｔ３、Ｆｌｔ２、ＰＩＸＹ ３２１、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）が挙げられる。

【0658】

赤血球系細胞は、ＣＤ３４＋細胞などの造血前駆細胞から、多段階培養プロセスで前駆細胞を定義付けられた因子と接触させて培養することができる。例えば、赤血球系細胞は、造血前駆細胞から三段階プロセスで培養することができる。

【0659】

第１のステップは、１～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、１～１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）、及び０．１～１００ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－３（ＩＬ－３）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。この第１のステップは、任意選択で、核ホルモン受容体、例えば、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、又はプレグナンＸ受容体と結合してそれを活性化するリガンドを培養下の細胞に接触させることを含む。これらの受容体に対するリガンドとしては、例えば、コルチコステロイド、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのデキサメタゾン又は１０ｎＭ～１００μＭのヒドロコルチゾン；エストロゲン、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのβ－エストラジオール；プロゲストーゲン、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのプロゲステロン、１０ｎＭ～１００μＭのヒドロキシプロゲステロン、１０ｎＭ～１００μＭの５ａ－ジヒドロプロゲステロン、１０ｎＭ～１００μＭの１１－デオキシコルチコステロン、又は合成プロゲスチン、例えば、１０ｎＭ～１００μＭの酢酸クロルマジノン；アンドロゲン、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのテストステロン、１０ｎＭ～１００μＭのジヒドロテストステロン又は１０ｎＭ～１００μＭのアンドロステンジオン；又はプレグナンＸ受容体リガンド、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのリファンピシン、１０ｎＭ～１００μＭのハイパフォリン、１０ｎＭ～１００μＭのセイヨウオトギリソウ（Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ Ｗｏｒｔ）（ヒペリシン）、又はビタミンＥ様分子、例えば、１０ｎＭ～１００μＭのトコフェロールが挙げられる。第１のステップはまた、任意選択で、インスリン様分子、例えば、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、又は１～５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子を培養下の細胞に接触させることも含み得る。さらに第１のステップは、任意選択で、０．１～５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを培養下の細胞に接触させることを含み得る。

【0660】

第１のステップは、任意選択で、１つ以上のインターロイキン（ＩＬ）又は成長因子、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、トロンボポエチン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－Ｂ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－Ａ）、巨核球増殖分化因子（ＭＧＤＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及びＦｌｔ３リガンドを培養下の細胞に接触させることを含み得る。各インターロイキン又は成長因子は、典型的には０．１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度で供給し得る。第１のステップはまた、任意選択で、血清タンパク質又は非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１～２０％）、ヒト血漿（１～２０％）、プラスマネート（１～２０％）、ヒト血清（１～２０％）、アルブミン（０．１～１００ｍｇ／ｍＬ）、又はヘパリン（０．１～１０Ｕ／ｍＬ）を培養下の細胞に接触させることも含み得る。

【0661】

第２のステップは、１～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）及び１～１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。この第２のステップはまた、任意選択で、インスリン様分子、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、又は１～５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子を培養下の細胞に接触させることも含み得る。第２のステップは、任意選択で、０．１～５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを培養下の細胞に接触させることをさらに含み得る。第２のステップはまた、任意選択で、血清タンパク質又は非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１～２０％）、ヒト血漿（１～２０％）、プラスマネート（１～２０％）、ヒト血清（１～２０％）、アルブミン（０．１～１００ｍｇ／ｍＬ）、又はヘパリン（０．１～１０Ｕ／ｍＬ）を培養下の細胞に接触させることも含み得る。

【0662】

第３のステップは、１～１００Ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。この第３のステップは、任意選択で、１～１０００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）を培養下の細胞に接触させることを含み得る。第３のステップは、任意選択で、インスリン様分子、例えば、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、１～５０μｇ／ｍＬのインスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、又は１～５０μｇ／ｍＬのメカノ成長因子を培養下の細胞に接触させることをさらに含み得る。第３のステップはまた、任意選択で、０．１～５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリンを培養下の細胞に接触させることも含み得る。第３のステップはまた、任意選択で、血清タンパク質又は非タンパク質分子、例えば、ウシ胎仔血清（１～２０％）、ヒト血漿（１～２０％）、プラスマネート（１～２０％）、ヒト血清（１～２０％）、アルブミン（０．１～１００ｍｇ／ｍＬ）、又はヘパリン（０．１～１０Ｕ／ｍＬ）を培養下の細胞に接触させることも含み得る。

【0663】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体を拡大し及び分化させる方法は、骨髄増殖性受容体（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｍｐｌ）リガンドを含む培地で合成膜－レシーバー複合体を培養することを含まない。

【0664】

この培養プロセスは、任意選択で、当該技術分野において公知の方法によって、１つ以上の遺伝子を活性化し又はノックダウンする分子、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ホルモン、又は小分子を細胞に接触させることを含み得る。標的遺伝子としては、例えば、転写因子、成長因子、又は成長因子受容体をコードする遺伝子を挙げることができ、限定はされないが、例えば、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＣＭｙｃ、ｈＴＥＲＴ、ｐ５３、ＥＰＯ、ＳＣＦ、インスリン、ＥＰＯ－Ｒ、ＳＣＦ－Ｒ、トランスフェリン－Ｒ、インスリン－Ｒが挙げられる。

【0665】

一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、種々の量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦ、及びエリスロポエチンを含有する培養液中に、３つの別個の分化段階で合計２２日間置かれる。

【0666】

一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、種々の量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦ、及びトロンボポエチンを含有する培養液中に、３つの別個の分化段階で合計１４日間置かれる。

【0667】

一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、種々の量のＩＭＤＭ、ＦＢＳ、グルタミン、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦ、及びＧＣＳＦを含有する培養液中に、３つの別個の分化段階で合計１５日間置かれる。

【0668】

組成物
本明細書には、対象への投与に好適な、合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、概して合成膜－レシーバー複合体の集団と薬学的に許容可能な担体とを対象への投与に好適な形態で含む。薬学的に許容可能な担体は、一部には、投与される詳細な組成物によって決まると共に、組成物の投与に用いられる詳細な方法によっても決まる。従って、合成膜－レシーバー複合体の集団を含む医薬組成物の好適な製剤は多種多様である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）を参照）。本医薬組成物は、概して、無菌で実質的に等張性の、且つ米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の全ての規則に完全に準拠したものとして製剤化される。

【0669】

薬学的に許容可能な賦形剤には、動物への使用並びにヒト医薬品としての使用が許容される賦形剤を含めた、概して安全で非毒性の望ましい賦形剤が含まれる。かかる賦形剤は固体、液体、半固体であってもよく、又はエアロゾル組成物の場合には気体であってもよい。

【0670】

担体又は希釈剤の例としては、限定はされないが、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。薬学的に活性な物質におけるかかる媒体及び化合物の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体又は化合物が本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体と不適合である場合を除き、組成物中におけるその使用が企図される。組成物中には補助的治療剤もまた配合され得る。典型的には、医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。合成膜－レシーバー複合体は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内；筋肉内経路によるか又は吸入薬として投与することができる。合成膜－レシーバー複合体は、任意選択で、合成膜－レシーバー複合体が対象とする疾患、障害又は病態の治療に少なくとも部分的に有効な他の治療剤と併用して投与することができる。

【0671】

非経口、皮内、又は皮下適用に用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール類、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌化合物；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調整化合物。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数用量バイアルに封入することができる。

【0672】

注射剤としての使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調合用滅菌粉末を含む。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌でなければならず、且つ容易な通針性が存在する程度に流体でなければならない。組成物は製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、且つ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用を受けることなく保たれなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用し、分散液の場合には要求される粒度を維持し、及び界面活性剤を使用することによって維持し得る。微生物作用の防止は、様々な抗細菌化合物及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現し得る。多くの場合、組成物中に等張化合物、例えば、糖類、多価アルコール類、例えばマニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

【0673】

滅菌注射用溶液は、必要に応じて本明細書に列挙される成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒中に有効量の合成膜－レシーバー複合体を配合することによって調製し得る。概して、分散液は、塩基性分散媒及び他の任意の所望の成分を含有する無菌媒体中に合成膜－レシーバー複合体を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、活性成分に任意の追加的な所望の成分が加わった粉末が、その予め滅菌ろ過した溶液から生じる。合成膜－レシーバー複合体は、合成膜－レシーバー複合体、その１つ又は複数のレシーバー及び／又はその任意選択の１つ又は複数のペイロードの持続放出又はパルス放出が可能となるように製剤化し得るデポー注射又は植込み製剤の形態で投与することができる。

【0674】

経口組成物は、概して不活性希釈剤又は食用担体を含む。経口組成物はゼラチンカプセルに封入してもよく、又は錠剤に圧縮してもよい。経口治療薬の投与には、合成膜－レシーバー複合体は賦形剤と配合して、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤としての使用向けに流体担体を使用して調製することもでき、ここで流体担体中の化合物は口内に適用され、ブクブク回されて吐き出されるか、又は飲み込まれる。組成物の一部として、薬剤適合性を有する結合化合物、及び／又は補助材料を含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分の任意のもの、又は類似した性質の化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、又はコーンスターチなどの崩壊化合物；ステアリン酸マグネシウム又はステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味化合物；又はペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香料などの香味化合物。

【0675】

吸入による投与には、合成膜－レシーバー複合体は、好適な噴射剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器又はディスペンサー、又はネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。

【0676】

合成膜－レシーバー複合体を含む組成物の全身投与もまた、経粘膜的又は経皮的手段によることができる。経粘膜又は経皮投与については、製剤中に、透過を図る関門に適切な浸透剤が使用される。かかる浸透剤は概して当該技術分野において公知であり、例えば経粘膜投与に関して、デタージェント、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔内スプレー又は坐薬を使用して達成することができる。経皮投与には、修飾赤血球は概して当該技術分野において公知のとおり軟膏、軟膏、ゲル、又はクリームに製剤化される。

【0677】

合成膜－レシーバー複合体はまた、直腸送達用の坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリド類などの従来の坐剤基剤を含む）又は停留浣腸の形態の医薬組成物として調製することもできる。

【0678】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、合成膜－レシーバー複合体が対象の体から排出される速度を低下させ得る担体と共に調製される。例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含め、制御放出製剤が好適である。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、及びポリ乳酸など、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販品を入手することもできる。

【0679】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物は、その医薬組成物の利益を受け得る対象に静脈内投与される。他の実施形態において、本組成物は、例えばリンパ内注射、又は節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＰＮＡＳ １０５（４６）：１７９０８を参照）、又は筋肉内注射、皮下投与、胸腺内若しくは肝臓内への直接の注射によってリンパ系に投与される。

【0680】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物は液体懸濁物として投与される。一実施形態において、本医薬組成物は、投与後にデポーを形成する能力を有し、且つ好ましい実施形態では合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を循環中にゆっくりと放出し、又は好ましい実施形態ではデポー形態のまま留まる凝固製剤（ｃｏａｇｕｌａｔｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）として投与される。

【0681】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物は、合成膜－レシーバー複合体の生存能を維持可能な方法及び緩衝組成物を用いて保存される。例えば、嫌気状態を維持するための保存前の酸素除去、ｐＨの操作、代謝前駆体の補充、浸透圧平衡の操作、懸濁媒の容積の増量、及び／又は保護分子を加えることによる酸化的ストレスの低減を用いて、合成膜－レシーバー複合体の生存能を維持することができる。これらの戦略の組み合わせを用いた幾つかの研究において、赤血球の生存能の維持によって６週間を超える保存の延長が可能となったことが報告されている（例えば、Ｙｏｓｈｉｄａ ａｎｄ Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ，Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ ２０１０ ８：２２０を参照）。

【0682】

本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチドの送達には、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤が用いられ得る。賦形剤とは、希釈剤又は媒体として使用される不活性物質を指す。薬学的に許容可能な担体は、一般には化合物と共に使用され、その化合物を治療に有用なもの又は製品として有用なものにする。一般に、任意の物質について、薬学的に許容可能な担体は、対象に送達する物質と組み合わされる材料である。従来の医薬担体、水性、粉末状又は油性基剤、増粘剤などが、必要なもの又は望ましいものであり得る。ある場合には、担体は、例えば不溶性化合物を液体送達用に可溶化するため送達に不可欠である；その活性が保たれるように物質のｐＨを制御する緩衝剤；又は保存容器内における物質の損失を防ぐ希釈剤。しかしながら、他の場合には、担体は利便性を図るものであり、例えば、投与の利便性を高める液体である。本明細書に記載される化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者に公知の方法に従い合成し得る。

【0683】

典型的には、薬学的に許容可能な組成物は夾雑物を含まないように高度に精製され、生体適合性且つ非毒性であり、及び対象への投与に適している。水が担体の一構成成分である場合、その水は、夾雑物、例えばエンドトキシンを含まないように高度な精製及び処理を受ける。

【0684】

薬学的に許容可能な担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／又は鉱油であり得るが、これらに限定されない。本医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／又は保存剤をさらに含み得る。

【0685】

有効レベルのレシーバーを有する合成膜－レシーバー複合体を含有する医薬組成物が提供される。かかる組成物は、複数の合成膜－レシーバー複合体、例えば、１×１０^３個の複合体、又は１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２個、又は１×１０^１２個超の複合体を含有する。具体的な例では、赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバー複合体は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％超の質量対体積比（％ｍ／ｖ）の濃度の生理食塩水中の濃厚赤血球として投与されてもよい。患者への投与時間は１０分～４時間の範囲であるか、又はそれを超えてもよい。

【0686】

具体的な例では、赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバー複合体は、適切な緩衝液、例えば、抗凝固クエン酸デキストロースＡ（ＡＣＤ－Ａ）、クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸リン酸デキストロースデキストロース（ＣＰ２Ｄ）、又はクエン酸リン酸デキストロースアデニン（ＣＰＤＡ－１）などのＦＤＡ承認済みの抗凝固保存溶液中に保存することができる。本組成物は最長２１日間保存し得る。

【0687】

或いは、赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバー複合体は、認可された添加剤溶液、例えば、ＡＳ－１（Ａｄｓｏｌ）、ＡＳ－３（Ｎｕｔｒｉｃｅｌ）、ＡＳ－５（Ｏｐｔｉｓｏｌ）、又はＡＳ－７（ＳＯＬＸ）中に保存することができる。

【0688】

或いは、赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバー複合体は、グリセロール凍結保護溶液中に保存することができる。組成物は凍結して最長１０年間保存し得る。凍結細胞は使用前に解凍し、例えば０．９％塩化ナトリウムによる連続的な洗浄ステップによって脱グリセロール化し得る。

【0689】

本明細書には、レシーバーを含む複数の培養機能性赤血球系細胞を含む組成物及び医薬組成物が提供される。本組成物及び医薬組成物は、例えば抗凝固クエン酸デキストロースＡなどの適切な保存緩衝剤の溶液を含み得る。レシーバーを含む複数の培養機能性赤血球系細胞を含む組成物及び医薬組成物は、例えばＡｄｓｏｌなどの認可された添加剤をさらに含み得る。レシーバーを含む複数の培養機能性赤血球系細胞を含む組成物及び医薬組成物は、凍結保存用にグリセロール凍結保護溶液をさらに含み得る。

【0690】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、別の合成膜－レシーバーポリペプチド複合体と多複合体凝集物、例えば、二量体、三量体、多量体を形成することが可能である。

【0691】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、循環系の構成要素、例えば、赤血球、網赤血球、血小板、マクロファージ、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞と多複合体凝集物、例えば、二量体、三量体、多量体を形成することが可能である。

【0692】

合成膜－レシーバー複合体及びその医薬組成物の投与の用量及び頻度は、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び食事、任意の炎症の重症度、投与時間、及び他の臨床学的要因など、様々な要因に基づき主治医が決定し得る。一例において、静脈内投与は最低限有効な用量で開始し、好ましい効果が観察されるまで、予め選択された時間経過にわたり用量を増加させる。続いて、現れ得る任意の有害作用を考慮しながら、対応する効果の増加が生じるレベルに限定して投薬量を漸増させる。

【0693】

好適な投薬量の非限定的な例は、例えば、１×１０^１０～１×１０^１４、１×１０^１１～１×１０^１３、又は５×１０^１１～５×１０^１２個の合成膜－レシーバー複合体の範囲であり得る。具体的な例としては、約５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２個、又はそれを超える合成膜－レシーバー複合体が挙げられる。合成膜－レシーバー複合体の各用量は、１日１回、週１回、週２回、月１回、又は月２回などの間隔で投与することができる。

【0694】

「複合体基準の比例投薬量」は、循環実体の天然に存在する量に対する相対的な用量として投与される合成膜－レシーバー複合体の数である。循環実体は、細胞、例えば、赤血球、網赤血球、又はリンパ球、又は標的、例えば、抗原、抗体、ウイルス、毒素、サイトカイン等であり得る。単位は１循環実体当たりの合成膜－レシーバー複合体、即ちＳＣＭＲＣ／ＣＥとして定義される。この投薬量単位には、１０^－７、１０^－６、１０^－５、１０^－４、１０^－３、１０^－２、１０^－１、１、１０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９が含まれ得る。

【0695】

本明細書に記載される医薬組成物は、合成膜－レシーバー複合体と任意選択で薬学的に活性な薬剤又は治療剤とを含む。治療剤は、生物学的薬剤、小分子薬剤、又は核酸薬剤であり得る。

【0696】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物を含む剤形が提供される。一部の実施形態において、剤形は静脈内注射用の液体懸濁物として製剤化される。

【0697】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物を保持する容器と対象への医薬組成物の静脈内注射用のアプリケーターとを含む医療器具が提供される。

【0698】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物と対象への医薬組成物の静脈内注射用の医療器具とを含む医療用キットが提供される。

【0699】

合成膜－レシーバー複合体の薬学的に許容可能な懸濁液は、好ましくは約１０～約２５０ｍｌの容積で包装される。包装材料はシリンジ又は輸血に好適なＩＶバッグであってもよい。懸濁液の投与は、任意選択でＩＶバッグからの点滴を使用するなどして例えば静脈内又は動脈内注入によって行われる。投与は典型的には腕に又は中枢カテーテルを介して静脈内に行われる。５０ｍｌを超える投与には、点滴の使用が好ましい。

【0700】

方法及び特性
一部の実施形態において、膜－レシーバー複合体は、前駆体造血細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、赤血球、血小板、巨核球、又は好中球を供給源として使用して作成される。一部の実施形態において、前駆体造血細胞はＧＭＰに準拠した方法によってヒトドナーから単離される。一部の実施形態において、出発細胞は自己ドナーから供給される。一部の実施形態において、出発細胞は同種ドナーから供給される。ドナーは血液細胞抗原多型についてタイピングされてもよく、及び／又はドナーは血液細胞抗原について遺伝子型が同定される。ドナーは万能血液ドナーであってもよい。一部の実施形態において、ドナーはボンベイ表現型を有し、即ちＨ抗原を発現しない。一部の実施形態において、ドナーはＡＢＯ血液型Ｏを有し、且つＲｈ陰性である。

【0701】

一部の実施形態において、膜－レシーバー複合体は、出発物質の供給源としてＣＤ３４＋造血前駆細胞、動員末梢ＣＤ３４＋細胞、又は骨髄由来ＣＤ３４＋細胞を使用して作成される。一部の実施形態において、出発細胞は臍帯血に由来し、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞である。

【0702】

合成膜－レシーバー複合体は培養されてもよい。培養複合体は、卓上スケールからバイオリアクタースケールにスケールアップすることができる。例えば、複合体は、それが飽和密度、例えば１ｍｌ当たり１×１０^５個、１×１０^６個、１×１０^７個、又は１×１０^７個超の複合体に達するまで培養される。任意選択で、飽和密度に達した後、複合体を大容積の新鮮培地に移してもよい。膜－レシーバー複合体はバイオリアクター、例えばＷａｖｅ型バイオリアクター、撹拌槽型バイオリアクターで培養し得る。様々な構成のバイオリアクターが当該技術分野において公知であり、必要に応じて好適な構成を選択し得る。合成膜－レシーバー複合体の集団の培養及び／又は拡大に好適な構成は、当業者であれば過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。バイオリアクターには酸素を送り込むことができる。バイオリアクターは、任意選択で、１つ以上のインペラ、再循環流、培地注入流、並びに培地及び栄養素の流入を調節し又は培地、栄養素、及び廃棄物の流出を調節する制御構成要素を含み得る。

【0703】

一部の実施形態において、バイオリアクターは、培養プロセスの間にその細胞内ＤＮＡをシェディングするレシーバーを含むヒト機能性赤血球系細胞の集団を含み得る。例えば、バイオリアクターは、培養後にヒト赤血球系細胞、除核赤血球系細胞、及びピレノサイトの集団を含み得る。具体的な実施形態において、ヒト赤血球系細胞及び除核赤血球系細胞はレシーバーを含み、レシーバーは除核赤血球系細胞によって保持されるが、一方、レシーバーをコードする外因性核酸は除核細胞によっては保持されない。特定の実施形態において、レシーバーを含む除核機能性赤血球系細胞は、対応する単離非修飾非培養赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を呈する。

【0704】

一実施形態において、バイオリアクターで赤血球系細胞又は赤血球系細胞前駆体から作成される合成膜－レシーバー複合体の集団は、１４日間以上で２０，０００倍超の総拡大を起こす。一部の実施形態において、レシーバーは、培養された又は新鮮に単離された赤血球系細胞前駆体に導入され、及びレシーバーをコードする外因性核酸の導入後、バイオリアクターで赤血球系細胞前駆体から作成される合成膜－レシーバー複合体の集団は、バイオリアクターで前駆細胞から２０，０００倍超拡大する。

【0705】

一部の実施形態において、バイオリアクターはＷａｖｅバイオリアクター又はインペラ駆動撹拌機である。バイオリアクターはスパージャを用いて曝気され得る。一実施形態において、バイオリアクターは使い捨てである。一実施形態において、バイオリアクターはＣＩＰ（定置洗浄）である。本明細書に記載されるとおりのバイオリアクター設定で得られ得る合成膜－レシーバー複合体の最終的な複合体数は、１０^９個超、１０^１０個、１０^１１個、１０^１２個、１０^１３個又は１０^１３個超の複合体であり得る。培養中、血球計のカウント又は６００ｎｍの光学濃度の読取りによって細胞密度を計測することにより、合成膜－レシーバー複合体の密度をモニタし得る。任意選択で、培養プロセスは、ｐＨレベル、酸素化、撹拌速度、及び／又は再循環速度に関してモニタする。

【0706】

膜－レシーバー複合体のアイデンティティはインビトロアッセイによって評価することができる。例えば、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、集団中の複合体の数を、例えば、顕微鏡法によるか、フローサイトメトリーによるか、又は血球計算によって計数して評価する。それに代えて又は加えて、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えばフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、質量分析法、又は吸光度分光法によって複合体のタンパク質含量を分析して評価する。一実施形態において、アッセイするタンパク質含量は、非表面タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質、ヘモグロビン、成人ヘモグロビン、胎児ヘモグロビン、胚ヘモグロビン、細胞骨格タンパク質である。一実施形態において、アッセイするタンパク質含量は、表面タンパク質、例えば、分化マーカー、受容体、共受容体、輸送体、糖タンパク質である。一実施形態において、表面タンパク質は、限定はされないが、グリコホリンＡ、ＣＫＩＴ、トランスフェリン受容体、バンド３、Ｋｅｌｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＲ１を含むリストから選択される。一部の実施形態において、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えばフローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、質量分析法、又は吸光度分光法によって複合体のレシーバー含量を分析して評価する。例えば、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えばＲＴ－ＰＣＲ、フローサイトメトリー、又はノーザンブロットによって複合体のｍＲＮＡ含量で評価することができる。膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えば核染色又は核酸プローブを使用した、例えばフローサイトメトリー、顕微鏡法、又はサザンブロットによって核物質含量で評価することができる。それに代えて又は加えて、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えばフローサイトメトリー、液体クロマトグラフィーによるか、又は質量分析法によって複合体の脂質含量で評価する。

【0707】

一部の実施形態において、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えば質量分析法、化学発光、蛍光分光法、吸光度分光法によって複合体の代謝活性で評価する。代謝活性はＡＴＰ消費速度によって評価することができ、及び／又は代謝活性は、合成膜－レシーバー複合体中の２，３－ジホスホグリセレート（２，３－ＤＰＧ）レベルを計測して評価する。代謝活性は、以下に挙げるもの、即ち、限定はされないが、アセチルサリチル酸、Ｎ－アセチルシステイン、４－アミノフェノール、アザチオプリン、ブノロール、カプトプリル、クロルプロマジン、ダプソーン、ダウノルビシン、デヒドロエピアンドロステロン、ジダノシン、ドーパミン、エピネフリン、エスモロール、エストラジオール、エストロン、エトポシド、ハロペリドール、ヘロイン、インスリン、イソプロテレノール、硝酸イソソルビド、ＬＹ ２１７８９６、６－メルカプトプリン、ミソニダゾール、ニトログリセリン、ノルエピネフリン、パラアミノ安息香酸のうちの１つの代謝速度として評価することができる。一部の実施形態において、膜－レシーバー複合体のアイデンティティは、例えば質量分析法、化学発光、蛍光分光法、又は吸光度分光法によって、基質を複合体で分配して評価する。基質は、以下に挙げるもの、即ち、限定はされないが、アセタゾラミド、アルブチン、ブメタミド（Ｂｕｍｅｔａｍｉｄｅ）、クレアチニン、ダルスチン（ｄａｒｓｔｉｎｅ）、デスエチルドルゾラミド、ジゴキシゲニンジギトキソシド、ジゴキシン－１６’－グルクロニド、エピネフリン、ゲンタマイシン、馬尿酸、メトホルミン、ノルエピネフリン、ｐ－アミノ馬尿酸、パパベリン、ペニシリンＧ、フェノールレッド、セロトニン、スルホサリチル酸、タクロリムス、テトラサイクリン、ツカレソール、及びバンコマイシンのうちの１つであり得る。

【0708】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は前駆体細胞又は複合体から分化する。この実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団の分化状態はインビトロアッセイによって評価する。インビトロアッセイには、限定はされないが、拡大速度、数、タンパク質含量又は発現レベル、ｍＲＮＡ含量又は発現レベル、脂質含量、基質の分配、触媒活性、又は代謝活性を含めた、複合体のアイデンティティの評価に関して本明細書に記載されるものが含まれる。

【0709】

一部の実施形態では、膜－レシーバー複合体が培養され、培養プロセスの過程にわたって複数の時点で複合体の分化状態が評価される。

【0710】

合成膜－レシーバー複合体は、出発物質の供給源として網赤血球を使用して作成し得る。顕微鏡法を用いて単離網赤血球の純度を評価してもよく、ここで網赤血球は、ニューメチレンブルー又はブリリアントクレシルブルーなどの特定の染色によって顕微鏡下で可視化されるリボソームＲＮＡの網状（メッシュ様）ネットワークによって特徴付けられる。トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の表面発現もまた網赤血球上で高く、赤血球に成熟するに従い減少するため、抗ＣＤ７１抗体を使用した網赤血球集団の濃縮及び分析が可能である（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ７１マイクロビーズ、製品添付文書番号１３０－０４６－２０１を参照）。或いは、クレアチン及びヘモグロビンＡ１Ｃ含量及びピルビン酸キナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素活性の分析を用いて、成熟赤血球に対する単離網赤血球の特性を評価してもよい（例えば、Ｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７６：２３９７－２４０３（１９９０）を参照）。例えば、成熟赤血球と比べて網赤血球ではポルホビリノーゲンデアミナーゼの活性が約９倍高く、一方、ヘモグロビンＡ１Ｃ含量は約１０分の１である。

【0711】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の作成に好適な細胞は、１つ以上の幹細胞からエキソビボ及び／又はインビボで分化するものである。一実施形態において、１つ以上の幹細胞は１つ以上の造血幹細胞である。培養造血幹細胞がエキソビボで網赤血球及び赤血球に分化したことは、例えば、顕微鏡法、血液学、フローサイトメトリー、変形能計測、酵素活性、及びヘモグロビン分析及び機能特性を含め、様々なアッセイを実施して確認し得る（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９－７４（２００５））。培養造血幹細胞の表現型は、例えばクレシルブリリアントブルーで染色した細胞の顕微鏡法を用いて評価し得る。例えば、網赤血球はこれらの染色条件下でリボソームＲＮＡの網状ネットワークを呈するが、一方、赤血球には染色がない。除核細胞もまた、例えばＸＥ２１００オートマット（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、平均赤血球容積（ＭＣＶ；フェムトリットル（ｆＬ））、平均赤血球血色素濃度（ＭＣＨＣ；％）及び平均赤血球血色素量（ＭＣＨ；ｐｇ／細胞）を含めた標準的な血液学的変数に関してモニタし得る。

【0712】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、それらの基本的な物理的特性、例えば、サイズ、質量、容積、直径、浮力、密度、及び膜特性、例えば、粘度、変形能の変動、及び流動性に関して評価される。

【0713】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の直径は、顕微鏡法によるか、又は自動計測手段、例えば血液分析機器によって計測される。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の直径は約１～２０ミクロンである。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の直径は少なくとも１つの寸法において約１～２０ミクロンである。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の直径は約１ミクロン未満である。一実施形態において、１つの寸法における複合体の直径は約２０ミクロン超である。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の直径は、約１ミクロン～約２０ミクロン、約２ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約２０ミクロン、約４ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約２０ミクロン、約６ミクロン～約２０ミクロン、約５ミクロン～約１５ミクロン又は約１０ミクロン～約３０ミクロンである。

【0714】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の平均赤血球容積は血液分析機器を使用して計測される。一実施形態において、複合体の平均赤血球容積の容積は１０ｆＬ超、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、又は１５０ｆＬ超である。一実施形態において、複合体の平均赤血球容積は３０ｆＬ未満、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ、又は２００ｆＬ未満である。一実施形態において、複合体の平均赤血球容積は８０～１００フェムトリットル（ｆＬ）である。

【0715】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の平均浮遊質量（ｐｇ／細胞）は、懸濁マイクロチャネル共振器又は二重懸濁マイクロチャネル共振器を使用して計測される（例えば、Ｂｙｕｎ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２０１３ １１０（１９）：７５８０及びＢｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１４ １４（３）：５６９を参照）。

【0716】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の乾燥密度はＨ２Ｏ－Ｄ２Ｏ交換アッセイで浮遊質量によって計測される（例えば、Ｆｅｉｊｏ Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８（７）：ｅ６７５９０を参照）。

【0717】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、空間光干渉顕微鏡法（ＳＬＩＭ）によって計測するとき、１０ｍｒａｄ超、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は１００ｍｒａｄ超の標準偏差の平均膜変形能変動を有する（例えば、Ｂｈａｄｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４，４：６２１１を参照）。

【0718】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団の平均膜粘度は、粘度依存性量子収量フルオロフォアと共にインキュベートしたときの平均蛍光の検出によって計測される（例えば、Ｈａｉｄｅｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ ２００１ ８（２）：１２３を参照）。

【0719】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の膜流動性は、例えば、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダーを用いた蛍光偏光によって計測される。

【0720】

例えば、変形能を計測するには、培養１５日目に網赤血球を例えば白血球除去フィルタ（例えばＬｅｕｃｏｌａｂ ＬＣＧ２、Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）に通過させて有核細胞と分離し、続いてエクタサイトメトリーを使用してアッセイし得る。除核細胞を４％ポリビニルピロリドン溶液に懸濁し、次に６０から４５０ｍｏｓＭへの漸増浸透圧勾配に曝露する。細胞のレーザー回折パターン（変形能指数）の変化が容量オスモル濃度の関数として記録され、それにより細胞膜の動的変形能を評価する。生理学的に有意味な容量オスモル濃度で達成された最大変形能指数が、赤血球の平均表面積と関係付けられる。

【0721】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体がヘモグロビン含量に関して分析される。ヘモグロビンのアッセイを用いて分化細胞の表現型を評価し得る（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６９－７４（２００５））。例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｖａｒｉａｎｔ ＩＩ Ｈｂアナライザー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて種々のヘモグロビン画分の割合を評価し得る。酸素平衡は、二波長分光光度計（例えば、Ｈｅｍｏｘアナライザー、ＴＣＳ）による連続的な方法を用いて計測し得る。ヘモグロビンの結合特性は、閃光光分解を用いて評価し得る。この方法では、５３２ｎｍの１０ナノ秒パルスによる光分解後、ＣＯと細胞内ヘモグロビン四量体の再結合が４３６ｎｍで分析される。

【0722】

本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体は、必要であれば製造後に精製することができる。多くの好適な精製方法が当該技術分野において公知である。例えば、合成膜－レシーバー複合体は、遠心、磁気泳動、照射、音響泳動、及び化学的又は物理的除核によって精製される。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、例えば間質細胞共培養によるエキソビボ成熟によって精製される。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、複合体の化学処理又は酵素処理、例えば脱グリコシル化酵素で処理することによって精製される。

【0723】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、膜－レシーバーポリペプチド複合体の任意の残存する複製能を無能化することにより精製される。一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が放射線、例えば、Ｘ線、ガンマ線、β粒子、α粒子、中性子、陽子、元素核、紫外線に曝され、残存する複製コンピテントの核酸に損傷が与えられる。

【0724】

電離放射線は、Ｘ線、ガンマ線、β粒子（高速電子）、α粒子（ヘリウム原子の核）、中性子、陽子、及び他の重イオン、例えば、アルゴン、窒素、炭素、及び他の元素の核によって伝達されるエネルギーである。Ｘ線及びガンマ線は光と同様に電磁波であるが、そのエネルギーは光と比べてはるかに高い（その波長がはるかに短い）。紫外（ＵＶ）光は、細胞に損傷を与えることのできる中間エネルギーの放射線であるが、紫外光は原子又は分子に電離（電子の喪失）を生じさせるのでなく、むしろ励起（電子のエネルギーレベルの変化）を生じさせる点で上述の電磁放射線の形態とは異なる。他の形態の放射線－粒子－は、負電荷であるか（電子）、正電荷であるか（陽子、α線、及び他の重イオン）、又は電気的に中性である（中性子）かのいずれかである。

【0725】

放射線誘発性の電離は、細胞成分分子に直接作用するか、又は水分子に間接的に作用して、水由来のラジカルを生じさせる。ラジカルは極めて短時間で隣接分子と反応し、影響を受けた分子に化学結合の切断又は酸化（酸素原子の付加）をもたらす。細胞における主な効果は、ＤＮＡ切断である。ＤＮＡは一対の相補的な二本鎖からなるため、単一の鎖或いは両鎖の切断が起こり得る。しかしながら、両鎖の切断は生物学的に一層重要であると考えられる。ほとんどの一本鎖切断は、通常はＤＮＡ分子の二本鎖の性質のために修復され得る（それらの２本の鎖が互いを補完し合い、そのためインタクトな鎖がその損傷を受けた逆鎖を修復するための鋳型として機能し得る）。しかしながら二本鎖切断の場合、修復はより困難であり、切断された末端の誤った再結合が起こり得る。こうしたいわゆる修復誤りは、突然変異、染色体異常、又は細胞死が誘導される原因となる。

【0726】

ＤＮＡセグメントの欠失は、照射を生き残った細胞における放射線損傷の主要な形態である。これは、（１）２つの外側端の結合及び切断間の断片の喪失を伴うＤＮＡ分子における２つの別個の二本鎖切断の修復誤り、又は（２）１つの二本鎖切断を修復する再結合前の切断端のクリーニングプロセス（ヌクレオチド（ＤＮＡの構成要素分子）の酵素消化）によって引き起こされ得る。

【0727】

放射線はその構成物（電子、陽子、中性子等）が異なるのみならず、そのエネルギーもまた異なる。飛跡に沿って高密度電離を発生させる放射線（中性子など）は高線エネルギー付与（高ＬＥＴ）放射線と称され、これは、飛跡の単位長さ当たりに放出される平均エネルギーを記述する物理的パラメータである（添付の図を参照）。低ＬＥＴ放射線は、その飛跡に沿ってあくまでも粗い密度で、ひいては細胞内で略均一に電離を発生させる。放射線量は、生物学的材料の単位当たりのエネルギーの量（例えば、１細胞当たりの電離の数）である。従って、高ＬＥＴ放射線は低ＬＥＴ放射線－Ｘ線及びガンマ線など－と比べて生物学的材料を破壊する能力が高く、なぜなら同じ線量では、低ＬＥＴ放射線は細胞内で同数のラジカルをより粗い密度で生じさせる一方、高ＬＥＴ放射線－中性子及びα粒子など－は、そのエネルギーのほとんどを細胞の小さい領域に付与するためである。高ＬＥＴ放射線からの高密度電離によって生じる限局的なＤＮＡ損傷は、低ＬＥＴ放射線からの粗い密度の電離によって生じる拡散したＤＮＡ損傷と比べて修復が困難である。

【0728】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団は、１ｋＧｙ超、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１００ｋＧｙ超の照射線量を使用するγ線照射に供される。

【0729】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の集団は、０．１ｍＳｖ超、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、又は１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用するＸ線照射に供される。

【0730】

合成膜－レシーバー複合体の集団の純度は、集団の均一性を計測することによって評価し得る。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の平均分布幅は血液分析機器で計測される。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、１０超、１００、１０００、１０^４、１０^５、１０^６、又は１０^６超の網赤血球対非網赤血球比を有する。合成膜－レシーバー複合体の集団の均一性は、集団の間質細胞含量を計測することによって評価し得る。一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体の集団は１ｐｐｂ未満の間質細胞を有する。それに代えて又は加えて、合成膜－レシーバー複合体の集団の均一性は、集団のウイルス価及び／又は細菌コロニー形成能を計測することによって評価する。

【0731】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団の均一性はインビトロアッセイによって評価される。インビトロアッセイには、限定はされないが、拡大速度、数、タンパク質含量又は発現レベル、ｍＲＮＡ含量又は発現レベル、脂質含量、基質の分配、触媒活性、又は代謝活性を含めた、複合体のアイデンティティの評価に関して本明細書に記載されるものが含まれる。

【0732】

合成膜－レシーバー複合体の作成に使用される成熟赤血球は、様々な方法、例えば、細胞洗浄機、連続フローセルセパレーター、密度勾配分離法、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ免疫磁気除去法（ＭＡＣＳ）、又はこれらの方法の組み合わせを用いて単離し得る（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１０８１－１０８２（１９８７）；Ｂａｒ－Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７７１９－１７７２３（１９８７）；Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３２：１４７０－１４７６（２００７）を参照）。

【0733】

赤血球は、単純な遠心によって全血から単離してもよい（例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１０８１－１０８２（１９８７）を参照）。例えば、ＥＤＴＡ抗凝固処理全血を８００×ｇ、４℃で１０分間遠心してもよい。多血小板血漿及びバフィーコートを除去し、赤血球を等張食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）で３回洗浄する。

【0734】

或いは、赤血球は、様々な分離媒体、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ、又はそれらの組み合わせなどによる密度勾配遠心法を用いて単離してもよい。例えば、所定容積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を等容積のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１１１９の上に層状に重ねる。そのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅの上に等容積の等張食塩水（ＮａＣｌ、９ｇ／Ｌ）中に１：１希釈したＥＤＴＡ抗凝固処理全血を層状に重ね、この試料を７００×ｇ、室温で３０分間遠心する。これらの条件下では、顆粒球が１０７７／１１１９界面に移動し、リンパ球、他の単核細胞及び血小板が血漿／１０７７界面に留まり、及び赤血球がペレット化される。赤血球を等張食塩水で２回洗浄する。

【0735】

或いは、赤血球は、Ｐｅｒｃｏｌｌステップ勾配を用いて遠心により単離してもよい（例えば、Ｂａｒ－Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７７１９－１７７２３（１９８７）を参照）。例えば、７５ｍＭクエン酸ナトリウム及び３８ｍＭクエン酸を含有する抗凝固薬溶液を新鮮な血液と混合し、細胞をＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で素早く洗浄する。α－セルロース及びＳｉｇｍａｃｅｌｌ（１：１）の混合物で吸着して白血球及び血小板を取り除く。Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ロータにおける２５００ｒｐｍで１０分間の４５／７５％Ｐｅｒｃｏｌｌステップ勾配での遠心によって、赤血球を網赤血球及び残留白血球からさらに単離する。赤血球はペレットとして回収され、一方、網赤血球バンドが４５／７５％界面にあり、及び残留白血球バンドが０／４５％界面にある。Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水で数回洗浄することにより、赤血球からＰｅｒｃｏｌｌを取り除く。赤血球を単離するための密度勾配の作成に使用し得る他の材料としては、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）、水中６０％イオジキサノール溶液（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄから）が挙げられる。

【0736】

赤血球は、例えばフローサイトメトリーを用いて網赤血球と分離してもよい（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｌ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３２：１４７０－１４７６（２００７）を参照）。この場合、全血を遠心して（５５０×ｇ、２０分、２５℃）、細胞を血漿と分離する。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水溶液に再懸濁し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（１．０７７密度）で例えば遠心によって（４００×ｇ、３０分、２５℃）さらに分画して赤血球を白血球と分離する。得られた細胞ペレットは、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩに再懸濁し、例えばＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）などのＦＡＣＳ機器でサイズ及び粒度に基づき選別する。

【0737】

赤血球は、免疫磁気除去法によって単離してもよい（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ，ｅｌ ａｌ．，（２００７）Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２３２：１４７０－１４７６を参照）。この場合、細胞型特異抗体を有する磁気ビーズを使用して非赤血球を除去する。例えば、本明細書に記載されるとおりの密度勾配を用いて赤血球を他の血液成分の大部分から単離し、続いて残留する任意の網赤血球を免疫磁気除去する。細胞はヒト抗体血清によって２５℃で２０分間前処理し、次に網赤血球特異的抗原に対する抗体、例えばＣＤ７１及びＣＤ３６で処理する。抗体は磁気ビーズに直接結合させてもよく、又は例えば抗ＰＥ抗体を有する磁気ビーズが反応し得るＰＥにコンジュゲートしてもよい。この抗体－磁気ビーズ複合体は、残留網赤血球を例えば赤血球集団から選択的に抽出することが可能である。

【0738】

赤血球はまた、アフェレーシスを用いて単離してもよい。アフェレーシスのプロセスは、患者又はドナーから全血を取り出し、遠心又は細胞選別を用いて血液成分を分離し、分離された部分の１つ以上を抜き取り、残りの成分を患者又はドナーに輸血し戻すことを伴う。現在、例えばＢａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、Ｉｌｌ．、ＵＳＡ）のＡｍｉｃｕｓ及びＡｌｙｘ機器、Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）のＴｒｉｍａ Ａｃｃｅｌ機器、及びＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、Ｍａｓｓ．、ＵＳＡ）のＭＣＳ＋９０００機器など、この目的のために幾つもの機器が使用されている。適切な細胞純度を達成するには、さらなる精製方法が必要となり得る。

【0739】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は１つ以上の網赤血球からエキソビボ及び／又はインビボで分化させる。網赤血球は、合成膜－レシーバー複合体の作成に使用し得る。網赤血球は未成熟赤血球であり、人体における赤血球の約１％を占める。網赤血球は骨髄で発達して成熟する。循環中に放出されると、網赤血球は急速に最終分化を起こして成熟赤血球となる。成熟赤血球と同様に、網赤血球は細胞核を有しない。成熟赤血球とは異なり、網赤血球はタンパク質合成を行う能力を維持している。一部の実施形態では、レシーバーをコードする外因性核酸（ｍＲＮＡなど）を網赤血球に導入して合成膜－レシーバー複合体を作成する。

【0740】

網赤血球の成熟に伴う細胞密度の違いに基づき、種々の成熟度の網赤血球を末梢血から単離し得る。網赤血球は末梢血から、様々な密度勾配での分画遠心法を用いて単離し得る。例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いて網赤血球を単離し得る（例えば、Ｎｏｂｌｅ ｅｌ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７４：４７５－４８１（１９８９）を参照）。Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）を１０ｍＭトリエタノールアミン、１１７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭグルコース、及び１．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の終濃度となるように希釈して、密度１．０９６及び１．０５８ｇ／ｍｌの滅菌等張Ｐｅｒｃｏｌｌ溶液を作製する。これらの溶液は容量オスモル濃度が２９５～３１０ｍＯｓｍである。例えば５ミリリットルの第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０９６）を滅菌１５ｍｌコニカル遠心管に加える。例えば２ミリリットルの第２のＰｅｒｃｏｌｌ溶液（密度１．０５８）を、より高密度の第１のＰｅｒｃｏｌｌ溶液の上に層状に重ねる。２～４ミリリットルの全血をチューブの上部に層状に重ねる。このチューブを、スイングアウト型チューブホルダを備えた冷却遠心機において２５０×ｇで３０分間遠心する。網赤血球及び一部の白血球が２つのＰｅｒｃｏｌｌ層の間の界面に移動する。界面にある細胞を新しいチューブに移し、５ｍＭグルコース、０．０３ｍＭナトリウムアジド及び１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄する。残留白血球をサイズ排除カラムでＰＢＳ中におけるクロマトグラフィーによって除去する。

【0741】

或いは、網赤血球は、免疫磁気分離手法を用いたポジティブ選択によって単離してもよい（例えば、Ｂｒｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７６：２３９７－２４０３（１９９０）を参照）。この手法は、成熟前に赤血球と比べて網赤血球の表面上で発現する多数のトランスフェリン受容体を利用するものである。トランスフェリン受容体に対する抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して、混合血液細胞集団から網赤血球を選択的に単離し得る。ヒトを含めた種々の哺乳類種のトランスフェリン受容体に対する抗体が、商業的供給元から入手可能である（例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）。トランスフェリン抗体は磁気ビーズに直接結合し得る。或いは、トランスフェリン抗体は、二次抗体を介して磁気ビーズに間接的に結合してもよい。例えば、ヒトトランスフェリンに対するマウスモノクローナル抗体１０Ｄ２（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏ．、ＵＳＡ）を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧでコーティングされた免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）と混合し得る。次に免疫磁気ビーズを白血球枯渇赤血球画分とインキュベートする。ビーズ及び赤血球は２２℃で穏やかに混合しながら６０～９０分間インキュベートし、続いて網赤血球が結合しているビーズを磁場を用いて単離する。単離網赤血球は、例えばＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ（登録商標）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を使用して磁気ビーズから取り外し得る。或いは、網赤血球は、本明細書に記載される方法を用いてＣＤ３４＋造血幹細胞のインビトロ成長及び成熟から単離してもよい。

【0742】

最終分化した除核赤血球は、そのＤＮＡ含量に基づき他の細胞と分離することができる。非限定的な例において、初めに細胞をバイタルＤＮＡ染色色素、例えばヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）で標識する。ヘキスト３３３４２は、二本鎖ＤＮＡに結合すると青色蛍光を発する細胞透過性核対比染色剤である。培養物中の未分化前駆細胞、マクロファージ又は他の有核細胞はヘキスト３３３４２によって染色されるが、一方、除核赤血球はヘキスト陰性である。ヘキスト陽性細胞は、蛍光活性化セルソーター又は他の細胞選別技法を用いて除核赤血球と分離することができる。ヘキスト色素は、透析又は他の好適な方法によって単離赤血球から除去することができる。

【0743】

合成膜－レシーバー複合体の集団は、複合体の集団の核物質含量を減少させることによって精製し得る。例えば、複合体の集団中の除核率を増加させ、及び／又は除核された合成膜－レシーバー複合体の数を増加させ又は濃縮する。

【0744】

合成膜－レシーバー複合体の集団は、小分子、例えばアクチン阻害薬、例えばサイトカラシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｊと共にインキュベートし、次に遠心によって核物質を取り除くことができる。それに代えて又は加えて、合成膜－レシーバー複合体の集団は、漸減するサイズ制限フィルタに通過させて機械的に操作することにより、核物質を取り除くことができる。合成膜－レシーバー複合体の集団はまた、フィブロネクチンでコーティングされたプラスチック表面上でインキュベートして核物質の除去を増加させてもよい。一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体の集団は間質細胞、例えばマクロファージとの共培養でインキュベートして核物質の除去を増加させる。

【0745】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は９９．９％超が除核されている。

【0746】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は支持細胞、例えば付着間質細胞層とは共培養されない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、赤血球系細胞をレシーバーと接触させ且つ赤血球系細胞を分化させてレシーバーを含む除核細胞の集団を得ることにより作成される。合成膜－レシーバー複合体の集団は、除核細胞を選択するための濃縮ステップ、例えば、重力分離、磁気又は蛍光選別、照射、有核細胞の中毒化などを用いずに得られる。

【0747】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、本明細書に記載されるものなどの核物質の検出アッセイによって評価するとき、５％超、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、又は９９．９％超が核物質を欠く合成膜－レシーバー複合体で構成される。

【0748】

一部の実施形態では、レシーバー、例えば合成膜－レシーバー複合体によって呈示されるレシーバーポリペプチドなどの存在、生物学的活性及び／又は機能が評価される。多くの好適なアッセイが利用可能であり、当該技術分野において公知である。

【0749】

一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の表面上のポリペプチドである。このレシーバーの存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、クームスロゼッティング（Ｃｏｏｍｂｓ ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の内部にあるポリペプチドである。このレシーバーの存在は、限定はされないが、ウエスタンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、サザンブロッティング、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。

【0750】

一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の表面上の核酸である。このレシーバーの存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、相同蛍光プローブによるフローサイトメトリー、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＰＣＲを含むアッセイによって評価することができる。一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の内部にある核酸である。このレシーバーの存在は、限定はされないが、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ＰＣＲを含むアッセイによって評価することができる。

【0751】

一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の表面上の小分子である。このレシーバーの存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の内部にある小分子である。このレシーバーの存在は、限定はされないが、質量分析法、蛍光分光法を含むアッセイによって評価することができる。

【0752】

一実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体の膜にある脂質である。このレシーバーの存在は、限定はされないが、質量分析法、フローサイトメトリー、膜溶解度、蛍光偏光、空間光干渉顕微鏡法を含むアッセイによって評価することができる。

【0753】

一実施形態において、レシーバーは蛍光性であるか、又は蛍光分子に融合しているか、又は外因性核酸（例えばベクター中の）からＧＦＰなどの蛍光レポータータンパク質と共発現する。合成膜－レシーバー複合体内又はその上にあるレシーバーの存在は、限定はされないが、フローサイトメトリー、蛍光分光法、吸光度分光法を含むアッセイによって評価することができる。

【0754】

一実施形態において、レシーバーはガス状分子である。合成膜－レシーバー複合体内又はその上にあるレシーバーの存在は、限定はされないが、化学発光アッセイ、質量分析法を含むアッセイによって評価することができる。

【0755】

合成膜－レシーバー複合体内又はその上にあるレシーバーの存在は、個々の複合体上のレシーバーの数を定量化する市販のサイトメトリーキャリブレーションビーズなどのキャリブレーションビーズを使用する定量的形式のフローサイトメトリーによって評価することができる。それに代えて又は加えて、合成膜－レシーバー複合体内又はその上にあるレシーバーの存在は、レシーバーと同じ検出試薬を使用して検出可能な既知の濃度の標準を使用する定量的形式のウエスタンブロットによって評価することができ、このようにして個々の複合体上のレシーバーの数を定量化し得る。

【0756】

一部の実施形態では、２つ以上の異なるレシーバーの存在が、同じ又は異なる方法で、同時に、逐次的に、或いは並行して評価され得る。例えば、一実施形態において、表面上のあるレシーバーを、そのレシーバーに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価することができ、及び表面上にない、蛍光性の別のレシーバーを、フローサイトメトリーにおいて別のチャネルを使用する蛍光シグナルによって評価することができる。別の例では、表面上のレシーバーをフローサイトメトリーによって評価することができ、表面上にない別のレシーバーをウエスタンブロットによって評価することができる。

【0757】

具体的な実施形態において、レシーバーは、細胞供給源の最終分化後も合成膜－レシーバー複合体に保持されている。例えば、膜－レシーバー複合体が培養赤血球系細胞から作成され、細胞の最終分化後にレシーバーの発現又は存在が、好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、サザンブロット、ノーザンブロット、又は吸光度分光法によって評価される。

【0758】

具体的な実施形態において、レシーバーは、合成膜－レシーバー複合体を対象に投与した後にインビボで循環した後にも合成膜－レシーバー複合体に保持されている。合成膜－レシーバー複合体は、マウスなどの実験動物又は動物モデルに静脈内に、例えば尾静脈から注入することができ、又はヒトに静脈内注射される。次に血液が採取され、合成膜－レシーバー複合体におけるレシーバーの存在が好適なアッセイ、例えば、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降、蛍光分光法、化学発光、サザンブロット、ノーザンブロット、又は吸光度分光法によって評価される。

【0759】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体内又はその上のレシーバーの生物学的活性、複合体の全体的な生物学的活性、及び複合体の集団の全体的な活性が、インビトロアッセイによって評価され得る。

【0760】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の活性は、モデル細胞株を使用して速やかに繰り返される。例えば、好適なレシーバーのライブラリをモデル細胞株、例えばＨＥＫ２９３Ｔ又はＫ５６２で発現させて、好適なアッセイにより活性を評価する；次に最良のレシーバー候補、例えば好適なアッセイにおいて最も高いレベルで発現するもの又は最も高い活性を示すものを、例えば培養赤血球系細胞で発現させて、合成膜－レシー
バー複合体を作成する。

【0761】

一実施形態において、合成膜レシーバー複合体の活性は、培養マウス赤血球系細胞モデルを使用して速やかに繰り返される。例えば、好適なレシーバーのライブラリを培養マウス赤血球系細胞で発現させて；好適なマウス疾患モデル又は活性を評価するのに好適なマウスモデルシステムで活性を評価し；次に、好適なアッセイにおいて最良のレシーバー候補、例えば最も高いレベルで発現するもの又は最も高い活性を示すものを、例えば培養赤血球系細胞で発現させて、合成膜－レシーバー複合体を作成する。

【0762】

場合によっては、レシーバーは酵素であり、レシーバーの活性は、特定の基質分子の消失を検出するか、又は特定の産物分子の出現を検出する酵素アッセイによって評価することができる。かかるアッセイには、限定はされないが、比色アッセイ、質量分析法、ＨＰＬＣ、蛍光アッセイが含まれる。

