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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-02
(45)【発行日】2022-08-10
(54)【発明の名称】新規なトリプシンアイソフォームおよびそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/76 20060101AFI20220803BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220803BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220803BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20220803BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 33/02 20060101ALI20220803BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20220803BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220803BHJP
A61P 19/04 20060101ALI20220803BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220803BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20220803BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20220803BHJP
A61P 17/08 20060101ALI20220803BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220803BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220803BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20220803BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220803BHJP
A61P 1/02 20060101ALI20220803BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20220803BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20220803BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20220803BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20220803BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220803BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220803BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20220803BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20220803BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220803BHJP
【ＦＩ】
C12N9/76 ZNA
A61P31/12
A61P31/04
A61P31/10
A61P33/00
A61P33/02
A61P11/00
A61P25/04
A61P29/00
A61P19/02
A61P19/04
A61P29/00 101
A61P21/00
A61P37/02
A61P9/00
A61P17/00
A61P17/06
A61P17/10
A61P17/08
A61P31/00
A61P17/02
A61P17/04
A61P37/08
A61P1/02
A61K38/48 100
A61K8/98
A61K8/64
A61Q19/00
A61Q19/08
A61K9/08
A61K9/06
A61K9/12
A61K47/10
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021068447
(22)【出願日】2021-04-14
(62)【分割の表示】P 2018522869の分割
【原出願日】2016-07-22
(65)【公開番号】P2021106603
(43)【公開日】2021-07-29
【審査請求日】2021-04-28
(31)【優先権主張番号】15178208.3
(32)【優先日】2015-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】518024747
【氏名又は名称】エンジマティカ アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】特許業務法人 信栄特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ガドモンズドッター，アグスタ
(72)【発明者】
【氏名】アスゲアーソン，アスゲー
(72)【発明者】
【氏名】ステファンソン，ビャッキ
【審査官】斉藤 貴子
(56)【参考文献】
【文献】特許第６８６９９７９（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２００３－５０２０７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】SPILLIAERT R; A GUDMUNDSDOTTIR，ATLANTIC COD TRYPSIN Y-MEMBER OF A NOVEL TRYPSIN GROUP，MARINE BIOTECHNOLOGY，米国，1999年，VOL:1, NR:6，PAGE(S):598 - 607，http://dx.doi.org/10.1007/PL00011815
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２のアミノ酸配列と９９％以上の配列同一性を有するが、ただし、配列番号２のアミノ酸配列を除く、アミノ酸配列を含む、単離されたタラのトリプシンＺＴアイソフォーム。
【請求項2】
適切な賦形剤および担体とともに、請求項１の少なくとも１つのタラのトリプシンＺＴアイソフォームを含む組成物。
【請求項3】
前記タラのトリプシンＺＴアイソフォームは、他のタラのトリプシンとの混合状態で存在する、請求項２の組成物。
【請求項4】
前記タラのトリプシンＺＴアイソフォームは、前記組成物におけるタラのトリプシンの全量の少なくとも５％（ｗ／ｗ）を含む、請求項３の組成物。
【請求項5】
外用水薬、ハイドロゲル、マウススプレー、または点鼻薬として、局所的に投与され得る、請求項２から４のいずれか一つの組成物。
【請求項6】
グリセロールのような多価アルコールをさらに含む、請求項２から５のいずれかの組成物。
【請求項7】
療法に使用するための、請求項２から６のいずれか一つの組成物。
【請求項8】
（ａ）ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原虫からなる群から選択される病原菌により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための；（ｂ）ウイルス、バクテリアおよび真菌のような病原菌により引き起こされる上気道における疾患の治療または予防において使用するための；
（ｃ）疼痛、急性炎症、慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節、滑液包炎、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、静脈炎、腱炎、発疹、乾癬、ざ瘡、湿疹、顔の脂漏湿疹、手、顔、もしくは首の湿疹、包皮感染症、水虫、フィステル感染症、感染した局所の潰瘍、新生児におけるへその感染症、しわ、瘢痕、ケロイド、おでき、いぼおよびアレルギー性かゆみ、痔核、真菌感染症、並びに自己免疫疾患を含む免疫不全症の治療または予防において使用するための；
（ｄ）創傷感染症および火傷による傷の治療において使用するための；および／または （ｅ）健康な皮膚からの垢の除去または皮膚のピーリングにおいて使用するための、請求項２から６のいずれか一つの組成物。
【請求項9】
化粧品に使用するための、請求項２から６のいずれか一つの組成物。
【請求項10】
前記組成物は、さらに追加の美容上活性のある配合物を含む、化粧品に使用するための、請求項９の組成物。
【請求項11】
（i）タラの内臓の水性抽出物を調製することと、（ii）ｐ－アミノベンザミジンアフィニティーリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーステップを含む、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップに前記水性抽出物を供すること、および、
（iii）前記ｐ－アミノベンザミジンアフィニティーリガンドに結合するタラのトリプシンＺＴアイソフォームを放出および溶出することとを含む、
配列番号２と９９％以上の配列同一性を有するが、ただし、配列番号２のアミノ酸配列を除く、アミノ酸配列を含む、タラのトリプシンＺＴアイソフォームを調製する方法。
【請求項12】
前記アフィニティークロマトグラフィーステップ（ii）の後に、アニオン交換樹脂を用いて少なくとも１つのステップを行うことをさらに含む、および／または前記アフィニティークロマトグラフィーステップ（ii）の前に、カチオン交換樹脂用いて少なくとも１つのステップを行うことをさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項13】
前記放出および溶出されたタラのトリプシンＺＴアイソフォームは、ポアサイズが０．４５μｍ以下のフィルターを用いて無菌的にろ過される、請求項１１または１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なトリプシンＺＴアイソフォームに関する。特に、本発明は、医療装置、医薬品、および化粧品におけるトリプシンＺＴアイソフォームの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
プロテイナーゼは、タンパク質を切断するためのそれらの性能により定義される酵素である。プロテイナーゼは、基質特異性において相違を示すタンパク質配列内で、異なるアミノ残基で基質を切断することができる。トリプシンはプロテイナーゼであり、アルギニンまたはリジン残基に対する切断Ｃ末端におけるそれらの優先性により部分的に特定される（Olsen, Ong et al., 2004, Mol Cell Proteomics 3: 608-614）。マルチプレックスな基質のプロファイリング方法が、プロテイナーゼの切断部位を明らかにし、それらの特異性についてのそれらの切断部位のまわりの残基の重大な重要性を開示する（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。
【0003】
米国特許第4,801,451号および第4,963,491号は、ナンキョクオキアミ (学名：Euphasia superba)から単離されたエキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼの混合物および洗浄溶液としてのこの混合物の使用を開示する。米国特許第4,801,451号は、傷からの異物および壊死組織を除くためのこのような酵素の使用を開示する。WO85/04809は、消化促進剤としてのオキアミ酵素の使用を開示する。EP-A1-0170115は、血餅を溶かすためのオキアミ酵素の使用を開示する。しかしながら、これらの参照文献のすべては、純粋でない、または、不十分に特徴づけられた材料を開示する。精製されたペプチダーゼまたは精製されたペプチダーゼの混合物は、医薬的に有用な製品を提供することが望ましい。
【0004】
WO96/24371は、オキアミ由来の多機能性タンパク質分解酵素およびナンキョクオキアミ由来の多機能性酵素に対して構造的類似性を有する、甲殻類および魚由来のタンパク質分解酵素のファミリーの使用を開示する。また、文書は、多機能性酵素を精製する方法、医薬品、化粧品、および多機能性酵素の他の使用に関する。ナンキョクオキアミ由来の多機能性酵素に対する構造的類似性は、オキアミ由来の多機能性ヒドロラーゼと少なくとも７０％の相同性を有するとして文書に定義されている。
【0005】
WO2000078332は、このような酵素の、内臓疾患および障害を治療するための局所（local）および局所（topical）投与のための、並びに、化粧品に使用するための、医薬組成物または薬品における、タラの由来のトリプシンおよびキモトリプシンの使用を開示する。開いた傷または粘膜組織に酵素をしみわたらせることなく、局所、内臓障害を治療するための局所的な使用は効果的であることが発見された。WO2000078332において開示されているセリンプロテイナーゼは、タイセイヨウダラ由来のトリプシンＩ、トリプシンＩＩ、トリプシンＩＩＩ、トリプシンＩＶと、少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するプロテイナーゼであり、タイセイヨウダラから単離されたキモトリプシンＡおよびキモトリプシンＢのいずれかと少なくとも９０％のアミノ酸配列相同性を有するキモトリプシンであるプロテイナーゼである。
