(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-02
(45)【発行日】2022-08-10
(54)【発明の名称】高輝度蛍光体
(51)【国際特許分類】
C09K 11/06 20060101AFI20220803BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20220803BHJP
G01N 21/64 20060101ALN20220803BHJP
【ＦＩ】
C09K11/06 630
G01N33/48 P
C09K11/06 ZNM
C09K11/06 645
G01N21/64 F
G01N21/64 E
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2019556207
(86)(22)【出願日】2018-04-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-06-11
(86)【国際出願番号】 US2018027612
(87)【国際公開番号】W WO2018191690
(87)【国際公開日】2018-10-18
【審査請求日】2021-03-17
(31)【優先権主張番号】62/485,379
(32)【優先日】2017-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】508275168
【氏名又は名称】ミシガン テクノロジカル ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100086232
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 博通
(74)【代理人】
【識別番号】100092613
【弁理士】
【氏名又は名称】富岡 潔
(72)【発明者】
【氏名】ヤップ，ヨーク キン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，トンヤン
(72)【発明者】
【氏名】ヤピチ，ナズミエ ビフテール
【審査官】川嶋 宏毅
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０３２３５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０３１５１９０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Hong Guosong et al.，Near-Infrared-Fluorescence-Enhanced Molecular Imaging of Live Cells on Gold Substrates，Angew. Chem.，2011年，50，pp.4644-4648
【文献】CHEN Ying et al.，A low molecular weight PSMA-based fluorescent imaging agent for cancer，Biochem. Biophys. Res. Commun.，2009年，390，pp.624-629
【文献】MIAO Wenjun et al.，Structure-dependent photothermal anticancer effects of caebon-based photoresponsive nanomaterials，Biomaterials，2014年，35，pp.4058-4065
【文献】NAKAYAMA-RATCHFORD Nozomi et al.，Noncovalent Functionalization of Carbon Nanotubes by Fluorescein-Polyethylene Glycol: Supramolecular Conjugates with pH-Dependent Absorbance and Fluorescence，J. Am. Chem. Soc. ，2007年，129，pp.2448-2449
【文献】LEE Chee Huei et al.，Functionalization, Dispersion, and Cutting of Boron Nitride Nanotubes in Water，J. Phys. Chem. C，116，2011年12月09日，pp. 1798-1804
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０９Ｋ １１／０６
Ｇ０１Ｎ ２１／６４，３３／４８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
キャリアと、少なくとも一つの蛍光要素と、
前記少なくとも一つの蛍光要素の各々を前記キャリアに連結する両親媒性リンカーであって、その分子量に対応するリンカー長を有するとともに、前記分子量は１０００Ｄａより大きい、両親媒性リンカーと、
を備え、
前記キャリアが、窒化ホウ素ナノチューブである、蛍光体。
【請求項2】
前記窒化ホウ素ナノチューブの長さが５０～１０００ｎｍである、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項3】
前記リンカーが、５ｎｍを超える伸長リンカー長を有する、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項4】
前記リンカーが、３４００Ｄａより大きい分子量を有する、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項5】
前記リンカーが、１００００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項6】