【0763】

例えば、ａ）レシーバーはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）であり、酵素アッセイではアデノシンからイノシンへの変換が検出される；ｂ）レシーバーはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）であり、アッセイではフェニルアラニンからチロシンへの変換が検出される；ｃ）レシーバーはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）であり、アッセイではフェニルアラニンからトランスケイ皮酸への変換が検出される；ｄ）レシーバーはチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）であり、アッセイではチミジンからチミン及び２－デオキシ－リボースへの変換が検出される；ｅ）レシーバーはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）であり、アッセイではイノシンからヒポキサンチンへの変換、アデノシンからアデニンへの変換、及びグアノシンからグアニンへの変換が検出される；ｆ）レシーバーはホモゲンチジン酸１，２－ジオキシゲナーゼ（ＨＤＧ）であり、アッセイではホモゲンチジン酸からマレイルアセト酢酸への変換が検出される；ｇ）レシーバーはシスタチオニンβシンターゼであり、アッセイではセリン及びホモシステインからシスタチオニンへの変換が検出される；ｈ）レシーバーはシュウ酸オキシダーゼであり、アッセイではオキサレートの酸化が検出される。

【0764】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の活性は、疾患、例えば代謝疾患又は酵素欠損症の動物モデル、例えばマウスモデル、及び免疫不全マウス、又はＮＳＧマウス、又は合成膜－レシーバー複合体の効果を実証し得るもの、例えば基質が注入され且つレシーバー媒介性変換の産物が計測されるマウスで評価される。

【0765】

一実施形態において、レシーバーは、補体受容体１（ＣＲ１）ポリペプチド、その誘導体又は機能断片である。ＣＲ１レシーバーの活性は、例えば、ＣＲ１レシーバーによる免疫複合体の特異的捕捉、マクロファージへの免疫複合体の効率的なトランスファー、又はマウスからの免疫複合体のインビボクリアランスを含め、幾つかの方法で評価することができる。

【0766】

ＣＲ１レシーバーを過剰発現する赤血球系細胞の機能性は、以下の１つ以上のプロセスによって評価し得る：ＣＲ１レシーバーを含む赤血球系細胞表面上への免疫複合体の捕捉、ＣＲ１レシーバーを含む赤血球系細胞は保持しておく一方でのマクロファージに対する免疫複合体の放出、及びＣＲ１レシーバーを含む赤血球系細胞の適切な循環。これらの３つのパラメータはインビトロで評価することができる。免疫複合体捕捉アッセイは、当該技術分野において、例えばＯｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００及びＳｃｈｉｆｆｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９１に記載されている。例えば、天然ＣＲ１又はＣＲ１レシーバーポリペプチド又はその断片を発現する赤血球系細胞と共に標識免疫複合体をインキュベートし、赤血球系細胞によって捕捉される免疫複合体の数をフローサイトメトリーによってアッセイする。マクロファージトランスファーアッセイは、当該技術分野において、例えば、Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８に記載されている。例えば、天然ＣＲ１又はＣＲ１レシーバーポリペプチド又はその断片を発現する赤血球に負荷された標識免疫複合体をマクロファージと共にインキュベートする。赤血球表面からマクロファージへの免疫複合体のトランスファー、及びマクロファージによる赤血球の消費又は回避をフローサイトメトリーによって計測することができる。適切な循環は、赤血球系細胞の形態及び変形能を分析することによって予測し得る。天然ＣＲ１又はＣＲ１レシーバーポリペプチド又はその断片を発現する赤血球系細胞の形態は、例えばＧｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１及びＲｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５によって記載されるとおり、標準的な顕微鏡技法を用いて目測で評価することができる。天然ＣＲ１又はＣＲ１レシーバーポリペプチド又はその断片を発現する赤血球系細胞の変形能は、例えばＧｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１に記載されるとおり、レーザー支援旋光細胞分析（ｌａｓｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＬＯＲＣＡ）としても知られるエクタサイトメトリーによって評価することができる。

【0767】

例えば、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体（この複合体はＣＲ１ポリペプチドレシーバーを含む）を免疫複合体、例えばインビブトロ（ｉｎ ｖｉｖｔｒｏ）で作成された免疫複合体又は患者に由来する免疫複合体と共にインキュベートする。ＣＲ１レシーバーによる免疫複合体の捕捉が、例えば、免疫複合体中の蛍光マーカーを使用するフローサイトメトリーによるか又は免疫複合体のエレメントに対する二次検出剤を使用するフローサイトメトリーによって評価される。

【0768】

一実施形態では、初めに合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体を免疫複合体と共にインキュベートし、次にマクロファージ、例えば、初代マクロファージ、初代単球、培養マクロファージ、培養単球、Ｕ９３７細胞、ＰＭＡ活性化Ｕ９３７細胞、ＡＡ９細胞、ＲＡＷ ２６４．７細胞、Ｊ７７４細胞、ＴＨＰ１細胞、ＫＧ－１細胞、ＮＲ８３８３細胞、ＭＶ－４－１１細胞、３Ｄ４／３１細胞、ＭＤ細胞、Ｆｃｗｆ－４細胞、ＤＨ８２細胞と共にインキュベートする。合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体によってトランスファーされた免疫複合体の存在に関して、マクロファージが例えばフローサイトメトリー又はＸ線撮影によって評価される。培養赤血球系細胞からマクロファージへの捕捉免疫複合体のトランスファーは、当該技術分野の標準アッセイである。例えば：Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：２３０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７８（７）：３１２９を参照されたい。

【0769】

一実施形態において、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体の活性は動物モデルで評価される。例えば、免疫不全マウス、又はＮＳＧマウスなどの好適なマウスモデルを使用し得る。マウス疾患モデルは、ループスなど、例えば免疫複合体病であってもよい。マウスモデルには、ＮＺＢＷＦ１／Ｊ、ＭＲＬ／ＭｐＪ、ＭＲＬ／ＭｐＪ－Ｆａｓ（ｌｐｒ）、Ｓｍｎ．Ｃ３－Ｆａｓｌ／Ｊ、ＮＺＭ２４１０／Ａｅｇ、１２９Ｓ４－Ｃｄ４８、Ｃｇ－Ｓｌｅ１、ＮＺＭ－Ｓｌｅ１ Ｓｌｅ２ Ｓｌｅ３／ＬｍｏＪ、及びＢＸＳＢ．１２９Ｐ２が含まれる。それに代えて又は加えて、例えば免疫複合体の注入により、マウスに疾患表現型が導入されてもよい。合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体を任意の好適なマウス（又は他の動物モデル）に注入して、複合体の１つ以上の生物学的作用、例えば合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体による注入された免疫複合体のクリアランスを試験し得る。

【0770】

一部の実施形態において、ＣＲ１レシーバーを含む合成膜－レシーバー複合体はマウスでは作成されず、及び／又はマウス赤血球系細胞からは作成されない。一部の実施形態において、ＣＲ１レシーバーを含む合成膜－レシーバー複合体は実験動物では作成されず、及び／又は実験動物に由来する赤血球系細胞からは作成されない。

【0771】

一実施形態において、レシーバーは補体調節分子であり、又は補体調節活性を有する。レシーバーのこの活性は、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方で評価することができる。例えば、レシーバーの活性は、インビトロ補体活性化アッセイ、例えば感作ヒツジ赤血球の補体媒介性の溶解を計測するＣＨ５０アッセイ、又は非感作ウサギ赤血球の第二経路補体媒介性溶解を計測するＡＨ５０アッセイにおいて低下を計測することによって評価し得る。或いは、レシーバーの活性は、限定はされないが、例えば、組換えＣ２からＣ２ａ及びＣ２ｂへの切断、Ｂ因子からＢａ因子及びｂＢ因子への切断、因子Ｃ３ｂからｉＣ３ｂＨ及びｉＣ３ｂＬへの切断、Ｃ３ｂＢｂからＣ３ｂ及びＢｂへの切断、Ｃ４ｂＢｂからＣ４ｂ及びＢｂへの切断、又は因子Ｃ４ｂからｉＣ４ｂＨ及びｉＣ４ｂＬへの切断を含めた、レシーバーと共にインキュベートされた組換え補体成分の、ネオエピトープに曝露されても又は曝露されなくてもよい、切断又は切断が存在しないことを検出して評価し得る。好適な組換え補体成分の切断又は切断が存在しないことは、限定はされないが、例えば、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、及びウエスタンブロッティングを含めた当該技術分野において公知のタンパク質分析方法によって評価することができる。レシーバー活性に好適なインビボアッセイは、動物、例えばマウスへの合成膜－レシーバー複合体の注入、及び組織染色法による補体因子、例えば膜侵襲複合体の沈着の調査を含む。

【0772】

一実施形態において、レシーバーは標的を結合又は捕捉する能力を有し、レシーバーの活性は、インビトロ又はインビボでレシーバーに捕捉された標的を検出することによって評価し得る。

【0773】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いてレシーバーによる標的の捕捉が検出される。

【0774】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はインビトロで標的と共にインキュベートされ、レシーバーによる標的の捕捉が、限定はされないが、例えば、オプソニン化レシーバー複合体のマクロファージ消費アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、Ｂ細胞刺激アッセイ、マスト細胞脱顆粒アッセイ、感染性潜在能力アッセイを含めたインビトロ共培養アッセイを用いて検出される。

【0775】

ある実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いて捕捉された標的の放出速度又はオフ速度が計測される。

【0776】

合成膜－レシーバー複合体による標的の捕捉は、例えば、マウスにおいて標的が天然に存在する疾患のマウスモデルを含めた動物においてインビボアッセイでアッセイすることができる。好適な疾患としては、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、免疫複合体病、自己抗体疾患、高脂血症、高血糖症が挙げられる。他のマウスモデルでは、標的がマウスに外部から、例えば注射によるか又は摂餌によって投与される。これらのアッセイでは、合成膜－レシーバー複合体による標的捕捉のアッセイは、動物、例えば血漿、組織を標的の減少又は保持に関して調べることによるか、或いは動物から、例えば血液、血漿、組織からレシーバー複合体を単離又は採取し、且つ限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いてレシーバー上の標的の存在をアッセイすることにより行われる。

【0777】

一部の実施形態において、レシーバーは標的を結合又は捕捉する能力、インビボでの標的のクリアランスを実質的に増加させる能力、又は循環中の標的の濃度を実質的に低減する能力を有する。合成膜－レシーバー複合体上のレシーバーの活性は、インビトロ又はインビボでの標的のクリアランスの亢進を検出することによって評価し得る。

【0778】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いてレシーバーによる標的の捕捉が検出される。続いて、合成膜－レシーバー複合体は、クリアランスを促進することが知られている細胞、例えばマクロファージ又は単球と共に共培養アッセイでインキュベートされ、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法によって標的及びレシーバー複合体のクリアランスが評価される。

【0779】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はインビトロで標的と共にインキュベートされ、限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いてレシーバーによる標的の捕捉が検出される。続いて、合成膜－レシーバー複合体は、インビボでの複合体のクリアランス機構を模倣する物理的システム、例えば人工脾臓、マイクロチャネル、充填カラム、樹脂、組織外植片、遠心機においてインキュベートされ、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法によって標的及びレシーバー複合体のクリアランスが評価される。

【0780】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体による標的のクリアランスは、例えば、マウスにおいて標的が天然に存在する疾患、例えば細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、免疫複合体病、自己抗体疾患、高脂血症、高血糖症のマウスモデル、又は例えば、標的がマウスに外部から、例えば注射によるか又は摂餌によって投与されるマウスモデルを例えば含めた動物におけるインビボアッセイでアッセイされる。これらのアッセイでは、レシーバー複合体による標的クリアランスのアッセイは、動物、例えば血漿、組織を標的の減少に関して調べることによるか、或いは動物から、例えば血液、血漿、組織から合成膜－レシーバー複合体を単離又は採取し、且つ限定はされないが、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、磁気分離、Ｘ線撮影、コロニー形成アッセイ、顕微鏡法を含めたインビトロアッセイを用いてレシーバー上の標的の存在をアッセイすることにより行われる。

【0781】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、好適なレシーバーを特定の細胞内コンパートメント、例えばリソソームに送達する能力を有する。

【0782】

例えば、レシーバーは、標的細胞、例えばマクロファージのリソソームコンパートメントに送達され得る。標的細胞のリソソームコンパートメントへのレシーバーの送達の成功は、顕微鏡法及び蛍光レシーバー又は蛍光レシーバー検出剤に対応する点状スポットの検出によって評価される。それに代えて又は加えて、標的細胞のリソソームコンパートメントへのレシーバーの送達の成功は、顕微鏡法及び蛍光レシーバー検出剤と既知のリソソームマーカー、例えばリソトラッカー（ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ）ＬＡＭＰ－１に対する蛍光検出薬剤との共局在によって評価される。

【0783】

一部の実施形態において、レシーバーは、リソソーム蓄積症の遺伝子型又は表現型を呈する細胞又はリソソーム蓄積症患者に由来する細胞のリソソームに蓄積した毒性成分を分解することのできる酵素である。例えば、レシーバーは、細胞内に蓄積した毒性物質を分解して細胞表現型をレスキューし、例えば細胞死を防ぐ能力を有する。

【0784】

合成膜－レシーバー複合体の集団は、複合体が複製不能であること、複合体が血管系を通じて安全に循環可能であること、及び複合体に免疫原性がないことに関して評価し得る。

【0785】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団の安全性は、好適なインビトロ又はインビボアッセイを用いて複合体の集団の複製能力を計測することにより評価される。例えば、合成膜－レシーバー複合体の実質的な自己複製不能性の試験は、ａ）免疫不全マウスへの注入時に実質的に腫瘍を形成不能であること；ｂ）軟寒天での培養時に実質的にコロニーを形成不能であること；ｃ）チミジン取込みアッセイにおいて実質的にチミジンを取り込み不能であること；ｄ）蛍光レポーターをコードするＤＮＡをトランスフェクトしたときに実質的に陽性シグナルがない、例えば、１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、１００ｐｐｔ、１０ｐｐｔ、１ｐｐｔ、又は１ｐｐｔ未満の陽性シグナルであること；ｅ）核色素で染色したときに実質的に陽性シグナルがない、例えば、１０％未満、１％、０．１％、０．０１％；及び０．００１％、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、１００ｐｐｔ、１０ｐｐｔ、１ｐｐｔ、又は１ｐｐｔ未満の陽性シグナルであること；ｆ）血液系悪性腫瘍の細胞マーカー、例えば、ＣＫＩＴ、ＣＤ３４、ＥｐＣａｍで染色したときに実質的に陽性シグナルがない、例えば、１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、１００ｐｐｔ、１０ｐｐｔ、１ｐｐｔ、又は１ｐｐｔ未満の陽性シグナルであることを含む。特定の実施形態において、実質的な量の複製核酸を含有しない合成膜－レシーバー複合体が提供される。

【0786】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団の安全性は、投与された複合体が実質的な血管閉塞又は凝固カスケードの誘導を引き起こすことなくインビボで（対象の循環系において）循環する能力を計測することにより評価される。任意選択で、合成膜－レシーバー複合体の循環薬物動態が評価されてもよい。

【0787】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の循環薬物動態は、マウスなどの動物に複合体を静脈内注射することによって評価される。マウスはＮＳＧ（ｎｏｄ－ＳＣＩＤ－γ）免疫不全マウスであってもよい。マウスには、マクロファージを枯渇させた後、例えばヒト赤血球の腹腔内注射によるか、又はクロドロネートリポソームの静脈内注射によって複合体を注射する。合成膜－レシーバー複合体は、蛍光色素、例えばＣＦＳＥで標識することができる。複合体の注射後、血液を採取し、残存する合成膜－レシーバー複合体の数を、例えばフローサイトメトリー、ウエスタンブロットによって評価し、これらのデータから合成膜－レシーバー複合体のクリアランス速度を推定する。合成膜－レシーバー複合体と同じ動物モデルにヒト赤血球を注射することができ、複合体及びヒト赤血球のクリアランス速度を比較する。

【0788】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体による凝固カスケードの活性化リスクがインビトロアッセイで評価される。一実施形態では、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体をヒト血液とインキュベートし、カオリン、負電荷リン脂質、及びカルシウムの存在下で凝固に要する時間を計測することによるか（活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）試験）（例えば、Ｅｘｎｅｒ ａｎｄ Ｒｉｃｋａｒｄ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７７ ２７（２）：６２を参照）、又はトロンボプラスチン及びカルシウムの存在下で凝固に要する時間を計測することによって（プロトロンビン時間（ＰＴ）試験）（例えば、Ｊａｑｕｅｓ ａｎｄ Ｄｕｎｌｏｐ １９４５，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １４５：６７を参照）、凝固カスケード活性化を評価する。ａＰＴＴ試験の正常範囲は約２５～３８秒である。ＰＴ試験の正常範囲は約１０～１２秒である。

【0789】

一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体によって引き起こされる任意の有害事象が、動物に複合体を静脈内注射し、及び凝固カスケードの活性化を評価することによって評価される。凝固カスケードの誘導レベルの評価は、血液を採取し、及び血漿中の凝固カスケード成分のレベルを例えばウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡで評価することによって行われる。凝固カスケード成分は、典型的にはフィブリノゲン崩壊産物、例えばフィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢである。例えば、凝固カスケード誘導レベルの評価は、血液を採取し、及び血小板活性化アッセイによって血漿中の凝血活性レベルを評価すること、例えば、血漿を血小板と共にインキュベートし、及び例えば活性化マーカーの染色、例えばＰＡＣ－１、ＣＤ６２ｐ、又はＣＤ４０Ｌの染色によるフローサイトメトリーで血小板の活性化を評価することによって行われる。

【0790】

一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体によって引き起こされる任意の有害事象が、動物に複合体を静脈内注射し、及び炎症経路の活性化を評価することによって評価される。炎症レベルの評価は、血液を採取し、及び血漿中の炎症性サイトカインレベルを例えばウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡで評価することによって行われ得る。一実施形態において、炎症性シトカイン（ｃｉｔｏｋｉｎｅ）は、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、又はＩＬ－１２断片ｐ７０である。

【0791】

一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体によって引き起こされる任意の有害事象が、動物に複合体を静脈内注射し、及び組織、例えば、肝臓、脾臓、心臓、肺、脳、皮膚、腎臓の状態を評価することによって評価される。組織の状態は、肉眼的剖検、組織解剖、組織染色、及び顕微鏡画像法によって評価することができる。

【0792】

一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体が実質的な血管閉塞又は凝固カスケードの活性化を引き起こすことなくインビボで循環する能力は、複合体の変形能を計測することによって評価される。合成膜－レシーバー複合体の変形能はインビトロアッセイを用いて評価する。例えば、このアッセイは、浸透圧脆弱性アッセイである。合成膜－レシーバー複合体の機械的脆弱性は、クエット型せん断システムにおいてずり応力に応答した構造的完全性を計測することによって評価し得る。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の変形能はエクタサイトメーターを使用して評価する。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の変形能は、レーザー支援旋光セルアナライザー（ＬＯＲＣＡ）機器を使用してレーザー回折で限定圧力における伸び指数を計測することによって評価する。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の変形能は、マイクロ流体装置において一定圧力で限定寸法の一連のミクロンスケール狭窄部を通り抜ける通過時間を計測することによって評価する。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の変形能は、マイクロ流体装置において一定圧力で限定寸法の一連のミクロンスケール狭窄部を通った生存率を計測することによって評価する。マイクロ流体装置は、以下に挙げるもの、即ち、限定はされないが、ミクロンスケール狭窄部を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）チップ（例えば、Ｈｏｅｌｚｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１４ ９１：ｅ５１４７４）；漏斗形狭窄部を有するチップ（例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ２０１２ １２：１１４３）；ピラーを有するＰＤＭＳチップ（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１２ １０９（４６）：１８７０７）；又はインビトロ人工脾臓マイクロビーズ充填カラム（Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ ＤｅＰｌａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１１，１１７（８））のうちの１つから選択することができる。

【0793】

一実施形態では、合成膜－レシーバー複合体が実質的な血管閉塞又は凝固カスケードの活性化を引き起こすことなくインビボで循環する能力は、複合体の血管閉塞を計測することにより評価される。合成膜－レシーバー複合体の血管閉塞は、インビトロアッセイを用いて評価することができる。例えば、合成膜－レシーバー複合体の血管閉塞は、エキソビボアッセイを用いて評価される。合成膜－レシーバー複合体を基準ヒト赤血球と１：１比でインキュベートし、Ｒｈ不適合血液による基準アッセイと比較した多細胞ロゼットの誘導を光学顕微鏡法によって評価する。合成膜－レシーバー複合体の血管閉塞は、流動条件下におけるヒト血管内皮細胞に対する複合体の付着を計測することによって評価される。例えば、Ｋａｕｌ ＤＫ，Ｆｉｎｎｅｇａｎ Ｅ，ａｎｄ Ｂａｒａｂｉｎｏ ＧＡ（２００９）Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １６（１）：９７－１１１を参照されたい。それに代えて又は加えて、血管閉塞は、ラット血管内皮のエキソビボ灌流アッセイにおける末梢抵抗単位（ＰＲＵ）の増加を計測することによって評価される。例えば、Ｋａｕｌ，Ｆａｂｒｙ ａｎｄ Ｎａｇｅｌ，ＰＮＡＳ １９８９，８６：３３５６を参照されたい。さらに、血管閉塞は、生体内顕微鏡法によって評価される。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｂｌｏｏｄ １１０（７）：２７０８を参照されたい。血管閉塞はまた、インビトロで段階的な高さの流動チャンバにおける複合体の流量及び付着を計測することによって評価されてもよい。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４（１２）：３７７４を参照されたい。

【0794】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団の安全性が、好適なインビトロ又はインビボアッセイを用いて複合体の集団の免疫原性を計測することにより評価される。

【0795】

例えば、合成膜－レシーバー複合体の集団は、ａ）意図されるレシピエント対象の血清を使用したクームス試験において凝集を生じさせず、又はｂ）ヒトプール血清を使用したクームス試験において凝集を生じさせない。

【0796】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、優勢な血液型抗原に関して遺伝子型を同定してレシピエントの血液型抗原遺伝子型に適合させた前駆細胞に由来する。

【0797】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、インシリコＴ細胞エピトープ予測アルゴリズムによって予測されるＴ細胞反応性が１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又は０．００１％未満であるレシーバー又は他の外因性タンパク質を含む。

【0798】

一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団は、インビトロＴ細胞活性化アッセイ、例えば、Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｉｎｃ．ＥｐｉＳｃｒｅｅｎアッセイにおける反応性が１０％未満、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、又は０．００１％未満であるレシーバー又は他の外因性タンパク質を含む。

【0799】

例えば、赤血球から誘導される合成膜－レシーバー複合体は、それを必要としている対象に注入するため、遠心し、適切な溶液（例えば、標準ＡＳ－３溶液）に再懸濁することができる。一部の実施形態において、注入される合成膜－レシーバー複合体はレシピエントと同じＡＢＯ型を有し、注入に伴う免疫反応のリスクが最小限に抑えられる。合成膜－レシーバー複合体はまた、前処理して血液型特異的抗原を除去し、又は他の方法で抗原性を低下させることもできる。このために好適な方法としては、限定はされないが、米国特許出願公開第２００１０００６７７２号明細書及び同第２００３０２０７２４７号明細書に記載されるものが挙げられる。

【0800】

治療及び予防方法
本明細書には、標的の循環濃度をモジュレートすることにより、対象の循環系におけるその標的の存在、非存在、濃度上昇又は濃度低下に関連する疾患、障害又は病態を治療又は予防する方法が提供される。対象は疾患、障害又は病態に罹患していてもよく、又は疾患、障害又は病態を発症するリスクを有していてもよい。本明細書に提供される方法は、標的の循環濃度を実質的にモジュレートするのに有効な量で本明細書に記載される好適な合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を投与し、それによって疾患、障害又は病態を予防又は治療することを含む。一部の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は医薬組成物として製剤化される。一部の実施形態において、本医薬組成物は、対象への静脈内注射用に製剤化される。本組成物は対象に１回投与されてもよい。或いは、所定の期間にわたって複数回の投与が行われてもよい。例えば、２回、３回、４回、５回、又はそれを超える投与が対象に提供され得る。一部の実施形態において、投与は、例えば疾患、障害又は病態に関連する症状が持続している限り、必要に応じて提供され得る。一部の実施形態において、対象の生涯にわたって反復投与が指示され得る。治療期間は様々であってよく、例えば、１年以下、６ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、１ヵ月、２週間、１週間、３日、２日、又は１日以下であり得る。

【0801】

一部の実施形態において、本組成物は、疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が軽減されるように、治療期間にわたって少なくとも２回投与される。一部の実施形態において、本組成物は、疾患、障害若しくは病態が治療され又はその症状が予防されるように、治療期間にわたって少なくとも２回投与される。一部の実施形態において、本医薬組成物は、標的の循環濃度が治療期間中に実質的に低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。一部の実施形態において、本医薬組成物は、標的自己抗体の循環濃度が治療期間中に実質的に低下し、それにより自己抗体媒介性疾患、障害又は病態の１つ以上の症状が予防され、軽減され、又は遅延するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。一部の実施形態において、標的の循環濃度を低下させることには、ピーク濃度を低下させることが含まれ、一方でまた、それには、平均濃度を低下させることが含まれる。一部の実施形態において、治療期間中の実質的な低下は、ヒト対象における治療前又は治療後期間を比較するか、又は治療を受けている集団で行われた計測を、対応する未治療対照集団と比較することにより決定し得る。一部の実施形態において、標的の循環濃度は、治療期間の一部又は全体で少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。一部の実施形態において、標的の循環濃度は、投与から約１、５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０分間、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間、又は１、２、３、４、５、若しくは６日間、又は約１、２、３、４、５、若しくは６週間以内に少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は９９．９９％超低下する。

【0802】

一部の実施形態において、本医薬組成物は、標的の循環濃度が、ｉ）ヒト対象による標的の内因性クリアランス速度、又はｉｉ）ヒト対象による標的の内因性産生速度、又はｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の両方よりも速い速度で低下するように、治療期間にわたって十分な回数投与される。一部の実施形態において、本医薬組成物は、標的の循環濃度が少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又は６ヵ月超にわたり実質的に低下するように、治療期間に十分な回数投与される。一部の実施形態において、本医薬組成物は、少なくとも治療期間中である間は標的の循環濃度が実質的に低下するように、治療期間に十分な回数投与される。

【0803】

一部の実施形態において、本医薬組成物は、標的の循環濃度を、疾患、障害又は病態の症状に関連するレベル未満に有効に低減するのに十分な頻度で投与される。

【0804】

一部の実施形態において、治療期間内における投与間の時間間隔は、循環中の合成膜－レシーバー複合体の数が投与医薬組成物中に存在する合成膜－レシーバー複合体の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％未満に減少する期間以下である。

【0805】

合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の投与によって治療又は予防し得る循環系中の標的に関連する疾患、障害及び病態は、本明細書に記載される。

【0806】

合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の投与によって治療又は予防し得る循環系中の標的に関連する疾患、障害及び病態としては、限定はされないが、以下が挙げられる：自己抗体媒介性疾患、補体調節異常関連疾患、免疫複合体関連疾患、アミロイドーシス、感染性因子又は病原体に関連する疾患（例えば、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫感染症）、毒性タンパク質に関連する疾患、脂質の蓄積に関連する疾患、アポトーシスの、壊死性の、異常な又は発癌性の哺乳類細胞に関連する疾患、及び代謝疾患。

【0807】

本明細書には、一部の実施形態において、少なくとも一部において循環系に滞留する標的（例えば、分子又は実体）に関連する疾患又は病態の治療又は予防方法が提供される。本方法は、特定の実施形態において、レシーバーを含む機能性赤血球系細胞、レシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団、又はレシーバーを含む機能性赤血球系細胞を含む組成物、好ましくは医薬組成物を、それを必要としている対象に、少なくとも一部において循環系に滞留する分子又は実体に関連する疾患又は病態を治療又は予防するのに有効な量で投与するステップを含む。

【0808】

炎症及び炎症に関連する疾患、例えば、敗血症、自己免疫疾患、癌、及び微生物感染症の治療又は予防方法が提供され、この方法は、免疫調節レシーバーを含む赤血球を、それを必要としている対象に炎症又は関連疾患の治療又は予防に有効な量で投与するステップを含む。一部の実施形態において、赤血球は、ケモカイン又はサイトカイン受容体を含む免疫調節レシーバーを含む。詳細な実施形態において、ケモカイン受容体はＤＡＲＣである。

【0809】

炎症部位におけるケモカイン恒常性のモジュレーション方法が提供され、この方法は、ケモカイン調節性レシーバーを含む赤血球を、それを必要としている対象に炎症部位におけるケモカイン恒常性をモジュレートするのに有効な量で投与するステップを含む。一部の実施形態において、ケモカイン調節性レシーバーを含む赤血球は、ケモカイン受容体を含むレシーバーを含む。詳細な実施形態において、ケモカイン受容体はＤＡＲＣである。一部の実施形態において、炎症部位は血管である（Ｄａｒｂｏｎｎｅ，Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｔ，１９９１）。

【0810】

さらに、毒素クリアランスを誘導する方法が提供される。この方法は、毒素との相互作用能を有するレシーバー、例えば、抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディレシーバーなどを含む機能性赤血球系細胞の集団を、それを必要としている対象に循環から毒素を除去するのに有効な量で投与するステップを含む。かかる方法を用いることにより、毒素を隔絶し、且つ本来であれば血管系内で生じたであろう組織損傷の大きさを低減して、それ程急性でない方法でその病原性効果を散逸させ得る。

【0811】

一部の実施形態において、疾患、例えば、限定はされないが、代謝疾患、癌、凝固疾患及び抗凝固疾患を治療する方法が提供される。この方法は、本明細書に提供されるレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の医薬組成物を、それを必要としている対象に、対象の代謝疾患、癌、凝固疾患又は抗凝固疾患を治療するのに十分な量で投与するステップを含む。

【0812】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、その表面上に、対象の循環系の環境に露出している１つ以上のレシーバーポリペプチドを呈示する。

【0813】

他の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の非露出側に向く１つ以上のレシーバーポリペプチドを含む。

【0814】

レシーバーポリペプチドは、循環系に存在する標的と相互作用し得る。レシーバーと標的の相互作用には、限定はされないが、ｉ）レシーバーと標的の結合；ｉｉ）標的の分解、ｉｉｉ）標的の切断；ｉｖ）標的の隔絶、及び／又はｖ）標的の触媒変換が含まれ得る。

【0815】

例えば、レシーバーポリペプチドは、抗体、一本鎖可変断片、ナノボディ、ダイアボディ、ダルピン（ｄａｒｐｉｎ）、リアーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、又はヌクレアーゼであってもよい。

【0816】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、ポリペプチドでないレシーバーを含む。一部の実施形態において、レシーバーは、炭水化物（例えば、ＧＡＧ）、脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は標的との相互作用能を有する非タンパク質リガンド、薬物若しくは基質を含む。

【0817】

一部の実施形態において、レシーバーと標的との間の相互作用により、循環系中の標的の濃度が直接又は間接的に低下する。例えば、レシーバーは標的を別の産物に直接変換し得る。レシーバーは、切断、分解等の、標的に対する触媒活性を有し得る。変換は、標的から分解産物への変換、毒性の又は有害な標的から非毒性産物への変換等であり得る。レシーバーの触媒活性には、標的への１つ以上の化学基の付加もまた含まれ得る。標的がレシーバーによって修飾されることで、例えば脱／リン酸化、脱／ユビキチン化、脱／メチル化、グリコシル化等が直接又は間接的に標的に生じ得る。レシーバーが例えば異なる酵素によって第２の修飾をもたらす第１の修飾を置いた場合、レシーバーは標的に間接的に第２の修飾を生じさせ得る。次に任意のかかる修飾が、例えば、標的の分解又は有害でない若しくは有害性の低い産物への標的の変換をもたらし得る。一部の実施形態では、標的濃度の低下が、直接又は間接的に非標的化合物の増加に関連し得る。例えば、毒性代謝産物が非毒性又はより低毒性の代謝産物に変換され得る。別の例では、標的は、欠損している又は低量で存在する産物に変換され得る。この場合、疾患、障害又は病態は非標的化合物の欠如又は低量に関連し、例えば合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の触媒作用による標的の変換が、疾患、障害又は病態を治療するのに有効な非標的化合物の量の増加を可能にする。

【0818】

他の例では、レシーバーは標的に結合し、それを隔絶した状態、例えば合成膜－レシーバーポリペプチド複合体と会合した状態にしておくことができる。この隔絶により、標的が有する活性、例えば自己免疫疾患の原因となり得る自己抗体、又は敗血症等を引き起こし得る細菌性毒素によって及ぼされるような有害な活性が阻害され得る。それに代えて又は加えて、標的が隔絶され又は結合すると、標的は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の分布に従い対象の循環系に再分布する。これは標的の分布容積、ひいては潜在的にその有害な影響又は悪影響を大幅に制限し得る。標的は、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の代謝回転又は半減期及び分布によって仕向けられる対象の体内の特定の部位又は臓器で分解又は蓄積し得る。

【0819】

医薬組成物の投与は、治療期間中に循環中の標的分子の濃度又は量を実質的に低下させるのに十分であってもよく、ここで実質的な低下は、ヒト対象における治療前又は治療後期間との比較で、又は対応する未治療対照集団と比較した治療を受けている集団で行われた計測の比較によって決定し得る。標的分子の実質的な低下には、ヒト患者に存在する標的分子のピーク濃度又は量の実質的な低下又はヒト患者に存在する標的分子の平均濃度又は量の実質的な低下が含まれ得る。

【0820】

一部の実施形態において、周期的フレアを特徴とする疾患の治療方法が提供され、ここでフレアは、症状の再発又は一層重篤な症状の発生として定義される。周期的フレアを特徴とする疾患としては、例えばループス、関節リウマチ、及びグッドパスチャー症候群を含めた自己抗体媒介性疾患、免疫複合体関連疾患、自己免疫疾患が挙げられる。

【0821】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与されない個体と比較してフレア間の時間が短くなるように、患者に医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む方法が提供される。

【0822】

一部の実施形態において、医薬組成物を投与されない個体と比較してフレアの重症度が低減されるように、患者に医薬組成物を治療期間にわたって十分な回数投与するステップを含む方法が提供される。

【0823】

一部の実施形態において、本明細書に記載される赤血球系細胞から作成される合成膜－レシーバー複合体を使用した治療及び予防方法は、インビボで例えば赤血球系細胞と会合した検出剤によって赤血球系細胞を検出するステップを含まない。

【0824】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はヒトドナー多能性造血幹細胞からは作成されない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の集団はバイオリアクターでは拡大されない。一部の実施形態において、拡大及び／又は分化後の合成膜－レシーバー複合体の集団は、分化したヒト血液細胞の単一の種を含まない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、分化した成熟ヒト血液細胞ではない。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、万能ドナー、例えば血液型Ｏ、Ｒｈ因子陰性に由来する血液細胞からは作成されない。

【0825】

一部の実施形態において、合成膜－ＡＤＡポリペプチドレシーバー複合体は重症複合型免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）の治療には使用されない。

【0826】

一部の実施形態において、本明細書に記載される治療方法は、対象においてポリペプチドレシーバーに対する免疫寛容を誘導するのに有効な量でポリペプチドレシーバーと接触させる赤血球系細胞から作成された合成膜－レシーバー複合体を投与するステップを含まない。

【0827】

好適な標的には、生物学的化合物、無機又は有機化合物が含まれる。好適な標的は、１００Ｄａ未満、２５０Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、１０００Ｄａ未満から１ｋＤａを超える標的に至るまでのサイズ範囲であり得る。標的は、例えば、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子、代謝産物及び元素であってもよい。一部の実施形態において、標的は、抗体、補体因子、免疫複合体、血清アミロイドタンパク質、細菌性病原体、真菌性病原体、ウイルス性病原体、又は感染した、病原性の、アポトーシスを起こした、壊死した、異常な若しくは発癌性の哺乳類細胞である。

【0828】

合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の投与によって治療又は予防し得る循環系中の標的に関連する疾患、障害及び病態としては、限定はされないが、以下が挙げられる：自己抗体媒介性疾患、補体調節異常関連疾患、免疫複合体関連疾患、アミロイドーシス、感染性因子又は病原体に関連する疾患（例えば、細菌、真菌、ウイルス、寄生虫感染症）、毒性タンパク質に関連する疾患、脂質の蓄積に関連する疾患、アポトーシスの、壊死性の、異常な又は発癌性の哺乳類細胞に関連する疾患、及び代謝疾患。

【0829】

一部の実施形態において、疾患、例えば、限定はされないが、代謝疾患、癌、凝固疾患及び抗凝固疾患の治療方法が提供される。この方法は、本明細書に提供されるレシーバーを含む赤血球細胞の医薬組成物を、それを必要としている対象に、対象の代謝疾患、癌、凝固疾患又は抗凝固疾患を治療するのに十分な量で投与するステップを含む。

【0830】

自己抗体媒介性疾患
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、自己抗体に関連する疾患、障害又は病態を治療又は予防し得る。

【0831】

具体的な実施形態において、自己抗体媒介性疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的自己抗体の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的自己抗体の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0832】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する標的自己抗体に特異的に結合してそれを隔絶するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。

【0833】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、循環系における標的自己抗体負荷を低減し、それにより標的自己抗体の存在又は濃度上昇に関連する疾患、障害又は病態の負担を低減し得る。標的自己抗体に関連する疾患としては、限定はされないが、グッドパスチャー症候群、膜性糸球体腎症、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、劇症型抗リン脂質症候群（ＣＡＰＳ）、並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【0834】

自己抗体媒介性疾患は、体内に通常存在する物質及び組織に対する体の異常免疫応答によって生じる。これは特定の臓器に限られていることもあり（例えば自己免疫性甲状腺炎において）、又は例えば肺及び腎臓の両方の基底膜に発症し得るグッドパスチャー症候群など、別の場所にある特定の組織が関わることもある。自己抗体媒介性疾患の治療は、典型的には、シクロホスファミド及びリツキシマブなどの、免疫応答を低下させる免疫抑制薬治療を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物による治療は１つ以上の免疫抑制薬治療と併用され、有効な薬剤が例えば共投与されるか、又は共製剤化される。

【0835】

健常な対象では、免疫系は、体自身の健常なタンパク質、細胞、及び組織を認識して無視することが可能であり、食品など、環境中にある脅威とならない物質には過剰反応しない。免疫系が体内の通常の構成物の１つ以上を「自己」として認識しなくなると、病的自己抗体、即ち「自己」抗原を認識する抗体が生じ得る。これらの自己抗体は体自身の健常な細胞、組織、及び／又は臓器を標的化し、炎症及び組織損傷を引き起こし得る。

【0836】

特定の実施形態において、標的自己抗体によって認識されることが可能なエピトープを含むレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が提供される。例えば、標的自己抗体は、糖タンパク質（ＧＰ Ｉｂ－ＩＸ、ＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＩＶ、又はＩａ－ＩＩａ）、コラーゲンα３（ＩＶ）のＮＣ１ドメイン、Ｂ２グリコプロテイン１、又はホスホリパーゼＡ２受容体を特異的に認識することができ、レシーバーポリペプチドは、この群から選択される抗原ポリペプチドを含み得る。

【0837】

合成膜－レシーバーポリペプチド複合体によって隔絶された標的自己抗体は、例えば細網内皮系を通じて循環から除去され得る。標的自己抗体の隔絶及び／又は分解により、自己抗体が「自己」組織と相互作用したときに通常引き起こされる炎症の程度が低下し得る。

【0838】

一実施形態において、疾患又は病態は抗リン脂質症候群であり、レシーバーはβ２グリコプロテイン１又はその断片であり、及び標的はβ２グリコプロテイン１に対する病原性自己抗体である。

【0839】

一実施形態において、疾患又は病態は劇症型抗リン脂質症候群であり、レシーバーはβ２グリコプロテイン１又はその断片であり、及び標的はβ２グリコプロテイン１に対する病原性自己抗体である。

【0840】

一実施形態において、疾患又は病態は寒冷凝集素症であり、レシーバーはＩ／ｉ抗原又はその断片であり、及び標的はＩ／ｉ抗原に対する病原性自己抗体である。

【0841】

一実施形態において、疾患又は病態はグッドパスチャー症候群であり、レシーバーはコラーゲン（ＩＶ）のａ３ ＮＣ１ドメイン又はその断片であり、及び標的はコラーゲン（ＩＶ）のａ３ ＮＣ１ドメインに対する病原性自己抗体である。

【0842】

一実施形態において、疾患又は病態は免疫性血小板減少性紫斑病であり、レシーバーは血小板糖タンパク質（Ｉｂ－ＩＸ、ＩＩｂ－ＩＩＩａ、ＩＶ、Ｉａ－ＩＩａ）又はその断片であり、及び標的は血小板糖タンパク質に対する病原性自己抗体である。

【0843】

一実施形態において、疾患又は病態は膜性腎症であり、レシーバーはホスホリパーゼＡ２受容体又はその断片であり、及び標的はホスホリパーゼＡ２受容体に対する病原性自己抗体である。

【0844】

一実施形態において、疾患又は病態は温式抗体溶血性貧血であり、レシーバーはグリコホリンＡ、グリコホリンＢ、及び／又はグリコホリンＣ、Ｒｈ抗原又はその断片であり、及び標的はグリコホリン及び／又はＲｈ抗原に対する病原性自己抗体である。

【0845】

例示的自己抗体疾患は、グッドパスチャー症候群、劇症型抗リン脂質症候群、及び膜性糸球体症である。

【0846】

１．グッドパスチャー症候群
一部の実施形態において、対象は、グッドパスチャー症候群の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。グッドパスチャー症候群に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0847】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、α３ＩＶコラーゲン（ＣＯＬ４Ａ３）、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。ＣＯＬ４Ａ３は通常腎細胞に見られ、グッドパスチャー症候群に関連する自己抗体がそれに結合することが示されている標的を提示する。

【0848】

ＣＯＬ４Ａ３は、肺の空気嚢及び腎臓の糸球体に見られる。グッドパスチャー症候群に関連する自己抗体は糸球体基底膜を標的化し、腎臓損傷を引き起こし得る。ウイルス性呼吸器感染によるか、又は炭化水素溶剤の吸入によってこの障害が惹起された場合、その結果生じる免疫応答によって肺の空気嚢の出血及び腎臓の糸球体の炎症が起こり得る。

【0849】

２．劇症型抗リン脂質症候群（ＣＡＰＳ）
一部の実施形態において、対象は、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＡＰＳに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0850】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、β２グリコプロテイン１（ｂ２ＧＰＩ）、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。ｂ２ＧＰＩは通常内皮細胞上見られ、ＡＰＳに関連する自己抗体がそれに結合することが示されている標的を提示する。

【0851】

抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）は、持続陽性抗リン脂質抗体（ａＰＬ）に関連する血管血栓症及び／又は妊娠損失を特徴とする多系統自己抗体媒介性病態である。劇症型ＡＰＳ（ＣＡＰＳ）は最も重症型のＡＰＳであり、通常微小血栓症に関連して多臓器障害が短期間のうちに現れる。予備的分類基準に基づき「確診（ｄｅｆｉｎｉｔｅ）」及び「準確診（ｐｒｏｂａｂｌｅ）」ＣＡＰＳが定義されている；しかしながら、これらの基準を満たさない多臓器血栓症及び／又は血栓性微小血管症を有するａＰＬ陽性患者が見られる。過去のＡＰＳ診断及び／又は持続性の臨床的に有意なａＰＬ陽性は、ＣＡＰＳ診断にとって非常に重要である；しかしながら、ＣＡＰＳを発症する患者の略半数は、ａＰＬ陽性の既往がない。

【0852】

３．膜性糸球体症（ＭＧＮ）
一部の実施形態において、対象は、膜性糸球体腎炎、膜性腎炎（ＭＮ）とも称される膜性糸球体症（ＭＧＮ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＭＧＮに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0853】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ホスホリパーゼＡ２受容体、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。ホスホリパーゼＡ２受容体は通常タコ足細胞に見られ、ＭＧＮに関連する自己抗体がそれに結合することが示されている標的を提示する。

【0854】

膜性腎炎、又は膜性糸球体腎炎という用語は、腎組織の光学顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、及び電子顕微鏡検査法で、肥厚した糸球体基底膜（ＧＢＭ）及びＧＢＭスパイク、糸球体の全てのループ状毛細血管の末梢に沿ったＩｇＧ及び補体の顆粒状染色、並びに顆粒状ＩｇＧ染色に対応する高電子密度の上皮下沈着物を含めた一組の明らかな形態学的特徴を糸球体に示す慢性糸球体疾患を記載して使用される。

【0855】

臨床的には、ほとんどの患者がネフローゼ症候群を呈し、又は定期検尿でタンパク尿が検出される。世界中のあらゆる年齢層及び人種並びに両性で特発性ＭＮが起こり、白人成人におけるネフローゼ症候群の主因となっている。小児では疾患の自然寛解が一般的であるが、成人にも起こる。個々の患者の治療には、多くの場合に数種の免疫抑制薬が使用されるが、治療の有無に関わらず、約３分の１の患者は末期腎疾患に進行する。

【0856】

補体調節異常関連疾患
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、補体調節異常に関連する疾患、障害又は病態が治療又は予防され得る。

【0857】

具体的な実施形態において、補体調節異常に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的補体タンパク質の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的補体タンパク質の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0858】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する標的補体タンパク質に特異的に結合してそれを隔絶するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。

【0859】

特定の実施形態において、本発明の治療用組成物は、補体の病態生理又は不適切な免疫複合体クリアランスに関連する疾患、障害若しくは病態を治療し、予防し、又はその重症度を低減するのに有用な、組成物中におけるレシーバーを含む機能性赤血球系細胞を提供する。

【0860】

具体的な実施形態において、補体調節異常に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的補体タンパク質の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的補体タンパク質の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0861】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する標的補体タンパク質に特異的に結合してそれを隔絶するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。

【0862】

補体の過剰活性化に関連する疾患又は病態、例えば、全身性エリテマトーデス、虚血再灌流傷害、臓器移植、心筋梗塞、関節リウマチ、強皮症、結節性多発性動脈炎、血清病、アルサス反応、農夫肺、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、細菌性心内膜炎、血管炎、及び他のＩＩＩ型過敏症病態などを治療するのに有効な量で存在する治療組成物が提供される。さらに、血中にオプソニン化病原体が存在する感染症、例えば、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌、薬物耐性淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、完全耐性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、薬物耐性結核、全身細菌性敗血症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、又はマラリアを治療することが可能な量で存在する治療組成物が提供される。さらなる実施形態において、補体因子欠損関連疾患、例えば、Ｈ補因子欠損症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、Ｂ因子欠損症、Ｄ因子欠損症、Ｃ１ｑ欠損症、Ｃ１ｒ欠損症、Ｃ４欠損症、Ｃ２欠損症、Ｃ３欠損症、Ｃ５欠損症、Ｃ６欠損症、Ｃ７欠損症、Ｉ因子欠損症、Ｄ因子欠損症、ＭＢＬ欠損症、ＭＡＳＰ２欠損症、ＣＤ５５欠損症、ＣＤ５９欠損症、及びその他の、限定はされないが表６及び表８に掲載されるものを含めた補体活性に関連する遺伝子の欠損を治療するのに有効な量で存在する治療組成物が提供される。

【0863】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、循環系における標的補体タンパク質負荷を低減し、それにより標的補体タンパク質の存在又は濃度上昇に関連する疾患、障害又は病態の負担を低減し得る。補体調節異常に関連する疾患としては、限定はされないが、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）欠損症並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【0864】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、以下からなる群から選択される補体タンパク質と特異的に相互作用し得る：Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、及びＣ９、Ｂ因子、Ｄ因子、プロパージン、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、Ｃ３ｄｋ、Ｃ３ｅ、Ｂｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、並びに表５及び表１０。

【0865】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｈ因子、ＣＲ１、Ｉ因子、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｃ３ａＲ、Ｃ３ｅＲ、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、Ｃ３β鎖受容体、Ｃ１インヒビター、Ｃ４結合タンパク質、及び表１０に掲載されるものを含み得る。

【0866】

相同制限因子微生物タンパク質ＮａｌＰ、微生物タンパク質ＳｐｅＢ、微生物タンパク質ＥｓｐＰ、それらの誘導体又は機能断片。それに代えて又は加えて、レシーバーポリペプチドは、異なる起源の１つ以上の補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール及び／又はショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）を含み得る。

【0867】

補体系は、７個の血清タンパク質及び９個の膜調節タンパク質、１個の漿膜調節タンパク質（ｓｅｒｏｓａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び補体断片に結合する８個の細胞膜受容体を含む３２個より多いタンパク質で構成される。炎症反応の開始に伴い補体の活性化が起こり、そのほとんどが血管内腔で起こる。補体の可溶性成分は循環中に、また体液及び組織中にも存在する。抗原抗体複合体によって誘導される特異的活性化に加え、補体はパターン認識受容体によって活性化され、この受容体は、病原体の表面上に存在する分子構造の反復パターン（病原体関連分子パターン）に基づき自己抗原と非自己抗原とを区別する能力を有する。補体活性化パターン認識受容体には、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、フィコリン、Ｃ反応性タンパク質、Ｃ１ｑ、及び天然ＩｇＭ（ＩｇＭ）が含まれる。

【0868】

過剰な、調節が解除された、又は慢性的な炎症は、幾つかの病的状態を惹起し、又はそれに寄与し得る。例えば、炎症反応の間における補体の活性化は、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）状況、様々な病因の脈管炎、腎炎、及び関節炎で起こる炎症が引き起こす組織傷害に寄与する。補体成分の欠損もまた、自己免疫反応で観察されるとおりの組織傷害をもたらし得る。さらに、補体調節タンパク質の発現が変化することにより、補体が過剰に活性化することがあり、これもまた組織傷害に寄与し得る。

【0869】

一実施形態において、疾患又は病態は加齢性黄斑変性症であり、レシーバーは好適な補体調節タンパク質又はその断片であり、及び標的は活性補体である。

【0870】

一実施形態において、疾患又は病態は非定型溶血性尿毒症症候群であり、レシーバーは補体Ｈ因子、又は好適な補体調節タンパク質又はその断片であり、及び標的は活性補体である。

【0871】

一実施形態において、疾患又は病態は補体因子Ｉ欠損症であり、レシーバーは補体Ｉ因子、好適な補体調節タンパク質又はその断片であり、及び標的は活性補体である。

【0872】

一実施形態において、疾患又は病態は発作性夜間ヘモグロビン尿症であり、レシーバーは好適な補体調節タンパク質又はその断片であり、及び標的は活性補体である。

【0873】

一実施形態において、疾患又は病態は自己免疫性溶血性貧血であり、レシーバーは好適な補体調節分子又はその断片であり、及び標的は活性補体である。

【0874】

一実施形態において、疾患又は病態は非アルコール性脂肪性肝炎であり、レシーバーは好適な補体調節分子又はその断片であり、及び標的は活性補体である。

【0875】

１．発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）
一部の実施形態において、対象は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＰＮＨに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0876】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、Ｈ補因子、又はその誘導体若しくは機能断片などの補体調節タンパク質を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されるものであってよく、炎症を抑えるために投与され得る。

【0877】

発作性夜間ヘモグロビン尿症は、早世及び血液細胞産生の障害をもたらす後天性の障害である。この障害は、赤血球、白血球）、及び血小板（栓球）を冒す。ＰＮＨは両性に等しく発症し、いずれの年齢でも起こり得るが、ほとんどの場合に青年期に診断される。

【0878】

発作性夜間ヘモグロビン尿症患者は症状の突発的な再発エピソードを有し（発作性症状）、これは感染又は労作などの体にかかるストレスによって引き起こされ得る。こうしたエピソードの間に、赤血球は早期に破壊される（溶血）。罹患者の排尿はヘモグロビンが存在するため暗色尿となり得る（ヘモグロビン尿症）。全てではないが、多くの症例で、ヘモグロビン尿症は夜間に膀胱に蓄積した尿の朝の排尿時に最も顕著である（夜間）。

【0879】

赤血球の早期破壊によって血中でこれらの細胞が欠乏し（溶血性貧血）、それにより疲労、脱力、異常に青白い皮膚（蒼白）、息切れ、及び心拍数の増加などの徴候及び症状が起こり得る。ＰＮＨ患者はまた、白血球の欠乏に起因して、感染症に罹り易いこともある。

【0880】

ＰＮＨに関連する異常な血小板は血液凝固プロセスに問題を引き起こし得る。結果として、この障害を有する患者は、特に腹部大静脈に血液凝固異常（血栓症）；又は頻度は低いものの、重度の出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）（出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ））のエピソードを起こし得る。

【0881】

２．非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）
一部の実施形態において、対象は、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ａＨＵＳに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0882】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、補因子Ｉ、又はその誘導体若しくは機能断片などの補体調節タンパク質を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されるものであってよく、炎症を抑えるために投与され得る。

【0883】

非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）は、溶血、血小板減少症、及び腎不全のまれな症候群である。この血栓性微小血管症に罹患した患者の６０％以上において、補体の第二経路における遺伝子突然変異が原因である。ａＨＵＳは、血漿療法、補体遮断、及び／又は肝移植を用いて治療され得る。ａＨＵＳは他の血栓性微小血管症の発現特徴の多くを共有し、発現時点で確証的な遺伝的結果は利用可能でないため、診断は、血栓性微小血管症の別の原因の徴候が存在しない場合の診断と一致する臨床的症候群の認識に強く依存する。

【0884】

３．加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）
一部の実施形態において、対象は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＡＭＤに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0885】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ＣＤ５５及びＣＤ５９などの補体調節タンパク質、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されるものであってよく、炎症を抑えるために投与され得る。

