特許 7116809 バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸合成遺伝子を用いた表面発現ベクター、及びそれを用いたタンパク質の微生物表面発現方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-02

(45)【発行日】2022-08-10

(54)【発明の名称】バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸合成遺伝子を用いた表面発現ベクター、及びそれを用いたタンパク質の微生物表面発現方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/74 20060101AFI20220803BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220803BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220803BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220803BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220803BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220803BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20220803BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220803BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220803BHJP

【ＦＩ】

C12N15/74 110Z

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12P21/02 C

A61K35/12

A61P37/04

C12N15/52 Z ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/31

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020570004

(86)(22)【出願日】2019-06-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-10-21

(86)【国際出願番号】 KR2019007592

(87)【国際公開番号】W WO2020004877

(87)【国際公開日】2020-01-02

【審査請求日】2020-12-15

(31)【優先権主張番号】10-2018-0073345

(32)【優先日】2018-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】519220124

【氏名又は名称】バイオリーダース コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】パク ヨン チュル

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ジェ ウォン

(72)【発明者】

【氏名】パク ホン ギュ

(72)【発明者】

【氏名】カン ヒュン ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ビョン セ ウン

(72)【発明者】

【氏名】パク クワン セオ

(72)【発明者】

【氏名】キ ダエ ウン

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５１４４６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／１２６６８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１０－５２１９８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５１４４６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５０１６６８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｐ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡと目的タンパク質をコードする遺伝子とを含む目的タンパク質の表面発現ベクターであって、
前記ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１３～１５および配列番号２４～２６のうちのいずれか一つの塩基配列からなることを特徴とする目的タンパク質の表面発現ベクター。

【請求項2】

前記遺伝子ｐｇｓＡは、ポリ－γ－グルタミン酸を生産するバチルス属菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。

【請求項3】

前記遺伝子ｐｇｓＡの末端部位にリンカーが挿入されており、前記挿入されたリンカーに目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項１に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。

【請求項4】

乳酸菌由来のアルドラーゼプロモーターを含むことを特徴とする請求項１に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。

【請求項5】

請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の表面発現ベクターで形質転換された微生物。

【請求項6】

微生物は、乳酸菌であることを特徴とする請求項５に記載の形質転換された微生物。

【請求項7】

請求項５に記載の形質転換された微生物を培養して目的タンパク質を細胞表面に発現させるステップと、目的タンパク質が表面に発現された細胞を回収するステップとを含むことを特徴とする目的タンパク質の細胞表面発現方法。

【請求項8】

目的タンパク質は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、シグナル伝達タンパク質またはその一部、抗体またはその一部、単鎖抗体、結合タンパク質、結合ドメイン、ペプチド、抗原、付着タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子、および植物生体防御誘導タンパク質からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項７に記載の方法。

【請求項9】

請求項８に記載の方法により製造され、抗原が表面に発現された細胞をヒト以外の脊椎動物に投与することにより、体液性免疫または細胞性免疫を誘導することを特徴とする方法。

【請求項10】

前記ベクターは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌に適用されることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。

【請求項11】

下記ステップを含むことを特徴とするグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞の表面に目的タンパク質を発現させる方法：
（ａ）請求項１０に記載の目的タンパク質の表面発現ベクターに、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入して組換えベクターを製造するステップ；
（ｂ）前記組換えベクターでグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞を形質転換するステップ；および
（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して目的タンパク質を宿主細胞表面に発現させるステップ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質（ｐｇｓＡ）を用いて、外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現させる新しいベクターに関する。また、本発明は、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を用いて、外来タンパク質を微生物の表面に発現させるタンパク質の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞表面発現技術は、タンパク質やペプチドなどを適切な表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）と融合させてグラム陰性菌、陽性菌、カビ、酵母、または動物細胞の表面に発現させる技術を指す（Ｌｅｅ ＳＹ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：４５５２，２００３）。１９８０年代に開発された最初の細胞表面発現技術によれば、比較的単純な表面を有するファージを用いて、ペプチドや小さなタンパク質を繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）のｐＩＩＩと融合させて発現させ、これは表面発現システム（ｓｕｒｆａｃｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）と呼ばれていた。ファージを用いた細胞表面発現は、抗体のスクリーニングやエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）、高親和性リガンド（ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｉｇａｎｄ）などのスクリーニングに使用されたが、ファージ表面に発現し得るタンパク質のサイズが比較的限られているという限界があった。このため、その代替として、バクテリアを用いた細胞表面発現が開発されてきた。バクテリアや酵母などの微生物の表面タンパク質を表面発現母体（ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）として使用して、外来タンパク質を微生物の表面に安定して発現させる分野である。

【0003】

特定の有機体の外膜タンパク質を用いて細胞表面に外来タンパク質を発現させるためには、適切な表面タンパク質と外来タンパク質を遺伝子レベルでつなぎ合わせて融合タンパク質を生合成し、それを安定して細胞内膜を通過させて細胞表面に付着させて維持する必要がある。そのためには、表面発現母体として、次のような特定を有するタンパク質を使用することが好ましい。第一に、タンパク質は、そのＮ末端において、細胞内膜を通過することのできる分泌シグナル（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を有するべきである。第二に、タンパク質は、細胞外膜表面に安定して付着できる標的シグナル（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を持っている必要がある。第三に、タンパク質が高い活性を示すことができるように、タンパク質は細胞の成長に悪影響を及ぼさない範囲内で細胞表面に大量に発現される必要がある。そして最後に、タンパク質はそのサイズに関係なく安定して発現され、様々な反応に使用できる必要がある（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１１：６，１９９３）。このような表面発現母体は、宿主細胞の表面の外膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端、またはタンパク質の中央に挿入されるように遺伝的に操作する必要もある（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ、２１：４５、２００３）