【0006】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をコードするトリプシンＹがタイセイヨウダラｃＤＮＡライブラリーから単離された（Spilliaert and Gudmundsdottir, 1999, Mar Biotechnol (NY) 1: 598-607）。タラのトリプシンＹは、２つのタイセイヨウダラのトリプシンＩおよびＸと、約４５％の同一性を有する（WO2000078332）。天然のトリプシンＹおよび組み換え形態のトリプシンＹは、これまでに簡易に記載されてきた（Palsdottir and Gudmundsdottir, 2007, Protein Expr Purif 51: 243-252, Palsdottir and Gudmundsdottir, 2008, Food Chemistry 111: 408-414）。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、トリプシンＺＴアイソフォームと呼ばれる、新規なトリプシンアイソフォームを提供する。このようなアイソフォームは、タイセイヨウダラのような魚から得ることができ、または、タンパク質発現システムを用いて組み換え形態で引き出すことができる。本発明は、適切な賦形剤および担体とともに、本願発明に係る少なくとも１つの単離されたタラのトリプシンＺＴアイソフォームを含む組成物をさらに提供する。
【0008】
発明者らは、これまでに知られているトリプシンからは予期されない、有用で、独特の特性の新規なトリプシンＺＴアイソフォームを特定した。これらの特性は、医療装置、医薬品、および化粧品における種々の適用のためのトリプシンＺＴアイソフォームを使用するときの有利な点を提供する。本発明は、上記トリプシンＺＴアイソフォームそれ自体、および病原菌により引き起こされる疾患を治療および予防するときの使用について提供する。これは、病原微生物により引き起こされる上気道における疾患を治療または予防するときの使用に関する。この目的のために、トリプシンＺＴアイソフォームは、例えば、医薬品における有効成分として、または、医療装置において使用され得る。また、本発明は、創傷感染症および火傷による傷の治療における使用のための、例えば医療装置において健康な皮膚からの垢の除去または皮膚のピーリングに使用するための、医薬品として、または化粧品として、上記トリプシンＺＴアイソフォームを提供する。本発明は、さらに、本発明のタラのトリプシンＺＴアイソフォームを調製する方法を提供する。
【0009】
・複合的な基質プロファイリングによれば、トリプシンＺＴアイソフォームは、トリプシンＩと比較して、Ａｒｇ残基での切断を優先する。トリプシンＩは、トリプシンＺＴアイソフォームと比較して、Ｌｙｓ残基での切断を優先する。
・複合的な基質プロファイリングは、切断部位を囲む基質における、異なるアミノ酸残基（Ｃ末端側での約４つのアミノ酸残基およびＮ末端側での約４つのアミノ酸残基）が、切断に大きな効果を有する。トリプシンＺＴアイソフォームは、トリプシンＩにわたって切断部位を囲む所定のアミノ酸残基を優先する。
・アルギニンおよびリジンに富むアミノ酸配列は、感染に関連するウィルス配列、バクテリアの配列、および寄生生物配列で頻繁にみられる。
・標準得点（Ｚスコア）比率（複合的な基質プロファイリングデータ）に基づく数値は、トリプシンＺＴアイソフォームが、トリプシンＩと比較して、いくつかの連続した塩基性アミノ酸残基（ＡｒｇおよびＬｙｓ）を含むペプチドを切断するためによりよく適用されることを示す。データに基づき、トリプシンＺＴアイソフォームは、それらがリジンおよびアルギニンのようなクラスター化した塩基性アミノ酸残基で切断することができるため、ウイルスやバクテリアに対する抗菌材として作用し得る。
・複合的な基質プロファイリングは、切断部位を囲む基質における、異なるアミノ酸残基（Ｃ末端側での約４つのアミノ酸残基およびＮ末端側での約４つのアミノ酸残基）が、切断に大きな効果を有する。トリプシンＺＴアイソフォームは、トリプシンＩにわたって切断部位を囲む所定のアミノ酸残基を優先する。
・アルギニンおよびリジンに富むアミノ酸配列は、感染に関連するウィルス配列、バクテリアの配列、および寄生生物配列で頻繁にみられる。
・標準得点（Ｚスコア）比率（複合的な基質プロファイリングデータ）に基づく数値は、トリプシンＺＴアイソフォームが、トリプシンＩと比較して、いくつかの連続した塩基性アミノ酸残基（ＡｒｇおよびＬｙｓ）を含むペプチドを切断するためによりよく適用されることを示す。データに基づき、トリプシンＺＴアイソフォームは、それらがリジンおよびアルギニンのようなクラスター化した塩基性アミノ酸残基で切断することができるため、ウイルスやバクテリアに対する抗菌材として作用し得る。
【0010】
発明の詳細な説明
本発明は、トリプシンＺＴアイソフォームと呼ばれる、新規なトリプシンアイソフォームを提供する。このようなアイソフォームは、タイセイヨウダラのような魚から得ることができ、または、タンパク質発現システムを用いて組み換え形態で引き出すことができる。本発明は、疾患を治療または予防するためのこのようなトリプシンＺＴアイソフォームの使用、および化粧品の分野に関連する。特に、本発明は、医薬品、医療装置内、および化粧品として有用な、新規なタイセイヨウダラのトリプシンＺＴアイソフォームに関連する。
本発明は、トリプシンＺＴアイソフォームと呼ばれる、新規なトリプシンアイソフォームを提供する。このようなアイソフォームは、タイセイヨウダラのような魚から得ることができ、または、タンパク質発現システムを用いて組み換え形態で引き出すことができる。本発明は、疾患を治療または予防するためのこのようなトリプシンＺＴアイソフォームの使用、および化粧品の分野に関連する。特に、本発明は、医薬品、医療装置内、および化粧品として有用な、新規なタイセイヨウダラのトリプシンＺＴアイソフォームに関連する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１は、陰イオン交換クロマトグラフィーでのトリプシンＺＴアイソフォームの単離を示す。吸光度２８０ｎｍ対溶出ボリュームを示す、ベンズアミジン精製タラトリプシンアイソフォームのＭｏｎｏＱ分離からのクロマトグラムである。タラのトリプシンアイソフォームは、ＭｏｎｏＱカラムにロードされ、塩勾配（点線）でタンパク質が溶出される。矢印は、トリプシンＺＴアイソフォームを含むピークを示す。カラムは、バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）で平衡化され、酵素は、流速１ｍＬ／ｍｉｎで、４０カラムボリュームでリニアな０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、６カラムボリュームでリニアな１５０～６２０ｍＭのＮａＣｌ、１０カラムボリュームでリニアな６２０～８５０ｍＭのＮａＣｌの勾配で溶出された。
【0012】
【0013】
【図3】図３は、タラのトリプシンＸ（トリプシン１、トリプシン５、およびトリプシン７）およびトリプシンＺＴアイソフォームのウエスタンブロット解析を示す。タラのトリプシンXおよびトリプシンＺＴアイソフォームは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供される。転写に続き、サンプルは、抗体と反応して、トリプシンＩ／Ｘ（上のパネル）およびトリプシンＺＴアイソフォーム（下のパネル）でイムノブロットされた。これは、トリプシンＺＴアイソフォームが陰イオン交換を用いてトリプシンＩ／Ｘから分離されたことを示す。図３にみられるように、トリプシンＺＴアイソフォームに対して反応するポリクローナル抗体は、トリプシンＩ／Ｘとは交差反応せず、トリプシンＩ／Ｘに対して挙げられるペプチド抗体は、トリプシンＺＴアイソフォームと交差反応しない。
【0014】
【図4】図４は、複合的な基質プロファイリング分析における、３つの異なるポイントでのトリプシンＺＴおよびトリプシンＩにより生成された、共有のおよび独創的な切断を図示するベン図を示す。５分間（Ａ）、１５分間（Ｂ）、および６０分間（Ｃ）のインキュベーション後のトリプシンＺＴ（左の白）およびトリプシンＩ（右の白）による、共有の（黒）および独創的な切断部位の数。図面は、ライブラリー内での１２４の定義されたペプチド（それぞれ１４のアミノ酸残基を含む）におけるトリプシンＺＴおよびトリプシンＩについての共有の切断部位および独創的な切断部位が、全ての時点であることを示す。データは、トリプシンＺＴの基質特異性が、トリプシンＩのそれとは異なることを示している。
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
発明者らは、トリプシンＺＴアイソフォームと名付けられた新規なトリプシンアイソフォームを特定した。トリプシンＺＴは、少なくとも以下のアイソフォーム：タイセイヨウダラトリプシンＺＴ－１アイソフォーム、タイセイヨウダラトリプシンＺＴ－２アイソフォーム、タイセイヨウダラトリプシンＺＴ－３アイソフォーム、およびタイセイヨウダラトリプシンＺＴ－４アイソフォームを含む。４つのすべてのタイセイヨウダラトリプシンＺＴアイソフォームは、約２５ｋＤａと同程度の分子量を有する。本発明のタイセイヨウダラトリプシンＺＴアイソフォームは、以下のアミノ酸配列により表される。
配列番号１
IX1GGX2X3CEPX4SRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEX5YDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEX6VX7CX8AX9YPGMISPRMX10CX11GX12MDGGRDX13CNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGX14GCAX15PNX16PGVYVKVYEX17LSWIQTTLDANP
ここで、Ｘ１は、ＩおよびＶから選択され、
Ｘ２は、ＱおよびＨから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ４は、ＲおよびＮから選択され、
Ｘ５は、Ｌであり、
Ｘ６は、ＴおよびＰから選択され、
Ｘ７は、ＤおよびＡから選択され、
Ｘ８は、ＥおよびＱから選択され、
Ｘ９は、ＡおよびＳから選択され、
Ｘ１０は、ＶおよびＭから選択され、
Ｘ１１は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１２は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ１３は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１４は、ＱおよびＲから選択され、
Ｘ１５は、ＬおよびＥから選択され、
Ｘ１６は、ＹおよびＳから選択され、並びに
Ｘ１７は、ＹおよびＦから選択される。
配列番号１
IX1GGX2X3CEPX4SRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHEX5YDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEX6VX7CX8AX9YPGMISPRMX10CX11GX12MDGGRDX13CNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGX14GCAX15PNX16PGVYVKVYEX17LSWIQTTLDANP
ここで、Ｘ１は、ＩおよびＶから選択され、
Ｘ２は、ＱおよびＨから選択され、
Ｘ３は、ＤおよびＥから選択され、
Ｘ４は、ＲおよびＮから選択され、
Ｘ５は、Ｌであり、
Ｘ６は、ＴおよびＰから選択され、
Ｘ７は、ＤおよびＡから選択され、
Ｘ８は、ＥおよびＱから選択され、
Ｘ９は、ＡおよびＳから選択され、
Ｘ１０は、ＶおよびＭから選択され、
Ｘ１１は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１２は、ＹおよびＦから選択され、
Ｘ１３は、ＡおよびＶから選択され、
Ｘ１４は、ＱおよびＲから選択され、
Ｘ１５は、ＬおよびＥから選択され、
Ｘ１６は、ＹおよびＳから選択され、並びに
Ｘ１７は、ＹおよびＦから選択される。
【0017】
配列番号２ タイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－１アイソフォーム
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
【0018】
配列番号３ タイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－２アイソフォーム
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
IVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
【0019】
配列番号４ タイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－３アイソフォーム
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYV KVYEFLSWIQTTLDANP
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYV KVYEFLSWIQTTLDANP
【0020】
配列番号５ タイセイヨウダラ トリプシンＺＴ-4アイソフォーム
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGC ALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
IIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGC ALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
【0021】
