特許 7117068 生体変換熊胆粉の抗炎症薬の調製における応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-03

(45)【発行日】2022-08-12

(54)【発明の名称】生体変換熊胆粉の抗炎症薬の調製における応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/413 20150101AFI20220804BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220804BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220804BHJP

【ＦＩ】

A61K35/413

A61P29/00

A61P11/00

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2020121911

(22)【出願日】2020-07-16

(65)【公開番号】P2021017443

(43)【公開日】2021-02-15

【審査請求日】2020-07-16

(31)【優先権主張番号】201910646710.4

(32)【優先日】2019-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】520264069

【氏名又は名称】シャンハイ カイバオ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＫＡＩＢＡＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100137095

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 武史

(74)【代理人】

【識別番号】100091627

【弁理士】

【氏名又は名称】朝比 一夫

(72)【発明者】

【氏名】グオ， キンピン

(72)【発明者】

【氏名】ム， ジンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ディシン

(72)【発明者】

【氏名】リ， ルイペン

(72)【発明者】

【氏名】ザン， シャオリ

【審査官】柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】中国特許第１０４３８２９４１（ＣＮ，Ｂ）

【文献】中国特許出願公開第１０９０１０３７３（ＣＮ，Ａ）

【文献】Korean J. Oriental Physiology & Pathology, (2005), 19, [1], p.204-211

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／４１３

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＰＳにより誘発された肺炎症を治療するための薬物の調製における生体変換熊胆粉の使用であって、
前記生体変換熊胆粉は、次のステップを含む方法によって鶏胆粉から調製され、
前記方法は、
ステップ１：鶏胆粉の調製：屠殺場から購入した鶏胆の数量と重量を確定し、全質量に対する７５質量％のアルコールを使って、鶏胆を局部的に消毒してから、鶏胆を切り開き、胆汁をとり、前記胆汁の凍結乾燥を４８時間行い、鶏胆粉を得、得られた鶏胆粉を乾燥器具に入れるステップ１と、
ステップ２：鶏胆粉の処理：ｐH＝７．０～９．０の緩衝液で鶏胆粉を溶かして、１L溶液を調合して、超音波で十分に溶解して、鶏胆粉溶液１１０００ｇの条件の下で、遠心分離を１０分行い、その後何度も濾過して、上澄みを家禽胆粉処理液として４℃の条件で保存しておき、沈殿物の凍結乾燥を行って保存するステップ２と、
ステップ３：固定化酵素の調製：質量分率が１質量％のキトサン（水溶性）溶液の中に酢酸を適量加え、３０分磁気撹拌することにより、キトサン酢酸溶液を調製し、上記のキトサン酢酸溶液を高圧注射ポンプで質量分率が３質量％の１００ｍL三燐酸ナトリウムに注入し、１～２時間固化することにより、粒度が均一で、形状が規則的な白いキトサンボールを得、前記溶液を濾過して、脱イオン水で何度も水洗して、質量分率が０．１２５質量％のグルタルアルデヒド水溶液の入ったビーカーに前記キトサンボールを入れ、３７℃で１７０ｇでシェーカーにて２～４時間振動して活性して、活性化キトサンビーズを得て、前記活性化キトサンビーズ１０ｇを計量し、小型のクロマトグラフィックカラムに入れ、適量の７α－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（７α－ＨＳＤＨ）と７β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（７β－ＨＳＤＨ）を加えて、垂直混合法にて４～６時間混合して、酵素カラムに固定してから、酵素液を排出し、ＰＢＳ緩衝液で、固定された酵素カラムを３～５回を洗い流し固定化酵素カラムとし、前記７α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素（７α－ＨＳＤＨ）と７β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（７β－ＨＳＤＨ）の固定率は、９０％より大きいステップ３と、
上記の７α－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（７α－ＨＳＤＨ）と７β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（７β－ＨＳＤＨ）は、クロストリジウム・サルディニエンス（Clostridium sardiniense，ＤＳＭ５９９／ＡＴＣＣ２７５５５）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis ＡＴＣＣ２５８２５）またはコリンセラ アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens ＡＴＣＣ２５９８６）の微生物から誘導され、
ステップ４：生体触媒変換：上記の固定化酵素カラムに、調製された家禽胆粉処理溶液を反応基質溶液として加え、補酵素Ｉまたは補酵素ＩＩを入れ、補酵素Ｉ（または補酵素ＩＩ）：ＴＤＣＣＡ＝１：２～１：４（モル比）で、２０～３０℃で、２～６時間反応させるステップ４と、
ステップ５：反応液の処理：上記ステップ４の反応が終わった後の反応液を４８時間凍結乾燥し、固体の反応生成物を得、最後に、ステップ２で得た沈殿物を上述の固体反応生成物と混合することにより、生体変換熊胆粉を得るステップ５と、を含み、
上記の緩衝液は、リン酸緩衝液（PBS）、Tris－HCl緩衝液（tris(hydroxymethyl)aminomethane）またはグリシン－水酸化ナトリウムの緩衝液（Gly-NaOH）のうちの一つであることを特徴とする生体変換熊胆粉の使用。