【0004】

タンパク質が細菌の表面に発現するためには、細胞内で生合成されたタンパク質が細胞膜を通過することを可能にする分泌シグナル（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）が、そのタンパク質の一次配列に位置している必要がある。さらに、グラム陰性菌の場合、タンパク質は細胞内膜と細胞膜空間を通過し、細胞外膜に挿入されて付着し、このとき、膜外に突出するように定着しなければならない。

【0005】

細菌の場合、このような分泌シグナル及び細胞表面に定着させる標的シグナル（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を有するタンパク質の例には、表面タンパク質、特殊酵素、毒素タンパク質などが含まれる。実際、これらのタンパク質の分泌シグナルと標的シグナルなどを適当なプロモーターと一緒に使用すれば、タンパク質を細菌表面でうまく発現させることができる。

【0006】

外来タンパク質の表面発現に使用される細菌の表面タンパク質は、細胞外膜タンパク質、リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質などの４つのタイプに大きく分けることができる。現在までに、主にグラム陰性菌に存在する表面タンパク質、例えば、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＯｍｐＡなどを使用して、必要な外来タンパク質を細菌表面に発現させる試みがなされてきた。これらのタンパク質を使用すると、外来タンパク質が細胞表面の突出したループ（ｌｏｏｐ）に挿入されるため、構造的に挿入できるタンパク質のサイズが制限される。また、挿入する外来タンパク質のＣ末端とＮ末端は立体的に近接している必要があるため、Ｃ末端とＮ末端との距離が長いと、連結ペプチドによって二つの末端を互いに近づけるべきであるという問題がある。

【0007】

実際、ＬａｍＢまたはＰｈｏＥを使用して５０～６０個以上のアミノ酸からなる外来ポリペプチドを挿入した場合、構造上の制限により安定した膜タンパク質が形成されなかった［Ｃｈａｒｂｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：１６５８－１６６４（１９８７）；Ａｇｔｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，８：８５－９１（１９９０）］。ＯｍｐＡを使用して外来タンパク質を突出ループに挿入する場合もあっったが、構造上の制限を克服するために、細胞外膜に定着させることのできる最小限の標的シグナルを含む、一部ＯｍｐＡ断片のみを使用した。この方法として、β－ラクタマーゼ（β－ｌａｃｔａｍａｓｅ）をＯｍｐＡ標的シグナルのＣ末端に連結して細胞表面に発現させた例がある。

【0008】

また、近年、グラム陰性菌の外膜タンパク質として、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に由来する氷核形成タンパク質（Ｉｃｅ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＩＮＰ）を用いた表面発現が試みられた［Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：５７６－５６０（１９９８），Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，２２（５）：３４８－３５４（１９９８），Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：６４５－６４８（２０００）］。Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．等は、Ｎ末端、中央の繰り返し区間、およびＣ末端からなる氷核形成タンパク質のＣ末端にレバンスクラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ）を融合させ、また、中央の繰り返し区間が削除されたＮ末端およびＣ末端からなる氷核形成タンパク質のＣ末端にカルボキシメチルセルラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ）を融合させ、それぞれを表面発現させて酵素活性を測定し確認した。また、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．などは、Ｎ末端、あるいは、Ｎ末端とＣ末端からなる氷核形成タンパク質のそれぞれの末端にＢ型肝炎ウイルスの表面抗原とＣ型肝炎ウイルスのコア（ｃｏｒｅ）抗原を融合させ、大腸菌またはサルモネラチフィＴｙ２１ａ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ Ｔｙ２１ａ）菌株の表面に発現させた後、これらを複合生ワクチンとして使用できることを確認した。

【0009】

リポタンパク質もまた表面タンパク質として表面発現に用いられている。特に、大腸菌リポタンパク質は、Ｎ末端に分泌シグナルを持ち、細胞内膜を通過することができ、その末端のシステイン（Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が、共有結合により細胞外膜脂質または細胞内膜脂質と直接結合されている。主なリポタンパク質であるＬｐｐは、Ｎ末端で細胞外膜に結合し、Ｃ末端で細胞壁（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ、ＰＧ）に結合しているため、細胞外膜タンパク質ＯｍｐＡ断片と連結されると、安定的に外来タンパク質を細胞外膜まで分泌して表面発現できる［Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８９：２７１３－２７１７（１９９２）］。また、他のリポタンパク質であるＴｒａＴは、リポタンパク質のこのような特性を用いて、ポリオウイルスのＣ３エピトープなどのペプチドを表面発現させるために使用された［Ｆｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：３０１－３１０（１９９１）］。さらに、正確な機能がまだ知られていないペプチドグリカン関連リポタンパク質（Ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＬ）も、組換え抗体の表面発現に使用された［Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：１３６９－１３７２（１９９１）］。この場合、ＰＡＬのＣ末端は細胞壁に連結され、Ｎ末端は組換え抗体に連結されて融合タンパク質が表面発現された。

【0010】

細胞外膜を通過する分泌タンパク質をも表面タンパク質として使用できるが、グラム陰性菌の場合、分泌タンパク質が発達せず、一部の分泌タンパク質についてのみ、分泌タンパク質の特有の分泌メカニズムに関与するタンパク質が存在し、分泌タンパク質が細胞外膜を通過するのを助けている。例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のプルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ）は、リポタンパク質であり、Ｎ末端が脂質に置き換わって細胞外膜に付着しており、細胞培養液中に完全に分泌される。Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．等がプルラナーゼのＮ末端断片を用いて細胞表面にβ－ラクタマーゼを発現させたが、発現されたプルラナーゼ／β－ラクタマーゼ融合タンパク質が一時的に細胞表面に付着しており、すぐに細胞培養液中に遊離されるという欠点があった。また、これを用いて、ペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）タンパク質であるアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を発現させた場合、少なくとも１４個以上のタンパク質がアルカリホスファターゼの分泌に関与しているため、安定して表面発現されなかった［Ｋｏｒｎａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ。Ｍｉｃｒｏｌ．，４：１１０１－１１０９（１９９０）］。