本発明のトリプシンＺＴアイソフォームは、WO2000078332に開示されるトリプシンと５０％未満のアミノ酸同一性および、WO2000078332に開示されるキモトリプシンと４５％未満のアミノ酸同一性を有する。
【0022】
上記トリプシンＺＴアイソフォームは、これらのトリプシンの活動中の可変部、すなわち、トリプシンのＮ末端が切断された場合に活性化される変異体を表す。これらのトリプシンは、細胞外への分泌のため、および酵素を不活性に維持するために重要であるＮ末端におけるアミノ酸の数を有する、幽門垂（魚におけるすい臓組織）で発現されるタンパク質である。全長トリプシンＺＴアイソフォームは、また、本明細書で以下のように開示される。
配列番号１９ 切断されていないタイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－１アイソフォーム
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
配列番号１９ 切断されていないタイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－１アイソフォーム
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【0023】
配列番号２０ 切断されていないタイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－２アイソフォーム
MIGLALLMLLGAAAAAVPRDVGKIVGGHECEPNSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
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【0024】
配列番号２１ 切断されていないタイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－３アイソフォーム
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVEPVACQASYPGMISPRMMCVGFMDGGRDVCNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGRGCAEPNSPGVYVKVYEFLSWIQTTLDANP
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【0025】
配列番号２２ 切断されていないタイセイヨウダラ トリプシンＺＴ－４アイソフォーム
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
MIGLALLMLLGAAAAVPREDGRIIGGQDCEPRSRPFMASLNYGYHFCGGVLINDQWVLSVAHCWYNPYYMQVMLGEHDLRVFEGTEQLVKTNTIFWHELYDYQTLDYDMMMIKLYHPVEVTQSVAPISLPTGPPDGGMLCSVSGWGNMAMGEEVNLPTRLQCLDVPIVETVDCEAAYPGMISPRMVCAGYMDGGRDACNGDSGSPLVCEGVLTGLVSWGQGCALPNYPGVYVKVYEYLSWIQTTLDANP
【0026】
複合的な基質プロファイリングは、酵素（プロテイナーゼ）の基質特異性を分析するために使用される（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。プロテイナーゼは、基質特異性における相違を示すペプチド配列内で、異なるアミノ残基で基質を切断することができる。トリプシンは、アルギニンまたはリジン残基に対してＣ末端を切断することにおけるそれらの優先性により特定される。意外なことに、基質において、アルギニンまたはリジンを囲むアミノ酸が、トリプシンＩと比較して、その切断のときに、異なる効果を有することを、トリプシンＺＴアイソフォームでの複合的な基質プロファイリングが明らかにした。要するに、トリプシンＺＴアイソフォームまたはトリプシンＩは、広範囲な生理化学的な多様性を有するペプチド（１２４の定義されたペプチド、１４－ｍｅｒ配列、合計１６１２のペプチド結合）のライブラリーで（５、１５、６０分）インキュベートされた（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。インキュベーション後に、切断部位は、質量分析により特定された。結果は以下の実施例に示され、トリプシンＩと比較して、トリプシンＺＴに対する特有の、多数の切断部位があることを示す。また、トリプシンＩと比較して、トリプシンＺＴアイソフォームによる優先的な切断を示す切断部位が特定された。さらに、新規なトリプシンＺＴアイソフォームが、WO 2000078332において開示される、トリプシンＩと比較して、異なる基質特異性を有する。これらの発見は予期されない。複合的な基質プロファイリング分析から得られる結果に基づき、基質におけるＰ４－Ｐ４’位置での標準得点（Ｚスコア）比率に基づく数値を含む表が作成され、トリプシンＺＴの基質特異性がトリプシンＩと比較された。正の数（Ｚスコア）は、トリプシンＩと比較して、トリプシンＺＴアイソフォームのために、所定のＰ位置におけるアミノ酸残基についての優先性を反映する。
【0027】
トリプシンＺＴアイソフォームは、特異的な抗菌特性を有する。実施例で生成されるおよび示される値に基づいて、トリプシンＺＴアイソフォームが、トリプシンＩと比較して、いくつかの連続した正電荷を持っている残基（アルギニンまたはリジン）を含むペプチドを切断することに、より多く適用されることがみられ得る。これらのタイプの配列は（リジンおよびアルギニンに富むアミノ酸配列）、ウイルスタンパク質で頻繁にみられる（Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Jiang, Cun et al., 2012, J Virol 86: 7256-7267, Gallaher and Garry, 2015, viral es 7: 285-305）。
【0028】
viroporinは、透過性を変更する細胞膜と相互に作用し、ウイルス粒子の放出を促進することができる、タンパク質のグループである。クラスター化したリジンおよび／またはアルギニン残基は、viroporinの活性化のために重要である。複合的な基質プロファイリング分析に基づき、トリプシンＺＴアイソフォームは、これらのクラスター化した塩基性アミノ酸残基を切断することができるので、ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤として作用し得る。viroporinは、フラビウイルス科、ピコルナウイルス科、レトロウイルス科、コロナウイルス科、レオウイルス科、およびパラミクソウイルス科を含む多くのウイルスのファミリーの存在を記載している（Royle, Dobson et al., 2015, ウイルス 7: 5375-5387）。研究は、viroporinにおける塩基性残基、リジン、またはアルギニンが、それらの機能についての重要な条件であることを示している。viroporinの大部分が、ＲＮＡウイルスで特定された。トリプシンＺＴアイソフォームについての標的であるリジンおよびアルギニンに富むviroporinを含むウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ロタウイルス、レストンエボラウイルス（ＲＥＳＴＶ）、Lloviuウイルス（ＬＬＯＶ）、Sudanウイルス（ＳＵＤＶ）、Bundibugyo（ＢＤＢＶ）、Tai Forestウイルス（ＴＡＦＶ）を含む（Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Gallaher and Garry, 2015, Viruses 7: 285-305）。
【0029】
viroporinは、ゾウリムシクロレラウイルス１、サルのウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒトポリオーマＪＣ（ＪＣＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）のような多岐に渡るＤＮＡおよびＲＮＡウイルスでみられる（Kang, Moroni et al., 2004, Proc Natl Acad Sci U S A 101: 5318-5324, Liao, Tam et al., 2006, Adv Exp Med Biol 581: 199-202, Daniels, Sadowicz et al., 2007, PLoS Pathog 3: e98）。
【0030】
アグノプロテインと呼ばれる強塩基性ウイルスタンパク質は、近年、ポリオーマウイルス科およびパピローマウイルス科ファミリーのようなＤＮＡウイルスから特定された（Royle, Dobson et al., 2015, Virus 7: 5375-5387）。これらのタンパク質は、多くのviroporin特性を示す。保存配列は、多くのクラスター化した塩基性アミノ酸残基を含むアグノプロテインで特定された（Royle, Dobson et al., 2015, Virus 7: 5375-5387）。複合的な基質プロファイリング分析に基づき、トリプシンＺＴアイソフォームは、これらのクラスター化した塩基性アミノ酸残基を切断することができるため、ＤＮＡウイルスに対する抗ウイルス剤として作用し得る（Royle, Dobson et al., 2015, Virus 7: 5375-5387）。
【0031】
多くのウイルスおよびバクテリアは、細胞透過性ペプチドまたはタンパク質を用いて細胞内移行を得るためのメカニズムを発生した（Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860）。ウイルスは、フラビウイルス科ファミリーのペスチウイルス、ヘルペスウイルス(HSV-1)、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1、Ｂ型肝炎、ヒト呼吸器合併症ウィルス（ＲＳＶ））を含む（Elliott and O'Hare, 1997, Cell 88: 223-233, Oess and Hildt, 2000, Gene Ther 7: 750-758, Langedijk, 2002, J Biol Chem 277: 5308-5314, Langedijk, Olijhoek et al., 2005, International Congress Series 1277: 95-107, Lu, Tager et al., 2006, Anal Biochem 353: 7-14, Godet, Guergnon et al., 2010, PLoS One 5: e13760）。さらに、タンパク質のこれらのタイプはマイコバクテリウム・ツベルクローシスのようなバクテリアでみられる（Lu, Tager et al., 2006, Anal Biochem 353: 7-14）。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、それらが塩基性アミノ酸残基、特にアルギニンで豊富であるという共通点がある（Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860）。ポーリンは、バクテリアの病原性における、および保護についての重要な役割を果たす外膜タンパク質であり、そのため、療法についての有用な標的である（Galdiero, Falanga et al., 2012, Curr Protein Pept Sci 13: 843-854）。これらのタンパク質は、連続したアルギニンアミノ酸残基を含むことが多い。複合的な基質プロファイリング分析に基づき、トリプシンＺＴアイソフォームは、クラスター化した塩基性アミノ酸残基を切断できることから、ウイルスおよびバクテリアに対する抗菌剤として作用することができる。
【0032】
寄生生物は、例えば、トキソプラズマ・ゴンディのような、アルギニンリッチドメインを含むタンパク質のような病原性決定基に基づく（Fentress, Steinfeldt et al., 2012, Cell Microbiol 14: 1921-1933）。複合的な基質プロファイリング分析は、トリプシンＺＴアイソフォームは、このようなタンパク質に対する作用する寄生生物に対して有用であることを示した。
【0033】
ベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）は、トリプシンＺＴアイソフォームにより切断された独特で優先性のあるアミノ酸配列のいくつかを調査するために使用された。調査結果は、これらのタイプの配列がウイルス（例えば、パラミクソウイルス科およびコロナウイルス科ファミリーのウイルス由来）、バクテリア（例えば、ヘモフィルス属）、および寄生生物（例えば、プラスモディウム属）を含む多くの病原体でみられることを示した。パラミクソウイルス科ファミリーは、例えば、呼吸器合抱体ウイルス（ＲＳＶ）およびヒト・パラインフルエンザウイルス、並びに流行性耳下腺炎およびはしかを引き起こすウイルスを含む。コロナウイルス科ファミリーは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を引き起こすウイルスを含む。バクテリアのヘモフィルス属は、心内膜炎、髄膜炎、および菌血症と関連性のあるヘモフィルス・パラインフルエンザを含む。プラスモディウム属は、マラリアを引き起こす熱帯熱マラリア原虫を含む。
【0034】
用語「医療装置」は、これに限定されないものの、疾患の診断、予防、モニタリング、治療または緩和、または補償のための、解剖学的構造または生理学的プロセスの調査、置換または改変のような怪我およびハンディキャップのための、受胎の制御のための器具、装置、機械、ソフトウェア、材料または他の物品を意味し、薬理学的、免疫学的または代謝的手段によって人体の中または上で本来の目的とする作用を達成しない装置を含むが、このような手段によりそれらの機能をアシストすることができる。