【請求項2】

上記薬物は、上記の生体変換熊胆粉と、薬学的に許容される賦形剤とを含む請求項１に記載のＬＰＳにより誘発された肺炎症を治療するための薬物の調製における生体変換熊胆粉の使用。

【請求項3】

上記薬物の剤形は、経口投与用の剤形または非経口投与用の剤形である請求項１または２に記載のＬＰＳにより誘発された肺炎症を治療するための薬物の調製における生体変換熊胆粉の使用。

【請求項4】

上記の経口投与用の剤形は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、乳濁液、シロップ、またはスプレーである請求項３に記載のＬＰＳにより誘発された肺炎症を治療するための薬物の調製における生体変換熊胆粉の使用。

【請求項5】

上記の非経口投与剤形は、注射剤または外用剤である請求項３に記載のＬＰＳにより誘発された肺炎症を治療するための薬物の調製における生体変換熊胆粉の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は製薬分野に関し、特に生体変換熊胆粉の抗炎症薬の調製における応用に関する。

【背景技術】

【0002】

熊胆は、黒熊やヒグマなどクマ科動物由来の胆汁を乾燥することにより得られ、解熱や、肝臓を温め、目を補う効用がある。主な成分は、タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）である。熊胆は貴重な動物生薬であり、2000年余り漢方薬として使用される歴史があり、大量な処方には熊胆という成分が含まれている。中国では、毎年熊胆粉の生産量は約３０トンあるが、依然として人類の健康な需要を満たす事ができない。現在では、ハイエンドの熊胆粉の需給の矛盾が際立ち、ローエンドの原料として使われる熊胆粉の需要が増加し続けたため、熊胆粉の価格が日増しに上昇しており、市場価格がすでに５，０００元／kgを超えている。更に厳しい状況は、国内外の動物保護団体が生きてるクマから胆嚢を取り出すことに長期的な抵抗を示し、特に、最近再び国内外から高い注目を集めた「帰真堂」事件が中国国内の熊胆粉の製造と其の関連産業の発展に未曾有な抵抗をもたらした。其のため、人工熊胆の研究開発を加速することは、熊胆産業の持続可能な発展を促進する鍵である。

【0003】

特許出願番号が201410588581.5（特許番号CN104382941B）で、発明の名称が「人工的な熊胆粉及び其の調製方法」の中国特許において、その他の化学成分を入れないという前提に、家禽の胆汁を、生体外で生体触媒を用いた反応を行う事により、一定のプロセスを通じて人工的な熊胆に変換することができる人工的な熊胆粉及びその調製方法を提供した。しかしながら、この人工熊胆粉は薬の調製における応用に未だに研究されてない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、既存の技術問題を解決するために、生体変換熊胆粉の抗炎症薬の調製における応用を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上述の目的を実現するため、本発明は以下の技術方案を採用する。