【0011】

独特の分泌システムを持つ病原微生物ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）由来のＩｇＡプロテアーゼは、Ｃ末端の断片とＮ末端のプロテアーゼとを細胞外膜に定着させるシグナルを持っている。一旦細胞外膜に到達して細胞表面に突出したプロテアーゼは、自体の加水分解能力によって細胞培養液に分泌される。Ｋｌａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．等は、このＩｇＡプロテアーゼ断片を用いて、約１２ｋＤａのコレラ毒素Ｂサブユニットを細胞表面に安定して発現させた［Ｋｌａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１９９１－１９９９（１９９０）］。しかし、融合タンパク質の分泌は、分泌過程中にペリプラズム空間で発生したタンパク質の折り畳み（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ）によって阻害された。

【0012】

さらに、グラム陰性菌の場合、細胞表面に存在し、表面発現に適用できる細胞小器官としては、鞭毛（Ｆｌａｇｅｌｌａ）、ピリ（Ｐｉｌｉ）及びフィムブリエ（Ｆｉｍｂｒｉａｅ）などがある。コレラ毒素ＢサブユニットとＢ型肝炎ウイルス由来のペプチドは、鞭毛の構成サブユニットである鞭毛タンパク質（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を用いて、安定して発現され、それらに対する抗体と強く反応した［Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４： ７０－７２（１９８９）］。糸のように見えるフィムブリエの構成タンパク質であるフィンブリリン（ｆｉｍｂｒｉｌｉｎ）を用いて、細胞表面に外来ペプチドを発現させようと試みた結果、小さなペプチドしか発現されなかった［Ｈｅｄｅｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ、８５：１１５－１２４（１９８９）］。

【0013】

上記のようにグラム陰性菌の表面タンパク質を使用して試みられた表面発現に加えて、グラム陽性菌の表面タンパク質を使用して試みられた表面発現が最近行われた［Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７７：１４７０－１４７６（１９９５）］。この場合でも、細胞内膜を通過できる分泌シグナルと、細胞膜に付着する表面発現母体とを必要とする。実際、ブトウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）由来のリパーゼを分泌シグナルとして用い、黄色ブトウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡを膜付着母体として用いて、８０個のアミノ酸からなるマラリア血液段階抗原（ｍａｌａｒｉａ ｂｌｏｏｄ ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎ）とストレプトコッカスタンパク質Ｇ由来のアルブミン付着タンパク質とを、グラム陽性菌の表面に効果的に発現させた例がある。

【0014】

前記したグラム陰性菌および陽性菌の表面での発現に関する上記の研究を通じて多くの有用なタンパク質発現システムが開発されており、米国、ヨーロッパ、日本などで出願されてきた。その中で、特にグラム陰性菌の細胞外膜タンパク質の使用に関して５例（ＷＯ９５０４０６９、ＷＯ９３２４６３６、ＷＯ９３１０２１４、ＥＰ６０３６７２，ＵＳ５３５６７９７）があり、細胞表面器官であるピり（ｐｉｌｉ）の使用に関して１例（ＷＯ９４１０３３０）があり、また、細胞表面リポタンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の使用に関して１例（ＷＯ９５０４０７９）がある。

【0015】

上記のように細菌の細胞外膜タンパク質を用いて細胞表面に外来タンパク質を発現させるためには、適切な細胞外膜タンパク質と外来タンパク質とを遺伝子レベルで連結して融合タンパク質の生合成を誘導する必要があり、これらが安定して細胞内膜を通過し、細胞外膜に付着して維持されるようにする必要がある。しかしながら、上記のすべての条件を満たす表面発現母体はまだ開発されておらず、これまでのところ、上記の場合の欠点を補完するレベルである。

【0016】

このような背景の下で、本発明者らは、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸合成遺伝子（ｐｇｓＡ）を新たな表面発現母体として使用することについて鋭意検討および研究を重ねた。その結果、ｐｇｓＡ遺伝子を用いて微生物表面に外来タンパク質を効果的に発現させる新しいベクター、および、微生物表面に外来タンパク質を大量に発現させる方法を開発し、本発明を完成させるに至った。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

本発明は、微生物の表面に外来タンパク質を大量に発現させることのできる表面発現母体として、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を選択し、これを用いて、外来タンパク質またはペプチドを微生物の表面に発現させることのできる目的タンパク質の表面発現ベクターを製造し、これにより形質転換された様々な形質転換体において、外来タンパク質を形質転換体の表面に効率よく発現させる方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

前記目的を達成するために、本発明は、ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡと目的タンパク質をコードする遺伝子とを含む目的タンパク質の表面発現ベクターであって、前記ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１３～１６および配列番号２４～２６のうちのいずれか一つの塩基配列を有することを特徴とする目的タンパク質の表面発現ベクターを提供する。

【0019】

本発明において、前記遺伝子ｐｇｓＡは、ポリ－γ－グルタミン酸を生産するバチルス属菌株に由来することを特徴としてもよい。

【0020】

本発明において、前記ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１７の塩基配列を有することを特徴としてもよい。

【0021】

本発明において、前記遺伝子ｐｇｓＡの末端部位にリンカーが挿入されており、前記挿入されたリンカーに目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としてもよい。

【0022】

本発明において、前記目的タンパク質は、表面発現に有利になるように、目的タンパク質のアミノ酸配列の一部が除去されるか、または位置特異的に突然変異されたことを特徴としてもよい。

【0023】

本発明において、前記塩基配列は、乳酸菌由来のアルドラーゼプロモーターを含むことを特徴としてもよい。

【0024】

本発明はまた、前記表面発現ベクターで形質転換された微生物を提供する。本発明において、形質転換に使用された微生物は、目的タンパク質の細胞表面発現に有利になるように、発現された目的タンパク質の分解に関与する細胞内または細胞外のタンパク質分解酵素を生産できないように変形されたことを特徴としてもよい。

