特許 7116937 イメージング質量分析に好適な試料作製法及び導電性粘着フィルム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-03

(45)【発行日】2022-08-12

(54)【発明の名称】イメージング質量分析に好適な試料作製法及び導電性粘着フィルム

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20220804BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 F

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2019051834

(22)【出願日】2019-03-04

(65)【公開番号】P2019158887

(43)【公開日】2019-09-19

【審査請求日】2021-03-02

(31)【優先権主張番号】P 2018055243

(32)【優先日】2018-03-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】510206752

【氏名又は名称】株式会社ＳＥＣＴＩＯＮ－ＬＡＢ

(72)【発明者】

【氏名】川本 孔明

(72)【発明者】

【氏名】川本 忠文

【審査官】▲高▼場 正光

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１１４０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０１４３４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１０９１４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０２７８４００（ＵＳ，Ａ１）

【文献】GOODWIN, Richard J.A. 外７名，“Conductive carbon tape used for support and mounting of both whole animal and fragile heat-treated tissue sections for MALDI MS imaging and quantitation”，JOURNAL OF PROTEOMICS，2012年07月14日，Volume 75，Pages 4912-4920，< DOI:10.1016/j.jprot.2012.07.006 >

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／６２ － Ｇ０１Ｎ ２７／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭｅｄＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イメージング質量分析に好適な試料作製法において、－２０度以下で凍結切片を粘着支持して試料の形態を保つことができる強い粘着力を有する粘着剤に直径１００ｎｍ以下のカーボン微粒子あるいは金属製微粒子を混和した導電性粘着剤をアルミニウムや銅などの金属を蒸着した厚さ３０μｍ以下のプラスチックフィルム上に塗布して導電性粘着フィルムを作製し、導電性粘着フィルムの粘着面の両端に金属箔あるいはプラスチックフィルムを付着して非粘着領域を設けて導電性粘着フィルムを掴むことができるようにした導電性粘着フィルムを用いて凍結試料からイメージング質量分析用切片を作製する事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イメージング質量分析装置による生
物組織中に含まれる特定質量の物質の分布を精度良く観察するのに適した分析用試料を作製するためのイメージング質量分析に好適な試料作製法及びその過程で使用する導電性粘着フィルムに関するものである。

【背景技術】

【0002】

生命科学の分野では、生物組織中に含まれる生体成分の質量を測定するとともに、特定質量の組織内分布を明らかにし、画像化する事が求められている。その目的のために生物試料を凍結薄切し、その薄切試料にレーザー照射、あるいはイオンビーム照射して試料中の分子をイオン化させ、そのイオン化した分子をイメージング質量分析装置で連続的に測定することにより特定質量の物質の分布を画像化している。

【0003】

イメージング質量分析用試料作製では、装置の検出感度を高めるためにレーザー照射等で分析試料をイオン化した際に測定に利用されずに試料表面に残ったイオンを除去する事が必要で、分析試料は図１に示す導電処理した光学顕微鏡用スライドガラス上に凍結ミクロトームで作製した生物試料の凍結切片を載せ、次いで凍結切片を解凍することにより切片を導電処理したスライドガラス上に密着固着してイメージング質量分析装置により分析している。従来の方法では、凍結切片は切片支持材を用いないで作製されるために薄切中に組織が壊れ、組織形態が保たれた凍結切片を作製する事が極めて困難であった。また、凍結切片をスライドガラスに固着するために凍結切片をスライドガラス上に密着して解凍を行っており、この解凍過程で生体内成分が酵素等により分解して分子が小さくなる問題がある。また解凍処理により生体内成分が特定部位から拡散する問題もあった。さらに骨や植物試料等から作製した凍結切片は導電処理したスライドガラス上に貼りつかないためにイメージング質量分析用切片を導電処理したスライドガラス上に作製する事ができない問題もあった。

【0004】

凍結試料の薄切中に起こる切片の損壊はプラスチック製粘着テープを凍結切片の支持材として用いる事により解決し、粘着テープに貼りついた状態の切片をイメーシング質量分析装置で分析する事が試みられている。しかしプラスチック製粘着テープは導電性を有していないため分析試料とイメージング質量分析装置間に導電性を確保できず、試料の分析部位が帯電してイメージング質量分析装置の検出感度が低化して精度良く質量分析を行えない問題があった。導電性の問題を解決するために薄い金属箔に粘着剤を塗布した導電性粘着支持材を用いた凍結切片作製が試みられているが、金属箔は柔軟性に乏しいために凍結切片を確実に粘着支持することができず形状の保たれた凍結切片を作製できない問題があった。