前記リンカーが、前記キャリアに非共有結合するとともに、前記蛍光要素に共有結合する、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項7】
前記リンカーが、少なくとも一つの親水性部分および疎水性部分を備え、前記疎水性部分が前記キャリアに非共有結合し、かつ前記親水性部分が前記蛍光要素に共有結合する、請求項６に記載の蛍光体。
【請求項8】
前記親水性部分が水溶性高分子の鎖を含み、その第１の端部で前記疎水性部分に付着し、前記少なくとも一つの蛍光要素が、前記鎖に第２の端部で付着する、請求項７に記載の蛍光体。
【請求項9】
前記リンカーが、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）基と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子の鎖と、を備える、請求項８に記載の蛍光体。
【請求項10】
前記リンカーが、反応性官能基を介して前記蛍光要素に共有結合する、請求項６に記載の蛍光体。
【請求項11】
前記少なくとも一つの蛍光要素が、クマリン、ベンゾオキサジアゾール、アクリドン、アクリジン、ビスベンズイミド、インドール、ベンゾイソキノリン、ナフタレン、アントラセン、キサンテン、ピレン、ポルフィリン、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、およびシアニン誘導体のうち少なくとも一つを備える、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項12】
少なくとも１００個の前記蛍光要素を備えた、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項13】
少なくとも１０００個の前記蛍光要素を備えた、請求項１２に記載の蛍光体。
【請求項14】
前記少なくとも一つの蛍光要素が、第１の蛍光要素と、前記第１の蛍光要素とは異なる第２の蛍光要素と、を備えた、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項15】
クラウンエーテル、炭水化物、核酸、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質および抗体の群から選択された部分をさらに備え、前記リンカーが、第１のリンカー、および前記部分を前記キャリアに連結する第２のリンカーである、請求項１に記載の蛍光体。
【請求項16】
ナノチューブと、疎水性部分および親水性部分を有する少なくとも一つの両親媒性リンカーであって、前記疎水性部分が前記ナノチューブに非共有結合するとともに、前記両親媒性リンカーは、その分子量に対応するリンカー長を有しており、前記分子量は１０００Ｄａ以上である、少なくとも一つの両親媒性リンカーと、
前記少なくとも一つの両親媒性リンカーの前記親水性部分に共有結合した少なくとも一つの蛍光要素と、
を備え、
前記ナノチューブが、窒化ホウ素ナノチューブ（ＢＮＮＴ）である、蛍光体。
【請求項17】
前記親水性部分が、水溶性高分子の鎖を含む、請求項１６に記載の蛍光体。
【請求項18】
前記水溶性高分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である、請求項１７に記載の蛍光体。
【請求項19】
前記リンカーが、ＤＳＰＥ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）基を備えた、請求項１８に記載の蛍光体。
【請求項20】
前記ポリエチレングリコール分子の鎖が、１０００Ｄａより大きい分子量を有する、請求項１７に記載の蛍光体。
【請求項21】
前記ポリエチレングリコール分子の鎖が、５ｎｍより長い、引き伸ばされた長さを有する、請求項２０に記載の蛍光体。
【請求項22】
前記リンカーが、３４００Ｄａより大きい分子量を有する、請求項１９に記載の蛍光体。
【請求項23】
前記リンカーが、１００００Ｄａ未満の分子量を有する、請求項２２に記載の蛍光体。
【請求項24】
前記ナノチューブの長さが５０～１０００ｎｍである、請求項２０に記載の蛍光体。
【請求項25】
少なくとも１００個の蛍光要素を備えた、請求項２０に記載の蛍光体。
【請求項26】
前記少なくとも一つの蛍光要素が、第１の蛍光要素と、前記第１の蛍光要素とは異なる第２の蛍光要素と、を備えた、請求項２０に記載の蛍光体。
【請求項27】
クラウンエーテル、炭水化物、核酸、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質および抗体の群から選択された部分をさらに備え、前記リンカーが、第１のリンカー、および前記部分を前記ナノチューブに連結する第２のリンカーである、請求項２０に記載の蛍光体。
【請求項28】
前記少なくとも一つのリンカーが、反応性官能基を介して前記少なくとも一つの蛍光要素に共有結合する、請求項２０に記載の蛍光体。
【請求項29】
キャリアと、少なくとも一つの蛍光要素と、
前記少なくとも一つの蛍光要素の各々を前記キャリアに連結する両親媒性リンカーであって、その分子量に対応する伸長リンカー長を有するとともに、前記伸長リンカー長が５ｎｍよりも大きい、両親媒性リンカーと、
を備え、
前記キャリアが、窒化ホウ素ナノチューブである、蛍光体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２０１７年４月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／４８５，３７９号の優先権を主張する。
（政府支援の声明）
本明細書に記載の発明は、国立科学財団によって授与された助成金＃１２６１９１０、助成金＃１４４５１０６、助成金＃１５２１０５７、および助成金＃１７３８４６６の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