【0025】

本発明において、前記微生物は、乳酸菌であることを特徴としてもよい。本発明において、前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、およびビフィドバクテリウム属を含んでもよい。代表的に、ラクトバチルス属は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｅｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・デルブリュッキィ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＬＪＩ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）及びラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などを宿主として使用してもよく、ストレプトコッカス属は、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などを宿主として使用してもよく、ビフィドバクテリウム属は、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Ｂ．ｐｓｕｅｄｏｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢｂ－１２（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ Ｂｂ－１２）及びビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）などを宿主として使用してもよい。好ましくは、ラクトバチルス属である。

【0026】

本発明はまた、前記形質転換された微生物を培養して目的タンパク質を細胞表面に発現させるステップと、目的タンパク質が表面に発現された細胞を回収するステップとを含む目的タンパク質の細胞表面発現方法を提供する。

【0027】

本発明において、目的タンパク質は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、シグナル伝達タンパク質またはその一部、抗体またはその一部、単鎖抗体、結合タンパク質、結合ドメイン、ペプチド、抗原、付着タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子、および植物生体防御誘導タンパク質からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴としてもよい。

【0028】

本発明はまた、前記方法により製造され、抗原が表面に発現された細胞をヒト以外の脊椎動物に投与することにより、体液性免疫または細胞性免疫を誘導することを特徴とする方法を提供する。

【0029】

本発明はまた、前記ベクターは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌に適用されることを特徴とする目的タンパク質の表面発現ベクターを提供する。

【0030】

本発明はまた、（ａ）請求項１４に記載の目的タンパク質の発現用ベクターに、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入して組換えベクターを製造するステップと、（ｂ）前記組換えベクターでグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞を形質転換するステップと、（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して目的タンパク質を宿主細胞表面に発現させるステップと、を含むことを特徴とするグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞の表面に目的タンパク質を発現させる方法を提供する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡと目的タンパク質をコードする遺伝子とを含む目的タンパク質の表面発現ベクターであって、
前記ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１３～１６および配列番号２４～２６のうちのいずれか一つの塩基配列を有することを特徴とする目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔２〕前記遺伝子ｐｇｓＡは、ポリ－γ－グルタミン酸を生産するバチルス属菌株に由来することを特徴とする前記〔１〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔３〕前記ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡは、配列番号１７の塩基配列を有することを特徴とする前記〔１〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔４〕前記遺伝子ｐｇｓＡの末端部位にリンカーが挿入されており、前記挿入されたリンカーに目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする前記〔１〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔５〕前記目的タンパク質は、表面発現に有利になるように、目的タンパク質のアミノ酸配列の一部が除去されるか、または位置特異的に突然変異されたことを特徴とする前記〔１〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔６〕前記塩基配列は、乳酸菌由来のアルドラーゼプロモーターを含むことを特徴とする前記〔１〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔７〕前記塩基配列は、乳酸菌由来のアルドラーゼプロモーターを含むことを特徴とする前記〔３〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔８〕前記〔１〕乃至前記〔７〕のいずれか一項に記載の表面発現ベクターで形質転換された微生物。
〔９〕形質転換に使用された微生物は、目的タンパク質の細胞表面発現に有利になるように、発現された目的タンパク質の分解に関与する細胞内または細胞外のタンパク質分解酵素を生産できないように変形されたことを特徴とする前記〔８〕に記載の形質転換された微生物。
〔１０〕微生物は、乳酸菌であることを特徴とする前記〔８〕に記載の形質転換された微生物。
〔１１〕前記〔８〕に記載の形質転換された微生物を培養して目的タンパク質を細胞表面に発現させるステップと、目的タンパク質が表面に発現された細胞を回収するステップとを含むことを特徴とする目的タンパク質の細胞表面発現方法。
〔１２〕目的タンパク質は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、シグナル伝達タンパク質またはその一部、抗体またはその一部、単鎖抗体、結合タンパク質、結合ドメイン、ペプチド、抗原、付着タンパク質、構造タンパク質、調節タンパク質、毒素タンパク質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子、および植物生体防御誘導タンパク質からなる群から選択されるいずれか一つであることを特徴とする前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕前記〔１２〕に記載の方法により製造され、抗原が表面に発現された細胞をヒト以外の脊椎動物に投与することにより、体液性免疫または細胞性免疫を誘導することを特徴とする方法。
〔１４〕前記ベクターは、グラム陰性菌またはグラム陽性菌に適用されることを特徴とする前記〔１〕乃至前記〔７〕のいずれか一項に記載の目的タンパク質の表面発現ベクター。
〔１５〕下記ステップを含むことを特徴とするグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞の表面に目的タンパク質を発現させる方法：
（ａ）前記〔１４〕に記載の目的タンパク質の表面発現ベクターに、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入して組換えベクターを製造するステップ；
（ｂ）前記組換えベクターでグラム陰性またはグラム陽性宿主細胞を形質転換するステップ；および
（ｃ）前記形質転換された宿主細胞を培養して目的タンパク質を宿主細胞表面に発現させるステップ。

【発明の効果】

【0031】

本発明による目的タンパク質の表面発現ベクターは、目的タンパク質を安定して発現させることができ、本発明による表面発現ベクターは、目的タンパク質を恒常的に発現させながら、同時に組換え微生物に表面発現させて必要なワクチン製造用抗原の作製などに有用に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰの遺伝子地図を示すものである。

【図2】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１（ＰｇｓＡモチーフ１－６０ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図3】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ２（ＰｇｓＡモチーフ１－７０ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図4】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ３（ＰｇｓＡモチーフ１－８０ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図5】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ５（ＰｇｓＡモチーフ１－１００ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図6】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ５（ｐＫＶ－ＰｇｓＡ １－１８８ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図7】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ６（ＰｇｓＡモチーフ２５－６０ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図8】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ７（ＰｇｓＡモチーフ２５－７０ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図9】本発明による、ラクトバチルス・カゼイを宿主として用いる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８（ＰｇｓＡモチーフ２５－１００ａ.ａ－ＥＧＦＰ）の遺伝子地図を示すものである。

