知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-04
(45)【発行日】2022-08-15
(54)【発明の名称】ハイスループットシーケンシング
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6858 20180101AFI20220805BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20220805BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6858 Z ZNA
C12N15/11 Z
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2017519317
(86)(22)【出願日】2015-10-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2017-11-02
(86)【国際出願番号】 GB2015053023
(87)【国際公開番号】W WO2016059398
(87)【国際公開日】2016-04-21
【審査請求日】2018-09-11
【審判番号】
【審判請求日】2020-07-30
(31)【優先権主張番号】1418144.0
(32)【優先日】2014-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】504043462
【氏名又は名称】ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100149294
【弁理士】
【氏名又は名称】内田 直人
(72)【発明者】
【氏名】ベアード，ダンカン
(72)【発明者】
【氏名】ノリス，ケビン
【合議体】
【審判長】長井 啓子
【審判官】上條 肇
【審判官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２４２５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００４－５３６５９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５１５７７８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５０５４１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３年，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２，ｐ．２０３－２０７
【文献】Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＡｎａｌｙｚｅｒＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，２０１２年，ｐ．１－４
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12Q 1/00 - 3/00
C12N 15/00 - 15/90
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するためのハイスループット方法（ＨＴ－ＳＴＥＬＡ）であって、ｉ）テロメア反復配列ＴＴＡＧＧＧの開始点から３８４３ｂｐ～３０ｂｐの間にある、ＸｐＹｐ、７ｑ、１２ｑまたは１７ｐ染色体ＤＮＡのテロメア反復配列に隣接する領域に、プライマーをアニーリングすることと；
ｉｉ）２１～２３サイクルを使用して、前記染色体ＤＮＡ２０ｎｇ～３５ｎｇをＰＣＲ増幅させ、増幅産物を生成させることと；
ｉｉｉ）キャピラリー電気泳動を用いた展開方法により増幅産物の長さを検出することとを含み、
前記プライマーは、７ｑ染色体であって、以下の７ｑ特異的ヌクレオチド：１１１５Ｔ（ｃｈｒ７：１５９３３４７５５ ｈｇ３８）、５５１Ａ（ｃｈｒ７：１５９３３５３１９ ｈｇ３８）、および１９５Ｇ（ｃｈｒ７：１５９３３５６７５ ｈｇ３８）（テロメア反復配列の開始点、またはｈｇ３８ヒトゲノム参照配列に関する）のうちの少なくとも１つに結合するように設計される；
前記プライマーは、１２ｑ染色体であって、以下の１２ｑ特異的ヌクレオチド：３５０Ｇ（ｃｈｒ１２：１３３２６４５２４ ｈｇ３８）および５５０Ｔ（ｃｈｒ１２：１３３２６４３２４ ｈｇ３８）（テロメア反復配列の開始点、またはｈｇ３８ヒトゲノム参照配列に関する）のうちの少なくとも１つに結合するように設計される；
前記プライマーは、ＸｐＹｐ染色体であって、以下のＸｐＹｐ特異的ヌクレオチド：３９７Ｃ（ＸｐＹｐＥ５）（ｃｈｒＸ：１０４３２ ｈｇ３８）および８６１Ｃ（ＸｐＹｐＣ ）（ｃｈｒＸ：１０８９６ ｈｇ３８）（テロメア反復配列の開始点、またはｈｇ３８ヒトゲノム参照配列に関する）のうちの少なくとも１つに結合するように設計される；または
前記プライマーは、１７ｐ染色体であって、以下の１７ｐ特異的ヌクレオチド：２９２Ｃ（１７ｐｓｅｑ１ｒｅｖ）、１０１８Ｔ（１７ｐｓｅｑ２ｒｅｖ）、１８３７Ｃ（１７ ｐｓｅｑ４ｒｅｖ）、２５５９Ｃ（１７ｐ２）および３０１８Ｇ（１７ｐ７）（テロメア反復配列の開始点に関する）のうちの少なくとも１つに結合するように設計される、
ハイスループット方法。
【請求項2】
ｉｉ）の工程が、２１～２３サイクルを使用して、前記染色体ＤＮＡ２５ｎｇ～３０ｎｇをＰＣＲ増幅させ、増幅産物を生成させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｉｉｉ）の工程が、少なくとも２５相対蛍光単位（ＲＦＵ）のシグナル；または少なくとも２５％の、０．５ｎｇ／μｌのマーカーが１０秒当たり１Ｋｖ値の注入量で使用される場合に生成されるマーカー産物の代表的な曲線下のマーカーピーク面積当たりの生成される産物の代表的な曲線下のテロメアピーク面積であるシグナルを提供する蛍光標識を、ＰＣＲ増幅産物に結合させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記染色体ＤＮＡを２３回のＰＣＲサイクルに供するか、または、３０ｎｇの染色体ＤＮＡを２３回のＰＣＲサイクルに供する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記プライマーの濃度が、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８μＭを含む群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記染色体ＤＮＡが少なくとも１つの細胞から自動抽出法を使用して抽出される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記細胞が任意の生体試料またはそれらの処理された誘導体から抽出される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記生体試料が複雑な細胞試料または精製された細胞試料である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記生体試料が全血を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
約６×１０５個の細胞または６×１０５個未満の細胞が抽出方法において使用される、 請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
２×１０５～６×１０５個の細胞が抽出方法において使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
４×１０５個の細胞が抽出方法において使用される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記方法を実施する前に、非テロメアＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼで前記染色体ＤＮＡを消化することを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記制限エンドヌクレアーゼが、前記プライマーの５’末端とテロメア反復配列との間を切断しない、または前記プライマーの５’末端と染色体テロメア末端との間を切断しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ｉｉｉ）の工程が、２００ｂｐよりも大きいが、ＨＴ－ＳＴＥＬＡを用いて同定されるテロメアの最小断片サイズよりも小さい低分子量マーカーの使用を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記低分子量マーカーが、８８２ｂｐ、８８１ｂｐ、８８０ｂｐ、８７９ｂｐ、８７８ｂｐ、８７７ｂｐ、８７６ｂｐ、８７５ｂｐ、８７４ｂｐ、８７３ｂｐ、８７２ｂｐ、８７１ｂｐ、８７０ｂｐ、４１０ｂｐ、４０９ｂｐ、４０８ｂｐ、４０７ｂｐ、４０６ｂｐ、４０５ｂｐ、４０４ｂｐ、４０３ｂｐ、４０２ｂｐ、４０１ｂｐ、４００ｂｐ、３９９ｂｐ、３９８ｂｐ、３９７ｂｐ、３９６ｂｐ、３９５ｂｐ、３９４ｂｐ、３９３ｂｐ、３９２ｂｐ、３９１ｂｐ、および３９０ｂｐを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ｉｉｉ）の工程が、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂおよび２０ｋｂを含む群であって、これらの間のすべての０．１ｋｂを含む群から選択される高分子量マーカーの使用を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記プライマーが、３’末端で、テロメア特異的ヌクレオチドに結合するように適合されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
がん、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の認知症を含む神経系障害、脳梗塞、心疾患、慢性ＨＩＶ感染、慢性肝炎、皮膚疾患、潰瘍性大腸炎を含む慢性炎症性腸疾患、貧血、アテローム性動脈硬化、バレット食道および前がん症状を含むがん、不妊症、先天性異常角化症を含むテロメア症候群、再生不良性貧血、特発性肺線維症、家族性骨髄異形成症候群－急性骨髄性白血病、Ｈｏｙｅｒａａｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群、レーベース症候群、コーツプラス症候群、骨髄機能不全、ならびに特発性肝硬変を含む群から選択される症状を発症するリスクを診断もしくは予後判定するため、または決定するために実施される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
移植ドナーとなるための個体の適合性を評価するために実施される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、哺乳動物染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するハイスループット方法；前記方法で使用するためのプライマー；前記プライマーを含むキット；テロメア短縮疾患、例えば、がん、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の認知症を含む神経系障害、脳梗塞、心疾患、慢性ＨＩＶ感染、慢性肝炎、皮膚疾患、潰瘍性大腸炎を含む慢性炎症性腸疾患、貧血、アテローム性動脈硬化、バレット食道および前がん症状を含むがん、不妊症、先天性異常角化症を含むテロメア症候群、再生不良性貧血、特発性肺線維症、家族性骨髄異形成症候群－急性骨髄性白血病、Ｈｏｙｅｒａａｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群、レーベース症候群、コーツプラス症候群、骨髄機能不全、ならびに特発性肝硬変を発症するリスクを診断もしくは予後判定するため、または決定するための前記方法の使用に関する。さらに、本発明はまた、移植ドナー、例えば骨髄ドナーとなるための個体の適合性を評価する際の適用も有する。
【背景技術】
【0002】
テロメアは、線状の真核生物染色体の末端をキャップし、劣化または隣接する染色体との融合からそれらを保護する、反復ＤＮＡ配列（テロメア反復配列と名付けられた、主として２５ｋｂ以下のタンデムリピート配列ＴＴＡＧＧＧ）を含んでなる核タンパク質構造である。ＴＴＡＧＧＧ反復に加えて、ヒトテロメア反復配列の近位１～２ｋｂもまた、特にＴＣＡＧＧＧおよびＴＧＡＧＧＧを含むテロメア変異体反復型（ＴＶＲ）を含有している（例えば、Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ ＥＭＢＯ １９９５、およびＬｅｔｓｏｌｏ ｅｔ ａｌ ＮＡＲ ２０１０）。ＤＮＡ複製中に、テロメア配列は染色体末端から失われる。酵素テロメラーゼは、新しいテロメア反復を合成することによってこれを補うが、体細胞においてはこの酵素は不活性であるため、時間の経過とともにテロメアは短縮する。しかし、特定の細胞型、例えば、生殖細胞、幹細胞および特定の白血球などでは、テロメア末端は、テロメア反復のＲＮＡ鋳型付加を触媒作用するテロメラーゼによって維持されている。
【0003】
テロメア長はテロメア機能の重要な決定因子であり、短い機能不全のテロメアは、マウスモデルにおいてゲノムの不安定性および腫瘍形成を促進し得ることが明らかになっている。さらに、テロメラーゼの制御解除により腫瘍形成が促進されることが明らかになっている。加えて、体細胞におけるテロメアの消失は典型的には複製老化につながり、これはゲノム安定性をもたらし、がんを防ぐ。反対に、悪性細胞はこの老化を回避することができ、テロメラーゼの異常活性化によって不死化するようになることも明らかになっている。多くの疾患が遺伝的異常、特にテロメア短縮の結果として存在することが知られている。これらの疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の認知症、脳梗塞、心疾患、慢性ＨＩＶ感染、慢性肝炎、皮膚疾患、潰瘍性大腸炎を含む慢性炎症性腸疾患、貧血、アテローム性動脈硬化、バレット食道および前がん症状を含むがん、不妊症、先天性異常角化症を含むテロメア症候群、再生不良性貧血、特発性肺線維症、家族性骨髄異形成症候群－急性骨髄性白血病、Ｈｏｙｅｒａａｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群、レーベース症候群、コーツプラス症候群、骨髄機能不全、ならび特発性肝硬変が挙げられる。さらに、テロメア長の決定は、移植ドナー、例えば骨髄ドナーとなるための個体の適合性を評価する際の適用も有する。
【0004】
腫瘍進行におけるテロメア生物学の役割と一致して、テロメア長が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む多くのヒト悪性腫瘍における予後判定情報を提供することができることを示すかなりの証拠が現在存在する。しかし、テロメア長を検出する現在利用可能な技術は解像度不足であり、このため、テロメアアッセイを臨床実施に移行するにあたっての進歩が妨げられている。例えば、乳がん進行中のテロメア機能障害の推定上の役割が示されているが、低解像度テロメア長解析だと限られた予後判定情報が提供されることが明らかであった。これらの技術に関する重要な問題は、ＤＮＡプローブのテロメア反復単位へのハイブリダイゼーションにそれらが基づくということである。結果的に、テロメアが短縮されるにつれて、プローブ標的は少なくなる。このことは、短縮されたテロメアが検出できないことを意味する。機能不全となって融合を起こし、ヒトがんの進行を促進し得るゲノム不安定性を引き起こすのは短縮されたテロメアであるという理由から、これは深刻である。また、Ｑ－ＰＣＲに基づく方法も、テロメア反復含有量の推定について開示されている（ＷＯ ２００４０６８１１０ＵＳ）。しかし、これらの方法はハイスループット解析を行うことはできるが、短いテロメア（＜４ｋｂ）の検出に関するそれらの直線性は確立されていない１８。これは、報告されている２８％までの高い変動係数（ＣＶ）値と関連付けると、Ｑ－ＰＣＲ方法は短いテロメアの検出には不適当であり、医療判断用の予後判定ツールとしては信頼性が低い１９。まとめると、これまで、既存の低解像度技術を使用するテロメア解析は、十分に有益な予後判定ツールとはいえない。