【0005】

これらの理由により、組織形態を保ち、しかも生体内成分の組織内分布を保持した切片試料を作製し、しかも試料とイメージング質量分析装置間に導電性を確保した状態で感度良く特定質量の物質の分布をイメージング質量分析装置で観察するのに適した試料作製法はなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００２－０３１５８６号

【文献】特開２００７－０５１９５７号

【文献】特開２００７－１２１１３５号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記に述べているように、従来の方法では生体内成分と分布が保たれ、しかも組織形態が保たれた切片試料を導電性支持体上に作製する事ができなかったために、イメージング質量分析装置を用いて組織中に分布している特定質量の物質を感度よく検出し、しかも正確に組織に関連させて画像化する事ができなかった。

【0008】

本発明は、この問題を解決するためにイメージング質量分析装置と分析用試料間に導電性を確保する事ができる導電性粘着フィルムを作製し、その導電性粘着フィルムを用いて組織内成分と組織形態を保った凍結切片を作製し、切片が貼り付いた導電性粘着フィルムをスライドガラスに両面テープ等で固定し、そのスライドガラスをイメージング質量分析装置試料台に装着して導電性を確保した状態で分析することにより感度良く、しかも分析データを正確に組織に関連させたイメージング質量分析を可能にするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記の課題を解決するために、第一発明では生物組織の形態と生体内成分が保たれた試料片を作製するために、まず生物試料を凍結し、その試料を凍結ミクロトームの試料台に固定し、切削面に導電性粘着フィルムを密着して切削を行って作製した導電性粘着フィルム上の凍結切片を用いてイメージング質量分析装置で分析する事により感度良く生体内成分の分布を観察できるイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供する。

【0010】

第二発明では、第一発明で導電性粘着フィルム上に作製した切片中の生体成分の分解や拡散を防ぐために導電性粘着フィルムに貼り付いた状態の凍結切片を凍結ミクロトーム内で凍結乾燥する。

【0011】

次いで、凍結乾燥後に切片を凍結ミクロトームから取り出し、スライドガラス上に導電性粘着フィルムの試料面を上に向け、両面テープで導電性粘着フィルムの基材側をスライドガラスに固定し、その試料をイメージング質量分析装置で分析する事により感度良く生体内成分の分布を観察できるイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供する。

【0012】

第三発明では、第一発明および第二発明で使用する形態を保持した凍結切片を作製するのに適した導電性粘着フィルムを凍結薄切を実施する低温下でも強い粘着力を有する粘着剤に導電性微粒子を混和した導電性粘着剤を薄いプラスチックフィルム上に塗布して作製した導電性粘着フィルムを用いて凍結切片を作製し、凍結乾燥後にイメージング質量分析装置で特定質量の物質の分析を行う事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供する。

【0013】

第四発明では、第一発明および第二発明で使用する形態を保持した凍結切片を作製するのに適した導電性粘着フィルムを凍結薄切を実施する低温下でも強い粘着力を有する粘着剤に導電性微粒子を混和した導電性粘着剤を金属蒸着した薄いプラスチックフィルム上に塗布することにより作製した導電性の優れた導電性粘着フィルムを用いて凍結切片を作製し、凍結乾燥後にイメージング質量分析装置で特定質量の物質の分析を行う事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供する。

【0014】

第五発明では、第三発明および第四発明で作製した導電性粘着フィルムを凍結試料の切削面に効率良く正確に貼付できるようにするために第三発明および第四発明で作製した導電性粘着フィルムの両端に金属箔あるいはプラスチックフィルムを付着して非粘着域を設け、凍結試料の切削面に効率良く導電性粘着フィルムを正確に貼付することができるようにした導電性粘着フィルムを用いてイメージング質量分析用試料を作製する事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法

【発明の効果】

【0015】

本発明は次のような効果を奏する。
第一発明によれば、導電性粘着フィルムを用いる事により、導電性支持体上に生物試料の形態が保たれたイメージング質量分析用切片試料を容易に作製でき、しかも分析用試料とイメージング質量分析装置間に導電性保つことができることから、従来の方法で作製した分析用試料よりも特定質量の物質の組織内分布状態を組織形態に正確に関連させて、しかも感度良く分析する事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供することができる。