【図10】本発明の表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１乃至ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８のそれぞれで形質転換されたラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰタンパク質の表面発現を示すウエスタンブロット写真を示すものである。

【発明を実施するための形態】

【0033】

実施例１で製造された表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を使用して、乳酸菌宿主においてより安定して高い発現率を示すことができるように、ＰｇｓＡの遺伝子を断片化する改良を行った。

【0034】

まず、ＰｇｓＡ断片のうちの１－６０ａ.ａ、１－７０ａ.ａ、１－８０ａ.ａ、１－１００ａ.ａ、１－１８８ａ.ａを含むＰｇｓＡ断片を得るために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型とし、配列番号３～１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

【0035】

その結果、アルドラーゼプロモーターを含み、それぞれのＰｇｓＡモチーフ断片を含むＤＮＡ切片が得られた。前記切片の５’末端には、ＳｐｈＩ制限酵素部位が含まれ、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。得られたＤＮＡ切片をＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで処理して切片を得た。また、それぞれのＰｇｓＡ１～Ａ５モチーフ断片は配列番号１３～１７の塩基配列を有することが確認された。

【0036】

一方、ＰｇｓＡ断片のうちの２５－６０ａ.ａ、２５－７０ａ.ａ、２５－１００ａ.ａを含むＰｇｓＡ断片を得るために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型とし、配列番号１８～２３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

【0037】

その結果、それぞれのＰｇｓＡモチーフ断片を含むＤＮＡ切片が得られた。前記切片の５’末端には、ＥｃｏＲＶ制限酵素部位が含まれ、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。得られたＤＮＡ切片をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理して切片を得た。また、それぞれのＰｇｓＡモチーフ断片は配列番号２４～２６の塩基配列を有することが確認された。

【0038】

本発明は、微生物の表面に外来タンパク質を大量に発現させることのできる新しい表面発現母体として、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を選択し、これを用いて、外来タンパク質またはペプチドを微生物の表面に発現させることのできる表面発現ベクターを製造し、これにより形質転換された様々な形質転換体において、外来タンパク質を形質転換体の表面に効率的に発現させる方法を提供することを目的とする。

【0039】

上記目的を達成するために、本発明は、ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＡを含む微生物表面発現ベクター、及び前記ベクターで形質転換された菌株を提供する。

【0040】

また、本発明は、上記目的を達成するために、前記微生物表面発現ベクターを用いて、外来タンパク質を形質転換菌株の表面に発現させる方法を提供する。

【0041】

遺伝子ｐｇｓＡがコードするタンパク質は、バチルス属に存在する細胞外膜タンパク質であり、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３６；納豆菌；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ．，２６３，６－１２，１９９９）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ９９４５；Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ。５７（４）、４３０－４３７，１９９８）、バチルス・アンシラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７１、７２２－７３０、１９８９）などから生産される食用、水溶性、陰イオン性、生分解性高分子物質であるポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与するタンパク質である。

【0042】

納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３６）の場合、細菌から分離された細胞外膜タンパク質は、全９２２個のアミノ酸からなるタンパク質であり、ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡから構成されており、ｐｇｓＢは３９３アミノ酸、ｐｇｓＣは１４９アミノ酸、そしてｐｇｓＡは３８０アミノ酸から構成されている。芦内（Ａｓｈｉｕｃｈｉ）らは、バチルス納豆菌由来のポリ－γ－グルタミン酸合成遺伝子をクローニングし、大腸菌に形質転換し、大腸菌でのポリ－γ－グルタミン酸の合成を観察した［Ａｓｈｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２６３：６－１２（１９９９）］。

【0043】

しかし、前記ポリ－γ－グルタミン酸合成酵素複合体をコードするタンパク質ｐｇｓＡの具体的な役割及び機能は、まだ明らかにされていない。但し、複合体の構成タンパク質のうち、ｐｇｓＢはアミドリガーゼ系であり、ｐｇｓＢのＮ末端の特定のアミノ酸が細胞膜又は細胞壁と相互作用し、ｐｇｓＡは、Ｎ末端およびＣ末端に親水性の特定のアミノ酸配列を有しており、ｐｇｓＡは、Ｎ末端およびＣ末端に親水性の特定のアミノ酸配列を有しており、ｐｇｓＢの助けとともに、これらアミノ酸配列が、細胞内膜の通過に際して、分泌シグナル、ターゲティングシグナル、および付着シグナルとして作用すると考えられている。

【0044】

本発明者らの研究の結果、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質は、そのミノ酸一次配列の構造と特性上、外来タンパク質を細胞表面に発現させる表面発現母体として多くの利点があることが明らかになった。第一に、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質は、ポリ－γ－グルタミン酸の合成および細胞外への分泌のために細胞表面に大量に発現され得る。第二に、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する、発現された細胞外膜タンパク質は、細胞周期の休止期においてさえ安定的に維持される。第三に、構造的に、特にｐｇｓＡは、細胞表面に突出しており、第四に、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質は、グラム陽性菌の表面に由来し、様々なグラム陽性菌またはグラム陰性菌のいずれの表面においても安定して発現され得る。

【0045】

本発明は、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の特性を用いて、外来タンパク質を細菌の表面に発現し得る有用なベクターを提供することを目的とする。特に、本発明の目的タンパク質の表面発現ベクターは、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の一次配列上に存在する分泌シグナル及び標的シグナルを含む。

【0046】

また、本発明は、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の特性を利用した表面発現ベクターを使用して、外来タンパク質を微生物の表面に発現させる方法を提供することを他の目的とする。特に、本発明は、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を使用して、外来タンパク質を微生物の表面に発現させることにより、細胞の破砕またはタンパク質の分離精製過程を経ずに外来タンパク質を効率的に使用することのできる外来タンパク質の製造方法を提供する。