【0005】
この問題に対処するため、本発明者らは、これまで、極端に短縮されたテロメアの存在を検出することが可能であり２０、２１、テロメア末端－末端融合を特徴づけることができる１６、１７単一分子技術を開発した。単一テロメア長解析（ＳＴＥＬＡ）では、テロメア末端－末端融合を生じ得るテロメア長を含む、特定の染色体末端でのテロメア長を完全に展開することができる１６、２０。したがって、この方法は、潜在的機能不全であり融合を起こし得る短いテロメアを検出することができる。これらのテロメアは、他のいずれの方法を用いても確実に検出することはできない。
【0006】
ＳＴＥＬＡおよびテロメア融合解析２２、２３を使用し、本発明者らは、テロメア融合を検出することが可能な腫瘍細胞のテロメア長を定めた２４、２５。本発明者らは、ＳＴＥＬＡを融合性閾値と共に使用し、テロメア長に基づいてＣＬＬ罹患患者を階層化した。これらのデータは、融合性閾値未満のテロメア長は予後判定性が高く、融合性範囲の平均（２．２６ｋｂ）が最適な予後判定解像度を提供することを示す。融合性閾値より下のテロメア長は、ＣＬＬにおける生存に関する最も強力な予測因子であり、これは特に初期段階の患者において予後判定的であった２４。テロメア機能不全は多くの腫瘍タイプの進行に関係しており、本発明者らは、今回、同じ閾値が乳がんおよび骨髄異形成症候群において予後判定的であることを確立した。したがって、本発明者らは、我々の閾値が多くの様々な腫瘍タイプにおいて臨床上の有用性を提供することができると考えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らの知見の予後判定の有意性を鑑み、本発明者らは、テロメア長を決定するために、ソートして頑健なハイスループット方法を確立する。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法は煩雑であるため、多大な労働力を要し、時間も必要とする。さらに、この方法は、放射性標識したＤＮＡプローブによるサザンハイブリダイゼーションを利用しており、このため、この方法は低スループットである。したがって、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法は、低スループットだが高解像度を必要とする研究室環境に最も適している。しかし、この方法は、がん患者の日常的なハイスループット評価には適していない。
【課題を解決するための手段】
【0008】
これらの問題を解決するため、本発明者らは、本明細書において、ＳＴＥＬＡ方法の新規な改良版－ハイスループットＳＴＥＬＡ（ＨＴ－ＳＴＥＬＡ）を開示している。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法と同様に、ＨＴ－ＳＴＥＬＡは、リンカーオリゴヌクレオチドを必要とし、特定のヒトテロメアを増幅する、ＰＣＲに基づいた技術である。しかし、テロメア長分布の展開および検出がゲル電気泳動およびサザンハイブリダイゼーションによって行われないという点で異なる。代わりに、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ中に生成されたＰＣＲ産物は、キャピラリー電気泳動（Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌを使用）によって展開され、ＰＣＲ産物への蛍光性挿入色素の取り込みをモニターするカメラによって検出される。この改良された展開および検出のステップは、テロメア長測定値の生成に要する時間を大幅に短くする。しかし、これらの異なる展開および検出の技術を使用する場合、それらを、テロメア長を確実に測定するのに必要とされる必要条件感度により作動させるのであれば、方法の変更が必要であり、したがって、本方法の感度を保証するための多くのステップが考案された。
【0009】
本発明の第１の態様によれば、哺乳動物染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するためのハイスループット方法であって、
ｉ）テロメア反復配列から３８４３ｂｐ～３０ｂｐの間にある、染色体ＤＮＡのテロメア反復配列に隣接する領域に、プライマー配列をアニーリングすることと；
ｉｉ）２１～２３サイクルを使用して、前記染色体ＤＮＡ２０ｎｇ～３５ｎｇをＰＣＲ増幅させ、増幅産物を生成させることと；
ｉｉｉ）増幅産物の長さを検出することと
を含むハイスループット方法が提供される。
ｉ）テロメア反復配列から３８４３ｂｐ～３０ｂｐの間にある、染色体ＤＮＡのテロメア反復配列に隣接する領域に、プライマー配列をアニーリングすることと；
ｉｉ）２１～２３サイクルを使用して、前記染色体ＤＮＡ２０ｎｇ～３５ｎｇをＰＣＲ増幅させ、増幅産物を生成させることと；
ｉｉｉ）増幅産物の長さを検出することと
を含むハイスループット方法が提供される。
【0010】
記載したように、テロメアは、染色体のそれぞれの末端で（ＴＴＡＧＧＧ）ｎを主として含んでなる反復ヌクレオチド配列の領域であり、したがって、前記テロメア反復配列から３８４３ｂｐ～３０ｂｐの領域への言及は、染色体末端をキャップするテロメア反復配列の開始位置から上流の領域（ＴＴＡＧＧＧ反復によって主として特徴付けされる）についての言及である。
【0011】
驚いたことに、本発明者らは、本方法が、分析に関して、バンドパターンとは対照的に、テロメア長分布の「スメア」を生成する場合、最も効果的に作用することを発見した。次の推察によって、本発明者らは、テロメア長分布スメアが有益である複数の理由が存在することを認めた。それは、（ＰＲＯＳｉｚｅ（商標））ソフトウェア内のデータ解析において人による操作がほとんど必要ないので、平均テロメア長をより迅速に分析できることであり；それは、試料当たりの反応が少なくて済むことであり；それは、産物の全量を増加させ、存在する非特異的バックグラウンドバンドがサイジング解析に組み込まれないようにすることである。このテロメア長分布「スメア」を達成するために、本発明者らは、最適なＤＮＡ量および最適なＰＣＲサイクル数を使用する必要があることを発見した。これらの２つのパラメーターを定義することにより、本発明者らは、後の解析でテロメア長分布「スメア」を確実に得ることができることを見出した。典型的なテロメア長の分布バンドを図１ａに示し、これに対し、典型的なテロメア長の分布スメアを図４に示す。
【0012】
さらに、本発明者らは、これらの最適化されたパラメーターが、テロメア短縮の代表的なテロメア長分布の特異的増幅と一致していることを理解した。したがって、最適化されたサイクル数およびＤＮＡ量の選択によって、テロメア長分布をより良好に表わすことが可能となる。実際、最適化されたＰＣＲサイクル数によって、人工的増幅は少なくなり、異質性が減少し、したがって、テロメア長分布がより正確に表わされる。
【0013】
ＰＣＲ増幅産物へ挿入される蛍光シグナルまたは標識を使用して、本発明者らは、ＰＣＲサイクル数２１および２３回が、システムにおいて、頑健なシグナル（２７～６５ＲＦＵの間）とテロメア長の信頼性の高い推定値をもたらすこと（図１１）を発見した。このシステムにおいて、信頼性の高いテロメア長推定値を提供する最小シグナルは、２５ＲＦＵまたは２５％（Ｔｅｌピーク面積ＬＭピーク面積、ここで、Ｔｅｌピーク面積はテロメア特異的産物の曲線下の面積であり、ＬＭ面積は低分子量マーカーの曲線下の面積である）であった。両方とも、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアを使用して決定する。最も理想的には、２３回のＰＣＲサイクル数を使用する。
【0014】
本発明のよりさらに好ましい方法において、ＰＣＲ増幅に使用される染色体ＤＮＡの量は、２５～３０ｎｇである。
【0015】
より理想的には、ＰＣＲ増幅に使用される染色体ＤＮＡの量は、２５ｎｇ、２６ｎｇ、２７ｎｇ、２８ｎｇ、２９ｎｇおよび３０ｎｇを含む群から選択される。最も理想的には、２５ｎｇの染色体ＤＮＡを使用し、２２回のＰＣＲサイクルを実施して増幅産物を得る。よりさらに好ましくは、３０ｎｇの染色体ＤＮＡを２３回のＰＣＲサイクルに供した。
【0016】
本発明のよりさらに好ましい方法において、前記プライマーは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８μＭの濃度で提供されるが、最も理想的には、０．１または０．２μＭで提供される。
【0017】
本発明のよりさらに好ましい方法において、前記染色体ＤＮＡは、反応が行われる毎にＰＣＲ反応に等量のＤＮＡを毎回提供する目的で自動抽出法を使用し、少なくとも１つの細胞、理想的には複数の細胞から抽出する。適切なＤＮＡ抽出システムの一例は、Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＩＱ（商標）システムである。このシステムを使用して、ＤＮＡを細胞懸濁液から抽出し、続いて、単一分子レベルまで希釈し、オリジナルのＳＴＥＬＡ法と同数の増幅可能な分子を得た。次いで、本発明者らは、さらに、ＨＴ－ＳＴＥＬＡで使用するためのテロメア長分布スメアを確実に生成するためにこの方法を最適化したが、これは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＤＮＡ ＩＱ（商標）システムから最適溶出量を決定し、次にＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応に加えるＤＮＡ溶液の容量を決定することにより行った。これによって、投入ＤＮＡの量を定量することなく、信頼性の高いテロメア長分布スメアが提供されることが分かった。これにより、ＳＴＥＬＡ方法の速度および信頼度が向上し、ＤＮＡ抽出、希釈およびＰＣＲセットアップの自動化が可能となる。また、分析可能な試料の範囲も拡大し、例えば、指穿刺または口腔内綿棒によりＦＴＡ ＤＮＡカードを使用することができる。有利なことには、この技術によって、個人が自宅で試料を準備し、テロメア検査のために一般的な郵便でそれらを送ることができる。
【0018】
患者由来の試料の日常的な評価について、試験しようとする細胞の単離（例えばＣＤ１９＋ ＣＬＬ）およびその後のこれらの細胞からのＤＮＡ抽出、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ、生成されたＰＣＲ産物の展開および検出、ならびにこれらの産物からの（例えば、ＸｐＹｐ染色体を使用する）平均テロメア長の測定は、すべて１日の作業内で行うことができるが、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法の場合、これは、終了するまで７日間の作業日を要する。したがって、ＨＴ－ＳＴＥＬＡは、迅速かつ正確にがん患者の予後判定を評価することができる有効なツールを提供する。
【0019】
本方法の好ましい実施形態において、前記細胞は、任意の生体試料から抽出することができる。本明細書における生体試料への言及は、テロメア長を解析しようとする対象から採取した任意の試料、またはそれらの処理された誘導体を意味する。これには、限定するものではないが、複雑な試料、例えば、全血、組織試料もしくは腫瘍試料、またはそれらの精製された細胞試料が含まれる。
【0020】
あるいは、生体試料を処理した誘導体、例えば、限定するものではないが、生体試料から採取し、予め単離、抽出し、必要に応じて適切な培地に再懸濁させた細胞などを使用することができる。例えば、ＦＴＡカードは、その後の下流でのＤＮＡ解析用の血液試料に都合のよいサンプリングおよび保存に一般に使用されているフォーマットである。これは、テロメア検査を必要とし得る患者に、臨床医または採血者を必要とすることなく、自宅で試料を準備するための迅速な方法を提供する。少量の血液試料をＦＴＡカード上にスポットし、次いで、標準的な郵便サービスによって検査施設に返送される。
【0021】
本発明の好ましい実施形態において、ＤＮＡ ＩＱシステムは４×１０５個の細胞で飽和しているように考えられる。したがって、好ましい方法は、２×１０５～６×１０５個、好ましくは４×１０５個の細胞の使用を含む。
【0022】
場合によっては、テロメア長は、例えば、正常個体の末梢血由来の試料において、かなりの異質性が示され、好ましくないＰＣＲ増幅産物をもたらす可能性があることがわかった。これらの状況において、ＨＴ－ＳＴＥＬＡの実施前に、染色体ＤＮＡを予備消化することで、試料ＤＮＡの複雑性が低減し、増幅用のよりシンプルな標的が得られることが確認された。
【0023】
したがって、本発明のさらなる好ましい実施形態において、非テロメアＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼで前記染色体ＤＮＡを消化する。当業者には理解されるように、ポリヌクレオチド鎖内のＤＮＡホスホジエステル結合を切断する任意の酵素を、増幅しようとするテロメア内で切断しない限り、使用することができる。
【0024】
しかし、本発明者らがテロメア長を評価している状況から、テロメア領域を切断しない制限エンドヌクレアーゼを使用することが望ましく、したがって、より理想的には、前記制限酵素は、前記プライマーの５’末端とテロメア反復配列または染色体テロメア末端との間をそれが切断しないということに基づいて選択する。
【0025】
本発明のよりさらに好ましい実施形態において、増幅産物の長さの前記検出は、次のマーカーの使用を含む：大きなプライマー複合体およびプライマー二量体（２００ｂｐ）のサイズよりも大きいが、ＨＴ－ＳＴＥＬＡで生成されるテロメアの最小断片サイズ（例えば、８８２ｂｐまたは４１５ｂｐ）よりも小さい低分子量マーカー；および本発明者らのＣＬＬのコホートで確認された最長平均テロメア長よりも大きい高分子量マーカー。したがって、理想的には、８８２ｂｐまたは４１５ｂｐ未満の低分子量マーカーが選択された。理想的には、このマーカーは、８８２ｂｐ、８８１ｂｐ、８８０ｂｐ、８７９ｂｐ、８７８ｂｐ、８７７ｂｐ、８７６ｂｐ、８７５ｂｐ、８７４ｂｐ、８７３ｂｐ、８７２ｂｐ、８７１ｂｐ、８７０ｂｐ、４１０ｂｐ、４０９ｂｐ、４０８ｂｐ、４０７ｂｐ、４０６ｂｐ、４０５ｂｐ、４０４ｂｐ、４０３ｂｐ、４０２ｂｐ、４０１ｂｐ、４００ｂｐ、３９９ｂｐ、３９８ｂｐ、３９７ｂｐ、３９６ｂｐ、３９５ｂｐ、３９４ｂｐ、３９３ｂｐ、３９２ｂｐ、３９１ｂｐ、および３９０ｂｐを含む群から選択される。理想的には、市販の４００ｂｐのＤＮＡ断片をこの目的のために取得した（ＮｏＬｉｍｉｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。同様に、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂおよび２０ｋｂの群であって、これらの間のすべての０．１ｋｂ整数を含む群から選択されるマーカーのような、１０ｋｂを超える高分子量マーカーがマーカーとして選択された。
【0026】
特定の染色体に対する特異性を得るためのよりさらに好ましい本発明の方法において、プライマーは、染色体ＸｐＹｐ、７ｑ、１２ｑおよび１７ｐの染色体ＤＮＡのテロメア反復配列に隣接する領域とアニールするように設計される。さらにより理想的には、テロメアに隣接するプライマーは、３’末端にテロメア特異的ヌクレオチドを組み込むように設計される。
【0027】
好ましくは、７ｑ染色体プライマーは、周辺で、すなわち、７ｑ特異的ヌクレオチド（１１１５Ｔ（ｃｈｒ７：１５９３３４７５５ ｈｇ３８）、５５１Ａ（ｃｈｒ７：１５９３３５３１９ ｈｇ３８）、１９５Ｇ（ｃｈｒ７：１５９３３５６７５ ｈｇ３８）および、また少し程度は低いが、２９Ｇ（ｃｈｒ７：１５９３３５８４１ ｈｇ３８）（テロメア反復配列の開始点、またはｈｇ３８ヒトゲノム参照配列に関する）に相補的であるように設計される。これらのプライマーは、頑健なテロメア長分布スメアを生成した。
【0028】
好ましくは、１２ｑ染色体プライマーは、周辺で、すなわち、１２ｑ特異的ヌクレオチド３５０Ｇ（ｃｈｒ１２：１３３２６４５２４ ｈｇ３８）および５５０Ｔ（ｃｈｒ１２：１３３２６４３２４ ｈｇ３８）（テロメア反復配列の開始点、またはｈｇ３８ヒトゲノム参照配列に関する）に相補的であるように設計される。これらのプライマーは、頑健なテロメア長分布スメアを生成した。
【0029】