【0886】

加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は西欧諸国における失明の一般的な形態であり、補体調節Ｈ因子、中心補体成分Ｃ３、Ｂ因子、Ｃ２、及びまたＩ因子を含めた幾つかの補体遺伝子の遺伝的変異によって疾患のリスクがもたらされる。しかしながら、ヒト第１染色体上のＨ因子遺伝子クラスターにおける染色体セグメントの欠失は、最終経路調節因子ＣＦＨＲ１、及び推定補体調節因子ＣＦＨＲ３の欠損をもたらすものであり、ＡＭＤの発症に対して保護作用を有する。Ｈ因子遺伝子は、選択的にプロセシングされる転写物から誘導される２つのタンパク質、Ｈ因子とＦＨＬ１とをコードする。詳細には、Ｈ因子及びＦＨＬ１の両方の４０２位における配列変異がＡＭＤのリスクに関連する。４０２位のチロシン残基が保護的変異体に相当し、及びヒスチジン残基がリスク変異体に相当する。ＡＭＤは慢性炎症性疾患と見なされ、これは持続的に活性化される第二補体経路が不完全且つ不適切に調節されて引き起こされ得る。この活性化により補体エフェクター産物及び炎症性メディエーターが生じ、それらがさらなる炎症反応を刺激する。不完全な調節によって免疫沈着物ドルーゼンが形成され、最終的に網膜色素上皮細胞の損傷、それらの上皮細胞とブルッフ膜との接合面の断裂及び視力喪失につながる。

【0887】

免疫複合体関連疾患
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、免疫複合体又は免疫複合体クリアランス不全に関連する疾患、障害又は病態が治療又は予防され得る。

【0888】

具体的な実施形態において、免疫複合体に関連する疾患、障害又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的免疫複合体の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、合成膜－補体受容体１（ＣＲ１）レシーバー複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的免疫複合体の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0889】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する標的免疫複合体に特異的に結合してそれを隔絶する合成膜－補体受容体１（ＣＲ１）レシーバー複合体が投与される。

【0890】

一部の実施形態において、補体受容体１（ＣＲ１）を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞が、循環中に免疫複合体を示す対象に投与され得る。例えば、補体受容体１（ＣＲ１）を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団は免疫複合体内のＣ３ｂと結合することができ、肝臓を介した循環からの除去及びクリアランスが起こり得る。

【0891】

高レベルのＣＲ１を含む複数の機能性赤血球系細胞などの、赤血球結合ＣＲ１レシーバーを含む組成物が、好ましくは、免疫複合体関連障害又は疾患などの、免疫複合体形成の過剰によって生じた病状又は天然ＣＲ１レベルの低下若しくは枯渇を引き起こした病状と診断されているか、又はそれに罹っている疑いがある対象に投与される。

【0892】

特定の実施形態において、本医薬組成物は循環系における標的免疫複合体負荷を低減し、及び／又は影響を受け易い軟部組織における免疫複合体の沈着を予防し、それにより標的免疫複合体の存在又は濃度上昇に関連する疾患、障害又は病態の負担を低減する。補体調節異常に関連する疾患としては、限定はされないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、デンスデポジット病、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、免疫複合体性血管炎、寒冷凝集素症、多発筋炎、急性肺出血、膜性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、微量免疫型糸球体腎炎、血液過粘稠度症候群、及び皮膚白血球破砕性血管炎並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【0893】

特定の実施形態において、標的免疫複合体は、ｉ）ＩｇＭ又はＩｇＧ、及びｉｉ）Ｃ３ｂ及び／又はＣ４ｂを含む。

【0894】

特定の実施形態において、ＣＲ１レシーバーは、１つ以上の補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）及び／又はロング相同リピート（ＬＨＲ）を含む。一部の実施形態において、ＣＲ１レシーバーは、完全長ＣＲ１ポリペプチドの機能断片を含む。

【0895】

ＩＩＩ型反応、又は免疫複合体反応は、組織に沈着している抗原抗体（免疫）複合体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）に応答した補体の活性化により引き起こされる組織損傷を特徴とする。抗原抗体複合体が形成されると、それらは体の様々な組織、特に血管、腎臓、肺、皮膚、及び関節に沈着する。免疫複合体が沈着すると炎症反応が引き起こされ、それによって組織損傷性の酵素及びインターロイキン－１が放出され、発熱が生じる。免疫複合体は、全身性エリテマトーデス（結合組織の炎症性障害）、ほとんどのタイプの糸球体腎炎（腎臓の毛細血管の炎症）、及び関節リウマチなど、多くの自己免疫疾患の根底にある。

【0896】

ＩＩＩ型過敏性反応は、抗原が肺に吸入されることによって起こり得る。幾つもの病態が、かびの生えた乾草からの真菌胞子によって引き起こされる農夫肺；粉末状のハトの糞のタンパク質が原因で起こるハト愛好者肺；及び温度・湿度が調節されたオフィスにおいて空調装置で増殖して微細液滴中に分散するようになり得る通常は無害な原虫が引き起こす加湿器熱を含め、このタイプの抗原曝露に原因があるとされる。いずれの場合も、人は媒介物に対するＩｇＧ抗体が血中を循環する状態で抗原に感作されることになる。抗原の吸入が反応を刺激して胸部絞扼感、発熱、及び倦怠を引き起こし、症状は通常は１日～２日で消失するが、個体が抗原に再曝露されると再発する。個体が繰り返し曝露されない限り、損傷が永久的であることはまれである。温暖な国で綿、サトウキビ、又はコーヒー廃棄物を取り扱う作業者のある種の職業病も同様の原因であり、通常、感作抗原は、廃棄物自体というよりむしろ、廃棄物で増殖する真菌類によってもたらされる。

【0897】

一実施形態において、疾患又は病態はＩｇＡ腎症であり、レシーバーは補体受容体１又はその断片であり、及び標的は免疫複合体である。

【0898】

一実施形態において、疾患又は病態はループス腎炎であり、レシーバーは補体受容体１又はその断片であり、及び標的は免疫複合体である。

【0899】

一実施形態において、疾患又は病態は全身性エリテマトーデスであり、レシーバーは補体受容体１又はその断片であり、及び標的は免疫複合体である。

【0900】

１．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
一部の実施形態において、対象は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＳＬＥに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0901】

特定の実施形態において、ＣＲ１レシーバーは、循環免疫複合体の構成物である標的Ｃ３ｂと相互作用する。一部の実施形態において、免疫複合体は、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体に結合すると、細網内皮系によって分解される。

【0902】

全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、症状が不定で再発寛解の経過をたどる慢性炎症性疾患である。ＳＬＥの症例の９０％超が女性に起こり、出産可能年齢で発病する頻度が高い。ＳＬＥは、略あらゆる器官系に発症し得る慢性自己免疫疾患であり；従って、その発症及び経過には、緩徐進行型から劇症型にまで及ぶ大きいばらつきがある。頬部発疹、潰瘍／皮膚粘膜病変、腎病変、タンパク尿、尿細胞円柱、発作、血小板減少症、溶血性貧血、発熱、及びリンパ節症を含め、幾つかの臨床症状は成人と比べて小児期発症ＳＬＥに見られることが多い。成人では、レイノー現象、胸膜炎及び乾燥症が小児及び青年期の２倍見られる。出産可能年齢の女性に発熱、関節痛、及び発疹の三主徴があれば、直ちにＳＬＥの診断に向けて調査すべきである。

【0903】

ＳＬＥは、自己抗体の産生を伴う多系統炎症を特徴とする自己免疫障害である。自己抗体は、ＳＬＥの初発症状が発症するより何年も前から存在し得る。さらに、ループス患者のＴ細胞は、シグナル伝達及びエフェクター機能の両方に欠陥を示す（例えば、インターロイキン（ＩＬ）－２の分泌低下）。Ｔ細胞の異常は治療の標的となり、例えばベリムマブは、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙｓ）シグナル伝達経路を標的化する。

【0904】

ＳＬＥの多くの臨床症状は、様々な組織で抗原と形成される循環免疫複合体によって媒介されるか、又は細胞表面成分に対する抗体の直接の効果である。免疫複合体は微小血管系で形成され、補体活性化及び炎症をもたらす。さらに、抗体－抗原複合体は皮膚及び腎臓の基底膜に沈着する。活性ＳＬＥでは、このプロセスは、これらの部位におけるＤＮＡなどの核内抗原、免疫グロブリン、及び補体タンパク質の複合体を示すことによって確認されている。自己抗体（例えば、ループス抗凝固因子（ＬＡ）、及び抗リボソームＰ抗体）をバイオマーカーとして使用して、ＳＬＥにおけるさらなる神経精神病学的イベントを決定することができる。他の指標としては、略全ての活性ＳＬＥ患者に見られる血清抗核抗体（ＡＮＡ）の存在が挙げられる。天然二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する抗体は、ＳＬＥの診断に比較的特異性がある。細胞傷害性Ｔ細胞及びサプレッサーＴ細胞（通常は免疫応答を下方調節する）は低下する。ポリクローナルＴ細胞細胞溶解活性の生成は損なわれる。ヘルパー（ＣＤ４^＋）Ｔ細胞は増加する。動物ループスモデルでは、免疫寛容の欠如が観察される。

【0905】

２．ＩｇＡ腎症
一部の実施形態において、対象は、ＩｇＡ腎症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＩｇＡ腎症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0906】

特定の実施形態において、ＣＲ１レシーバーは、循環ＩｇＡ免疫複合体の構成物である標的Ｃ３ｂと相互作用する。一部の実施形態において、免疫複合体は、合成膜－ＣＲ１レシーバー複合体に結合すると、細網内皮系によって分解される。

【0907】

ベルジェ病としても知られるＩｇＡ腎症は、ＩｇＡ免疫複合体の蓄積に関連する腎疾患である。免疫複合体の存在が原因となって局所炎症が起こり、腎臓が血液から排泄物、過剰の水及び電解質をろ過する能力が低下する。腎臓損傷は、尿中の血液及びタンパク質、高血圧及び足の腫脹が指標となり得る。

【0908】

ＩｇＡ腎症は、通常、何年にもわたって緩慢に進行する。対象の中には、問題を生じることなくその尿中に血液が出る者もあれば、最終的に完全寛解を得る者もあり、また末期腎不全を発症する者もある。

【0909】

ＩｇＡ腎症は世界中で最も一般的な糸球体腎炎である。臨床的には血尿及びタンパク尿によって特徴付けられる；ＩｇＡＮ患者の約２０～３０％が疾患の発生から１０～２０年以内に進行性腎不全を発症する。組織学的には、糸球体メサンギウムが、ＩｇＡ１、Ｃ３補体成分、及びそれほど頻繁ではないがＩｇＧ及び／又はＩｇＭの沈着を含む。ＩｇＡ１、Ｃ３、及びＩｇＧで構成される循環免疫複合体（ＣＩＣ）が、この疾患の病因に関わる。

【0910】

ＩｇＡＮ患者の血清ＩｇＡ１は、グリカン側鎖の変化を呈し得る。ヒトＩｇＡ１はＮ－結合型及びＯ－結合型グリカンを含む。ＩｇＡＮ患者のＩｇＡ１はグリカン部分の変化を示し、通常はガラクトース（Ｇａｌ）含量が減少する。Ｇａｌ欠損ＩｇＡ１は、ＩｇＧとのＣＩＣに存在し得る。ＩｇＡＮ患者の血清のＩｇＡ１は、末端ＧａｌＮＡｃに特異的なレクチン、例えばヘリックスアスペルサ（Ｈｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ）（ＨＡＡ）又はヘリックスポマチア（ＨＰＯ）との結合の増加を呈する。

【0911】

アミロイドーシス
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用してアミロイドーシスを治療又は予防し得る。一部の実施形態では、レシーバーポリペプチドを含有しない膜－レシーバー複合体が用いられる。レシーバーは、例えばグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であってもよい。

【0912】

具体的な実施形態において、アミロイド斑に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的血清アミロイドタンパク質の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0913】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する標的血清アミロイドタンパク質又は標的アミロイド斑に特異的に結合し、それを隔絶し、及び／又はそれを分解するレシーバーを含む合成膜－レシーバー複合体が投与される。

【0914】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、循環系における標的血清アミロイドタンパク質又はアミロイド斑負荷を、例えば軟部組織におけるその沈着を防止して低減し、それによりアミロイドーシスの負担を低減する。アミロイドーシスとしては、限定はされないが、ＡＡアミロイドーシス、軽鎖（ＡＬ）アミロイドーシス、β２ミクログロブリンアミロイドーシス並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【0915】

特定の実施形態において、レシーバーポリペプチドは、アミロイドＰタンパク質、アミロイドＡタンパク質、軽鎖、ミスフォールドトランスサイレチン、及びフィブリノゲンα鎖からなる群から選択される標的血清アミロイドタンパク質と特異的に相互作用し得る。

【0916】

アミロイドーシスは、アミロイド斑の蓄積に関連するまれな疾患である。アミロイドーシスは、例えば、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、神経系及び消化管など、種々の臓器に発症し得る。重篤なアミロイドーシスは、生命を脅かす臓器不全を引き起こし得る。

【0917】

西洋諸国では、およそ１，０００人に１人の死因が後天性全身性アミロイドーシスであると考えられ、高齢者に最もよく見られる。全身性ＡＬアミロイドーシスが最も一般的で重症型であり、症例の６０％超を占める。透析関連β_２－ミクログロブリンアミロイドーシスは全世界で約１００万人の患者が罹患している。老人性トランスサイレチン（ＡＴＴＲ）アミロイドーシスは、主に心臓が関わるものであり、８０歳を超える患者の約４分の１に起こる。

【0918】

一実施形態において、疾患又は病態はＡＡアミロイドーシスであり、レシーバーは血清アミロイドＡタンパク質又は血清アミロイドＰ成分に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は血清アミロイドＡタンパク質及びアミロイド斑である。

【0919】

一実施形態において、疾患又は病態はβ２ミクログロブリンアミロイドーシスであり、レシーバーはβ－２ミクログロブリン又は血清アミロイドＰ成分に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はβ－２ミクログロブリン又はアミロイド斑である。

【0920】

一実施形態において、疾患又は病態は軽鎖アミロイドーシスであり、レシーバーは軽鎖、血清アミロイドＰ成分に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は抗体軽鎖又はアミロイド斑である。

【0921】

１．ＡＡアミロイドーシス
一部の実施形態において、対象は、ＡＡアミロイドーシスの治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＡＡアミロイドーシスに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0922】

ＡＡアミロイドーシスは、慢性感染症及び炎症性疾患の合併症、又は急性期反応物質ＳＡＡの長期過剰産生をもたらす任意の病態である。アミロイド線維はＳＡＡのＮ末端切断断片（ＡＡタンパク質）で構成される。ＡＡアミロイドーシスは、関節リウマチ、若年性特発性関節炎及びクローン病の患者の１％～５％に起こる。結核及びらいもまた、世界の一部の地域ではＡＡアミロイドーシスの重要な原因である。多くの患者がタンパク尿を示し、時間が経つにつれて肝臓及び胃腸病変が起こり得る。

【0923】

２．ＡＬアミロイドーシス
一部の実施形態において、対象は、ＡＬアミロイドーシスの治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＡＬアミロイドーシスに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0924】

全身性ＡＬは、モノクローナルＢ細胞悪液質患者の約２％に起こる。ＡＬ線維はモノクローナル免疫グロブリン軽鎖に由来し、通常、腎臓、心臓、肝臓及び末梢神経を冒す。

【0925】

３．β２－ミクログロブリンアミロイドーシス
一部の実施形態において、対象は、β２－ミクログロブリンアミロイドーシスの治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。β２－ミクログロブリンアミロイドーシスに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0926】

β_２－ミクログロブリンアミロイド沈着は透析依存慢性腎不全患者に起こり、主として関節及び関節周囲の構造に発症する。典型的には、肩関節、膝関節、手首関節及び手の小関節の関節痛；関節腫脹及び手根管症候群が引き起こされる。アミロイド線維前駆体タンパク質はβ_２－ミクログロブリンであり、これは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のインバリアント鎖であって、あらゆる有核細胞で発現する。これは通常は糸球体で自由にろ過され、近位尿細管細胞に再吸収されて異化されるため、腎機能が低下すると、比例してその濃度が上昇する。末期腎不全に対する透析開始から３年以内に患者の２０％～３０％に疾患関連アミロイドーシス（ＤＲＡ）が見られる。

【0927】

一部の実施形態において、レシーバーポリペプチドを含有しない膜－レシーバー複合体が、アミロイドーシスの治療及び／又は血清アミロイドタンパク質又はアミロイド斑の低減に使用される。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバー複合体の表面上に呈示されるものであってよく、投与されると循環アミロイド形成前駆体に結合し得る。特定の実施形態では、アミロイド沈着の形成が防止される。

【0928】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されるものであってよく、投与されるとアミロイドの凝集を防止する。血清アミロイドＰ成分（タンパク質ＳＡＰ）は、インビトロで一次型及び二次型の両方の単離アミロイド線維に結合することが記載されている。

【0929】

感染病原体媒介性疾患及び病態
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、感染病原体に関連する疾患、障害又は病態が治療又は予防され得る。

【0930】

一部の実施形態において、循環病原体に特異的なレシーバーを含む機能性赤血球系細胞が、それを必要としている対象に、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌、薬物耐性淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、完全耐性肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、薬物耐性結核、全身細菌性敗血症、ヒト免疫不全ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、又はマラリアなどの、オプソニン化病原体が血中に存在する感染症を治療するのに有効な量で投与される。一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、限定はされないが表５の標的を含めた循環病原体に特異的なレシーバーを含む。

【0931】

具体的な実施形態において、感染症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的感染病原体の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的感染病原体の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0932】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する細菌、ウイルス、真菌、又は寄生虫などの感染病原体に特異的に結合し、それを隔絶し、及び／又はそれを分解するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。

【0933】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の投与により、感染病原体の血漿力価、例えばウイルス力価が低下する。

【0934】

特定の実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の投与により、感染病原体が単位時間当たりに十分な宿主細胞に接触する能力が低下する。宿主細胞の感染率の低下は、感染病原体が感染を持続させる能力の喪失又は対象宿主に対する有害効果を持続させる能力の喪失の増加と相関し得る。感染は抑制及び／又は阻止され得る。

【0935】

特定の実施形態において、本医薬組成物は、感染を減速させ又は止め且つ免疫系のその防御を補助して循環系における標的感染病原体負荷を低減し、それにより感染症の負担を低減する。感染症としては、限定はされないが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、エボラ、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、Ｃ．ボツリヌス（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、炭疽菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、マラリア並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【0936】

一実施形態において、疾患又は病態は炭疽菌（Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ））感染症であり、レシーバーはＢ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＢ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）である。

【0937】

一実施形態において、疾患又は病態はＣ．ボツリヌス（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）感染症であり、レシーバーはＣ．ボツリヌス（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＣ．ボツリヌス（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）である。

【0938】

一実施形態において、疾患又は病態はＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症であり、レシーバーはＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＣ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）である。

【0939】

一実施形態において、疾患又は病態はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）感染症であり、レシーバーはカンジダ表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はカンジダである。

【0940】

一実施形態において、疾患又は病態は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症であり、レシーバーは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

【0941】

一実施形態において、疾患又は病態はエボラ感染症であり、レシーバーはエボラ表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はエボラである。

【0942】

一実施形態において、疾患又は病態はＢ型肝炎（ＨＢＶ）感染症であり、レシーバーはＨＢＶ表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＨＢＶである。

【0943】

一実施形態において、疾患又は病態はＣ型肝炎（ＨＣＶ）感染症であり、レシーバーはＨＣＶ表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＨＣＶである。

【0944】

一実施形態において、疾患又は病態はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症であり、レシーバーはＨＩＶエンベロープタンパク質又はＣＤ４又はＣＣＲ５に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＨＩＶである。

【0945】

一実施形態において、疾患又は病態はＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染症であり、レシーバーはＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）である。

【0946】

一実施形態において、疾患又は病態は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染症であり、レシーバーは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）表面タンパク質に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である。

【0947】

１．細菌感染症
一部の実施形態において、対象は、細菌感染症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。細菌感染症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0948】

一部の実施形態において、標的は細菌である。特定の実施形態において、標的は細菌性抗原を含む。一部の実施形態において、細菌性抗原は、細胞表面抗原、分泌毒素、又は分泌細菌性抗原を含む。

【0949】

菌血症は、血中に細菌が存在するものである。感染症に続発するグラム陰性菌血症は、通常、褥瘡性潰瘍を有する患者の泌尿生殖器系又は胃腸管、又は皮膚から発生する。慢性疾患患者及び免疫不全患者はグラム陰性菌血症を起こすリスクが高い。これらの患者はまた、グラム陽性球菌、嫌気性菌、及び真菌による菌血症も発症し得る。ブドウ球菌性菌血症は注射薬物使用者によく見られる。バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）菌血症は、腹部及び骨盤、特に女性生殖器の感染症患者に発症し得る。菌血症を引き起こす可能性が最も高い細菌には、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）のメンバー、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。

【0950】

本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物によって治療し得る細菌感染症としては、限定はされないが、マイコバクテリア、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、腸管毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）が挙げられる。菌血症が報告されている他の病原体としては、以下が挙げられる：リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、バルトネラ・ヘンセレ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クラミジア属（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）；エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコプラズマ属種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）；蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）；ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；及びクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。

【0951】

一部の実施形態において、感染性細菌性疾患の治療に膜－レシーバーポリペプチド複合体が用いられ得る。好適なレシーバーポリペプチドは、例えばＣＤ１４又はその機能断片を含み得る。ＣＤ１４は単球／マクロファージに関連し、グラム陰性菌に関連するリポ多糖並びにグラム陽性菌バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に関連するリポタイコ酸を結合する。他の好適なレシーバーは、アデニル酸シクラーゼ（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、Ｇａｌα１－４Ｇａｌ含有イソレセプター（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、複合糖質受容体（腸内細菌）、ルイス（ｂ）血液型抗原受容体（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、ＣＲ３受容体、プロテインキナーゼ受容体、ガラクトースＮ－アセチルガラクトサミン阻害性レクチン受容体、ケモカイン受容体（レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ））、アネキシンＩ（メキシコリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａ））、ＡｃｔＡタンパク質（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、髄膜炎菌性ビルレンス関連Ｏｐａ受容体（髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ））、急性過剰（α）５β３インテグリン（ａｃｕｔｅ ｏｖｅｒ（α）５β３ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）（マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）－Ｍ）、ヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体、ＣＤ６６受容体、インテグリン受容体、膜補因子タンパク質、ＣＤ４６、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、及びＣＤ３（淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、ＫＤＥＬ 受容体（シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ））、上皮成長因子受容体（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、β１インテグリン（赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ））、非グリコシル化Ｊ７７４受容体（連鎖球菌）又はこれらの組み合わせ又は機能断片を含み得る。

【0952】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は２つ以上のレシーバーを含み得る。一方のレシーバーは標的と相互作用するように機能し得ると共に、他方のレシーバーは標的を修飾して、例えば、標的の完全性を破壊し、分解のため標的を標識し及び／又は標的を不活性化し得る。例えば、標的が細菌である場合、一方のレシーバーが標的細菌と（例えばレシーバーが抗体様機能を含む場合、エピトープとの相互作用によって）相互作用するように機能する。他方のレシーバーは、細菌の細胞膜を破る能力を有し得る。好適な第２のレシーバーとしては、例えば、リゾチーム、殺菌性透過性増加ペプチド、プロテアーゼ、及び他のポア形成抗菌剤が挙げられる。例えば、リゾチームレシーバーは、ペプチドグリカンにおけるＮ－アセチルムラミン酸残基とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基との間及び特定の細菌のキトデキストリンにおけるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基間の１，４－β結合を加水分解し得る。

【0953】

或いは、第２のレシーバーは、細菌と接触し得る静菌剤又は殺菌剤を含み得る。さらに別の代替例は、合成膜－レシーバー複合体が、細菌と接触し得る静菌剤又は殺菌剤が（例えば負荷によって）含むものである。レシーバー又は複合体と関連付け得る静菌剤又は殺菌剤の例としては、限定はされないが、β－ラクタム系化合物（ペニシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、チカルシリン、アモキシシリン、カルベニシリン、ピペラシリン）；セファロスポリン系及びセファマイシン系（セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファロチン、セファピリン、セフラジン、セファクロル、セファマンドール、セフォニシド、セフロキシム、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォラニド、セフォキシチン、セフメタゾール、セフォテタン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフタジジン（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｎｅ）、セフチゾキシン（ｃｅｆｔｉｚｏｘｉｎｅ）、セフトリアキソン、セフィキシム、セフポドキシム、プロキセチル、セフジニル、セフジトレン、ピボキシル、セフチブテン、モキサラクタム、セフェピム）；他のβラクタム系薬物（アズトレオナム、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム）；細胞壁膜活性薬剤（バンコマイシン、テイコプラニン、ダプトマイシン、ホスホマイシン、バシトラシン、サイクロセリン）；テトラサイクリン系（テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン）；マクロライド系（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、テリスロマイシン）；クリンダマイシン；コラムフェニコール（ｃｈｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）；キヌプリスチン・ダルホプリスチン；リネゾリド；アミノグリコシド系（ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、シソマイシン、ネチルマイシン）；スペクチノマイシン；スルホンアミド系（スルファシチン、スルフイソキサゾール、シルファメチゾール（ｓｉｌｆａｍｅｔｈｉｚｏｌｅ）、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファピリジン、スルファドキシン）；トリメトプリム；ピリメタミン；トリメトプリム・スルファメトキサゾール；フルオロキノロン系（シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン）；コリスチンメタナトリウム、馬尿酸メテナミン、マンデル酸メテナミン、メトロニダゾール、ムピロシン、ニトロフラントイン、及びポリミキシンＢが挙げられる。抗マイコバクテリア薬の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：イソニアジド、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、ピラジナミド、エタンブトール、エチオナミド、カプレオマイシン、クロファジミン、及びダプソーン。

【0954】

一部の実施形態において、１つ以上の静菌剤又は殺菌剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体との共投与を含む、細菌感染症の治療方法が提供され、ここで共投与には、合成膜－レシーバー複合体の投与前、その投与後又はその投与と同時の静菌剤又は殺菌剤の投与が含まれる。

【0955】

一部の実施形態において、１つ以上の静菌剤又は殺菌剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体とを含む医薬組成物の投与を含む、細菌感染症の治療方法が提供される。

【0956】

一部の実施形態において、レシーバーは標的を直接修飾することなく標的細菌を隔絶し、それを循環系に分布させ得る。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、関連する標的細菌を細網内皮系による分解に供し得る。

【0957】

２．真菌感染症
一部の実施形態において、対象は、真菌感染症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。真菌感染症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0958】

一部の実施形態において、標的は真菌である。特定の実施形態において、標的は真菌性抗原を含む。一部の実施形態において、真菌性抗原は、細胞表面抗原、分泌毒素、又は分泌真菌性抗原を含む。

【0959】

真菌血症（カンジダ血症、カンデデミア（ｃａｎｄｅｄｅｍｉａ）、及び侵襲性カンジダ症としても知られる）は、血中に真菌類又は酵母が存在するものである。最も一般的に知られる病原体は、真菌血症の約７０％の原因となっているカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、次に１０％がカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、及び１％がアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である。Ｔ．グラブラタ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、及びＣ．パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）の感染もまた起こり得る。

【0960】

一部の実施形態において、感染性真菌疾患の治療に膜－レシーバーポリペプチド複合体が用いられ得る。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は２つ以上のレシーバーを含み得る。一方のレシーバーは標的と相互作用するように機能し得ると共に、他方のレシーバーは標的を修飾して、例えば、標的の完全性を破壊し、分解のため標的を標識し及び／又は標的を不活性化し得る。第２のレシーバーは、真菌と接触し得る抗真菌剤を含み得る。別の実施形態では、合成膜－レシーバー複合体が、真菌と接触し得る抗真菌剤を（例えば負荷によって）含む。

【0961】

レシーバー又は複合体と関連付け得る抗真菌剤の例としては、限定はされないが、アリルアミン類；テルビナフィン；代謝拮抗薬；フルシトシン；アゾール系；フルコナゾール；イトラコナゾール；ケトコナゾール；ラブコナゾール；ポサコナゾール；ボリコナゾール；グルカン合成阻害薬；カスポファンギン；ミカファンギン；アニデュラファンギン；ポリエン系；アムホテリシンＢ；アムホテリシンＢ脂質複合体（ＡＢＬＣ）；アムホテリシンＢコロイド分散系（ＡＢＣＤ）；リポソームアムホテリシンＢ（Ｌ－ＡＭＢ）；リポソームナイスタチン；及びグリセオフルビンが挙げられる。

【0962】

一部の実施形態において、１つ以上の抗真菌剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体との共投与を含む、真菌感染症の治療方法が提供され、ここで共投与には、合成膜－レシーバー複合体の投与前、その投与後又はその投与と同時の抗真菌剤の投与が含まれる。

【0963】

一部の実施形態において、１つ以上の抗真菌剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体とを含む医薬組成物の投与を含む、細菌感染症の治療方法が提供される。

【0964】

一部の実施形態において、レシーバーは標的を直接修飾することなく標的真菌を隔絶し、それを循環系に分布させ得る。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、関連する標的真菌を細網内皮系による分解に供し得る。

【0965】

３．寄生虫感染症
一部の実施形態において、対象は、寄生虫感染症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。寄生虫感染症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0966】

一部の実施形態において、標的は寄生虫である。特定の実施形態において、標的は寄生虫抗原を含む。一部の実施形態において、寄生虫抗原は、細胞表面抗原、分泌毒素、又は分泌寄生虫抗原を含む。好適な標的には、原虫を含めた腸内寄生虫又は血液感染性の寄生虫が含まれる。

【0967】

典型的には、血液感染性の寄生虫は媒介節足動物を介して伝播する。寄生虫感染症の伝播に最も重要な節足動物は、蚊である。蚊はマラリア及び糸状線虫を運ぶ。刺咬性のハエは、アフリカトリパノソーマ症、リーシュマニア症及び幾つかの種類のフィラリア症を伝播する。寄生虫の例としては、限定はされないが、トリパノソーマ；マラリアを引き起こす能力を有する血液原虫及び寄生虫；腸内条虫及びテニア科条虫を含めた全身性条虫；腸内コクシジウム；腸内鞭毛原虫；糸状線虫；胃腸管及び全身性線虫及び鉤虫が挙げられる。

【0968】

一部の実施形態において、寄生虫感染症の治療に膜－レシーバーポリペプチド複合体が用いられ得る。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は２つ以上のレシーバーを含み得る。一方のレシーバーは標的と相互作用するように機能し得ると共に、他方のレシーバーは標的を修飾して、例えば、標的の完全性を破壊し、分解のため標的を標識し及び／又は標的を不活性化し得る。第２のレシーバーは、真菌と接触し得る抗寄生虫剤を含み得る。別の実施形態では、合成膜－レシーバー複合体が、真菌と接触し得る抗寄生虫剤を（例えば負荷によって）含む。

【0969】

レシーバー又は複合体と関連付け得る抗寄生虫剤の例としては、限定はされないが、抗原虫剤；エフロルニチン；フラゾリドン；メラルソプロール；メトロニダゾール；オルニダゾール；硫酸パロモマイシン；ペンタミジン；ピリメタミン；チニダゾール；抗マラリア剤；キニーネ；クロロキン；アモジアキン；ピリメタミン；スルファドキシン；プログアニル；メフロキン；ハロファントリン；プリマキン；アルテメシニン（ａｒｔｅｍｅｓｉｎｉｎ）及びこれらの誘導体；ドキシサイクリン；クリンダマイシン；ベンズニダゾール；ニフルチモックス；駆虫薬；アルベンダゾール；ジエチルカルバマジン；メベンダゾール；ニクロサミド；イベルメクチン；スラミン；チアベンダゾール；パモ酸ピランテル；レバミゾール；ピペラジン系；プラジカンテル；トリクラベンダゾール；オクタデプシペプチド類；及びエモデプシドが挙げられる。

【0970】

一部の実施形態において、１つ以上の抗寄生虫剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体との共投与を含む、寄生虫感染症の治療方法が提供され、ここで共投与には、合成膜－レシーバー複合体の投与前、その投与後又はその投与と同時の抗寄生虫剤の投与が含まれる。

【0971】

一部の実施形態において、１つ以上の抗寄生虫剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体とを含む医薬組成物の投与を含む、寄生虫感染症の治療方法が提供される。

【0972】

一部の実施形態において、レシーバーは標的を直接修飾することなく標的寄生虫を隔絶し、それを循環系に分布させ得る。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、関連する標的寄生虫を細網内皮系による分解に供し得る。

【0973】

４．ウイルス感染症
一部の実施形態において、対象は、ウイルス感染症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ウイルス感染症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【0974】

一部の実施形態において、標的はウイルスである。特定の実施形態において、標的はウイルス抗原を含む。一部の実施形態において、ウイルス抗原は、エンベロープ抗原又はカプシド抗原を含む。好適なウイルス標的としては、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、及び風疹ウイルスが挙げられる。他の好適なウイルス標的としては、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルス又はルブラウイルス）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アデノウイルス）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどのアレナウイルス）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス又はウマ動脈炎ウイルス）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、フレボウイルス又はハンタウイルス）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ノーウォークウイルス）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス又はトロウイルス）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラ様ウイルス）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ヘパシウイルス又はフラビウイルス）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、又はリンホクリプトウイルス）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス又はトゴトウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パルボウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エンテロウイルス又はヘパトウイルス）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、オルトポックスウイルス、アビポックスウイルス、又はレポリポックスウイルス）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レンチウイルス又はスプーマウイルス）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ロタウイルス）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、又はベシクロウイルス）、及びトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、アルファウイルス又はルビウイルス）が挙げられる。これらのウイルスの具体的な例としては、ヒト呼吸器コロナウイルス、Ａ～Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ～Ｇ型肝炎ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１～９型が挙げられる。

【0975】

一部の実施形態において、ウイルス感染症の治療に膜－レシーバーポリペプチド複合体が用いられ得る。一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は２つ以上のレシーバーを含み得る。一方のレシーバーは標的と相互作用するように機能し得ると共に、他方のレシーバーは標的を修飾して、例えば、標的の完全性を破壊し、分解のため標的を標識し及び／又は標的を不活性化し得る。

【0976】

例えば、標的がウイルスである場合、一方のレシーバーが標的ウイルスと（例えばレシーバーが抗体様機能を含む場合、ウイルスエピトープとの相互作用を介して）相互作用するように機能する。他方のレシーバーはウイルスエンベロープ又はカプシドを破る能力を有し得る。好適な第２のレシーバーとしては、例えば、抗ウイルス剤、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、アンチセンス分子、リボザイム、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）、又は毒性であるか若しくはウイルスにとって有害な他の分子が挙げられる。

【0977】

第２のレシーバーは、ウイルスと接触し得る抗ウイルス剤を含み得る。別の実施形態では、合成膜－レシーバー複合体が、ウイルスと接触し得る抗ウイルス剤を（例えば負荷によって）含む。

【0978】

レシーバー又は複合体と関連付け得る抗ウイルス剤の例としては、限定はされないが、チオセミカルバゾン類；メチサゾン；ヌクレオシド及びヌクレオチド；アシクロビル；イドクスウリジン；ビダラビン；リバビリン；ガンシクロビル；ファムシクロビル；バラシクロビル；シドホビル；ペンシクロビル；バルガンシクロビル；ブリブジン；リバビリン、環状アミン類；リマンタジン；トロマンタジン；ホスホン酸誘導体；ホスカルネット；ホスホネット；プロテアーゼ阻害薬；サキナビル；インジナビル；リトナビル；ネルフィナビル；アンプレナビル；ロピナビル；ホスアンプレナビル；アタザナビル；チプラナビル；ヌクレオシド及びヌクレオチド逆転写酵素阻害薬；ジドブジン；ジダノシン；ザルシタビン；スタブジン；ラミブジン；アバカビル；テノホビルジソプロキシル；アデホビルジピボキシル；エムトリシタビン；エンテカビル；非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬；ネビラピン；デラビルジン；エファビレンツ；ノイラミニダーゼ阻害薬；ザナミビル；オセルタミビル；モロキシジン；イノシンプラノベクス；プレコナリル；及びエンフビルチドが挙げられる。

【0979】

一部の実施形態において、１つ以上の抗ウイルス剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体との共投与を含む、ウイルス感染症の治療方法が提供され、ここで共投与には、合成膜－レシーバー複合体の投与前、その投与後又はその投与と同時の抗ウイルス剤の投与が含まれる。

【0980】

一部の実施形態において、１つ以上の抗ウイルス剤と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体とを含む、医薬組成物の投与を含むウイルス感染症の治療方法が提供される。

【0981】

一部の実施形態において、レシーバーは標的を直接修飾することなく標的ウイルスを隔絶し、それを循環系に分布させ得る。特定の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体は、関連する標的ウイルスを細網内皮系による分解に供し得る。

【0982】

毒素及び毒物に関連する病態
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、毒素又は毒物によって引き起こされる被毒状態又は中毒を治療又は予防し得る。

【0983】

敗血症及び敗血症性ショックは、現代の集中治療医学における死亡の主な原因に相当するもので、細菌感染に対する宿主の不適切な炎症反応及び免疫反応によって引き起こされる。エビデンスから、菌血症自体というよりむしろ、微生物毒素が全身に広がることが、発病において決定的に重要なイベントであることが示唆される。内皮は細菌性毒素の主要な標的である。結果として生じる内皮機能不全が、根底にある病理学的機序及び臓器機能の恒常性の崩れに寄与すると考えられる。

【0984】

内皮細胞を標的化する細菌性毒素は、血管作動性メディエーターの過剰形成及び接着分子の過剰発現によって血管外細胞及び循環白血球の挙動を著しく変化させる（Ｇｒａｎｄｅｌ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３）。

【0985】

ポア形成毒素（ＰＦＴ）は、天然に見出される最も一般的なタンパク質毒素の１つである。この毒素は、細胞膜にポアを形成してその透過性を変えることにより細胞を破壊する。細菌感染症では、ＰＦＴによる攻撃が主要な病原性機構である。ポア形成ａ毒素を阻害すると黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染症の重症度を低減し得ることが実証されており、同様のＰＦＴ標的化戦略が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）及び肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含めた他の病原体に対する治療可能性を示している。細菌性の発病におけるその役割に加え、ＰＦＴは、イソギンチャク、サソリ及びヘビなどの動物によって毒攻撃によく利用されている。８０種を超えるＰＦＴファミリーが同定されており、多様な分子構造及び特徴的なエピトープ標的を示している（Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏ，２０１３）。

【0986】

幾つもの生体分子が、エンドトキシン、例えば、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、アミロイドＰ成分、カチオン性タンパク質、又はカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）からの生物学的エンドトキシンアッセイ（抗ＬＰＳ）因子に用いられる酵素と相互作用を示す。これらのタンパク質は、エンドトキシン投与時の多くの異なる種の反応に直接関与する。

【0987】

一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）に由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む。リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）に由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団は、それを必要としている対象に、微生物感染の結果として循環中にあり得る免疫原性リポ多糖を除去するのに有効な量で投与され得る。

【0988】

さらに、毒素クリアランスを誘導する方法が提供される。この方法は、毒素との相互作用能を有するレシーバー、例えば、抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディレシーバーなどを含む機能性赤血球系細胞の集団を、それを必要としている対象に循環から毒素を除去するのに有効な量で投与するステップを含む。毒素特異的レシーバーを含む機能性赤血球系細胞を含む組成物は、諸レベルの毒性代謝産物又は感染病原体、例えば、炭疽、ボツリヌス、サイトカイン、サリン、溶血素、毒液を、及び限定はされないが表５のものを含め、示す対象に投与され得る。

【0989】

一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、エンドトキシン受容体ＣＤ１４に由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む。エンドトキシン受容体ＣＤ１４に由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団は、それを必要としている対象に、循環中の標的エンドトキシンに結合するのに有効な量で投与され得る。かかる方法を用いることにより、毒素を隔絶し、且つ本来であれば血管系内で生じたであろう組織損傷の大きさを低減して、それ程急性でない方法でその病原性効果を散逸させ得る。

【0990】

一実施形態において、レシーバーは無細胞循環ＤＮＡと相互作用する。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、例えば、ＤＮアーゼ、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン又はヒストン断片などのＤＮＡ相互作用ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むレシーバーをコードする外因性遺伝子を発現する。ＤＮアーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン又はヒストン断片は融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、ＤＮアーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ヒストン断片又は循環ＤＮＡに親和性を有する別のレシーバーは、赤血球系細胞内又はその上に負荷される。一実施形態において、レシーバーは、細胞外に局在するＤＮアーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン又はヒストン断片である。

【0991】

アポトーシスの顕著な特徴はＤＮＡ分解であり、ここでは初めに染色体ＤＮＡが切断されて大きい断片（５０～３００ｋｂ）となり、続いて複数のヌクレオソーム単位（１８０～２００ｂｐ）になる（Ｎａｇａｔａ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２００３）。アポトーシス細胞の内容物は食細胞又は隣接細胞に取り込まれ、ＤＮＡはリソソーム中のＤＮアーゼＩによって完全に消化される（Ｎａｇａｔａ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ，２００３）。従って、アポトーシスによって放出されるＤＮＡ断片は、循環中に現れる前に取り除かれ得る。アポトーシス小体の貪食が低下するか又は細胞死が増加する場合、炎症反応が起こり得る。例えば、癌及び循環ＤＮＡの増加を伴う他の病態では、高頻度に自己免疫が起こる（Ｖｉｏｒｒｉｔｔｏ，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７）。

【0992】

血漿中には細胞外ＤＮＡ、又は循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆ－ＤＮＡ）が存在する。こうしたｃｆ－ＤＮＡは、少なくともその一部は癌細胞に由来すると考えられ、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、異常マイクロサテライト、異常ＤＮＡメチル化遺伝子、及び再配列染色体ＤＮＡを含め、幾つもの癌特異的実体を含有する。健常細胞に水平に入ってそれを変えるＤＮＡを含有するアポトーシス小体の現象を記述するため、用語「ゲノメタスタシス（ｇｅｎｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」が提案されている（Ｇａｒｃｉａ－Ｏｌｍｏ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１２）。

【0993】

特定の実施形態において、循環ＤＮＡに特異的なレシーバーを含む機能性赤血球系細胞が、それを必要としている対象に、ゲノメタスタシス（ｇｅｎｏｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）の疑いがある全身性エリテマトーデス及び癌などの、ＤＮＡによって駆動される発病機序を治療するのに有効な量で投与される。一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、グリコホリンＡのＮ末端に融合したＤＮアーゼを含む細胞外レシーバーを含み、従ってこれは血管系内で循環ＤＮＡを分解する能力を有する。

【0994】

具体的な実施形態において、被毒状態又は中毒に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的毒素又は毒物の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的毒素又は毒物の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【0995】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する病原性毒素、毒液、プリオンタンパク質、サイトカイン、金属（例えば重金属）、又はアルコール（例えばメタノール）などの毒素又は毒物に特異的に結合し、それを隔絶し、及び／又はそれを分解するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。毒素又は毒物に関連する病態としては、限定はされないが、細菌性毒素誘発性ショック、クモ毒誘発性ショック、プリオン病、サイトカインストーム、鉄中毒、銅中毒、ウィルソン病、重金属中毒、メタノール中毒並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【0996】

さらに、毒素クリアランスを誘導する方法が提供される。具体的な実施形態において、この方法は、本明細書に提供されるレシーバーを含む赤血球細胞の医薬組成物を、それを必要としている対象に、対象において毒素クリアランスを誘導するのに十分な量で投与するステップを含む。組成物は、諸レベルの炭疽、ボツリヌス、サイトカイン、サリン、溶血素、毒液、及び限定はされないが表５に含まれるものなどの毒性代謝産物又は感染病原体を示す対象に投与され得る。

【0997】

一実施形態において、疾患又は病態はα溶血素中毒であり、レシーバーはα溶血素に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はα溶血素である。

【0998】

一実施形態において、疾患又は病態は炭疽毒素中毒であり、レシーバーは炭疽毒素に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は炭疽毒素である。

【0999】

一実施形態において、疾患又は病態は細菌性毒素誘発性ショックであり、レシーバーは細菌性毒素に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は細菌性毒素である。

【1000】

一実施形態において、疾患又は病態はボツリヌス毒素中毒であり、レシーバーはボツリヌス毒素に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はボツリヌス毒素である。

【1001】

一実施形態において、疾患又は病態はＰＲＰによって引き起こされるプリオン病であり、レシーバーはプリオンタンパク質ＰＲＰに対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はプリオンタンパク質ＰＲＰである。

【1002】

一実施形態において、疾患又は病態はＰＲＰｃによって引き起こされるプリオン病であり、レシーバーはプリオンタンパク質ＰＲＰｃに対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はプリオンタンパク質ＰＲＰｃである。

【1003】

一実施形態において、疾患又は病態はＰＲＰｓｃによって引き起こされるプリオン病であり、レシーバーはプリオンタンパク質ＰＲＰｓｃに対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はプリオンタンパク質ＰＲＰｓｃである。

【1004】

一実施形態において、疾患又は病態はＰＲＰｒｅｓによって引き起こされるプリオン病であり、レシーバーはプリオンタンパク質ＰＲＰｒｅｓに対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はプリオンタンパク質ＰＲＰｒｅｓである。

【1005】

一実施形態において、疾患又は病態は敗血症又はサイトカインストームであり、レシーバーはサイトカイン又はダッフィ抗原ケモカイン受容体（ＤＡＲＣ）に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はサイトカインである。

【1006】

ウィルソン病は、銅代謝不全並びに肝臓、脳、及び他の臓器における銅の蓄積によって引き起こされる。臨床的には銅キレーター、例えばＤ－ペニシラミンが使用されるが、それらは半減期が短いという欠点があり、その治療有効性を低下させている。一実施形態において、合成膜－レシーバー複合体の表面上のレシーバーはＤ－ペニシラミンである。合成膜－レシーバー複合体の投与によってＤ－ペニシラミンは遊離Ｄ－ペニシラミンより実質的に長く循環中に留まることが可能となり、ひいてはより長時間銅を捕捉し、ウィルソン病における臨床的有益性を提供する。

【1007】

一実施形態において、疾患又は病態はクモ毒中毒であり、レシーバーはクモ毒に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はクモ毒である。

【1008】

１．毒素
一部の実施形態において、対象は、ボツリヌス毒素（ＢＴＸ）中毒の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＢＴＸ中毒に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1009】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、Ａ型～Ｈ型のいずれかのＢＴＸに結合する抗体ドメイン又は抗体様ドメイン、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは、ＢＴＸに結合してＢＴＸがその機能を果たすことを妨げる能力を有する。

【1010】

ＢＴＸはボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）によって産生され、推定ヒト致死量が静脈内で１．３～２．１ｎｇ／ｋｇの強力な神経毒である（Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．２００１ Ｊ Ａｍ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ ２８５（８）：１０５９）。ＢＴＸは、神経筋接合部の融合タンパク質（ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン又はシナプトブレビン）の１つを攻撃するプロテアーゼであり、小胞が膜にアンカリングしてアセチルコリンを放出することを妨げる。毒素はアセチルコリン放出を阻害することにより神経インパルスを妨害し、筋肉の弛緩性の（垂れ下がる）完全麻痺を引き起こす。

【1011】

２．プリオン－クロイツフェルトヤコブ病
一部の実施形態において、対象は、スクレイピー型（ＰｒＰｓｃ）のプリオンタンパク質によって引き起こされるクロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＣＪＤに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1012】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、ＰｒＰｓｃに結合する抗体ドメイン又は抗体様ドメイン又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは、ＰｒＰｓｃに結合してＰｒＰｓｃがその機能を果たすことを妨げる能力を有する。

【1013】

ＰｒＰｓｃは、正常なＰｒＰに自己触媒的な方法で誤った折り畳みを生じさせることのできる誤って折り畳まれた形態のＰｒＰである。ＰｒＰｓｃはプロテアーゼ耐性であり、細胞に損傷を与える不溶性の凝集物及び線維を形成する。ＣＪＤでは、ＰｒＰｓｃ凝集物及び線維が急速な神経変性をもたらし、その結果脳組織に孔が増えてスポンジ様の構造となる。

【1014】

３．サイトカイン
一部の実施形態において、対象は、敗血症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。敗血症中毒に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1015】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、サイトカインの腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）、又はインターロイキン－２（ＩＬ－２）又はその誘導体若しくは機能断片の１つ以上に結合する抗体ドメイン、抗体様ドメイン、又はサイトカイン受容体ドメインを含む１つ以上のレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは、サイトカインに結合して、例えばサイトカインがその天然受容体に結合しないよう妨げることによりサイトカインがその機能を果たすことを妨げる能力を有する。

【1016】

ＴＮＦａ、ＩＦＮｇ、及びＩＬ－２のようなサイトカインは免疫細胞によって感染に応答して産生され、他の免疫細胞の強力な炎症性刺激である。敗血症では、重度の細菌感染によってサイトカインストームの駆動による全身炎症が引き起こされ、それが多臓器不全、急性呼吸窮迫、心不全、脳症、及び浮腫を惹起する。

【1017】

脂質又はコレステロールの蓄積に関連する疾患及び病態
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、脂質又はコレステロールの蓄積に関連する疾患及び病態を治療又は予防し得る。

【1018】

一実施形態において、レシーバーは１つ以上の脂質と相互作用する。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、リパーゼに由来するアミノ酸配列をコードする外因性遺伝子を発現する。リパーゼは完全長タンパク質又はその断片として発現し得る。リパーゼは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、リパーゼタンパク質レシーバー又は脂質に親和性を有する別のレシーバーは、赤血球系細胞内又はその上に負荷される。リパーゼタンパク質レシーバー又は脂質に親和性を有する他のレシーバーは、細胞内又は細胞外に局在し得る。一実施形態において、レシーバーは、リポタンパク質リパーゼに由来するアミノ酸配列を含む。

【1019】

高脂血症又は高リポタンパク血症は、血中の過剰な脂質、主としてコレステロール及びトリグリセリドである。脂質は、血液中をタンパク質に結合して移動し、循環する間は溶解したままである。一般に、高脂血症は２つのサブカテゴリーに分けることができる；コレステロールが高値である高コレステロール血症、及び最も一般的な形態の脂肪であるトリグリセリドが高値である高トリグリセリド血症。過剰ＬＤＬコレステロールは動脈の閉塞に寄与し、それが最終的には心臓発作につながる。集団研究から、ＬＤＬコレステロール値が高いほど心疾患のリスクが高まることが明らかにされている。

【1020】

高脂血症は、通常は顕著な症状がなく、定期健診又はアテローム動脈硬化性心血管疾患の評価の間に発見される傾向がある。しかしながら、家族型の障害を有する人又は極めて高値の血中コレステロールを有する人においては、コレステロールの沈着（黄色腫として知られる）が皮膚下に（特に眼の周囲又はアキレス腱に沿って）形成され得る。高トリグリセリド血症患者は全身にわたって多数の面皰様病変を生じ得る。極端に高値のトリグリセリドはまた、生命を脅かし得る重度の膵臓炎症である膵炎も引き起こし得る。

【1021】

特定の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、脂質との相互作用能を有するか、又は表５に掲載される標的脂質又は標的脂質関連分子に対して親和性を有するレシーバーを含む。特定の実施形態において、脂質との相互作用能を有するレシーバーを含むか又はリポタンパク質リパーゼに由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団が、それを必要としている対象に、高脂血症治療又は予防するのに有効な量で投与される。

【1022】

特定の実施形態において、脂質との相互作用能を有するレシーバーを含むか又はリポタンパク質リパーゼに由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団が、それを必要としている対象に、脂質、タンパク質、及びコレステロールからなるリポタンパク質粒子であるカイロミクロンを血液循環から除去するのに有効な量で投与される。一部の実施形態において、レシーバーはリポタンパク質リパーゼであり、このレシーバーは赤血球系細胞の表面上に位置する。特定の実施形態において、リポタンパク質リパーゼに由来するアミノ酸配列を含むレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団が、それを必要としている対象に、リポタンパク質リパーゼ欠損症を治療し、軽減し又は予防するのに有効な量で投与される。家族性リポタンパク質リパーゼ欠損症は、人に脂質分解能が欠損しているため血中に多量の脂肪が蓄積する一群のまれな遺伝的障害である。

【1023】

具体的な実施形態において、脂質又はコレステロールの蓄積に関連する疾患又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的脂質又はコレステロールの循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的脂質又はコレステロールの循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【1024】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する標的脂質又はコレステロール、又は脂質若しくはコレステロールを含む複合体若しくは凝集物に特異的に結合し、それを隔絶し、及び／又はそれを分解するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。循環脂質又はコレステロール及びそれらに関連する複合体の量又は濃度が低下すると、心血管及び他の循環障害が減少し又は軽減され得る。脂質又はコレステロールの蓄積に関連する疾患又は病態としては、限定はされないが、リポタンパク質リパーゼ欠損症、高コレステロール血症、冠動脈疾患並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【1025】

一実施形態において、疾患又は病態は高コレステロール血症であり、レシーバーは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、ＬＤＬ受容体に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＬＤＬである。

【1026】

一実施形態において、疾患又は病態は高コレステロール血症であり、レシーバーは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）又はＨＤＬ受容体に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的はＨＤＬである。

【1027】

一実施形態において、疾患又は病態はリポタンパク質リパーゼ欠損症であり、レシーバーはリポタンパク質リパーゼ又はその断片であり、及び標的はキロミクロン（ｃｈｉｌｏｍｉｃｒｏｎ）及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）である。

【1028】

リポタンパク質リパーゼ欠損症（グリベラ（Ｇｌｙｂｅｒａ））
一部の実施形態において、対象は、リポタンパク質リパーゼ欠損症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。リポタンパク質リパーゼ欠損症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1029】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、酵素リポタンパク質リパーゼ又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは、カイロミクロン及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）に見られるものなどの、リポタンパク質中のトリグリセリドを２つの遊離脂肪酸と１つのモノアシルグリセロール分子とに加水分解する能力を有する。

【1030】

リポタンパク質リパーゼ欠損症は、罹患者に脂肪酸の有効な分解に必要なリポタンパク質リパーゼ酵素の産生能が欠損しているまれな障害である。この障害は、通常は小児に見られ、腹痛、再発性急性膵炎、発疹性皮膚黄色腫、及び肝脾腫のエピソードを伴う極めて重篤な高トリグリセリド血症を特徴とする。血漿からのカイロミクロンのクリアランスが低下し、その結果血漿中にトリグリセリドが蓄積し、血漿が乳状になる。通常、総食事性脂肪を２０グラム／日以下に制限することで症状は消散する。