【0047】

また、本発明において、前記「目的タンパク質」または「外来タンパク質」とは、前記タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞では正常には存在できないタンパク質を意味する。例えば、乳酸菌からウイルス由来または腫瘍由来のタンパク質を人工的に発現するように操作した場合、前記のタンパク質を外来タンパク質または目的タンパク質という。

【0048】

より具体的には、前記目的タンパク質は、好ましくは、感染性微生物、免疫疾患由来の抗原または腫瘍由来の抗原、例えば、真菌性病原体、バクテリア、寄生虫、腸内寄生虫（ｈｅｌｍｉｎｔｈ）、ウイルスまたはアレルギー誘発物質などを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。より詳細には、前記抗原は、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）または核タンパク質、ジフテリアトキソイド（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｏｉｄ）、ＨＩＶのｇｐ１２０またはその断片、ＨＩＶのｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、インシュリンペプチドＢ、ジャガイモ粉状そうか病（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）抗原、ビブリオ症（Ｖｉｂｒｉｏｓｅ）抗原、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）抗原、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）抗原、ＲＳウイルス（ＲＳＶ：Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）抗原、インフルエンザ菌（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）外膜タンパク質、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）抗原、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のピリン（ｐｉｌｉｎ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のピリン（ｐｉｌｉｎ）、メラノーマ関連タンパク質（ｍｅｌａｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３，ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ－１、ＨＳＰ－７０、β‐ＨＣＧ）、ＨＰＶ－１６、－１８、－３１、－３５、または－４５に由来するＥ１、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の抗原、ＣＥＡ腫瘍抗原、正常または変異型ｒａｓタンパク質、正常または変異型ｐ５３、Ｍｕｃ１、ｐＳＡなどを含み、また、コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、脳炎、耳下腺炎、百日咳、水痘、肺炎（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、小児麻痺、恐水病、風疹（ｒｕｂｅｌｌａ）、破傷風、結核、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、免疫反応誘発物質（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）、アレルギー誘発物質（ａｌｌｅｒｇｅｎ）、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む癌、後天性免疫不全症、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、肝などの移植拒否時に関与する因子などに由来する当業界に周知の抗原及び自己免疫を誘発する抗原などを含んでもよい。

【0049】

したがって、本発明の表面発現方法により生産された外来タンパク質を、様々な用途に提供することができる。このような用途には、抗体および酵素の効果的な生産、ならびに抗原、付着または吸着タンパク質、および新しい生理活性物質をスクリーニングするためのペプチドライブラリーの生産などが含まれる。

【0050】

バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質を含む、すべての種類のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する遺伝子を用いた表面発現ベクターは、すべて本発明の範囲に含まれる。

【0051】

また、本発明のポリ－γ－グルタミン酸の合成遺伝子を用いた表面発現ベクターは、外来タンパク質を微生物の表面に発現させるために、すべての菌株に適用可能であり、好ましくはグラム陰性菌、より好ましくは大腸菌、サルモネラチフィ、サルモネラチフィリウム、ビブリオコレラ、マイコバクテリウムボビス、シゲラ、およびグラム陽性菌、好ましくはバチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌株などに適用可能である。前記菌株を用いて外来タンパク質を製造するすべての方法は、本発明の範囲に含まれる。

【0052】

必要に応じて、ポリ－γ－グルタミン酸の合成遺伝子のＮ末端またはＣ末端にすべてまたは一部の制限酵素の様々な認識部位を挿入可能であり、これらの制限酵素部位が挿入された表面発現ベクターは、すべて本発明の範囲に含まれる。

【0053】

具体的には、本発明は、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸合成遺伝子であるｐｇｓＡを含み、ｐｇｓＡのＣ末端に制限酵素認識部位を挿入することにより、様々な外来タンパク質遺伝子を簡単にクローニングすることのできる表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１乃至ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８を提供する。

【0054】

本発明は、ポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質の複合体の中で細胞外膜タンパク質の複合体であるｐｇｓＡからなり、ｐｇｓＡのＣ末端にＥＧＦＰタンパク質のＮ末端を連結することにより、ＥＧＦＰタンパク質を融合タンパク質の形でグラム陽性菌の表面に発現し得る表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１乃至ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８を提供する。

【0055】

特に、一実施例によれば、バチルス・サブティリス清麹醤（チョングッチャン）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ．Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ、ＫＣＴＣ ０６９７ＢＰ）からポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質遺伝子ｐｇｓＡが得られたが、ポリ－γ－グルタミン酸を生産するすべてのバチルス属菌株からｐｇｓＡを得てベクターを製造したり、外来タンパク質を表面発現させたりすることもまた、本発明の範囲に含まれる。例えば、バチルス・サブティリス清麹醤に存在するｐｇｓＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他の菌株由来のｐｇｓＡ遺伝子を用いてベクターを製造したり、外来タンパク質を表面発現させたりすることもまた、本発明の範囲に含まれる。

【0056】

本発明の他の一実施例によれば、タンパク質が大腸菌細胞の表面で効率的に発現されるかどうかを調べるために、強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＥＧＦＰ）をモデルタンパク質として選択して確認した。「ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子」は、生体内で緑色光を発することにより、当該タンパク質を発現している細胞を観察しやすくする遺伝子であり、蛍光顕微鏡で観察できるという利点がある。ＧＦＰは、クラゲ（ｊｅｌｌｙｆｉｓｈ）（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ：オワンクラゲ）に由来する緑蛍光タンパク質であり、さまざまな研究分野で遺伝子発現の重要なマーカーとして使用されている。ＥＧＦＰは、ＧＦＰの突然変異体であり、元のＧＦＰの６４位のフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）のアミノ酸配列がロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）で置換され、６５位のセリン（Ｓｅｒｉｎｅ）のアミノ酸配列がスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）で置換されることにより、元のＧＦＰよりも強い蛍光シグナルを発するという利点がある。