好ましくは、ＸｐＹｐ染色体プライマーは、周辺で、すなわち、ＸｐＹｐ特異的ヌクレオチド３９７Ｃ（ＸｐＹｐＥ５）（ｃｈｒＸ：１０４３２ ｈｇ３８）および８６１Ｃ（ＸｐＹｐＣ）（ｃｈｒＸ：１０８９６ ｈｇ３８）（テロメア反復配列の開始点、またはｈｇ３８ヒトゲノム参照配列に関する）に相補的であるように設計される。これらのプライマーは、頑健なテロメア長分布スメアを生成した。
【0030】
好ましくは、１７ｐ染色体プライマーは、周辺で、すなわち、１７ｐ特異的ヌクレオチド２９２Ｃ（１７ｐｓｅｑ１ｒｅｖ）、１０１８Ｔ（１７ｐｓｅｑ２ｒｅｖ）、１８３７Ｃ（１７ｐｓｅｑ４ｒｅｖ）、２５５９Ｃ（１７ｐ２）および３０１８Ｇ（１７ｐ７）（テロメア反復配列の開始点に関する）に相補的であるように設計される。これらのプライマーは、頑健なテロメア長分布スメアを生成した。
【0031】
好ましくは、さらにオリジナルのＳＴＥＬＡ方法でテロメア特異的産物を生成する２ｐ、４ｑ、４ｐ、５ｐ、１１ｑ、１６ｐおよび１８ｑを含む、他の染色体テロメアを増幅するように設計されたプライマーもまた、ＨＴ－ＳＴＥＬＡで有用性を提供し得る。これらのプライマーとしては、２ｐ２（ｃｈｒ２：１０７５５ ｈｇ３８）、４ｑＫ１（ｃｈｒ４：１９０１２２０９８ ｈｇ３８）、４ｐ４（ｃｈｒ４：１０４５７ ｈｇ３８）、５ｐ３（ｃｈｒ５：１２２４０ ｈｇ３８）、１１ｑ１３Ｂ（ｃｈｒ１１：１３５０７６４６７ ｈｇ３８）、１６ｐｒｅｖ１（ｃｈｒ１６：１０２４１ ｈｇ３８）、および１８ｑｒｅｖ４Ｍ（ｃｈｒ１８：８０２６２１４７ ｈｇ３８）が挙げられる。
【0032】
実際、本発明者らは、テロメア反復配列の開始点から少なくとも３．８４３ｋｂまでアニーリングするプライマーが頑健なテロメアプロファイルをもたらすことを見出した。しかし、テロメア反復配列の３０ｂｐ内でアニーリングするプライマーが効果的増幅または特異的増幅を生じなかったことも明白であった。したがって、本発明を実施する場合、本発明者らは、テロメア反復ＴＴＡＧＧＧの開始点から３８４３ｂｐ～３０ｂｐの間にある染色体の領域にアニーリングするプライマーを使用する。
【0033】
本明細書で使用する場合、「プライマー（複数可）」という用語は、染色体ＤＮＡの末端に生理学的条件または反応条件（ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ、２０ページを参照）下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。理想的には、オリゴヌクレオチドプライマーが少なくとも１つの、理想的には複数の前記染色体末端特異的ヌクレオチドに相補的であるように設計されるという事実にかかわらず、オリゴヌクレオチドの正確な長さ、およびその標的との相補性のその程度は、標的の配列、およびその配列を含む特定の塩基を含む、選択した特定の標的に依存するとことは、当業者には理解されよう。
【0034】
オリゴヌクレオチドは、生理学的条件／反応条件下で標的と選択的に結合するように、すなわち、生理学的条件／反応条件下で標的細胞の任意の別の配列よりも標的配列に対してより実質的にハイブリダイズするように、構築され配置されることが好ましい。
【0035】
十分に選択的で、かつ有効であるために、オリゴヌクレオチドは、標的に相補的である少なくとも７個２６、より好ましくは、少なくとも１５個の連続する塩基を含むものとする。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、２０～３０塩基の相補配列を含む。
【0036】
本発明のよりさらに好ましい実施形態において、前記増幅産物（複数可）の検出は、キャピラリー電気泳動を使用する展開（または分離）方法を含み、この試験の実施に適切な装置の一例は、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌから入手可能）である。他のキャピラリーゲルシステムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ａｎｄ Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。さらに、キャピラリー電気泳動を使用して増幅産物（複数可）を分離したら、これ／これらは、適切なシグナルまたは標識を使用して検出するが、本発明者らは、好ましくは、蛍光色素、理想的には増幅産物に挿入される蛍光色素を使用する。本発明の方法を使用して、本発明者らは、ＰＣＲ増幅産物に挿入され、２７～６５ＲＦＵ、理想的には少なくとも２５ＲＦＵのシグナルを生成する蛍光シグナルまたは標識が、信頼性の高いテロメア長の推定値を提供する最小シグナルが２５ＲＦＵであったシステムにおいて、テロメア長の推定にとって十分頑健であり信頼性が高い（図１１）ことを発見した。２５ＲＦＵは、２５％の（図１１で示した低分子量マーカーの曲線下面積で除算したＨＴ－ＳＴＥＬＡシグナルの曲線下面積、すなわち、Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積）に等しいか、または２５％として表すことができる。３５ページ、品質管理を参照されたい。
【0037】
本発明のよりさらなる実施形態において、前記方法は、がん、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の認知症を含む神経系障害、脳梗塞、心疾患、慢性ＨＩＶ感染、慢性肝炎、皮膚疾患、潰瘍性大腸炎を含む慢性炎症性腸疾患、貧血、アテローム性動脈硬化、バレット食道および前がん症状を含むがん、不妊症、先天性異常角化症を含むテロメア症候群、再生不良性貧血、特発性肺線維症、家族性骨髄異形成症候群－急性骨髄性白血病、Ｈｏｙｅｒａａｌ－Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群、レーベース症候群、コーツプラス症候群、骨髄機能不全、ならびに特発性肝硬変を含む群から選択される症状を発症するリスクを診断もしくは予後判定するため、または決定するために実施される。
【0038】
本発明のよりさらなる実施形態において、前記方法は、移植ドナー、例えば骨髄ドナーとなるための個体の適合性を評価するために実施される。
【0039】
本発明のさらなる態様によれば、哺乳動物染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するためのキットであって、テロメア反復配列から３８４３ｂｐ～３０ｂｐの間にある、染色体ＤＮＡのテロメア反復配列に隣接する領域にアニーリングし得る少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットが提供される。
【0040】
本発明の好ましいキットにおいて、複数のプライマーが提供され、理想的には、前記プライマーは、以下の染色体７ｑ、１２ｑ、１７ｐ、ＸｐＹｐ、２ｐ、４ｑ、４ｐ、５ｐ、１１ｑ、１６ｐおよび１８ｑのうちの少なくとも１つで少なくとも前記領域にアニーリングし得る。
【0041】
よりさらに好ましくは、前記キットは、前記方法を実施するための試薬を含む。
【0042】
本発明のよりさらなる態様において、以下を含む群から選択されるプライマーが提供される：
【0043】
【0044】
【0045】
本明細書に引用されているいずれかの特許または特許出願を含む、すべての参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。いずれの先行文献も先行技術を構成することを容認するものではない。さらに、いずれかの先行技術が当技術分野における通常の一般知識の一部を構成することを容認するものではない。
【0046】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、他のいずれかの態様に関連して記載されたものであり得る。
【0047】
本発明の他の特徴は、以下の実施例から明白になるであろう。概して言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示されている特徴のいずれかの新規なもの、またはいずれかの新規なものの組み合わせに及んでいる。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または実施例に関連して記載されている特徴、整数、特性、化合物または化学成分は、それらと矛盾しない限り、本明細書に記載されている任意の他の態様、実施形態または実施例に適用することができるものと理解されたい。
【0048】
さらに、他に言及されていない限り、本明細書に記載されているいずれかの特徴は、同じ目的または類似の目的を果たす代替の特徴と置き換えることができる。
【0049】
本発明を、以下の表および図を参照し単なる例示としてここに説明する。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】フラグメントアナライザーでのＳＴＥＬＡによって生成されたＰＣＲ産物の電気泳動および検出を示す図である。２５０ｐｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡを３０μｌのＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、６５℃のアニール温度で２２回ＰＣＲサイクルを繰り返した。（ａ）続いてそれぞれの反応物から４μｌを取り、ＳＴＥＬＡプロトコルによって解析した。（ｂ）（ｉ）ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の残りを電気泳動にかけ、フラグメントアナライザーを使用してＰＣＲ産物を検出することが可能な陽性対照ＰＣＲと共に、フラグメントアナライザーを使用して検出した。（ｉｉ）１つのキャピラリーから生成された電気泳動図の例であり、それからＰＣＲ反応物の１つが展開された。ＬＭ＝低分子量マーカー、ＵＭ＝高分子量マーカー。
【図2】ＰＣＲサイクル数の増加によって、生成されるＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の量が増加し、フラグメントアナライザーでそれらを可視化することができることを示す図である。２５０ｐｇのＭＲＣ５ ｃｌ．１３ ＤＮＡを３０μｌのＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、６５℃のアニール温度で２２、２４、２６または２８回のＰＣＲサイクルに供した。４μｌの生成されたＰＣＲ産物を、従来のＳＴＥＬＡ解析用（ａ）に取り、残りの２６μｌは、フラグメントアナライザーによるキャピラリー電気泳動および検出用（ｂ）の９６ウェルプレートにロードした。
【図3-1】代替のＸｐＹｐテロメア隣接プライマーの設計および使用によるＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物収量の改善を示す図である。（ａ）多くの代替ＸｐＹｐテロメア隣接プライマーを、ＸｐＹｐＥ２と同じ領域周辺で設計した。（ｂ）５つのＸｐＹｐテロメア隣接プライマーのすべてをＳＴＥＬＡ ＰＣＲにおいて使用し、プライマーの性能を５つのプライマー間で比較し、さらにＸｐＹｐＥ２に対しても比較し、ＰＣＲ効率に任意の増加があったか、またより多くのＰＣＲ産物が生成されたかどうかを判定した。（ｃ）ＸｐＹｐＥ２またはＸｐＹｐＥ５のいずれかを含有する三連のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、フラグメントアナライザーを使用する解析用の９６ウェルプレートにロードした。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を使用し、それぞれの個別のＰＣＲ反応によって生成されたＰＣＲ産物の量を示した。次いで、それぞれの反応物セットの平均ＲＦＵを使用し、いずれかのプライマーを使用して生成されたＰＣＲ産物の量を決定した。
【図3-2】同上。
【図4】反応物当たりの投入ＤＮＡの量を増加させることにより、バンドパターンとは対照的なテロメア長分布スメアが形成されたことを示す図である。（ａ）１．２５ｎｇ、６．２５ｎｇまたは１２．５ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．５ ＤＮＡを、複製のためＸｐＹｐＥ５を含有する３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２８回のＰＣＲサイクルを行った。得られた生成ＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザーを使用して展開し、検出した。（ｂ）ＤＮＡはＣＬＬ患者（患者ＩＤ－４４０８）から採取したものを使用する以外は、（ａ）の方法を繰り返したが、これは、より異質的なテロメア長分布を示した。１．２５ｎｇ、３．１２５ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇおよび４７．５ｎｇの４４０８ ＤＮＡを、複製のため３０μｌ ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、次いで、これを２８のＰＣＲ断片に供した。生成されたＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザーを使用して、展開し、検出した。
【図5】ＸｐＹｐＥ５およびｔｅｌテイルプライマー濃度を低下させると、生成されるＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の量が増加することを示す図である。（ａ）３０ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．５ ＤＮＡを、０．２μＭ、０．５μＭまたは０．８μＭのいずれかのテロメア隣接ＸｐＹｐＥ５およびｔｅｌテイルプライマーを含有する複数の反応物に加えた。次いで、反応物から生成された、得られたＰＣＲ産物を、フラグメントアナライザーを使用して展開し、検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）をそれぞれの反応物について得た。それぞれの反応物セット内において、個々の反応物ＲＦＵを平均し、特定のプライマー濃度によって生成されるＰＣＲ産物の量の指標を得た。（ｂ）ＨＴ ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物が異なるプライマー濃度を含む以外は、（ａ）の方法を繰り返した。０．０５μＭ、０．１μＭまたは０．２μＭを含有する反応物セットから生成されたＰＣＲ産物を、フラグメントアナライザーで展開、検出し、反応物セットに対する平均ＲＦＵを計算した。
【図6-1】従来の単一テロメア長解析（ＳＴＥＬＡ）およびハイスループットＳＴＥＬＡ（ＨＴ－ＳＴＥＬＡ）によって測定された平均テロメア長の比較を示す図である。（ａ）ＨＴ１０８０およびＭＲＣ５のクローン個体群と共にＣＬＬ試料のパネルからの平均ＸｐＹｐテロメア長を従来のＳＴＥＬＡによって解析した。平均テロメア長は、Ｐｈｏｒｅｔｉｘソフトウェア（ＮｏｎＬｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してバンド定量によって測定し、すべての定量バンドを平均した。（ｂ）また、同じ試料パネルからのＸｐＹｐテロメア長も、新たに最適化した条件を使用し、ＨＴ－ＳＴＥＬＡによって測定した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡについては、平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）のスメア解析機能によって個々のレーンごとに計算し、特定の試料について、すべての反応物にわたって平均テロメア長を計算した。（ｃ）ＳＴＥＬＡおよびＨＴ－ＳＴＥＬＡにより生成されたＭＴＬ推定値の比較である。
【図6-2】同上。