【1031】

感染細胞、異常細胞又は発癌性細胞に関連する疾患及び病態
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、例えば癌などの、感染細胞、異常細胞又は発癌性細胞に関連する疾患及び病態を治療又は予防し得る。

【1032】

一実施形態において、レシーバーは癌幹細胞（ＣＳＣ）又は別の癌関連循環細胞と相互作用する。一実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ＣＳＣ抗原に特異的な抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディをコードする外因性遺伝子を発現する。抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディは融合タンパク質として発現し得る。他の実施形態において、抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディレシーバー又は循環癌細胞に親和性を有する別のレシーバーは、赤血球系細胞内又はその上に負荷される。一実施形態において、レシーバーは細胞外に局在する抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディである。特定の実施形態において、抗体、ｓｃＦｖ又はナノボディレシーバーは、Ｄ４４、ＣＤ４７、及びＭＥＴから選択されるＣＳＣ抗原に特異的である。

【1033】

癌幹細胞（ＣＳＣ）は、癌細胞のごく一部を占めるものであり、ほとんどのヒト腫瘍の起源をなすと考えられる。転移カスケードの重要なステップの１つは、原発腫瘍からの腫瘍細胞の遊走であり、ＣＳＣはこの遊走に関連している可能性が高い。ほとんどの成人組織が、創傷治癒、組織再生及び臓器線維症の間に上皮間葉転換（ＥＭＴ）様のプロセスを生じる能力をもって遊走能のある面を維持している。ＣＳＣはまた、ＥＭＴのプロセスを経てその遊走を活性化し得ることが仮定されている。

【1034】

幾つもの研究において循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）が種々の固形腫瘍の腫瘍進行に結び付けられており、転移性乳癌（Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）、結腸癌（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）及び前立腺癌（Ｄａｎｉｌａ ｅｔ ａｌ．，２００７）の患者においてＣＴＣの計数が予後診断ツールとして利用され始めている。潜在的に、ＣＴＣのごく一部がＣＳＣ活性を有し、循環に入る原発腫瘍中のＣＳＣは循環ＣＳＣになって、標的臓器に留まるか又はそこに収まるまでそのままであると仮定される。黒色腫患者から単離されたＣＴＣは、異種移植モデルで転移を生じることが見出されている（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｓｈｉｏｚａｗａ，Ｐｈａｒｍ ａｎｄ Ｔｈｅｒａ，２０１３）。

【1035】

血管系は、様々な循環腫瘍細胞、転移、及び癌幹細胞を増殖させるための強力な導管である。特定の実施形態において、循環癌細胞に特異的なレシーバーを含む機能性赤血球系細胞が、それを必要としている対象に、転移を治療又は予防するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、循環癌細胞に特異的なレシーバーを含む機能性赤血球系細胞の集団が、それを必要としている対象に、ＣＳＣ又はＣＴＣと相互作用してそれらを例えば肝臓における分解を促進することによって循環から除去するのに有効な量で投与される。一部の実施形態において、機能性赤血球系細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ４７、又はＭＥＴ（ＣＴＣの３つの特徴的な表面抗原）に特異的な抗体、ｓｃＦｖ、又はナノボディレシーバーを含む。本明細書に記載される赤血球系細胞によって除去され得る好適な癌細胞としては、限定はされないが、表５及び表８に掲載する癌に関連する細胞が挙げられる。

【1036】

具体的な実施形態において、感染細胞、異常細胞又は発癌性細胞に関連する疾患又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的細胞の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的細胞の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。

【1037】

特定の実施形態において、対象の循環系に存在する感染細胞、異常細胞又は発癌性細胞などの標的細胞に特異的に結合し、それを隔絶し、及び／又はそれを分解するレシーバーを含む合成膜－レシーバーポリペプチド複合体が投与される。循環標的細胞の量又は濃度が低下すると、例えば感染症又は癌などの、感染細胞、異常細胞又は発癌性細胞に関連する病態が減少し又は軽減され得る。感染細胞、異常細胞又は発癌性細胞に関連する疾患又は病態としては、限定はされないが、癌並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【1038】

一実施形態において、疾患又は病態は癌であり、レシーバーはＣＤ４４に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は循環腫瘍細胞である。

【1039】

一実施形態において、疾患又は病態は癌であり、レシーバーはＥｐＣａｍに対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は循環腫瘍細胞である。

【1040】

一実施形態において、疾患又は病態は癌であり、レシーバーはＨｅｒ２に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は循環腫瘍細胞である。

【1041】

一実施形態において、疾患又は病態は癌であり、レシーバーはＥＧＦＲに対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は循環腫瘍細胞である。

【1042】

一実施形態において、疾患又は病態は癌（Ｂ細胞）であり、レシーバーはＣＤ２０に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は癌性Ｂ細胞である。

【1043】

一実施形態において、疾患又は病態は癌（Ｂ細胞）であり、レシーバーはＣＤ１９に対する抗体様結合剤又はその断片であり、及び標的は癌性Ｂ細胞である。

【1044】

循環癌細胞
一部の実施形態において、対象は、癌の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。癌に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1045】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、癌細胞特異的受容体、例えばＣＤ１９を介して循環癌細胞、例えば増殖Ｂ細胞に結合する抗体ドメイン又は抗体様ドメイン、又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは、循環癌細胞上のＣＤ１９に結合してＣＤ１９発現癌細胞のクリアランスを促進する能力を有する。

【1046】

ＣＤ１９はＢ細胞に対する共通の受容体であり、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫を含めたＢ細胞癌のバリデートされたマーカーである（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｒａｃｉｌａ，（１９９５）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １８（５）：３８５－３９７。ＣＤ１９はＭｙｃオンコプロテインを安定化させることによって癌におけるＢ細胞の増殖にさらなる役割を果たしていることが徐々に分かりつつある（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２２（６）：２２５７）。Ｂ細胞癌では、増殖Ｂ細胞がリンパ節及び骨髄を制圧する。これらのＢ細胞を標的化して除去する戦略が、抗体療法（リツキシマブ）を含め、標準治療の一環として認められている。

【1047】

腫瘍転移は、癌死亡率を押し上げる主因であり、転移を標的化する治療法は、数、作用機構及び有効性の点で限られている。血行性腫瘍細胞播種（血流を介する）が多くの癌腫に共通する経路であり、原発部位の脱離、遊走、血流中への輸送、血管系内での腫瘍細胞付着及び転移部位における増殖が関わる極めて複雑なプロセスである。

【1048】

代謝欠陥に関連する疾患及び病態
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して代謝欠陥に関連する疾患及び病態を治療又は予防し得る。合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の概略的な例を図１３Ａに示す。

【1049】

本明細書に記載されるとおり、多くの小分子代謝産物は、好適なレシーバーを含む例えば赤血球系細胞の膜を越えて拡散し得るか、又は定義された膜透過チャネルによって能動輸送される（例えば、Ｔｕｎｎｉｃｌｉｆｆ，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４を参照）。しかしながら、一部の代謝産物は、細胞内に局在するレシーバー酵素に到達するためにさらなる補助を必要とし、従って合成膜－レシーバー複合体は任意選択で輸送体を含み得る。

【1050】

一実施形態では、表面露出レシーバーポリペプジド（ｐｏｌｙｐｅｐｄｉｄｅ）が細胞膜を越えて合成膜－レシーバー複合体、例えばレシーバーを含む赤血球系細胞の中へと基質をシャトリングし得る。レシーバーを含む機能性赤血球系細胞は、限定はされないが、表７に掲載されるレシーバーポリペプチドを含めた複数のレシーバーポリペプチドを含有し得る。レシーバーポリペプチドは、細胞が代謝産物又は他の基質を膜の向こうに輸送する能力を増加させ得る。例えば、細胞内で発現するレシーバーグルコキナーゼと組み合わせてＧｌｕｔ１輸送体が機能性赤血球系細胞の膜に含まれてもよく、従ってこの赤血球系細胞は非修飾赤血球系細胞と比べて多い量のグルコースを内部に取り入れてリン酸化する。レシーバーグルコキナーゼを含む赤血球系細胞を使用して血中グルコース値を低減し得る。ＩＩ型糖尿病は、インスリン抵抗性及びインスリンの相対的不足の結果として高血糖症を伴う。高血糖症は、表面局在レシーバーＧｌｕｔ１によってグルコースを捕捉し、且つ細胞内局在レシーバーグルコキナーゼによってリン酸化する、レシーバーグルコキナーゼを含む赤血球系細胞によって軽減し得る。修飾されたグルコースは細胞を出ることができなくてもよい。合成膜－レシーバー複合体は、高血糖状態に応答する「緩衝剤」として機能する。

【1051】

任意選択で、増加した輸送能力を呈する機能性赤血球系細胞には、第２のレシーバーポリペプチドが存在し得る。第２のレシーバーポリペプチドは細胞内に局在し得る。第２の細胞内に局在したレシーバーポリペプチドは、細胞表面上に局在する第１のレシーバーポリペプチドによって細胞内にシャトリングされた標的基質を酵素的に修飾し、変換し、変化させ又は他の方法で改変することができる。

【1052】

具体的な実施形態において、代謝欠陥に関連する疾患又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的代謝産物の循環濃度をモジュレートする方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的代謝産物の循環濃度を実質的にモジュレートするのに有効な量で投与される。一部の実施形態において、標的代謝産物は循環中に存在するか又は上昇したレベルで存在し、その標的代謝産物の量又は濃度を低減する。例えば代謝産物のレベル又は濃度が毒性である場合、その毒性標的代謝産物が分解されてもよく、又は毒性標的代謝産物は別の非毒性産物に（例えば、レシーバーの触媒作用によって）変換されてもよい。一部の実施形態において、非標的代謝産物は循環中に存在しないか又は低下したレベルで存在し、標的代謝産物をその非標的代謝産物に変換してそのレベル又は濃度を増加させる。かかる実施形態において、非標的代謝産物の非存在又はレベルの低下は代謝疾患又は障害と関連付けられ、標的代謝産物が非標的代謝産物に変換されると非標的代謝産物のレベル又は濃度が少なくとも部分的に回復し又は補われ、従って代謝疾患が治療又は予防され得る。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。代謝欠陥に関連する疾患又は病態としては、限定はされないが、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損症、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、ホモシスチン尿症、原発性高シュウ酸尿症並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【1053】

具体的な実施形態において、代謝疾患を治療する方法は、本明細書に提供されるレシーバーを含む赤血球細胞の医薬組成物を、それを必要としている対象に代謝疾患を治療するのに十分な量で投与するステップを含む。組成物は、糖質代謝、アミノ酸代謝、有機酸代謝、ミトコンドリア代謝、脂肪酸代謝、プリン－ピリミジン代謝、ステロイド代謝、ペルオキシソーム機能、リソソーム内蓄積、又は尿素サイクルに障害を呈する対象に投与され得る。これらの障害のうち、具体的な徴候としては、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、原発性高シュウ酸尿症、及びフェニルケトン尿症、並びに、限定はされないが、表６及び表８に掲載する病態が挙げられる。

【1054】

一実施形態において、疾患又は病態は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症であり、レシーバーは３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ又はその断片であり、及び標的は３－ヒドロキシバレリルカルニチン、３－メチルクロトニルグリシン（３－ＭＣＧ）及び３－ヒドロキシイソ吉草酸（３－ＨＩＶＡ）である。

【1055】

一実施形態において、疾患又は病態は急性間欠性ポルフィリン症であり、レシーバーはポルホビリノーゲンデアミナーゼ又はその断片であり、及び標的はポルホビリノーゲンである。

【1056】

一実施形態において、疾患又は病態はアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症であり、レシーバーはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的は不溶性プリン２，８－ジヒドロキシアデニンである。

【1057】

一実施形態において、疾患又は病態はアデノシンデアミナーゼ欠損症であり、レシーバーはアデノシンデアミナーゼ又はその断片であり、及び標的はアデノシンである。

【1058】

一実施形態において、疾患又は病態はアルカプトン尿症であり、レシーバーはホモゲンチジン酸オキシダーゼ又はその断片であり、及び標的はホモゲンチジン酸である。

【1059】

一実施形態において、疾患又は病態はアルギニン血症であり、レシーバーはアンモニアモノオキシゲナーゼ又はその断片であり、及び標的はアンモニアである。

【1060】

一実施形態において、疾患又は病態はアルギニノコハク酸尿症であり、レシーバーはアンモニアモノオキシゲナーゼ又はその断片であり、及び標的はアンモニアである。

【1061】

一実施形態において、疾患又は病態はシトルリン血症Ｉ型であり、レシーバーはアンモニアモノオキシゲナーゼ又はその断片であり、及び標的はアンモニアである。

【1062】

一実施形態において、疾患又は病態はシトルリン血症ＩＩ型であり、レシーバーはアンモニアモノオキシゲナーゼ又はその断片であり、及び標的はアンモニアである。

【1063】

一実施形態において、疾患又は病態はグルタル酸血症Ｉ型であり、レシーバーはリジンオキシダーゼ又はその断片であり、及び標的は３－ヒドロキシグルタル酸及びグルタル酸（Ｃ５－ＤＣ）及びリジンである。

【1064】

一実施形態において、疾患又は病態は高尿酸血症を伴う痛風であり、レシーバーはウリカーゼ又はその断片であり、及び標的は尿酸（尿酸結晶）である。

【1065】

一実施形態において、疾患又は病態はピリミジン５’ヌクレオチダーゼ欠損に起因する溶血性貧血であり、レシーバーはピリミジン５’ヌクレオチダーゼ又はその断片であり、及び標的はピリミジン類である。

【1066】

一実施形態において、疾患又は病態はホモシスチン尿症であり、レシーバーはシスタチオニンＢシンターゼ又はその断片であり、及び標的はホモシステインである。

【1067】

一実施形態において、疾患又は病態は高アンモニア血症／オルニチン血症／シトルリン血症（オルニチン輸送体異常）であり、レシーバーはアンモニアモノオキシゲナーゼ又はその断片であり、及び標的はアンモニアである。

【1068】

一実施形態において、疾患又は病態はイソ吉草酸血症であり、レシーバーはロイシン代謝酵素又はその断片であり、及び標的はロイシンである。

【1069】

一実施形態において、疾患又は病態はレッシュ・ナイハン症候群であり、レシーバーはウリカーゼ又はその断片であり、及び標的は尿酸である。

【1070】

一実施形態において、疾患又は病態はメープルシロップ尿症であり、レシーバーはロイシン代謝酵素又はその断片であり、及び標的はロイシンである。

【1071】

一実施形態において、疾患又は病態はメチルマロン酸血症（ビタミンｂ１２非反応性）であり、レシーバーはメチルマロニル－ＣｏＡムターゼ又はその断片であり、及び標的はメチルマロネートである。

【1072】

一実施形態において、疾患又は病態はミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症（ＭＮＧＩＥ）であり、レシーバーはチミジンホスホリラーゼ又はその断片であり、及び標的はチミジンである。

【1073】

一実施形態において、疾患又は病態はフェニルケトン尿症であり、レシーバーはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ又はその断片であり、及び標的はフェニルアラニンである。

【1074】

一実施形態において、疾患又は病態は原発性高シュウ酸尿症であり、レシーバーはシュウ酸オキシダーゼ又はその断片であり、及び標的はオキサレートである。

【1075】

一実施形態において、疾患又は病態はプロピオン酸血症であり、レシーバーはプロピオン酸コンバターゼ又はその断片であり、及び標的はプロプリオニルｃｏＡである。

【1076】

一実施形態において、疾患又は病態はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症であり、レシーバーはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ又はその断片であり、及び標的はイノシン及び／又はｄＧＴＰである。

【1077】

一実施形態において、疾患又は病態はトランスフェラーゼ欠損ガラクトース血症（ガラクトース血症１型）であり、レシーバーはガラクトースデヒドロゲナーゼ又はその断片であり、及び標的はガラクトース－１－リン酸である。

【1078】

一実施形態において、疾患又は病態はチロシン血症１型であり、レシーバーはチロシンフェノールリアーゼ又はその断片であり、及び標的はチロシンである。

【1079】

１．アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症
一部の実施形態において、対象は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＡＤＡ欠損症に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1080】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上又は非露出側に呈示されてもよく、投与されるとデオキシアデノシンをデオキシ－イノシンに変換し、それにより毒性デオキシアデノシンレベルの上昇を防止し得る。

【1081】

特定の実施形態において、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）レシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供される。かかる組成物は、ＡＤＡ重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を呈する対象の治療に用いられ得る。

【1082】

ＡＤＡ欠損症を呈する対象は、体組織にデオキシアデノシンの蓄積を起こしている。高デオキシアデノシン値は未成熟白血球にとって有毒である。結果として、対象の適応免疫反応が損なわれ、そのため非常に感染症に罹り易くなる。ＡＤＡは、赤血球を含め、多種多様な細胞によって産生される内因性酵素である。ＡＤＡはデオキシアデノシンからデオキシイノシンへの変換に関与し、従って毒性デオキシアデノシンレベルの上昇を防止し得る。利用可能な酵素補充療法薬はウシ腸由来のＡＤＡを供給源とする。外来性供給源のＡＤＡは免疫原性反応及び阻害因子の発生に曝される。阻害因子の発生は、対象の免疫系が治療用分子を除去及び／又は改変する能力が高まり、治療用分子の治療効果が低下するときに起こり得る。加えて、新変異型クロイツフェルトヤコブ病が出現したことにより、ウシ腸をＡＤＡの供給源とすることに関して懸念が生じている（Ｂｏｏｔｈ ２００９，Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）。

【1083】

特定の実施形態において、本明細書には、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ対象の既存の野生型細胞の内因性レベルと比べてＡＤＡレベルを上昇させるためＡＤＡ－ＳＣＩＤ対象に投与され得るアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）レシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供される。多くのＡＤＡ－ＳＣＩＤ対象は機能性デオキシアデノシン代謝が重度に欠損している。赤血球系細胞は、その細胞内空間内に外因性ＡＤＡを含有し得る。細胞内に局在する外因性ＡＤＡレシーバーポリペプチドは、次にはデオキシアデノシンをデオキシイノシンに変換し、それによってデオキシアデノシンレベルを低下させ得る。デオキシアデノシンは細胞膜を通過し、デオキシイノシンに変換され、循環中に戻って拡散する。これは未成熟白血球集団を維持するのに十分であり、ひいては疾患が治療され得る。一部の実施形態において、アデノシンデアミナーゼレシーバーはヘモグロビンβのＣ末端との融合物として発現し、従って除核中にもＡＤＡは機能性赤血球系細胞に保持される。或いは、ＡＤＡ遺伝子はグリコホリンＡのＣ末端をコードする遺伝子の一部に融合し、従って発現すると膜貫通抗原の細胞内の一部分に係留される。

【1084】

２．フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）
一部の実施形態において、対象は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＰＫＵに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与
され得る。

【1085】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。

【1086】

別の実施形態では、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。

【1087】

好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上又は非露出側に呈示されてもよく、投与されるとフェニルアラニンをチロシンに変換し、それにより毒性フェニルアラニンレベルの上昇を防止してＰＫＵを治療又は予防し得る。

【1088】

具体的な実施形態において、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）レシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供される。かかる組成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を呈する又はそれと診断される対象の治療に用いられ得る。

【1089】

ＰＫＵと診断される対象は、酵素の突然変異又は産生欠損に起因してフェニルアラニンアンモニアヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）活性が欠損している。ＰＡＨは、その補因子テトラヒドロビオプテリンと共に、フェニルアラニンからチロシンへの変換に関与する。ＰＡＨ欠損症はフェニルアラニン蓄積をもたらし、幾つかの神経障害に関連する。

【1090】

ＰＡＬは、植物、酵母、及び真菌クリサンテミ（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）から単離される酵素である。ＰＡＬは、強力な免疫原性反応を誘発することのできる大型の２７０ｋＤａ酵素である。ＰＡＬはまた、体内から急速に除去され、従って多量の頻繁な注入が必要である。そのペグ化形態であっても、ＰＡＬは約３日間しか循環中に留まらない。この短い半減期のため、ＰＡＬ治療は患者にとって遵守が困難である（Ｇａｍｅｚ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００５）。

【1091】

特定の実施形態において、本明細書には、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）レシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供され、この組成物はフェニルアラニン蓄積の治療のためフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）対象に投与され得る。機能性赤血球系細胞はその細胞内空間内に外因性ＰＡＬを含有し得る。細胞内に局在する外因性ＰＡＬポリペプチドは、次にフェニルアラニンを良性の代謝産物であるｔｒａｎｓ－ケイ皮酸に変換し、それによってフェニルアラニンのレベルを低下させ得る。フェニルアラニンは細胞膜を通過し、ｔｒａｎｓ－ケイ皮酸に変換され、循環中に戻って拡散する。これは血中のフェニルアラニン濃度を低減するのに十分であり得る。

【1092】

具体的な実施形態において、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）レシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供される。かかる組成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を呈する又はそれと診断される対象の治療に用いられ得る。ＰＡＨは、細菌又は哺乳動物から単離することのできる酵素である。クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のＰＡＨは単量体の約３０ｋＤａタンパク質である（Ｙｅｗ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｍｅｔａｂ １０９：３３９）。

【1093】

特定の実施形態において、本明細書には、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）レシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供され、この組成物は、フェニルアラニン蓄積の治療のためフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）対象に投与され得る。機能性赤血球系細胞はその細胞内空間内に外因性ＰＡＨを含有し得る。細胞内に局在する外因性ＰＡＨポリペプチドは、次にフェニルアラニンをチロシンに変換し、それによってフェニルアラニンのレベルを低下させ得る。フェニルアラニンは細胞膜を通過し、チロシンに変換され、それが循環中に戻って拡散する。これは血中のフェニルアラニン濃度を低減するのに十分であり得る。

【1094】

３．ＭＮＧＩＥ
一部の実施形態において、対象は、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＭＮＧＩＥに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1095】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、酵素チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の内部に含まれ得る。好適なレシーバーは、チミジン又はデオキシウリジンからチミン又はウラシルへのリン酸化触媒能を有する。

【1096】

ＭＮＧＩＥでは、チミジン代謝の異常によってｍｔＤＮＡの複製又は維持が損なわれ、ｍｔＤＮＡ枯渇、欠失、又はその両方が生じる（Ｎｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３：６８９）。この疾患は、早期満腹感、悪心、嚥下障害、胃食道逆流、食後嘔吐、突発性腹痛及び／又は膨張、及び下痢として現れる進行性胃腸運動障害及び悪液質；下垂／眼筋麻痺又は眼麻痺；難聴；及び錯感覚（刺痛、しびれ感、及び疼痛）並びにより顕著には下肢に発症する対称性・遠位性の脱力として現れる脱髄性末梢神経障害を特徴とする。ＭＮＧＩＥの治療法はない。管理は対症的であり、嚥下困難及び気道保護への対応；悪心嘔吐に対するドロンペリドン（ｄｒｏｍｐｅｒｉｄｏｎｅ）；疼痛を抑えるためのブピビカインによる腹腔神経叢ブロック；栄養補給のためのボーラス栄養、胃瘻造設術、及び非経口栄養；腸内細菌異常増殖に対する抗生物質；神経障害症状に対するモルヒネ、アミトリプチリン、ガバペンチン、及びフェニトイン；専門的なスクーリングの手配；並びに理学療法及び作業療法が挙げられる。

【1097】

４．リソソーム酵素欠損症
本明細書に記載される合成複合体は、リソソーム蓄積障害の治療に有用であり得る。一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、細胞リソソームにおいて活性な、且つリソソーム酵素が欠損した細胞のリソソームに蓄積した毒性化合物、例えば、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、又は脂質を分解することのできるレシーバー、例えば酵素を含む。レシーバーはこれらの細胞のリソソームに蓄積した毒性化合物の量を減少させることによって作用し、ひいては疾患の負担を低減する。リソソーム蓄積障害としては、限定はされないが、ムコ多糖症Ｉ、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【1098】

一実施形態において、対象は、ゴーシェ病の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ゴーシェ病に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1099】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、酵素グルコセレブロシダーゼ又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上又は合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の内部に呈示され得る。好適なレシーバーは、スフィンゴ脂質である化学的グルコセレブロシドのβ－グルコシド結合を加水分解によって切断する能力を有する。

【1100】

ゴーシェ病は、酵素グルコセレブロシダーゼの遺伝的欠損によって引き起こされる。この酵素に欠陥があると、グルコセレブロシドが白血球、脾臓、肝臓、腎臓、肺、脳、及び骨髄に蓄積する。この障害は、挫傷、疲労、貧血症、低血小板数、並びに肝臓及び脾臓の腫大を特徴とする。症状には、腫大した脾臓及び肝臓、肝機能不全、有痛性のこともある骨障害及び骨病変、重度の神経学的合併症、リンパ節及び（時に）隣接関節の腫脹、腹部膨張、皮膚の褐変、貧血症、低血小板数、及び白眼（強膜）上の黄色の脂肪沈着物が含まれ得る。最も重症の罹患者はまた、感染性に罹り易くなり得る。

【1101】

幾つかのリソソーム蓄積障害は、本明細書に記載される治療方法によって対処可能である。例えば：一実施形態において、疾患又は病態はアスパルチルグルコサミン尿症（２０８４００）であり、レシーバーはＮ－アスパルチルグルコサミニダーゼ又はその断片であり、及び標的は糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は脳腱黄色腫症（コレスタノールリピドーシス；２１３７００）であり、レシーバーはステロール２７－ヒドロキシラーゼ又はその断片であり、及び標的は脂質、コレステロール、及び胆汁酸である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、成人型（ＣＬＮ４、クッフス病；２０４３００）であり、レシーバーはパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ－１又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、乳児型（ＣＬＮ１、サンタブオリ・ハルチア（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ）病；２５６７３０）であり、レシーバーはパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ－１又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、若年型（ＣＬＮ３、バッテン病、フォークト・シュピールマイアー病；２０４２００）であり、レシーバーはリソソーム膜貫通ＣＬＮ３タンパク質又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、乳児後期型（ＣＬＮ２、ヤンスキー・ビールショースキー病；２０４５００）であり、レシーバーはリソソームペプスタチン非感受性ペプチダーゼ又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、知的障害を伴う進行性癲癇（６００１４３）であり、レシーバーは膜貫通ＣＬＮ８タンパク質又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、変異型、乳児後期型（ＣＬＮ６；６０１７８０）であり、レシーバーは膜貫通ＣＬＮ６タンパク質又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はセロイドリポフスチン沈着症、変異型、乳児後期型、フィンランド型（ＣＬＮ５；２５６７３１）であり、レシーバーはリソソーム膜貫通ＣＬＮ５タンパク質又はその断片であり、及び標的は脂肪色素である。一実施形態において、疾患又は病態はコレステリルエステル蓄積症（ＣＥＳＤ）であり、レシーバーはリソソーム酸リパーゼ又はその断片であり、及び標的は脂質及びコレステロールである。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉａ（神経単独型及び神経多臓器型；２１２０６５）であり、レシーバーはホスホマンノムターゼ－２又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｂ（６０２５７９）であり、レシーバーはマンノース（Ｍａｎ）リン酸（Ｐ）イソメラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｃ（６０３１４７）であり、レシーバーはドリコ－Ｐ－Ｇｌｃ：Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２－ＰＰ－ドリコールグルコシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｄ（６０１１１０）であり、レシーバーはドリコ－Ｐ－Ｍａｎ：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２－ＰＰ－ドリコールマンノシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｅ（６０８７９９）であり、レシーバーはドリコール－Ｐ－マンノースシンターゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｆ（６０９１８０）であり、レシーバーはマンノース－Ｐ－ドリコール利用に関与するタンパク質又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｇ（６０７１４３）であり、レシーバーはドリキル－Ｐ－マンノース：Ｍａｎ－７－ＧｌｃＮＡｃ－２－ＰＰ－ドリキル－α－６－マンノシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｈ（６０８１０４）であり、レシーバーはドリキル－Ｐ－グルコース：Ｇｌｃ－１－Ｍａｎ－９－ＧｌｃＮＡｃ－２－ＰＰ－ドリキル－α－３－グルコシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｉ（６０７９０６）であり、レシーバーはα－１，３－マンノシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ ＩＩａ（２１２０６６）であり、レシーバーはマンノシル－α－１，６－糖タンパク質－β－１，２－Ｎ－アセチルグルコスミニルトランスフェラーゼ（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ ＩＩｂ（６０６０５６）であり、レシーバーはグルコシダーゼＩ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ ＩＩｃ（ランバン・ハシャロン（Ｒａｍｂａｍ－Ｈａｓｈａｒｏｎ）症候群；２６６２６５であり、レシーバーはＧＤＰ－フコース輸送体－１又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ ＩＩｄ（６０７０９１）であり、レシーバーはβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ ＩＩｅ（６０８７７９）であり、レシーバーはオリゴマーゴルジ複合体－７又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｊ（６０８０９３）であり、レシーバーはＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：ドリキル－ＰＮＡｃＧｌｃホスホトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｋ（６０８５４０）であり、レシーバーはβ－１，４－マンノシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症ＣＤＧ Ｉｌ（６０８７７６）であり、レシーバーはα－１，２－マンノシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態は先天性Ｎ－グリコシル化異常症、Ｉ型（プレゴルジグリコシル化障害）であり、レシーバーはα－１，２－マンノシルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はＮ－グリコシル化タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はシスチン蓄積症であり、レシーバーはシスチノシン（リソソームシスチン輸送体）又はその断片であり、及び標的はシステインである。一実施形態において、疾患又は病態はファブリー病（３０１５００）であり、レシーバーはトリヘキソシルセラミドα－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はグロボトリアオシルセラミドである。一実施形態において、疾患又は病態はファーバー病（皮下脂肪肉芽腫症；２２８０００）であり、レシーバーはセラミダーゼ又はその断片であり、及び標的は脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はフコシドーシス（２３００００）であり、レシーバーはα－Ｌ－フコシダーゼ又はその断片であり、及び標的はフコース及び複合糖類である。一実施形態において、疾患又は病態はガラクトシアリドーシス（ゴールドバーグ症候群、ノイラミニダーゼ・β－ガラクトシダーゼ複合欠損症；２５６５４０）であり、レシーバーは保護タンパク質／カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）又はその断片であり、及び標的は脂質及び糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はゴーシェ病であり、レシーバーはグルコシルセラミドβ－グルコシダーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はグルタミルリボース－５－リン酸蓄積症（３０５９２０）であり、レシーバーはＡＤＰ－リボースタンパク質ヒドロラーゼ又はその断片であり、及び標的はグルタミルリボース５－リン酸である。一実施形態において、疾患又は病態は糖原病２型（ポンペ病）であり、レシーバーはαグルコシダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコーゲンである。一実施形態において、疾患又は病態はＧＭ１ガングリオシドーシス、全身性であり、レシーバーはガングリオシドβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的は酸性脂質物質ガングリオシドである。一実施形態において、疾患又は病態はＧＭ２アクチベータータンパク質欠損症（ＡＢ型テイ・サックス病、ＧＭ２Ａ；２７２７５０）であり、レシーバーはＧＭ２アクチベータータンパク質又はその断片であり、及び標的はガングリオシドである。一実施形態において、疾患又は病態はＧＭ２ガングリオシドーシスであり、レシーバーはガングリオシドβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はガングリオシドである。一実施形態において、疾患又は病態は乳児シアル酸蓄積症（２６９９２０）であり、レシーバーはリン酸Ｎａ共輸送体、シアリン又はその断片であり、及び標的はシアル酸である。一実施形態において、疾患又は病態はクラッベ病（２４５２００）であり、レシーバーはガラクトシルセラミドβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はリソソーム酸リパーゼ欠損症（２７８０００）であり、レシーバーはリソソーム酸リパーゼ又はその断片であり、及び標的はコレステリルエステル及びトリグリセリドである。一実施形態において、疾患又は病態は異染性白質ジストロフィー（２５０１００）であり、レシーバーはアリールスルファターゼＡ又はその断片であり、及び標的はスルファチドである。一実施形態において、疾患又は病態はムコリピドーシスＭＬ ＩＩ（Ｉ細胞病；２５２５００）であり、レシーバーはＮ－アセチルグルコサミニル－１－ホスホトランスフェーラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｅｒａｓｅ）触媒サブユニット又はその断片であり、及び標的はＮ－結合型糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はムコリピドーシスＭＬ ＩＩＩ（偽性ハーラー・ポリジストロフィー）であり、レシーバーはＮ－アセチルグルコサミニル－１－ホスホトランスフェーラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｅｒａｓｅ）又はその断片であり、及び標的はＮ－結合型糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はムコリピドーシスＭＬ ＩＩＩ（偽性ハーラー・ポリジストロフィー）ＩＩＩ－Ａ型（２５２６００）であり、レシーバーは触媒サブユニット又はその断片であり、及び標的はＮ－結合型糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はムコリピドーシスＭＬ ＩＩＩ（偽性ハーラー・ポリジストロフィー）ＩＩＩ－Ｃ型（２５２６０５）であり、レシーバーは基質認識サブユニット又はその断片であり、及び標的はＮ－結合型糖タンパク質である。
一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ Ｉ Ｈ／Ｓ（ハーラー・シャイエ症候群；６０７０１５）であり、レシーバーはα－ｌ－イズロニダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ Ｉ－Ｈ（ハーラー症候群；６０７０１４）であり、レシーバーはα－ｌ－イズロニダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群；３０９９００）であり、レシーバーはイズロン酸硫酸スルファターゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリポ症候群）ＩＩＩ－Ａ型（２５２９００）であり、レシーバーはヘパラン－Ｓ－硫酸スルファミダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリポ症候群）ＩＩＩ－Ｂ型（２５２９２０）であり、レシーバーはＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミニダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリポ症候群）ＩＩＩ－Ｃ型（２５２９３０）であり、レシーバーはアセチル－ＣｏＡ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＩＩ（サンフィリポ症候群）ＩＩＩ－Ｄ型（２５２９４０）であり、レシーバーはＮ－アセチル－グルコサミニン（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｎｅ）－６－硫酸スルファターゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ Ｉ－Ｓ（シャイエ症候群；６０７０１６）であり、レシーバーはα－ｌ－イズロニダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＶ（モルキオ症候群）ＩＶ－Ａ型（２５３０００）であり、レシーバーはガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＶ（モルキオ症候群）ＩＶ－Ｂ型（２５３０１０）であり、レシーバーはβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＩＸ（ヒアルロニダーゼ欠損症；６０１４９２）であり、レシーバーはヒアルロニダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＶＩ（マロトー・ラミー症候群；２５３２００）であり、レシーバーはＮ－アセチルガラクトサミンα－４－硫酸スルファターゼ（アリールスルファターゼＢ）又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコ多糖症ＭＰＳ ＶＩＩ（スライ症候群；２５３２２０）であり、レシーバーはβ－グルクロニダーゼ又はその断片であり、及び標的はグリコサミノグリカンである。一実施形態において、疾患又は病態はムコスルファチドーシス（多種スルファターゼ欠損症；２７２２００）であり、レシーバーはスルファターゼ修飾因子－１又はその断片であり、及び標的はスルファチドである。一実施形態において、疾患又は病態はニーマン・ピック病Ａ型であり、レシーバーはスフィンゴミエリナーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴミエリンである。一実施形態において、疾患又は病態はニーマン・ピック病Ｂ型であり、レシーバーはスフィンゴミエリナーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴミエリンである。一実施形態において、疾患又は病態はニーマン・ピック病Ｃ１型／Ｄ型（２５７２２０）であり、レシーバーはＮＰＣ１タンパク質又はその断片であり、及び標的はスフィンゴミエリンである。一実施形態において、疾患又は病態はニーマン・ピック病Ｃ２型（６０７６２５）であり、レシーバーは精巣上体分泌タンパク質１（ＨＥ１；ＮＰＣ２タンパク質）又はその断片であり、及び標的はスフィンゴミエリンである。一実施形態において、疾患又は病態はプロサポシン欠損症（１７６８０１）であり、レシーバーはプロサポシン又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はピクノディスオストーシス（２６５８００）であり、レシーバーはカテプシンＫ又はその断片であり、及び標的はキニンである。一実施形態において、疾患又は病態はサンドホフ病；２６８８００であり、レシーバーはβ－ヘキソサミニダーゼＢ又はその断片であり、及び標的はガングリオシドである。一実施形態において、疾患又は病態はサポシンＢ欠損症（スルファチドアクチベーター欠損症）であり、レシーバーはサポシンＢ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はサポシンＣ欠損症（ゴーシェアクチベーター欠損症）であり、レシーバーはサポシンＣ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はシンドラー病Ｉ型（乳児重症型；６０９２４１）であり、レシーバーはＮ－アセチル－ガラクトサミニダーゼ又はその断片であり、及び標的は糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はシンドラー病ＩＩ型（カンザキ病、成人発症型；６０９２４２）であり、レシーバーはＮ－アセチル－ガラクトサミニダーゼ又はその断片であり、及び標的は糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はシンドラー病ＩＩＩ型（中間型；６０９２４１）であり、レシーバーはＮ－アセチル－ガラクトサミニダーゼ又はその断片であり、及び標的は糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はシアリドーシス（２５６５５０）であり、レシーバーはノイラミニダーゼ１（シアリダーゼ）又はその断片であり、及び標的はムコ多糖及びムコ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はシアル酸尿症フィンランド型（サラ病；６０４３６９）であり、レシーバーはリン酸Ｎａ共輸送体、シアリン又はその断片であり、及び標的はシアル酸である。一実施形態において、疾患又は病態はシアル酸尿症フランス型（２６９９２１）であり、レシーバーはＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン－２－エピメラーゼ／Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ、シアリン又はその断片であり、及び標的はシアル酸である。一実施形態において、疾患又は病態はスフィンゴリピドーシスＩ型（２３０５００）であり、レシーバーはガングリオシドβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はスフィンゴリピドーシスＩＩ型（若年型；２３０６００）であり、レシーバーはガングリオシドβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はスフィンゴリピドーシスＩＩＩ型（成人型；２３０６５０）であり、レシーバーはガングリオシドβ－ガラクトシダーゼ又はその断片であり、及び標的はスフィンゴ脂質である。一実施形態において、疾患又は病態はテイ・サックス病；２７２８００であり、レシーバーはβ－ヘキソサミニダーゼＡ又はその断片であり、及び標的はガングリオシドである。一実施形態において、疾患又は病態はウィンチェスター症候群（２７７９５０）であり、レシーバーはメタロプロテイナーゼ－２又はその断片であり、及び標的はムコ多糖である。一実施形態において、疾患又は病態はウォルマン病であり、レシーバーはリソソーム酸リパーゼ又はその断片であり、及び標的は脂質及びコレステロールである。一実施形態において、疾患又は病態はα－マンノシドーシス（２４８５００）、Ｉ型（重症）又はＩＩ型（軽症）であり、レシーバーはα－Ｄ－マンノシダーゼ又はその断片であり、及び標的は炭水化物及び糖タンパク質である。一実施形態において、疾患又は病態はβ－マンノシドーシス（２４８５１０）であり、レシーバーはβ－Ｄ－マンノシダーゼ又はその断片であり、及び標的は炭水化物及び糖タンパク質である。

【1102】

代謝産物の選択的飢餓
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して癌を治療又は予防し得る。

【1103】

具体的な実施形態において、癌に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）におけるアミノ酸細胞などの標的代謝産物の循環濃度を低減する方法が提供される。この標的代謝産物は癌細胞の生存に必須であるが、健康な正常細胞の生存には必須でない。特定の実施形態では、それによって癌細胞が選択的に必須代謝産物の飢餓状態となり、しかし健康な正常細胞にとってその代謝産物は必須でないため、これらの細胞は免れる。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。医薬組成物は、標的代謝産物の循環濃度を実質的に低減するのに有効な量で投与される。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。標的代謝産物の選択的な飢餓によって利益を得る疾患には、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、膵臓腺癌、ｐ５３欠損固形腫瘍並びに表６及び表８に掲載されるものを含めた癌が含まれる。

【1104】

具体的な実施形態において、本明細書に提供されるレシーバーを含む赤血球細胞の医薬組成物を、それを必要としている対象に癌を治療するのに十分な量で投与するステップを含む、癌の治療方法が提供される。化学療法薬又は腫瘍及び液状癌を治療する能力を有するレシーバーポリペプチドを含む機能性赤血球系細胞を含む組成物が、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、中枢神経系癌、乳癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、膵癌、並びに限定はされないが、表６及び表８に掲載されるものを含めた癌を呈する対象に投与され得る。

【1105】

一実施形態において、疾患又は病態は急性リンパ芽球性白血病であり、レシーバーはアスパラギナーゼ又はその断片であり、及び標的はアスパラギンである。

【1106】

一実施形態において、疾患又は病態は急性骨髄芽球性白血病であり、レシーバーはアスパラギナーゼ又はその断片であり、及び標的はアスパラギンである。

【1107】

一実施形態において、疾患又は病態はｐ５３欠損固形腫瘍であり、レシーバーはセリンデヒルダターゼ（ｄｅｈｙｒｄａｔａｓｅ）又はセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ又はそれらの断片であり、及び標的はセリンである。

【1108】

一実施形態において、疾患又は病態は膵臓腺癌であり、レシーバーはアスパラギナーゼ又はその断片であり、及び標的はアスパラギンである。

【1109】

急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）
一部の実施形態において、対象は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＡＬＬに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1110】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、アスパラギナーゼ又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上又は非露出側に呈示されてもよく、投与されると循環中のアスパラギン濃度を低減し、それによりＬ－アスパラギンの合成能が欠損した、且つアスパラギンのアミノ酸について局所環境に頼る癌細胞を取り除く。

【1111】

具体的な実施形態において、アスパラギナーゼレシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供される。かかる組成物は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を呈する又はそれと診断される対象の治療に用いられ得る。

【1112】

腫瘍細胞はＬ－アスパラギンの合成能を欠き、アミノ酸についてはその局所環境に頼っている。アスパラギナーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びエルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）の両方から単離することのできる酵素である。外来供給源由来のアスパラギナーゼは、生命を脅かすヒト抗細菌抗体反応を生じ得る免疫原性反応に曝される（Ａｖｒａｍｉｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００９ Ｊａｎ；２９（１）：２９９－３０２）。これは独立した酵素補充療法薬として治療利益を提供しているが、慢性治療の結果として阻害因子の発生がよく見られる。

【1113】

具体的な実施形態において、本明細書には、アスパラギナーゼレシーバーを含む複数の機能性赤血球系細胞を含む組成物が提供され、この組成物は、癌細胞からアスパラギンを欠乏させるためＡＬＬ対象に投与され得る。機能性赤血球系細胞は、その細胞内空間内に外因性アスパラギナーゼを含有し得る。細胞内に局在する外因性アスパラギナーゼポリペプチドは、次にアスパラギンをアスパラギン酸に変換し、それによってアスパラギンのレベルを低下させ得る。アスパラギンは細胞膜を通過し、アスパラギン酸に変換され、循環中に戻って拡散する。これは必須栄養素の局所欠乏を生じさせて腫瘍細胞を飢餓状態にするのに十分であり得る。

【1114】

血管欠損症に関連する疾患及び病態
一部の実施形態では、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を使用して、例えば血管タンパク質の血管欠損症に関連する疾患及び病態を治療又は予防し得る。本発明のこの態様の概略的な例を図１３Ｂに示す。

【1115】

一部の実施形態において、表面露出レシーバーポリペプジド（ｐｏｌｙｐｅｐｄｉｄｅ）は標的基質と相互作用し、標的基質を修飾し、変換し、変化させ又は他の方法で改変することができる。或いは、表面露出レシーバーポリペプジド（ｐｏｌｙｐｅｐｄｉｄｅ）は、特定の微小環境又は分子に応答して合成膜－レシーバー複合体の表面から切断される。一実施形態において、レシーバーの触媒活性は切断後に始まり得る。

【1116】

一部の実施形態において、合成膜－レシーバー複合体はレシーバーを含み、且つ任意選択で、合成膜－レシーバー複合体が溶解すると放出され得る治療剤などのペイロードを含む。ペイロードは、酵素、タンパク質、抗体、又は小分子であってもよい。溶解イベントは、合成膜－レシーバー複合体が存在する微小環境中の刺激によって惹起され得る。刺激は、例えば、膜標的化酵素を動員し、補体系を惹起して合成膜－レシーバー複合体を溶解させ、又は複合体を破壊用に標識し得る。或いは、合成膜－レシーバー複合体が細胞、例えば赤血球系細胞から作成される実施形態では、合成膜－レシーバー複合体は、特定の刺激に曝露されるか又はある期間が過ぎるとアポトーシスを起こすように修飾されてもよい。概略的な例を図１３Ｃに示す。

【1117】

具体的な実施形態において、血管欠損症に関連する疾患又は病態に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象（例えばヒト）における標的血管タンパク質の循環濃度を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物を投与するステップを含む。合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、血管タンパク質を分解し、切断し、又は変換することのできるレシーバーを含み得る。一部の実施形態において、欠損した血管酵素（非標的）の機能が回復する。一部の実施形態において、標的血管タンパク質の量が低下して、血管タンパク質の恒常性バランスが疾患又は病態の治療又は予防に有効なレベルまで有効に回復する。特定の実施形態において、投与は静脈内に行われる。血管欠損症に関連する疾患又は病態としては、限定はされないが、血栓性血小板減少性紫斑病、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病並びに表６及び表８に掲載されるものが挙げられる。

【1118】

具体的な実施形態において、凝固疾患又は抗凝固疾患の治療方法が提供される。この方法は、本明細書に提供されるレシーバーを含む赤血球細胞の医薬組成物を、それを必要としている対象に凝固疾患又は抗凝固疾患を治療するのに十分な量で投与するステップを含む。組成物は、血友病Ａ型、血友病Ｂ型、血友病Ｃ型、フォン・ヴィレブランド病、第ＩＩ因子欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、血栓形成傾向、肺塞栓症、脳卒中、並びに限定はされないが、表６及び表８に含まれる疾患又は欠損症を呈する対象に投与され得る。

【1119】

一実施形態において、疾患又は病態は血友病Ａであり、レシーバーは第ＶＩＩＩ因子又はその断片であり、及び標的はトロンビン（第ＩＩａ因子）又は第Ｘ因子である。

【1120】

一実施形態において、疾患又は病態は血友病Ｂであり、レシーバーは第ＩＸ因子又はその断片であり、及び標的は第ＸＩａ因子又は第Ｘ因子である。

【1121】

一実施形態において、疾患又は病態は血栓性血小板減少性紫斑病であり、レシーバーはＡＤＡＭＴＳ１３又はその断片であり、及び標的は超大型フォン・ヴィレブランド因子（ＵＬＶＷＦ）である。

【1122】

血友病
一部の実施形態において、対象は、血友病の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。血友病に罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1123】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、凝固第ＶＩＩＩ因子又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されてもよく、投与されると、血友病Ａを呈する対象に第ＶＩＩＩ因子機能を提供し得る。

【1124】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、凝固第ＩＸ因子又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示されてもよく、投与されると、血友病Ｂを呈する対象に第ＩＸ因子機能を提供し得る。

【1125】

血友病は一般的な出血性障害であり（およそ１万人に１人の男性に起こる）、患者の血液が正常に凝固しないため、多くの場合に死亡に至る重度の内出血が生じる。血友病は通常遺伝し、患者は出生時から始まる重度の制御不能な出血イベントを示し、生涯にわたって再発を繰り返す。血小板と協働して血液凝固を促進する凝固因子には幾つかの種類があるが、血友病患者は通常、凝固第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）又は第ＩＸ因子（血友病Ｂ）をコードするタンパク質の定量的又は定性的欠陥を有し、それが正常な止血を妨げる。第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子はＸ染色体上にあるため、通常、血友病は男性に起こる（しかしながら、まれに、罹患した父親及びこの疾患の保因者である母親からそれぞれ欠陥Ｘ染色体を受け継ぐ女性の例外もある）。毎年、全世界でおよそ１万人に１人は血友病を有して生まれる。

【1126】

止血は、出血の停止をもたらす複雑な生理学的プロセスである。血小板、血漿タンパク質、血管及び内皮細胞が、各々、組織傷害の直後に起こる、且つ通常の状況下では急速な凝血塊形成を生じさせるイベントにおいて重要な役割を果たす。その中心となるのは凝固カスケードであり、これは、特定の血漿タンパク質（即ち凝固因子）が先に活性化された別の凝固因子によって「カスケード」で順次活性化されて急速なトロンビン産生が生じる一連のタンパク質分解イベントである。次に、このカスケードで産生された多量のトロンビンが、フィブリノゲンを切断して凝血塊形成に必要なフィブリンペプチドにする役割を果たす。

【1127】

凝固因子は不活性単鎖チモーゲンとして循環し、１つ以上の位置で切断されると活性化し、二重鎖活性型のタンパク質を生じる。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質の第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、初めはチモーゲンとして血中を循環する。ＦＶＩＩチモーゲンは単一の部位Ａｒｇ１５２－Ｉｌｅ１５３におけるタンパク質分解切断によって活性化され、その結果、単一のジスルフィド結合で連結された二重鎖プロテアーゼとなる（ＦＶＩＩａ）。ＦＶＩＩａはその補因子、組織因子（ＴＦ）に結合して複合体を形成し、ここでＦＶＩＩａは第Ｘ因子（ＦＸ）をＦＸａに効率的に活性化することができ、それによりフィブリン形成及び止血をもたらす一連のイベントが開始される。

【1128】

血液凝固経路は、一部には、血小板の表面上における第Ｖｉｌｌａ因子（ＦＶＩＩＩａ）及び第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）の酵素複合体（Ｘａｓｅ複合体）の形成を含む。ＦＩＸａは、その補因子ＦＶＩＩＩａがなければ触媒活性が比較的弱いセリンプロテアーゼである。Ｘａｓｅ複合体は第Ｘ因子（ＦＸ）を切断して第Ｘａ因子（ＦＸａ）にし、次には第Ｘａ因子が第Ｖａ因子（ＦＶａ）と相互作用してプロトロンビンを切断し、トロンビンを生成する。

【1129】

血友病患者はおよそ１０人中９人がＡ型である。血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ活性の欠損を生じさせる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の突然変異及び／又は欠失によって引き起こされる出血性障害である。ある場合には、患者は抗ＦＶＩＩＩ抗体などのＦＶＩＩＩ阻害因子の存在に起因して低いＦＶＩＩＩレベルを有する。血友病Ａは、突発性出血及び外傷後の出血多量を特徴とする。時間が経つと、小児期早期に始まることの多い筋内及び関節内への出血が繰り返され、血友病性関節症及び不可逆的な関節損傷が生じる。この損傷は進行性であり、重度の関節可動性制限、筋萎縮及び慢性痛を引き起こし得る（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７－９６（２００３））。

【1130】

この疾患は、ＦＶＩＩＩ活性を正常値の１～５％に回復して突発性出血を防ぐことを目標とする補充療法によって治療され得る（例えば、Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３－９（２００１）（本明細書において全体として参照により援用される）を参照）。血漿由来及び組換えＦＶＩＩＩ製剤が、出血エピソードのオンデマンド治療又は予防的処置による出血エピソードの発生予防に利用可能である。これらの製剤の半減期に基づけば（１０～１２時間）（Ｗｈｉｔｅ Ｇ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：６６０－７（１９９７）；Ｍｏｒｆｍｉ，Ｍ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ９（ｓｕｐｐｌ ｌ）：９４－９９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １００（２００３））、治療レジメンには頻回静脈内投与、通常予防について週２～３回及びオンデマンド治療について１日１～３回が必要である（Ｍａｎｃｏ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５７：５３５－５４４（２００７））（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）。かかる頻回投与は痛みを伴い、不便である。

【1131】

オンデマンド治療が頻用されているが、予防法及び関節損傷の阻止に向かう傾向がある（Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２００４：１０；６７９－６８３，Ｍａｎｃｏ－Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＭＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００７；３５７：５３５－５４４）。現行のＦＶＩＩＩ製剤は半減期が１０～１２時間と比較的短いため、予防には２～３日おきに投与することで、患者において１％を上回るＦＶＩＩＩ：Ｃが維持される（Ｍｏｒｆｉｎｉ，Ｍ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２００３；９（ｓｕｐｐｌ ｌ）：９４－９９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １００，Ｗｈｉｔｅ ＧＣ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９７：７７：６６０－７，Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ，Ｐ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８ Ａｕｇ；６（８）：１３１９－２６）。出血の長期保護を提供する長時間作用型ＦＶＩＩＩ治療薬は、血友病Ａ患者のクオリティオブライフの向上を意味し得る。

【1132】

凝固因子の半減期を延長させる戦略としては、ペグ化（Ｒｏｓｔｉｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０００；１１：３８７－９６）、グリコペグ化（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ ＨＲ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８；１００：９２０－８）、ペグ化リポソームを含む製剤化（Ｓｐｉｒａ Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００６；１０８：３６６８－３６７３，Ｐａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００９；１１４：２８０２－２８１１）及びアルブミンとのコンジュゲーション（Ｓｃｈｕｌｔｅ Ｓ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．２００８；１２２ Ｓｕｐｐｌ ４：Ｓ１４－９）が挙げられる。

【1133】

通常の条件下では、活性化した血小板は脂質界面を支持する凝固を提供する。血小板はトロンビンによって活性化され、トロンビンは血管外傷部位に形成されるものであるため、凝固プロセスは外傷部位に限られている。しかしながら、凝固促進性脂質の一般的な代替物であるペプチドを体に供給することは、全身性凝固を生じさせ、最終的に播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を引き起こし得るため望ましくない。

【1134】

米国特許第７，１０９，１７０号明細書及び同第６，６２４，２８９号明細書は、ＦＶＩＩＩａと相互作用し且つＦＩＸａのＦＶＩＩＩａ結合部位を含むＦＩＸａプロテアーゼドメインの領域を開示している。このペプチドは、ＦＩＸａとＦＶＩＩＩａの結合を阻害する。この開示のペプチドは、血栓症を予防又は治療する抗凝固薬として有用であり得る。