【0006】

特許番号CN104382941Bの特許により、生体変換熊胆粉が次ような方法で調製されているのが分かった。

【0007】

a）家禽の胆粉をｐH＝７～９の緩衝液で溶かした後、１１０００ｇの条件の下で遠心分離を１０分行った。その後何度も濾過して、沈殿物とその上澄みを得て、沈殿物を取って凍結乾燥を行って保存する。上記の家禽の胆粉として鶏胆粉、アヒル胆粉、ガチョウ胆粉、牛胆粉、兎胆粉、犬胆粉、羊胆粉のうちの一つまたは２種類以上混合して使用することができる。その主な成分と重量比は、総コール酸は４０～６５質量％で、アミノ酸は４～９質量％で、微量元素は０．５～１質量％である。その中で、上記の総コール酸にはTCDCAが含まれ、其のTCDCAが家禽の胆粉の総重量を基準に４０～５０質量％の比で占める。

【0008】

ｂ）上記の上澄みを７α－ヒドロキシステロイド脱水素酵素、７β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素及び補酵素Iまたは補酵素IIを入れた反応容器に入れて反応させた。上記の７α－ヒドロキシステロイド脱水素酵素、７β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素は、反応容器に固定化で存在する。

【0009】

ｃ）上記の反応が完了した反応液を、凍結乾燥を４８時間行った後、上記の沈殿物と混合することにより、生体変換熊胆粉を得た。

【0010】

本発明の第一方面は、生体変換熊胆粉の抗炎症薬の調製における応用を提供する。

【0011】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗炎症薬は、上記の生体変換熊胆粉と薬学的に受け入れ（許容）可能な賦形剤を含む。

【0012】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗炎症薬の剤形は、経口投与用の剤形または非経口投与用の剤形である。

【0013】

他の一つの好ましい実施例において、上記の経口投与用の剤形は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、乳濁液、シロップ、またはスプレーである。

【0014】

他の一つの好ましい実施例において、非経口投与剤形は、注射剤または外用剤である。

【0015】

他の一つの好ましい実施例において、外用剤は、点眼剤である。

【0016】

他の一つの好ましい実施例において、上記の生体変換熊胆粉は、家禽の胆汁を原料とし、生物発酵を通して調製された人工熊胆粉である。

【0017】

他の一つの好ましい実施例において、上記の家禽の胆汁は、鶏胆粉、アヒル胆粉、ガチョウ胆粉、牛胆粉、兎胆粉、犬胆粉、羊胆粉のうちの一つまたは２種類以上の混合物から抽出されたものであり、より好ましくのは鶏胆粉である。

【0018】

本発明の第二方面は、生体変換熊胆粉の抗肺炎薬の調製における応用を提供する。

【0019】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗肺炎薬は、上記の生体変換熊胆粉と薬学的に受け入れ（許容）可能な賦形剤を含む。

【0020】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗肺炎薬の剤形は、経口投与用の剤形または非経口投与用の剤形である。

【0021】

他の一つの好ましい実施例において、上記の経口投与用の剤形は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、乳濁液、シロップ、またはスプレーである。

【0022】

他の一つの好ましい実施例において、非経口投与剤形は、注射剤または外用剤である。

【0023】

他の一つの好ましい実施例において、外用剤は、点眼剤である。

【0024】

他の一つの好ましい実施例において、上記の生体変換熊胆粉は、家禽の胆汁を原料とし、生物発酵を通して調製された人工熊胆粉である。

【0025】

他の一つの好ましい実施例において、上記の家禽の胆汁は、鶏胆粉、アヒル胆粉、ガチョウ胆粉、牛胆粉、兎胆粉、犬胆粉、羊胆粉のうちの一つまたは２種類以上の混合物から抽出されたものであり、より好ましくは鶏胆粉である。

【発明の効果】

【0026】

本発明は、上記の技術方案を採用し、既存技術と比べて、以下の効果がある。

【0027】

本発明は、本発明による生体変換熊胆粉と天然の熊胆粉に対して、抗炎症薬の活性を比べた。生体変換熊胆粉がラットの炎症モデルに対する影響と、生体変換熊胆粉がLPSに誘発された肺炎症のネズミに対する影響など、動物実験や研究を通じて、生体変換熊胆粉の抗炎症効果が天然の熊胆粉より低くないことが分かり、生体変換熊胆粉が抗炎症薬の調製における幅広い見通しが明らかになった。