【0016】

第二発明によれば、導電性粘着フィルムを用いる事により、導電性支持体上に作製された形態が保たれた凍結切片を凍結乾燥することにより生体成分の分解と特定部位からの拡散がない状態のイメージング質量分析用切片試料を容易に作製でき、しかも分析用試料とイメージング質量分析装置間に導電性保つことができることから、従来の方法で作製した分析用試料よりも特定質量の物質の組織内分布を組織形態に関連させて正確に、しかも感度良く分析する事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供することができる。

【0017】

第三発明では、第一発明および第二発明で使用する形態を保持した凍結切片を作製するのに適した導電性粘着フィルムを凍結薄切を実施する低温下でも凍結試料を確実に粘着支持できる強い粘着力を有する粘着剤に導電性微粒子を混和した導電性粘着剤を薄いプラスチックフィルム上に塗布して作製した導電性粘着フィルムを用いて凍結切片を作製するので、生物組織の形態が保たれた凍結切片を容易に作製できる事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供することができる。

【0018】

第四発明では、第一発明あるいは第二発明で使用する形態を保持した凍結切片作製に適した導電性粘着フィルムを凍結薄切を実施する低温下でも強い粘着力を有する粘着剤に導電性微粒子を混和した導電性粘着剤を金属蒸着した薄いプラスチックフィルム上に塗布して作製した導電性の優れた導電性粘着フィルムを用いて凍結切片を作製するので分析試料とイメージング質量分析装置間の導電性が改善されて感度良く生体成分を分析する事を可能にする事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供することができる。

【0019】

第五発明では、第三発明あるいは第四発明で使用する導電性粘着フィルムの粘着面の両端に金属箔あるいはプラスチックフィルムを付着して非粘着領域を設けて導電性粘着フィルムを掴むことができるようにしているために凍結試料の切削面に導電性粘着フィルムを正確に効率良く貼付することができ、しかも金属箔を使用している事から導電性粘着フィルムと分析用試料間の導電性が良くなり、感度の良い分析用試料を作製できる事を特徴とするイメージング質量分析に好適な試料作製法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】従来の方法で導電性スライドガラス上に作製された切片をイメージング質量分析装置で分析を行っている状態を示す断面模式図である。

【図2】第三発明の実施による導電性粘着フィルムを使って作製された試料をイメージング質量分析装置で分析を行っている状態を示す断面模式図である。

【図3】第四発明の実施による導電性粘着フィルムを使って作製された試料をイメージング質量分析装置で分析を行っている状態を示す断面模式図である。

【図4】第五発明の実施による導電性粘着フィルムを使って作製された試料をイメージング質量分析装置で分析を行っている状態を示す断面模式図である。

【図5】図４のＩ－Ｉ線の断面模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、添付図面を参照して、本発明の一実施の形態について説明する。

【0022】

第一発明では、形態と組織成分が保たれた分析用試料片を導電性が確保された状態で作製するために、まず生物試料中の生体成分の分解と拡散を防ぐために凍結し、ついで導電性粘着フィルムを凍結試料の切削面に貼付し、切削して凍結試料片を作製する。

【0023】

第二発明では、第一発明で導電性粘着フィルム上に作製した凍結切片をクリオスタットから取り出す際の解凍による組織中成分の酵素による分解を防ぐこと、解凍による物質の拡散を防ぐためにクリオスタット内で凍結切片を凍結乾燥する。

【0024】

上記第一発明と第二発明の凍結切片作製で使用する凍結切片支持のための導電性粘着フィルムには、以下に記載している第三発明、第四発明および第五発明の導電性粘着フィルムを使用する。

【0025】

第三発明の導電性粘着フィルムはプラスチックフィルム上の片面に導電性粘着剤を塗布して作製し、図２に示す構成となっている。

【0026】

第四発明の導電性粘着フィルムでは導電性粘着フィルムの導電性を高めることによりイメージング質量分析の感度を高くするために、第三発明の導電性粘着フィルムの基材として使用したプラスチックフィルムに代わってプラスチックフィルムの片面の全面にアルミニウムや銅などの金属を蒸着したプラスチックフィルムを用い、金属蒸着した上に導電性粘着剤を塗布して作製し、図３の構成となっている。