この出願は、２０１７年４月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／４８５，３７９号の優先権を主張する。
（政府支援の声明）
本明細書に記載の発明は、国立科学財団によって授与された助成金＃１２６１９１０、助成金＃１４４５１０６、助成金＃１５２１０５７、および助成金＃１７３８４６６の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0002】
蛍光体（fluorophores）は、生物医学的用途がある蛍光特性を有する化合物である。例えば、特定の分子または構造を染色するためのトレーサーまたは色素として蛍光体を使用できる。より具体的には、蛍光色素分子を使用して、蛍光イメージングや分光法などの様々な分析方法において組織、細胞、または材料を染色することができる。
【0003】
蛍光体は、特定の組織、細胞、または材料への送達のために、他の分子に付着される。これらの他の送達分子に付着すると、蛍光体は消光を示す可能性があり、これは蛍光体の蛍光の輝度の低下である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本出願による例示的な蛍光体は、キャリアと、少なくとも一つの蛍光要素（fluorescent entity）と、少なくとも一つの蛍光要素のそれぞれをキャリアに連結する両親媒性リンカーと、を含む。リンカーは、分子量に対応するリンカー長を有し、その分子量は１０００Ｄａよりも大きい。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1A】色素‐リンカー構造を概略的に示す図である。
【図1B】蛍光体を概略的に示す図である。
【図2A】蛍光体の色素‐リンカー構造の例を概略的に示す図である。
【図8A】別の色素‐リンカー構造の例を示す図である。
【図12A】別の色素‐リンカー構造の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0006】
極めて一般的に、高輝度蛍光体は、キャリア要素、蛍光要素、およびキャリア要素を蛍光要素に連結するリンカーを含む。生物医学用途では、キャリア要素、リンカー、および蛍光要素のそれぞれが生体適合性である必要がある（ただし、生体適合性の要件は特定の用途によって異なる）。
【0007】
キャリア要素の一例は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）や窒化ホウ素ナノチューブ（ＢＮＮＴ）などのナノ材料であり、いずれも細胞薬物送達や分光法などの生物医学用途向けの生体適合性ナノ材料として認識されている。一方、ナノチューブに連結された蛍光要素は、消光、すなわち蛍光の輝度の低下を示すことが示されている。
【0008】
ナノ材料キャリアを有する特定の蛍光体は、本明細書で議論されるように、消光効果を示さないだけでなく、他の既知の蛍光体よりも数桁高い輝度を示すことが発見された。
【0009】
ここで図１Ａ～Ｂを参照すると、蛍光体２０が概略的に示されている。蛍光体２０は一般に、無機ナノスケールキャリア２２、リンカー２４、および蛍光要素（fluorescent entity）２６を含む。
【0010】
キャリア２２は、一例では、ＢＮＮＴまたはＣＮＴキャリアである。特定の例において、キャリア２２は、多層ＢＮＮＴまたはＣＮＴキャリアであり、各ＢＮＮＴまたはＣＮＴは、六方晶窒化ホウ素（ＢＮＮＴではｈ－ＢＮ）または（ＣＮＴでは）グラフェンの複数の同軸シェルを有し、約５ｎｍを超えるが約８０ｎｍ未満の一般的な外径を有する。これらのＢＮＮＴとＣＮＴの長さは約５０～１０００ｎｍである。他の例では、キャリア２２は、窒化ホウ素（ｈ－ＢＮ）ナノシート／ナノ粒子およびグラフェン／グラファイトナノシート／ナノ粒子などの、別のナノスケールの無機材料である。キャリア２２は、任意の公知の方法によって製造することができる。
【0011】
リンカー２４は、両親媒性ポリマーリンカーである。すなわち、リンカー２４は、疎水性領域２８と親水性領域３０とを含む。疎水性領域２８は、ナノチューブキャリア２２に非共有結合する一方、親水性領域は、蛍光要素２６（または以下で説明する別の要素）に共有結合する。リンカー２４の一例は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧn（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［（ポリエチレングリコール）n］）であり、ここで、ｎはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖中のＰＥＧ分子の数である。他のリンカー２４は、長さが異なるＰＥＧ鎖（または異なる鎖）を同様に含みうる。
【0012】
上述のＤＳＰＥ－ＰＥＧリンカー２４に加えて、他に多くの潜在的なリンカーが当技術分野で知られている。例えば、リンカー２４は、－ＣＨ2－、－ＣＨ＝、－Ｃ≡、－ＮＨ－、－Ｎ＝、Ｏ－、－ＮＨ2－、－Ｎ3－、－Ｓ－、Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、またはそれらの組み合せから選択される１つまたは複数の基を含んでもよい。上記の２つ以上の基を備えたリンカーは、リンカー２４が安定するように選択されうる、例えば、リンカー２４は、不安定な過酸化物結合を生成する２つの隣接する－Ｏ－基を含まないように選択されうることが理解されよう。リンカー２４は、直鎖、枝分かれ鎖であってもよく、１つ以上の環系を含んでもよい。