【図7】ＰＣＲサイクルの量を減少させると、ＨＴ－ＳＴＥＬＡにおける人工的短鎖分子の増幅と、より短いテロメアの優先的増幅が減少し、正確な平均ＸｐＹｐテロメア長測定値が得られることを示す図である。（ａ）１μｌ（１０．０６ｎｇ）、２μｌ（２０．１２ｎｇ）および３μｌ（３０．１８ｎｇ）のＨＴ１０８０ ｃｌ．５ ＤＮＡを複数のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２２、２４、２６または２８回のＰＣＲサイクルに供した。生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。（ｂ）ＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡが１μｌ（６．６ｎｇ）、２μｌ（１３．２ｎｇ）または３μｌ（１９．９ｎｇ）である以外、（ａ）と同じ方法を実施した。（ｃ）３０ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡを複数のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２２回または２３回のＰＣＲサイクルのいずれかに供した。生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。平均ＲＦＵ（相対蛍光単位）を使用し、それぞれのＰＣＲ反応物セットによって生成されるＰＣＲ産物の平均量を示す。それぞれの反応物セットに対する平均テロメア長（ＭＴＬ）は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアでスメア解析を使用して計算した。ＵＡ／ＬＡ＝高分子量テロメアアレルと低分子量テロメアアレルとの間のピーク高における比。
【図8】最適なキャピラリー間正規化のための低分子量マーカー可視性の改善を示す図である。（ａ）ＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡ試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）に付属の０．５ｎｇ／μｌの低分子量マーカー（７５ｂｐ）および高分子量マーカー（２０ｋｂ）と共に、単一キャピラリー内で展開された、未精製ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の電気泳動図の例である。「ＵＭ」は高分子量マーカーの位置を示すが、２００ｂｐ未満のＰＣＲアーチファクトの存在によって、７５ｂｐの低分子量マーカー「ＬＭ」の位置がマスクされる。（ｂ）ＰＣＲ後にＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物を精製した以外は（ａ）と同じ電気泳動図である。（ｃ）新しい４００ｂｐおよび１５ｋｂのＮｏＬｉｍｉｔｓ ＤＮＡ断片（０．５ｎｇ／μｌ）と共に、キャピラリー内で展開したＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の電気泳動図である。新しい４００ｂｐの低分子量マーカーは、望ましくないＰＣＲアーチファクトから分離した一つの明瞭なピークを生じる。
【図9】ＰＣＲサイクル数を減少させた後、ハイスループットＳＴＥＬＡ（ＨＴ－ＳＴＥＬＡ）によって測定した平均テロメア長の再解析を示す図である。（ａ）ＸｐＹｐ ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲを、ＣＬＬ試料のパネル、ならびにＨＴ１０８０およびＭＲＣ５のクローン個体群で実施した。各ＤＮＡの２０～３０ｎｇＤＮＡを３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、次いで、これを２２回のＰＣＲサイクルに供した。得られた生成ＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。平均ＸｐＹｐテロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ））のスメア解析機能によってそれぞれの個別のレーンについて計算し、特定の試料について、すべての反応物にわたり平均テロメア長を計算した。（ｂ）ＳＴＥＬＡおよびＨＴ－ＳＴＥＬＡにより生成されたＭＴＬ推定値の比較を示す。
【図10-1】ＨＴ－ＳＴＥＬＡの変動係数の解析を示す図である（ａ、ｂおよびｃ）。３０ｎｇのＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡを、テロメア隣接プライマーＸｐＹｐＥ５を含有する、９５×３０μｌ複製ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２３回のＰＣＲサイクルに供した。生成されたＰＣＲ産物を９６ウェルプレートにロードしてから、フラグメントアナライザーによって展開し、検出した。得られた提示のアウトプットゲルは、同じＰＣＲ反応物を使用したフラグメントアナライザーでの３回の独立した実行から得ている。両テロメアアレルに関するテロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）のスメア解析ツールを使用して測定した。次いで、平均テロメア長を、全９５のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物すべてについて計算した。変動係数（ＣＶ％）は、式ＣＶ％＝（ＳＤ／ＭＴＬ）＊１００を使用して計算し、同じ９６ウェルプレート内のＰＣＲ反応物間で計算したか（それぞれのアウトプットゲルを下に記載）、または、同じＰＣＲ反応物について、３回の独立したフラグメントアナライザーの実行で展開し、検出した（表１）。
【図10-2】同上。
【図11】どのＲＦＵ値が不正確な平均テロメア長測定値をもたらすのかを決定するピーク高解析を示す図である。３０ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加えた。次いで、これらの反応物を１８、１９、２０、２１、２２または２３回のＰＣＲサイクルに供した。生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）はＰＣＲ産物量を表わす。平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）内のスメア解析ツールを使用して、それぞれのレーンについて計算した。Ｔｅｌピーク面積＝ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアの電気泳動図上のテロメア長分布スメアピーク下の面積。ＬＭピーク面積＝ＰｒｏＳｉｚｅの電気泳動図上の低分子量マーカーピーク下のピーク面積。Ｔｅｌピーク面積は、Ｐｒｏｓｉｚｅソフトウェアから得られたピーク面積値を使用し、式（Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積）＊１００でＬＭピーク面積の割合として示した。ＴＬ＝テロメア長、ＭＴＬ＝平均テロメア長、ＣＶ％＝変動係数。
【図12】テロメア長分布スメアを生成するためのＤＮＡ ＩＱプロトコルを使用するＭａｘｗｅｌｌ １６装置での自動ＤＮＡ抽出の最適化を示す図である。（ａ）ＳＴＥＬＡは、単離されたＣＬＬ細胞に対して実施した。（ｂ）（ａ）と同じ細胞群の異なる量を１時間溶解させた後、ＤＮＡ ＩＱプロトコルを使用し、自動ＤＮＡ抽出のＭａｘｗｅｌｌ １６装置にロードした。ＤＮＡを８０μｌに溶出した。ｔｅｌ２オリゴヌクレオチド（２５０ｐＭ）を加えた後、このＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物をＨＴ－ＳＴＥＬＡによって解析した。生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。（ｃ）ＤＮＡを、ＤＮＡ ＩＱプロトコルを使用して、４×１０５個の単離ＣＬＬ細胞の８つの複製物から抽出した。複製物のうちの４つを４０μｌ溶出バッファーに溶出させ（４０－１～４０－４）、残りの４つを８０μｌに溶出させた（８０－１～８０－４）。ＤＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ３３００蛍光分光計（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。（ｄ）複製物８０－４から抽出したＤＮＡの漸増量（１μｌおよび３μｌ＆ ５μｌ）を複数のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、テロメア長分布スメアを得た。（ｅ）１μｌの代わりに３μｌの溶出ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加える以外は、（ｃ）の方法を繰り返した。
【図13-1】慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者の全血から単離したＣＤ１９＋細胞の平均ＸｐＹｐテロメア長の解析を示す図である。ＣＤ１９＋細胞は、ＭＡＣＳ全血ＣＤ１９マイクロビーズおよびＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、全血から単離した。ＤＮＡは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置でＤＮＡ ＩＱプロトコルを使用して、４×１０５個のＣＣＤ１９＋細胞から抽出した。次いで、溶出されたＤＮＡを使用し、（ａ）ＳＴＥＬＡによって、または（ｂ）ＨＴ－ＳＴＥＬＡによって、ＣＬＬ患者の平均ＸｐＹｐテロメア長を解析した。（ｃ）２つの技術によって測定した平均ＸｐＹｐテロメア長の比較である。
【図13-2】同上。
【図14-1】７ｑ、１２ｑおよび１７ｐ染色体末端に対するＨＴ－ＳＴＥＬＡの開発を示す図である。多数の染色体特異的プライマーを（ａ）７ｑおよび（ｂ）１２ｑのテロメア隣接領域内で設計した。プライマーは、前に、（ｃ）１７ｐおよび（ｄ）ＸｐＹｐのテロメア隣接領域内で設計されている。ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲをこれらの代替テロメア隣接プライマーを用いて実施し、生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。平均ＲＦＵ（相対蛍光単位）は、所定のテロメア隣接プライマーについてそれぞれのＰＣＲ反応物よって得られたＲＦＵの算出平均である。プライマーの３’末端に組み込まれたテロメア特異的ヌクレオチドの識別および位置（ＴＴＡＧＧＧ反復開始に関する位置）は、それぞれのプライマーについて記載している。それぞれのプライマーのＴＴＡＧＧＧ反復の開始位置からの距離（プライマーの長さを含む）は、フラグメントアナライザーによって生成された分子量から差し引き、テロメア隣接ＤＮＡに対して補正した実際のテロメア長を得る。またＳＴＥＬＡも、それぞれの染色体末端について実施した。再度、テロメア隣接ＤＮＡを差し引くことにより実際のテロメア長を計算した。
【図14-2】同上。
【図15-1】ＰＣＲ産物収量を改善するためのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲの最適化を示す図である。多数の異なる最適化実験を実施し、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物収量を改善した。それぞれの最適化実験において、生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。（ａ）３０ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物を、２ｍＭ、４ｍＭまたは６ｍＭのいずれかのＭｇＣｌ２を含有するＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加えた。（ｂ）リンカーオリゴヌクレオチドｔｅｌ２を、２５０ｐＭ、２５ｐＭまたは５ｐＭのいずれかの最終濃度までＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）に加えた。３０ｎｇのそれぞれのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物をＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応に加えた。電気泳動および検出を行った後、ＲＦＵ（相対蛍光単位）をＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアによって測定した。ＲＦＵは、どれだけのＰＣＲ産物がフラグメントアナライザーによって検出されたかを示す。（ｃ）３０ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物を、Ｒｅｄ Ｈｏｔ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはチタニウムＴａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のいずれかを含有するＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加えた。（ｄ）３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物は、未希釈であるか、２×、５×および１０×希釈であった。検出されたＰＣＲ産物の量は、ＲＦＵ解析によって測定した。（ｅ）３０ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２／ｔｅｌ２混合物を、３０μｌまたは６０μｌのいずれかの容量のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加えた。検出されたＰＣＲ産物の量は、ＲＦＵ解析によって測定した。
【図15-2】同上。
【図16】新たに設計したプライマーを使用したＨＴ１０８０ ｃｌ．２の７ｑ、１２ｑおよび１７ｐ染色体末端のＳＴＥＬＡ解析を示す図である。従来のＳＴＥＬＡは、記載のテロメア特異的ヌクレオチドの周辺で設計されたプライマーを使用し、７ｑおよび１２ｑ染色体末端でＨＴ１０８０ ｃｌ２．ＤＮＡを用いた。１７ｐ ＳＴＥＬＡは、以前に設計した１７ｐｓｅｑ１ｒｅｖを使用して実施した。ＰＣＲ産物サイズの量は、Ｐｈｏｒｅｔｉｘソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量し、続いて、平均テロメア長を計算した。
【図17】ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲの前にＥｃｏＲ１でＤＮＡを消化すると、バックグラウンドノイズが減少し、よりクリアなＨＴ－ＳＴＥＬＡ電気泳動図が得られることを示す図である。（ａ）８つの末梢血試料から抽出したＤＮＡを、２時間ＥｃｏＲ１で消化した。次いで、消化したＤＮＡを三連のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２３回のＰＣＲサイクルを繰り返した。同じ試料の未消化ＤＮＡを含有した並行の反応物も構築した。次いで、得られたＰＣＲ産物を、フラグメントアナライザーを使用してキャピラリー電気泳動により分離した。（ｂ）（ａ）の試料３の（ｉ）未消化ＤＮＡまたは（ｉｉ）消化ＤＮＡを増幅する１つのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物から生成された電気泳動図の比較を示す。
【図18】ＰＣＲサイクル数およびＤＮＡ投入量の最適化を示す図である。３つの末梢血試料（１、９および１１）から抽出したＤＮＡを、２時間ＥｃｏＲ１で消化した。消化した後、ＤＮＡを定量し、消化したＤＮＡの２ｕｌまたは３ｕｌのいずれかを３セットの三連ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた。三連の反応物のそれぞれのセットについて、２１、２２または２３回のＰＣＲサイクルを繰り返した。次いで、得られたＰＣＲ産物を、フラグメントアナライザーを使用してキャピラリー電気泳動によって展開した。平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）内のスメア解析ツールを使用し、それぞれのレーンについて計算した。テロメア隣接ＤＮＡ（ＰＣＲアッセイ開始位置とテロメア反復配列の開始位置との間の距離）を除き、最終平均テロメア長を得た。標準ピーク面積％は、式（Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積）＊１００を使用することにより計算した。式中、Ｔｅｌピーク面積は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアにおける電気泳動図上のテロメア長分布スメアピーク下の面積である。ＬＭピーク面積は、ＰｒｏＳｉｚｅにおける電気泳動図の低分子量マーカーピーク下のピーク面積である。