【0028】

理解すべきなのは、本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術特徴と、以下の（実施例のように）具体的に説明する各技術特徴との間の組み合わせが可能であり、新しい技術的または好ましい技術方案を構成することができる。紙幅の都合上、ここでは論じないことにする。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図1は、実施例1における生体変換熊胆粉がカラギーナンにより誘発されたラットの炎症モデルの足底腫脹に対する影響結果を示す図である。

【図2】図２は、実施例1における天然の熊胆粉がカラギーナンにより誘発されたラットの炎症モデルの足底腫脹に対する影響結果を示す図である。

【図3】図３は、実施例２におけるLPSにより誘発されたネズミの肺部炎症血清中の炎症因子IL-6に対し、熊胆粉を７日間継続的に投与した影響を示す図である。

【図4】図４は、実施例２におけるLPSにより誘発されたネズミ肺部炎症の肺胞灌流液中の炎症因子IL-6に対し、熊胆粉を７日間継続的に投与した影響を示す図である。

【図5】図５は、実施例2における熊胆粉を7日まで毎日投与することにより、LPSにより誘発されたネズミの肺部炎症の血清中の炎症因子TNF-αに対する影響を示す図である。

【図6】図６は、実施例2における熊胆粉を7日まで毎日投与することにより、LPSにより誘発されたネズミ肺部炎症の肺胞洗浄液中の炎症因子TNF-αに対する影響を示す図である。

【図7】図７は、実施例２における肺組織HE染色の２０倍対物レンズ下での顕微鏡画像である。Ａは対照群、Ｂはモデル群、Ｉは天然の熊胆粉１０００ｍｇ／ｋｇ群、及びＪは生体変換熊胆粉１０００ｍｇ／ｋｇ群である。

【図8】図８は、実施例2における肺組織損傷評価の統計図である。Aは対照群、Bはモデル群、Iは天然の熊胆粉１０００ｍｇ/ｋｇ群、Jは生体変換熊胆粉１０００ｍｇ／ｋｇ群である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

鶏胆粉を使用して、微生物変換により熊胆粉を調製する。具体的なステップが以下である。

【0031】

ステップ１：鶏胆粉の調製：屠殺場から購入した鶏胆の数量と重量を確定し、全質量に対する７５質量％のアルコールを使って、鶏胆を局部的に消毒してから、鶏胆を切り開き、胆汁をとり、凍結乾燥４８時間を行い、鶏胆粉が得られる。それを乾燥器具に入れて保存しておく。

【0032】

ステップ２：鶏胆粉の処理：ｐH＝７．０～９．０の緩衝液で鶏胆粉を溶かして、１L溶液を調合して、超音波で十分に溶解して、鶏胆粉溶液１１０００ｇの条件の下で、遠心分離を１０分行い、その後何度も濾過して、上澄みを家禽胆粉処理液として４℃の条件で保存しておき、沈殿物の凍結乾燥を行って保存しておく。

【0033】

その中で、上記の緩衝液は、リン酸緩衝液（PBS）、Tris－HCl緩衝液（tris(hydroxymethyl)aminomethane）またはグリシン－水酸化ナトリウムの緩衝液（Gly-NaOH）のうちの一つである。

【0034】

ステップ３：固定化酵素の調製：質量分率が１質量％のキトサン（水溶生）溶液の中に酢酸を適量加え、３０分磁気撹拌することにより、キトサン酢酸溶液を調製する。上記の溶液を高圧注射ポンプで質量分率が３質量％の１００ｍL三燐酸ナトリウムに注入し、１～２時間固化することにより、粒度が均一で、形状が規則的な白いキトサンボールを得た。それを濾過して、脱イオン水で何度も水洗して、質量分率が０．１２５質量％のグルタルアルデヒドの入ったビーカーに入れ、３７℃で１７０ｇでシェーカーにて２～４ｈ振動して活性して、活性化キトサンビーズを得る。