非限定的な例示的リンカーは、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、リンスフィンゴ脂質である疎水性領域を含む（ＤＳＰＥ、１－Ｏ－ヘキサデカニル－２－Ｏ－（９Ｚ－オクタデセニル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（アンモニウム塩）、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）］５０００、Ｄ－エリスロ－スフィンゴシル ホスホエタノールアミン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－Ｌ－セリン、３－ｓｎ－ホスファチジル－Ｌ－セリン（ＰＳ）、グリコシルホスファチジルイノシトール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノアミンなど、これに限定しない）。疎水性ユニットは、ＰＥＧ（またはＰＥＯポリエチレンオキシド）、ＰＭＯ（ポリメチルオキサゾリン）、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリペプチド、炭水化物アンカーなどの水溶性高分子鎖と結合するために使用することができる。水溶性高分子鎖は、一方の端部でリンカーに結合され、第２の端部で蛍光要素（または以下で議論されるように別の部分）に結合される。これらの疎水性ユニットと親水性ユニットは、上記のように反応性基を有する必要があり、これらの基が互いに共役して両親媒性リンカーになるようにしなければならない。
【0013】
蛍光要素２６は、これに限定しないが、クマリン、ベンゾオキサジアゾール、アクリドン、アクリジン、ビスベンズイミド、インドール、ベンゾイソキノリン、ナフタレン、アントラセン、キサンテン、ピレン、ポルフィリン、フルオレセイン、ローダミン、ホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）、およびシアニン誘導体を含む、既知の蛍光色素である。多くのこのような蛍光色素は市販されている。蛍光要素２６は、任意の適切な方法によりリンカー２４に結合される。
【0014】
一般に、蛍光体２０の輝度は、蛍光体２０上の蛍光要素２６の数に直接関係している。すなわち、より少ない蛍光要素２６を有する蛍光体２０は、より多くの蛍光要素２６を有する蛍光体２０よりも低い輝度を示す。しかしながら、リンカー２４の長さも蛍光体２０の明るさに影響することも発見された。上記の特定の例のＤＳＰＥ－ＰＥＧnリンカー２４では、ＰＥＧ鎖中のＰＥＧ分子の数（ｎ）を変えるとリンカー２４の長さが変化し、したがって蛍光体２０の輝度が変化する。上記のその他の種類のリンカーのリンカー長を変えることも達成できることは理解されるであろう。より詳細には、約１０００Ｄａを超えるリンカー２４分子量を有する蛍光体２０（ＰＥＧ鎖を有するリンカー２４の場合、約５～１０ｎｍの伸長リンカー長に対応する）が、予想外の非線形消光効果を示すことが発見された。したがって、本明細書に記載の蛍光体２０は、従来技術の蛍光体よりも数桁高い輝度を示す。さらに、異なる蛍光要素２６を有する蛍光体２０は、それらの蛍光特性とリンカー２４の長さとの間に異なる関係を有しうることが発見された。
【0015】
一例では、リンカー２４は官能基Ｒを含むことができる。官能基Ｒは、既知の化学により蛍光体２６へのリンカー２４の共有結合を促進する反応基である。例示的な官能基Ｒはアミン基である。その他の例示的な官能基は、カルボン酸、イソチオシアネート、マレイミド、アルキニル基、アジド基、チオール基、モノスルホン、または、スクシンイミジル、スルホジクロロフェノール、ペンタフルオロフェニルまたはテトラフルオロフェニルなどのエステル基である。官能化リンカー２４（すなわち、官能基Ｒを有するリンカー２４）は、市販されているか、あるいは本明細書に記載の方法または当業者に周知のその他の方法に従って合成することができる。
【0016】
図２Ａ～Ｂは、例示的な赤色蛍光体１２０を示す。例示的な赤色蛍光体１２０は、ＢＮＮＴキャリア１２２、アミド官能化ＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2リンカー１２４（すなわち、アミド官能基、ＮＨ2を有する上記で議論したリンカー）、およびスルホローダミンＢ（ＲｈＢ、赤色）蛍光要素１２６を含む。
【0017】
ＲｈＢ蛍光色素要素１２６は、図２Ａに示されるように、色素‐リンカー構造１２４，１２６を形成するための任意の方法により、ＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2リンカー１２４に共有結合される。例えば、ＲｈＢ蛍光要素１２６は、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の窒素下の氷浴中でＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2リンカー１２４と結合し、次いでフラッシュクロマトグラフィーまたは別の精製方法によって精製される。
【0018】
様々な分子量（ＭＷ）のＰＥＧ鎖（つまり、様々なｎ値）を有するＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2リンカー１２４を使用することにより、色素‐リンカー構造１２４，１２６が異なる蛍光強度と蛍光量子収量（ＱＹ）で発光する。色素要素１２６は、ＢＮＮＴキャリア１２２へのリンカー１２４接続とは反対側のリンカー１２４のＰＥＧ鎖の末端にあるため、ＰＥＧ鎖のより高いＭＷ（およびより高いｎ値）は、リンカー１２４がより長いことを意味し、したがって、色素要素１２６はＢＮＮＴキャリア１２２からさらに遠くにあることを意味する。以下の説明は特定の例の赤色蛍光体１２０に関して行われているが、上記のように、その他のリンカー、キャリア、または蛍光要素を含む蛍光体２０にも適用可能であることを理解されたい。
【0019】