【0035】
本発明は、新規なトリプシンＺＴアイソフォーに関する。本発明は、医療への適用において価値が高くなるように、トリプシンＺＴアイソフォームの予測できない独特のタンパク質切断特性を記載する。特に、本発明は、医薬品として、医療装置および化粧品において有用な、新規なタイセイヨウダラトリプシンＺＴアイソフォームに関する。
【0036】
本発明の一態様は、配列番号１またはこれと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたタラのトリプシンＺＴアイソフォームを提供する。典型的には、このような配列相同性は、配列番号１のアミノ酸配列と８５、９０、９５、または９９％の相同性がある。
【0037】
本態様の一実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－１、配列番号３のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－２、配列番号４のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－３、および配列番号５のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－４、またはそれらと８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列から選択される、単離されたタラのトリプシンＺＴアイソフォームが提供される。また、配列番号２～５で配列されるアミノ酸と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。典型的には、このような配列相同性は、配列番号２～５のアミノ酸配列と８５、９０、９５、または９９％の相同性がある。
【0038】
本発明の一態様は、適切な賦形剤および担体とともに、本発明に係る少なくとも１つのタラのトリプシンＺＴアイソフォームを含む組成物を提供する。前記タラのトリプシンＺＴアイソフォームは、配列番号２のアミノ酸配列を含むタラのトリプシンＺＴ－１、配列番号３のアミノ酸配列を含むタラのトリプシンＺＴ－２、配列番号４のアミノ酸配列を含むタラのトリプシンＺＴ－３、および配列番号５のアミノ酸配列を含むタラのトリプシンＺＴ－４から選択されることとしてもよい。また、配列番号２～５で配列されるアミノ酸と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。典型的には、このような配列相同性は、配列番号２～５のアミノ酸配列と８５、９０、９５、または９９％の相同性がある。
【0039】
典型的には、前記組成物は、他のタラのトリプシンとの混合状態で存在するタラのトリプシンＺＴアイソフォームを含む。好ましくは、前記タラのトリプシンＺＴアイソフォームは、前記組成物におけるタラのトリプシンの全量の少なくとも５％（ｗ／ｗ）を含み、例えば、前記組成物における前記タラのトリプシンの全量の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以上（ｗ／ｗ）を含む。
【0040】
前記組成物は、典型的には、外用水薬、ハイドロゲル、マウススプレー、または点鼻薬として、局所的に投与される。前記組成物は、グリセロールのような多価アルコールをさらに含むこととしてもよい。
【0041】
本態様の一実施形態では、療法に使用するための前記組成物が提供される。
【0042】
本態様の一実施形態では、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原虫からなる群から選択される病原菌により引き起こされる疾患を治療または予防するときに使用するための前記組成物が提供される。
【0043】
本態様の一実施形態では、ウイルス、バクテリアおよび真菌のような病原菌により引き起こされる上気道における疾患を治療または予防するときに使用するための前記組成物が提供される。
【0044】
本態様の一実施形態では、疼痛、急性炎症、慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節、滑液包炎、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、静脈炎、腱炎、発疹、乾癬、ざ瘡、湿疹、顔の脂漏湿疹、手、顔、もしくは首の湿疹、包皮感染症、水虫、フィステル感染症、感染した局所の潰瘍、新生児におけるへその感染症、しわ、瘢痕、ケロイド、おでき、いぼおよびアレルギー性かゆみ、痔核、真菌感染症、並びに自己免疫疾患を含む免疫不全症を治療または防止するときに使用するための、前記組成物が提供される。
【0045】
本態様の一実施形態では、創傷感染症および火傷による傷の治療で使用するための、前記組成物が提供される。
【0046】
本態様の一実施形態では、健康な皮膚からの垢の除去または皮膚のピーリングにおいて使用するための、前記組成物が提供される。
【0047】
本態様の一実施形態では、化粧品に使用するための、前記組成物が提供される。前記組成物は、さらに追加の美容上活性のある配合物を含むこととしてもよい。
【0048】
本発明の一態様では、それを必要とする患者に、治療に有効な量の本発明に係る組成物を投与することを含む、疾患を治療する方法が提供される。
本態様の一実施形態では、前記疾患は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原虫からなる群から選択される病原菌により引き起こされる。
本態様の一実施形態では、前記疾患は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原虫からなる群から選択される病原菌により引き起こされる。
【0049】
本態様の一実施形態では、前記疾患は、ウイルスおよびバクテリアのような病原菌により引き起こされる、上気道における疾患である。
【0050】
本態様の一実施形態では、前記疾患は、疼痛、急性炎症、慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節、滑液包炎、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、静脈炎、腱炎、発疹、乾癬、ざ瘡、湿疹、顔の脂漏湿疹、手、顔、もしくは首の湿疹、包皮感染症、水虫、フィステル感染症、感染した局所の潰瘍、新生児におけるへその感染症、しわ、瘢痕、ケロイド、おでき、いぼおよびアレルギー性かゆみ、痔核、真菌感染症、並びに自己免疫疾患を含む免疫不全症から選択される。
【0051】
本態様の一実施形態では、前記疾患は、創傷感染症または火傷による傷である。
【0052】
本発明の一態様では、配列番号１９のアミノ酸配列を含む全長トリプシンＺＴ－１、配列番号２０のアミノ酸配列を含む全長トリプシンＺＴ－２、配列番号２１のアミノ酸配列を含む全長トリプシンＺＴ－３、および配列番号２２アミノ酸配列を含む全長トリプシンＺＴ－４から選択される、単離されたタラのトリプシンＺＴアイソフォームが提供される。
【0053】
本発明の一態様では、
（i）タラの内蔵のトリプシンＺＴを抽出することと、
（ii）ｐ－アミノベンザミジンアフィニティーリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーステップを含む、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップに前記抽出物を供すること、および、
（iii）前記ｐ－アミノベンザミジンアフィニティーリガンドに結合するタラのトリプシンＺＴアイソフォームを放出および溶出することとを含む、配列番号２から配列番号５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、タラのトリプシンＺＴアイソフォームを調製する方法が提供される。
（i）タラの内蔵のトリプシンＺＴを抽出することと、
（ii）ｐ－アミノベンザミジンアフィニティーリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーステップを含む、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップに前記抽出物を供すること、および、
（iii）前記ｐ－アミノベンザミジンアフィニティーリガンドに結合するタラのトリプシンＺＴアイソフォームを放出および溶出することとを含む、配列番号２から配列番号５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、タラのトリプシンＺＴアイソフォームを調製する方法が提供される。
【0054】
本態様の一実施形態では、前記方法は、前記アフィニティークロマトグラフィーステップ（ii）の後に、アニオン交換樹脂を用いて少なくとも１つのステップを行うことをさらに含む。
【0055】
本態様の一実施形態では、前記タラのトリプシンＺＴアイソフォームは、配列番号２のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－１、配列番号３のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－２、配列番号４のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－３、および配列番号５のアミノ酸配列を含むトリプシンＺＴ－４、またはこれらの混合物から選択される。
【0056】
タラの内臓は、典型的には、トリプシンＺＴアイソフォームを精製および単離するために使用される。発明者らは、トリプシンＺＴアイソフォームの商業規模の産生のために有用な、以下に記載される新規な方法を特定した。抽出は、１０℃以下の温度で、ｐＨ６～８で行われる。タラの内臓は、１：６から１：２０の割合（ｗ／ｗ）で水と混合される。抽出物を残りの殻から分離し、沈降およびろ過によりさらに清澄化する。これに続いて精密ろ過および限外ろ過が行われ、いくつかのステップを含むクロマトグラフィー分離のために使用されるトリプシンＺＴアイソフォームを含む液を得る。
【0057】
アフィニティークロマトグラフィーは、トリプシンＺＴアイソフォームを精製するために、好ましくは、アミノベンズアミジンアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。トリプシンＺＴアイソフォームは、その後、陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製され得る。
【0058】
トリプシンＺＴアイソフォームまたはトリプシンＺＴアイソフォームを含む精製されたタラのトリプシンの混合物の適用の１つの方法は、ハイドロゲルまたは外用水薬、およびグリセロールのような多価アルコール（ポリオール）を０～９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む水の調製時である。トリプシンＺＴアイソフォームの適切な濃度は、他のトリプシンに対して少なくとも１～１００のタンパク質濃度割合で構成され、好ましくは、タラのトリプシンの全量の好ましくは５％以上（ｗ／ｗ）で構成される。トリプシン活性は、最終的なハイドロゲル／外用水薬調製物１００ｍｌあたりCBZ-Gly-Pro-Arg-pNA（カルボベンゾキシGly-Pro-Arg-パラニトロアニリド）についての０．１～１０，０００酵素ユニットの活性である。
【0059】
本発明は、さらに、（ａ）有効な量の精製されたトリプシンＺＴアイソフォームを用いて所定の状態に関する方法、（ｂ）このような方法で使用するための組成物または物質、（ｃ）このような方法で使用するためのトリプシンＺＴアイソフォームの有効な量を含む医薬品または医療装置の組成物、（ｄ）このような方法で使用するための薬品（医薬品および医療装置）を製造するための酵素または酵素組成物の使用を提供する。
【0060】
方法は、特に、
例えば、上気道および下気道並びに肺で生じるウイルス、バクテリア、およびカビにより引き起こされる病原性の疾患を治療または予防すること、
例えば、ざ瘡、発疹、乾癬、または手、顔、頭、もしくは首を含む湿疹、痔核のような皮膚疾患を治療または予防的に防止することであって、投与されるトリプシンＺＴアイソフォームおよび他のトリプシンの量は、好ましくは、皮膚疾患の治療または予防に有効な量であり、
肺の疾患を治療することであって、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームは、例えば、治療に有効な投与量で、高効率な加圧式定量用量吸入器を使用し、
微生物感染の予防に有効な量の他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームを傷に適用することにより、または、治療された傷が壊死組織の実質的な遊離である場合に、菌抑制に有効な量のトリプシンＺＴアイソフォームを、他のトリプシンとともにまたは単独で、投与することにより傷の治癒を促進することにより、創傷感染症および清拭した傷を治療または予防的に防止すること、
やけどを治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で投与されるトリプシンＺＴアイソフォームの量が、治療の促進に十分な量であり、
日焼けを治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で投与されるトリプシンＺＴアイソフォームの量が、治療の促進に十分な量であり、
放射線熱傷を治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で投与されるトリプシンＺＴアイソフォームの量が、治療の促進に十分な量であり、
肌の表面を改善するための、健康な皮膚からの垢の除去または皮膚のピーリングであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量が、垢の除去に有効な量で投与され、