【0057】

本発明者らは、前記作製された組換えベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１乃至ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８にＥＧＦＰ遺伝子を挿入して表面発現ベクターを作製し、これを用いてラクトバチルス・カゼイを形質転換した後、培養して発現を誘導し、一定量の培養液を採取してタンパク質を得た。得られた前記タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、抗ＥＧＦＰ抗体を用いてウエスタンブログティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。その結果、前記作製された組換えベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１乃至ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８にタンパク質ＥＧＦＰが正常に挿入され、細胞表面に発現していることが確認された。

【0058】

また、前記実施例では、ＥＧＦＰタンパク質を外来タンパク質として使用したが、他の酵素、抗原、抗体、付着タンパク質または吸着タンパク質などのいかなるタンパク質も外来タンパク質として使用することができる。

【0059】

また、下記実施例では、グラム陽性菌に適用される表面発現ベクターを製造し、宿主細胞としてラクトバチルス・カゼイを使用したが、ラクトバチルス・カゼイ以外のいかなるグラム陽性菌を宿主細胞として使用することができ、グラム陽性菌以外のいかなるグラム陰性菌およびその他の細菌に形質転換することも、当業者には自明であろう。

【0060】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は、ひたすら本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であるであろう。

【0061】

実施例１：表面発現ベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰの製造
前記ＥＧＦＰ発現ベクターを製造するために、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７（韓国登録特許第１０－１４７１０４３号参照）から製造された表面発現ベクターを使用してＰｇｓＡのＣ末端にＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、乳酸菌で表面発現できるベクターｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰを得た。

【0062】

まず、ｐｇｓＡと融合したＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子をｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７ベクターから除去し、ＥＧＦＰをコードする遺伝子を挿入した。合成ＥＧＦＰ遺伝子断片を鋳型とし、配列番号１および配列番号２のプライマーを用いてＰＣＲにより取得した。

【0063】

配列番号１：
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’

【0064】

その結果、ＥＧＦＰ遺伝子を含む７５５ｂｐの切片が得られた。前記切片の５’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれ、前記切片の３’末端にはＸｂａＩ制限酵素部位が含まれている。得られたＤＮＡ切片をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素で処理して切断して７４１ｂｐ切片を得た。

【0065】

ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－Ｅ７をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断し、ＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子部分を除去してベクター部分を得た。

【0066】

ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切断したＥ７遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で切断したベクターと連結してｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰを完成させた（図１）。

【0067】

実施例２：表面発現ベクターＰｇｓＡモチーフの改良
本実施例では、実施例１で製造された表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を使用して、乳酸菌宿主においてより安定して高い発現率を示すことができるように、ＰｇｓＡの遺伝子を断片化する改良を行った。

【0068】

まず、ＰｇｓＡ断片のうちの１－６０ａ.ａ、１－７０ａ.ａ、１－８０ａ.ａ、１－１００ａ.ａ、１－１８８ａ.ａを含むＰｇｓＡ断片を得るために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

【0069】

ＰｇｓＡモチーフ１－６０ａ.ａ
配列番号３：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号４：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’

【0070】

ＰｇｓＡモチーフ１－７０ａ.ａ
配列番号５：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号６：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’

【0071】

ＰｇｓＡモチーフ１－８０ａ.ａ
配列番号７：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号８：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡ－３’

【0072】

ＰｇｓＡモチーフ１－１００ａ.ａ
配列番号９：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号１０：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’

【0073】

ＰｇｓＡモチーフ１－１８８ａ.ａ
配列番号１１：
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号１２：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴ－３’

【0074】

その結果、アルドラーゼプロモーターを含み、それぞれのＰｇｓＡモチーフ断片を含むＤＮＡ切片が得られた。前記切片の５’末端にはＳｐｈＩ制限酵素部位が含まれ、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。得られたＤＮＡ切片をＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで処理して切片を得た。また、それぞれのＰｇｓＡ１～ＰｇｓＡ５モチーフ断片は以下のような塩基配列を有することが確認された。

【0075】

ＰｇｓＡ １－６０ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ１）
配列番号１３：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’

【0076】

ＰｇｓＡ １－７０ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ２）
配列番号１４：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’

【0077】

ＰｇｓＡ １－８０ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ３）
配列番号１５：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡ－３’

【0078】

ＰｇｓＡ １－１００ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ４）
配列番号１６：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡ－３’

【0079】

ＰｇｓＡ １－１８８ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ５）
配列番号１７：
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣ－３’

【0080】

前記ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰをＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アルドラーゼプロモーターとＰｇｓＡ遺伝子部分を除去したベクター部分を取得した。

【0081】

ＳｐｈＩおよびＢａｍＨＩで切断したアルドラーゼプロモーターを含み、それぞれのＰｇｓＡモチーフ遺伝子断片を含有しているＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で切断したベクターと連結することにより、改良されたベクターを完成させた（図２～図６）。

【0082】

一方、ＰｇｓＡ断片のうちの２５－６０ａ.ａ、２５－７０ａ.ａ、２５－１００ａ.ａを含むＰｇｓＡ断片を得るために、表面発現ベクター（ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰ）を鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。

【0083】

ＰｇｓＡモチーフ２５－６０ａ.ａ
配列番号１８：
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
配列番号１９：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’

【0084】

ＰｇｓＡモチーフ２５－７０ａ.ａ
配列番号２０：
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
配列番号２１：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’

【0085】

ＰｇｓＡモチーフ２５－１００ａ.ａ
配列番号２２：
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
配列番号２３：
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’

【0086】

その結果、それぞれのＰｇｓＡモチーフ断片を含むＤＮＡ切片が得られた。前記切片の５’末端にはＥｃｏＲＶ制限酵素部位が含まれ、前記切片の３’末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が含まれている。得られたＤＮＡ切片をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理して切片を得た。また、それぞれのＰｇｓＡモチーフ断片は以下のような塩基配列を有することが確認された。

【0087】

ＰｇｓＡ ２５－６０ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ６）
配列番号２４：
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’

【0088】

ＰｇｓＡ ２５－７０ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ７）
配列番号２５：
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’

【0089】

ＰｇｓＡ ２５－１００ａ.ａ断片配列（ＰｇｓＡ８）
配列番号２６：
５’－ＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧ－３’