図３は、様々なＰＥＧ ＭＷ（それぞれ、ｎ＝２２、４５、７７、１１４、２２７のＰＥＧ分子に対応する、１０００、２０００、３４００、５０００、および１０，０００Ｄａ）の色素‐リンカー構造１２４，１２６のＱＹを示す。１つのＰＥＧ部分の既知の長さは０．４４ｎｍであるため、完全に引き伸ばされたＰＥＧnチェーンの長さを推定できる。例えば、完全に引き伸ばされた５０００ＭＷ ＰＥＧチェーンは、５，０００／４４×０．４４ｎｍ＝５０ｎｍとして計算される。ＭＷが１０００、２０００、３４００、５０００、１０，０００のＰＥＧ鎖の、完全に引き伸ばされた伸長リンカー長は、それぞれ５～１０ｎｍ、１１～２０ｎｍ、１８～３４ｎｍ、２７～５０ｎｍ、および５４～１００ｎｍと推定される。実際には、ＰＥＧチェーンは互いにまたはそれ自体に巻き付いている可能性があり、完全に引き伸ばされた状態を保持できない場合がある。
【0020】
各色素‐リンカーサンプルの相対蛍光ＱＹは、ＱＹ（サンプル）＝ＱＹ（参照）×［勾配（サンプル）／勾配（参照）］×［ｒ（サンプル）／ｒ（参照）］によって計算され、ｒは屈折率である。方程式によって示されるように、相対ＱＹは、図３に示すように濃度に対して共に線形にスケーリングされたサンプルと参照の、蛍光/吸光度勾配比によって計算されたため、サンプルの色素濃度とは無関係であった。
【0021】
図３に示すように、様々なリンカー１２４分子量ＭＷ（例えば、様々なリンカー１２４の長さ）に対して量子収量ＱＹが変化することは驚くべきことである。特に、例示の蛍光体１２０では、ＱＹは、ＭＷが２０００から５０００のリンカー長で非線形に増加するが、ＭＷが１０，０００では減少し飽和している（つまり、ＭＷ １００００では、リンカーが長くても、ＱＹは高くならない）。ＭＷが１０００のＱＹが、ＮＷが２０００および３４００のＱＹよりも高かったことも予期しないことである。ＭＷ＝５０００の場合に検出される最大ＱＹは、遊離したＲｈＢの標準的なＱＹ（蒸留水中で０．３１）にも近く、蛍光消光が存在しないことを示している。
【0022】
例えば、蛍光体１２０、色素‐リンカー構造１２４，１２６（ＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2－ＲｈＢ）は、図２Ｂに示されるように、任意の方法によりＢＮＮＴキャリア１２２上に非共有結合的に標識される。ＢＮＮＴキャリア１２２は、任意の既知の方法によって製造され、所望の長さに切断される。例えば、ＢＮＮＴキャリア１２２は、約５０～１０００ｎｍの間、より具体的には約３００～４００ｎｍの間である。ＢＮＮＴキャリア１２２は、色素‐リンカー構造１２４，１２６に露出され、その結果、色素‐リンカー構造１２４，１２６は、任意の方法によりＢＮＮＴキャリア１２２に非共有結合する。任意選択的に、ＢＮＮＴキャリア１２２／色素‐リンカー構造１２４，１２６溶液を蒸留またはろ過して、過剰な未結合の色素‐リンカー構造１２４，１２６を除去することができる。
【0023】
図２Ｂに示すように、リンカー１２４のアルキル鎖（－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）34）はＢＮＮＴキャリア１２２の表面に非共有結合的に吸着される一方、色素‐リンカー構造１２４，１２６のＰＥＧn－ＮＨ2－ＲｈＢは、ＢＮＮＴキャリア１２２から離れるように延在する。その他の例では、上述のように、リンカー２４の疎水性末端はキャリア２２に非共有結合する一方、遊離親水性末端は蛍光要素２６に共有結合する。
【0024】
ＢＮＮＴに吸着する１つのＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2リンカー１２４分子の表面積は１．４４ｎｍ2であることに留意されたい。これは、全ての色素‐リンカー構造１２４，１２６が一直線に並ぶ場合に、長さ５００ｎｍ、直径５０ｎｍの単一のＢＮＮＴキャリア１２２上に、１．３６×１０6個ものＤＳＰＥ－ＰＥＧn－ＮＨ2－ＲｈＢ色素‐リンカー構造１２４，１２６が存在できることを意味する。したがって、蛍光体１２０は、たった１～６個の蛍光要素からなる従来技術の蛍光体よりも６桁多い蛍光要素を有すると推定される。より一般的には、本明細書に記載の蛍光体２０は少なくとも１００個、より詳細には少なくとも１０００個の色素‐リンカー構造２４，２６を含むと推定される。
【0025】
図４Ａは、上述した様々な色素‐リンカー構造１２４，１２６を備えた蛍光体１２０のＱＹを示す。示されるように、ＱＹの傾向は、図３に示されているように、色素‐リンカー構造１２４，１２６のみのＱＹの傾向と非常に類似している。
【0026】
図４Ｂは、ＢＮＮＴキャリア１２２上の、上述した様々な色素‐リンカー構造１２４，１２６の標識効率を示す。キャリアＢＮＮＴ１２２に標識した後、色素‐リンカー構造１２４，１２６の濃度を決定することにより、標識効率を計算した。次に、この色素‐リンカー構造１２４，１２６の実際の濃度を、標識効率を決定するために、各標識プロセスに使用されている初期色素濃度と比較した。
【0027】
例示の蛍光体１２０について、小さい（ＭＷ＝１０００）リンカーおよび大きい（ＭＷ＝１００００）リンカーの標識効率が著しく低い（＜２０％）ことは驚くべきことである。中間分子量（２０００、３４００、５０００）のリンカーの標識効率は、標識効率がよく似ている（５５～７５％）。
【0028】
蛍光体１２０の蛍光輝度は、ＢＮＮＴキャリア１２２が曝される色素‐リンカー構造１２４，１２６の濃度にも関係している。これは次に、上述したように標識効率、および最終的に各ＢＮＮＴキャリア１２２上の蛍光色素要素１２６の数に影響を与える。図５Ａは、蛍光強度に対する色素‐リンカー構造１２４，１２６自体の濃度のプロットを示し、一方、図５Ｂは、蛍光強度に対する蛍光体１２０の色素‐リンカー構造１２４，１２６の濃度のプロットを示す。
【0029】