割れたかかとを治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量が、効果的な治療に十分な量で投与され、
ドライパッチ、かゆみ、赤みおよび傷のような刺激を受けた皮膚のマネージメント用であって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量が、効果的な治療に十分な量で投与され、
癌治療に有効な量のまたは腫瘍転移予防もしくは阻害する量のトリプシンＺＴアイソフォームを投与することにより、嚢胞性線維症、癌、アテローム性動脈硬化、喘息、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、腱鞘炎などの組織癒着、腹腔後癒合または関節癒着、再灌流傷害、マラリア、自己免疫疾患のような免疫疾患、アポトーシス、大腸炎および腸炎、クローン病を治療または予防的に防止することであり、好ましくは、投与されるトリプシンＺＴアイソフォームおよび関連するペプチダーゼの量が有効であり、
微生物感染、例えば、ウイルスの感染、ライノウイルス（ＲＶ）、呼吸器合併症ウィルス（ＲＳＶ）、インフルエンザ、ヘルペスウィルス感染（例えばＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ヘルペス疱疹または性器ヘルペス感染）、ＨＩＶ、肝炎、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、またはパピローマウイルス感染、潰瘍または下痢のような胃腸の疾患を引き起こす感染、真菌の爪の感染およびカンジダ感染を含む酵母の感染を含む、全身、皮膚、経口、膣または食道の真菌感染症、点眼により好ましくは治療される目の微生物感染、ヘリコバクター・ピロリ、ブドウ球菌属菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ミディス、ストレプトコッカス属、クレブシエラ属、シュードモナス属、淋菌、ヘモフィルス属種、クラミジア種、梅毒および大腸菌感染症、軟性下かんを引き起こすバクテリア感染、による感染を含む、バクテリア感染を治療または予防的に防止し、免疫不全患者における日和見性の微生物感染であって、好ましくはタラのトリプシンの投与される量は、微生物感染の治療または予防に有効な量である、または細胞～細胞、細胞～ウイルス接着に対する阻害活性を有し、
疼痛、炎症、急性または慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節、滑液包炎、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデスおよび静脈炎からなる群から選択される兆候を治療または予防的に防止することであって、好ましくは、その量は、治療または予防に有効な量であり、
歯垢を除去することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量は、歯垢の除去に有効な量で投与され、
血餅を溶かすことであって、好ましくは、トリプシンＺＴアイソフォームの量は、好ましくは、血餅を溶かすのに有効な量である。
例えば、上気道および下気道並びに肺で生じるウイルス、バクテリア、およびカビにより引き起こされる病原性の疾患を治療または予防すること、
例えば、ざ瘡、発疹、乾癬、または手、顔、頭、もしくは首を含む湿疹、痔核のような皮膚疾患を治療または予防的に防止することであって、投与されるトリプシンＺＴアイソフォームおよび他のトリプシンの量は、好ましくは、皮膚疾患の治療または予防に有効な量であり、
肺の疾患を治療することであって、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームは、例えば、治療に有効な投与量で、高効率な加圧式定量用量吸入器を使用し、
微生物感染の予防に有効な量の他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームを傷に適用することにより、または、治療された傷が壊死組織の実質的な遊離である場合に、菌抑制に有効な量のトリプシンＺＴアイソフォームを、他のトリプシンとともにまたは単独で、投与することにより傷の治癒を促進することにより、創傷感染症および清拭した傷を治療または予防的に防止すること、
やけどを治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で投与されるトリプシンＺＴアイソフォームの量が、治療の促進に十分な量であり、
日焼けを治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で投与されるトリプシンＺＴアイソフォームの量が、治療の促進に十分な量であり、
放射線熱傷を治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で投与されるトリプシンＺＴアイソフォームの量が、治療の促進に十分な量であり、
肌の表面を改善するための、健康な皮膚からの垢の除去または皮膚のピーリングであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量が、垢の除去に有効な量で投与され、
割れたかかとを治療することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量が、効果的な治療に十分な量で投与され、
ドライパッチ、かゆみ、赤みおよび傷のような刺激を受けた皮膚のマネージメント用であって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量が、効果的な治療に十分な量で投与され、
癌治療に有効な量のまたは腫瘍転移予防もしくは阻害する量のトリプシンＺＴアイソフォームを投与することにより、嚢胞性線維症、癌、アテローム性動脈硬化、喘息、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、腱鞘炎などの組織癒着、腹腔後癒合または関節癒着、再灌流傷害、マラリア、自己免疫疾患のような免疫疾患、アポトーシス、大腸炎および腸炎、クローン病を治療または予防的に防止することであり、好ましくは、投与されるトリプシンＺＴアイソフォームおよび関連するペプチダーゼの量が有効であり、
微生物感染、例えば、ウイルスの感染、ライノウイルス（ＲＶ）、呼吸器合併症ウィルス（ＲＳＶ）、インフルエンザ、ヘルペスウィルス感染（例えばＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ヘルペス疱疹または性器ヘルペス感染）、ＨＩＶ、肝炎、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、またはパピローマウイルス感染、潰瘍または下痢のような胃腸の疾患を引き起こす感染、真菌の爪の感染およびカンジダ感染を含む酵母の感染を含む、全身、皮膚、経口、膣または食道の真菌感染症、点眼により好ましくは治療される目の微生物感染、ヘリコバクター・ピロリ、ブドウ球菌属菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ヘモフィルス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ミディス、ストレプトコッカス属、クレブシエラ属、シュードモナス属、淋菌、ヘモフィルス属種、クラミジア種、梅毒および大腸菌感染症、軟性下かんを引き起こすバクテリア感染、による感染を含む、バクテリア感染を治療または予防的に防止し、免疫不全患者における日和見性の微生物感染であって、好ましくはタラのトリプシンの投与される量は、微生物感染の治療または予防に有効な量である、または細胞～細胞、細胞～ウイルス接着に対する阻害活性を有し、
疼痛、炎症、急性または慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節、滑液包炎、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデスおよび静脈炎からなる群から選択される兆候を治療または予防的に防止することであって、好ましくは、その量は、治療または予防に有効な量であり、
歯垢を除去することであって、好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの量は、歯垢の除去に有効な量で投与され、
血餅を溶かすことであって、好ましくは、トリプシンＺＴアイソフォームの量は、好ましくは、血餅を溶かすのに有効な量である。
【0061】
上記のように本方法は、トリプシンＺＴアイソフォームを含む、組成物を投与する。
【0062】
本発明は、上記トリプシンＺＴアイソフォーム、ゲル、クリーム、または坐薬の組成物を含む局所の化粧品および医療用組成物を提供する。
【0063】
本発明は、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームを投与することにより、病原体微生物の移動を阻害または予防的に防止する方法を提供する。好ましくは、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームは、問題の微生物のための一次伝達入口を含む身体の部分に適用される。一実施形態では、スプレー、軟膏、洗浄は、例えば、ＨＩＶおよび肝炎の伝染を予防するために、性的な活動を含む体の開口部に適用される。別の実施形態では、トリプシンＺＴアイソフォームまたは関連するペプチダーゼは、例えば、エアゾールを介して上気道に適用され、ライノウイルスまたはコロナウイルスのような風邪ウイルスの伝染を阻害または予防する。
【0064】
細胞接着成分を取り除くための、組織、体液、細胞の組成物を体外で治療する方法は、１つの個体から他へと移植されたときの、組織、体液、または細胞の組成物の免疫拒絶反応を低減する。別の態様では、このような治療は、微生物感染にともなう、治療される組織、体液、または細胞の組成物でみられる細胞接着成分を除去または不活化にする。
【0065】
トリプシンＺＴアイソフォームまたは関連するペプチダーゼを投与することにより、感染性ショックまたは毒素性ショック症候群を治療または予防的に防止することにおいて、適切な投与経路は、全身投与を含む。刺激に関連する膣感染については、膣内洗浄、クリーム、ゲルまたは坐剤を投与方法として使用することができる。
【0066】
トリプシンＺＴアイソフォームまたは関連するペプチダーゼを投与することによる、疼痛、炎症、急性または慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節、滑液包炎、変形性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、化膿性関節炎、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、静脈炎における治療または予防的な防止において、適切な投与経路は、限定されることなく、クリーム、ゲル、または坐薬を含み、限定するものではないが、特に、グリセロールまたは他のポロオールを含有するハイドロゲルを含む。
【0067】
他のトリプシンを含むもしくは含まないトリプシンＺＴアイソフォームまたは関連するペプチダーゼを投与することにより、疹、乾癬、ざ瘡、湿疹、顔の脂漏湿疹、手、顔、もしくは首の湿疹、包皮感染症、水虫、フィステル感染症、感染した局所の潰瘍、新生児におけるへその感染症、しわ、瘢痕、ケロイド、おでき、いぼおよびアレルギー性かゆみ、痔核等、傷、創傷感染症、火傷による傷、肌の表面の改善のための健康な皮膚からの垢の除去または皮膚のピーリング、全身、肌、口、膣、食道の真菌のような真菌感染症、例えば、真菌の爪の感染およびカンジダ感染を含む酵母の感染、および自己免疫疾患を含む免疫障害を治療または予防的に防止することにおいて、適切な投与経路は、クリーム、ゲル、または坐薬、限定するものではないが、特に、グリセロールまたは他のポロオールを含有するハイドロゲルを含む。
【0068】
上記目的は、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの有効な量を含む組成物を用いることにより達成され、前置きの部分で言及した、疼痛、炎症、関節炎、腫れ、浮腫、乾癬、湿疹、皮膚炎、発疹および／または他の疾患の兆候を明らかにすることができる。トリプシンＺＴアイソフォームは、タラの内臓から、比較的簡易な方法で、かつ高い収率で得られる。トリプシンＺＴアイソフォームは、商業的規模で、比較的簡単な方法で合理的な収率で精製され得ることがわかった。トリプシンＺＴアイソフォームは、本発明の目的のために、他のアトランティックセリンプロテアーゼとともに、あるいは単独で使用することができる。
【0069】
本開示に示されるトリプシンＺＴアイソフォームは、酵素およびアフィニティーリガンド間の相互作用を不安定にさせる条件を適用することにより、アフィニティーマトリックスから放出することができる。このような条件は、高塩基、続いて低ｐＨ、好ましくは３０％以上のグリセロールを含む。カラム溶出液は、酸溶出ステップ後にタラのトリプシンを安定化させるために中和バッファへと流す。トリプシンＺＴアイソフォームを、陰イオン交換を用いてさらに精製し、その後、塩濃度を増加させて溶出した。これらの方法により、約９０％を超える純度を有するトリプシンＺＴアイソフォームを単離することができた。得られたタラのトリプシン区画は、その後、２つのバンドを生み出すＳＤＳ電気泳動およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により現れるように、２～３の主要なアイソフォームを含む。トリプシンＺＴアイソフォームの分子量は約２５ｋＤａであり、計算された等電点はアイソフォームにより４．３５～４．４９である。
【0070】