【0035】

上記の活性化キトサンビーズ１０ｇを計量し、小型のクロマトグラフィックカラムに入れ、適量の7α－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7α－HSDH）と7β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7β－HSDH）を加えて、垂直混合法にて４～６ｈ結合して、固定してから、酵素液を排出し、PBS緩衝液で固定された酵素柱3～5回を洗い流した。7α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7α－HSDH）と7β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7β－HSDH）の固定率は、９０％より大きい。

【0036】

其の中で、上記の7α－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7α－HSDH）と7β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素（7β－HSDH）は、クロストリジウム・サルディニエンス（Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis ATCC25825）またはコリンセラ アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens ATCC25986）などの微生物から選ばれている。

【0037】

ステップ４：生体触媒変換：上記の固定化酵素カラムに、調製された家禽胆粉処理溶液を反応基質溶液として加え、補酵素Iまたは補酵素IIを入れ、補酵素I（または補酵素II）：TDCCA=1：2～1：4（モル比）で、20～30℃で、2～6時間反応させる。

【0038】

ステップ５：反応液の処理：上記ステップ４の反応が終わった後の反応液を48h凍結乾燥し、固体の反応生成物を得た。最後に、ステップ２で得た沈殿物を上述の固体反応生成物と混合することにより、生体変換熊胆粉を得ることができる。

【0039】

上記の生体変換熊胆粉は、抗炎症薬の調製に応用されうる。

【0040】

他の一つの好ましい実施例において、抗炎症薬が上記の生体変換熊胆粉と薬学的に許容される賦形剤を含む。

【0041】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗炎症薬の剤形が、経口投与用の剤形または非経口投与用の剤形である。

【0042】

他の一つの好ましい実施例において、上記の経口投与用の剤形が、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、乳濁液、シロップ、またはスプレーである。

【0043】

他の一つの好ましい実施例において、非経口投与剤形が注射剤または外用剤である。

【0044】

他の一つの好ましい実施例において、外用剤が点眼剤である。

【0045】

他の一つの好ましい実施例において、上記の生体変換熊胆粉が、家禽の胆汁を原料とし、生物発酵を通して調製された人工熊胆粉である。

【0046】

他の一つの好ましい実施例において、上記の家禽の胆汁が鶏胆粉、アヒル胆粉、ガチョウ胆粉、牛胆粉、兎胆粉、犬胆粉、羊胆粉のうちの一つまたは２種類以上の混合物から抽出されたものであり、より好ましくは鶏胆粉である。

【0047】

上記の生体変換熊胆粉が、抗肺炎薬の調製に応用されうる。

【0048】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗肺炎薬が上記の生体変換熊胆粉と薬学的に受け入れ可能な賦形剤を含む。

【0049】

他の一つの好ましい実施例において、上記の抗肺炎薬の剤形が、経口投与用の剤形または非経口投与用の剤形である。

【0050】

他の一つの好ましい実施例において、上記の経口投与用の剤形が、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、乳濁液、シロップ、またはスプレーである。

【0051】

他の一つの好ましい実施例において、非経口投与剤形が注射剤または外用剤である。

【0052】

他の一つの好ましい実施例において、外用剤が点眼剤である。

【0053】

他の一つの好ましい実施例において、上記の生体変換熊胆粉は、家禽の胆汁を原料とし、生物発酵を通して調製された人工熊胆粉である。

【0054】

他の一つの好ましい実施例において、上記の家禽の胆汁が鶏胆粉、アヒル胆粉、ガチョウ胆粉、牛胆粉、兎胆粉、犬胆粉、羊胆粉のうちの一つまたは２種類以上の混合物から抽出されたものであり、より好ましくは鶏胆粉である。

【0055】

以下、本発明をよりよく理解するために、具体的な実施例によって詳細かつ具体的に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例1】

【0056】

生体変換熊胆粉と天然の熊胆粉とを使用して、カラギーナンにより誘発されたラットの炎症モデルに対する研究を行った。その実験は、以下である。

【0057】

動物種：生後６週齢の雄SDラットを用いた。取得時の体重が１３２～１９９ｇ範囲内で、投与時の体重が１５２～２２５ｇで、湖南Slake Jingda実験動物有限会社由来で、Specific-Pathogen-Free(SPF)等級である。実験動物生産許可証番号がSCXK（湖）２０１６-０００２（有効期限が２０２１年９月２９日）で、湖南省科学技術庁より発行され、実験動物質量合格証明番号が４３００４７０００６０７７９である。