図５Ｂに示されるように、例えば高濃度の大量の色素‐リンカー構造１２４，１２６がＢＮＮＴキャリア１２０上に、蛍光強度の顕著な低下なしに標識され得ることは予想外である。これは、ＢＮＮＴキャリア１２０と色素‐リンカー構造１２４，１２６との間の安定した非共有結合が、凝集と衝突消光を防ぐことができることを意味し、したがって、標識のためにより濃厚な色素‐リンカーを使用することにより、制御可能で強化された蛍光輝度をもたらすことができる。
【0030】
蛍光体の明るさは、量子収量（ＱＹ）と吸光係数（extinction coefficient）（ε）の積として定義される。上述のように、単一のＢＮＮＴキャリア１２０に１．５×１０6個もの蛍光要素を付加できるため、例示的な蛍光体１２０の各々の輝度は、各蛍光体がほんの僅か（例えば、前述のように１～６個）の蛍光色素要素を有する従来技術の蛍光体よりも数桁明るい。実際、様々な分子量のリンカー１２４を有する例示的な蛍光体１２０の吸光係数は、１×１０7～１×１０11 Ｍ-1ｃｍ-1の範囲にあり（図６Ａに示すように）、これは、約１×１０6 Ｍ-1ｃｍ-1の吸光係数を有する市販の最も明るい色素（フィコエリトリン（ＰＥ））の吸光係数よりも遥かに高い。図６Ｂは、蛍光体１２０の輝度を示す。図７Ａ～Ｂは、色素‐リンカー構造１２４，１２６の吸光係数および輝度を示す。
【0031】
図６Ｂに示されるように、例示的な蛍光体１２０の輝度は、図７Ｂに示される色素‐リンカー構造１２４，１２６の輝度よりも１０10ほど遥かに高い。これは、遊離した色素‐リンカー構造１２４，１２６の吸光係数と比較して、全てのリンカー１２４長さについての蛍光体１２０の高い吸光係数によるものである。吸光係数は、ＢＮＮＴキャリア１２２への色素‐リンカー構造１２４，１２６の標識効率に依存する（図４Ｂ）。したがって、ＭＷ＝３４００および５０００Ｄａのリンカーの輝度が最も高くなる。いずれにせよ、全てのリンカー１２４の長さについての例示的な蛍光体１２０の吸光係数は、既存の市販の蛍光体の吸光係数よりも数桁高い。
【0032】
図８Ａ～Ｂに示す別の例の緑色蛍光体２２０は、前の例のようにナノチューブキャリア２２２およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨ2リンカー２２４を含むが、前の例のＲｈＢの代わりにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、緑色）蛍光要素２２６を含む。図９は、前の例と同じ分子量のリンカー２２４の色素‐リンカー構造２２４，２２６のＱＹを示す。図９に示すように、色素‐リンカー構造２２４，２２６は、リンカー２２４の分子量に関して非線形傾向を示す。
【0033】
図１０は、２種類のナノチューブキャリア２２０である、ＣＮＴおよびＢＮＮＴ上に標識された色素‐リンカー構造２２４，２２６のＱＹを示す。示されるように、ＣＮＴキャリアとＢＮＮＴキャリアのＱＹには僅かな違いがある。また、一般的に、ＣＮＴキャリアとＢＮＮＴキャリアの両方で、リンカー分子量とＱＹの間に直線的な傾向がある。蛍光体２２０は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で０．８６のＱＹを有することが知られる参照として使用されるレーザーグレードフルオレセインよりも低いＱＹを示した。したがって、蛍光体２２０は消光を示した。これは、特に低分子量のリンカー２２４（それぞれ図１１および４Ｂに示される）について、第１の例の蛍光体１２０と比較して、ナノチューブキャリア２２２に対する色素‐リンカー構造２２４，２２６の標識効率が比較的低いことに起因する可能性がある。ＦＩＴＣはｐＨ感受性色素であり、これらの短い色素‐リンカー構造２２４，２２６の低い標識効率は、色素‐リンカー構造２２４，２２６の分子構造によって影響を受けることに留意すべきである。
【0034】
図１２Ａ～Ｂに示される別の例の遠赤色蛍光体３２０は、前の例のようにナノチューブキャリア３２２およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨ2リンカー３２４を含むが、前の例のＲｈＢまたはＦＩＴＣの代わりにスルホ（sulfo）Ｃｙ５（遠赤色）蛍光要素３２６を含む。図１３は、前の例と同じ分子量リンカー２２４の色素‐リンカー構造３２４，３２６のＱＹを示す。図１３に示されるように、色素‐リンカー構造３２４，３２６は、リンカー３２４の分子量に関して非線形傾向を示す。
【0035】
図１４は、２種類のナノチューブキャリア３２０である、ＣＮＴおよびＢＮＮＴに標識された色素‐リンカー構造３２４，３２６のＱＹを示す。示されるように、ＣＮＴキャリアとＢＮＮＴキャリアのＱＹには僅かな違いがある。また、一般的に、ＣＮＴキャリアとＢＮＮＴキャリアの両方で、リンカー分子量とＱＹの間に直線的な傾向がある。蛍光体３２０は、参照色素（ＥｔＯＨ（エタノール）中で０．３１のＱＹを有することが知られている３，３'ジエチジアジカルボビニンヨウ素）よりも低いＱＹを示した。したがって、蛍光体３２０は、特に１００００を下回る分子量のリンカー３２４について消光を示した。これは、特に低分子量のリンカー２２４（それぞれ図１５及び４Ｂに示されている）について、第１の例の蛍光体１２０と比較して、ナノチューブキャリア３２２に対する色素‐リンカー構造３２４，３２６の標識効率が比較的低いためである可能性がある。スルホＣｙ５は小さい分子であり、Ｃｙ５色素は高濃度で消光および凝集することが知られていることに留意されたい。
【0036】
赤色蛍光体１２０、緑色蛍光体２２０、または遠赤色蛍光体３２０の吸収スペクトルに顕著なスペクトルピークシフトはなかった。これは、これらの色素‐リンカー構造のキャリアへの非共有結合が色素凝集と衝突消光を防ぐように安定していたため、標識プロセスでより高い色素‐リンカー濃度が使用された場合に蛍光強度が向上することを意味する。一方、遠赤色蛍光体３２０の色素‐リンカーの長さが３４００未満の場合は異なっていた。著しい凝集があった。
【0037】