【図19】一定の強度でＨＴ－ＳＴＥＬＡテロメア長分布スメアを得るためのＤＮＡ ＩＱシステムのクリーンアップの最適化とＤＮＡ投入試料の正規化を示す図である。２００、５００、１０００および２０００ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡを、ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジ（ＣＷ）またはＤＮＡ ＩＱ標準カートリッジ（ＲＳ）に加えた。ＤＮＡを５０ｕｌ（ＣＷ）または３００ｕｌ（ＲＳ）のいずれかに溶出させた。ＣＷの精製試料については、３、６または９ｕｌのいずれかの溶出ＤＮＡを個々のＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた。ＲＳ精製試料については、３、１０または２０ｕｌの溶出ＤＮＡをそれぞれのＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた。次いで、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物を２３回のＰＣＲサイクルに供し、生成されたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ３３００蛍光分光計を使用して、ピコグリーンを用い三連で測定した。（Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積）％＝（電気泳動図のテロメア長分布スメアピーク下の面積／電気泳動図の低分子量マーカーピーク下のピーク面積）＊１００。平均テロメア長（ＭＴＬ）は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）内のスメア解析ツールを使用して、それぞれのＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物三連について計算した。
【図20】ＤＮＡ ＩＱ Ｃａｓｅｗｏｒｋ Ｐｒｏキットを使用するＤＮＡクリーンアップと正規化手順の再現性試験を示す図である。（ａ）２００、５００または１０００ｎｇのＤＮＡをＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジに加えた。それぞれのＤＮＡ量の精製は４回実施した。ＤＮＡを８０ｕｌ溶出バッファーに溶出させた。１２ｕｌの溶出ＤＮＡを三連のＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加え、２３回のＰＣＲサイクルに供した。ＰＣＲ産物をフラグメントアナライザーで展開し、検出した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ３３００蛍光分光計を使用して、ピコグリーンを用い三連で測定した。（Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積）％＝（電気泳動図のテロメア長分布スメアピーク下の面積／電気泳動図の低分子量マーカーピーク下のピーク面積）＊１００。平均テロメア長（ＭＴＬ）は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）内のスメア解析ツールを使用して、それぞれのＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物三連について計算した。変動係数（ＣＶ％）は、式ＣＶ％＝（ＳＤ／ＭＴＬ）＊１００を使用して計算した。（ｂ）個々のＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物から生成されたテロメア長分布スメアから計算した平均テロメア長の比較を示す。変動係数は、（ａ）と同様の方法で計算した。
【図21-1】ＣＬＬ患者の乾燥血液から抽出したＤＮＡのＦＴＡ ＳＴＥＬＡ解析を示す図である。（ａ）ＤＮＡは、それぞれの患者の１２５ｕｌ血液で飽和させたＦＴＡカードサンプリング領域、または血液を含有していないＦＴＡカードサンプリング領域（陰性対照）の２つの３ｍｍパンチから抽出した。このパンチをＣａｓｅｗｏｒｋ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で振盪させながら（１４００ｒｐｍ）６５℃で１時間インキュベートし、その後、ＤＮＡを、ＬＥＶ血液カートリッジを使用して、溶出させた細胞溶解産物から抽出した。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ３３００蛍光分光計を使用して測定した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲは、反応物当たり３ｕｌのＤＮＡを使用して実施した。生成されたＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザーを使用して、キャピラリー電気泳動によって展開した。平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）内のスメア解析ツールを使用して、それぞれのレーンについて計算した。正規化ｔｅｌピーク面積％は、式（ｔｅｌピーク面積／低分子量マーカーピーク面積）×１００を使用して計算した。ピーク面積は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアで明示される。（ｂ）溶出された細胞溶解産物由来のＤＮＡを、ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏカートリッジを使用して抽出する以外は（ａ）の方法を繰り返した。（ｃ）（ｂ）の方法を、回収された２６名のＣＬＬ患者血液試料について繰り返した。また、ＳＴＥＬＡもこれらの患者について実施し、２つの解析方法によって計算されたＭＴＬを比較した。
【図21-2】同上。
【発明を実施するための形態】
【0051】
表－１。オリゴヌクレオチドのリスト。
【0052】
表－２。ＨＴ－ＳＴＥＬＡに関する変動係数解析。３０ｎｇのＭＲＣ５ ｃｌ５．ＤＮＡを９５のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２３回のＰＣＲサイクルに供した。得られたＰＣＲ産物を電気泳動にかけ、独立して３回フラグメントアナライザーで検出した。平均ＸｐＹｐテロメア長は、各々のアレルの後、低分子量および高分子量アレルについて測定した。９５のそれぞれのＰＣＲ反応物について、フラグメントアナライザーでのそれぞれのアッセイ後の平均ＸｐＹｐテロメア長測定値間の変動を、式ＣＶ％＝ＳＤ／平均ＭＴＬを使用して決定した。これは、低分子量および高分子量アレルについて実施した。
【0053】
材料および方法
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、Ｗｉｓｔａｒ研究所（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｗｉｓｔａｒ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｉｔｈｍａｎ）のＨ．Ｒｅｉｔｈｍａｎおよび国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から得たヒトＤＮＡ配列に基づいて設計した。オリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。この試験で使用したすべてのプライマーを表１に示す。
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、Ｗｉｓｔａｒ研究所（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｗｉｓｔａｒ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｉｔｈｍａｎ）のＨ．Ｒｅｉｔｈｍａｎおよび国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から得たヒトＤＮＡ配列に基づいて設計した。オリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。この試験で使用したすべてのプライマーを表１に示す。
【0054】
ＣＬＬ細胞の単離
ＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞は、ＭＡＣＳ全血ＣＤ１９マイクロビーズを使用して単離した。２×１０６個の白血球を含有する全血の量を採取し、１×ＰＢＳで１０００ｕｌにした。次いで、２０ｕｌのＭＡＣＳ全血マイクロビーズを添加し、その後、完全混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、血液サンプルをＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に充填し、ＣＤ１９＋細胞を、ｐｏｓｓｅｌｗｂプログラムを使用して確実に選択した。
ＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞は、ＭＡＣＳ全血ＣＤ１９マイクロビーズを使用して単離した。２×１０６個の白血球を含有する全血の量を採取し、１×ＰＢＳで１０００ｕｌにした。次いで、２０ｕｌのＭＡＣＳ全血マイクロビーズを添加し、その後、完全混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、血液サンプルをＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に充填し、ＣＤ１９＋細胞を、ｐｏｓｓｅｌｗｂプログラムを使用して確実に選択した。
【0055】
ＤＮＡ抽出
Ｍａｘｗｅｌｌ
ゲノムＤＮＡは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ ＬＥＶ ＤＮＡ－ＩＱ ＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＭａｘｗｅｌｌ １６装置と共に使用し、細胞ペレットから抽出した。細胞融解は、少なくとも１時間５６℃で、細胞ペレットを４００μｌ溶解バッファーおよび１０μｌのプロテイナーゼＫと共にインキュベーションすることによって行った。次いで、細胞溶解産物をカートリッジに充填し、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置に入れた。ＬＥＶハードウェアによるフォレンジックモードを実行し、細胞溶解産物からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、４０μｌの溶出バッファーに溶出させた。
Ｍａｘｗｅｌｌ
ゲノムＤＮＡは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ ＬＥＶ ＤＮＡ－ＩＱ ＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＭａｘｗｅｌｌ １６装置と共に使用し、細胞ペレットから抽出した。細胞融解は、少なくとも１時間５６℃で、細胞ペレットを４００μｌ溶解バッファーおよび１０μｌのプロテイナーゼＫと共にインキュベーションすることによって行った。次いで、細胞溶解産物をカートリッジに充填し、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置に入れた。ＬＥＶハードウェアによるフォレンジックモードを実行し、細胞溶解産物からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、４０μｌの溶出バッファーに溶出させた。
【0056】
フェノール／クロロホルム
３×１０６個を超える細胞を含有する細胞ペレットからのゲノムＤＮＡは、標準のフェノール／クロロホルム抽出によって抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。簡単に説明すると、細胞を、３０μｇのＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ；ストック１０ｍｇ／ｍｌ）および６０μｇのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ；ストック２０ｍｇ／ｍｌ）を含有する３００～５００μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、０．５％ ＳＤＳ）中にて４５℃で一晩溶解した。短時間遠心分離した後に、３００～５００μｌのフェノール／クロロホルムを細胞溶解産物に添加し、室温で２０分間回転した。混合物を５分間、１３０００ｒｐｍの遠心分離にかけて相を分離させ、水性相と相間相を除去し、３００μｌのフェノール／クロロホルムを含有するエッペンドルフに加えた。これを再度２０分間回転させ、次いで、５分間、遠心分離にかけた（１３０００ｒｐｍ）。水相を除去し、これに、３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．３（Ｓｉｇｍａ）および９００μｌの氷冷１００％エタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。混合物を少なくとも１時間、－２０℃で静置した。短時間遠心分離した後に（１３０００ｒｐｍ、１分）、ＤＮＡペレットを７０％氷冷エタノールで洗浄し、マイクロフローフード中で風乾した。次いで、ＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８に再懸濁させた。
３×１０６個を超える細胞を含有する細胞ペレットからのゲノムＤＮＡは、標準のフェノール／クロロホルム抽出によって抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。簡単に説明すると、細胞を、３０μｇのＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ；ストック１０ｍｇ／ｍｌ）および６０μｇのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ；ストック２０ｍｇ／ｍｌ）を含有する３００～５００μｌの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、０．５％ ＳＤＳ）中にて４５℃で一晩溶解した。短時間遠心分離した後に、３００～５００μｌのフェノール／クロロホルムを細胞溶解産物に添加し、室温で２０分間回転した。混合物を５分間、１３０００ｒｐｍの遠心分離にかけて相を分離させ、水性相と相間相を除去し、３００μｌのフェノール／クロロホルムを含有するエッペンドルフに加えた。これを再度２０分間回転させ、次いで、５分間、遠心分離にかけた（１３０００ｒｐｍ）。水相を除去し、これに、３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．３（Ｓｉｇｍａ）および９００μｌの氷冷１００％エタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。混合物を少なくとも１時間、－２０℃で静置した。短時間遠心分離した後に（１３０００ｒｐｍ、１分）、ＤＮＡペレットを７０％氷冷エタノールで洗浄し、マイクロフローフード中で風乾した。次いで、ＤＮＡを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８に再懸濁させた。
【0057】
ＤＮＡの定量
ＤＮＡ濃度は、以前開示されているＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８蛍光測定法（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）により、またはＮａｎｏｄｒｏｐ ３３００蛍光分光計（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することにより、三連で測定した。簡単に説明すると、等量のＱｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２倍稀釈液とＤＮＡを混合し、５分間、室温でインキュベートした。２ｕｌを台座に載せ、蛍光を測定した。次いで、蛍光測定値は、既知の量のＤＮＡを使用し構築した標準曲線を用いて、ＤＮＡ濃度に変換した。