【1135】

米国特許出願公開第２００１００１４４５６Ａ１号明細書は、ヒトＦＶＩＩＩ及びＦＶＩＩＩ様タンパク質に対する結合分子を開示している。これらのポリペプチドはＦＶＩＩＩ及び／又はＦＶＩＩＩ様ポリペプチドと結合し、血液又は馴化培地などの溶液からのヒトＦＶＩＩＩ及び／又はＦＶＩＩＩ様ポリペプチドの検出及び精製に有用である。

【1136】

米国特許第７，０３３，５９０号明細書では、ＦＩＸ／ＦＩＸａ活性化抗体及び抗体誘導体が、ＦＩＸａのアミド分解活性の増加、並びに血友病Ａ及び出血性素因などの血液凝固障害の治療に用いられている。

【1137】

米国特許第７，０８４，１０９号明細書は、ペプチドであってＦＶＩＩａ活性を阻害するＦＶＩＩａ拮抗薬を開示している。このようなペプチドは、血栓溶解療法と組み合わせた動脈血栓症の予防に有用であり得る。

【1138】

血友病は、血中に正常な機能性凝固因子がどの程度存在するかによって軽症、中等症、又は重症となり得る。およそ１０人中７人の血友病Ａ患者が重症型のこの障害を有する。

【1139】

血友病Ｂ（クリスマス病としても知られる）は、世界で最もよく見られる遺伝性出血性障害の１つである。これはインビボ及びインビトロ血液凝固活性の低下をもたらし、罹患者の生涯にわたって広範な医学的モニタリングが必要である。

【1140】

介入がない場合、罹患者は関節の突発性出血を起こし、そのため激痛及び衰弱性の硬直が生じる。筋肉内に出血すると、それらの組織に血液が蓄積する。咽頭及び頸部の突発性出血は、直ちに処置が行われない場合には窒息を引き起こし得る。尿中への出血、及び手術、事故による軽度外傷、又は抜歯に伴う重度の出血もまたよく見られる。

【1141】

血友病Ｂは、第ＩＸ因子タンパク質合成の低下又は活性が減少した欠陥分子のいずれかに起因し得る第ＩＸ因子の欠乏によって引き起こされる。

【1142】

ビタミンＫ依存性ポリペプチド群の一員であるヒトＦＩＸは、肝細胞によって４１５アミノ酸の不活性チモーゲンとして血流中に分泌される分子量が５７ｋＤａの単鎖糖タンパク質である。ヒトＦＩＸは、ポリペプチドのＮ末端Ｇｌａドメインに局在する１２個のγ－カルボキシグルタミン酸残基を含有する。Ｇｌａ残基はその生合成にビタミンＫを必要とする。Ｇｌａドメインに続き、２個の上皮成長因子ドメイン、活性化ペプチド、及びトリプシン型セリンプロテアーゼドメインがある。ＦＩＸのさらなる翻訳後修飾には、ヒドロキシル化（Ａｓｐ ６４）、Ｎ－（Ａｓｎｌ５７及びＡｓｎｌ６７）並びにＯ結合型グリコシル化（Ｓｅｒ５３、Ｓｅｒ６１、Ｔｈｒｌ５９、Ｔｈｒｌ６９、及びＴｈｒｌ７２）、硫酸化（Ｔｙｒｌ５５）、及びリン酸化（Ｓｅｒｌ５８）が包含される。Ａｒｇｌ４５－Ａｌａｌ４６及びＡｒｇｌ８０－Ｖａｌｌ８１での活性化ペプチドのタンパク質分解によってＦＩＸがその活性型、第ＩＸａ因子に変換されると、２つのポリペプチド鎖、Ｎ末端軽鎖（１８ｋＤａ）及びＣ末端重鎖（２８ｋＤａ）が形成され、これらは１つのジスルフィド架橋によって共に保持されている。第ＩＸ因子の活性化切断は、例えば第ＸＩａ因子又は第ＶＩＩａ／ＴＦ因子によってインビトロで達成し得る。第ＩＸ因子はヒト血漿中に５～１０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。ヒトにおける第ＩＸ因子の終末血漿中半減期は約１５～１８時間であることが分かっている（Ｗｈｉｔｅ Ｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．７８：２６１－２６５；Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ Ｂ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｍａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆ ＩＸ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｏｒ ｓｅｖｅｒｅ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４２：１９０－１９７）。

【1143】

血友病Ｂの治療は、欠損凝固因子を、第ＩＸ因子が高度に濃縮されている外的因子濃縮物で補充することにより行われる。しかしながら、血液からかかる濃縮物を生成することは困難である。血漿から第ＩＸ因子を精製すると（血漿由来第ＩＸ因子；ｐｄＦＩＸ）、ほとんど例外なく活性第ＩＸ因子が得られる。しかしながら、ＦＩＸは血漿中に低濃度でしか存在しないため、血漿からのＦＩＸのかかる精製は非常に困難である（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：４５１ ４５９（１９７５）。さらに、血液から精製するには、ＨＩＶ及びＨＣＶなどの感染病原体を除去するか又は不活性化する必要がある。加えて、ｐｄＦＩＸは半減期が短く、従って頻回投与が必要である。組換えＦＩＸ（ｒＦＩＸ）もまた利用可能であるが、ｐｄＦＩＸと同じく短い半減期及び頻回投与の必要性（例えば、予防のために週２～３回）という欠点がある。

【1144】

組換えＦＶＩＩａ製剤は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから市販されている（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）。組換えＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸに対する阻害因子を有する血友病Ａ又はＢ患者の治療用に承認されており、出血エピソードの停止又は外傷及び／又は手術に関連する出血の予防に用いられていると共に、先天性ＦＶＩＩ欠乏症患者の治療用にも承認されている。血友病患者における急性出血エピソードの管理には６時間の間に平均３用量のＦＶＩＩａが必要であるため、ＦＶＩＩａ治療薬は依然として未だ対処されていない高い医療ニーズとなっている。

【1145】

補充療法の合併症としては、患者の免疫系にとって外来性の正常な治療用タンパク質に対する抗体応答の発生（阻害因子形成として知られる）（これは最終的に約３０％の患者に凝固因子の不活性化又は破壊及び制御不能の出血を引き起こす）、ヒト凝固因子（特に第三世界諸国における感染供血者からのＨＩＶ又は肝炎で汚染された血液由来のもの）からのウイルス感染症の発生、重症の血管外傷及び治療の遅れに起因する関節、筋肉、又は他の身体部分の損傷を鎮静化するために頻繁な再投与が必要な、半減期が極めて短い（数日の）補充タンパク質の極めて高いコストが挙げられる。

【1146】

具体的な実施形態において、本明細書には、血友病を含めた凝固疾患を治療又は予防する能力を有するレシーバーポリペプチドを含む血小板が提供される。好適なレシーバーポリペプチドとしては、凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子が挙げられる。ヒト第ＶＩＩＩ因子は受託番号ＮＭ ０００１３２．３であり、ヒト第ＩＸ因子は受託番号ＮＭ ０００１３３．３である。

【1147】

一部の実施形態において、１つ以上の組換え因子（例えば、組換えＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩ、及びＦＶＩＩａ）と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体との共投与を含む、血友病の治療方法が提供され、ここで共投与には、合成膜－レシーバー複合体の投与前、その投与後又はその投与と同時の組換え因子の投与が含まれる。

【1148】

一部の実施形態において、１つ以上の組換え因子（例えば、組換えＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩ、及びＦＶＩＩａ）と本明細書に記載される合成膜－レシーバー複合体とを含む医薬組成物の投与を含む、ウイルス感染症の治療方法が提供される。

【1149】

一部の実施形態において、出血エピソードに対する長期保護を提供するため単回治療が利用される。血友病を治療する一部の実施形態において、治療は、出血エピソードを予防するため定期的に（例えば、週１回、月１回、年１回、２、３、４、５年又はそれを超える期間に１回など）実施される。一部の実施形態において、治療は、異常出血エピソードが起こったとき（例えば、事故後、術前又は術後等）にのみ投与される。一部の実施形態において、異常出血エピソードが起こったときに別の治療法と組み合わせて維持療法が投与される。

【1150】

血栓性血小板減少性紫斑病
一部の実施形態において、対象は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の治療を受けているか、又はそれを受けることによって利益を得るであろうものとして特定され得る。ＴＴＰに罹患しているか又はそれを発症するリスクがある対象には、疾患の治療又は予防のため、本明細書に記載される合成膜－レシーバーポリペプチド複合体を含む医薬組成物が投与され得る。

【1151】

一実施形態において、合成膜－レシーバーポリペプチド複合体は、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３又はその誘導体若しくは機能断片を含むレシーバーを含む。好適なレシーバーは合成膜－レシーバーポリペプチド複合体の表面上に呈示され得る。好適なレシーバーは、超大型フォン・ヴィレブランド因子（ＵＬ－ＶＷＦ）多量体を切断して小型の多量体にする能力を有する。

【1152】

ＵＬ－ＶＷＦの循環多量体は、内皮傷害の領域、特に細動脈－毛細血管接合部の血小板粘着を増加させる。顕微鏡的凝血塊を通過する赤血球はずり応力に供されてその膜に損傷を受け、そのため血管内溶血が起こり、ひいては貧血及び分裂赤血球形成が起こる。血栓症及び細胞傷害に起因する血流低下は、末端臓器障害を引き起こす。現行の治療法は、血中酵素レベルを補うための支持及びプラスマフェレーシスに基づく。

【実施例】

【1153】

実施例１：遺伝子アセンブリ
以下の遺伝子をコードするＤＮＡ－グリコホリンＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０２７２４）、Ｋｅｌｌ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ２３２７６）、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体ｓｃＦｖ（Ｂｏｓｅ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０（９）：６１７、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＪ５４９５０１．１）、アデノシンデアミナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ００８１３）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦ１４６７１１．１）、補体受容体１（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１７９２７）、ＣＤ４６（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ１２２２４．１）、ＣＤ５５（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０８１７４）、ＣＤ５９（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１３９８７）、緑色蛍光タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４２２１２）、チミジンホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１９９７１）、グルコセレブロシダーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０４０６２）、β２グリコプロテイン１（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０２７４９）、ホスホリパーゼａ２受容体（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１３０１８）、コラーゲンα３（ＩＶ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０１９５５）、血清アミロイドＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０２７４３）、リポタンパク質リパーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０６８５８）、アスパラギナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ００８０５）、第ＩＸ因子（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｆ２ＲＭ３５）、ＡＤＡＭＴＳ１３（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ７６ＬＸ８）－をｃＤＮＡとしてＤｈａｒｍａｃｏｎ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入するか、又はＤＮＡ２．０及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔでデノボ合成した。

【1154】

１．単一遺伝子クローニング（ＣＲ１）
当該技術分野において公知の標準的な分子生物学的方法によって遺伝子をアセンブルし、発現ベクターにした。補体受容体１（ＣＲ１）の遺伝子は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。このｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した：上流オリゴは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＣＲ１の始端に相同の２５ｎｔとからなった；下流オリゴは、下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＣＲ１の終端に相同の２５ｎｔとからなった。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾－尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるギブソンアセンブリにより、ＣＲ１アンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。

【1155】

２．２つの遺伝子の融合（膜Ｋｅｌｌ－ｓｃＦｖ）
Ｋｅｌｌの遺伝子はｃＤＮＡとして購入し、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。これらのｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した。Ｋｅｌｌは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ、及びｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。ｓｃＦｖは、Ｋｅｌｌ挿入部位の３’末端に相同の２５ｎｔとｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ、及び下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとｓｃＦｖの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾－尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるワンポットギブソンアセンブリにより、Ｋｅｌｌ及びｓｃＦｖアンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。

【1156】

３．遺伝子間のリンカーアセンブリ（Ｋｅｌｌ－ｓｃｆｖ）
Ｋｅｌｌの遺伝子はｃＤＮＡとして購入し、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。これらのｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した。Ｋｅｌｌは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及びｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとＫｅｌｌの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。ｓｃＦｖは、Ｋｅｌｌ挿入部位の３’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及び下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとｓｃＦｖの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾－尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるワンポットギブソンアセンブリにより、Ｋｅｌｌ及びｓｃＦｖアンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。

【1157】

４．エピトープタグの付加（Ｋｅｌｌ－ｓｃＦｖ）
Ｋｅｌｌの遺伝子はｃＤＮＡとして購入し、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。これらのｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した。Ｋｅｌｌは、上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＫｅｌｌの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及びｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとＫｅｌｌの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。ｓｃＦｖは、Ｋｅｌｌ挿入部位の３’末端に相同の２５ｎｔと（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｘ２スペーサーをコードする２４ｎｔとｓｃＦｖの５’末端に相同の２５ｎｔとからなる上流オリゴ；及び下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＨＡエピトープタグをコードする２７ｎｔ配列ｔａｃｃｃｃｔａｔｇａｃｇｔｇｃｃｃｇａｃｔａｔｇｃｃ（配列番号８）とｓｃＦｖの３’末端に相同の２５ｎｔとからなる下流オリゴで増幅した。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾－尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化した。下流プライマーには、ＨＡエピトープタグをコードする２７ｎｔ配列ｔａｃｃｃｃｔａｔｇａｃｇｔｇｃｃｃｇａｃｔａｔｇｃｃ（配列番号８）がさらに含まれた。線状化したベクターをＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるワンポットギブソンアセンブリにより、Ｋｅｌｌ及びｓｃＦｖアンプリコンを線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。

【1158】

５．２つの遺伝子の融合（レポーターアセンブリ）（ＧＰＡ－ＨＡ）
補体受容体１（ＣＲ１）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子は商業的供給業者（ＤＮＡ２．０）によって合成され、標準クローニングベクター（ｐＪ系列）として供給された。このｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＣＲ１遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した：上流オリゴは上流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＣＲ１の始端に相同の２５ｎｔとからなった；下流オリゴはウイルス由来のＴ２Ａ配列ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号７）に相同の５４ｎｔからなった。ｐＪベクターから、非相同末端配列を有するオリゴを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＧＦＰ遺伝子を増幅し、哺乳類発現ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｐＭ系列）への挿入用に調製した：上流オリゴは、ウイルス由来のＴ２Ａ配列ｇａｇｇｇｃａｇａｇｇａａｇｔｃｔｔｃｔａａｃａｔｇｃｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇｓｇｓｓｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔ（配列番号７）に相同の５４ｎｔとＧＦＰの始端に相同の２５ｎｔとからなった；下流オリゴは、下流ｐＭ挿入部位に相同の２５ｎｔとＧＦＰの終端に相同の２５ｎｔとからなった。増幅産物はゲル電気泳動（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。上流及び下流挿入部位に相同の尾－尾型オリゴによるＰＣＲでｐＭベクターを線状化し、ＰＣＲ精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。Ｇｉｂｓｏｎ ２０１１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ ４９８，ｐ．３９４に詳説されるギブソンアセンブリにより、ＣＲ１及びＧＦＰアンプリコンを共に線状化ｐＭベクターにライゲートした。配列はサンガー塩基配列決定法で確認した。

【1159】

実施例２：ｍＲＮＡアセンブリ
標準的な分子生物学的方法を用いて目的の遺伝子をｐＳＰ６４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の多重クローニング部位にクローニングする。ベクターをＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で消化して、ＳＰ６プロモーターと目的の遺伝子と３０ヌクレオチド長のポリＡテールとを含む線状化ｄｓＤＮＡベクターを作成する。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との反応によって、キャップ付加ｍＲＮＡ転写物を合成するための５’キャップ類似体（ＡＲＣＡ）の推奨濃度を含めて製造者の指示に従いｍＲＮＡを合成する。次に反応混合物をＤＮアーゼで処理して鋳型ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａのリボプローブ（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ））を消化し、ＥＺＮＡ ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅ ＲＮＡクリーンアップキット（Ｏｍｅｇａ）を使用してｍＲＮＡを精製する。

【1160】

実施例３：細胞培養
１．ヒト赤血球（ＲＢＣ）
Ｍｉｎｉ－ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；９４％±３％純度）の使用による超磁気マイクロビーズ選択法により、末梢血からＣＤ３４細胞を単離する。細胞は、安定化グルタミン、３３０μｇ／ｍＬホロヒトトランスフェリン、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン、２ＩＵ／ｍＬヘパリン、及び５％溶剤／界面活性剤ウイルス不活化血漿を補充したＩＭＤＭをベースとする赤血球分化培地（ＥＤＭ）で培養する。拡大手順には３つのステップが含まれる。第１のステップでは（０日目～７日目）、ＥＤＭ中、１μＭヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－３、及び３ＩＵ／ｍＬ ＥＰＯの存在下で１０^４個／ｍＬのＣＤ３４＋細胞を培養する。４日目に、ＳＣＦ、ＩＬ－３、ＥＰＯ、及びヒドロコルチゾンを含有する４容積の新鮮培地中に１容積の細胞培養物を希釈する。第２のステップでは（７日目～１１日目）、ＳＣＦ及びＥＰＯを補充したＥＤＭ中に１０^５個／ｍＬで細胞を再懸濁する。第３のステップでは（１１日目～１８日目）、ＥＰＯのみを補充したＥＤＭ中で細胞を培養する。細胞数は１１日目及び１５日目にそれぞれ７．５×１０^５～１×１０^６及び５～１０×１０^６細胞／ｍＬに調整する。１８日目を過ぎたら、ＥＰＯを含有する培養培地を週２回取り替える。培養物は５％ＣＯ２の空気中３７℃に維持する。

【1161】

２．マウス赤血球
マウス胎仔肝赤血球前駆体からマウス赤血球系細胞を培養する方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４，ＰＮＡＳ ２０１４ １１１（２８）：１０１３１を参照されたい。

【1162】

胎仔肝からマウス赤血球前駆体を単離する。胎仔肝はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓから購入する。肝臓を氷上の１ｍｌ ＰＢＳ中に入れる。ピペットを上下させて単一細胞懸濁溶液を得て、７０ｕｍストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ３５－２２３５）に通す。そのメッシュを１ｍｌのＰＢＳでリンスする。素通り画分を合わせる（１つの胚当たり１ｍｌ）。細胞を１．５ｋ ＲＰＭ、５分間でペレット化し、赤血球溶解緩衝液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌの塩化アンモニウム溶液）で再懸濁し、及び氷上で１０分間インキュベートする。細胞を１．５ｋ ＲＰＭ、５分間でペレット化し、溶解緩衝液を除去し、及び１０ｍｌ ＰＢＳ－２％ＦＢＳで再懸濁する。ｃｈｒｏｍＰｕｒｅ Ｒａｔ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、＃０１２－０００－００３）を５０ｕｌ／マウスで加え、４℃で５分間インキュベートする。ビオチン化抗マウスＴＥＲ１１９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５３６７２）を（１ｕｌ／１×１０^６細胞）で加え、４℃で１５分間インキュベートする。細胞にＭｓ Ｌｉｎｅａｇｅ Ｐａｎｅｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃ＢＤＢ５５９９７１）を（２ｕｌ／１×１０^６細胞）で加え、４℃で１５分間インキュベートする。１０倍容積のＰＢＳで１回洗浄し、細胞を４℃、１．５ｋ ＲＰＭで５分間スピンさせる。ストレプトアビジン粒子Ｐｌｕｓ－ＤＭ（磁気ビーズ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、＃５５７８１２）（５ｕｌ／１×１０^６細胞）を加え、４℃で３０分間インキュベートする。磁気ホルダ上に２～４本のＦＡＣＳチューブを準備する。２ｍｌの細胞のアリコートを各チューブに取り分け（合計４ｍｌ）、磁気スティックビーズを破壊しないようにしながらチューブから細胞を慎重に取り出して反対側にある他方のチューブに入れる。同じ手順を繰り返し、Ｔｅｒ１１９陰性細胞及びリンケージ陰性細胞を新しいチューブに取る。細胞を濃縮し、それらの細胞を５０～１００ｕｌ ＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で再懸濁する。

【1163】

精製した赤血球前駆体は、（４０ｍＬに対して）：ＩＭＤＭ：２９ｍｌ、ＦＢＳ（幹細胞）：６ｍｌ（最終１５％）、ＩＭＤＭ中１０％ＢＳＡ（幹細胞）：４ｍｌ（最終１％）、１０ｍｇ／ｍｌホロトランスフェリン：２０００ｕｌ（最終：５００ｕｇ／ｍｌ）、１００×Ｌ－グルタミン：４００ｕｌ、１００×ペニシリンストレプトマイシン：４００ｕｌ、１０Ｕ／ｕｌ Ｅｐｏ：２ｕｌ（最終：０．５Ｕ／ｍｌ）、１０ｍｇ／ｍｌインスリン：４０ｕｌ（最終：１０ｕｇ／ｍｌ）を含む分化培地で培養する。２×１０^５細胞／ｍｌを２４ウェルプレートの分化培地中３７℃で培養する。合計４４～４８時間培養した後、例えば本明細書で実施されるとおりフローサイトメトリーによって分析を実施する。分化プロファイル分析のため、（ヘキスト染色）を使用して除核赤血球をゲーティングする。培養が成功すれば、１６倍の増加が得られる。

【1164】

３．血小板
Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから、提供されたＣＤ３４＋細胞を入手する。ＣＤ３４＋濃縮細胞を２～４×１０^４細胞／ｍＬで無血清培地にプレーティングし、４日目に等容積の培地を加えて培地のリフレッシュを行う。６日目、細胞をカウントして分析する：１．５×１０^５細胞を洗浄し、ＴＰＯ ３０ｎｇ／ｍＬ、ＳＣＦ １ｎｇ／ｍＬ、インターロイキン（ＩＬ）－６ ７．５ｎｇ／ｍＬ及びＩＬ－９ １３．５ｎｇ／ｍＬ］からなるサイトカインカクテルを補充した１ｍＬの同じ培地に入れて巨核球分化を誘導する。１０日目に１／２～１／４の浮遊培養液を新鮮培地に交換する。サイトカインは全て、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入する。加湿雰囲気中（１０％ＣＯ２）、培養の最初の６日間は３９℃で及び最後の８日間は３７℃で培養物をインキュベートする。血球計算器（０．４％トリパンブルー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，カナダ）で生存有核細胞をカウントする。

【1165】

骨髄ＣＰＣについてはＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３６及び巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ－Ｍｋ）についてはＭｅｇａＣｕｌｔ－Ｃを使用して、製造者の指示（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，カナダ）に従いクローン原性前駆細胞（ＣＰＣ）をアッセイする。分化を評価するため、ＦＡＣＳ－Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用したフローサイトメトリーにより、ＣＤ６１ｍ ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、及びＣＤ４９ｂに対する抗体で細胞を染色する。細胞周期分析のため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、ホルムアルデヒド２％（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で５分間固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で透過処理する。次に細胞をｍＡｂ－Ｋｉ－６７－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識し、洗浄し、製造者の指示（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い０．５ｍＬ ＰＢＳ－１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）－０．０１％アジド７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）中に再懸濁する。

【1166】

実施例４：細胞単離
１．初代ＲＢＣ
無菌法を用いて、低分子量ヘパリン、ダルテパリンナトリウム（９単位／ｍＬ血液）が入ったチューブに全血を収集する。血液を５０００×ｇで５分間遠心し、血漿及びバフィーコートを除去した後（両方とも後に使用するため取り置かれ得る）、赤血球を冷（４℃）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で遠心して２回洗浄する。得られた赤血球集団は、長期保存のためＣＰＤＡ－１抗凝固剤又はグリセロール溶液中４℃で保存する。

【1167】

２．初代血小板
適切なＩＲＢプロトコルに基づき健常人から全血（４０ｍｌ）を３．８％クエン酸ナトリウム（１：９クエン酸塩対血液ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に収集する。血液を２００ｇで１５分間遠心して多血小板血漿（ＰＲＰ）を単離する。次に、１μＭプロスタグランジンＩ２の存在下、変性タイロード緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭ デキストロース、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ ＫＣｌ２、０．３６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ含有、ｐＨ７．４）中で血小板を洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁する。

【1168】

実施例５：初代細胞又は培養細胞の照射
合成膜－レシーバー複合体の集団の照射を実施して、それらが複製不能であることを確実にし得る。かかるプロトコルは、細胞、例えば初代赤血球の照射について当該技術分野で公知のものと同様である。簡潔に言えば、１単位（３５０ｍｌ）の全血を取り、各１７５ｍｌの２つのアリコートに分け、従ってかかる１０単位を２０のアリコートに分ける。各単位血液の一方のアリコート（１７５ｍｌ）を、自蔵式ガンマ線細胞照射器（ＧａｍｍａＣｅｌｌ １０００、Ｔｈｅｒａｔｒｏｎｉｃｓ）によって２５Ｇｙの、但し５０Ｇｙ以下のγ線照射に供する。次に血液を従来の血液貯蔵条件下に４℃で保存する。これらの１０個の照射済み血液バッグ及び１０個の非照射血液バッグから、０、７、１４、及び２１日目にサンプリングサイトカプラー（Ｆｅｎｗａｌ、ＵＳＡ）を用いてサンプリングを行う。潜在的な有糸分裂能を定量化するチミジン取込みアッセイを含め、細胞増殖試験を実施する。遊離ヘモグロビンに関しては吸光度分光法、及び遊離乳酸デヒドロゲナーゼに関しては比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で上清をアッセイし、細胞溶解レベルを評価する。

【1169】

実施例６：赤血球系細胞の除核
コラーゲンでコーティングした直径１２ｍｍのカバーガラス上で、１００単位／ｍｉのペニシリン及び１００単位／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＩＭＤＭ培地中において赤血球系細胞をセミコンフルエンス（１～４×１０^４細胞毎ｃｍ２）になるまで成長させる。コラーゲンは、遠心中に全細胞がカバーガラスから落ちることを防止するために必要である。細胞を同じ培地中か又は１０％仔ウシ血清含有ダルベッコ変法イーグル培地中においてカバーガラス上に単層（５×１０４細胞毎ｃｍ２）に成長させる。この細胞カバーガラスをコラーゲンでコーティングする必要はない。細胞を除核するため、カバーガラスを反転させ（細胞側を下にして）、１０ｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む２～５ｍｌの培地が入った１５ｍｌ Ｃｏｒｅｘ遠心管の底に置く。このカバーガラスが入った遠心管を直ちに、（ＳＳ ３４）ローターをヘッドを所定位置にして１０，０００ｒｐｍで約１時間スピンさせることにより３７℃に加温したＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ－２遠心機に置く（温度調節装置は３７～３９度に設定）。遠心の時間の長さ及び速度は除核の成功に重大な要素である。細胞を３７±２０で９０００ｒｐｍで１時間スピンし、及び細胞を３７±－２０で６５００ｒｐｍで５０分間スピンする。遠心後、遠心機からカバーガラスを取り出し、３ｍｌのサイトカラシンＢ不含培地が入った３５ｍｍ（Ｆａｌｃｏｎ）組織培養皿（Ｂｉｏｌｑｕｅｓｔ）に細胞側を上にして置く。３７０で３０～６０分以内に細胞は形態学的に正常となり、９０～９９％が核を欠く。トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏ．）で処理することによりカバーガラスから除核細胞を取り外し、通常の培地に細胞を懸濁する。次に３５ｍｍ組織培養皿に保持した２２ｍｍ２カバーガラスに除核細胞を小滴で再度プレーティングし、インキュベーターに置く。再度プレーティングした後時間間隔を置いてスライド（１２）上にカバーガラスをマウントし、Ｚｅｉｓｓ位相コントラスト、偏光、及びノマルスキー光学系で除核物の観察を行う。

【1170】

実施例７：細胞の接触
１．核酸－トランスフェクション
目的の核酸をスケールアップして、負荷する１０^５個の複合体、例えば細胞、赤血球系細胞、血小板、又は造血前駆細胞当たり約５ｕｇの核酸を提供する。核酸はＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に１ｕｇ対５０ｕＬ培地の比で希釈する。次に希釈した核をトランスフェクション試薬（ＤＮＡについてはＴｒａｎｓ－ＩＴ、ｍＲＮＡについてはＴｒａｎｓ－ＩＴ ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡについてはＴｒａｎｓ－ＩＴ ｓｉＲＮＡ、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）と１：１容積比で合わせ、室温で５分間複合体を形成させる。この核酸複合体を細胞に１２～２４時間加える。任意選択で、この時間が経った後、トランスフェクション試薬がそれ以上存在することのないよう、培地を新鮮培地に交換してもよい。

【1171】

２．核酸－ウイルス形質導入
目的の遺伝子をＳｙｓｔｅｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＭＳＣＶプロモーター配列と共にレンチウイルスベクターｐＣＤＨの多重クローニング部位にクローニングする。

【1172】

レンチウイルスは、２９３Ｔ細胞にリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）をトランスフェクトすることにより２９３Ｔ細胞で産生される。トランスフェクションの前日に５×１０^６個の２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞株、Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号６３２１８０）をＰ１０ペトリ皿にプレーティングする。細胞コンフルエンシーは約７０％でなければならない。１つのコンストラクトにつき１つのプレートをトランスフェクトする。２０μｌ（１０μｇ）ｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）プラスミドミックス＋２μｇレンチコンストラクト＋２０μｌ Ｐｌｕｓ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１５１４－０１５）を４００μｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ中に合わせ、室温で１５分間インキュベートする。３０μｌのＬＦ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８－０１９）を４００μｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ中に希釈し、ＤＮＡ混合物に滴下して加え、室温で１５分間インキュベートする。ＤＮＡ混合物を細胞に加える（細胞は９ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ中にある）。細胞を６時間インキュベートし、次に培地をＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに交換する。トランスフェクション後４８時間に１，５００ｒｐｍで５分間遠心してウイルス上清を回収する。この上清を回収し、１ｍｌアリコートとして－８０℃で凍結する。

【1173】

本明細書に記載される培養プロセスの３～７日目に標的細胞を形質導入する。５×１０^５個の培養細胞を２４ウェルプレート中の２０μｇ／ｍＬポリブレンを含有する５００μＬの培地にプレーティングする。細胞は各ウイルスにつきトリプリケートのウェルで形質導入する。ウイルス上清を別の５００μＬの培地に加え、ピペッティングによって試料を混合する。感染は、プレートを室温、２０００ｒｐｍで９０分間スピンする遠心接種によって達成する。遠心接種後、細胞を３７℃で一晩インキュベートし、翌日、適切なサイトカインを含有する１ｍＬの新鮮ＩＭＤＭ培地を加える。

【1174】

３．核酸－カチオン性ポリマー
目的のトランス遺伝子をコードする、且つ上流プロモーター配列及び下流ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、複数の商業的供給業者（例えば、ＩＤＴ－ＤＮＡ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）から購入することができる。ＲＮＡトランスフェクションは、ＲＮＡＩＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）又はＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡ（Ｍｉｍｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）カチオン性脂質送達媒体を使用して行う。ＲＮＡ及び試薬は、初めにＯｐｔｉ－ＭＥＭ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）に希釈する。１００ｎｇ／ｕＬ ＲＮＡを５倍希釈し、ＲＮＡ１μｇ当たり５μＬのＲＮＡＩＭａｘを１０倍希釈する。希釈した構成成分をプールし、室温で１５分間インキュベートした後、それらを培養培地に分注する。ＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクションについては、１００ｎｇ／ｕＬ ＲＮＡをＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に１０倍希釈し、ブースト試薬を（ＲＮＡ１μｇ当たり２μＬの濃度で）加え、ＴＲＡＮＳＩＴ－ｍＲＮＡを（ＲＮＡ１μｇ当たり２μＬの濃度で）加え、次に、室温で２分間インキュベートした後、このＲＮＡ－脂質複合体を培養培地に供給する。ＲＮＡトランスフェクションは、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ異物不含ｈＥＳ培地（ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）又は２％ＦＢＳ含有Ｏｐｔｉ－ＭＥＭで実施する。宿主細胞へのｍＲＮＡ転写物の導入の成功は、蛍光標識又はレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など、様々な公知の方法を用いてモニタすることができる。修飾ｍＲＮＡのトランスフェクションの成功はまた、標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを例えばウエスタンブロッティング又は免疫細胞化学で計測することによっても判断し得る。同様のＲＮＡ－脂質複合体比に従うマルチリットル（５～１０，０００Ｌ）培養フォーマットへの大容積スケールアップについても、同様の方法に従い得る。

【1175】

４．核酸－電気穿孔
目的のトランス遺伝子をコードする、且つ上流プロモーター配列及び下流ポリＡテールを含むｍＲＮＡは、複数の商業的供給業者（例えば、ＩＤＴ－ＤＮＡ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ ＩＡ）から購入することができる。赤血球系統細胞をｍＲＮＡ転写物でトランスフェクトし、及び外因性転写物を特異的に検出するように設計されたプライマーによる定量的ＲＴ－ＰＣＲによってトランスフェクション効率を計測することにより、電気穿孔パラメータを最適化する。ある種の細胞の調製には、２ｍｍ間隙の標準電気穿孔キュベット内において５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）中に懸濁した２．５×１０^６細胞に１５０ｕＦキャパシタンスを放電することが、検量線法を用いて判断するとき、高い生存能（＞７０％）を維持しながら１細胞当たり１０，０００コピーを上回る修飾ｍＲＮＡ転写物を繰り返し送達するのに十分である。細胞密度は１×１０^６細胞／５０μｌ～２．５×１０^６細胞／５００の密度で様々であり、１細胞当たりの転写物コピー数で計測して同程度の効率で細胞をトランスフェクトするためには１１０Ｖ～１４５Ｖが必要である。上述の制約を伴い記載される方法と同様の大容積流動電気穿孔戦略と同様に、大量マルチリットル（５～１０，０００Ｌ）電気穿孔を実施し得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【1176】

５．ポリペプチド－リポソーム
細胞は、初代最終分化細胞、例えば赤血球を含め、その表面上及びその細胞質に外因性タンパク質を負荷することができる。タンパク質の負荷はリポソームを使用して実施することができる。

【1177】

有機溶媒中の脂質（Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ）をガラスシンチレーションバイアルにおいて窒素下で乾燥させて薄膜にした。１０^５細胞につき約２ｕＬの脂質を使用した。ポリクローナルマウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ－６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造者の指示に従い標識した。この乾燥脂質混合物にＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を加えた。この溶液を数回ピペッティングし、室温で５分間インキュベートし、次に激しくボルテックスして封入リポソームを作成した。無血清培地を加えて総容積を１０^５細胞当たり５００ｕＬにした。次にこのリポソーム混合物を細胞と共に３７℃で３～４時間インキュベートした。

【1178】

図１は、リポソームによる初代赤血球への外因性タンパク質、この場合には蛍光標識ＩｇＧの負荷を示す。負荷はフローサイトメトリーによって計測される。リポソームがない場合には細胞の０．０６％が蛍光であり、低リポソーム用量では細胞の約６０％が蛍光であり、及び高リポソーム用量では細胞の約８５％が蛍光であるとおり、負荷は用量依存性である。図１のデータは、リポソームで外因性タンパク質を赤血球系細胞に負荷し得ることの強力な証拠である。

【1179】

６．ポリペプチド－機械的破壊
細胞は、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ幅のチャネルを含むマイクロ流体装置を使用して負荷してもよく、チャネルが細胞を一過性に穿孔して、細胞がそのシステムに押し通されるときにペイロードが侵入することを可能にする。

【1180】

マサチューセッツ工科大学（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の微細加工施設において、フォトリソグラフィ及び深堀り反応性イオンエッチング技法を用いてシリコンベースの装置を作製する。このプロセスでは、４５０μｍ厚の６インチシリコンウエハをヘキサメチルジシラザンで処理し、フォトレジスト（ＯＣＧ９３４；ＦｕｊｉＦｉｌｍ）によって３，０００ｒｐｍで６０秒間スピンコーティングし、狭窄チャネル設計を有するクロムマスクを通じて紫外光（ＥＶ１；ＥＶＧ）に露光し、及びＡＺ４０５（ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）溶液で１００秒間現像する。９０℃で２０分間焼成した後、ウエハを深堀り反応性イオンエッチング（ＳＰＴＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって所望の深さ（典型的には１５μｍ）にエッチングする。このプロセスをウエハの反対側（即ち、エッチングされたチャネルを有しない側）で別のマスク（これはアクセスホールパターンを含む）を使用して、且つより厚いフォトレジストＡＺ９２６０（ＡＺ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を使用して繰り返す。次に湿式酸化を用いて１００～２００ｎｍの酸化ケイ素を成長させた後、そのウエハをＰｙｒｅｘウエハに陽極接合し、個々の装置にダイスカットする。各実験前に装置は目視検査し、入口及び出口リザーバを備えるホルダに取り付ける（全てインハウスで設計され、Ｆｉｒｓｔｃｕｔによって製造される）。これらのリザーバはブナＮＯリング（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ）を使用して装置と接合し、適切な封止を設ける。材料を装置に押し通すのに必要な推進力が提供されるように、入口リザーバはＴｅｆｌｏｎチュービングを用いて自家製圧力調整システムに接続する。初めに赤血球系細胞の集団を所望の送達緩衝液［成長培地、ＰＢＳ、又は３％ＦＢＳ及び１％Ｆ－６８ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＰＢＳ］に懸濁し、所望の送達材料と混合して、装置の入口リザーバに置く。このリザーバは、調整器によって制御される圧縮空気ラインに接続し、選択圧力（０～７０ｐｓｉ）を用いて装置中に流体が押し進められる。次に処理された細胞を出口リザーバから回収する。細胞は処理後に送達溶液中室温で５～２０分間インキュベートして孔を確実に塞いだ後、任意のさらなる処理に供する。蛍光標識フェニルアラニンアンモニアヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を送達するため、送達緩衝液が０．１～０．３ｍｇ／ｍＬのＰＡＨを含有したように上記に記載したとおり実験を行う。ＧＦＰノックダウンは、未処理対照と比べた細胞集団の平均蛍光強度の低下パーセンテージとして計測する。

【1181】

７．ポリペプチド－表面コンジュゲーション
細胞表面をトラウト試薬（２－イミノチオランＨＣｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）で処理して第一級アミンをチオール化する。ＥＤＴＡ含有トリス緩衝液ｐＨ８にトラウト試薬を溶解し、スルフヒドリルの酸化を防止する。約１ｐｍｏｌのトラウト試薬を使用して１０^６細胞を処理する。トラウト試薬を細胞と共に室温で１時間インキュベートする。過剰の又は未反応の試薬を遠心によって除去して細胞を洗浄する。利用可能なスルフヒドリル基の数は、エルマン試薬を使用して計測することができる。その一方で、好適なレシーバーポリペプチドをＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）などのアミン－スルフヒドリルクロスリンカーで製造者の指示に従い処理する。過剰の架橋結合試薬を脱塩によって除去する。次にマレイミド官能化タンパク質をチオール化した細胞と共に数時間インキュベートする。コンジュゲート細胞から遠心及び洗浄によって未反応のタンパク質を分離する。

【1182】

８．ポリペプチド－非共有結合性表面付加
哺乳類発現ベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）において、Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体ｓｃＦｖの遺伝子（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）を６－ヒスチジンアフィニティータグと、マウスグリコホリンＡに結合するポリペプチド配列、ＨＷＭＶＬＰＷＬＰＧＴＬＤＧＧＳＧＣＲＧをコードする遺伝子とに融合する。標準方法を使用したＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって完全融合タンパク質を作製し、製造者の指示に従いＮｉ－ＮＴＡアフィニティー樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）で精製する。精製した融合タンパク質を１００ｎＭ超の濃度のマウス赤血球と共にインキュベートし、迅速な平衡化及びペプチドとグリコホリンＡの結合を可能にする。

【1183】

９．ポリペプチド－膜への脂質挿入
製造者のプロトコルに従いトラウト試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してアミン含有の好適なレシーバーポリペプチド分子にスルフヒドリル基を作成する。反応混合物を振盪機において室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、製造者の指示に従いスピン脱塩カラム（Ｚｅｂａ、ＭＷＣＯ ７Ｋ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通して洗浄して未反応のトラウト試薬を除去する。修飾ポリペプチドへのスルフヒドリル基の作成は、製造者のプロトコルに基づきエルマン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量化する。

【1184】

脱塩したポリペプチド溶液にＤＳＰＥ－ＰＥＧ_３４００－ｍａｌ（ＰＢＳ、４μＬ中１×１０^－３Ｍ、脂質：ポリペプチドモル比＝１：１）（全ての脂質はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入し、アルゴン下－２０℃でクロロホルム溶液として保存する）を加え、振盪機においてＲＴでインキュベートする。１時間後、遠心ろ過装置（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．）を使用して試料溶液を４℃、１４ ０００ｇで１５分間ろ過することにより小分子を除去し、６００μＬ ＰＢＳ（１ｍｇ／ｍＬポリペプチド）に懸濁する。

【1185】

２００μＬの全血を１０００μＬ ＰＢＳ中に懸濁して１５００ｇで３０秒間スピンし、これを４回繰り返す。最後に、ＲＢＣを８００μＬ ＰＢＳ中に懸濁する。ＲＢＣ／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ポリペプチドのコンジュゲーションは、上記のＲＢＣ懸濁液及び様々な量のＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ポリペプチド溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を混合した後、続いて３７℃で１５～３０分間インキュベートすることにより調製する。混合物を室温に５分間置いておき、次にＰＢＳで３回洗浄し、５×１０^８個／ｍＬの最終ＲＢＣ濃度となるように再懸濁する。自動細胞計数器（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞濃度を計測する。

【1186】

１０．ポリペプチド－低張負荷
好適なレシーバーポリペプチド、この場合マウスＩｇＧをＡｂｃａｍから購入し、７０％のヘマトクリット（Ｈｃｔ）の等張液中のＲＢＣ懸濁液に０．２５ｍｇ／ｍＬで加えた。この懸濁液を１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、及び２０ｍＭグルコースを含有する２５０ｍＬの低張液に透析し、４℃、１５ｒｐｍで１時間撹拌した。次に、５ｍＭアデニン、１００ｍＭイノシン、１００ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭグルコース、１２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の１／１０容積の再密閉溶液を加えることにより、細胞を等張的に再密閉した。次に細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。

【1187】

１１．ポリペプチド－細胞透過性ペプチド
プロタミンコンジュゲートポリペプチドの製造は当該技術分野において公知である。例えば、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ １３９（３）：１８２を参照されたい。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中５ｍｇ／ｍｌの低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）をヘテロ二官能性架橋剤３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＳＰＤＰ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と１：１０モル比でＤＭＳＯ中に混合し、室温で１時間振盪する。次にこの反応混合物を５０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、チオール化したＬＭＷＰをヘパリンアフィニティーカラムでのＨＰＬＣによって精製する。生成物を限外ろ過によって回収し、凍結乾燥し、後に使用するまで－２０℃で保存する。

【1188】

コンジュゲーションのため、５ｍｇ／ｍｌの好適なレシーバーポリペプチドをリン酸緩衝液中のＳＰＤＰ（１ｍｌタンパク質溶液に対してエタノール中４０μｌの０．１Ｍ ＳＰＤＰ）と混合し、室温で１時間撹拌する。急速な脱塩及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でのＦＰＬＣによる緩衝液交換によって未反応ＳＰＤＰを除去する。次に活性化ポリペプチドを１０倍モル過剰の上記で調製したＬＭＷＰ－ＳＨと４℃で２４時間コンジュゲートする。ヘパリンアフィニティーカラムを使用したイオン交換クロマトグラフィーと、続く５ラウンドの遠心ろ過（分子量カットオフ：５，０００Ｄａ）によってＬＭＷＰ－ポリペプチドコンジュゲートを単離する。プールされたＬＭＷＰ－ポリペプチドコンジュゲートを濃縮し、コンジュゲーションの程度をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって決定する。

【1189】

取込み実験のため、新鮮ヒツジ赤血球（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に５×１０^８細胞／ｍｌの密度で懸濁し、次にＬＭＷＰ－ポリペプチドコンジュゲートの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液と共に穏やかに撹拌しながら室温で３０分間インキュベートする。次にＲＢＣをＨＢＳＳで洗浄し、２～８℃で保存する。

【1190】

１２．ポリペプチド－化学的透過性
３×１０^８個のＲＢＣをリンゲル溶液中２００μＭのクロルプロマジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３０分間プレインキュベートした。その後、好適なレシーバーポリペプチドをリンゲル溶液に（１～４μＭ）最終容積が４００μｌとなるように加え、穏やかな撹拌下、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、リンゲルに再懸濁し、分析用に回収した。

【1191】

１３．ポリペプチド－酵素的コンジュゲーション
ソルターゼによる酵素的細胞表面コンジュゲーションは当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ ＰＮＡＳ ２０１４ １１１（２８）：１０１３１を参照されたい。ＧＰＡ Ｎ末端をポリペプチドで標識するため、３０ｕＬの５００ｕＭ黄色ブドウ球菌（Ｓ ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼ及びＣ末端にＬＰＥＴＧＧを有する１ｍＭポリペプチドを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中、氷上で１５分間プレインキュベートし、ＤＭＥＭ中５×１０^７個のＲＢＣに加える。このソルターゼと細胞との混合物を時折穏やかに混合しながら氷上で３０分間インキュベートし、次に４℃、５００×ｇで２分間スピンして緩衝液／ＤＭＥＭを除去し、次に１ｍＬの氷冷ＰＢＳで３回洗浄する。

【1192】

１４．気体
以下のステップは、赤血球系細胞に一酸化窒素（ＮＯ）を負荷するために行う。Ｓ－ニトロシステイン（ＣＳＮＯ）によるＨｂ以外の赤血球タンパク質の酸化副反応又はＳ－ニトロシル化を回避するため、（ｉ）完全に脱酸素化されたＲＢＣにＮＯ水溶液を加えることによるＦｅ－ニトロシルＨｂ［ＨｂＦｅ（ＩＩ）ＮＯ］の生成；（ｉｉ）嫌気的条件下での洗浄；及び（ｉｉｉ）再酸素化によって、インタクトなＲＢＣにＳ－ニトロソチオール（ＳＮＯ）Ｈｂを合成し、ヘム［Ｆｅ（ＩＩ）ＮＯ］からＣｙｓ－Ｂ９３へのＮＯの赤血球内分子内移動を生じさせる。１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＨｇＣｌ２含有及び／又は不含で０．４ＭＨＣｌ中にスルファニルアミド［ＳＡ；３．４％（ｗｔ＿ｖｏｌ）］を調製し、０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮ－（１－ナフチル）エチレンジアミン（ＮＥＤ）も調製する。ＨｇＣｌ２含有又は不含のＳＡに等容積のＳＮＯＨｂを加え、次にＮＥＤと反応させる。比色定量法を用いて吸光度（５４０ｎｍ）の差から［ＳＮＯ］を決定する。

【1193】

１５．小分子（細胞質）
リポソームＰｒｏＪｅｃｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）をガラスシンチレーションバイアルにおいて窒素下で乾燥させて薄膜にする。１０^５細胞につき約２ｕＬ試薬が必要である。この乾燥リポソーム試薬にＰＢＳ中の目的の小分子の溶液を加える。この溶液を数回ピペッティングし、室温で５分間インキュベートし、次に激しくボルテックスして封入リポソームを作成する。無血清培地を加えて総容積を１０^５細胞当たり５００ｕＬにする。このリポソーム混合物を細胞と共に３７℃で３～４時間インキュベートする。

【1194】

１６．小分子（表面）
化学官能基を使用した細胞の表面に対する小分子のコンジュゲーションは当該技術分野において周知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ＧＴ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２^ｎｄ Ｅｄ，ＩＳＢＮ ９７８－０１２３７０５０１３を参照されたい。簡潔に言えば、目的の小分子にＮＨＳエステル、例えばＮＨＳエステルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）などのアミン反応性官能基を提供する。目的の小分子は有機溶媒中に保存して、ＮＨＳエステル官能基の加水分解を防止する。目的の小分子を大モル過剰（１０^６細胞に少なくとも１０ｐｍｏｌ）で水性媒体中の細胞とインキュベートして、細胞表面上の第一級アミンとのコンジュゲーションを促進する。１時間インキュベートした後、過剰の未反応分子を細胞の遠心及び洗浄によって除去する。

【1195】

実施例８：ポリペプチドの存在の評価
１．蛍光トランス遺伝子
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端上のＨＡタグがウイルス性Ｔ２Ａペプチドの介在を伴いＧＦＰに融合したグリコホリンＡをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びフローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。形質導入効率は、集団中におけるＧＦＰ陽性細胞の割合として評価した。

【1196】

２．細胞表面タンパク質
細胞表面タンパク質について、タンパク質発現レベルは、タンパク質又は共発現するエピトープタグに特異的な抗体によるフローサイトメトリーによって、早くもトランスフェクションの２日後には検出することができる。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｎ末端にＨＡタグを有するグリコホリンＡをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びマウス抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）の１：５０希釈物で１時間染色した。細胞を洗浄し、次にａｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗マウス二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１００希釈物によって氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。形質導入効率は、集団中におけるａｌｅｘａ ４８８陽性細胞の割合として評価した。

【1197】

３．細胞内タンパク質
細胞内タンパク質について、タンパク質発現レベルは、ウエスタンブロットによって早くもトランスフェクションの８～１２時間後には検出することができる。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中で溶解させた。細胞溶解物を１００ｍＭ ＤＴＴ中で煮沸することにより変性させ、次にＮｕＰａｇｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥプレキャストゲル上にロードした。電気泳動及びニトロセルロース膜への転写後、マウス抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）の１：５０００希釈物、続いてヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）の１：５０００希釈物で染色することによりタンパク質バンドを発色させ、続いてＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）で処理した。Ａｍｅｒｓｈａｍイメージャ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して画像を取得した。

【1198】

実施例９：小分子の存在の評価
正常ヒトドナー由来の赤血球を購入した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）。次に細胞を、０．０２倍容積の２ｍＭストックビオチン試薬を使用して製造者の指示に従いＮＨＳ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ）によって室温で３０分間ビオチン化した。抗ビオチン抗体（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）で蛍光標識した。標識抗ビオチン抗体を検出マーカーとして使用して、細胞の標識効率を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価した。

【1199】

実施例１０：ガスレベルの評価
標準プロトコルを使用して３種の血液成分のＮＯ２レベル及びＮＯ３レベルを決定する。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ ３７（１）：１を参照されたい。簡潔に言えば、血液に「停止液」（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｎ－エチルマレイミド、水、ＮＰ４０）を加えて試料分析時まで亜硝酸塩レベルを維持する。「停止液」と血液との１：４希釈物をボルテックスし、ドライアイス上に置く。試料分析時、９９．９％純メタノール及び解凍した試料の１：１希釈物を１３，０００ｒｐｍで２分間遠心する；直ちに、キャリアガスとしてヘリウムを使用する化学発光一酸化窒素分析計（ＮＯＡ、Ｓｉｅｖｅｒｓ、モデル２８０ ＮＯ分析計、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）に上清を入れる。三ヨウ化物（Ｉ３－）オゾンベースの化学発光アッセイを用いて亜硝酸塩レベルを分析する。硝酸塩を分析するには、血液に脱イオン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣＱ－Ｇａｒｄ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を加えて細胞を溶解させる。脱イオン水と血液との９：１希釈物をボルテックスし、ドライアイス上に置く。試料分析時、純ＨＰＬＣグレードエタノール及び解凍した試料の３：１希釈物を遠心し、直ちに塩化バナジウム（ＩＩＩ）化学発光アッセイを用いて上清を分析する。例えば、Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｊａｎｅｒｏ，１９９８ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２５（４－５）：６２１を参照されたい。ヘリウムをキャリアガスとしてＶＣｌ３反応液を９０℃に維持する。１μＭ亜硝酸塩及び硝酸塩溶液を使用して、試料の亜硝酸塩及び硝酸塩濃度の比較及び調整用の検量線を作成する。

【1200】

血液にチオール安定化溶液（ＮＥＭ－ＤＰＴＡ；Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｎ－エチルマレイミド、ジエチレントリアミン五酢酸、ＮＰ４０、水）を加えてさらなるチオール反応を阻害することにより、ＳＮＯＨｂ及びＨｂＮＯレベルを維持する。ＮＥＭ－ＤＰＴＡと血液との４：１希釈物をボルテックスし、ドライアイス上に置く。試料及び５％酸性スルファニルアミド（ＡＳ）の９：１希釈物を５分間インキュベートする；半分はＮＯＡ（Ｉ３－アッセイ）に投入してＳＮＯＨｂ及びＨｂＮＯの合計レベルを得る。残りの試料は５０ｍＭ ＨｇＣｌ２とインキュベートし、次に再び５％ＡＳとインキュベートし、ＮＯＡに投入してＨｂＮＯレベルを得る。

【1201】

実施例１１：発現及び活性の評価
培養細胞内及びその上での外因性タンパク質の発現は、フローサイトメトリーによるか（タンパク質が表面上で発現する場合）又はウエスタンブロットによって（細胞質内で発現するタンパク質用）、定量的に評価することができる。

【1202】

１．定量的フローサイトメトリー
抗マウスＦｃ結合定量的フローサイトメトリービーズ（Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）はＢａｎｇｓ Ｌａｂｓから購入した。関連性のある細胞表面受容体－グリコホリンＡ、Ｃｋｉｔ、及びトランスフェリン受容体－に対する蛍光標識マウス抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。ＨＡエピトープタグに対する蛍光標識マウス抗体はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｎ末端にＨＡタグを有するグリコホリンＡをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の少なくとも２日後、２×１０^５細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及び上記に挙げた抗体のうちの１つの１：１００希釈物で１時間染色した。細胞を洗浄し、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。上記に挙げる４つの抗体の各々について、このプロトコルを繰り返した。製造者の指示に従い定量化を実施した。簡潔に言えば、５つのビーズ試料の各々の一滴を、上記に挙げた抗体の１：１００希釈物とインキュベートした。ビーズを１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、及びフローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。上記に挙げる４つの抗体の各々について、このプロトコルを繰り返した。製造者提供のｅｘｃｅｌスプレッドシートを使用して検量線をフィットし、そこから細胞ベースシグナルの蛍光強度の定量化を導出した。