【0090】

ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで切断し、ＰｇｓＡ遺伝子部分を除去したベクター部分を得た。

【0091】

ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで切断したそれぞれのＰｇｓＡモチーフ遺伝子断片を含有しているＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で切断したベクターと連結することにより、改良されたベクターを完成させた（図７～図９）。

【0092】

実施例３：ＰｇｓＡモチーフ改良表面発現ベクター形質転換体の発現の確認
本実施例では、実施例２で製作されたＰｇｓＡモチーフ改良表面発現ベクターでラクトバチルス・カゼイを形質転換し、前記形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイを培養して、ＥＧＦＰタンパク質の発現を確認した。形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおいて、改良された断片ｐｇｓＡ１～ｐｇｓＡ８のうちのいずれか一つと融合したＥＧＦＰタンパク質が発現したかどうかを調べた。

【0093】

ＰｇｓＡモチーフ断片表面発現ベクターで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイを、ＭＲＳ培地（ラクトバチルスＭＲＳ、ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー、スパークス、米国）で３０℃にて静置培養して、ポリ－γ－グルタミン酸を合成する遺伝子断片ｐｇｓＡ１～ｐｇｓＡ８のうちのいずれか一つのＣ末端と融合したＥＧＦＰタンパク質の表面発現を誘導した。

【0094】

前記培養されたラクトバチルス・カゼイの全細胞に対して、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＥＧＦＰに対する特異抗体を使用したウエスタンブロットを行い、前記融合タンパク質の発現を確認した。

【0095】

具体的には、発現が誘導された、形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイの全細胞を、同じ細胞濃度で得られたタンパク質で変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ、ディネイチャー）させて試料を準備し、これをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した後、分画されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、ポリフッ化ビニリデンメンブレン、バイオラッド社製）に転写した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦメンブレンを、ブロッキング緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）、ｐＨ８．０）で１時間振とうすることでブロッキングした後、ＥＧＦＰに対するウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝液に１０００倍希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝液で洗浄し、ウサギに対するＨＲＰ結合２次抗体をブロッキング緩衝液に１００００倍希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、洗浄されたメンブレンに基質（ｌｕｍｉｇｅｎ ＰＳ－３ ａｃｒｉｄａｎ、Ｈ₂０₂）を加えて約２分間発色させ、ＣＣＤカメラでＥＧＦＰに対する特異抗体と前記融合タンパク質との間の特異的な結合を確認した（図１０）。

【0096】

図１０は、本発明との比較のための対照群として設定された、改良されていないｐｇｓＡが挿入されたｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ組換え発現ベクターで形質転換されたラクトバチルス・カゼイにおける発現パターン（レーン６及びレーン１１）、および、本発明による、改良されたｐｇｓＡ１乃至ｐｇｓＡ８が挿入されたｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ１乃至ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ８組換え発現ベクターで形質転換されたラクトバチルス・カゼイにおける発現パターン（レーン１乃至レーン５およびレーン７乃至レーン１０）を示す。

【0097】

具体的には、図１０において、レーン（ｌａｎｅ）１は、ＰｇｓＡモチーフ１－６０ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン２は、ＰｇｓＡモチーフ１－７０ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン３は、ＰｇｓＡモチーフ１－８０ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン４は、ＰｇｓＡモチーフ１－１００ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン５は、ＰｇｓＡモチーフ１－１８８ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示す。また、レーン６は、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるタンパク質の発現を示す。

【0098】

また、図１０において、レーン７は、ＰｇｓＡモチーフ２５－６０ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン８は、ＰｇｓＡモチーフ２５－７０ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン９は、ＰｇｓＡモチーフ２５－１００ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示し、レーン１０は、ＰｇｓＡモチーフ１－１８８ａ.ａで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるＥＧＦＰの発現を示す。また、レーン１１は、ｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ＰｇｓＡ－ＥＧＦＰで形質転換された組換えラクトバチルス・カゼイにおけるタンパク質の発現を示す。

【0099】

改良されたＰｇｓＡモチーフ断片を含む表面発現ベクターによるＥＧＦＰ融合タンパク質の発現は、改良されていないｐＫＶ－Ｐａｌｄ－ｐｇｓＡ－ＥＧＦＰ表面発現ベクターによるＥＧＦＰ融合タンパク質の発現よりも強いことが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0100】

本発明は、バチルス属菌株由来のポリ－γ－グルタミン酸の合成に関与する細胞外膜タンパク質（ｐｇｓＡ）を用いて、外来タンパク質を微生物の表面に効果的に発現させる新しいベクターに関するもので、本発明に従った、目的タンパク質の表面発現ベクターは、目的タンパク質を安定に発現させることができ、本発明に係る表面発現ベクターは、目的タンパク質を恒常的に発現させながら、同時に、組換え微生物に表面発現させ必要とするワクチンの製造のための抗原制作などに有用であることがありますので、 、産業上の利用可能性が認められることがある。

【0101】

配列番号１
５’－ＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’
配列番号２
５’－ＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ－３’
配列番号３
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ －３’
配列番号４
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴ－３’
配列番号５
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号６
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’
配列番号７
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号８
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡ－３’
配列番号９
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号１０
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’
配列番号１１
５’－ＴＣＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＴＧＣＧＡＴＴＴＧＣＴ－３’
配列番号１２
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＴＧＧＴＡＣＧＡＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴ－３’
配列番号１３
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡ－３’
配列番号１４
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡ－３’
配列番号１５
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡ－３’
配列番号１６
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡ－３’
配列番号１７
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＣＧＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＡＧＡＴＡＣＧＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＧＧＡＧＣＧＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＡＡＧＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣ－３’
配列番号１８
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配列番号１９
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配列番号２０
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
配列番号２１
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴ－３’
配列番号２２
５’－ＣＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＡＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’
配列番号２３
５’－ＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＧ－３’
配列番号２４
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配列番号２５
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配列番号２６
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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