ＤＮＡ濃度は、以前開示されているＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８蛍光測定法（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）により、またはＮａｎｏｄｒｏｐ ３３００蛍光分光計（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することにより、三連で測定した。簡単に説明すると、等量のＱｕａｎｔ－ｉＴ Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２倍稀釈液とＤＮＡを混合し、５分間、室温でインキュベートした。２ｕｌを台座に載せ、蛍光を測定した。次いで、蛍光測定値は、既知の量のＤＮＡを使用し構築した標準曲線を用いて、ＤＮＡ濃度に変換した。
【0058】
ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ
ＤＮＡを、２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）中で２５０ｐｇ／μｌに希釈した。複数の１０μｌ反応物を、１×Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０）（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テロメア特異的プライマー（０．５μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．５μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料ごとに（典型的には６試料）１０：１の比でセットアップした。１μｌ ＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物（２５０ｐｇ）を各反応物に添加した。次いで、これらの反応物を次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（８分）で２２サイクルを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーにおいてサイクルを実施した。
ＤＮＡを、２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）中で２５０ｐｇ／μｌに希釈した。複数の１０μｌ反応物を、１×Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０）（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テロメア特異的プライマー（０．５μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．５μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料ごとに（典型的には６試料）１０：１の比でセットアップした。１μｌ ＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物（２５０ｐｇ）を各反応物に添加した。次いで、これらの反応物を次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（８分）で２２サイクルを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーにおいてサイクルを実施した。
【0059】
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ
ＤＮＡを、２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）中で１０ｎｇ／μｌに希釈した。複数の３０ｕｌ反応物を、１×Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テロメア特異的プライマー（０．２μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．２μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料ごとに（典型的には３～５試料）１０：１の比でセットアップした。３μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物（３０ｎｇ）を各反応物に添加した。次いで、これらの反応物は、次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（５分）の２３サイクルを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーにおいてサイクルを実施した。
ＤＮＡを、２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）中で１０ｎｇ／μｌに希釈した。複数の３０ｕｌ反応物を、１×Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、テロメア特異的プライマー（０．２μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．２μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料ごとに（典型的には３～５試料）１０：１の比でセットアップした。３μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物（３０ｎｇ）を各反応物に添加した。次いで、これらの反応物は、次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（５分）の２３サイクルを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーにおいてサイクルを実施した。
【0060】
ゲル電気泳動
ＤＮＡ断片は、循環冷却系によって４℃に冷却された１×ＴＡＥ中に浸漬した長さ４０ｃｍの０．５％Ｔｒｉｓ－アセテート－ＥＤＴＡアガロースゲルを使用して展開した。１×フィコールベースのローディング色素（５％ブロモフェノールブルー、５％キシレン、１５％フィコール）を含有する４ｕｌのＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物をゲルに充填し、１６時間、１２０Ｖでゲルの距離を電気泳動させた。
ＤＮＡ断片は、循環冷却系によって４℃に冷却された１×ＴＡＥ中に浸漬した長さ４０ｃｍの０．５％Ｔｒｉｓ－アセテート－ＥＤＴＡアガロースゲルを使用して展開した。１×フィコールベースのローディング色素（５％ブロモフェノールブルー、５％キシレン、１５％フィコール）を含有する４ｕｌのＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物をゲルに充填し、１６時間、１２０Ｖでゲルの距離を電気泳動させた。
【0061】
キャピラリー電気泳動
３０ｕｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、９６ウェルプレート（試料プレート）に、１ウェル中７５ｂｐ～１５ｋｂのラダーと共にロードした。すべてのウェル中に低分子量マーカー（４００ｂｐ）および高分子量マーカー（１５ｋｂ）マーカーをあわせたものが２２ｕｌ入っている別の９６ウェルプレート（マーカープレート）にもロードした。両プレートを、１．１ｍｌの１×インレットバッファーが入ったディープ９６ウェルプレートと共に、フラグメントアナライザーに入れた。次いで、マーカーＤＮＡ断片およびＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ断片の両方を、次の条件：プレラン（６ｋＶ、３０秒）、マーカー注入（１ｋＶ、１０秒）、試料注入（４ｋＶ、５０秒）、分離（６ｋＶ、１２０分）を使用し、０．００１×インターカレートゲルを含有するＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡゲルを通して展開した。
３０ｕｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、９６ウェルプレート（試料プレート）に、１ウェル中７５ｂｐ～１５ｋｂのラダーと共にロードした。すべてのウェル中に低分子量マーカー（４００ｂｐ）および高分子量マーカー（１５ｋｂ）マーカーをあわせたものが２２ｕｌ入っている別の９６ウェルプレート（マーカープレート）にもロードした。両プレートを、１．１ｍｌの１×インレットバッファーが入ったディープ９６ウェルプレートと共に、フラグメントアナライザーに入れた。次いで、マーカーＤＮＡ断片およびＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ断片の両方を、次の条件：プレラン（６ｋＶ、３０秒）、マーカー注入（１ｋＶ、１０秒）、試料注入（４ｋＶ、５０秒）、分離（６ｋＶ、１２０分）を使用し、０．００１×インターカレートゲルを含有するＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡゲルを通して展開した。
【0062】
サザンブロッティング
展開したＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物を６分間、脱プリンバッファー（０．２５Ｍ ＨＣｌ）中で２回ゲル洗浄することによって脱プリン化した。すすいだ後、次いで、ゲルを１５分間、変性バッファー（１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ）で洗浄した。その後、ＤＮＡを、４～６時間、変性バッファーを用いるアルカリ性サザンブロッティングによって正荷電膜（Ｈｙｂｏｎｄ ＸＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に移した。
展開したＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物を６分間、脱プリンバッファー（０．２５Ｍ ＨＣｌ）中で２回ゲル洗浄することによって脱プリン化した。すすいだ後、次いで、ゲルを１５分間、変性バッファー（１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ ＮａＯＨ）で洗浄した。その後、ＤＮＡを、４～６時間、変性バッファーを用いるアルカリ性サザンブロッティングによって正荷電膜（Ｈｙｂｏｎｄ ＸＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に移した。
【0063】
プローブ標識およびハイブリダイゼーション
プローブ合成
ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の２５ｎｇプローブＤＮＡおよびラダー（１ｋｂ：２．５ｋｂは１：１）を、Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ ＤＮＡ標識ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し標識した。このキットは、［α－３３Ｐ］ｄＣＴＰで標識されているランダムヘキサプリン（ｈｅｘａｐｒｉｍｅ）を使用し、標識プローブを生成する。
プローブ合成
ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）中の２５ｎｇプローブＤＮＡおよびラダー（１ｋｂ：２．５ｋｂは１：１）を、Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ ＤＮＡ標識ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し標識した。このキットは、［α－３３Ｐ］ｄＣＴＰで標識されているランダムヘキサプリン（ｈｅｘａｐｒｉｍｅ）を使用し、標識プローブを生成する。
【0064】
ハイブリダイゼーション
ブロッティングした後、膜をＨ２Ｏですすぎ、その後、チャーチバッファー（０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（１Ｍリン酸水素二ナトリウムおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、７％ＳＤＳ、ｐＨ７．２）中で１５分間、プレハイブリダイゼーションを行った。放射性標識プローブ２５μｌをハイブリダイゼーションボトルに加え、次いで、これを６０℃で一晩静置し、ハイブリダイズさせた。
ブロッティングした後、膜をＨ２Ｏですすぎ、その後、チャーチバッファー（０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（１Ｍリン酸水素二ナトリウムおよび１Ｍリン酸二水素ナトリウム）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、７％ＳＤＳ、ｐＨ７．２）中で１５分間、プレハイブリダイゼーションを行った。放射性標識プローブ２５μｌをハイブリダイゼーションボトルに加え、次いで、これを６０℃で一晩静置し、ハイブリダイズさせた。
【0065】
未結合プローブの除去
未結合プローブを除去するため、膜を６０℃で数回、０．１×塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて洗浄した。次いで、洗浄したブロットを６０℃で約３０分間、ハイブリダイゼーションオーブンで乾燥させた。
未結合プローブを除去するため、膜を６０℃で数回、０．１×塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて洗浄した。次いで、洗浄したブロットを６０℃で約３０分間、ハイブリダイゼーションオーブンで乾燥させた。
【0066】
放射性標識ブロットの可視化
放射性標識したサザンブロットを、２４時間、ホスホイメージャースクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を備えたカセットに置いた。次いで、ホスホイメージャースクリーンを、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してスキャンした。
放射性標識したサザンブロットを、２４時間、ホスホイメージャースクリーン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を備えたカセットに置いた。次いで、ホスホイメージャースクリーンを、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してスキャンした。
【0067】
ＤＮＡテンプレート消化
末梢血は、接触活性化ランセット（ＢＤ）を使用して健常者から得た。ＤＮＡは、ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジを使用して末梢血試料（３００μｌ）から直接抽出し、５０μｌ溶出バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶出させた。抽出したＤＮＡは、ＥｃｏＲ１を使用して消化した。簡単に説明すると、１７．３μｌのＤＮＡを、ＲＥ １×バッファー、アセチル化ＢＳＡ（１ｕｇ／μｌ）およびＥｃｏＲ１制限酵素（５Ｕ）を含有する２０μｌ反応物に加えた。次いで、反応物を２時間３７℃でインキュベートし、続いて６５℃で５分間インキュベートして制限酵素を加熱不活性化した。消化後、次いで、ＮａｎｏＤｒｏｐ ３３００蛍光分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、約１０ｎｇ／ｕｌに希釈した。