緑色蛍光体２２０および遠赤色蛍光体３２０は、色素濃度の関数としてＦＩＴＣ要素２２６の吸光度の勾配から推定されるように、分子量５０００のリンカー内で高い吸光係数を示した（これは、各ナノチューブキャリア上の色素‐リンカー構造の数に関係する）。図１６は、蛍光体２２０の吸光係数に対するＢＮＮＴキャリア２２２あたりの色素‐リンカー構造２２４，２２６の数を示す。示されるように、これらの緑色蛍光体２２０の吸光係数は、１．６５×１０12～５．６３×１０13 Ｍ-1ｃｍ-1程度に高くなり得る。蛍光強度は、ＢＮＮＴキャリア２２２に標識された色素‐リンカー構造２２４，２２６の数とともに直線的に増加し続ける（ＢＮＮＴキャリア２２２あたり３．９６×１０7～３．２×１０8個の範囲の色素‐リンカー構造２２４，２２６）。従来技術の蛍光体では、数個以上の色素分子が近接して共役している場合に消光が起きたため、これは予想外である。
【0038】
図１７Ａ～Ｂおよび図１８Ａ～Ｂは、ＣＮＴおよびＢＮＮＴキャリアの両方について、それぞれ緑色および遠赤色蛍光体２２０，３２０の輝度および吸光係数を示す。示されるように、緑色蛍光体２２０の吸光係数は、リンカー分子量とともに約２×１０11 Ｍ-1ｃｍ-1まで増加し、輝度は約６×１０9～１×１０11の範囲である。遠赤色蛍光体３２０では、吸光係数はリンカー分子量とともに約１×１０12 Ｍ-1ｃｍ-1まで増加し、輝度範囲は約４×１０10～２×１０11の範囲である。
【0039】
上記のように、ＢＮＮＴとＣＮＴは構造的に類似している。しかしながら、ＣＮＴは導電性である一方、ＢＮＮＴは電気絶縁性である。同様のサイズのＢＮＮＴとＣＮＴが同じ赤色色素‐リンカー構造、例えば上記の例示の赤色色素‐リンカー構造１２４，１２６で標識付けされている場合、ＢＮＮＴ蛍光体は類似のＣＮＴの蛍光強度よりも約４．５倍大きい蛍光強度を示す。この結果は、キャリアとしてＢＮＮＴを使用した赤色蛍光体の相対ＱＹは、キャリアとしてＣＮＴを使用した赤色蛍光体のＱＹよりも４．５倍高いことを示唆している。
【0040】
違いの一つの説明は次のとおりである。電気的絶縁物質と物理的に接触している蛍光要素は、蛍光粒子が導電性物質と接触している場合と比較して、より低い蛍光消光を受けることが理解される。しかしながら、本明細書で使用される蛍光要素２６は、例えば上述のＤＳＰＥ－ＰＥＧリンカーなどの電気絶縁性の、長いポリマーリンカー２４を介してキャリア２０に連結される。したがって、リンカー２４は、ＣＮＴキャリア２２の導電率の影響から蛍光体２６を絶縁することが期待される。意外なことに、ＣＮＴキャリアとＢＮＮＴキャリアの蛍光体の間で発見された異なる蛍光強度は、キャリアの特性が蛍光体の蛍光に影響することを意味する。結果は、電気絶縁性ナノ材料が、従来技術の蛍光体よりも高いＱＹでより高輝度の蛍光体を形成することも示唆している。キャリア２２として使用できる他の電気絶縁性ナノ材料には、ＢＮナノシート、ＢＮナノ粒子、シリカ粒子、アルミナ粒子、ナノワイヤ、またはＳｉ、Ｇｅ、ＺｎＯなどのナノロッドが含まれる。
【0041】
それにもかかわらず、ＣＮＴを使用して作成された蛍光体の相対的なＱＹはＢＮＮＴを使用して作成されたものよりも４．５倍低いが、ＣＮＴあたりおよびＢＮＮＴあたりの色素‐リンカーの数は上記のように同じである。したがって、ＣＮＴを使用して調製した蛍光体の吸光係数は、ＢＮＮＴを使用して調製したものと同じ桁数になる。したがって、ＣＮＴキャリアを備えた高輝度蛍光体は、他の従来技術の蛍光体よりも遥かに明るい。
【0042】
上記の例の蛍光体２２０，３２０などの、緑色および遠赤色に標識された蛍光体の場合、図１０及び１４に示すように、これらの色素‐リンカー構造がＢＮＮＴおよびＣＮＴに標識されている場合、著しいＱＹの違いはなかった。どうやら、ナノ材料（ここではＢＮＮＴおよびＣＮＴ）の電気絶縁性または導電性の性質は、ＲｈＢ蛍光要素の場合のように、ＦＩＴＣ及びＣｙ５蛍光要素のＱＹには影響しなかった。これは、リンカー（例えば、分子量１０００以上のリンカー）の長さが、ＦＩＴＣおよびＣｙ５がキャリアのナノ材料により大幅に消光されるのを防ぐのに十分であることを意味する。上記のように、これらすべての緑色および遠赤色蛍光体は、吸光係数が高いため、市販の色素よりもはるかに明るい。
【0043】
ここで説明する高輝度蛍光体は、共焦点蛍光顕微鏡分析下で厳密に焦点を合わせたレーザーの照射下でさえも光安定性がある。例えば、ＨｅＬａ細胞の赤色蛍光体１２０を５日間監視し、同じ顕微鏡設定（同じ焦点比、同じ光源パワー、同じゲイン、および同じ励起波長）を使用して調べた場合、目に見える蛍光強度の減少を示さなかった。これは、本明細書に記載される例示的な蛍光体が、細胞顕微鏡イメージングに通常使用される従来技術の染色よりも光安定性であることを示している。さらに、娘細胞では増殖とシグナルの安定性が観察された。この結果は、本明細書に記載の蛍光体の構造が安定的で、生物学的に適合性があり、生体外および生体内で追跡用の光安定染色剤としても使用できることを示唆している。
【0044】
さらに、上記の赤色蛍光体１２０とともに培養した細胞は、色素‐リンカーの濃度と蛍光強度の関係を示した。これは、赤、緑、および遠赤色の蛍光体について上述した蛍光強度が細胞内で同じ傾向を有していることを意味し、したがって、生体外および生体内の細胞追跡用途に応用することができる。
【0045】
上述した例示的な蛍光体は、１種類の蛍光要素２６のみを含むが、単一のキャリア２２に連結された複数の種類の蛍光要素２６を含む蛍光体２０も考えられる。
【0046】
さらに、本明細書に記載の任意の蛍光体２０は、同じまたは異なるリンカー２４を使用する蛍光要素２６に加えて、抗体などの生体分子と結合させることもできる。これにより、細胞膜、または細胞内のその他の構造に対する特定の生物学的標識のために、蛍光体２０を生体分子と同時に官能化することが可能になる。抗体または他の生体分子は、既知の方法および化学によりリンカー２４に付着させることができる。上述したように、リンカー２４はＲ官能基を含み、他の分子への結合を促進する。Ｒ基は、リンカー２４に付着される生体分子に従って選択され得る。例えば、モノスルホン－チオール反応を使用して、抗体をモノスルホンＲ－基に結合させることができる。マレイミドＲ基も使用できる。