【0058】

動物の組分け方法：検疫した後、検疫観察に合格したラットを体重によってランダムに9組に分けた。それぞれは、陰性対照群（１０匹／群）、モデル群（１０匹／群）、生体変換熊胆粉の低用量群、中間用量群、高用量群（１０匹／毎群）、天然の熊胆粉の低用量群、中間用量群、高用量群（１０匹／毎群）、陽性対照群（１０匹／群）である。

【0059】

陰性対照材料と溶媒：陰性対照材料は、質量分率が０．５質量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液（CMC-Na）（分析試薬）である。規格が５００ｇ／瓶、ロット番号が２０１５０８０６で、メーカーが天津市大茂化学試薬工場で、配合時に特別な温度、湿度制限がない。CMC-Naを計量し、超純水で溶解し、濃度が質量分率で０．５質量％のCMC-Na溶液になるように配合された。それは常温に保存され、湿度制限がなくて、保存期間が７日である。溶媒：被験物質を配合する溶媒、及び陽性対照材料の溶媒は、ともに０．５質量％のカルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液（CMC-Na）（分析試薬）である。

【0060】

実験の投与量と組分け方法：共に９組に分けられた。それぞれは、陰性対照群（ブランクコントロール群）モデル群、生体変換熊胆粉の低用量群、中間用量群、高用量群、天然の熊胆粉の低用量群、中間用量群、高用量群、陽性対照群（インドメタシン群）であり、毎群１０匹の雄動物である。具体的には、表１を参照されたい。
表１

【0061】

表１において、毎群に１０ｍL／ｋｇで投与し、陰性対照群、モデル群に質量分率が０．５質量％のCMC-Na溶液を投与する。

【0062】

実験中、被験物質と対照材料とが共に経口投与され、投与容積が１０ｍL／ｋｇである。検疫終了後、動物が組分けられた後、毎群に一回投与した。

【0063】

実験方法：検疫に合格したSDラットを選択し、ランダムに９組に分けた。それぞれは、陰性対照群、モデル群、生体変換熊胆粉の低用量群、中間用量群、高用量群、天然の熊胆粉の低用量群、中間用量群、高用量群、陽性対照インドメタシン群である。毎群１０匹で、全部雄である。モデル群を作る前に、各動物の右後足の飛節に線を描いて、足底容積計測器具で右後足の容積を計量した。二回連続測定し、その平均値をベース容積とする。ブランクコントロール群を除いて、他の各群動物の右後足底腱膜の下に、質量分率が１質量％のカラギーナン懸濁液を注射した。一匹ごとに０．１ｍL投与した。ブランクコントロール群には、同じ容積の生理食塩水を注射した。カラギーナンを注射した後、すぐ相応的に薬物を経口投与し、注射後の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間と６時間後に各群動物の右後足の足底容積を測定した。二回連続測定し、その平均値をモデル群を作った後の足底容積とし、炎症誘発後の異なる時点での足底容積に基づいて、足底腫脹度と腫脹抑制率を算出した。

【0064】

腫脹抑制率（％）＝（モデル群の平均腫脹度－薬物投与群の平均腫脹度）／モデル群の平均腫脹度＊１００％。

【0065】

実験統計分析方法：すべてのデータは、統計分析のためにEXCELに入力された。各群で、足底の腫脹度に対して平均値±標準偏差を計算した。SPSSソフトウェアにより各群間のデータの正規性の検定を行い、一元配置分散分析を使って各群間の差を比較した。比較前に、データに均一性検定を行った。各群間の分散が均一である場合、LSD、Nonferroni及びSNK検定を使用して統計分析を行い、各群間の分散が均一でない場合、Dunnett's T3検定、Dunnett's C検定を使用して統計分析を行った。実験結果が表２－３、及び図１－２に示される。