【1203】

２．定量的ウエスタンブロット
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解させた。

【1204】

リポフェクタミン２０００（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランス遺伝子を導入した。細胞を１週間培養し、上清を回収した。組換えタンパク質をＨＡアフィニティーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で製造者の指示に従い精製した。２８０ｎｍの吸光度によってタンパク質濃度を評価した。

【1205】

本明細書に記載されるとおりウエスタンブロッティングを実施した。細胞溶解物試料に加え、同じゲル上で既知量の組換えアデノシンデアミナーゼのランを行った。画像収集後、組換えバンドの強度を使用して検量線を作成し、細胞試料中に存在するタンパク質の量を定量化した。

【1206】

トランス遺伝子の高レベルでのロバストな発現は、最終的な細胞集団の治療能力にとって重要な意味を有する。図２は、分化の指標となる３つの表面タンパク質及び１つの外因性トランス遺伝子の発現を定量的フローサイトメトリーによって定量化し、トランス遺伝子が高レベルでロバストに発現することを実証する。

【1207】

培養下の赤血球系細胞を四段階インビトロ分化プロセスの間に７時点で採取した。最初の時点（「拡大 Ｄ６」）で細胞は有核造血前駆体である。最後の時点（「分化３ Ｄ８」）までに細胞は主として除核赤血球系細胞になる。赤血球系細胞の標準マーカーであるＧＰＡ（塗り潰した三角形）は、前駆細胞では低値で始まり、急激に１細胞当たり＞１×１０^６コピーに達する。幹細胞因子の受容体であるＣＫＩＴ（破線上の四角形）は高値で始まり、次に分化が続いて起こるに従い１細胞当たり＜１×１０^４コピーに下がる。赤血球系細胞への鉄の輸送に必要なＴＲ（点線上の菱形）は、最初は増加し、次に１細胞当たり＜１×１０^５コピーまで徐々に低下する。第２の分化段階（「分化１」）の終わりにトランス遺伝子（白色の丸）が導入され、これは分化全体を通して１細胞当たり約１×１０^５コピーで一定に発現する。上記のデータは、培養細胞でトランス遺伝子がロバストに発現することを実証している。

【1208】

培養細胞内及びその上での外因性タンパク質の発現は、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによるか（タンパク質が表面上で発現する場合）又は本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって（細胞質内で発現するタンパク質用）、評価することができる。下流蛍光レポータータンパク質を含む単一の転写物コンストラクト内に外因性遺伝子がある例では、レポータータンパク質の蛍光を上流遺伝子の発現の代用として使用し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価することができる。

【1209】

図３Ａ～図３Ｓは、除核培養赤血球系細胞における表面タンパク質及び細胞質タンパク質の外因性発現を示す。上記のデータは、複数のタンパク質クラスが（過剰発現し、及びデノボ発現する、Ｉ型膜タンパク質との細胞質の、表面の、インタクトな融合物、ＩＩ型膜タンパク質との融合物、ＧＰＩ結合型膜タンパク質との融合物、細胞内融合物を含めて）、培養除核赤血球系細胞、培養有核赤血球系前駆細胞、及びＫ５６２赤白血病細胞を含む複数の細胞型で発現し得ることを決定的に実証している。

【1210】

図３Ｂ及び図３Ｆは、除核培養細胞における２つの外因性タンパク質の同時発現を実証する。

【1211】

図３Ｂでは、本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、ＨＡエピトープタグ、グリコホリンＡコード配列、ウイルスＴ２Ａ切断可能配列及びＧＦＰをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。両方のトランス遺伝子の発現を検出するため蛍光抗ＨＡ抗体及びＧＦＰ蛍光を使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって細胞を分析した。

【1212】

図３Ｆでは、本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、グリコホリンＡコード配列、ウイルスＴ２Ａ切断可能配列及びＧＦＰをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。両方のトランス遺伝子の発現を検出するため蛍光抗ＨＡ抗体及びＧＦＰ蛍光を使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって細胞を分析した。

【1213】

実施例１２：血小板におけるｍＲＮＡからのタンパク質の発現
外因性トランスフェクトｍＲＮＡから翻訳される外因性タンパク質の血小板における発現を、フローサイトメトリーによって計測した。端的には、多血小板血清を１９０ｇで１５分間遠心して赤血球及び白血球を除去した。次に上清を２５００ｇでさらに５分間スピンして血小板をペレット化した。血小板を５ｍＬの１ｕＭプロスタグランジン含有タイロード緩衝液に再懸濁し、洗浄し、７５０ｕＬの１ｕＭプロスタグランジン含有タイロード緩衝液に再懸濁した。目的の遺伝子、この例ではＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、リポフェクタミンと１：１ｍｇ／ｍＬ比で混合した。この混合物を５分間インキュベートし、次に洗浄した血小板集団に加えた。この混合物をゆっくりと揺らしながら室温で２４時間インキュベートした。トランス遺伝子の血小板発現を、フローサイトメトリーによってＧＦＰ蛍光を計測してアッセイした。表面タンパク質もまたフローサイトメトリーによってアッセイすることができる。細胞質タンパク質又は他の細胞内発現したタンパク質はまた、ウエスタンブロットによってもアッセイすることができる。

【1214】

外因性タンパク質を血小板の中及びその上に導入することには、治療上意味がある。血小板は核又はＲＮＡ転写機構を有しないため、ＤＮＡトランスフェクションは、血小板に外因性タンパク質発現を導入する実行可能な手段ではない。しかしながら、ｍＲＮＡトランスフェクション及び翻訳は、外因性タンパク質を細胞に導入する一方法である。血小板はｍＲＮＡ翻訳機構を含むと考えられているが、しかしこれまで、血小板が外因性ｍＲＮＡを受け入れてタンパク質に翻訳することが可能かどうかは分からなかった。

【1215】

図４は、トランス遺伝子、この場合ＧＦＰをコードする外因性ｍＲＮＡの、血小板による翻訳を実証する一連のフローサイトメトリープロットである。ＧＦＰは、４８８ｎｍレーザーで励起した後のＦＬ１チャネル内の蛍光によって検出される。（４Ａ）非トランスフェクト血小板（１．７％ＧＦＰ＋）。（４Ｂ）３ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板（８．６％ＧＦＰ＋）。（４Ｃ）６．８ｕｇ ＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした血小板（３．３％ＧＦＰ＋）。

【1216】

これらのデータは、初めて、血小板により外因性ｍＲＮＡが外因性タンパク質に翻訳されることを決定的に実証している。

【1217】

実施例１３：酵素の活性
図５は、赤血球系細胞に含まれる酵素の活性を実証する。分化の過程にわたるタンパク質の保持について、細胞質酵素の生化学的活性をウエスタンブロットによって評価した。細胞質酵素の生物学的活性はインビトロ酵素活性アッセイによって評価した。

【1218】

図５は、培養赤血球系細胞で発現する２つの異なる細胞内酵素の活性を示す。

【1219】

１．アデノシンデアミナーゼ
Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりリポフェクタミントランスフェクション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に導入した。酵素活性は、Ｈｅｌｅｎｉｕｓ ２０１２，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８２３（１０）：１９６７に基づくプロトコルを用いてアッセイされ、このプロトコルでは、特定の酵素混合物がプリンを尿酸及びＨ２Ｏ２に変換した後、続いて生成されたＨ２Ｏ２を蛍光定量的に検出する。端的には、トランスフェクションの２日後、細胞を回収し、培地を吸引し、細胞にクレブス・リンゲルリン酸グルコース（ＫＲＰＧ；含有物：１４５ｍＭ ＮａＣｌ、５．７ｍＭリン酸ナトリウム、４．８６ｍＭ ＫＣｌ、０．５４ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２２ｍＭ ＭｇＳＯ４、及び５．５ｍＭグルコース；ｐＨ７．３５）を２×１０^５細胞／ｍＬで加えた。アデノシンを５０ｕＭで加えた。６時間反応させた後、上清を回収し、６０℃で５分間熱失活させた。上清のアリコートを、０．２５Ｕ／ｍｌ細菌性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）及び０．１５Ｕ／ｍｌ微生物性キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）（いずれもＳｉｇｍａから）が入った白色９６ウェルマイクロプレートのウェルに移した。室温で２０分間インキュベートした後、マイクロウェルにＨＲＰ（最終濃度１Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）及びＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ試薬（６０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含有する３０μｌのＨ２Ｏ２検出混合物を加え、続いてそれぞれ５４５及び５９０ｎｍの発光波長及び励起波長で蛍光強度を計測した（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）。

【1220】

２．フェニルアラニンヒドロキシラーゼ
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。Ｃ末端にＨＡタグを有するフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。形質導入の２日後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、及びＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解させた。細胞溶解物（６４ｕｇ総タンパク質）を、１００ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４ｍＭ ＤＴＴ、４ｍＭフェニルアラニン、３３μｇカタラーゼ、及び０．４ｍＭ ＤＭＰＨ４（全てＳｉｇｍａ）を含有する１ｍＬ反応緩衝液に加えた。反応を３７℃で一晩実行した。インキュベーション後、試料をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心フィルタ１０ＫＤ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＦＣ８０１０２４）において３７００ｒｐｍで１０分間スピンさせて遠心ろ過することにより脱タンパク質化した。試料を回収し、チロシン濃度に関して５４０ｎｍの吸光度によってアッセイした。

【1221】

これらの外因性タンパク質は両方とも最終分化の終わりまで保持されたが、当該技術分野では、赤血球系細胞が基本機能に不要なタンパク質の厳しい除去プログラムを受けることが周知である点を考えれば、これは軽視できない成果である（Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１０）：２０２１－２０２７，Ｌｏｄｉｓｈ ＨＦ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７（１）：５９）。図５Ａにおいては、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたる種々の時点で、外因的に過剰発現したタンパク質アデノシンデアミナーゼが抗ＨＡウエスタンブロットによって検出される。図５Ｃにおいては、有核前駆細胞（「分化Ｉ Ｄ５」）から除核赤血球系細胞（「分化ＩＩＩ Ｄ８」）に至るまでの分化の過程にわたる種々の時点で、外因的に発現した微生物タンパク質フェニルアラニンヒドロキシラーゼが抗ＨＡウエスタンブロットによって検出される。

【1222】

加えて、これらの酵素はいずれも、基質を産物に酵素的に変換するそれらの能力を維持した。図５Ｂは、インタクトなアデノシンデアミナーゼ発現２９３Ｔ細胞によるアデノシンからイノシンへの酵素変換を示す。図５Ｄは、培養フェニルアラニンヒドロキシラーゼ発現除核赤血球系細胞のライセートによるフェニルアラニンからチロシンへの酵素変換を示す。

【1223】

これらのデータは、培養プロセス全体を通して赤血球系細胞で外因性酵素が保持されること、及びそれらの外因性酵素が赤血球系細胞において酵素的に活性であることを決定的に実証しており、これは治療上、深い意味を有する。

【1224】

実施例１４：ＣＲ１の活性
図６は、培養赤血球系細胞の表面上で過剰発現した補体受容体１（ＣＲ１）の生化学的活性及び生物学的活性の両方を示す。ＣＲ１の生化学的活性は、免疫複合体との結合に関してフローサイトメトリーによって評価した。ＣＲ１の生物学的活性は、共培養アッセイにおけるマクロファージへの免疫複合体のトランスファーによって評価した。

【1225】

１．ＣＲ１発現細胞の免疫複合体結合
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。補体受容体１（ＣＲ１）をコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。トランス遺伝子発現レベルは、抗ＣＲ１抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。

【1226】

Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－６５０）を、抗体過剰のポリクローナルウサギ抗ＢＳＡ（Ａｂｃａｍ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次にこの複合体をヒト血清と１：１容積比で３７℃で３０分間混合した。対照複合体は、ヒト血清と混合しないか、又は熱失活したヒト血清と混合するかのいずれかであった。

【1227】

複合体をＣＲ１発現細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することにより免疫複合体の捕捉に関して分析した。

【1228】

２．マクロファージへの免疫複合体トランスファー
１００ｎＭホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）と共に３７℃で２４時間インキュベートすることにより、培養Ｕ９３７単球を活性化した。免疫複合体で被覆された細胞（上記参照）を活性化Ｕ９３７マクロファージと共に３７℃で３０分間インキュベートした。この共培養物をフローサイトメトリーによって分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングによってマクロファージを同定した。マクロファージ集団のＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することにより、マクロファージにおける免疫複合体の存在を分析した。

【1229】

図６は、培養赤血球系細胞で外因的に過剰発現する補体受容体１（ＣＲ１）の生化学的活性及び生物学的活性を示す。

【1230】

図６Ａは、インビトロでの免疫複合体の捕捉として定義されるＣＲ１の生化学的活性を示す。黒色のヒストグラムは、培養赤血球系細胞で過剰発現したＣＲ１によるＢＳＡベースの免疫複合体の捕捉を示す。網掛けのヒストグラムは、ヒト補体を欠くＢＳＡ及びＩｇＧの複合体との最小バックグラウンド結合を示し、結合イベントがＣＲ１媒介性であることを実証している。

【1231】

図６Ｂは、培養赤血球系細胞からマクロファージへの捕捉された免疫複合体のトランスファーとして定義されるＣＲ１の生物学的活性を示す。これは、当該技術分野における標準アッセイであり、以下を参照されたい：Ｒｅｐｉｋ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：２３０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７８（７）：３１２９。トランスファーはフローサイトメトリーによって評価され、マクロファージにおける標識された免疫複合体から生じる蛍光の強度として計測される。このアッセイでは、免疫複合体無しにインキュベートされるマクロファージ（黒色のバー）は蛍光にならない。補体を欠く（従ってＣＲ１に結合しない）ＢＳＡ及びＩｇＧの複合体と共にインキュベートするマクロファージは、培養ＣＲ１過剰発現赤血球系細胞の存在とは無関係に、少量の免疫複合体のみを取り込む（塗り潰した灰色のバー）。この取込みは、Ｕ９３７細胞のＦｃ－γ受容体がＩｇＧ分子のＦｃ領域と相互作用することに起因する可能性が高い。ＣＲ１過剰発現細胞の非存在下で免疫複合体（ＢＳＡ＋ＩｇＧ＋補体）と共にインキュベートされるマクロファージは（網掛けのバー、左）、恐らくは同じＦｃ－γの媒介による方法によって補体の非存在下と同じ量の免疫複合体を取り込む。しかしながら、ＣＲ１過剰発現細胞の存在下で免疫複合体と共にインキュベートされるマクロファージ（網掛けのバー、右）は、蛍光によって計測するとき略２倍の数の免疫複合体を取り込む。

【1232】

これらのデータは、培養赤血球系細胞におけるＣＲ１過剰発現が前記赤血球系細胞上の免疫複合体の捕捉を可能にし、赤血球系細胞からマクロファージへの免疫複合体のトランスファーを促進し、マクロファージによって取り込まれる免疫複合体の速度及び数を大幅に増加させることを決定的に実証している。

【1233】

実施例１５：ｓｃＦｖの活性
図７は、膜貫通タンパク質ＧＰＡとの融合物として培養赤血球系細胞の表面上で外因的に発現する抗体ｓｃＦｖの生化学的活性及び生物学的活性を示す。

【1234】

本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡのリーダー配列、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ、Ｂｏｓｅ ２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０：６１７に記載される）、ＨＡエピトープタグ、［Ｇｌｙ－３－Ｓｅｒ］２可動性リンカー、及びグリコホリンＡの本体をコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。トランス遺伝子発現を、抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。抗体ｓｃＦｖの生化学的活性は、標的タンパク質、この場合Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）との結合に関してフローサイトメトリーによって評価した。組換えＨＢｓＡｇタンパク質（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ－６５０フルオロフォア（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識した。ｓｃＦｖ発現細胞を１００ｎＭの標識タンパク質とインキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光に関して本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。

【1235】

抗体ｓｃＦｖの生物学的活性は、フローサイトメトリーによって検出されるＨＢｓＡｇのインビボ捕捉によって評価した。組換えＨＢｓＡｇタンパク質（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ－６５０フルオロフォア（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識した。ｓｃＦｖ発現細胞をＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ）で蛍光標識した。免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）に約４００ｐｍｏｌの標識ＨＢｓＡｇを尾静脈注射した。数分後、同じマウスに２×１０^７個のｓｃＦｖ発現細胞を注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。採取した血液細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞はＣＦＳＥ陽性であると特定された。ヒト細胞におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光としてＨＢｓＡｇの捕捉を検出した。

【1236】

図７Ａ～図７Ｂは、その同種抗原、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の結合として定義される抗体ｓｃＦｖの生化学的活性を示す。図７Ａにおいては、抗体ｓｃＦｖを発現する細胞（黒色）又はそれを発現しない細胞（灰色網掛け）を４５０ｎＭ ＨＢｓＡｇと共にインキュベートし、ビオチン化抗ＨＢｓＡｇ抗体及び蛍光ストレプトアビジンで染色する。抗体ｓｃＦｖを発現する細胞（この培養物中の細胞の約４５％）は抗原と結合する。図７Ｂにおいては、抗体ｓｃＦｖを発現する細胞を様々な濃度のＨＢｓＡｇと共にインキュベートして上記のとおり染色し、結合イベントが用量依存性であって、親和性が約１０ｎＭであることが示される。

【1237】

図７Ｃ～図７Ｄは、マウスにおいて循環中にある間の同種抗原ＨＢｓＡｇの捕捉として定義される抗体ｓｃＦｖの生物学的活性を示す。この実験では、免疫不全ＮＳＧマウスに約４００ｐｍｏｌの蛍光標識ＨＢｓＡｇを尾静脈注射した。５分後、培養除核赤血球系細胞（７Ｃ）又は外因性抗体ｓｃＦｖを発現する培養除核赤血球系細胞（７Ｄ）を尾静脈注射した。注射前、全ての培養細胞をＣＦＳＥ蛍光色素で標識した。６時間後に血液を採取し、フローサイトメーターで分析し、ＣＦＳＥ＋ヒト細胞でゲーティングした。裸の培養細胞はＨＢｓＡｇに結合しなかったが（７Ｃ）、一方、抗体ｓｃＦｖ発現細胞はＨＢｓＡｇに結合する（７Ｄ）。生化学的活性実験と一致して、この培養物中の細胞の約４５％が抗体－ｓｃＦｖを発現する。

【1238】

これらのデータは、抗体ｓｃＦｖが培養赤血球系細胞の表面上で発現するとき生化学的活性であること、及び赤血球系細胞上の抗体ｓｃＦｖがインビボで循環中にあるときその標的に結合可能であることを実証している。これは、循環中の物質の捕捉、隔絶、及びクリアランスが所望される治療手法にとって深い意味を有する。

【1239】

実施例１６：活性 － 循環クリアランス
図８は、標的の循環クリアランスに使用される表面分子捕捉剤の生化学的活性及び生物学的活性の両方を示す。

【1240】

捕捉剤、この場合ＨＡポリペプチド及びビオチンの生化学的活性は、標的タンパク質、この場合抗ＨＡ抗体及び抗ビオチン抗体との結合に関してフローサイトメトリーによって評価した。捕捉剤の生物学的活性は、フローサイトメトリー及び血漿タンパク質定量化により検出するときの標的タンパク質のインビボ捕捉及びクリアランスによって評価した。

【1241】

１．化学的に修飾された細胞による抗ビオチン抗体の捕捉
正常ヒトドナー由来の赤血球を購入した（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）。細胞をＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ）によって製造者の指示に従い３７℃で２０分間標識した。次に、０．０２容積の２ｍＭストックビオチン試薬を使用して細胞を製造者の指示に従いＮＨＳ－ビオチン（Ｓｉｇｍａ）で室温で３０分間ビオチン化した。抗ビオチン抗体（Ａｂｃａｍ）をＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）で蛍光標識した。標識抗ビオチン抗体及びＣＦＳＥ蛍光を検出マーカーとして使用してフローサイトメトリーによって細胞の標識効率を評価した。２５０ｕｇの標識抗体をＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から静脈内注射した。４時間後、１×１０^８個のビオチン化細胞を尾静脈から静脈内注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。採取した血液細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞はＣＦＳＥ陽性であると特定された。ヒト細胞におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光として抗ビオチン抗体の捕捉を検出した。採血からの血漿をＥＬＩＳＡによってビオチン被覆マイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者の指示に従い分析し、循環中の抗体レベルを検出した。

【1242】

２．トランスジェニック培養細胞による抗ＨＡ抗体の捕捉
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、ＨＡエピトープタグ、グリコホリンＡコード配列、ウイルスＴ２Ａ切断可能配列及びＧＦＰをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｐｉｅｒｃｅ）及びＧＦＰ蛍光で蛍光標識した抗ＨＡ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって細胞を分析し、両方のトランス遺伝子の発現を検出した。２５０ｕｇの標識抗ＨＡ抗体をＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から静脈内注射した。４時間後、１×１０^８個の培養細胞を尾静脈から静脈内注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。採取した血液細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞はＣＦＳＥ陽性であると特定された。ヒト細胞におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光として抗ＨＡ抗体の捕捉を検出した。採血からの血漿をＥＬＩＳＡによってＨＡペプチド被覆マイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者の指示に従い分析し、循環中の抗体レベルを検出した。

【1243】

図８は、（８Ａ～８Ｂ）ＧＰＡとの融合物として培養赤血球系細胞の表面上で発現するポルペプチド（ｐｏｌｐｅｐｔｉｄｅ）ＨＡ、及び（８Ｃ～８Ｄ）初代赤血球の表面に化学的にコンジュゲートしたビオチンの生化学的活性及び生物学的活性を示す。生化学的活性は、インビトロでの標的タンパク質の捕捉として定義される。生物学的活性は、インビトロでの標的タンパク質のクリアランスの亢進として定義される。

【1244】

図８Ａにおいては、ＧＰＡのＮ末端との融合物として発現するＨＡポリペプチドが、インビボでマウス抗ＨＡ抗体を捕捉する。ＮＳＧマウスに蛍光標識マウス抗ＨＡ抗体を注射し、続いて表面上にＧＰＡとの融合物としてＨＡエピトープタグを発現しない（上）、或いは発現する（下）培養ヒト赤血球系細胞を注射した。血液を採取し、細胞をフローサイトメーターで分析した。ｘ軸はＣＦＳＥ蛍光を表す。ｙ軸は抗ＨＡ抗体Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を表す。両方の試料でＣＦＳＥ陽性培養ヒト赤血球が観察されるが、ＨＡエピトープタグを発現する細胞のみが、循環抗ＨＡ抗体を捕捉することが可能である。

【1245】

図８Ｂにおいては、マウスに抗ＨＡ抗体を注射し、次に任意選択で、その表面上にＧＰＡとの融合物としてＨＡペプチドを発現しない、或いは発現する培養ヒト赤血球系細胞を注射した。複数の時点で血漿を採取し、血漿中の抗ＨＡ抗体レベルを、ＨＡペプチド被覆プレートを基質として使用してＥＬＩＳＡによって評価した。抗ＨＡ抗体のみ（白色の丸、実線－このマウスは１２０分後に治療とは無関係な原因によって死亡した）又は抗ＨＡ抗体と、続いてその表面上にＨＡペプチドを発現しない細胞（破線）を注射したマウスは、細胞の注射後２４時間まで循環中に有意な抗体を有する。対照的に、抗ＨＡ抗体と、続いてその表面上にＨＡペプチドを発現する細胞を注射したマウスは、数分以内に標的抗体が枯渇する。このデータは、その表面上にレシーバーポリペプチドを発現する培養赤血球系細胞によって標的抗体が循環から急速且つ特異的に除去されることを決定的に実証している。

【1246】

図８Ｃにおいては、アミン官能化化学によって赤血球系細胞の表面にコンジュゲートしたビオチン分子が、マウス抗ビオチン抗体を捕捉する。これらの例のいずれにおいても、捕捉はフローサイトメトリーによって評価した。ＣＦＳＥ標識され且つビオチン化された細胞は、蛍光抗ビオチン抗体で染色したときダブルポジティブとして現れ（下側のドットプロット）、一方、ビオチン化されていないＣＦＳＥ標識細胞は、シングルポジティブとして現れるのみである（上側のドットプロット）。

【1247】

図８Ｄにおいては、マウスに抗ビオチン抗体を注射し、次に任意選択で、その表面上でビオチンにコンジュゲートされていない、又はコンジュゲートされている培養ヒト赤血球系細胞を注射した。複数の時点で血漿を採取し、血漿中の抗ビオチン抗体レベルを、ビオチン被覆プレートを基質として使用してＥＬＩＳＡによって評価した。抗ビオチン抗体のみ（白色の丸、実線）又は抗ビオチン抗体と、続いてその表面上でビオチンにコンジュゲートされていない細胞（破線）を注射したマウスは、細胞の注射後２４時間まで循環中に有意な抗体を有する。対照的に、抗ビオチン抗体と、続いてその表面上でビオチンにコンジュゲートされている細胞を注射したマウスは、数分以内に標的抗体が枯渇する。このデータは、その表面上にレシーバーポリペプチドを含む培養赤血球系細胞によって標的抗体が循環から急速且つ特異的に除去されることを決定的に実証している。

【1248】

総合して、これらのデータは、膜－レシーバー複合体上の好適なレシーバーが循環中にあるときインビボでその標的分子を結合して標的分子の急速な循環クリアランスを媒介し得ることを決定的に実証しており、これは治療上、深い意味を有する。

【1249】

実施例１７：補体調節因子の活性
合成膜－レシーバー複合体の補体調節活性は、当該技術分野において公知の標準ＣＨ５０及びＡＨ５０アッセイによって評価する（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９６１ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ ｐｐ．１３３－２３９及びＰｌａｔｔｓ－Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．１９７４ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１３：３４８を参照）。

【1250】

簡潔に言えば、ＣＨ５０アッセイは標的細胞としてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を利用する。簡潔に言えば、ＧＶＢ（２＋）緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有ゼラチン／ベロナール緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．３５に１×１０^９個のＳＲＢＣ／ｍｌを含有する懸濁液を調製する。溶血素（ウサギ抗ヒツジ抗血清）を力価測定して、ＳＲＢＣを感作するのに最適な希釈を決定する。希釈した溶血素（１：８００）を等容積のＳＲＢＣ（１×１０９ＳＲＢＣ／）と混合し、全てを３７℃で１５分間インキュベートする。これにより５×１０^８／ｍｌの抗体被覆赤血球（ＥＡ）が得られる。ＥＡ（１００μｌ）を、正常ヒト血清（ＮＨＳ）の１００μｌの５つの段階２倍希釈物（１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、及び１：３２０）又はＮＨＳと膜－レシーバー複合体との混合物の同様の希釈物と共に３７℃で１時間インキュベートする。ＧＶＢ２＋緩衝液とインキュベートするＮＨＳを対照として使用する。ＥＡを緩衝液単独（血清を加えない）と共にインキュベートすることによりバックグラウンド対照を得て、ＥＡに蒸留水を加えることにより総溶解（１００％溶血）を決定する。１．２ｍｌの氷冷０．１５Ｍ ＮａＣｌを使用して反応を停止させ、混合物をスピンして非溶解細胞をペレット化し、上清の光学濃度を分光光度法（４１２ｎｍ）で決定する。１００％溶解対照と比べた溶血パーセンテージを決定する。アッセイ混合物中の細胞の５０％を溶解させるために必要な血清希釈度を決定することにより、補体活性を定量化する。結果は、この希釈度の逆数としてＣＨ５０単位／ｍｌ血清単位で表す。

【1251】

簡潔に言えば、ＡＨ５０アッセイは、第二経路の活性化によるヒト血清による非感作ウサギ赤血球（Ｅｒａｂ）の溶解に依存する。アッセイ緩衝液にカルシウムキレーターエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）を加えることによりカルシウム依存性古典経路の活性化を阻止し、及びこの緩衝液に、両方の経路に必要なマグネシウムを加える。簡潔に言えば、ＧＶＢ－Ｍｇ２＋－ＥＧＴＡ緩衝液にウサギＲＢＣ（２×１０^８細胞／ｍｌ）の細胞懸濁液を調製する。正常ヒト血清（ＮＨＳ）の段階１．５倍希釈物（１：４、１：６、１：９、１：１３．５、及び１：２０．２５）又はＮＨＳと膜－レシーバー複合体との混合物の同様の希釈物をＧＶＢ－Ｍｇ２＋－ＥＧＴＡ緩衝液に調製し、１００μｌの各血清希釈物を５０μｌの標準化Ｅｒａｂに加える。ＧＶＢ－Ｍｇ２＋－ＥＧＴＡ緩衝液とインキュベートしたＮＨＳを対照として使用する。次にこの混合物を、振盪水浴中で細胞を懸濁下に保ちながら３７℃で６０分インキュベートし、１．２ｍｌの氷冷ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）を使用して反応を停止させる。チューブを１２５０ｇ、４℃で１０分間スピンして細胞をペレット化し、上清の光学濃度を分光光度法（４１２ｎｍ）で決定する。バックグラウンド対照は１００μｌのＧＶＢ－Ｍｇ２＋－ＥＧＴＡ緩衝液、及び５０μｌのＥｒａｂを有し、１０％の総溶解を超えない。総溶解物対照チューブにおいて５０μｌ Ｅｒａｂ懸濁液に１００μｌの蒸留水を加え、１００％溶解対照と比べた溶血のパーセンテージを決定する。アッセイの結果を計算し、アッセイ混合物中の細胞の５０％を溶解させるために必要な血清希釈度を決定することにより、補体活性を定量化する。結果は、この希釈度の逆数としてＡＨ５０単位／ｍｌ血清単位で表す。

【1252】

実施例１８：血小板に負荷したチミジンホスホリラーゼの活性
Ｃ末端にＨＡタグを有するチミジンホスホリラーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築する。本明細書に記載されるとおり前駆細胞から血小板を培養する。本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によってトランス遺伝子を培養血小板前駆細胞に導入する。培養血小板内でのチミジンホスホリラーゼの発現を、本明細書に記載されるとおり、抗ＨＡ検出抗体を使用してウエスタンブロッティングにより評価する。

【1253】

チミジンからチミンへの変換率を定量化することにより、血小板試料においてチミジンホスホリラーゼ活性を決定する。予備実験を行って、時間及び酵素希釈度に対する線形代謝産物形成動態を決定する；この方法は、４．０～７１９ｎｍｏｌ／分／ｍｌのチミンホスホリラーゼ範囲（１０～９０８８の試料希釈度範囲に対応する）に対し、１６分まで線形であることが示される。解凍した試料を１２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．４で１：７１０希釈することにより、透析前試料培養血小板及び対照血小板試料のライセートを調製する。次に２５ｕｌの血小板溶解物を１００ｕｌリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ６．５）及び２５ｕｌチミジン標準（１０ｍＭ）に加え、混合し、３７℃で１０分間インキュベートする。この反応は２５ｕｌの４０％ＴＣＡで停止させる。血小板溶解物を加える前にＴＣＡをリン酸ナトリウム緩衝液／チミジンインキュベーション混合物に加えることにより、アッセイブランクを調製する。試料を１３，４００×ｇで２分間遠心し、上清を振盪機において水飽和ジエチルエーテルで２分、２回洗浄して、ＴＣＡを抽出する。エーテルがＨＰＬＣ分離を妨害しないように、マトリックスを５分間曝気してエーテルを蒸発させることにより、有効な除去を達成する。ＨＰＬＣに１０ｕｌの試料容積を投入する。

【1254】

基質及び生成物のクロマトグラフ分離は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ２７９５システムを使用した均一濃度溶離による逆相クロマトグラフィーを用いて達成する。予め充填されたＣ１８カラム（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳ １２５ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ、５ｕｍ粒度、Ｗａｔｅｒｓ）を固定相として使用した。ＨＣｌでｐＨ２．７０に調整したイオン対生成剤硫酸水素テトラブチルアンモニウム（５ｍＭ）を含有する酢酸アンモニウム（４０ｍＭ）の移動相を使用して、１．０ｍｌ／分の流量で送り、８分のラン時間で分析物を溶離させる。ＵＶ検出は２５４ｎｍ及び０．１吸光度単位フルスケールである。スペクトルを純粋標準と比較して代謝産物を同定する。

【1255】

実施例１９：血小板によって提示されるグッドパスチャー抗原の活性
介在するＨＡタグを有してＣＤ４２ｂ（ＧＰ１Ｂ、ｇｅｎｂａｎｋ ＡＡＨ２７９５５．１）のＮ末端に融合したコラーゲンα３（ＩＶ）（ＣＯＬ４Ａ３）ＮＣ１ドメイン抗原をコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築する。血小板を本明細書に記載されるとおり前駆細胞から培養する。本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によってトランス遺伝子を培養血小板前駆細胞に導入する。培養血小板における外因性抗原の発現を、本明細書に記載されるとおり抗ＨＡ検出抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価する。

【1256】

グッドパスチャー症候群に罹患している患者から血清を採取し、その血清を市販のＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ ＣＯＬ４Ａ３ ＥＬＩＳＡキット）によって抗ＣＯＬ４Ａ３抗体に関して試験する。この抗ＣＯＬ４Ａ３血清を一次検出抗体として使用し、及び蛍光抗ヒトＩｇＧを二次検出抗体として使用して、抗原を発現する血小板の結合能を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。

【1257】

この抗原を発現する血小板を使用して、インビボでの血小板によって促進される循環抗原のクリアランスをマウスにモデル化する。ＮＳＧマウスに、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０色素で蛍光標識した１００ｕＬのマウス抗ヒトＣＯＬ４Ａ３抗体（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ）を注射する。次に外因性抗原を発現するＣＦＳＥ標識培養血小板（１マウス当たり１０^８）を尾静脈から注射する。１０分、３０分、２時間、１２時間、及び２４時間で顎下部位から血液を採取する。血液を遠心して多血小板画分を収集し、次にそれを染色して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析する。ＣＦＳＥ－Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０ダブルポジティブ集団をトラッキングすることにより、血小板による抗体捕捉を決定する。

【1258】

実施例２０：インビボ活性（マウス）
本明細書に記載されるとおりマウス赤血球系細胞を培養する。赤血球系前駆細胞に、本明細書に記載されるとおりレンチウイルスを使用して、好適な、例えば補体受容体１（ＣＲ１）をコードするレシーバーポリペプチドトランス遺伝子を形質導入する。本明細書に記載されるとおり細胞を培養して最終分化させる。細胞における外因性タンパク質の存在を、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。細胞の検出を促進するため、細胞を蛍光色素、例えばＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で製造者の指示に従い標識する。ループスのＮＺＢＷＦ１／Ｊマウスモデル、又は好適なレシーバーポリペプチドに対応する他の適切な疾患若しくは活性モデルに細胞を注射し、約１×１０^８個の細胞を尾静脈から注射する。複数の時点で顎下穿刺によって血液を採取する。ラジ細胞アッセイによって血漿中の免疫複合体レベルを検出する。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．９７６，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５７（１）：１６９を参照されたい。採取した血液試料中のＣＦＳＥ蛍光細胞の割合をトラッキングすることにより、培養細胞の薬物動態を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。マウスの全般的な健康を、免疫複合体沈着及び炎症媒介性の損傷をトラッキングするための腎組織の組織学を含め、肉眼的剖検によって評価する。

【1259】

実施例２１：迅速スクリーニング
細胞株、例えば２９３Ｔ及びＫ５６２は、発現及び培養サイクル（約１日）が培養赤血球系細胞（数日～数週間）と比較して短い。これらの細胞株を使用して、好適なレシーバーポリペプチドをコードする遺伝子ライブラリを高速で繰り返し適用し、最も高い発現又は活性を有するレシーバーポリペプチドを同定することができる。

【1260】

好適なレシーバーポリペプチドトランス遺伝子、例えば補体受容体１（ＣＲ１）の完全長及びより短い変異体のライブラリを、本明細書に記載されるとおりポリメラーゼ連鎖反応及びギブソンアセンブリによって構築する。このトランス遺伝子のライブラリを、本明細書に記載されるとおりリポフェクタミンを使用してマイクロタイタープレートにおいて並行方式でＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、本明細書に記載されるとおりレンチウイルスを使用してＫ５６２細胞に形質導入する。２４～４８時間後にレシーバーの発現を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される蛍光免疫複合体の捕捉により、及び本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される培養単球への蛍光免疫複合体のトランスファーにより、ライブラリ中のレシーバーの各々の活性を評価する。次にライブラリからの最も機能性である（例えば、最も高度に発現する、最も多く免疫複合体を捕捉する、又は免疫複合体を単球に最良にトランスファーする）レシーバーを、本明細書に記載されるとおりレンチウイルスを使用して本明細書に記載されるとおり並行赤血球系細胞培養物に個々に形質導入する。培養赤血球系細胞における各レシーバーの発現は、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。培養赤血球系細胞における各レシーバーの活性は、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される蛍光免疫複合体の捕捉により、及び本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーで検出される培養単球への蛍光免疫複合体のトランスファーによって評価する。

【1261】

実施例２２：インビボでのＲＢＣのクリアランス速度の評価
免疫不全マウスモデルにおいてインビボで赤血球系細胞のクリアランス速度を評価した。－１日目にＮＳＧマウスを１００ｕＬのクロルドネートリポソーム（ｃｌｏｒｄｏｎａｔｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（Ｃｌｏｄｒｏｓｏｍｅｓ．ｃｏｍ）溶液で処置し、マクロファージを選択的に枯渇させた。細胞を蛍光タグＣＦＳＥで標識し、約１×１０^８個の細胞を各マウスに尾静脈から注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取し、血液細胞を回収した。細胞を抗ヒトＧＰＡ抗体で共染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒト赤血球系細胞は、ＣＦＳＥシグナルによって、及びヒトＧＰＡシグナルによってマウス赤血球系細胞と区別された。

【1262】

治療上の適用には、培養赤血球系細胞、及び細胞内か或いは表面上に外因性タンパク質を含有する培養赤血球系細胞が、生体内で正常に循環することが重要である。これは、標準的な免疫不全マウスモデルを使用して図９に示される。図９Ａにおいては、注射したマウスから採取した血液をフローサイトメーターで分析する。培養ヒト赤血球系細胞は、プロットの右上の象限に、ＣＦＳＥ及びヒト－ＧＰＡがダブルポジティブと同定される。図９Ｂにおいては、マウスにヒト赤血球（塗り潰しの丸）、培養除核赤血球系細胞（破線上の菱形）、細胞内外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（点線上の四角形）及び表面外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞（白色の三角形）を注射した。ヒト細胞のクリアランス速度は、最初の時点（注射後２０分）に対してスケーリングした時間に対する残存ＣＦＳＥ＋細胞のパーセンテージとして計測される。４つの試料間にクリアランス速度の有意な差はない。

【1263】

これらのデータは、培養除核赤血球系細胞の循環が正常ヒト赤血球と実質的に同様であることを明らかに実証している。さらに、細胞内空間又は細胞の表面上のいずれで発現する外因性タンパク質も、これらの細胞の循環挙動に実質的に影響を及ぼさない。これは、この技術の治療的解釈にとって重要な結果である。

【1264】

実施例２３：有害循環事象の評価
循環中の培養赤血球系細胞によって引き起こされる有害事象の発生を、培養赤血球系細胞を注射した動物における血中のフィブリノゲン崩壊産物の検出及び組織学によって評価した。

【1265】

フィブリノゲン崩壊産物の検出。本明細書に記載されるとおりマウスに培養赤血球系細胞を注射した。マウスから血液を顎下穿刺によってＥＤＴＡ入りチューブに採取した。遠心によって細胞を分離し、血漿を収集した。マウス血漿中のフィブリノゲン崩壊産物フィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢのレベルをＥＬＩＳＡ（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ）によって製造者の指示に従い計測した。

【1266】

組織学。同じマウスの組織試料を死体解剖後に採取した。組織をトリミングし、パラフィンワックスに包埋して切片化した。組織切片をＨ＆Ｅ染色及びトリクロム染色によって染色した。１０倍及び２０倍の拡大率で顕微鏡像を撮った。

【1267】

治療上の適用には、培養赤血球系細胞及び外因性タンパク質を（細胞内又は表面上のいずれかに）含む培養赤血球系細胞が凝固カスケードの活性化及び組織血栓形成などの有害事象を誘導しないことが重要である。

【1268】

図１０Ａ及び図１０Ｂは、（１）ヒト赤血球、（２）培養除核赤血球系細胞、（３）細胞内外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞、（４）表面外因性タンパク質を発現する培養除核赤血球系細胞、及び（５）組換えタンパク質単独を注射したマウスに関するマウス血漿中のフィブリノペプチドＡ及びＢのレベルを示す。凝固カスケードのフィブリノゲン崩壊及び活性化マーカーであるフィブリノペプチドＡ及びＢのレベルは、全ての試料で実質的に同程度である。

【1269】

図１０Ｃ及び図１０Ｄは、培養除核赤血球系細胞（１０Ｃ）及び組換えタンパク質（１０Ｄ）を注射したマウスに関する脾臓の組織染色切片を示す。組織間に実質的な差はなく、試料のいずれの間においても、脾臓、肝臓、肺、脳、心臓、及び腎臓に同定可能な組織損傷は観察されなかった。

【1270】

これらのデータは、外因性タンパク質を含む又は含まない培養赤血球系細胞が、マウスにおいて循環中にある間にいかなる有害事象も誘導しないことを決定的に実証している。

【1271】

実施例２４：循環中における外因性タンパク質保持の評価
培養除核赤血球系細胞内及びその上での外因性タンパク質の保持をフローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによって評価した。

【1272】

１．フローサイトメトリーによって評価した外因性タンパク質の保持
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。グリコホリンＡシグナル配列、Ｂ型肝炎表面抗原に特異的な抗体ｓｃＦｖ、ＨＡエピトープタグ、及びグリコホリンＡコード配列をコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した（１マウス当たり１×１０^８細胞）。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。採取した細胞を蛍光抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ヒト細胞をＣＦＳＥ＋細胞と同定し、エピトープタグに関しても陽性染色されたＣＦＳＥ＋細胞の画分によって外因性タンパク質保持を評価した。

【1273】

２．ウエスタンブロットによって評価した外因性タンパク質の保持
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。アデノシンデアミナーゼ及びＨＡエピトープタグをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した（１マウス当たり１×１０^８細胞）。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。採取した細胞を洗浄し、溶解し、ＨＡエピトープタグに対する検出抗体で本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析した。

【1274】

治療上の適用には、細胞内或いは表面上に外因性タンパク質を含む培養赤血球系細胞が循環中にある間にこれらのトランス遺伝子を保持することが重要である。当該技術分野においては、赤血球系細胞が循環中にあるとき、成熟し及び成熟するに従い基本的な機能に不要なタンパク質を除去する厳密なプログラムを受けることが広く仮定されている点を考えると、これは軽視できない成果である（Ｌｉｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（１０）：２０２１－２０２７，Ｌｏｄｉｓｈ ＨＦ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４７（１）：５９）。

【1275】

図１１は、培養除核赤血球系細胞内及びその上で発現する外因性タンパク質が循環中に保持されたことを示す。図１１Ａでは、マウスに、抗体ｓｃＦｖを表面上に発現する培養除核赤血球系細胞を注射した。抗体ｓｃＦｖ陽性細胞の割合は約５０％で始まり、複数日の循環試験の継続期間中そのまま一定に保たれた。図１１Ｂでは、マウスに、ＨＡタグを有する細胞質酵素を発現する培養除核赤血球系細胞又はＨＡタグを有する組換え酵素のいずれかを注射した。ウエスタンブロットで分析したとき、実験の継続期間にわたり酵素が培養細胞内に保持されたことは明らかである。バンド強度の低下は実験中の細胞のクリアランスに起因し、前記細胞から外因性酵素が外れたことによるものではない。

【1276】

これらのデータは、培養除核赤血球系細胞内及びその上で発現する外因性タンパク質が循環中において細胞内及びその上に保持されることを明らかに実証しており、これは治療上の関連性に大きい且つ前例のない意味を有する。

【1277】

実施例２５：インビボでの半減期延長の評価
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。アデノシンデアミナーゼ及びＨＡエピトープタグをコードするトランス遺伝子コンストラクトを、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによってアセンブルした。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりレンチウイルス形質導入によって赤血球系細胞に導入した。この細胞を本明細書に記載されるとおり培養して最終分化させた。細胞をＣＦＳＥで蛍光標識し、免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した（１マウス当たり１×１０^８細胞）。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。採取した細胞を洗浄し、溶解し、ＨＡエピトープタグに対する検出抗体で本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析した。

【1278】

Ｃ末端にＨＡタグを有するアデノシンデアミナーゼをコードするトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりギブソンアセンブリによって構築した。このトランス遺伝子を、本明細書に記載されるとおりリポフェクタミントランスフェクション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に導入した。７日後にＨＡアフィニティー樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して製造者の指示に従い細胞培養上清からタンパク質を精製した。タンパク質濃度は２８０ｎｍの光の吸光度によって評価した。タンパク質（４０ｕｇ）を免疫不全ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に尾静脈から注射した。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取した。血漿をＨＡエピトープタグに対する検出抗体で本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析した。

【1279】

図１１Ｂでは、マウスに、ＨＡタグを有する細胞質酵素を発現する培養除核赤血球系細胞又はＨＡタグを有する組換え酵素を注入した。ウエスタンブロットで分析したとき、可溶性形態で注入したときと比較して、循環細胞内で発現したときには酵素の循環半減期が有意に延長されることは明らかである。

【1280】

実施例２６：インビボでのクリアランス速度の評価 － 血小板
外因性チミジンホスホリラーゼを発現する血小板の集団を、本明細書に詳説される手順を用いて培養し、ＣＦＳＥで標識し、ＮＳＧマウスに尾静脈から注射する。ヒト供給源の天然血小板の集団を同様にＣＦＳＥで標識し、別のマウスに注射する。両方のマウスから１０分、１時間、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間の時点で試料を採取し、フローサイトメトリーを用いて血小板循環レベルを定量化する。天然血小板と培養血小板の半減期を比較する。

【1281】

実施例２７：有害循環事象の評価 － 血小板
治療上の適用には、培養血小板及び外因性タンパク質を（細胞内又は表面上のいずれかに）含む培養血小板が凝固カスケードの活性化及び組織血栓形成などの有害事象を誘導しないことが重要である。培養血小板をＮＳＧマウスに尾静脈から注射した後、ＥＬＩＳＡによって製造者のプロトコルに従い（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ）マウス血漿中のフィブリノゲン崩壊産物フィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢを検出する。死体解剖後、ＮＳＧマウスの組織試料を採取する。組織はトリミングし、パラフィンワックスに包埋して切片化する。組織切片をＨ＆Ｅ染色及びトリクロム染色によって染色する。１０倍及び２０倍の拡大率で顕微鏡像を撮り、病原性の特徴について熟練の病理学者が評価する。

【1282】

実施例２８：循環中における外因性タンパク質保持の評価 － 血小板
培養血小板内及びその上における外因性タンパク質の保持を、フローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングによって評価する。

【1283】

細胞内外因性タンパク質を含むＣＦＳＥ標識血小板をマウスに尾静脈から注射する。一定の間隔で血液を顎下穿刺によって採取する。血液を遠心して多血小板血漿を単離し、次にそれを溶解して、外因性タンパク質に存在するエピトープタグを染色してウエスタンブロットで分析する。

【1284】

実施例２９：生成用ドナー細胞の入手
インフォームドコンセントを得た後、健康ＣＤ３４＋幹細胞ドナーが末梢血幹細胞動員のためｒｈＧ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ又はＮｅｕｐｏｇｅｎ）、１０ｕｇ／ｋｇ／日ｓ．ｃ．を５日間受け、次に２日連続でアフェレーシスを受けて、動員されたＣＤ３４＋ＨＳＣが収集される。動員された末梢血からＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心法によって単核細胞（ＭＮＣ）を単離し、２部に分ける。１部は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉプロトコルに関連して、抗ＣＤ３４被覆磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したＣＤ３４＋細胞の精製に使用する。ＣＤ３４＋画分の純度を制御する。次にＣＤ３４＋濃縮ＨＳＣを二段階培養法で直ちに使用するか、又は一段階培養法における使用時まで凍結する。

【1285】

使用する完全培地（ＣＭ）は、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）及び１０％熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）である。拡大には、１０％熱失活ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）を使用する。組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、胎児肝チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＴＮＦ－αは、Ｒ＆Ｄシステム（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）から購入する。

【1286】

実施例３０：生成用のスケールアップ
静置培養で細胞を１×１０^５～２×１０^６細胞／ｍＬの密度に維持して、赤血球系細胞の容積を漸進的にスケールアップする。拡大段階は１０^５／ｍｌで播種し、３～７回の漸進的な容積替えを含む；１００ｍｌ、５００ｍｌ、１Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１００Ｌ。生成の過程において、細胞培地はＩＭＤＭ、ＦＢＳ、ＢＳＡ、ホロトランスフェリン、インスリン、グルタミン、デキサメタゾン、βエストラジオール、ＩＬ－３、ＳＣＦ、及びエリスロポエチンの組み合わせを含む。細胞が生成バイオリアクターに播種するのに適切な容積に達したところで、最終的なスケールアップ及び分化のため細胞を生成バイオリアクターに移し替える。

【1287】

実施例３１：バイオリアクターでの細胞の培養（Ｗａｖｅ）
ＷＡＶＥバイオリアクター２／１０システムを操作マニュアルに従いセットアップする。端的には、Ｃｅｌｌｂａｇをロッキングユニットに組み付け、それを灌流モジュールに置く。このバッグを空気で膨張させた後、ウエイトをゼロに設定する。続いてバッグに適切な量の培養培地を充填し、少なくとも２時間インキュベートして培地を３７℃に到達させる。２つのポートを有する特別な設計のＤＵＲＡＮガラスボトルであるトランスファーフラスコでこのバッグに培地及び細胞を移し替える。フラスコの上部においてポートにフィルタを接続する。フラスコの底の近くの他方のポートにはチューブを組み付ける。トランスファーフラスコのチューブをＣｅｌｌｂａｇの供給接続部と結合する。トランスファーフラスコはＬＡＦフード内に維持し、汚染のリスクを低下させる。

【1288】

灌流開始前、回収及び供給用のチュービング及び容器をＣｅｌｌｂａｇに接続する。チュービングは以下のとおり調製する；それぞれ３．２ｍｍ、６．４ｍｍの内径及び外径を有する５０又は７０ｃｍ長さのＳａｎｉｆｌｅｘ ＡＳＴＰ－ＥＬＰシリコーンチュービング（Ｇｏｒｅ／Ｓａｎｉｆｌｅｘ ＡＢ）は、両端に雄型ルアーロック接続部を備える。シリコーンチュービングを雌型ルアーロックを介してＣ－Ｆｌｅｘチューブの一端に接続する。Ｃ－Ｆｌｅｘチューブの他端に雄型ルアーロックを組み付け、その後チュービングをオートクレーブ処理する。全てのチューブ上にルアーロックをジップタイで適所に保持する。灌流に先立ち、供給及び回収の両方のためシリコーン部品をＣｅｌｌｂａｇに接続し、Ｃ－Ｆｌｅｘ部品を５Ｌ容器（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｔａｉｎｅｒ）に接続する。全ての接続は層流キャビネット内で行う。

【1289】

環境要因及び代謝要因を制御すると、培養下の赤血球系細胞の転写因子及び遺伝子調節タンパク質の発現又は活性を変えることができる。例えば、Ｃｓａｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０３（２）：４０２；Ｃｓａｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０（２）：２１８を参照されたい。反応器の入出力の制御をもたらすため微量送達システムを作成し、その主要構成要素は、内径が１００ｕｍの６０～８０ｃｍ長さの溶融石英毛細管（＃ＴＳＰ１００３７５、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。入力端で、毛細管には、ＰＥＥＫルアーを介してＭｉｃｒｏＴｉｇｈｔアダプター（＃Ｐ－６６２、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続したｌｕｅｒ－ｌｏｋ先端ストックシリンジ（＃３０９５８５ ＢＤ）を送り込む。ストックシリンジはモデル３３ Ｔｗｉｎシリンジポンプ（＃５５３３３３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に装填し、４℃の冷蔵庫に保管する。出力端で、毛細管はバイオリアクターに入る：２ポートＦＥＰ細胞培養バッグ（＃２ＰＦ－０００２、ＶｕｅＬｉｆｅ）を３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーター内のオービタルシェーカーに置く。毛細管を針でセルフシールゴム隔膜（＃Ｂ－ＩＩＳ、ＩｎｔｅｒＬｉｎｋ）に通し、バイオリアクターの中間点まで送り込む。バイオリアクターの反対側のコネクタは、別のセルフシールゴム隔膜に交換する。ストックシリンジ及び送達毛細管は、使用前に、シリンジ及び毛細管壁にタンパク質が付着することを防ぐため１０％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ溶液で一晩ブロックする。

【1290】

Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬａｂＶＩＥＷ ７．１を使用してプログラムを作成し、シリンジポンプの注入を制御する。このプログラムの基本的な投与戦略は、初回注射で濃度Ｌ１にし、待機時間ｔ１が続き、次に各々濃度Ｌ２にする注射と、続く待機時間ｔ２をｎ回繰り返すものである。使用者が、流量、ストック濃度、初期培養容積、注射後の所望の濃度、注射間の時間、及び総注射回数を入力する。

【1291】

実施例３２：培養赤血球系細胞の拡大及び分化を評価する
インビトロ分化細胞の拡大、分化、及び除核を評価して、トランス遺伝子の導入が培養下の細胞の品質に悪影響を及ぼさないよう確実にすることは重要である。拡大は、細胞計数によって評価する。分化は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、及びＲＴ－ＰＣＲによって評価する。除核は、フローサイトメトリーによって評価する。

【1292】

細胞計数による拡大速度の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンター機器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してカウントする。細胞の拡大速度は、時間に伴う細胞数の増加によって決定する。

【1293】

フローサイトメトリーによる分化の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、細胞表面マーカーＧＰＡ（ＣＤ２３５ａ）、ＣＫＩＴ（ＣＤ１１７）、及びＴＲ（ＣＤ７１）に対する蛍光抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）の１：１００希釈物で染色する。標識した細胞を本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって分析する。