【0047】
一例では、上述した５０００ＭＷのリンカー２２４を有する緑色蛍光体２２０は、ＢＮＮＴキャリア２２２上の抗ヒトＣＤ４と同時標識された。吸収スペクトルは、蛍光体２２０上の抗体濃度が、ＣＤ４を有する市販のＦＩＴＣ蛍光体のそれに匹敵することを示した。ＣＤ４を有する蛍光体２２０は、市販の抗ヒトＣＤ４ ＦＩＴＣ化合物よりも４倍低い濃度で５倍高い蛍光強度を有していた。
【0048】
抗体に加えて、またはその代わりに、蛍光体２０は、上記と同じ方法で、リンカー２４を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、または、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体などの他の高分子で標識することもできる。
【0049】
二重官能基を含む架橋剤を使用して、リンカー２４を他の要素、例えば蛍光要素２６、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体などに接続することもできる。架橋剤の例は、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、スルホ－ＳＭＣＣ（（スルホスクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＡＭＡＳ（Ｎ－ａ－マレイミドアセト）－オキシスクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ν－β－マレイミドプロピル－オキシスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ν－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル）、スルホ－ＧＭＢＳ、ＭＢＳ（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、スルホ－ＭＢＳ、ＥＭＣＳ（Ν－ε－マレミドカプロイル－オキシスクシンイミドエステル）、スルホ－ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ（スクシンイミジル ４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート）、スルホ－ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル ６－（（ベータ－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート）、ＬＣ－ＳＭＣＣスクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）、スルホ－ＫＭＵＳ（Ｎ－κ－マレイミドウンデカノイル－オキシスルホスクシンイミドエステル）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ （ｎ＝２，４，６，８，１２，２４） （ＰＥＧ化ＳＭＣＣ架橋剤）、ＳＰＤＰ（３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジル）、ＬＣ－ＳＰＤＰ、スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－ａ（２－ピリジルジチオ）トルエン）、ＰＥＧｎ－ＳＰＤＰ （ｎ＝２，４，１２，２４）、ＳＩＡ（ヨード酢酸Ｎ－スクシンイミジル）、ＳＢＡＰ（３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸スクシンイミジル）、ＳＩＡＰ（スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸）、スルホ－ＳＩＡＰ、ＡＮＢ－ＮＯＳ（Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド）、スルホ－ＳＡＮＰＡＨ（スルホスクシンイミジル ６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート）、ＳＤＡ（４，４'－アジペンタン酸スクシンイミジル）、スルホ－ＳＤＡ、ＬＣ－ＳＤＡ、スルホ－ＬＣ－ＳＤＡ、ＳＤＡＤ（スクシンイミジル２－（（４，４'－アジペンタンアミド）エチル）－１，３'－ジチオプロピオネート）、スルホ－ＳＤＡＤ、ＤＣＣ（Ν，Ν'－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＭＣＨ（Ν－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド）、ＭＰＢＨ（４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、ＫＭＵＨ（Ν－κ－マレイミドウンデカン酸ヒドラジド）、ＰＤＰＨ（３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド）、ＰＭＰＩ（ｐ－マレイミドフェニルイソシアネート）、ＳＰＢ（スクシンイミジル－［４－（ソラレン－８－イルオキシ）］－ブチレート）である。
【0050】
上記の説明は、本質的に限定的ではなく例示的なものである。本発明の本質から必ずしも逸脱しない、開示された例の変形および修正が当業者に明らかとなるであろう。本発明に付与の法的保護の範囲は、添付の特許請求の範囲を検討することによってのみ決定することができる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】