他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームは、特定の処方で医薬品として、医療装置において（例えば、化学製剤として）、または意図される使用に応じて化粧品として使用することができる。本発明のトリプシンＺＴアイソフォームは、（他のトリプシンとともにまたは単独で）局所的に、口腔、直腸、膣、点滴（例えば、尿路またはフィステルへ）により、肺経路により、例えば、エアロゾルの使用によって（例えば、加圧式定量吸入器の使用により（ｐＭＤＩ））、眼への滴の適用により、または、全身的に、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内または静脈内のように非経口的に投与される。トリプシンＺＴアイソフォームは、スタンダードな医薬品プラクティスにより薬学的に許容可能な担体または賦形剤と組み合わせてまたは溶液で投与される。投与の経口モードでは、トリプシンＺＴアイソフォームは、錠剤、カプセル、ロゼンジ、チューインガム、トローチ、粉末、シロップ、エリキシル、水溶液および懸濁液等の形態で使用される。非経口投与については、トリプシンＺＴアイソフォームの無菌的な溶液が通常調製され、溶液のｐＨの値は、適切に調製され、緩衝される。静脈内使用については、溶液の合計濃度は、等張性調製物になるように制御される必要がある。眼投与については、軟膏または滴下可能な液体は、アプリケーターまたは点眼薬などの当技術分野で公知の眼内送達システムによって送達され得る。
【0071】
肺投与については、希釈剤および/または担体は、エアロゾルの形成を可能にするのに適切であるように選択される。局所投与については、トリプシンＺＴアイソフォームは、典型的には、約２０％～３０％グリセロール、場合によっては最大で８５％グリセロールのような０～８５％グリセロールを含むハイドロゲルで投与される。
【0072】
局所治療については、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの投与あたりの適切な用量は、約０．０１μｇ／ｃｍ２～約１ｍｇ／ｃｍ２、好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ２～約０．０１ｍｇ／ｃｍ２（例えば約０．０１ｍｇ／ｍｌの酵素ゲルを使用）の範囲である。全身的な治療については、用量は、一般に、約０．１ｍｇ／１００ｍｌ～約１００ｍｇ／１００ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／１００ｍｌ～約２．０ｍｇ／１００ｍｇの間の、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームの血清レベルを維持するように選択される。好ましい全身投与量の代替測定において、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇが使用される。膣および尿路治療の場合、トリプシンＺＴアイソフォームの適切なフラッシング／点滴溶液は、一般に、約１μｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１００μｇ／ｍｌ～約３ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。すべての治療について、一般的に、構成組成物は、約１～約１０回／日、好ましくは約２～約５回／日の頻度で使用される。もちろん、これらの値は、医学分野の当業者によって認識されるように、疾患の種類および重症度、患者の年齢、体重および医学的状態を含む多くの要因によって変化するであろう。実質的により高い用量が、実質的な有害作用なしに使用され得ると考えられる。
【0073】
創傷治癒については、他のトリプシンとともにまたは単独で、トリプシンＺＴアイソフォームは、好ましくは、創傷が最初に被覆されるときよりも、頻繁に適用される。好ましくは、トリプシンＺＴアイソフォームは、少なくとも創傷被覆材が交換されるたびに適用される。トリプシンＺＴアイソフォームは、約１日おきに、より好ましくは毎日、または１日に数回適用し得る。湿疹、乾癬などの皮膚症状の場合には、トリプシンＺＴアイソフォーム（他のトリプシンとともにまたは単独で）ハイドロゲルを、好ましくは毎日、より好ましくは１日２回適用する。急性または慢性炎症、関節炎、炎症を起こした関節炎、滑液包炎、変形性関節炎などの場合、トリプシンＺＴアイソフォームは、好ましくは毎日、より好ましくは毎日２回適用される。
【0074】
タンパク質の相同性のパーセントを決定するための多くの方法が当該技術分野において知られている。ClustalW2（バージョンClustal2.1）を使用して、配列比較を行うときに、パーセント同一性を計算した（EMBL-EBI ウェブサイトhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ date 4th of May 2015）。
【0075】
本発明は、多くの非限定的な実施例によってここに説明される。
【0076】
実施例１
タラ由来のプロテアーゼの混合物の調製
凍結したタイセイヨウダラ内蔵約１００ｋｇを解凍し、抽出タンク内の４倍量の冷たい水に加え、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを約６に調整した。混合物を０～５℃で約１０時間攪拌した。短時間の粗沈降（約３０分）後、残っている不溶性の内臓から水溶性の抽出物をポンプで流出させ、沈降槽に回収した。水溶性の抽出物を、冷却された沈降槽内で、室温で約４０～８０時間沈殿させた。上清を上清タンクからポンプを用いて保持タンクにデカントした。限外ろ過により上清を１０～２０倍に濃縮し、約２．５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度でイオン強度の許容レベルにダイアフィルトレーションした。限外ろ過およびダイアフィルトレーションされたタンパク質濃縮物約１０～１５リットルが得られた。
タラ由来のプロテアーゼの混合物の調製
凍結したタイセイヨウダラ内蔵約１００ｋｇを解凍し、抽出タンク内の４倍量の冷たい水に加え、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを約６に調整した。混合物を０～５℃で約１０時間攪拌した。短時間の粗沈降（約３０分）後、残っている不溶性の内臓から水溶性の抽出物をポンプで流出させ、沈降槽に回収した。水溶性の抽出物を、冷却された沈降槽内で、室温で約４０～８０時間沈殿させた。上清を上清タンクからポンプを用いて保持タンクにデカントした。限外ろ過により上清を１０～２０倍に濃縮し、約２．５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度でイオン強度の許容レベルにダイアフィルトレーションした。限外ろ過およびダイアフィルトレーションされたタンパク質濃縮物約１０～１５リットルが得られた。
【0077】
実施例２
濃縮されたタラの内臓抽出物由来のタラのトリプシンＺＴアイソフォームの精製
実施例１で得られた約１２リットルの限外ろ過およびダイアフィルトレーションされた濃縮物を、約１リットルのパックドクロマトグラフカラムの連続した連続シリーズに適用し、第１のものはカルボキシメチル（ＣＭ）高速流動陽イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）を含有し、第２のものはセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合したｐ－アミノベンザミジンアフィニティリガンドを含む。ＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムは、２．５ｍＭの塩化カルシウム（緩衝液Ａ）を含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）の約１０カラムボリュームで前平衡化された。濃縮物を約１００ｍｌ／分の流速でＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムにポンピングした。カラムへの濃縮溶液の適用が完了したとき、残留物質を約８リットルの緩衝液Ａで連続カラムシステムから洗い流した。この洗浄が完了した後、ｐ－アミノベンザミジンアフィニティカラムをＣＭカラムから切り離し、０．５ＭＮａＣｌおよび２．５ｍＭ塩化カルシウムを含有する２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５の高塩溶液の約５カラムボリュームで洗浄した。タラのトリプシンをアフィニティリガンドから取り出し、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび３０％グリセロールを含む、ｐＨ３．２、２５ｍＭ酢酸の酸溶液でカラムから溶出させた。
濃縮されたタラの内臓抽出物由来のタラのトリプシンＺＴアイソフォームの精製
実施例１で得られた約１２リットルの限外ろ過およびダイアフィルトレーションされた濃縮物を、約１リットルのパックドクロマトグラフカラムの連続した連続シリーズに適用し、第１のものはカルボキシメチル（ＣＭ）高速流動陽イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）を含有し、第２のものはセファロース樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合したｐ－アミノベンザミジンアフィニティリガンドを含む。ＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムは、２．５ｍＭの塩化カルシウム（緩衝液Ａ）を含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）の約１０カラムボリュームで前平衡化された。濃縮物を約１００ｍｌ／分の流速でＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムにポンピングした。カラムへの濃縮溶液の適用が完了したとき、残留物質を約８リットルの緩衝液Ａで連続カラムシステムから洗い流した。この洗浄が完了した後、ｐ－アミノベンザミジンアフィニティカラムをＣＭカラムから切り離し、０．５ＭＮａＣｌおよび２．５ｍＭ塩化カルシウムを含有する２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５の高塩溶液の約５カラムボリュームで洗浄した。タラのトリプシンをアフィニティリガンドから取り出し、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび３０％グリセロールを含む、ｐＨ３．２、２５ｍＭ酢酸の酸溶液でカラムから溶出させた。
【0078】
精製されたタラのトリプシンＺＴアイソフォーム含有調製物は、ＳＤＳＰＡＧＥ電気泳動により均一であった。精製された調製物を０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌し、約－２０℃で凍結保存した。タラのトリプシンＺＴアイソフォーム含有調製物を０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌し、約－２０℃で凍結保存した。タラのトリプシンＺＴアイソフォーム含有調製物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＭｏｎｏＱ）に適用し、を塩勾配（図１）でタンパク質を溶出した。このカラムを緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０）で平衡化し、４０カラムボリュームでリニアな０～１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６カラムボリュームでリニアな１５０～６２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０カラムボリュームで６２０～８５０ｍＭ ＮａＣｌの勾配で、１ｍＬ／分の流速にて、酵素を溶出させた。図１のトリプシンＺＴで標識されたピークのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した（図２）。トリプシンＺＴピーク由来のゲル上のタンパク質バンドをゲルから切り出し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を用いて分析した。質量分析（ＭＳ）分析は、トリプシンＺＴ－１、トリプシンＺＴ－２、トリプシンＺＴ－３およびトリプシンＺＴ－４に対する同一性を示した（表１および表２）。トリプシンＩおよびトリプシンＸに対する抗体は、タラのトリプシンＩおよびタラのトリプシンＸの極端なＣ末端の残基２２８－２３９に対応するペプチド（（ＮＨ２－）ＣＶＬＳＧＷＶＲＤＴＭＡ（－ＣＯＯＨ））（配列番号２３）に対してウサギで調製された。抗体は、ゲルビーズ支持体にカップリングしたペプチドを用いて、ウサギ血清からアフィニティー精製された。トリプシンＺＴアイソフォームに対するポリクローナル抗体を、Overkamp et al.に記載されるように、マウス腹水中で作成した（Overkamp, Mohammed-Ali et al., 1988, J Immunoassay 9: 51-68）。組換えトリプシンＺＴ－４の精製された形態を、Ｂａｌｂ／Ｃ２マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３４日目にマウスを屠殺し、腹水を採取した。それぞれの抗体はウエスタンブロット解析に用いられた。ウェスタンブロット解析は図１（図３）のピーク標識されたトリプシンＺＴにおけるタンパク質について行った。トトリプシンＺＴアイソフォーム抗体は、ピーク標識されたトリプシンＺＴ由来のタンパク質に対して反応したが、トリプシンＩおよびトリプシンＸに対する抗体は反応しなかった（図３）。
【0079】
表１は、図２（非グアニジル化試料）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからのタンパク質バンド上のＭＳ分析から得られたペプチド質量を示す（カラム１のＭｒ（ｅｘｐｔ）参照）。Ｍｒは相対分子量をＤａで表す。カラム２，３および４は、アミノ酸配列トリプトンＺＴ－１、トリプシンＺＴ－２、トリプシンＺＴ－３およびトリプシンＺＴ－４のインシリコトリプシンダイジェストからの計算値（カラム１の質量に一致する質量について）を示す。カラム５は、インシリコダイジェストからの質量値を与えるペプチドの配列を示す。カラム６は、インシリコダイジェストに基づく異なるペプチドの修飾を示す。