【1294】

ウエスタンブロットによる分化の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、分化マーカーＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、バンド３、ＣＤ４４、及びアクチンに対する抗体（Ａｂｃａｍ）を使用して、本明細書に記載されるとおりウエスタンブロットによって分析する。

【1295】

フローサイトメトリーによる除核の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、グリコホリンＡに対する蛍光抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び核酸染色剤ＤＲＡＱ５（Ｐｉｅｒｃｅ）により製造者の推奨する希釈度で染色し、本明細書に記載されるとおりＡｔｔｕｎｅフローサイトメーターで分析する。

【1296】

顕微鏡法（ベンジジン－ギムザ）による除核の評価。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養した。種々の時点で細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してスライド上でスピンした。細胞は、ｃｙｔｏｓｐｉｎ後に－２０℃のメタノールによって室温で２分間固定し、水でリンスして風乾した。ベンジジン錠（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５９０５）を１０ｍＬ ＰＢＳで溶解し、そこに１０μＬのＨ２Ｏ２を加えた。この溶液を０．２２ｕｍシリンジフィルタでろ過した。スライド上の細胞スポットを３００～５００ｕＬのベンジジン溶液で被覆し、室温で１時間インキュベートし、次に水で洗浄した。ギムザ染色液を水で１：２０希釈した（Ｓｉｇｍａ＃ＧＳ５００）。スライド上の細胞スポットを３００～５００ｕＬのギムザ溶液で被覆し、室温で４０分間インキュベートし、水で洗浄して風乾した。次にスライドをマウントし、シールした後、顕微鏡でイメージングした。

【1297】

図１２Ａは、トランス遺伝子を含む細胞（破線及び点線）及びトランス遺伝子を含まない細胞（実線）に関する７日間の拡大及び分化ウィンドウにおける培養下赤血球系細胞の拡大速度を示す。注目すべきことに、トランス遺伝子を含む培養細胞の拡大速度は、トランス遺伝子を含まない細胞の拡大速度と区別がつかない。

【1298】

図１２Ｂは、細胞表面分化マーカーＧＰＡ及びＣＫＩＴに対する抗体で染色した細胞の一連のフローサイトメトリープロットである。この特定の分化段階では、細胞が最終的な成熟に近付くにつれ培養物はそのＣＫＩＴ発現を失い、且つそのＧＰＡ発現を増加させている。注目すべきことに、トランス遺伝子を含む培養細胞をこの分化尺度によってトランス遺伝子を含まない培養細胞と区別することはできない。

【1299】

図１２Ｃは、表面マーカーＧＰＡに対する抗体及び蛍光ＤＮＡ染色剤で染色した細胞の一連のフローサイトメトリープロットである。３つの細胞集団が明らかである：（１）ＧＰＡ－高及びＤＮＡ－低の細胞、除核赤血球系細胞が含まれる；（２）ＧＰＡ－高及びＤＮＡ－高の細胞、遺伝物質をなおも含む赤血球系細胞が含まれる；及び（３）ＧＰＡ－低及びＤＮＡ－高の細胞、ピレノサイト、即ち除核細胞から放出された膜に囲まれた核が含まれる。注目すべきことに、トランス遺伝子を含む培養細胞をこの除核尺度によってトランス遺伝子を含まない培養細胞と区別することはできない。

【1300】

細胞培養物へのトランス遺伝子の導入は、培養下の細胞の拡大速度、分化、又は除核速度に特に著しい影響を及ぼさない。

【1301】

実施例３３：ヘモグロビン含量を評価する
１．全ヘモグロビン
赤血球ヘモグロビン含量をドラブキン試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品Ｄ５９４１）によって製造者の指示に従い決定した。簡潔に言えば、血液細胞をこの試薬と水性緩衝液中に合わせ、徹底的に混合し、標準的な分光光度計を使用して波長５４０ｎｍの光の吸光度を計測した。可溶性ヘモグロビン検量線を使用して細胞中のヘモグロビン含量を定量化した。

【1302】

２．ＲＴ－ＰＣＲによるヘモグロビンタイピング
細胞を溶解したと共に、全ＲＮＡを回収する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ－ＰＣＲ用第一鎖合成システム（Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって製造者のプロトコルに従い逆転写を実施した。簡潔に言えば、全ＲＮＡ（５ｕｇ）を１０ｕＬ Ｈ２Ｏ中の１５０ｎｇランダムヘキサマープライマー及び１０ｎｍｏｌ ｄＮＴＰミックスと共に６５℃で５分間、次に氷上で１分間インキュベートした。反応マスター混合物を、２ｕＬ １０×ＲＴ緩衝液、４ｕＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｕＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、及び１ｕＬのＲＮＡｓｅＯＵＴと共に調製した。この反応混合物をＲＮＡ／プライマー混合物に加え、素早く混合し、次に室温に２分間置いた。各チューブに１ｕＬ（５０単位）のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを加え、混合し、２５℃で１０分間インキュベートした。この反応物を４２℃で５０分間インキュベートし、７０℃で１５分間熱失活させ、次に氷上で保存した。１ｕＬのＲＮアーゼＨを加え、３７℃で２０分間インキュベートした。次にこの反応産物、第１鎖ｃＤＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲ反応に必要になるまで－２０℃で保存した。

【1303】

種々のヘモグロビン遺伝子及び対照遺伝子を増幅するためのプライマーは、ＩＤＴ－ＤＮＡから購入した。プライマーは以下のとおりであった：ｈＨＢＢ＿Ｆ － ｔｃｃｔｇａｇｇａｇａａｇｔｃｔｇｃｃｇｔ（配列番号９）；ｈＨＢＢ＿Ｒ － ｇｇａｇｔｇｇａｃａｇａｔｃｃｃｃａａａｇ（配列番号１０）；ｈＨＢＡ＿Ｆ１ － ｔｃｔｃｃｔｇｃｃｇａｃａａｇａｃｃａａ（配列番号１１）；ｈＨＢＡ＿Ｒ１ － ｇｃａｇｔｇｇｃｔｔａｇｃｔｔｇａａｇｔｔｇ（配列番号１２）；ｈＨＢＡ＿Ｆ２ － ｃａａｃｔｔｃａａｇｃｔａａｇｃｃａｃｔｇｃ（配列番号１３）；ｈＨＢＡ＿Ｒ２ － ｃｇｇｔｇｃｔｃａｃａｇａａｇｃｃａｇ（配列番号１４）；ｈＨＢＤ＿Ｆ － ｇａｃｔｇｃｔｇｔｃａａｔｇｃｃｃｔｇｔ（配列番号１５）；ｈＨＢＤ＿Ｒ － ａａａｇｇｃａｃｃｔａｇｃａｃｃｔｔｃｔｔ（配列番号１６）；ｈＨＢＧ２＿Ｆ － ｃａｃｔｇｇａｇｃｔａｃａｇａｃａａｇａａｇｇｔｇ（配列番号１７）；ｈＨＢＧ２＿Ｒ － ｔｃｔｃｃｃａｃｃａｔａｇａａｇａｔａｃｃａｇｇ（配列番号１８）；ｈＨＢＥ＿Ｆ － ａａｇａｇｃｃｔｃａｇｇａｔｃｃａｇｃａｃ（配列番号１９）；ｈＨＢＥ＿Ｒ － ｔｃａｇｃａｇｔｇａｔｇｇａｔｇｇａｃａｃ（配列番号２０）；ｈ１８Ｓ－ＲＮＡ－Ｆ － ｃｇｃａｇｃｔａｇｇａａｔａａｔｇｇａａｔａｇｇ（配列番号２１）；ｈ１８Ｓ－ＲＮＡ－Ｒ － ｃａｔｇｇｃｃｔｃａｇｔｔｃｃｇａａａ（配列番号２２）。

【1304】

２５ｕＬ ＳＹＢＲグリーンミックス（２ｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５ｕＬ 第１鎖ｃＤＮＡ、２ｕＬ フォワード／リバースプライマーペアミックス（各プライマー５ｐｍｏｌ／ｕＬ）と共に、５０ｕＬ Ｈ２Ｏの総容積でＲＴ ＰＣＲ反応混合物を調製した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＳＤＳ ７０００機器（ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で以下の増幅サイクルを用いて反応を実行した：５０℃２分、１サイクル；９５℃１０分、１サイクル；９５℃１５秒－＞６０℃３０秒－＞７２℃３０秒、４０サイクル；７２℃１０分、１サイクル。解離曲線分析及びＲＴ－ＰＣＲ結果はＳＤＳ ７０００機器で行った。

【1305】

実施例３４：培養血小板の分化を評価する － ＦＡＣＳ
培養下の血小板の分化状態は、フローサイトメトリーによって評価することができる。巨核球（ＭＫ）は、最終的な血小板分化に先行する特徴的な細胞形態を表す。ＭＫに向かう成熟の程度を決定するため、１×１０^６個の培養細胞（ＬＡＭＡ－８４及びＣＤ３４＋細胞）を洗浄し、次に（ａ）抗ＣＤ４１－ＦＩＴＣ（ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）又は抗ＣＤ７１－ＦＩＴＣ又は（ｂ）抗ＣＤ３３－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４１－ＰＥ、抗ＣＤ４５－ＰｅｒＣｐ及びＣＤ３４－ＡＰＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で標識し、作成されたＣＤ４１細胞のパーセンテージを分析する。

【1306】

倍数性の大きさを決定するため、分化型ＬＡＭＡ－８４細胞を４℃の７５％エタノール中に一晩固定し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５０μｇ／ｍｌ）で標識し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析する一方、１４日目の分化型ＣＤ３４＋細胞をメイ・グルンワルド／ギムザ染色後に、この染色で１細胞当たりの核の数及びＭＫの特異的形態を定量化することによって顕微鏡下で定量的に分析する。ＭＫ形態を有する細胞のみを分析する。ｃｙｔｏｓｐｉｎ調製物における多核細胞の存在が、倍数体ＭＫの存在の指標となる。分化型ＣＤ３４＋細胞を多核成熟ＭＫの存在に関して形態によって評価する。

【1307】

実施例３５：培養血小板の分化を評価する － ｑＰＣＲ
培養下の血小板の分化状態は、定量的ＰＣＲによって評価することができる。血小板ＲＮＡを抽出して培養細胞をさらに特徴付ける。全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出する。各血小板調製物の純度は血小板（ＧＰＩＩＩａ）及び白血球（ＣＤ４５）マーカーのＰＣＲ解析によって評価する。さらなる分析の前に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して血小板ＲＮＡの完全性を評価する。

【1308】

細胞溶解物から全ＲＮＡを回収し、市販の合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡライブラリを作成する。標識したｃＤＮＡをＱｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量化し、３ｐＭに希釈してシングルレーンにロードし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ １Ｇゲノムアナライザー（Ｓｏｌｅｘａ）でシーケンシングする。

【1309】

未加工配列を一連の品質管理基準でフィルタリングする。第一に、少なくとも６ｎｔの３’Ｓｏｌｅｘａアダプターが存在することを確認する。この基準に適合しなかった配列リードを破棄し、一方、残りをトリミングして、３’末端にあるアダプター配列を除去する。残りのタグを、その長さ（＞１０ｎｔ）、コピー数（＞４リード）及び可読性（＜９の同定されないヌクレオチド、アノテートされたＮ）に関してさらにフィルタリングする。続いてこれらの基準全てに適合するリードを有効なリードとして定義する。

【1310】

有効なリードを全て、ｍｉＲＢａｓｅデータベースから抽出したプレマイクロＲＮＡに対してアラインメントする。２つ以上の前駆体と完全にマッチする配列タグをそれらの間に均等に分布させる。ドローシャ及びダイサーの不完全な切断を考慮するため、参照成熟マイクロＲＮＡ位置と比較したとき最大４ｎｔのシフトを許容して成熟マイクロＲＮＡ領域におけるプレマイクロＲＮＡと完全にマッチした任意の配列タグが、成熟マイクロＲＮＡと見なされる。マイクロＲＮＡ発現レベルは、小さいＲＮＡの総数が不変であることを考えると、有効なリードの総数に対して正規化した各成熟マイクロＲＮＡをマッピングするリードの数として定義される。各マイクロＲＮＡの相対的存在量は、成熟マイクロＲＮＡをマッピングするリードの総数と比較した各マイクロＲＮＡをマッピングするリードの数として定義される。

【1311】

実施例３６：遠心による精製
培養細胞画分は遠心によって精製し、核及び夾雑代替密度細胞型（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ａｌｔｅｒｎａｔｅ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ）から分離することができる。細胞を２００ｇで１５分間遠心して赤血球及び網赤血球リッチ画分を単離する。上清をピペットで取り除き、次に望ましい細胞画分を、１μＭプロスタグランジンＩ２の存在下で変性タイロード緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５．５ｍＭデキストロース、１２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．８ｍＭ ＣａＣｌ２、０．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．９ｍＭ ＫＣｌ２、０．３６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４及び２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ含有、ｐＨ７．４）で洗浄し、同じ緩衝液に再懸濁する。

【1312】

実施例３７：化学的除核による精製
培養細胞の除核は、培養物に対する化学添加剤によって刺激することができ、これは精製前に細胞の除核画分の増加を促進し得る。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。回収の４８時間前、細胞を２１０ｍＭ Ｍｅ２ＳＯと共にインキュベートする。次に３５０×ｇ、室温で５分間遠心することによって細胞を回収し、２１０ｍＭ Ｍｅ２ＳＯ及び５ｕｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（又は他のアクチン又は核操作分子、即ちｐ３８ ＭＡＰＫ、ソラレン）を含有する新鮮培地に３×１０５細胞／ｍｌのレベルで再懸濁し、３７℃でインキュベートする。核のない細胞の割合を、ＤＲＡＱ５を核酸染色剤及びグリコホリンＡに対する抗体を赤血球表面分化マーカーとして使用して、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって評価する。

【1313】

実施例３８：音響泳動による精製
幾つかの機械的分離システムを使用して一様な細胞集団を得ることができる。フリーフロー音響泳動は、１つの機械的分離方法に相当する（Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ ２００７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）。ＣｓＣｌ（０．２２ｇ／ｍＬ）を含めて、栄養素添加剤と共に生理食塩水（０．９ｍｇ／ｍＬ）中に懸濁しながら、生理食塩水に加える。培養赤血球系細胞を含有する試料懸濁液を、２つの能動的出口（１つの出口につき流量０．１０ｍＬ／分）を有する音響泳動チップ（Ｃｅｌｌ－Ｃａｒｅ）を使用して処理する。

【1314】

シリンジポンプ（ＷＰＩ ＳＰ２６０Ｐ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用してチップの流量を制御する。出口は全て、Ｔｅｆｌｏｎチュービングを使用した注入器を介して精密ガラスシリンジ（１００５ ＴＬＬ及び１０１０ ＴＬＬ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂｏｎａｄｕｚ ＡＧ、Ｂｏｎａｄｕｚ、スイス）に個々に接続しており、出口流量の独立した制御が可能である。クリーン流体入口はシリンジポンプに接続し、及び細胞懸濁液入口はＴｅｆｌｏｎチュービング（０．３ｍｍ内径）の５０ｍｍ長さ部品に接続し、このチュービングの他端はビーカーに浸されており、そのビーカーから試料懸濁液が、正味の出口流量とクリーン流体入口流量との差によって定義される速度で吸引される。

【1315】

分離チャネルの壁間に定在波を生じさせるために使用される超音波は、チップの裏面に取り付けられた２０×２０ｍｍの圧電セラミック（Ｐｚ２６、Ｆｅｒｒｏｐｅｒｍ Ｐｉｅｚｏｃｅｒａｍｉｃｓ ＡＳ、Ｋｖｉｓｔｇａｒｄ、デンマーク）を使用して生成する。超音波ゲル（Ａｑｕａｓｏｎｉｃ Ｃｌｅａｒ、Ｐａｒｋｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ）が、両者の間の良好な音響結合を確実にする。圧電セラミックは、関数発生器（ＨＰ ３３２５Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に接続された電力増幅器（モデル７５Ａ２５０、Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｄｅｒｔｏｎ、ＰＡ）によって作動する。音波が裏側からチップに入るとしても、結晶構造の３軸に沿って機械的振動が結合する結果として、分離チャネルの側壁間に定在波が誘導される。

【1316】

この分離プロセスは、標準的な顕微鏡及び電力計（４３ Ｔｈｒｕｌｉｎｅ電力計、Ｂｉｒｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｒｐ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を使用してモニタする。続いてこのプロセスは、信号周波数、作動出力、及び流量を調整することにより制御できる。

【1317】

試料中の細胞サイズ分布はコールターカウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ３、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を使用して分析する。各試料を電解質（Ｉｓｏｔｏｎ ＩＩ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）と混合し、１００ｕｍアパチャーを使用して分析する。溶血レベル、即ち損傷を受けた赤血球からの遊離ヘモグロビンの濃度を光度計（血漿／低ＨＢ光度計、ＨｅｍｏＣｕｅ ＡＢ、Ａｎｇｅｌｈｏｌｍ、スウェーデン）を使用して計測する。

【1318】

実施例３９：エキソビボ成熟による精製
完全には成熟していない赤血球系細胞は、天然のインビボ成熟トリガーを模倣するシステムにおいてエキソビボでインキュベートすることにより、成熟に至るよう促進することができる。

【1319】

１．間質細胞との共培養
培養の最終段階において、赤血球系細胞をサイトカイン不含の新鮮培地中の付着間質細胞層上で培養する。培養物は３７℃で５％ＣＯ２空気中に維持する。付着細胞層は、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の、正常成人全骨髄から樹立されたＭＳ－５間質細胞株又は間葉間質細胞（ＭＳＣ）のいずれかからなる（Ｐｒｏｃｋｏｐ，ＤＪ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７１を参照）。付着ＭＳＣは、共培養で使用する前に、少なくとも２代の連続継代で拡大及び精製する。

【1320】

２．フィブロネクチン被覆プレートにおける培養
培養の最終段階において、ヒトフィブロネクチンを吸着させたプレートで赤血球系細胞を培養する。このようなプレートを作製するには、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＬ滅菌Ｈ２Ｏ／ｍｇタンパク質で再構成し、３７℃で少なくとも３０分間溶解させる。少量の不溶材料が残り得る。これが産物のパフォーマンスに影響を与えることはない。フィブロネクチン溶液を滅菌平衡塩類溶液中に１００倍希釈し、最少容積で培養表面に加える。培養表面を室温で少なくとも４５分間風乾させる。過剰のフィブロネクチンを吸引によって取り除く。

【1321】

実施例４０：磁気泳動による精製
赤血球系細胞を磁気泳動によって分離し、濃縮し、及び／又は精製する戦略は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｚｂｏｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８４（４）２６３８及びＪｉｎ＆Ｃｈａｌｍｅｒｓ ２０１２，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１２ ７（８）：ｅ３９４９１を参照されたい。市販の磁気分離システム（４つのＭｉｄｉＭＡＣＳ（商標）分離ユニット及びＬＤカラムを組み合わせるＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）セパレーター、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を使用してＨＳＣ由来の赤血球培養物から赤血球を磁気的に濃縮する。窒素（Ｍｅｄｉｐｕｒｅ（商標）窒素、濃度＞９９％、Ｐｒａｘａｉｒ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を充満させたＧｌｏｖｅ－Ｂａｇ（商標）膨張式グローブチャンバ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）において細胞を脱酸素化する。脱酸素化前に全ての材料及び機器を、分離システム、脱気した滅菌緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋０．５％ＢＳＡ）、及び滅菌コレクションチューブを含めてグローブバッグに置き、次にバッグをきつく密閉する。Ｎ２ガスを充満させた膨張式グローブチャンバの内部で酸素欠乏条件下に保たれているＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商標）セパレーターに置かれたＭＡＣＳ（登録商標）ＬＤカラムに、脱酸素化培養物を直接ロードする。磁石内に入ったカラムを通り抜ける細胞は陰性画分と分類され、これは「非磁性」と予想され、ＨＳＣ及び最終的な成熟前の赤血球系細胞が含まれる。分離カラムに保持される細胞は陽性画分と分類され、これは「磁性」であり、機能性ヘモグロビンで略充満した成熟ＲＢＣ様細胞からなる。これらの細胞は、ＬＤカラムを磁石から取り外した後にそこから溶出する。分離終了後、回収された細胞を曝気することにより、酸素化した細胞が可逆的に回復する。

【1322】

実施例４１：ＦＡＣＳによる精製
Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｒｉａ ＩＩｕセルソーターを使用して赤血球培養細胞の集団を選別する。選別前に細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、グリコホリンＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対する蛍光抗体及び核酸染色剤ＤＲＡＱ５（Ｐｉｅｒｃｅ）によって製造者の推奨する希釈度で染色する。２８，０００滴／秒の滴下駆動周波数で１００μｍノズルを使用する。試料閾値速度は約４０００イベント／秒である。全選別時間にわたり温度制御オプションを使用して試料及びコレクションチューブを４℃に維持する。加えて、選別の間中試料撹拌機能を２００ｒｐｍで使用して、試料の沈降を防止する。試料は、シリンジから分注される約７５０μのアリコートに選別される。一方、これらの中断中はコレクションチューブを４℃に保ち、遮光し、穏やかに混合した後に選別を再開する。選別した試料は、１０％ＦＣＳを補充した２５０μｌ ＤＭＥＭが入った１２×７５ｍｍホウケイ酸ガラスコレクションチューブに回収する。

【1323】

実施例４１：細胞の酵素処理による精製
同種赤血球を供給源とするにおいては、Ａ及びＢ抗原を除去して万能に適合する産物を生成することが有益であり得る。これは、ガラクトース基を選択的に切断して赤血球系細胞を免疫原性の点でより有利なものにする能力を有する一組の酵素によって促進し得る。

【1324】

エンド－β－ガラクトシダーゼの２種類の組換えタンパク質（当初はクロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）から同定されている）を、標準的なクローニング方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ－２１で産生する。Ａ／Ｂ Ａｇを遊離させるためのＡＢアーゼ及び異種移植において高度に免疫原性であることが知られ、且つＡ／Ｂ Ａｇと似た糖鎖構造を有するＧａｌα１－３Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ Ａｇ）を遊離させるためのエンド－β－ガラクトシダーゼＣ（ＥｎｄｏＧａｌＣ）を調製する。ＡＢアーゼは血液型Ａ［ＧａｌＮＡｃα１－３（Ｆｕｃα１－２）Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ］及び血液型Ｂ［Ｇａｌα１－３（Ｆｕｃα１－２）Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ］においてＧａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃ結合を切断する。

【1325】

簡潔に言えば、ＡＢアーゼのクローニング後、シグナルペプチドを有しないｐＥＴ－１５ｂベクターｅａｂＣに、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する発現プラスミドを構築する。この外因性遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ－２１細胞に形質転換する。細胞で可溶性タンパク質画分として産生される酵素をニッケル－ニトリロ三酢酸カラム（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製する。最後に、３．６ｍｇ／ｍＬの濃度で比活性が１５００Ｕ／ｍｇの５ｍＬの精製組換えＡＢアーゼが得られる。酵素活性の１単位は、毎分１μｍｏｌの基質を加水分解するために必要な酵素の量として定義される。

【1326】

Ａｇの存在、Ａｂ結合及び補体活性化に対するＡＢアーゼ処理の効果を調べる。ヒトＡ／Ｂ ＲＢＣをＡＢアーゼで消化し、交差反応性を有する（それぞれＢ型、Ａ型又はＯ型を含む抗Ａ又は抗Ｂ又は抗Ａ及びＢ）ヒト血清と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析に供する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して血液型Ａ、Ｂ及びＧａｌ Ａｇの発現レベルを定量化する。消化レベルは、ＡＢアーゼの非存在下でインキュベートした後にＲＢＣ上で発現する血液型Ａ又はＢ Ａｇに対するパーセンテージとして表される。

【1327】

３人の健常ヒトボランティアから新鮮血液型Ｏ血清をプールし、－８０℃で凍結して、使用時まで内因性補体活性を維持する。熱失活させた（５６℃で３０分間）血清を使用してＡｂ結合を分析する。酵素（ＡＢアーゼ）消化を伴う又は伴わないＲＢＣを、０．２％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で希釈した５０％血液型Ｏ血清（１００μＬ）と共に３７℃で３０分間インキュベートする。洗浄後、ＲＢＣをＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）（×３０、１００μＬ）と４℃で３０分間反応させて、次にフローサイトメトリー分析に供する。

【1328】

補体活性化に対する酵素処理の阻害効果もまた、Ｃ３ｄ沈着の変化によって評価する。ＲＢＣを補体活性の存在下において５０％ヒト血清と共に３７℃で１５分間インキュベートした後、ＲＢＣをＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＣ３ｄ Ａｂ（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）（×１００、１００μＬ）と４℃で３０分間反応させ、次にフローサイトメトリー分析にかける。対照レベル（酵素の非存在下）のパーセンテージをＭＦＩに基づき計算し、Ａｂ結合及びＣ３ｄ沈着に対する酵素処理の阻害効果を評価する。

【1329】

実施例４２：遠心による血小板の精製
血小板は、混合細胞懸濁液から遠心によって精製することができる。約４０ｍｌの全血を、抗凝固薬として使用される３．２％のクエン酸ナトリウムと共に採血チューブに分配する。このチューブを４００×ｇで１０分間遠心する。この段階後、３層の境界が明確に画定される：血漿、赤血球、及び中間域。血漿が上にあり、血小板、赤血球は密度が高いため、下にある；及び微細な白みがかった中間域は、より大きい血小板及び白血球からなり、バフィーコートと呼ばれる。Ｊｅｌｃｏ １８Ｇ針を使用して、血小板を含む血漿の上部を抜き取り、バフィーコートを、ここでは添加剤無しに２本の別のチューブに入れる：一方のチューブは血漿を作製するため（Ｐチューブ）及び他方はトロンビンを作製するため（Ｔチューブ）である。僅か１．５ｍｌの血漿のみを使用してトロンビンを作製し、そこに１０％で０．５ｍｌのグルコン酸カルシウムを加え、３７℃で１５分間ダブルボイラーに置く。次に２本のチューブを、ここでは８００×ｇで、同じ長さの時間にわたり（Ｔ＝１０分）再度遠心する。この最後の遠心後、Ｔチューブにはトロンビンリッチの液体が含まれ、一方、Ｐチューブには血小板沈渣及びいくらかの赤血球（赤血球－血小板凝集塊）が含まれる。この段階で、総血漿容積の３分の２を取り除いて容積を減らす。取り除く部分は乏血小板性であり、一方、沈降した血小板（撹拌することによって容易に分散し得る）を含む残りの部分は多血小板性である。

【1330】

実施例４３：チミジン取込み
細胞集団の自己複製能力は、当該技術分野において公知のチミジン取込みアッセイを用いて評価することができる。例えば、Ｈａｒｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １８６Ｌ２８８及びＴａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．１９９２ ＰＮＡＳ ８９：８９２８を参照されたい。

【1331】

簡潔に言えば、均一に１３Ｃ及び１５Ｎ濃縮したチミジン［Ｕ－１３Ｃ，１５Ｎ－ＴｄＲ］をＭａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）から入手し、及び３Ｈ－ＴｄＲ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をＩＣＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から購入する。培地及び緩衝液はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から入手する。ホスホジエステラーゼを除く全ての酵素はＢｏｅｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からのものである。ホスホジエステラーゼＩＩはＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）から入手する。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）溶媒はＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）からのものであり、含まれる蒸発残留物質は＜０．１ｐｐｍの蒸発残留物質であった。

【1332】

本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。培養後、チミジン取込みアッセイで使用するため細胞を回収する。

【1333】

最終チミジン濃度が１μＭに達するように非濃縮チミジンを添加して、細胞を１．６μｇ／ｍｌの［Ｕ－１３Ｃ，１５Ｎ］－ＴｄＲで１８時間標識する。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、補足ＤＭＥＭで６時間以上培養してから３Ｈ－ＴｄＲを指示濃度（０．１～１０μＣｉ／ｍｌ）で加え、さらに１８時間インキュベートする。この試料に非標識チミジンを加えて最終チミジン濃度を０．１３μＭにする（これは、１０μＣｉ放射性標識／ｍｌを受ける試料中の３Ｈ－ＴｄＲ濃度と均等である）。３Ｈ－ＴｄＲの除去後、補足ＤＭＥＭ中で細胞をさらに６～５４時間インキュベートした後、ＤＮＡを単離する。

【1334】

ＤＮＡは、改良Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して抽出する。試料中の細胞の数に基づき、スケールアップ／スケールダウン手順を用いて添加試薬容積を決定する。例えば、１×１０^７個の細胞を使用する場合、３２８μｇのプロテイナーゼＫを含有する２１μｌが３ｍｌの細胞溶解物溶液に加えられる。混合後、試料を室温に一晩放置する。翌日、１０μｇのＲＮアーゼを加え、試料を混合し、３７℃で２時間インキュベートする。タンパク質沈殿溶液（１ｍｌ）を加え、試料を氷上で５分間インキュベートする。２０００ｇで１０分間遠心した後、ＤＮＡを含有する上清を３ｍｌの１００％２－プロパノールと混合し、５０回、又はＤＮＡの白色の糸が見えるようになるまで、穏やかに反転させる。次に試料を２０００ｇで５分間遠心する。得られたＤＮＡペレットを５分間乾燥させた後、３ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、再び２０００ｇで５分間遠心する。この最終ペレットを風乾させ、次に脱イオン化Ｈ２Ｏで再水和さて、２６０ｎｍの吸光によって定量化する。複製対照として、ＣＤ３４＋幹細胞に同じ手順を適用する。

【1335】

３分間煮沸することによりＤＮＡを全て変性させて、次に氷上で急速に冷却する。０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度で酵素加水分解手順を実施する。以下のプロトコルは、ＤＮＡ溶液１ミリリットル当たりに加える試薬容積を記載する。ＤＮＡは、２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＺｎＣｌ２、及び１Ｍトリスを含有する１０μｌの緩衝液、ｐＨ７．２中の１０μｌのヌクレアーゼＰ１（０．５Ｕ／μｌ）及び５μｌのＤＮアーゼＩ（４Ｕ／μｌ）によって４５℃で２時間加水分解し、続いて２０μｌホスホジエステラーゼ（４ｍＵ／μｌ）を加え、３７℃で２時間さらにインキュベートする。最後に、５μｌの１０Ｍ 酢酸アンモニウム（ｐＨ９．０）及び１０μｌのアルカリホスファターゼ（１Ｕ／μｌ）を加え、試料を３７℃でさらに２時間インキュベートする。

【1336】

消化したＤＮＡ試料を０．２２μｍナイロンフィルタでろ過する。この試料をＨＰＬＣ／ＣＲＩ／ＩＲＭＳシステムで、４．６×２５０ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ－１８－Ｓ ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ）を使用して分析する。同じ溶媒系を１ｍｌ／分及び５％～２５％ Ｂの直線勾配で１５分間使用する。

【1337】

ＨＰＬＣによって分離した後、化学反応界面質量分析法（ＣＲＩＭＳ）を用いてデオキシヌクレオシドを分析する。この方法では、ヘリウム流によって駆動される噴霧及び脱溶媒和系にデオキシヌクレオシドが流れ込み、そこでデオキシヌクレオシドは乾燥粒子ビームとして現れる。このインライン生成されたＣＯ２からの１３ＣＯ２／１２ＣＯ２存在量が、Ｆｉｎｎｉｇａｎ／ＭＡＴ Ｄｅｌｔａ Ｓ同位体比質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及びそれに付属するＩｓｏｄａｔデータシステムで決定される。５－フルオロデオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）が内部同位体比標準として使用される。

【1338】

各試料から３個のヌクレオシド：Ｔ、ｄＡ、及びｄＧの同位体比（以下の式中ではＩＲ）を得る。各ＤＮＡ由来デオキシヌクレオシドから生じるＣＯ２濃縮は、式（１３）ＣＯ２（１ｍｉｌ当たり）＝１０００×（ＩＲ実験－ＩＲ標準）／ＩＲ標準によって計算される。最も高いレベルの内部均一性を維持し、且ついかなる実験間のずれも回避するため、全ての実験についてＴの同位体比からｄＧの同位体比を減じる。安定同位体標識期間の終わり（０日目）からウォッシアウトの終わり（３日目）までのデータを評価する。

【1339】

実施例４４：核物質の定量化
ＤＮＡを含有する混合集団中の細胞の数を、ＤＮＡ染色剤ＤＲＡＱ５（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用したフローサイトメトリーによって評価する。細胞を染色剤と共に製造者の指示に従いインキュベートし、フローサイトメーター、例えばＡｔｔｕｎｅサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析する。所定の核物質含量閾値を上回る細胞の割合を定量化する。

【1340】

実施例４５：インビトロ腫瘍原性アッセイ
細胞の複製能を評価するには、軟寒天コロニー形成アッセイを実施することができる。端的には、０．５％寒天＋１×ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ溶液を作ることによって基本寒天層が作り、全成分を４０℃に加温し、１．５ｍＬのこの溶液を３５ｍｍペトリ皿に加える。使用前にこの寒天を室温で３０分間凝固させる。

【1341】

０．７％アガロースを電子レンジで融解させて４０℃に冷却することにより、上層アガロースを調製する。２×ＲＰＭＩ＋２０％ＦＣＳ溶液を４０℃に加熱する。細胞をカウントし、２００，０００細胞／ｍＬの密度で１プレート当たり５０００細胞でプレーティングするように調製する。１０ｍＬチューブに０．１ｍＬの細胞懸濁液を加え、続いて３ｍＬの温かい０．７％アガロース及び３ｍＬの温かいＲＰＭＩ／ＦＣＳ溶液を加える。この溶液を静かにかき回して混合し、３つ又は４つのレプリケート基本寒天プレートの各々に加える（１．５ｍＬ）。

【1342】

プレートを加湿インキュベーターにおいて３７℃で１０～３０日間インキュベートする。週１～２回、細胞に０．７５ｍＬ／プレートの細胞培養培地を供給する。

【1343】

コロニー形成を評価するため、プレートを０．５ｍＬの０．００５％クリスタルバイオレットで１時間超染色する。解剖顕微鏡を使用してコロニーをカウントする。

【1344】

実施例４６：インビボ腫瘍原性アッセイ
最終分化した培養赤血球系細胞を様々な動物モデルに移植して潜在的な腫瘍原性を評価する。様々なモデルから幾つかの組織を採取し、組織学的、免疫化学的、及び蛍光アッセイで分析して腫瘍原性を定量化する。

【1345】

動物には、移植２日前から開始して毎日ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｏｖａｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ、Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ）の腹腔内注射を投与する。ＮＫ細胞を枯渇させるため、一部のラットには、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＣｓＡ腹腔内注射に加え、抗ＮＫＲ－Ｐ１Ａ（クローン１０／７８、マウスＩｇＧ_１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はそれぞれのアイソタイプ対照（クローンＰＰＶ－０６、マウスＩｇＧ_１、Ｅｘｂｉｏ、Ｐｒａｇｕｅ、チェコ共和国）を投与する。抗ＮＫＲ－Ｐ１Ａ ｍＡｂ（クローン１０／７８）はｍＡｂ（クローン３．２．３）と同じエピトープを標的にする。赤血球系細胞の注射前日に１ｍｇのそれぞれの抗体を投与し、続いて細胞移植後４日目に０．５ｍｇを投与する。

【1346】

これらの実験の開始前、赤血球系細胞移植後０日目及び４日目、及び剖検時（９２日目）に血液試料を採取し、フローサイトメトリーによって血中のＮＫ細胞の割合を決定する。皮下腫瘍成長の分析のため、１００μｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の赤血球系細胞を動物の側腹部に注射する。腫瘍成長を触診によって１日おきにモニタし、直尺ノギスを使用してサイズを記録する。１００日目より前にマウスで１ｃｍ^３及びラットで５ｃｍ^３の腫瘍容積に達した場合、１０％より多い体重減少が生じた場合、又は任意の疼痛又は苦痛の行動的徴候が観察された場合には、動物を犠牲にする。全ての動物の剖検を実施する。

【1347】

注射部位近傍のマウス組織を液体窒素で直ちに凍結し、又はリン酸緩衝４％ホルマリン中に１６時間置き、次にパラフィンに包埋する。続く免疫学的分析のため脾臓及びリンパ節を摘出する。片側性６－ＯＨＤＡ病変ラットの線条体への赤血球系細胞の移植を実施する。これらの動物は移植後６週間で犠牲にする。

【1348】

動物組織をフローサイトメトリーによって分析する。切除した組織試料に、ＣＤ１３３、ＣＤ３、ＣＤ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ４４、ＣＤ２４、及びＣＤ１３３の確立された癌細胞バイオマーカーに対する適切な蛍光抗体及びＰＥコンジュゲート抗体を加え、分析して潜在的な腫瘍原性を定量化する。

【1349】

実施例４７：ＥＫＴＡによる変形能
本明細書に記載されるとおり培養した赤血球系細胞を、変形能特性に関してエクタサイトメトリーによって天然赤血球試料と比べて評価する。

【1350】

エクタサイトメーターは、２つのシリンダ間にある粘性流体中に懸濁された赤血球の回折像を生じさせるために使用されるヘリウム－ネオンレーザーと組み合わされたクエット型粘度計からなる。粘度計が回転すると、正常な赤血球はせん断場で伸長し、そのため回折像が楕円になる。回折パターンの長軸（Ａ）及び短軸（Ｂ）に沿った光の強度を定量化し、且つそれを比（Ａ－Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）、変形能指数（ＤＩ）又は伸び指数（ＥＩ）として表すことにより、この像の楕円率が計測される。媒体の粘度は、最も高密度の赤血球系細胞の内部粘度より高くなるように選択される。蒸留水中のＫ２ＨＰ０４及びＫＨ２Ｐ０４で構成される０．０４Ｍのリン酸緩衝液中のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ｍｗ＝３６０，０００の３１ｇ／リットル溶液は、２５℃で０．２０ポアズ及び３７℃で１２ポアズの粘度を生じる。

【1351】

容量オスモル濃度はＮａＣｌで所望のレベルに調整し、ローブリング凝固点浸透圧計で計測する。最終的なｐＨは、ＮａＯＨ及びＨＣＩの１Ｍ溶液を少量加えることにより変更し、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ ＢＧ Ｉ１血液ガスアナライザーで計測する。ストック溶液に保存剤としてナトリウムアジドを０．４ｇ／ｌとなるように加える。

【1352】

エクタサイトメーターは赤血球系細胞試料から３つの主要な尺度；重量オスモル濃度最小値（Ｏ_ｍｉｎ）、変形能指数（Ｄｉ_ｍａｘ）、及びＤＩがその最大値の半分に達する重量オスモル濃度（Ｏ_ｈｙｐ）を収集し、それらを天然赤血球と比較する。

【1353】

Ｏ_ｍｉｎは、細胞の表面積対容積比に関係し、古典的浸透圧脆弱性試験における５０％溶血点に等しいことが分かっている。

【1354】

Ｄｉ_ｍａｘは、変形能指数の最大値であり、通常２９０ミリオスモル（生理学的重量オスモル濃度値）で達する。これはずり応力下の細胞の最大変形能を示し、多くの因子、例えば、表面積、容積、内部粘度、及び細胞膜の機械的特性に関係する。

【1355】

Ｏ_ｈｙｐは、ＤＩがその最大値の半分に達するときの重量オスモル濃度である。これは曲線の高浸透圧部の位置の指標を提供し、これは細胞の内部粘度並びに膜の機械的特性、例えば膜が力を受けてどの程度曲がるか（剛性）に関係する。

【1356】

培養赤血球系細胞に関して得られるパラメータを、初代赤血球系細胞の同じ値と比較する。

【1357】

実施例４８：ＬＯＲＣＡによる変形能
精製ｃＲＢＣ集団の変形能をレーザー回折法（ＬＯＲＣＡ、レーザー支援旋光セルアナライザー、Ｒ＆Ｒ Ｍｅｃｈａｎｏｔｒｉｃｓ）によって計測する。端的には、細胞の高度希釈懸濁液を、２つのシリンダ間が０．３ｍｍ間隙の、シリンダの一方が回転してずり応力を生じさせることが可能なクエットシステムでせん断する。レーザービームが懸濁液を通過し、３７℃で回折パターンが計測される。低ずり応力では細胞は円板であるが、一方、高ずり応力では細胞は楕円になる。細胞変形能は伸び指数（ＥＩ）を単位として表され、ＥＩは変形細胞の楕円率に依存する。１２．５ｕＬのペレット化したＲＢＣペレットを含有するアリコートを５ｍＬのポリビニルピロリドン溶液（分子量３６００００）に希釈する。種々のずり応力における試料間での比較を容易にするため、３０ＰａにおけるＥＩ値（ＥＩｍａｘと称される）及び３ＰａにおけるＥＩ値が変形能の代表値として選択される。

【1358】

実施例４９：血管閉塞の評価 － エキソビボラット血管系
赤血球系細胞の血管閉塞の可能性は、当該技術分野において公知の方法を用いて単離人工灌流ラット血管系で評価することができる。例えば、Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７２：２２を参照されたい。簡潔に言えば、ウィスター系の麻酔下（ペントバルビトール（ｐｅｎｔａｂａｒｂｉｔｏｌ）ナトリウム３０ｍｇ／ｋｇ）ラット、１２０～１５０ｇにおいて、右回結腸動脈及び静脈を、回結腸接合部から３ｃｍ離れた部位でヘパリン添加（１００ｕＬ／ｍＬ）シラスティックチュービングによってカニューレ挿入する。１％ウシ血清アルブミンを含有するリンゲル液による定常状態の灌流下で、上行結腸及び回腸末端（各３ｃｍ）を結紮間で区切る。全ての血管接続部の止血結紮を達成した後、組織を単離する。顕微鏡ステージ上の光学的に透明なルーサイトブロックに単離虫垂間膜を穏やかに広げる。カニューレの出口及び顕微鏡対物レンズを除き、調製物全体をプラスチックサランラップ（登録商標）で被覆する。

【1359】

対照動脈灌流圧力（Ｐｐａ）及び静脈流出圧力（Ｐｖ）はそれぞれ８０及び３．８ｍｍＨｇに一定に保ち、Ｓｔａｔｈａｍ－Ｇｏｕｌｄ Ｐ－５０圧力トランスデューサー（Ｓｔａｔｈａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｏｘｎａｒｄ ＣＡ）によってモニタする。静脈流出量（Ｆｖ）は光電式滴数計を使用してモニタし、ｍＬ／分単位で表す。１０～１２分の経過によって組織を平衡させ、Ｆｖを安定化させる。宿主血液細胞を含まない、且つ４．６±０．５（平均値±ＳＤ）の一定のＦｖを有する虫垂間膜微小血管系を呈する調製物のみを使用する。実験は３７℃で行う。

【1360】

赤血球系細胞を本明細書に記載されるとおり単離する。Ｐｐａ及びＦｖの対照計測後、動脈カニューレ挿入部位より１５ｃｍ遠位の注入ポートから赤血球系細胞（０．２ｍＬ、Ｈｃｔ３０％）を穏やかに送り込み、Ｐｐａ及びＦｖの変化をＧｒａｓｓポリグラフ（Ｇｒａｓｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ，Ｑｕｉｎｃｙ ＭＡ）のストリップチャートに記録する。組織調製物は試料注入前にリンゲル溶液で１０～１５分間灌流して組織を安定させ、血管系から宿主動物の残存血液細胞を取り除く。細胞の注入後に生じた閉塞は、血管系を高圧（１００ｍｍＨｇ）の完全酸素化リンゲル溶液で短時間（２～３分）灌流することによって除去し、流れを回復させ得る。

【1361】

各実験の終わりに組織調製物の全体（カニューレ及び管腔内容物は含まない）を秤量する。末梢抵抗単位（ＰＲＵ）を計算し、ＰＲＵ＝ΔＰ／Ｑ＝ｍｍＨｇ／ｍＬ／（分－ｇ）（式中、ΔＰ（ｍｍＨｇ）は動静脈圧力差であり、及びＱ（ｍＬ／分－ｇ）は組織１グラム当たりの静脈流出量である）として表す。

【1362】

各実験において、試料のボーラス注入後に圧力流回復時間（Ｔｐｆ）を決定する。Ｔｐｆは、所与の試料の送達後にＰｐａ及びＦｖがベースライン値に戻るまでにかかる時間（秒）として定義され、全虫垂間膜血管系にわたる総通過時間に相当する。培養赤血球系細胞について得られるパラメータ値を初代赤血球系細胞について得られる値を比較する。

【1363】

実施例５０：血管閉塞の評価 － インビトロフローチャンバ
漸進的高さのインビトロフローチャンバを使用して赤血球系細胞の血管閉塞を評価する方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ ２００４，Ｂｌｏｏｄ １０４（１２）：３７７４を参照されたい。

【1364】

簡潔に言えば、漸進的高さのフローチャンバを使用して内皮細胞（ＥＣ）に対する赤血球系細胞の付着を定量化する。ＥＣで被覆されたスライドを、予め３７℃に加温した１．２６ｍＭ Ｃａ２＋、０．９ｍＭ Ｍｇ２＋含有ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で洗浄し、次に可変高さのフローチャンバに入れる。フローチャンバを、３７℃に設定したサーモプレート（ｔｈｅｒｍｏｐｌａｔｅ）（東海ヒット、富士宮市、日本）に接続した倒立位相差顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ；Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）のステージにマウントする。顕微鏡に取り付け、且つＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ４コンピュータ（Ａｐｐｌｅ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ）に接続したビデオカメラ（ＲＳ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）を使用して、細胞を観察する。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養し、蛍光色素ＰＫＨ ２６赤色蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ）で製造者の指示に従い標識する。Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋含有ＨＢＳＳ中に０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で懸濁した細胞（３ｍＬ）をフローチャンバに注入し、フロー無しで１５分間スライドに付着させる。フローに曝露する前に、フローの行く手に垂直な方向の線に沿った７つの異なる位置の各々にある最低３つのフィールドについて、蛍光細胞の総数を調べる。次に目盛り付きシリンジポンプを使用して流体フロー（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋含有ＨＢＳＳ）を開始する。フローに曝露した後、フィールドを再び調べ、付着細胞の数をカウントする。付着細胞の割合は以下のとおり表される：フローへの曝露後に付着した細胞の数／フロー前に各フィールドに存在した細胞。壁ずり応力は以下のとおり計算される：τｗ＝（６μＱ）／（ｗＨ［ｘ］２）、式中、τｗは壁ずり応力（ダイン／ｃｍ２）を示し；Ｑ、体積流量（ｃｍ３／ｓ）；μ、媒体粘度；ｗ、フローチャネルの幅；及びＨ（ｘ）、顕微鏡スライドに沿った位置の関数としてのフローチャンバの高さを示す。

【1365】

実施例５１：血管閉塞の評価 － 生体顕微鏡法
生体顕微鏡法を使用して赤血球系細胞の血管閉塞を評価する方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｚｅｎｎａｄｉ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｂｌｏｏｄ １１０（７）：２７０８を参照されたい。

【1366】

簡潔に言えば、１００ｍｇ／ｋｇケタミン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）及び１０ｍｇ／ｋｇキシラジン（Ｂａｙｅｒ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）の腹腔内注射によって被験動物の全身麻酔を得る。層流フードを使用して無菌条件下で両面チタンフレームウィンドウチャンバを背面皮下脂肪に外科的に植え込む。手術には、背面皮下脂肪の片側の表皮層及び真皮層を慎重に取り除くこと、反対側の皮下脂肪の横紋筋に隣接する皮下組織の血管を露出させること、次にチャンバの２つのサイドをステンレス鋼ネジ及び縫合糸を使用して皮膚に固定することが含まれる。チャンバにガラスウィンドウを置いて露出した組織を覆い、スナップリングで固定する。続いて、手術の３日後にインビボ研究を実施するまで、動物を３２℃～３４℃に保つ。

【1367】

ウィンドウチャンバを有する麻酔下の動物をＡｘｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）のステージに置く；体温はサーモスタット制御式加熱パッドを使用して３７℃に維持する。全ての注入は背側尾静脈からとする。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。次に細胞をＤｉｌ又はＤｉＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）色素で製造者の指示に従い標識する。標識した細胞（３００μＬ；Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有ＰＢＳ中ヘマトクリット［Ｈｃｔ］０．５０［５０％］）を注入し、ＬＤ Ａｃｈｒｏｐｌａｎ ２０×／０．４０Ｋｏｒｒ及びＦｌｕａｒ ５×／０．２５対物レンズを使用して皮下血管のＲＢＣ付着及び血流動態を少なくとも３０分間観察する。デジタルビデオカメラＣ２４００（浜松ホトニクス株式会社、浜松市、日本）に接続したＴｒｉｎｉｔｒｏｎカラービデオモニタ（ＰＶＭ－１３５３ＭＤ；ソニー、東京、日本）及びＪＶＣビデオカセットレコーダー（ＢＲ－Ｓ３７８４；ＶＣＲ Ｋｉｎｇ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用して微小循環イベント及び細胞付着を同時に記録する。各条件セットについて細静脈の３０区間を調べる。細動脈と細静脈の区別は、（１）狭まる流れとは対照的な広がる流れの観察；（２）細動脈血管平滑筋に特有の、透光法を使用したときの血管壁の複屈折像；及び（３）明らかな蛇行のない比較的直線的な血管軌道に基づき行われる。

【1368】

赤血球流束及び付着の計測は、２０倍の拡大率を使用して作成したビデオテープ調べることによって実施する。細胞付着は、血管壁に付着して１分間動かない細胞を考慮して定量化する。ＳＳ ＲＢＣによって占有される、最大２５μｍ又は２５μｍより大きい直径の血管の長さの割合は、以下のとおり定量化する：ＳＳ ＲＢＣによって占有される％細静脈長さ＝（付着細胞を有する血管壁の長さ／分析する血管区間の全長）×１００。ＲＢＣ流束の変化は、以下のとおり計算する：流束＝直径５０μｍ未満の血管上に印された単一の点を通る毎分循環蛍光ヒトＲＢＣの数。

【1369】

実施例５２：血管閉塞の評価 － 血小板
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して血小板の血管閉塞を評価する方法は、赤血球に関する同様の方法を適用することができる。簡潔に言えば、２ｍＬ容積の０．０５％ヘマトクリット懸濁液を組織培養ペトリ皿上のコンフルエントなＨＵＶＥＣに加える。血小板を加えて１分以内にコーンアンドプレート器具を組み立て、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ－ＴＭＤ倒立位相差顕微鏡（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）に置く。モータを始動させてコーンを回転させ、０．１又は１ダイン／ｃｍ２のずり応力で３０分間、付着を継続的にモニタする。温度は、付着器具に吹き付けるエアカーテンインキュベーター（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって３７℃に一定に維持する。血小板付着を可視化し、５分毎に、各時点各視野につき８つの異なる視野に２０秒間焦点を合わせることにより記録する。実験全体はＣＣＤ－７２シリーズカメラ（Ｄａｇｅ－ＭＴＩ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ、ＩＮ）によって４００倍の総倍率下で観察し、ＳＶＯ ２０００ビデオカセットレコーダー（Ｓｏｎｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でビデオテープに記録する。各実験終了時に、記録したビデオ画像を手動再生する間に個々の付着細胞をカウントすることにより、付着をオフラインで定量化する。各時点につき８つの視野の細胞数を平均し、内皮１平方ミリメートル当たりの付着赤血球に対して正規化する。

【1370】

実施例５３：共振器による質量／容積／密度の評価
Ｂｒｙａｎ ｅｔ ａｌ，ＬａｂＣｈｉｐ，２０１４に基づきデュアル懸濁マイクロチャネル共振器（ＳＭＲ）システムを使用して最終分化型赤血球系細胞集団の質量、容積、及び密度を特徴付ける。細胞密度計測の開始時、初めにシステムをＰｅｒｃｏｌｌろ過媒体でフラッシュし、これが高密度流体としての役割を果たす。次に、試料バイパスに希釈細胞試料を充填し、試料入口及び出口のバイアル高さを調整して流体フローが最初のＳＭＲに入るように導く。高密度流体入口の圧力が流体２の密度を設定するために使用され、廃棄物出口の圧力が装置における全体の流速を制御する。より重い細胞が試料バイアル又はチュービングの底に沈降することに起因してサイズバイアスがかかる可能性を最小限に抑えるため、一定の間隔で試料バイパスチャネルをフラッシュすることにより、新鮮な試料を導入する。ＬａｂＶＩＥＷによってデータを取得し、ＭＡＴＬＡＢで処理する。

【1371】

コールターカウンターを使用して細胞濃度をモニタする。５×１０^５～１×１０^６細胞／ｍｌに成長させた培養物で細胞計測を実施する。第２のＳＭＲに計測用に導入される高密度流体は、５０％（ｖ／ｖ）Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ）、１．３８％（ｗ／ｖ）粉末状Ｌ１５媒体（Ｓｉｇｍａ）、０．４％（ｗ／ｖ）グルコース、１００ＩＵペニシリン、及び１００μｇｍＬ－１ストレプトマイシンの溶液として配合する。媒体のｐＨを７．２に調整する。このＰｅｒｃｏｌｌ媒体は４℃に保存し、使用直前にデュアルＳＭＲでろ過する。

【1372】

実施例５４：アネキシンＶによるホスファチジルセリン含量の評価
本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有するリンゲル溶液中で５０μＬ細胞懸濁液を洗浄し、次にこの溶液中のアネキシン－Ｖ－ＦＩＴＣ（１：２００希釈；ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ、Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって遮光下３７℃で２０分間染色する。細胞を洗浄し、本明細書に記載されるとおりフローサイトメトリーによって染色し、４８８ｎｍの励起波長及び５３０ｎｍの発光波長でアネキシン－Ｖ蛍光強度を計測する。アネキシン－Ｖ蛍光から相対ホスファチジルセリン露出を評価する。