【0066】

表２において、陰性対照群と比べ、#がp<0 .05を表し、モデル群と比べ、*がp<＝0 .05を表す。

【0067】

表２

表３

【0068】

上記の実験結果から、陰性対照群と比べて、モデル群の足底腫脹抑制度が明らかに増加していることが分かる。これは、カラギーナンが成功に炎症を誘発し、モデリングに成功したことを示す。モデル群と比べて、生体変換熊胆粉0.093g/kg、0.185g/kg群、と天然の熊胆粉0.09g/kg、0.18g/kg群の動物の足底腫脹度が共に低下した（p<0 .05またはp< 0 .01）。それに、生体変換熊胆粉は、足底腫脹に効果がより明らかになった。これは、天然の熊胆粉より生体変換熊胆粉がカラギーナンによる誘発されたモデル動物の炎症に優れた抗炎効果があることを示した。

【0069】

以上のことから、生体変換熊胆粉の炎症に対する薬効活性が天然の熊胆粉に相当し、生体変換熊胆粉の抗炎症薬を調製に応用されうる他、優れた薬効活性があることも分かった。

【実施例2】

【0070】

生体変換熊胆粉と天然の熊胆粉とがLPSにより誘発されたラットの肺炎症に対する影響の研究を行った。実験は、以下である。

【0071】

動物種：45雄C57BL/６ネズミを用いた。上海霊暢生物科技有限会社由来で、実験動物生産許可証番号がSCXK（ろ）2013-0018である。

【0072】

実験の投与量と組分け方法：共に４組に分けられた。それぞれは、ブランクコントロール群、LPSモデル対照群、生体変換熊胆粉1000 mg/kg群、天然の熊胆粉1000 mg/kg群である。

【0073】

実験方法：LPSモデル対照群及び各薬物投与群のネズミが７日まで毎日霧化されたLPS（2.5ｍｇ／ｍｌ）に2回露出させ（毎回30分、２時間間隔で）た。毎日２回目の霧化が終了した後、各群のネズミにそれに相応する薬物を投与した。実験の第1、4、7日の第2回の霧化が終わってから5時間後に、目の縁から血を採取して、遠心管に置き、室温で2時間静置してから、血清を2000gの条件下、20分間遠心分離して、－80℃で凍結保存予備、血清中のIL－6とTNF－αレベルを測定した。実験の7日目に血を採取後、ネズミの胸腔を開き、左側の胚葉を結紮し、気管から挿管し、０．５ｍｌのPBSで３回繰り返しに洗浄し、採取された回収液を遠心管に置き、４℃、１５００ｒｐｍの条件で１０分遠心分離を行い、上清をとり、－８０℃の冷蔵庫に凍結保存し、気管支肺胞洗浄液中のIL－6、TNF－αレベルを測定した。結紮側の肺組織をとり、ホルマリン溶液に固定した。毎群からランダムに５匹ネズミの肺サンプルを抽出し、切片し、HEと染色後病理組織学検査に用いた。

【0074】

2.1生体変換熊胆粉がLPSにより誘発されたネズミ肺部の炎症血清と肺胞洗浄液中の炎症因子IL－6に対する影響が、表４、図３－４のように示される。

【0075】

図３が熊胆粉を７日連続で投与することにより、LPSにより誘発されたネズミの肺部炎症血清中の炎症因子IL-6に与えた影響で、図4が熊胆粉を７日連続で投与することにより、LPSにより誘発されたネズミの肺部炎症肺胞洗浄液中の炎症因子IL－6に与えた影響である。
表４

【0076】

表４と図３－４から、C57BL/6ネズミが霧化されたLPSにさらされて肺の炎症が誘発された。各群のネズミにそれぞれ天然の熊胆粉1000mg/kgと生体変換熊胆粉1000mg/kgを経口投与した。1日目と4日目にネズミ血清中のIL－6レベルは、モデル対照群と比べて顕著な差がない。７日目までに連続投与し、７日目に天然の熊胆粉1000 mg/kg群と生体変換熊胆粉1000mg/kg群とのネズミ血清中のIL－6レベルが、モデル対照群に比べて著しく低下した（P＜0.05またはP＜0.01）。天然の熊胆粉1000mg/kg組と生体変換熊胆粉1000mg/kg群が、7日目に、ネズミの肺泡洗浄液中のIL－6レベルのモデル対照群に比べて著しく低下した（P＜0.05またはP＜0.01）ことが分かる。