末梢血は、接触活性化ランセット（ＢＤ）を使用して健常者から得た。ＤＮＡは、ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジを使用して末梢血試料（３００μｌ）から直接抽出し、５０μｌ溶出バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶出させた。抽出したＤＮＡは、ＥｃｏＲ１を使用して消化した。簡単に説明すると、１７．３μｌのＤＮＡを、ＲＥ １×バッファー、アセチル化ＢＳＡ（１ｕｇ／μｌ）およびＥｃｏＲ１制限酵素（５Ｕ）を含有する２０μｌ反応物に加えた。次いで、反応物を２時間３７℃でインキュベートし、続いて６５℃で５分間インキュベートして制限酵素を加熱不活性化した。消化後、次いで、ＮａｎｏＤｒｏｐ ３３００蛍光分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、約１０ｎｇ／ｕｌに希釈した。
【0068】
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ
２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを、それぞれ消化したＤＮＡに加えた。３つの３０ｕｌ反応物を、１× Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＸｐＹｐＣプライマー（０．２μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．２μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料につき１０：１の比率でセットアップした。２μｌまたは３μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物のいずれかを、それぞれの反応物に加えた。次いで、これらの反応物を、次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（５分）の２１、２２または２３サイクルを使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーでサイクルを実施した。
２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを、それぞれ消化したＤＮＡに加えた。３つの３０ｕｌ反応物を、１× Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＸｐＹｐＣプライマー（０．２μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．２μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料につき１０：１の比率でセットアップした。２μｌまたは３μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物のいずれかを、それぞれの反応物に加えた。次いで、これらの反応物を、次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（５分）の２１、２２または２３サイクルを使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーでサイクルを実施した。
【0069】
キャピラリー電気泳動
３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、９６ウェルプレート（試料プレート）に、１ウェル中７５ｂｐ～１５ｋｂのラダーと共にロードした。低分子量マーカー（４００ｂｐ）および高分子量マーカー（１５ｋｂまたは２０ｋｂ）マーカーをあわせたものが２２ｕｌ入っている別の９６ウェルプレート（マーカープレート）にもロードした。両プレートを、１．１ｍｌの１×インレットバッファーが入ったディープ９６ウェルプレートと共に、フラグメントアナライザー（ＡＡＴＩ）に入れた。次いで、マーカーＤＮＡ断片およびＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ断片の両方を、次の条件：プレラン（６ｋＶ、３０秒）、マーカー注入（１ｋＶ、１０秒）、試料注入（４ｋＶ、７５秒）、分離（６ｋＶ、１２０分）を使用し、０．００１×インターカレートゲルを含有するＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡゲルを通して展開した。
３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、９６ウェルプレート（試料プレート）に、１ウェル中７５ｂｐ～１５ｋｂのラダーと共にロードした。低分子量マーカー（４００ｂｐ）および高分子量マーカー（１５ｋｂまたは２０ｋｂ）マーカーをあわせたものが２２ｕｌ入っている別の９６ウェルプレート（マーカープレート）にもロードした。両プレートを、１．１ｍｌの１×インレットバッファーが入ったディープ９６ウェルプレートと共に、フラグメントアナライザー（ＡＡＴＩ）に入れた。次いで、マーカーＤＮＡ断片およびＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ断片の両方を、次の条件：プレラン（６ｋＶ、３０秒）、マーカー注入（１ｋＶ、１０秒）、試料注入（４ｋＶ、７５秒）、分離（６ｋＶ、１２０分）を使用し、０．００１×インターカレートゲルを含有するＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡゲルを通して展開した。
【0070】
ＤＮＡ ＩＱシステムを使用するＤＮＡ正規化
ゲノムＤＮＡを４００μｌの溶解バッファーに直接添加し、次いで、これをＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジまたはＤＮＡ ＩＱ標準試料キットカートリッジ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にロードし、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置に置いた。ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットにおいては、ＤＮＡは、フォレンジックモードを使用し、低溶出量（ＬＥＶ）ハードウェアで抽出した。ＤＮＡは、８０μｌの溶出バッファーに溶出させた。標準試料キットにおいては、ＤＮＡは、フォレンジックモードを使用し、標準溶出量（ＳＥＶ）ハードウェアで抽出した。このキットにおいては、抽出ＤＮＡは、３００μｌ溶出バッファーへ溶出させた。
ゲノムＤＮＡを４００μｌの溶解バッファーに直接添加し、次いで、これをＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジまたはＤＮＡ ＩＱ標準試料キットカートリッジ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にロードし、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置に置いた。ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットにおいては、ＤＮＡは、フォレンジックモードを使用し、低溶出量（ＬＥＶ）ハードウェアで抽出した。ＤＮＡは、８０μｌの溶出バッファーに溶出させた。標準試料キットにおいては、ＤＮＡは、フォレンジックモードを使用し、標準溶出量（ＳＥＶ）ハードウェアで抽出した。このキットにおいては、抽出ＤＮＡは、３００μｌ溶出バッファーへ溶出させた。
【0071】
乾燥血液スポットからのＤＮＡ抽出
１２５μｌの血液をＦＴＡカード試料ターゲット上にピペットで移し、一晩静置して空気乾燥させた。２つの３ｍｍパンチを各々の乾燥血液スポットからカットし、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫおよび３６０μｌのｃａｓｅｗｏｒｋ抽出バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて振盪しながら（１４００ｒｐｍ）６５℃でインキュベートした。パンチおよび上清の両方をエッペンドルフチューブに入れたスピンバスケット（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、これを２分間１２０００ｒｐｍで遠心分離することによって、溶出された細胞溶解産物をストリッピングされたＦＴＡカードパンチから取り出した。次いで、細胞溶解産物をＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にロードし、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置に置いた。ＬＥＶハードウェアによるフォレンジックモードを実行し、細胞溶解産物からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、５０μｌ溶出バッファーに溶出させた。
１２５μｌの血液をＦＴＡカード試料ターゲット上にピペットで移し、一晩静置して空気乾燥させた。２つの３ｍｍパンチを各々の乾燥血液スポットからカットし、４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫおよび３６０μｌのｃａｓｅｗｏｒｋ抽出バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて振盪しながら（１４００ｒｐｍ）６５℃でインキュベートした。パンチおよび上清の両方をエッペンドルフチューブに入れたスピンバスケット（Ｐｒｏｍｅｇａ）に加え、これを２分間１２０００ｒｐｍで遠心分離することによって、溶出された細胞溶解産物をストリッピングされたＦＴＡカードパンチから取り出した。次いで、細胞溶解産物をＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にロードし、Ｍａｘｗｅｌｌ １６装置に置いた。ＬＥＶハードウェアによるフォレンジックモードを実行し、細胞溶解産物からＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、５０μｌ溶出バッファーに溶出させた。
【0072】
ＨＴ－ＳＴＥＬＡおよびＦＴＡ ＳＴＥＬＡ
２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを、それぞれの抽出ＤＮＡに加えた。３つの３０μｌ反応物を、１× Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０）（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＸｐＹｐＣプライマー（０．２μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．２μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料ごとに１０：１の比率でセットアップした。４μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物を各反応物に添加した。次いで、これらの反応物は、次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（５分）の２３サイクルを使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーでサイクルを実施した。
２５０ｐＭのＴｅｌ２リンカーを、それぞれの抽出ＤＮＡに加えた。３つの３０μｌ反応物を、１× Ｔａｑバッファー（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）ＳＯ４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０）（Ａｂｇｅｎｅ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ＸｐＹｐＣプライマー（０．２μＭ）、ｔｅｌテイルプライマー（０．２μＭ）、および１Ｕ Ｔａｑ／ＰＷＯ（Ａｂｇｅｎｅ／Ｒｏｃｈｅ）をそれぞれ含有する試料ごとに１０：１の比率でセットアップした。４μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物を各反応物に添加した。次いで、これらの反応物は、次の条件：９４℃（２０秒）、６５℃（３０秒）、６８℃（５分）の２３サイクルを使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）サーマルサイクラーでサイクルを実施した。
【0073】
キャピラリー電気泳動
３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、９６ウェルプレート（試料プレート）に、１ウェル中７５ｂｐ～１５ｋｂラダーと共にロードした。すべてのウェル中に低分子量マーカー（４００ｂｐ）および高分子量マーカー（１５ｋｂ）マーカーをあわせたものが２２ｕｌ入っている別の９６ウェルプレート（マーカープレート）にもロードした。両プレートを、１．１ｍｌの１×インレットバッファーが入ったディープ９６ウェルプレートと共に、フラグメントアナライザー（商標）に入れた。次いで、マーカーＤＮＡ断片およびＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ断片の両方を、次の条件：プレラン（６ｋＶ、３０秒）、マーカー注入（１ｋＶ、１０秒）、試料注入（４ｋＶ、７５秒）、分離（６ｋＶ、１２０分）を使用し、０．００１×インターカレートゲルを含有するＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡゲルを通して展開した。
３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を、９６ウェルプレート（試料プレート）に、１ウェル中７５ｂｐ～１５ｋｂラダーと共にロードした。すべてのウェル中に低分子量マーカー（４００ｂｐ）および高分子量マーカー（１５ｋｂ）マーカーをあわせたものが２２ｕｌ入っている別の９６ウェルプレート（マーカープレート）にもロードした。両プレートを、１．１ｍｌの１×インレットバッファーが入ったディープ９６ウェルプレートと共に、フラグメントアナライザー（商標）に入れた。次いで、マーカーＤＮＡ断片およびＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ断片の両方を、次の条件：プレラン（６ｋＶ、３０秒）、マーカー注入（１ｋＶ、１０秒）、試料注入（４ｋＶ、７５秒）、分離（６ｋＶ、１２０分）を使用し、０．００１×インターカレートゲルを含有するＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡゲルを通して展開した。
【0074】
統計分析
ＳＴＥＬＡバンドの定量化
Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０を使用してスキャンしたゲルは、続いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ５．０（ＧＥ）を使用し解析した。各々のＳＴＥＬＡサザンブロット上の個々のテロメア分子量は、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ １Ｄ ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用し、計算した。次いで、平均テロメア長測定値を計算した。
ＳＴＥＬＡバンドの定量化
Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０を使用してスキャンしたゲルは、続いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ５．０（ＧＥ）を使用し解析した。各々のＳＴＥＬＡサザンブロット上の個々のテロメア分子量は、Ｐｈｏｒｅｔｉｘ １Ｄ ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用し、計算した。次いで、平均テロメア長測定値を計算した。