【0080】
【表1】
【0081】
表１の配列は以下の通りである。
【表2】
【0082】
表２は、図２（グアニジル化試料）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからのタンパク質バンドのＭＳ分析から得られたペプチド質量を示し、カラム１のＭｒ（ｅｘｐｔ）を参照されたい。Ｍｒは相対分子量をＤａで表す。カラム２，３および４は、トリプシンＺＴ－１、トリプシンＺＴ－２、トリプシンＺＴ－３およびトリプシンＺＴ－４のアミノ酸配列のインシリコトリプシン消化物からの計算値（カラム１の質量に一致する質量について）を示す。カラム５は、インシリコダイジェストからの質量値を与えるペプチドの配列を示す。カラム６は、インシリコダイジェストに基づく異なるペプチドの修飾を示す。
【0083】
【表3】
【0084】
表２の配列は以下の通りである。
【表4】
【0085】
実施例３
トリプシンＺＴアイソフォームでの複合的な基質プロファイリング
複合的な基質プロファイリングが酵素（プロテイナーゼ）の基質特異性を分析するために使用された（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。プロテイナーゼは、基質特異性における相違を示すためにペプチド配列内で異なるアミノ酸残基で基質を切断することができる。トリプシンはアルギニンまたはリジン残基に対するＣ末端を切断することにおけるそれらの優先性により特定される。
トリプシンＺＴアイソフォームでの複合的な基質プロファイリング
複合的な基質プロファイリングが酵素（プロテイナーゼ）の基質特異性を分析するために使用された（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。プロテイナーゼは、基質特異性における相違を示すためにペプチド配列内で異なるアミノ酸残基で基質を切断することができる。トリプシンはアルギニンまたはリジン残基に対するＣ末端を切断することにおけるそれらの優先性により特定される。
【0086】
酵素アイソフォーム
タラのトリプシン・イソ酵素は、ベンスアミジン精製されたタラのトリプシンをＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５イオン交換カラムに適用することによって分離された。トリプシンＩの単離のために、カラムを２０ｍＭトリス、５ｍＭエタノールアミン、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ９．１を用いて平衡化し、８０カラムボリュームでリニアな０～２００ｍＭ ＮａＣｌ勾配、１０カラムボリュームでリニアな２００～１０００ｍＭ ＮａＣｌ勾配、１ｍＬ／分の流速で、酵素を溶出した。サンプルｐＨは、適用前に１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ９．１に調整した。
タラのトリプシン・イソ酵素は、ベンスアミジン精製されたタラのトリプシンをＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５イオン交換カラムに適用することによって分離された。トリプシンＩの単離のために、カラムを２０ｍＭトリス、５ｍＭエタノールアミン、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ９．１を用いて平衡化し、８０カラムボリュームでリニアな０～２００ｍＭ ＮａＣｌ勾配、１０カラムボリュームでリニアな２００～１０００ｍＭ ＮａＣｌ勾配、１ｍＬ／分の流速で、酵素を溶出した。サンプルｐＨは、適用前に１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ９．１に調整した。
【0087】
トリプシンＺＴアイソフォームの単離では、カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、ｐＨ７．５で平衡化し、５カラムボリュームでリニアな０～１５０ｍＭ ＮａＣｌ勾配、２０カラムボリュームでリニアな１５０～５５０ｍＭ ＮａＣｌ勾配、１カラムボリュームでリニアな５００～１０００ｍＭ ＮａＣｌ勾配、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で、酵素を溶出した。
【0088】
両方の酵素試料（トリプシンＺＴおよびトリプシンＩ）の組成物を、ｐＨ８．５でトリスの最終濃度が６０ｍＭ、ＣａＣｌ２ ３０ｍＭおよびグリセロール１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように調整した。
【0089】
複合的な基質プロファイリング分析
O'Donoghue, Eroy-Reveles et al.に記載されているように、精製されたトリプシンＺＴアイソフォームまたはトリプシンＩを、広範囲な生理化学的な多様性を有するペプチドライブラリー（１２４個のペプチド、１４－ｍｅｒの配列、合計１６１２個のペプチド結合）とともにインキュベートした（５、１５および６０分）（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。インキュベーション後に、切断部位は、質量分析により特定された（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。
O'Donoghue, Eroy-Reveles et al.に記載されているように、精製されたトリプシンＺＴアイソフォームまたはトリプシンＩを、広範囲な生理化学的な多様性を有するペプチドライブラリー（１２４個のペプチド、１４－ｍｅｒの配列、合計１６１２個のペプチド結合）とともにインキュベートした（５、１５および６０分）（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。インキュベーション後に、切断部位は、質量分析により特定された（O'Donoghue, Eroy-Reveles et al., 2012, Nat Methods 9: 1095-1100）。
【0090】
結果
複合的な基質プロファイル分析は予想外に、国際公開第2000078332号パンフレット（図4および表4）に開示されている、トリプシンIと比較して、トリプシンＺＴアイソフォームに特有の多くの切断部位があることを示した。また、トリプシンＩと比較したトリプシンＺＴアイソフォームによる優先切断を示した切断部位が特定された（表４）。複合的基質プロファイル分析の結果に基づいて、基質中のＰ４－Ｐ４’位置における標準得点（Ｚスコア）に基づく数値を含む表を作成し、トリプシンＺＴの基質特異性をトリプシンＩと比較した（表３）。正の数（Ｚスコア）は、トリプシンＺＴアイソフォームをトリプシンＩと比較して特定のＰ位にあるアミノ酸残基の優先性を反映する。予期されないことに、トリプシンＺＴアイソフォームの複合的な基質プロファイリングは、基質中のアルギニンまたはリジンを取り囲むアミノ酸が、トリプシンIと比較してその切断に対して異なる効果を有することを明らかにした。
複合的な基質プロファイル分析は予想外に、国際公開第2000078332号パンフレット（図4および表4）に開示されている、トリプシンIと比較して、トリプシンＺＴアイソフォームに特有の多くの切断部位があることを示した。また、トリプシンＩと比較したトリプシンＺＴアイソフォームによる優先切断を示した切断部位が特定された（表４）。複合的基質プロファイル分析の結果に基づいて、基質中のＰ４－Ｐ４’位置における標準得点（Ｚスコア）に基づく数値を含む表を作成し、トリプシンＺＴの基質特異性をトリプシンＩと比較した（表３）。正の数（Ｚスコア）は、トリプシンＺＴアイソフォームをトリプシンＩと比較して特定のＰ位にあるアミノ酸残基の優先性を反映する。予期されないことに、トリプシンＺＴアイソフォームの複合的な基質プロファイリングは、基質中のアルギニンまたはリジンを取り囲むアミノ酸が、トリプシンIと比較してその切断に対して異なる効果を有することを明らかにした。
【0091】
表３は、５，１５および６０分間のインキュベーション後のトリプシンＺＴおよびトリプシンＩの基質特異性を比較する、基質中のＰ４－Ｐ４’位置における標準得点（Ｚスコア）比に基づく数値を示す。切断を受ける基質中のアミノ基残基を切断された結合からＮ末端方向にＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４と命名した（Schechter and Berger, 1967, Biochem Biophys Res Commun 27: 157-162, Schechter and Berger, 1968, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902）。Ｃ末端方向における残基はＰ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’と指定される。Ｐ位置は列に提供され、行は異なるＰ位置におけるアミノ酸を示す。表中の正の数（Ｚスコア）は、トリプシンＺＴアイソフォームをトリプシンＩと比較して特定のＰ位にあるアミノ酸残基の優先性を反映している。負の値（Ｚスコア）は、トリプシンＩをトリプシンＺＴと比較して優先性を反映している。例えば、表３の値に基づいて、トリプシンＺＴは、トリプシンＩと比較して、いくつかの連続した正電荷を持っている残基（アルギニンまたはリジン）を含有するペプチドを切断するのにより適していることが分かる。また、リジンやアルギニンが豊富なアミノ酸配列であるこれらのタイプの配列は、病原体に含まれるタンパク質毒素、タンパク質、ペプチドで多くみられる（Suzuki, Orba et al., 2010, PLoS Pathog 6: e1000801, Fentress, Steinfeldt et al., 2012, Cell Microbiol 14: 1921-1933, Jiang, Cun et al., 2012, J Virol 86: 7256-7267, Milletti, 2012, Drug Discov Today 17: 850-860, Gallaher and Garry, 2015, Virus 7: 285-305）。したがって、前述のように、トリプシンＺＴアイソフォームは、多くの微生物の病原性に関与するタンパク質に対して有益な特性を有する。
【0092】
【表5】
【0093】
表３続き
【表6】
【0094】
表３続き
【表7】
【0095】
表４は、トリプシンＺＴまたはトリプシンＩとのインキュベーション後の複合的なプロファイリングからの選択されたペプチドの前駆イオン強度を示す。前駆イオン強度は、所定の種の相対存在量の尺度を表すフラグメンテーション前のＭＳのペプチドピーク強度である。ペプチド配列のＸはペプドド配列にアミノ酸がないプレースホルダーを示す。このデータは、トリプシンＺＴアイソフォームが、トリプシンＩと比較して３つのペプチド鎖（QGKKAPXX、WGNRSPLEおよびQAVRPNGM）を排他的に切断できることを示している。さらに、データは、トリプシンＺＴアイソフォームがトリプシンＩと比較して優先的に２つのペプチドを切断することを示している。トリプシンＺＴアイソフォームは、５分以内にXIARQPWNを切断し、１５分以内にFDNRVGKWを切断することができたが、これらの２つのペプチド内の切断は、トリプシンＩでは、６０分間のインキュベーション後に検出されただけであった。
【0096】
【表8】
【0097】
実施例４
濃縮されたタラの内臓抽出物由来のタラのトリプシンＺＴアイソフォームの精製
実施例１で得られた約１２リットルの限外ろ過およびダイアフィルトレーション濃縮物を、ＣＭ高速フロー陽イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）を含有する第１のもの、セファロース樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合するp-アミノベンザミジンアフィニティーリガンドを含有する第２のもの、ＤＥＡＥ高速フロー陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）を含有する第３のものという、約１リットルのパックドクロマトグラフィーカラムの連続接続シリーズに適用した。ＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムは、２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．８の約１０カラムボリュームで前平衡化した。濃縮物を約１００ｍｌ／分の流速でＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムにポンピングした。カラムへの濃縮溶液の適用が完了したとき、残留物質を約８リットルの緩衝液Ａで連続カラムシステムから洗い流した。この洗浄が完了した後、ｐ－アミノベンザミジンアフィニティカラムをＣＭカラムから切り離し、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ塩化カルシウムを含有する２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５の高塩溶液の約５カラムボリュームで洗浄した。タラのトリプシンをアフィニティリガンドから取り出し、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび３０％グリセロールを含む、ｐＨ３．２、２５ｍＭ酢酸の酸溶液でカラムから溶出させた。タラのトリプシン画分を、３０％グリセロールを含む、ｐＨ８．５の２００ｍＭトリス中和緩衝液に収集した。ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムを、２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）の約１０カラムボリュームで前平衡化した。タラのトリプシン画分をＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂に適用し、約５カラムの平衡緩衝液で洗浄した。次いで、最大０．９Ｍ ＮａＣｌ勾配塩溶液を使用して、カラムからトリプシンＺＴアイソフォームを放出させた。精製されたタラのトリプシンＺＴアイソフォーム調製物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動およびＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑクロロマトグラフィーにより均一であった。精製された調製物を０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌し、約－２０℃で凍結保存した。