【0077】

2.2生体変換熊胆粉がLPSにより誘発されたネズミ肺部の炎症血清と肺胞洗浄液中の炎症因子TNF－αに対する影響が、表5、図5－6のように示される。

【0078】

図５は、熊胆粉を7日まで毎日投与することにより、LPSにより誘発されたネズミの肺部炎症の血清中の炎症因子TNF－αに対する影響を示す図である。図６は、熊胆粉を7日まで毎日投与することにより、LPSにより誘発されたネズミ肺部炎症の肺胞洗浄液中の炎症因子TNF-αに対する影響を示す図である。

【0079】

表5

【0080】

モデル対照群と比べて、*がP＜0.05を，**がP＜0.01を表す。

【0081】

表５と図５－６から、C57／BL6ネズミが霧化されたLPSにさらされて肺の炎症が誘発された。各群のネズミの血清と肺胞洗浄液中の炎症因子TNF－αのレベルを検定し、１日目と４日目のネズミ血清中のTNF－αレベルは、モデル対照群と比べて、明らかな差はない。しかしながら、７日までに毎日投薬して、７日目に天然の熊胆粉1000mg/kg群と生体変換熊胆粉1000mg/kg群のネズミ血清中のTNF－αレベルが、モデル対照群と比べて、顕著に低下した（P＜0.05またはP＜0.01）ことが分かる。生体変換熊胆粉1000mg/kg群に経口投与して、７日目のネズミ肺胞洗浄液中のTNF－α濃度が、モデル対照群と比べて一定の低下（P＞0.05）があり、天然の熊胆粉1000mg/kgに経口投与して、７日目のネズミ肺胞洗浄液中のTNF－αレベル濃度が、モデル対照群と比べて顕著な低下（P＜0.05）があることが分かる。

【0082】

実験結果は、LPS誘発されたC57/BL６ネズミモデルに、それぞれ熊胆粉と生体変換熊胆粉とを投与するなら、全部肺部と血清中の炎症因子IL－6、TNF－αレベルを顕著に低下できる。これは、熊胆粉と生体変換熊胆粉と共に炎症に対抗効果があり、熊胆粉と生体変換熊胆粉とともに炎症に対抗する一定の効果がり、生体変換熊胆粉が抗炎症薬を調製に応用でき、よりいい薬効活性があることを表明する。

【0083】

2.3生体変換熊胆粉がLPS誘発されたネズミの肺部炎症肺組織病理変化に与える影響
図７－８に示すように、２０倍対物レンズ下で、ブランクコントロール群の肺胞間隔がより細くて、極めて少ない炎症細胞に浸潤される。しかし、モデル群の肺胞間隔が厚くなり、肺胞空洞が消え、繊維化に似て、気管支と小血管の周りに大量な炎症細胞が見られる（図７B）。

【0084】

以下の採点基準で各群のネズミの肺部損傷状況を採点する。

【0085】

視野内に肺胞構造の損傷がない――0
0－25%視野内に構造的な損傷がある――1
25%－50%視野内に構造的な損傷がある――2
25%－50%視野内に構造的な損傷がある――3
拡散性損傷――4
生体変換熊胆粉と天然の熊胆粉を投与した後、天然の熊胆粉1000mg/kg（図９I）と生体変換熊胆粉1000mg/kg（図９J）は、ねずみ肺部炎症肺組織病理変化に対する治療効果が著しい。

【0086】

結果により、天然の熊胆粉と生体変換熊胆粉と共に、LPSにより誘発されたネズミ肺の損傷に一定の改善効果がある。

【0087】

以上、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明したが、単なる例示として、本発明は上述の具体的な実施形態に限定されない。当業者にとっては、本発明に対する均等な修正および代替も本発明の範囲内にある。したがって、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行った均等変換および修正は、本発明の範囲内に含まれるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】