【1373】

実施例５５：クロマトグラフィーによる脂質含量の評価
抗酸化剤ＢＨＴ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、室温でメタノール－クロロホルム１：１によって３回抽出することにより、洗浄した合成膜－レシーバー複合体から脂質を抽出する。プールした抽出物を、Ｆｏｌｃｈ，Ｌｅｅｓ ａｎｄ Ｓｌｏａｎｅ Ｓｔａｎｌｅｙ１９５７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２２６：４９７の方法において０．０５Ｍ ＫＣｌで洗浄する。簡潔に言えば、最初の抽出については、遠心管内の洗浄した複合体に０．０５ｍｇ／ｍＬ ＢＨＴ含有１５ｍＬメタノールを加え、沈降物を散らせるため時折撹拌しながら３０分間静置する。次に１５ｍＬのクロロホルムを加え、凝集塊を散らせるため時折撹拌しながら混合物を３０分間静置する。チューブを１５００ｇで５分間遠心し、上清画分をＴｅｆｌｏｎ活栓付きの分液漏斗にデカントする。２回目及び３回目の抽出も同様に、１５ｍＬのメタノール－ＢＨＴを残渣に加え、続いて１５ｍＬのクロロホルムを加えて実施し、但し毎回加えた後に抽出物は時折撹拌しながら１０分間だけ静置する。遠心後、上清画分を分液漏斗にプールし、次に４８ｍＬのクロロホルム及び２８ｍＬの０．０５Ｍ ＫＣｌを加え、混合する。この混合物を４℃で一晩暗所に静置して相分離させる。再び室温に加温した後、２つクリアな相の下の方を回収し、ロータリー真空エバポレーターにおいて真空中４０℃で蒸発乾固させる。脂質をクロロホルムと共に定量的に１０ｍＬメスフラスコに移し、－２２℃で保存する。

【1374】

脂質抽出物中の遊離コレステロールの濃度は以下のとおり決定する。ヘキサン－ジエチルエーテル－氷酢酸８０：２０：１中のシリカゲルＨＲ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｎ．Ｙ．）の０．５ｍｍ層で脂質抽出物をクロマトグラフ処理し、２，７－ジクロロフルオレセイン溶液（下記参照）をスプレーすることによりＴＬＣプレートを染色し、遊離コレステロールスポットをコニカル遠心管に剥がし取り、２．０ｍｌのクロロホルムで１回及び１．０ｍｌのクロロホルムで３回抽出し、抽出物をロータリー真空エバポレーターにおいて真空中４０℃で蒸発乾固させ、鹸化を含まないＭａｎｎ １９６１ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ７：２７５の塩化第二鉄方法によってコレステロールを推定する。二臭化物誘導体を用いた単離（例えば、Ｆｉｅｓｅｒ Ｊ Ａｍｅｒ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １９５３ ７５：５４２１を参照）によって市販の認可試薬グレード材料から調製した遊離コレステロール標準をクロマトグラフ手順で取り、一組の決定毎に推定する。遊離コレステロール値は、標準の回収率（これは平均して９５％である）に対して決定毎に補正する。ＴＬＣはＢＨＴを取り除く必要があり、取り除かない場合にはＢＨＴが５６０ｎｍを吸収する褐色の産物を生じて塩化第二鉄方法を妨害する。

【1375】

クロマトグラフィー中の自動酸化を防止するため５０ｍｇ／１００ｍｌの濃度のＢＨＴを加えたクロロホルムメタノール－氷酢酸－水２５：１５：４：２中、シリカゲルＨＲ、０．５ｍｍ厚上４℃の全脂質抽出物のアリコートのＴＬＣによってリン脂質分布をトリプリケートで決定する；このＴＬＣプレートを水で調製する（「中性」プレート）。「くさび形先端法」を用いてプレートの基点に脂質試料を適用すると（Ｓｔａｈｌ １９６５ Ｔｈｉｎ－Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．を参照）、個々のリン脂質の優れた分離がもたらされる。詳細には、この方法は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、レシチン、及びスフィンゴミエリンの間の完全な分離をもたらす；ある特徴的なスポットがＰＳとレシチンとの間に移動し、これがホスファチジルイノシトール（ＰＩ）として同定される。これらのスポットは、２，７－ジクロロフルオレセインの溶液（３３．３ｍｇ／１００ｍｌの２ｍＭ ＮａＯＨ水溶液）をスプレーすることにより紫外光下で可視化され、次にＫｒａｍｅｒ－Ｇｉｔｔｌｅｍａｎチューブに直接剥がし取り、ここでリン脂質を１．０ｍｌの７０％過塩素酸によって１９０℃で６０分間消化する。残りの手順を上記に記載したとおり実施し、但し発色後、３０００ｇで５分間遠心することによりシリカゲルは取り除き、澄明な上清溶液で吸光度を決定する。ブランクレーンの対応する領域の吸光度に対して補正を行う。

【1376】

Ｇａｓ－Ｃｈｒｏｍ Ｐ、１００－１２０メッシュ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）上のＥＧＳＳ－Ｘ（シリコーンと組み合わせたコハク酸エチレングリコールポリエステル）８％の対の８ｆｔカラム及びデュアル水素炎イオン化検出器を備えたＢａｒｂｅｒ－Ｃｏｌｍａｎ機器、モデル５０００によって、ヘキサン溶解試料でガス－液体クロマトグラフィーを実施する。窒素流量は入口で５０ｍｌ／分である。カラム温度は試料注入後１６５℃に１０分間維持し、次に２℃／分で２００℃まで増加させる。

【1377】

実施例５６：膜粘度の評価
細胞の集団の膜粘度は、蛍光退色アッセイによって評価することができる。赤血球系細胞の０．５ｍｌ試料を収集し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（１３２ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、２．０ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に調整）で１回洗浄する。次にこの濃厚血球を１４５ｍＭ ＮａＣｌ－１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５で１回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌ ＤＴＡＦ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏから入手）を含有する同じ緩衝液に再懸濁する。細胞を氷上で１時間インキュベートし、次に５０ｍＭグリシン－９５ｍＭ ＮａＣｌ－１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．５で２回洗浄して、タンパク質に共有結合的に結合しなかった色素を全て取り除く。最後に、細胞を２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン含有ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中の－２％ヘマトクリットに再懸濁する。対照陰性赤血球にも同じ処理を適用する。

【1378】

落射式蛍光顕微鏡法用に装備されたＬｅｉｔｚ Ｄｉａｖｅｒｔ（Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ、ＮＪ）倒立顕微鏡のステージにフローチャンバをマウントする。ダイクロイックミラー及び励起／発光フィルタは、励起波長が範囲４５０～４９０ｎｍの、フルオレセイン色素（Ｌｅｉｔｚ記号１２）で使用される標準的な組み合わせである。対物レンズは１００倍倍率及び１．２５開口数の油浸型である。適切な動力源及びハウジング（Ｏｒｉｅｌ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を有する１００ワット高圧水銀アークランプ（Ｏｓｒａｍ、Ｍｕｎｉｃｈ）が蛍光励起源としての役割を果たす。

【1379】

コンピュータ制御式電子シャッター（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）が曝露時間を制限し、蛍光強度の計測用光子計数電子システムと同期する。入射光イルミネーターの視野絞りを使用して励起を直径２０～４０ｕｍの円形範囲に制限する。一定の間隔で、コンピュータからの出力パルスが２０ｍｓの典型的な持続時間にわたりシャッターを開放する。短時間蛍光像からの光は一連のプリズムで分割され、従って光の半分は低光量ＳＩＴビデオカメラ（モデル６６－ＳＩＴ、Ｄａｇｅ－ＭＴＩ、ＭｉｃｈｉｇａｎＣｉｔｙ、ＩＮ）に送られ、及び半分は周囲温度ハウジングに囲まれた光電子増倍管（モデル８８５０、ＲＣＡ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ、ＮＪ）に送られる。電子シャッターが開放している時間中、ビデオ画像プロセッサ（モデル７９４、ＨｕｇｈｅｓＡｉｒｃｒａｆｔ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が作動して蛍光像を取得し、ビデオスナップショットが提供され、それをモニタすることにより、対象に焦点が合ったままであり、視野に異物が侵入していないことを確認し得る。ビデオキャリパーでビデオスクリーン上の距離を計測し、ステージマイクロメートルのビデオ画像との比較によってキャリブレーションする。シャッターが開放している時間中はまた、光電子増倍管信号が光子計数法で処理される。増幅器／弁別器（モデルＡＤ６、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）が所与の大きさを上回る各信号パルスのデジタル論理パルスを生成し、それらのデジタルパルスを１００ＭＨｚゲートカウンター（モデル７７０、ＥＧ＆Ｇ Ｏｒｔｅｃ、ＯａｋＲｉｄｇｅ、ＴＮ）でカウントする。マイクロコンピュータが光子カウントのゲーティング、リセット、及び記録を制御する。

【1380】

典型的な実験は、励起光の短時間（２０ミリ秒）パルスの間に行われる複数回の予備的蛍光計測と、続いて試料細胞を退色させる長い照射期間（典型的には３０秒）と、続いて１５～３０秒毎の、蛍光が回復し終えたように見えるまでのさらなる一連の短時間曝露とからなる。

【1381】

培養赤血球系細胞について得られる回復時間及び他のパラメータ値を、初代赤血球系細胞について得られる同じ値と比較する。

【1382】

実施例５７：Ａｄｖｉａ血液アナライザーによる平均赤血球容積の評価
Ａｄｖｉａ １２０血液アナライザー（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において電気インピーダンスを使用して培養赤血球系細胞の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を計測する。その結果を天然ヒト赤血球と比較する。

【1383】

実施例５８：培養赤血球系細胞の病原体検査
ＲＴ－ＰＣＲを用いて培養赤血球系細胞集団における外来性ウイルスの存在を定量化し、非汚染を確認する（アッセイ番号００３０００．ＢＳＶ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ）。未処理バルク及び最終バルク、最終バイアル、貯蔵前細胞、並びに細胞及びウイルスバンクの無菌検査を、それぞれ好気性及び嫌気性細菌の成長を支持する２つの異なる種類の培地に赤血球集団を直接接種することにより実施する。試料を１４日間インキュベートし、続いてＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ無菌試験プロトコルＵＳＰ ７１に従い汚染微生物に関して試験する。

【1384】

実施例５９：浸透圧脆弱性の評価
低張液に曝露されたときの赤血球系細胞の溶解に対する抵抗性を計測するため、浸透圧脆弱性を評価する。０％～１％にわたる濃度でＮａＣｌ水溶液を作製した。これらの塩溶液の各々で細胞を１５分間インキュベートした。試料を遠心してインタクトな細胞をペレット化した。分光光度計を使用して５４０ｎｍの光の吸収によるヘモグロビン含量に関して上清をアッセイした。５０％溶血が起こる点を計算し、初代赤血球について得られる値と比較する。

【1385】

実施例６０：ロゼット形成／免疫原性の評価
クームス試験としても知られる直接抗グロブリン試験は、血清のポリクローナル抗体が細胞の表面抗原に結合することにより引き起こされる赤血球系細胞の凝集又はロゼット形成を評価する。これは、一般的な同種免疫原性評価のためのヒトプール血清で行うか、又は特定の免疫原性予測のための意図されるレシピエントの血清で行うことができる。

【1386】

端的には、ＥＤＴＡチューブに保存された細胞１～２滴を反応チューブに加える。このチューブを等張生理食塩水で３回洗浄する。３回目の洗浄後、洗浄した細胞から３％懸濁液を調製する。２本のチューブ名をＡ及びＢとする。洗浄した３％懸濁液の１滴を各チューブに加える。これらのチューブをもう一回洗浄する。デカントするとき、細胞ボタン（ｃｅｌｌ ｂｕｔｔｏｎ）が上になるようにチューブを位置決めする。これにより洗浄プロセスで細胞が過剰に多く失われることが防止される。ウェルを排水し、バイオワイプで拭き取って乾燥させる。直ちに両方のチューブに１滴のヒト被検血清を加え、振盪して混合する。Ｂチューブを室温で５分間インキュベートしておく。セロフュージでのクームススピン用にキャリブレーションした時間にわたりＡチューブを遠心する。直ちに穏やかに再懸濁し、ライト付き凝集観察器（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して凝集を調べる。Ａチューブが陽性である場合、Ｂチューブを読む必要はなく、またＡチューブを顕微鏡で調べる必要もない。Ａチューブがライト付き凝集観察器によって陰性である場合、顕微鏡下で凝集に関して調べる。顕微鏡の読み取りでＡチューブが陰性である場合、Ｂチューブをそのインキュベーション期間後に遠心し、Ｂチューブ試料でステップ２～４を繰り返す。さらにＢチューブも陰性である場合、チューブに１滴のＩｇＧ被覆クームス対照細胞（チェック細胞）を加えて遠心する。凝集を調べる。この段階で凝集が存在するはずであり、さもなければ試験は無効である。

【1387】

チェック細胞（ｃｃｃ）を加える前にどの段階にも凝集がない場合、試験は陰性と解釈される。チェック細胞を加える前の任意の段階で凝集が観察される場合、試験は陽性と解釈される。

【1388】

実施例６１：酸素結合能の評価
１ｃｍ経路長キュベットに連結したトノメーターにおいて３７℃での平衡酸素結合曲線を決定する。分光光度計（Ｃａｒｙ ５０；Ｖａｒｉａｎｔ Ｉｎｃ）でスペクトル計測を実施し、ペルチェモジュールで温度を制御する。分析は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭグルコースを含有する５０ｍＭビストリス緩衝液（ｐＨ７．２）中で実施する。窒素下で完全に脱酸素化した後、既知の容積の純酸素をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジでゴムキャップを介してトノメーターに注入することにより、赤血球懸濁液を種々の酸素分圧で平衡化する。最小二乗回帰によってＲＢＣ懸濁液の完全脱酸素化及び酸素化スペクトルの一次結合として可視及びソーレー領域における吸収スペクトルをシミュレーションすることにより、飽和度を推定する。

【1389】

実施例６２：細胞の代謝状態の評価
赤血球系細胞集団は、種々の異なる酵素ベースのアッセイを用いて重要な代謝最終産物を定量化して、代謝的に活性であると確かめ得る。能動的解糖は、評価するのに決定的な代謝経路であり、以下のアッセイ（解糖細胞ベースのアッセイキット、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、品目６００４５０）で計測し得る。

【1390】

４５０ｕｌのアッセイ緩衝液、続いて５０ｕＬのＬ－乳酸標準を試験管にアリコートに分け、完全に混合する。１ｍＭ希釈から開始して乳酸濃度標準を用いて滴定曲線を作成する。

【1391】

９６ウェルプレートに細胞を加え、１０００ＲＰＭで５分間遠心する。１００ｕＬの標準を別個の９６ウェルプレートに移す。次に各ウェルに９０ｕＬのアッセイ緩衝液を加える。次に各細胞ウェル中の１０ｕｌの上清を対応する新しいウェルに移す。反復ピペッターを使用して各ウェルに１００ｕｌの反応液を加える。次にプレートをオービタルシェーカーにおいて室温で３０分間インキュベートする。プレートリーダーによって４９０ｎｍで吸光度を読み取る。結果を天然細胞と比較して任意の代謝の違いを同定する。

【1392】

実施例６３：血小板凝集の評価
培養又は初代供給源の血小板の凝集傾向をモニタすることができる。血小板を光源の前で振盪することにより血小板をスワーリング分析にかけ、結果は複屈折の存在又は非存在として表す。５０～７０ｍＬの容積で生じる濃縮血小板の単位を１時間静置しておき、２２±２℃（７１．６±３．６°Ｆ）の制御された温度で７０ｒｐｍの直線振盪機（Ｃ－Ｍａｒ（登録商標））に置く。

【1393】

処理後１日目、３日目及び５日目に濃縮血小板の試験（血小板数、血小板凝集及びｐＨ）を実施する；白血球数は１日目のみ実施し、微生物制御は保存５日目のみ実施する。濃縮血小板の試料からアリコートを得るため、滅菌接続（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標））を使用して環境の完全性を確実にする。血液採取から４時間以内にデュアルチャネルＣｈｒｏｎｏｌｏｇ（Ｃｒｏｎｏ－Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））を使用した比濁凝集法を用いて血小板凝集を達成する。このため、初めに１０００ｒｐｍで５分間軽く遠心することによって細胞を得て、次に３０００ｒｐｍで１５分間遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標））。試料を自動カウンター（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｕｎｔ（登録商標））で血小板計数に供する。

【1394】

血小板濃度の調整後、種々の濃度の誘導作動薬：コラーゲン２．０μｇ／ｍＬ及びＡＤＰ７．０μｇ／ｍＬ（Ｃｒｏｎｏ－Ｌｏｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））を使用して凝集を評価する。自発的な凝集を待った後、各試験につき４００μＬのＰＲＰ及び４００μＬのＰＰＰを使用する（各々が異なるキュベットにある）。作動薬を誘導することによる刺激の５分後に凝集曲線を観察し、直後に凝集を計測して、試験中に形成される曲線に従いパーセンテージとして表す。試験の結果は通常、試験溶液を透過する光の量による凝集のパーセンテージとして表す；凝集は、正常、低又は高に分類する。

【1395】

実施例６４：自家培養プロセス
自家供給源の前駆体ＣＤ３４＋細胞を使用した赤血球系細胞の培養を行い、患者に対する細胞免疫適合性を最適化する。患者において本明細書に記載されるとおりＧＭ－ＣＳＦを使用して骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を末梢に動員する。１０^６～１０^８個のＣＤ３４＋細胞を採取し、限定培地を使用する前述の２２日間プロトコルを用いて培養する。４日目の間に、治療剤の発現をコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする。培養プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。次にこの細胞を、最初のＣＤ３４＋細胞を提供したのと同じ患者に注入する。

【1396】

実施例６５：自家負荷プロセス
好適なレシーバーが負荷された治療用赤血球系細胞を調製するため、自家供給源の赤血球を使用して患者に対する細胞免疫適合性を最適化することができる。患者から血液を採取し、５０００ｇで２０分間遠心する。バフィーコートを取り除き、残りの赤血球を抗凝固薬緩衝液中に１０^８細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、合計１０^１０細胞とする。上記に記載される方法の１つによって細胞に目的の治療用レシーバーを負荷する。負荷プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。この細胞を、最初の赤血球を提供したのと同じ患者に注入する。

【1397】

実施例６６：同種培養プロセス
拡張性のある万能な治療薬を作るため、同種供給源から赤血球系細胞を培養することができる。同種供給源の前駆体ＣＤ３４＋細胞を使用した赤血球系細胞の培養を行い、プロセスを合理化して、規模を拡大して患者を治療する能力を有するある容積の治療薬を培養する。ドナーのＡ、Ｂ、Ｒｈを含めた主要血液抗原の血液型を決定し、万能ドナー（例えば、Ｏ Ｒｈ－又はボンベイＲｈ－）を同定する。好適なドナーにおいて本明細書に記載されるとおりＧＭ－ＣＳＦを使用して骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を末梢に動員する。１０^６～１０^８個のＣＤ３４＋細胞を採取し、限定培地を使用する前述の２２日間プロトコルを用いて培養する。４日目の間に、治療剤の発現をコードする遺伝子を含有するレンチウイルスベクターで細胞をトランスフェクトする。培養プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。次にこの細胞を患者に対し、その主要血液型とは無関係に注入する。

【1398】

実施例６７：同種負荷プロセス
同種供給源の前駆体ＣＤ３４＋細胞を使用した赤血球系細胞の培養を行い、規模を拡大して患者を治療する能力を有するより大容積の治療用細胞の調製方法を合理化する。ドナーのＡ、Ｂ、Ｒｈを含めた主要血液抗原の血液型を決定し、万能ドナー（例えば、Ｏ Ｒｈ－又はボンベイＲｈ－）を同定する。上記に記載される方法の１つによって細胞に目的の治療用レシーバーを負荷する。負荷プロトコルの完了後、細胞を精製し、循環生存能、免疫原性、複製能、純度、及び治療用量と相関する物理的特性を含めた幾つかの品質管理尺度に関して評価する。次に細胞を適切な安定化溶液に保存し、シリンジ又は適切な送達媒体に製剤化する。次にこの細胞を患者に対し、その主要血液型とは無関係に注入する。

【1399】

実施例６８：保存
１．冷蔵緩衝溶液中での保存
赤血球の標準保存プロトコルは当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｅｒｙｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ １９８６，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２６（６）：５００を参照されたい。赤血球の標準保存プロトコル（最長４２日間）は、抗凝固薬溶液（クエン酸－デキストロース－リン酸）への採血である。本明細書に記載されるとおり赤血球系細胞を培養する。遠心によって血漿を取り除くことにより、濃縮赤血球を調製する。細胞をやや高張の添加剤溶液、ＳＡＧＭ（ナトリウム、アデニン、グルコース、マンニトール、３７６ｍＯｓｍ／Ｌ）中に４±２℃で保存する。

【1400】

２．凍結緩衝溶液中での保存
赤血球系細胞のグリセロール処理、凍結、及び解凍方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｅｒｙｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ １９７７ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ １７（５）：４３４８を参照されたい。採取から４日以内にクエン酸リン酸デキストロース中のヒト血液をグリセロール処理し、凍結する。グリセロール処理ＲＢＣの調製には、初めに約１０ｍＬの全血を１，４００ｇで１０～１５分遠心し、血漿を取り除く。次に得られた濃厚血球に、以下の組成のグリセロール水溶液を使用して２段階でグリセロール処理する：５７．１ｇグリセロール、０．０３ｇ塩化カリウム、０．０８５ｇ塩化マグネシウム六水和物、０．０８ｇリン酸二ナトリウム、及び１．６ｇ乳酸ナトリウム、総容積１００ｍＬ中、ｐＨは６．８に調整４２。第１のステップでは、濃厚血球に１．５ｍＬのこのグリセロール溶液を穏やかに撹拌しながら３分間かけて滴下して加える。次に混合物を少なくとも５分間そのままにして平衡化させる。第２のグリセロール処理ステップでは、混合物を穏やかに撹拌しながら３分間かけて５ｍＬのグリセロール溶液を滴下して加え、約４０％ｗ／ｖの最終グリセロール組成物を得る。グリセロール処理プロセス全体は室温で行う。次にグリセロール処理ＲＢＣを低温用バイアルに０．６～１．１ｍＬのアリコートに分け、ＮａｌｇｅｎｅＶＲ Ｃｒｙｏ「Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ」凍結容器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＣ）に入れ、－８０℃のフリーザーに少なくとも１２時間、最長１０年保存する。凍結ＲＢＣは、低温用バイアルを３７℃の水浴中に１分間置くことにより解凍する。全てのグリセロール処理血液試料は解凍後２時間以内に脱グリセロール化実験で使用する。

【1401】

３．シリンジとしての製剤化
細胞集団はシリンジによって静脈内投与し得る。１００ｍｌの容積、又は１０^９細胞が送達されるように、３７℃の標準生理食塩緩衝液を使用して治療用細胞を１０^７細胞／ｍｌの密度に希釈する。細胞溶液を１５０ｃｃシリンジ、２０ゲージ針に装填し、尺側皮静脈から５ｃｃ／分で患者に注射する。注射中、免疫原性反応又は凝固反応がないか患者のバイタルをモニタする。

【1402】

４．バッグとしての製剤化
細胞集団は、バッグ及び点滴チャンバに接続したシリンジによって静脈内投与し得る（即ちＩＶ点滴）。１００ｍｌの容積、又は１０^９細胞が送達されるように、３７℃の標準生理食塩緩衝液を使用して治療用細胞を１０^７細胞／ｍｌの密度に希釈する。細胞溶液を１Ｌプラスチックバッグに装填し、カテーテルに接続し、重力によって尺側皮静脈から患者体内に送液する。注入中、免疫原性反応又は凝固反応がないか患者のバイタルをモニタする。

【1403】

実施例６９：ＣＡＰＳ劇症型抗リン脂質症候群
最終細胞産物が１細胞当たり表面上に＞１×１０^５コピーのｂ２ＧＰＩレシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性トランス遺伝子β２グリコプロテインＩ（ｂ２ＧＰＩ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５３５９５．１）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、インビトロ活性をフローサイトメトリーによって評価する。簡潔に言えば、以前にＥＬＩＳＡによる抗ｂ２ＧＰＩ抗体試験で陽性を示した抗リン脂質症候群患者の血清と共に細胞をインキュベートする。この細胞を洗浄し、その表面に結合したヒト一次抗体を検出するため二次抗体で標識し、フルオロフォアの存在についてフローサイトメトリーによって分析する。

【1404】

β－２グリコプロテインＩを過剰発現する培養赤血球系細胞集団は、臨床試験初期段階における抗リン脂質症候群の治療薬として提供される。

【1405】

循環中に抗リン脂質自己抗体を有すると診断される患者に単一用量の１０^９～１０^１１細胞を月１回、６～１２ヵ月間静脈内投与する。治療経過中、毎日の血液検査で患者のチミジン及びチミンレベルをモニタし、血栓イベント及び出血などの関連性のあるＡＰＳ症状を記録する。

【1406】

１細胞当たり１０Ｋ～１００Ｋコピーのβ－２グリコプロテイン１を発現する１０^１１個の赤血球系細胞の集団をＣＰＤＡ－１及びグリセロールと共に輸血バッグに保存し、－８０℃で最長１０年間保存する。治療時にはバッグを解凍し、遠心し、細胞を取り出して、患者への投与用の生理食塩水に再懸濁する。細胞は５０ゲージ針によって３７℃、５ｍｌ／分で静脈内投与する。

【1407】

実施例７０：グッドパスチャー病
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり表面上に＞１×１０^５コピーのＮＣ１－ＣＯＬ４Ａ３レシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性トランス遺伝子ＣＯＬ４Ａ３、ＮＣ１－ＣＯＬ４Ａ３（ＩＤ：ＮＭ＿００００９１．４）の非コラーゲン性Ｃ末端ドメインをコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、インビトロ活性をフローサイトメトリーによって評価する。簡潔に言えば、以前にＥＬＩＳＡによる抗ＮＣ１－ＣＯＬ４Ａ３抗体試験で陽性を示したグッドパスチャー症候群患者の血清と共に細胞をインキュベートする。この細胞を洗浄し、その表面に結合したヒト一次抗体を検出するため二次抗体で標識し、フルオロフォアの存在についてフローサイトメトリーによって分析する。

【1408】

実施例７１：膜性ＧＮ
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり表面上に＞１×１０^５コピーのＰＬＡ２Ｒレシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性トランス遺伝子ホスホリパーゼＡ２受容体（ＰＬＡ２Ｒ）（ＩＤ：ＭＧＣ：１７８１７９）の４番目～６番目の細胞外ドメインをコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、インビトロ活性をフローサイトメトリーによって評価する。簡潔に言えば、以前にＥＬＩＳＡによる抗ＰＬＡ２Ｒ抗体試験で陽性を示した膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）患者の血清と共に細胞をインキュベートする。この細胞を洗浄し、その表面に結合したヒト一次抗体を検出するため二次抗体で標識し、フルオロフォアの存在についてフローサイトメトリーによって分析する。

【1409】

実施例７２：ＩｇＡ腎症
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーのＣＲ１外部ドメインレシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性トランス遺伝子補体受容体１（ＣＲ１）（配列番号２）の細胞外ドメインをコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、免疫複合体と結合し、且つその複合体をマクロファージにトランスファーするその能力に関して細胞をアッセイする。

【1410】

Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－６５０）をポリクローナルウサギ抗ＢＳＡ（Ａｂｃａｍ）と共に抗体過剰で室温で３０分間インキュベートして、複合体を作成する。次にこの複合体をヒト血清と１：１容積比で３７℃で３０分間混合して、免疫複合体を形成する。対照複合体はヒト血清と混合しないか、或いは熱失活ヒト血清と混合する。次に複合体を細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、免疫複合体の捕捉に関してフローサイトメトリーでＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することによって分析する。

【1411】

１００ｎＭホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）と共に３７℃で２４時間インキュベートすることにより、培養Ｕ９３７単球を活性化させる。免疫複合体で被覆された細胞（上記参照）を活性Ｕ９３７マクロファージと共に３７℃で３０分間インキュベートする。この共培養物をフローサイトメトリーによって分析する。ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングによってマクロファージを同定する。この細胞集団におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することにより、マクロファージにおける免疫複合体の存在を分析する。

【1412】

実施例７３：全身性エリテマトーデス
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーのＣＲ１外部ドメインレシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性トランス遺伝子補体受容体１（ＣＲ１）（配列番号２）の細胞外ドメインをコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、免疫複合体と結合し、且つその複合体をマクロファージにトランスファーするその能力に関して細胞をアッセイする。

【1413】

Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ－６５０）をポリクローナルウサギ抗ＢＳＡ（Ａｂｃａｍ）と共に抗体過剰で室温で３０分間インキュベートして、複合体を作成する。次にこの複合体をヒト血清と１：１容積比で３７℃で３０分間混合して、免疫複合体を形成する。対照複合体はヒト血清と混合しないか、或いは熱失活ヒト血清と混合する。次に複合体を細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートする。細胞を洗浄し、免疫複合体の捕捉に関してフローサイトメトリーでＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することによって分析する。

【1414】

１００ｎＭホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）と共に３７℃で２４時間インキュベートすることにより、培養Ｕ９３７単球を活性化させる。免疫複合体で被覆された細胞（上記参照）を活性Ｕ９３７マクロファージと共に３７℃で３０分間インキュベートする。この共培養物をフローサイトメトリーによって分析する。ＦＳＣ／ＳＳＣゲーティングによってマクロファージを同定する。この細胞集団におけるＤｙｌｉｇｈｔ ６５０蛍光を検出することにより、マクロファージにおける免疫複合体の存在を分析する。

【1415】

実施例７４：発作性夜間ヘモグロビン尿症
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーのＣＤ５９レシーバーを発現するように、Ｎ末端エピトープタグを有する外因性トランス遺伝子ＣＤ５９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿２０３３３０．２）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、共培養下でヒツジ赤血球に対する膜侵襲複合体を阻害するその能力に関して細胞をアッセイする。

【1416】

簡潔に言えば、１×ベロナール緩衝生理食塩水（ＶＢＳ）の１０％溶液中の新鮮ヒツジ赤血球をポリクローナルウサギ抗ヒツジＲＢＣ抗体（溶血素）によって３０℃で３０分間感作する。感作したヒツジ赤血球に培養細胞の段階希釈物を加える。各ウェルにヒト血清を段階希釈で、ＶＢＳ中１：４希釈から開始して加える。３７℃で３０分間、１５分後に混合してインキュベートする。試料を１，５００ｇで５分間遠心してＲＢＣを沈降させる。各チューブから１００ｕｌの上清を９６ウェル平底プレートのウェルに移す。各ウェルに１００ｍｌの蒸留水を加える。プレート分光光度計を使用して５４０ｎｍで試料の吸光度を読み取る。％溶解は、ＯＤ５４０（被験）－ＯＤ５４０（ブランク）／ＯＤ５４０（総溶解物）－ＯＤ５４０（ブランク）×１００として計算する。

【1417】

実施例７５：非定型溶血性尿毒症症候群
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーのＣＤ５９レシーバーを発現するように、Ｎ末端エピトープタグを有する外因性トランス遺伝子ＣＤ５９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿２０３３３０．２）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、共培養下でヒツジ赤血球に対する膜侵襲複合体を阻害するその能力に関して細胞をアッセイする。

【1418】

簡潔に言えば、１×ベロナール緩衝生理食塩水（ＶＢＳ）の１０％溶液中の新鮮ヒツジ赤血球をポリクローナルウサギ抗ヒツジＲＢＣ抗体（溶血素）によって３０℃で３０分間感作する。感作したヒツジ赤血球に培養細胞の段階希釈物を加える。各ウェルにヒト血清を段階希釈で、ＶＢＳ中１：４希釈から開始して加える。３７℃で３０分間、１５分後に混合してインキュベートする。試料を１，５００ｇで５分間遠心してＲＢＣを沈降させる。各チューブから１００ｕｌの上清を９６ウェル平底プレートのウェルに移す。各ウェルに１００ｍｌの蒸留水を加える。プレート分光光度計を使用して５４０ｎｍで試料の吸光度を読み取る。％溶解は、ＯＤ５４０（被験）－ＯＤ５４０（ブランク）／ＯＤ５４０（総溶解物）－ＯＤ５４０（ブランク）×１００として計算する。

【1419】

実施例７６：加齢性黄斑変性症
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーのＣＤ５９レシーバーを発現するように、Ｎ末端エピトープタグを有する外因性トランス遺伝子ＣＤ５９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿２０３３３０．２）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、共培養下でヒツジ赤血球に対する膜侵襲複合体を阻害するその能力に関して細胞をアッセイする。

【1420】

簡潔に言えば、１×ベロナール緩衝生理食塩水（ＶＢＳ）の１０％溶液中の新鮮ヒツジ赤血球をポリクローナルウサギ抗ヒツジＲＢＣ抗体（溶血素）によって３０℃で３０分間感作する。感作したヒツジ赤血球に培養細胞の段階希釈物を加える。各ウェルにヒト血清を段階希釈で、ＶＢＳ中１：４希釈から開始して加える。３７℃で３０分間、１５分後に混合してインキュベートする。試料を１，５００ｇで５分間遠心してＲＢＣを沈降させる。各チューブから１００ｕｌの上清を９６ウェル平底プレートのウェルに移す。各ウェルに１００ｍｌの蒸留水を加える。プレート分光光度計を使用して５４０ｎｍで試料の吸光度を読み取る。％溶解は、ＯＤ５４０（被験）－ＯＤ５４０（ブランク）／ＯＤ５４０（総溶解物）－ＯＤ５４０（ブランク）×１００として計算する。

【1421】

実施例７７：Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病
全長抗ＣＤ２０抗体をベースとして抗体ｓｃＦｖを生成する。スプライスオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ－ＰＣＲ）を用いて、マウス２Ｂ８のＶ遺伝子配列をベースとして完全合成抗ＣＤ２０可変（Ｖ）遺伝子を作成する（米国特許第５，７３６，１３７号明細書）。次に全長２Ｂ８ＶＬ及びＶＨ遺伝子をＳＯＥ－ＰＣＲによってアセンブルして、ＶＬ－ＶＨの向きで１８残基長リンカー（Ｗｈｉｔｌｏｗ ２１８リンカー；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作製する。５’末端（上流）にシグナルペプチドも含んで分泌を可能にするＳＯＥ－ＰＣＲに続き、このコンストラクトをｐＣＲ（登録商標）－２．１－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にクローニングし、シーケンシングによって確認する。

【1422】

フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーの抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖレシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性抗ＣＤ２０抗体ｓｃＦｖ抗ＣＤ２０（Ｏｌａｆｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００９，５０（９）：１５００）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、インビトロ活性をフローサイトメトリーによって評価する。簡潔に言えば、細胞を様々な濃度の可溶性ＣＤ２０標的タンパク質（Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートする。標的タンパク質をフルオロフォアで直接標識する。インキュベートした細胞を洗浄し、フルオロフォアの存在についてフローサイトメトリーによって分析する。

【1423】

実施例７８：軽鎖アミロイドーシス
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーのＳＡＰレシーバーを発現するように、グリコホリンＡのＮ末端に融合した外因性トランス遺伝子血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ０００９７．１）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、インビトロ活性をフローサイトメトリーによって評価する。簡潔に言えば、抗軽鎖ＥＬＩＳＡでアミロイド斑が陽性である軽鎖アミロイドーシス患者の血清と共に細胞をインキュベートする。フルオロフォアで直接標識されている抗λ軽鎖抗体（Ａｂｃａｍ）で二次標識することにより、軽鎖アミロイド斑とＳＡＰ提示細胞の結合を検出する。インキュベートした細胞を洗浄し、フルオロフォアの存在についてフローサイトメトリーによって分析する。

【1424】

実施例７９：Ｂ型肝炎
フローサイトメトリーによって評価するとき最終細胞産物が１細胞当たり＞１×１０^５コピーの抗体ｓｃＦｖレシーバーを発現するように、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する外因性トランス遺伝子抗体ｓｃＦｖ（配列番号１）をコードするレンチウイルスの存在下で細胞を培養する。レシーバーが機能的に発現することを確実にするため、インビトロ活性をフローサイトメトリーによって評価する。簡潔に言えば、様々な濃度のＤｙｌｉｇｈｔ ６５０フルオロフォアで直接標識されている標的タンパク質ＨＢｓＡｇ（Ａｂｃａｍ）と共に細胞をインキュベートする。インキュベートした細胞を洗浄し、フルオロフォアの存在についてフローサイトメトリーによって分析する。

【1425】

実施例８０：ＡＤＡ－ＳＣＩＤ
ＨＰＬＣプロトコルを用いてアデノシン及びイノシンレベルを検出することにより、アデノシンデアミナーゼ活性をインビトロでモニタする。前述のトランスフェクションプロトコルを用いて作製した、外因性の細胞内アデノシンデアミナーゼを発現する約１０^５個の赤血球系細胞を、１ｍｌウェルにアリコートに分ける。各ウェルに１ｍＭのアデノシンを投与し、１時間インキュベートする。細胞を遠心し、冷メタノール沈殿を用いて上清から可溶性タンパク質を取り除く。次に上清試料を、イノシン及びアデノシン検量線を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣにかけて、天然細胞と比較したヌクレオシドの相対量及び細胞内酵素活性を決定する。

【1426】

ＨＰＬＣプロトコルを用いてアデノシン及びイノシンレベルを検出することにより、アデノシンデアミナーゼ活性をインビボでモニタする。ＡＤＡ－ＳＣＩＤマウスモデルは細胞治療薬投与前にクロドロネートで３日間治療する。１００ｕｌの１０^８個のＡＤＡ発現ヒト赤血球系細胞をマウスモデルに尾静脈注射で投与し、１０分、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で顎下採血によって血液試料を採取する。ＨＰＬＣを用いて試料を分析し、イノシン及びアデノシンレベルを経時的に追跡する。

【1427】

１細胞当たり１０Ｋ～１００ＫコピーのＡＤＡを発現する１０^８個の培養赤血球系細胞の集団を、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスのコホートに尾静脈注射で投与する。注射前にアデノシン及びイノシン循環レベルを記録する。細胞は１週間循環させて、１０分、１時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、９６時間、１４４時間の時点で血液試料を採取する。アデノシン及びイノシンレベルを追跡する。

【1428】

ＡＤＡ－ＳＣＩＤと診断された患者を遺伝子タイピングによって確認し、ＡＤＡ活性が欠損していることを見出す。診断に用いられる関連性のある臨床症状としては、リンパ球数、アデノシンレベル、及び感染頻度が挙げられる。この患者に、血液型適合ドナーから培養した、且つ５００ｍｌの生理食塩水に希釈した外因性ＡＤＡを発現する１０^１１個の赤血球系細胞を重力送液で１時間にわたって静脈内投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は特定のＣＤ抗原の免疫蛍光分析を用いて患者リンパ球数を追跡し、ＨＰＬＣを用いてアデノシン及びイノシンレベルをモニタし、及び感染率を記録する。輸血に対する免疫原性反応を厳重にモニタする。

【1429】

アデノシンデアミナーゼを過剰発現する培養赤血球系細胞集団は、ＡＤＡ－ＳＣＩＤの治療薬として提供される。

【1430】

アデノシンデアミナーゼが欠損していると診断された患者に単一用量の１０^９～１０^１１個の細胞を月１回、６～１２ヵ月間にわたり静脈内投与する。治療経過中、毎日の血液検査で患者のアデノシン及びイノシンレベルをモニタし、リンパ球数、感染症、及び皮膚発疹などの関連性のあるＡＤＡ－ＳＣＩＤ症状を記録する。

【1431】

１細胞当たり１０Ｋ～１００ＫコピーのＡＤＡを発現する１０^１１個の赤血球系細胞の集団をＣＰＤＡ－１及びグリセロールと共に輸血バッグに保存し、－８０℃で最長１０年間保存する。治療時にはバッグを解凍し、遠心し、細胞を取り出して、患者への投与用の生理食塩水に再懸濁する。細胞は５０ゲージ針によって３７℃、５ｍｌ／分で静脈内投与する。

【1432】

実施例８１：ＭＮＧＩＥ
ＨＰＬＣプロトコルを用いてチミジン及びチミンレベルを検出することにより、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）活性をインビトロでモニタする。前述のトランスフェクションプロトコルを用いて作製した、外因性の細胞内チミジンホスホリラーゼを発現する約１０^５個の赤血球系細胞を、１ｍｌウェルにアリコートに分ける。各ウェルに１ｍＭのチミジンを投与し、１時間インキュベートする。細胞を遠心し、冷メタノール沈殿を用いて上清から可溶性タンパク質を取り除く。次に上清試料を、チミジン及びチミン検量線を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣにかけて、天然細胞と比較したヌクレオシドの相対量及び細胞内酵素活性を決定する。

【1433】

ＨＰＬＣプロトコルを用いてチミジン及びチミンレベルを検出することにより、チミジンホスホリラーゼ活性をインビボでモニタする。ＴＰ欠損マウスモデルは細胞治療薬投与前にクロドロネートで３日間治療する（Ｈａｒａｇｕｓｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００２）。１００ｕｌの１０^８個のＴＰ発現赤血球系細胞をマウスモデルに尾静脈注射で投与し、１０分、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で顎下採血によって血液試料を採取する。ＨＰＬＣを用いて試料を分析し、チミジン及びチミンレベルを経時的に追跡する。

【1434】

ＭＮＧＩＥと診断された患者を遺伝子タイピングによって確認し、ＴＹＭＰが欠損していることを見出す。診断に用いられる関連性のある臨床症状としては、胃腸運動、早期満腹感、悪液質、及び悪心が挙げられる。この患者に、血液型適合ドナーから培養した、且つ５００ｍｌの生理食塩水に希釈した外因性ＴＰを発現する１０^１１個の赤血球系細胞を、重力送液で１時間にわたって静脈内投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は、ＨＰＬＣを使用したチミジン及びチミンレベルを含め、患者の症状をモニタする。

【1435】

チミジンホスホリラーゼを過剰発現する培養赤血球系細胞集団は、ＭＮＧＩＥの治療薬として提供される。

【1436】

チミジンホスホリラーゼが欠損していると診断された患者に単一用量の１０^９～１０^１１個の細胞を月１回、６～１２ヵ月間にわたり静脈内投与する。治療経過中、毎日の血液検査で患者のチミジン及びチミンレベルをモニタし、消化管内動態及び悪液質などの関連性のあるＭＮＧＩＥ症状を記録する。

【1437】

１細胞当たり１０Ｋ～１００Ｋコピーのチミジンホスホリラーゼを発現する１０^１１個の赤血球系細胞の集団をＣＰＤＡ－１及びグリセロールと共に輸血バッグに保存し、－８０℃で最長１０年間保存する。治療時にはバッグを解凍し、遠心し、細胞を取り出して、患者への投与用の生理食塩水に再懸濁する。細胞は５０ゲージ針によって３７℃、５ｍｌ／分で静脈内投与する。

【1438】

実施例８２：ゴーシェ病
ＧＣを負荷した、又はＧＣを発現する赤血球系細胞を使用したマクロファージへのβ－グルコセレブロシダーゼ（ＧＣ）の送達を実証するため、インビトロアッセイを実施する。送達の成功は、ゴーシェ病の治療薬としての潜在的な機構的作用を示す。Ｕ９３７細胞株を使用してマクロファージの初代培養物を調製する。トランス遺伝子発現方法及び標準的な小分子負荷プロトコルを使用して赤血球系細胞にＧＣ及びＣＦＳＥを負荷し、アルセバー液で洗浄し、カバーガラス上のマクロファージに１０：１の比で加える。プレートを２６００ｇで５分間遠心し、３７℃で３０分間インキュベートする。非貪食赤血球系細胞を低張緩衝液で溶解させる。マクロファージをＰＢＳで洗浄し、ベンジジン及びギムザで染色する。次にインターナライズされたＧＣ及びＣＦＳＥに関してマクロファージをＦＡＣＳで分析し、並びに蓄積セラミドレベルをジアシルグリセロール（ＤＡＧ）キナーゼアッセイを用いて分析する。

【1439】

マウス由来の赤血球系細胞をアルセバー液で洗浄し、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色する。標識したＧＣ負荷細胞をマウスに腹腔内注射する。注射の４日後に顕微鏡法用に脾臓を調製し、蛍光顕微鏡を使用して１２ミクロン切片を可視化する。ＰＫＨ２６を観察して定量化する。加えて、ＧＣ負荷赤血球系細胞を投与し、７日後にそれぞれのＣＤ抗原のＦＡＣＳを用いて循環マクロファージ細胞レベルを定量化し、対照マウスのレベルと比較する。ＤＡＧキナーゼアッセイを用いてマクロファージ集団のセラミドレベルを定量化する。

【1440】

患者は、肥大肝、貧血症、血小板減少症、肺疾患、関節炎などの特徴的症状、及び関連する突然変異遺伝子を同定する遺伝子タイピングに基づきゴーシェ病と診断される。この患者に、ＧＣが負荷されているか、或いは又はＧＣを発現する１０^１１個の赤血球系細胞を投与する。細胞を５００ｍｌの生理食塩水中に希釈し、重力送液で１時間にわたって投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は、マクロファージ数、出血及び血栓イベント、及びマクロファージセラミドレベルを含め、患者の症状をモニタする。

【1441】

実施例８３：ＡＬＬ－アスパラギナーゼ
ＨＰＬＣプロトコルを用いてＬ－アスパラギン及びアスパラギン酸レベルを検出することにより、アスパラギナーゼ活性をインビトロでモニタする。標準トランスフェクションプロトコルを用いて作製した、外因性の細胞内アスパラギナーゼを発現する約１０^５個の赤血球系細胞を、１ｍｌウェルにアリコートに分ける。各ウェルに１ｍＭのアスパラギンを投与し、１時間インキュベートする。細胞を遠心し、冷メタノール沈殿を用いて上清から可溶性タンパク質を取り除く。次に上清試料を、アスパラギン及びアスパラギン酸検量線を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣにかけて、天然細胞と比較したアミノ酸の相対量及び細胞内酵素活性を決定する。

【1442】

ＨＰＬＣプロトコルを用いてアスパラギン及びアスパラギン酸レベルを検出することにより、アスパラギナーゼ活性をインビボでモニタする。突然変異ＮＯＴＣＨ１遺伝子の挿入によって作成した急性リンパ性白血病マウスモデルを、細胞治療薬投与前にクロドロネートで３日間治療する（Ｈａｒａｇｕｓｈｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００２）。１００ｕｌの１０^８個のアスパラギナーゼ発現赤血球系細胞をマウスモデルに尾静脈注射で投与し、１０分、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間の時点で顎下採血によって血液試料を採取する。ＨＰＬＣを用いて試料を分析し、アスパラギン及びアスパラギン酸レベル並びに白血病の進行を示すＴ細胞増殖挙動を経時的に追跡する。

【1443】

標準的な症状及び体細胞突然変異解析、例えばＮＯＴＣＨ１、ＲＡＳ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ脱制御シグナル伝達に基づきＡＬＬと診断された患者に、血液型適合ドナーから培養した１０^１１個の赤血球系細胞を静脈内投与する。細胞は、５００ｍｌの生理食塩水中に希釈した外因性の細胞内アスパラギナーゼを発現し、重力送液で１時間にわたって投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は、ＨＰＬＣを用いたアスパラギン及びアスパラギン酸レベルを含め、患者の症状をモニタする。増殖白血病細胞は血液試料の免疫蛍光法を用いて定量化する。

【1444】

実施例８４：血栓性血小板減少性紫斑病
培養赤血球系細胞の膜上で発現するＡＤＡＭＴＳ１３の活性を実証するため、インビトロアッセイを実施する。ＡＤＡＭＴＳ１３アッセイは、合成の７３アミノ酸ペプチド、ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３に頼るＦＲＥＴ誘導性システムである。この基質が２つの修飾残基間で切断されると、インタクトなペプチドにおける蛍光クエンチが解消される。ＦＲＥＴＳ－ＶＷＦ７３を培養赤血球系細胞と共にインキュベートすると、天然赤血球と比較して、時間の経過に伴う蛍光の定量的増加が示される。定量分析は、共通のフィルタを有する市販のプレートリーダーの９６ウェルフォーマットを使用して１時間以内に達成する（Ｋｏｋａｍｅ、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ、２００５）。

【1445】

ＡＤＡＭＴＳ１３を発現する培養赤血球系細胞の機構的能力は、マクロファージを枯渇させるためクロドロネートを投与されるＮＳＧマウスモデルを使用して実証される。組換えヒトフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）を１０ｍＭで尾静脈から注射する。続いてＡＤＡＭＴＳ１３を発現する１０^８個のヒト赤血球系細胞を注射し、１０分、１時間、４時間、８時間、２４時間の時点で血液試料を採取する。ＶＷＦ切断に関してゲル電気泳動を用いて血清をアッセイする。ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦの切断が起こると、多量体サイズが低下する。この低下を、アガロースゲル電気泳動と、続くペルオキシダーゼコンジュゲート抗ＶＷＦ抗体によるウエスタンブロッティングによって可視化する。一連の希釈正常血漿試料を参照することにより、試験試料中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の濃度を確定する。

【1446】

患者は、血小板減少症、微小血管症性溶血性貧血、神経症状、腎不全などの特徴的症状、及び関連する突然変異遺伝子を同定する遺伝子タイピングに基づき血栓性血小板減少性紫斑病と診断される。患者には、表面上にＡＤＡＭＴＳ１３を発現する１０^１１個の赤血球系細胞を投与する。細胞を５００ｍｌの生理食塩水中に希釈し、重力送液で１時間にわたって投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は、ＶＷＦ多量体レベル、出血、及び血栓イベントを含め、患者の症状をモニタする。

【1447】

実施例８５：血友病Ｂ（ＦＩＸ）
培養赤血球系細胞の膜上で発現する第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の活性を実証するため、インビトロアッセイを実施する。第ＩＸａ因子アッセイプロトコル（活性化第ＩＸ因子、ＢＩＯＰＨＥＮ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ、参照Ａ２２１８１２）を使用して赤血球系細胞の試料の定量的な発色読取り値を提供する。赤血球系細胞のＦＩＸａ活性を天然赤血球及びヒト血漿の両方と比較する。

【1448】

血友病Ｂのマウスモデル（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂ６．１２９Ｐ２－Ｆ９^{ｔｍ１Ｄｗｓ}／Ｊ）をシクロホスファミドで免疫抑制し、クロドロネートでマクロファージを除去する。次にマウスに、表面上にヒトＦＩＸを発現する１０^８個のヒト赤血球系細胞を注射する。マウスを２週間にわたって毎日尾静脈から採血し、凝固時間を記録する。結果を陰性対照マウスモデル及び単一用量の可溶性ＦＩＸの投与を受ける陽性対照モデルと比較する。

【1449】

患者は、突発性出血、胃腸管出血、挫傷、低循環第ＩＸ因子レベルなどの特徴的症状、及びＸ連鎖遺伝子の突然変異を確認する遺伝子タイピングに基づき血友病Ｂと診断される。この患者に、表面上にＦＩＸを発現する１０^１１個の赤血球系細胞を投与する。細胞を５００ｍｌの生理食塩水に希釈し、重力送液で１時間にわたって投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は、ＦＩＸａレベル、突発性出血、及び血栓イベントを含め、患者の症状をモニタする。

【1450】

実施例８５：急性リンパ芽球性白血病
白血病抗原、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）に対するｓｃＦｖを発現する赤血球系細胞を、初代供給源のＷＴ１陽性白血病細胞とのロゼット形成に関してインビトロでアッセイする。Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｂｌｏｏｄ １１８（１３）：ｅ７４により記載される方法を用いて、２０％同種血清濃縮マッコイ５Ａ培地を使用して３％ヘマトクリットで細胞を培養する。ロゼットの存在を検出し、ｖａｎ Ｄｒｉｅｓｓｃｈｅ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００５で適用される技法を改良した新規ギムザ低活性染色法を使用して定量化する。サンプリングした培養懸濁液をギムザで（最終染色濃度は５％である）１５分間染色する。少量のこの懸濁液（７．５μｌ）を使用して、２２×３２ｍｍ（０．１７ｍｍ厚）カバーガラスで湿式マウントを作る。この湿式マウントを光学顕微鏡で油浸拡大下に直ちに調べる。２０％同種血清濃縮マッコイ５Ａ培地の赤血球系細胞を調べることにより、ロゼット形成率を決定する。

【1451】

ＮＳＧマウスモデルをクロドロネートで処置してそのマクロファージ集団を除去する。マウスにＷＴ１陽性の１０^８個の白血病細胞を注射する。その直後に、表面上にＷＴ１に対するｓｃＦｖの複数のコピーを発現する赤血球系細胞の集団を注射し、１０分、１時間、４時間、１２時間、２４時間、４８時間の時点で血液試料を採取する。ＦＡＣＳを用いて試料を分析し、赤血球Ｂ細胞結合を定量化して、陽性対照赤血球注入マウスと比較する。

【1452】

疲労、発熱、体重減少、貧血症、白血球数異常、及び陽性骨髄生検などの特徴的症状に基づき急性リンパ芽球性白血病と診断された患者。この患者に、表面上に抗ＷＴ１ ｓｃＦｖを発現する１０^１１個の赤血球系細胞を投与する。細胞を５００ｍｌの生理食塩水に希釈し、重力送液で１時間にわたって投与する。この手順を６ヵ月間にわたり毎月繰り返す。治療期間中は、白血病白血球数を含め、患者の症状をモニタする。

【1453】

前述の発明は、理解を明確にするため説明及び例示としていくらか詳細に記載されているが、当業者には、本発明の教示を踏まえれば、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなくそれに対する特定の変更形態及び改良形態をなし得ることは直ちに明らかであろう。

【1454】

【表1】

【1455】

【表2】

【1456】

【表3】

【1457】

【表4】

【1458】

【表5】

【1459】

【表6】

【1460】

【表7】

【1461】

【表8】

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【表9】

【1463】

【表10】

【1464】

【表11】

【1465】

【表12】

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【表13】

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【表14】

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【表15】

【1469】

【表16】

【1470】

【表17】

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【表18】

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【表19】

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【表20】

【1474】

【表21】

【1475】

【表22】

【1476】

【表23】

【1477】

【表24】

【1478】

【表25】

【1479】

【表26】

【1480】

【表27】

【1481】

【表28】

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【表29】

【1483】

【表30】

【1484】

【表31】

【1485】

【表32】

【1486】

【表33】

【1487】

【表34】

【1488】

【表35】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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