濃縮されたタラの内臓抽出物由来のタラのトリプシンＺＴアイソフォームの精製
実施例１で得られた約１２リットルの限外ろ過およびダイアフィルトレーション濃縮物を、ＣＭ高速フロー陽イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）を含有する第１のもの、セファロース樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合するp-アミノベンザミジンアフィニティーリガンドを含有する第２のもの、ＤＥＡＥ高速フロー陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）を含有する第３のものという、約１リットルのパックドクロマトグラフィーカラムの連続接続シリーズに適用した。ＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムは、２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．８の約１０カラムボリュームで前平衡化した。濃縮物を約１００ｍｌ／分の流速でＣＭおよびｐ－アミノベンザミジンカラムにポンピングした。カラムへの濃縮溶液の適用が完了したとき、残留物質を約８リットルの緩衝液Ａで連続カラムシステムから洗い流した。この洗浄が完了した後、ｐ－アミノベンザミジンアフィニティカラムをＣＭカラムから切り離し、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ塩化カルシウムを含有する２５ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５の高塩溶液の約５カラムボリュームで洗浄した。タラのトリプシンをアフィニティリガンドから取り出し、１０ｍＭ塩化カルシウムおよび３０％グリセロールを含む、ｐＨ３．２、２５ｍＭ酢酸の酸溶液でカラムから溶出させた。タラのトリプシン画分を、３０％グリセロールを含む、ｐＨ８．５の２００ｍＭトリス中和緩衝液に収集した。ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムを、２．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．８）の約１０カラムボリュームで前平衡化した。タラのトリプシン画分をＤＥＡＥ陰イオン交換樹脂に適用し、約５カラムの平衡緩衝液で洗浄した。次いで、最大０．９Ｍ ＮａＣｌ勾配塩溶液を使用して、カラムからトリプシンＺＴアイソフォームを放出させた。精製されたタラのトリプシンＺＴアイソフォーム調製物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動およびＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑクロロマトグラフィーにより均一であった。精製された調製物を０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌し、約－２０℃で凍結保存した。
【0098】
実施例５
タラのトリプシンＺＴアイソフォームを含むタラのトリプシンのハイドロゲル調製物の調製
実施例２の精製されたタラのトリプシンＺＴアイソフォーム含有調製物を、０．８％ｗ／ｖカルボマー９４０および４０％グリセロールを含む水性ゲルを含む親水コロイドゲルと混合した。タラのトリプシン調製物は、ハイドロゲルと１：１の比で混合し、最終的なゲル－酵素混合物（酵素ハイドロゲル軟膏）のｍｇ当たり４酵素単位（Ｕ／ｍｇ）の最終濃度を得た。酵素単位は、前述の基質としてのCbz-GPR-pNAを用いて決定される。従って、得られた酵素ハイドロゲル軟膏は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、または１Ｕ／ｍｌのタラのトリプシン酵素、０．４％のカルボマー９４０、２０％のグリセロールおよび０．０４％のパラオキシ安息香酸を含有した。
タラのトリプシンＺＴアイソフォームを含むタラのトリプシンのハイドロゲル調製物の調製
実施例２の精製されたタラのトリプシンＺＴアイソフォーム含有調製物を、０．８％ｗ／ｖカルボマー９４０および４０％グリセロールを含む水性ゲルを含む親水コロイドゲルと混合した。タラのトリプシン調製物は、ハイドロゲルと１：１の比で混合し、最終的なゲル－酵素混合物（酵素ハイドロゲル軟膏）のｍｇ当たり４酵素単位（Ｕ／ｍｇ）の最終濃度を得た。酵素単位は、前述の基質としてのCbz-GPR-pNAを用いて決定される。従って、得られた酵素ハイドロゲル軟膏は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、または１Ｕ／ｍｌのタラのトリプシン酵素、０．４％のカルボマー９４０、２０％のグリセロールおよび０．０４％のパラオキシ安息香酸を含有した。
【0099】
実施例６
ライノウイルスについてのモデルとしてのエンテロウイルスに対するトリプシンＺＴアイソフォームの抗ウイルス活性
ピコルナウイルスは、脂質エンベロープを欠く小さな一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。エンテロウイルスとライノウイルスはピコルナウイルス科の２属である。エンテロウイルスは、最初に口腔咽頭で複製し、胃の酸性環境で生存する。小腸は、エンテロウイルスの主要侵入部位である。ライノウイルスは鼻の通路では複製するが、胃の酸性環境では破壊される。ライノウイルスとエンテロウイルスは、同一の形態を有するが、臨床的、生物物理学的、および疫学的研究に基づいて区別することができる。ライノウイルスは細胞培養で扱うには問題がある（Racaniello, 2007, Fields virology, 5th ed: 795-838）。したがって、エンテロイルスは、トリプシンＺＴアイソフォームの抗ウイルス活性を分析するために、ライノウイルスのモデルとして使用された。
ライノウイルスについてのモデルとしてのエンテロウイルスに対するトリプシンＺＴアイソフォームの抗ウイルス活性
ピコルナウイルスは、脂質エンベロープを欠く小さな一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。エンテロウイルスとライノウイルスはピコルナウイルス科の２属である。エンテロウイルスは、最初に口腔咽頭で複製し、胃の酸性環境で生存する。小腸は、エンテロウイルスの主要侵入部位である。ライノウイルスは鼻の通路では複製するが、胃の酸性環境では破壊される。ライノウイルスとエンテロウイルスは、同一の形態を有するが、臨床的、生物物理学的、および疫学的研究に基づいて区別することができる。ライノウイルスは細胞培養で扱うには問題がある（Racaniello, 2007, Fields virology, 5th ed: 795-838）。したがって、エンテロイルスは、トリプシンＺＴアイソフォームの抗ウイルス活性を分析するために、ライノウイルスのモデルとして使用された。
【0100】
材料と方法
エンテロウイルスストックソリューション
エンテロウイルス（コクサッキーウイルスＢ２）は、アイスランド大学病院のウイルス科の患者から単離され、ＭＡ－１０４細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）またはベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）で増殖した。コクサッキーウイルスＢ２は、Reed-Muenchにより滴定された（TCID50 = 8,23）（REED and MUENCH, 1938, American Journal of Epidemiology 27: 493-497）。
エンテロウイルスストックソリューション
エンテロウイルス（コクサッキーウイルスＢ２）は、アイスランド大学病院のウイルス科の患者から単離され、ＭＡ－１０４細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）またはベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞）で増殖した。コクサッキーウイルスＢ２は、Reed-Muenchにより滴定された（TCID50 = 8,23）（REED and MUENCH, 1938, American Journal of Epidemiology 27: 493-497）。
【0101】
酵素アイソフォーム
タラのトリプシン・イソ酵素は、ベンスアミジン精製されたタラのトリプシンをＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５イオン交換カラムに適用することによって分離された。トリプシンＺＴアイソフォームの単離では、カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５で平衡化し、５カラムボリュームでリニアな０～４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０カラムボリュームでリニアな４００～１０００ｍＭ ＮａＣｌの勾配で、１ｍＬ／分の流速で、酵素を溶出させた。
タラのトリプシン・イソ酵素は、ベンスアミジン精製されたタラのトリプシンをＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５イオン交換カラムに適用することによって分離された。トリプシンＺＴアイソフォームの単離では、カラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５で平衡化し、５カラムボリュームでリニアな０～４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０カラムボリュームでリニアな４００～１０００ｍＭ ＮａＣｌの勾配で、１ｍＬ／分の流速で、酵素を溶出させた。
【0102】
処理
ＭＡ－１０４細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート中で９５％コンフルエンシーまで増殖させた。エンテロウイルスをストック溶液から最小必須培地（ＭＥＭ）を用いて１０－６に希釈し、１．５ｍＬの希釈溶液を２つの異なるバイアルに入れた。バイアルを１．５ｍＬのトリプシンＺＴアイソフォームおよび１．５ｍＬのＭＥＭで陽性対照として処理した。ネガティブ対照は、ウイルスなしのＭＥＭ（３ｍＬ）であった。すべてのバイアルを３４℃および５％ＣＯ２で９０分間インキュベートしてから、残留するトリプシンを除去するために１００μＬのベンズアミジンアガロース溶液を添加し、さらに３０分間インキュベートした。この溶液を５５００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、２ｍＬの上清をエッペンドルフバイアルに入れた。２００μＬの溶液を、マイクロタイタープレートの各ウェル、合計１０ウェルに入れた。プレートを３０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を捨て、すべてのウェルに１％新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を添加したＭＥＭを加えた。顕微鏡を用いて感染の存在をモニターした。
ＭＡ－１０４細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート中で９５％コンフルエンシーまで増殖させた。エンテロウイルスをストック溶液から最小必須培地（ＭＥＭ）を用いて１０－６に希釈し、１．５ｍＬの希釈溶液を２つの異なるバイアルに入れた。バイアルを１．５ｍＬのトリプシンＺＴアイソフォームおよび１．５ｍＬのＭＥＭで陽性対照として処理した。ネガティブ対照は、ウイルスなしのＭＥＭ（３ｍＬ）であった。すべてのバイアルを３４℃および５％ＣＯ２で９０分間インキュベートしてから、残留するトリプシンを除去するために１００μＬのベンズアミジンアガロース溶液を添加し、さらに３０分間インキュベートした。この溶液を５５００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、２ｍＬの上清をエッペンドルフバイアルに入れた。２００μＬの溶液を、マイクロタイタープレートの各ウェル、合計１０ウェルに入れた。プレートを３０分間インキュベートした。インキュベーション後、培地を捨て、すべてのウェルに１％新生児ウシ血清（ＮＣＳ）を添加したＭＥＭを加えた。顕微鏡を用いて感染の存在をモニターした。
【0103】
結果
トリプシンＺＴアイソフォームは、ライノウイルスのモデルとして使われたエンテロウイルス（コクサッキーウイルスＢ２）に対する抗ウィルス剤として非常に有効であった。結果を図５に示す。
トリプシンＺＴアイソフォームは、ライノウイルスのモデルとして使われたエンテロウイルス（コクサッキーウイルスＢ２）に対する抗ウィルス剤として非常に有効であった。結果を図５に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】