【0027】

第五発明の導電性粘着フィルムでは、図４および図５に示すように第三発明および第四発明の導電性粘着フィルムを用いて凍結切片を作製する際に導電性粘着フィルムを掴む領域として導電性粘着フィルムの両端に非粘着域を設け、凍結試料の切削面に導電性粘着フィルムを正確に容易に貼付する事ができるようにしている。非粘着域作製に使用する材料として導電性粘着フィルムとイメージング質量分析装置の導電性を確保するために銅やアルミニウム等の金属箔を使用する。

【0028】

第三発明、第四発明および第五発明で使用するプラスチックフィルムとして、凍結切片を作製する－２０℃以下の低温下でも柔軟性を保った材料が適し、具体的には、厚さ３０μｍよりも２０μｍ、２０μｍよりも１５μｍ、さらに１５μｍよりも１２μｍ以下が好適である。

【0029】

第三発明、第四発明および第五発明で使用する粘着剤としては、凍結切片を作製する－２０℃以下の温度でも凍結切片を確実に粘着できるものを使用する。試料により－３０℃以下の温度での凍結薄切が必要な場合があり、そのような試料薄切には－３０℃以下で凍結切片を粘着支持できる粘着剤を使用する。

【0030】

第三発明、第四発明および第五発明で粘着剤に混和する導電性微粒子としてカーボン微粒子と金属性微粒子を使用する事ができる。導電性微粒子は小さいほど導電性粘着フィルムの粘着面が平滑になって薄切面と粘着面の接触面積が増加して粘着力が強くなり、良好な凍結切片を作製できる。また分析試料と導電性粘着フィルムとの導電性もよくなって検出感度が良くなることから出来るだけ微粒子が適している。例えば、直径１００ｎｍ以下の微粒子を使用すると平面性の良い粘着面を作製でき、更に直径５０ｎｍ以下の微粒子を使用するとより平滑な平面となり好適である。

【0031】

上記の方法と導電性粘着フィルムで作製した凍結切片は、凍結切片作製後直ちに、あるいは凍結乾燥後クリオスタットから取り出し、図２、図３、図４および図５に示す配置となるように切片が貼り付いた導電性粘着フィルムを両面テープでスライドガラス上に固定する。

【0032】

切片中の物質がレーザー光のエネルギーを吸収して生体内物質が蒸発しやすくするためにα－Ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉ、ｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシ－３－メトキシケイ皮酸等のマトリクスを切片上に塗布する。

【0033】

次いで、イメージング質量分析装置の試料台に装着して分析を実施する。

【0034】

次に具体的な実施例について説明する。

【0035】

まず、分析用試料を凍結包埋し、凍結ミクロトームに装着して分析対象部位が現れるまで切削する。

【0036】

次に、－３０℃の凍結切片を確実に粘着支持できる低温度でも使用できる粘着剤に直径５０ｎｍ以下のカーボン微粒子を加えて作製した導電性粘着剤を厚さ２０μｍ以下の厚みのプラスチックフィルムに塗布して作製した第三、第四あるいは第五発明の導電性粘着フィルムを凍結ブロックの切削面に密着し、切削を行って凍結切片を作製する。

【0037】

次いで、凍結切片をクリオスタット内に放置し、完全に凍結乾燥してからクリオスタットから取り出す。解凍切片を使用する場合は、凍結薄切後直ちにクリオスタットから取り出して解凍する。

【0038】

クリオスタットから取り出した粘着フィルムに貼り付いた切片をスライドガラス上に両面テープで固定する（図２、図３、図５）。この固定作業では切片面を上に向け、粘着フィルムの基材側を両面テープでスライドガラスに固定する。

【0039】

次いで、切片上にマトリクス（例えば、α－Ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ等）をコートする。

【0040】

次いで、切片をイメージング質量分析装置に装着し分析する。

【0041】

上記の手順により、組織形態と生体内物質の組織内分布が保たれ、しかも高い感度で検出する事ができるイメージング質量分析用試料片を容易に、しかも確実に作製できる。

【符号の説明】

【0042】

１…スライドガラス、２…導電膜、３…分析試料、４…レーザー光、５…イメージング質量分析装置と試料片との導電性を確保するための電極、６…分析中に試料中に生じた不要なイオンが流れる方向を示す矢印、７…導電性粘着剤、８…粘着プラスチックフィルムの基材であるプラスチックフィルム、９…両面テープ、１０…金属蒸着膜、１１…金属箔

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】