【0075】
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ － データ解釈および統計解析
フラグメントアナライザーからのアウトプットデータは、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で見られた。データを解析する際、以下のピーク解析設定を適用した：ピーク幅－５０秒、最小のピーク高－２５ＲＦＵ、谷から谷までのベースラインなし。ベースライン設定値は、各々の試料について手動で決定した。平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア内のスメア解析機能を使用して計算した。スメア範囲は、各々の試料について手動で設定した。平均テロメア長は、各々の試料反応物セット内のすべての反応物に対するスメア解析結果から計算した。
フラグメントアナライザーからのアウトプットデータは、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で見られた。データを解析する際、以下のピーク解析設定を適用した：ピーク幅－５０秒、最小のピーク高－２５ＲＦＵ、谷から谷までのベースラインなし。ベースライン設定値は、各々の試料について手動で決定した。平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア内のスメア解析機能を使用して計算した。スメア範囲は、各々の試料について手動で設定した。平均テロメア長は、各々の試料反応物セット内のすべての反応物に対するスメア解析結果から計算した。
【0076】
結果
フラグメントアナライザー（商標）によるＳＴＥＬＡ産物の検出
ＳＴＥＬＡ ＰＣＲは、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０ ｃｌ．２）のクローン個体群から抽出したＤＮＡを使用して実施した。このＤＮＡは、ＣＬＬ患者において確認されているものと同様のＸｐＹｐでの同質テロメア長プロファイルを示すので使用した。ＸｐＹｐテロメアに関するオリジナルのＳＴＥＬＡ方法の反応条件に基づいて、２５０ｐｇのＤＮＡを３０μｌのＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に添加し、これを、６５℃のアニール温度を使用する２２回のＰＣＲサイクルに供した。各反応物４μｌを標準のＳＴＥＬＡ解析に使用し、残りのＰＣＲ産物をフラグメントアナライザー（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ；図１）を使用して展開し、検出した。オリジナルの方法では、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物は、プローブを含有する放射性標識テロメアリピートのアニーリングによって容易に検出される（図１ａ）。しかし、ＰＲＯＳｉｚｅ（商標）ソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で生成されたデジタルゲル画像から明らかなように、これらの同じＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザー（商標）で蛍光的に検出するのに十分であるほど豊富ではない（図１ｂ（ｉ））。生成されたＰＣＲ産物の電気泳動を行ったキャピラリーの１つの電気泳動図からは、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物から生成されるすべての蛍光シグナルが欠如していることがさらに確認される（図１ｂ（ｉｉ））。低分子量マーカーおよび高分子量マーカーは、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲで形成される２００ｂｐ未満の多量のアーチファクトとともにはっきりと目視される。したがって、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ条件では、テロメア長分布がキャピラリー電気泳動（フラグメントアナライザー（商標）を使用）によって確実に検出され得る改良が必要であった。
フラグメントアナライザー（商標）によるＳＴＥＬＡ産物の検出
ＳＴＥＬＡ ＰＣＲは、ＨＴ１０８０線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０ ｃｌ．２）のクローン個体群から抽出したＤＮＡを使用して実施した。このＤＮＡは、ＣＬＬ患者において確認されているものと同様のＸｐＹｐでの同質テロメア長プロファイルを示すので使用した。ＸｐＹｐテロメアに関するオリジナルのＳＴＥＬＡ方法の反応条件に基づいて、２５０ｐｇのＤＮＡを３０μｌのＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に添加し、これを、６５℃のアニール温度を使用する２２回のＰＣＲサイクルに供した。各反応物４μｌを標準のＳＴＥＬＡ解析に使用し、残りのＰＣＲ産物をフラグメントアナライザー（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ；図１）を使用して展開し、検出した。オリジナルの方法では、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物は、プローブを含有する放射性標識テロメアリピートのアニーリングによって容易に検出される（図１ａ）。しかし、ＰＲＯＳｉｚｅ（商標）ソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で生成されたデジタルゲル画像から明らかなように、これらの同じＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザー（商標）で蛍光的に検出するのに十分であるほど豊富ではない（図１ｂ（ｉ））。生成されたＰＣＲ産物の電気泳動を行ったキャピラリーの１つの電気泳動図からは、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物から生成されるすべての蛍光シグナルが欠如していることがさらに確認される（図１ｂ（ｉｉ））。低分子量マーカーおよび高分子量マーカーは、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲで形成される２００ｂｐ未満の多量のアーチファクトとともにはっきりと目視される。したがって、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ条件では、テロメア長分布がキャピラリー電気泳動（フラグメントアナライザー（商標）を使用）によって確実に検出され得る改良が必要であった。
【0077】
フラグメントアナライザー（商標）でＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物を直接的に検出する条件の改良
オリジナルのＳＴＥＬＡ条件ではフラグメントアナライザー（商標）によって検出しようとするＰＣＲ産物が十分ではなかったので、生成されるＰＣＲ産物の量を増加させ、それによってフラグメントアナライザー（商標）で測定されるシグナル強度を増加させるよう、多くの要因について最適化を行った。
オリジナルのＳＴＥＬＡ条件ではフラグメントアナライザー（商標）によって検出しようとするＰＣＲ産物が十分ではなかったので、生成されるＰＣＲ産物の量を増加させ、それによってフラグメントアナライザー（商標）で測定されるシグナル強度を増加させるよう、多くの要因について最適化を行った。
【0078】
サイクル数の増加
生成されるＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の量を増加させる最初の試みは、ＰＣＲサイクル数を増加させることであった。ＭＲＣ５繊維芽細胞クローンの個体群から抽出した２５０ｐｇのＤＮＡを複数の３０μｌのＰＣＲ反応物に加え、２２、２４、２６または２８サイクルのいずれかに供した（図２）。反応物を２２または２４回のいずれかのＰＣＲサイクルに供した場合、少量のＳＴＥＬＡ－ＰＣＲ産物が生成されたが、これらの産物の強度は、フラグメントアナライザー（商標）を使用してそれらを検出するのには十分ではなかった（図２ａおよび図２ｂ）。しかし、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応が２６回繰り返された場合、多量のＰＣＲ産物が生成され、ＳＴＥＬＡサザンブロット上でより強くハイブリダイズするバンドが生じた。これは、フラグメントアナライザー（商標）を用いて多数のバンドを検出するのに十分であった（図２ａおよび図２ｂ）。２８サイクルに供した反応物は、ＳＴＥＬＡブロットおよびフラグメントアナライザー（商標）アウトプットゲルの両方でより高い強度を示し（図２ａおよび図２ｂ）、オリジナルの方法を用いて検出したすべてのＤＮＡ断片を検出することができた。したがって、その後のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物は、２２回のサイクルではなく、２８回のサイクルを行った。
生成されるＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の量を増加させる最初の試みは、ＰＣＲサイクル数を増加させることであった。ＭＲＣ５繊維芽細胞クローンの個体群から抽出した２５０ｐｇのＤＮＡを複数の３０μｌのＰＣＲ反応物に加え、２２、２４、２６または２８サイクルのいずれかに供した（図２）。反応物を２２または２４回のいずれかのＰＣＲサイクルに供した場合、少量のＳＴＥＬＡ－ＰＣＲ産物が生成されたが、これらの産物の強度は、フラグメントアナライザー（商標）を使用してそれらを検出するのには十分ではなかった（図２ａおよび図２ｂ）。しかし、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応が２６回繰り返された場合、多量のＰＣＲ産物が生成され、ＳＴＥＬＡサザンブロット上でより強くハイブリダイズするバンドが生じた。これは、フラグメントアナライザー（商標）を用いて多数のバンドを検出するのに十分であった（図２ａおよび図２ｂ）。２８サイクルに供した反応物は、ＳＴＥＬＡブロットおよびフラグメントアナライザー（商標）アウトプットゲルの両方でより高い強度を示し（図２ａおよび図２ｂ）、オリジナルの方法を用いて検出したすべてのＤＮＡ断片を検出することができた。したがって、その後のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物は、２２回のサイクルではなく、２８回のサイクルを行った。
【0079】
代替ＸｐＹｐテロメア－隣接プライマー
ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ中に生成されるＰＣＲ産物の量を増加させるために行った別の手法は、ＰＣＲ増幅効率を増加させることであった。これを実施するために、本発明者らは、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法のテロメアＤＮＡを増幅させるために使用したテロメア隣接プライマーに注目した。ＸｐＹｐＥ２は、ＸｐＹｐテロメアの開始点から４０８ヌクレオチドに存在する。多数の同様のプライマーをこの領域の周辺で設計し、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲにおいてＸｐＹｐＥ２を置き換えて使用してＰＣＲ効率を高め、それによって、生成されるＰＣＲ産物の量を増加させようと試みた。５種類の追加プライマーを設計した（Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７）（図３ａ）。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法をこれらの各々のテロメア隣接プライマーを用いて実施したところ、すべてのテロメア隣接プライマーの中でＸｐＹｐＥ５が最も強いバンドパターンを生じ、このプライマーが最も高いＰＣＲ効率を付与することが示唆していることが明らかであった（図３ｂ）。ＰＣＲ効率におけるこの増加がフラグメントアナライザー（商標）によっても検出されるか否かを確認するため、ＸｐＹｐＥ２およびＸｐＹｐＥ５によって生成されるＰＣＲ産物の差を比較する同様の実験を実施した。ＰＲＯＳｉｚｅ（商標）ソフトウェアによって得られる相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、ＰＣＲ産物のシグナル強度を反映し、その結果、産生されるＰＣＲ産物の量を反映する。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法において確認されたように、ＸｐＹｐＥ５プライマーは、ＸｐＹｐＥ２と比べ、より効率的なＰＣＲと、より多くのＰＣＲ産物の生成をもたらす（図３ｃ）。ＸｐＹｐＥ５を使用した場合、平均相対蛍光は４３０．３単位であり、ＸｐＹｐＥ２を含有するＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応によって達成された相対蛍光（２４４．３ＲＦＵ）のほぼ２倍であった。したがって、その後のＨＴ ＳＴＥＬＡ ＰＣＲは、ＸｐＹｐＥ２に対してＸｐＹｐＥ５を使用し実施した。
ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ中に生成されるＰＣＲ産物の量を増加させるために行った別の手法は、ＰＣＲ増幅効率を増加させることであった。これを実施するために、本発明者らは、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法のテロメアＤＮＡを増幅させるために使用したテロメア隣接プライマーに注目した。ＸｐＹｐＥ２は、ＸｐＹｐテロメアの開始点から４０８ヌクレオチドに存在する。多数の同様のプライマーをこの領域の周辺で設計し、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲにおいてＸｐＹｐＥ２を置き換えて使用してＰＣＲ効率を高め、それによって、生成されるＰＣＲ産物の量を増加させようと試みた。５種類の追加プライマーを設計した（Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７）（図３ａ）。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法をこれらの各々のテロメア隣接プライマーを用いて実施したところ、すべてのテロメア隣接プライマーの中でＸｐＹｐＥ５が最も強いバンドパターンを生じ、このプライマーが最も高いＰＣＲ効率を付与することが示唆していることが明らかであった（図３ｂ）。ＰＣＲ効率におけるこの増加がフラグメントアナライザー（商標）によっても検出されるか否かを確認するため、ＸｐＹｐＥ２およびＸｐＹｐＥ５によって生成されるＰＣＲ産物の差を比較する同様の実験を実施した。ＰＲＯＳｉｚｅ（商標）ソフトウェアによって得られる相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、ＰＣＲ産物のシグナル強度を反映し、その結果、産生されるＰＣＲ産物の量を反映する。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法において確認されたように、ＸｐＹｐＥ５プライマーは、ＸｐＹｐＥ２と比べ、より効率的なＰＣＲと、より多くのＰＣＲ産物の生成をもたらす（図３ｃ）。ＸｐＹｐＥ５を使用した場合、平均相対蛍光は４３０．３単位であり、ＸｐＹｐＥ２を含有するＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応によって達成された相対蛍光（２４４．３ＲＦＵ）のほぼ２倍であった。したがって、その後のＨＴ ＳＴＥＬＡ ＰＣＲは、ＸｐＹｐＥ２に対してＸｐＹｐＥ５を使用し実施した。
【0080】
投入ＤＮＡ量の増加
サイクル数の増加およびテロメア隣接プライマーの変更に加えて、ＰＣＲ産物のシグナル強度を増加させるために行った別の手法は、各々のＳＴＥＬＡ－ＰＣＲ反応での投入ＤＮＡ量を増加させることであった。この手法の目標は２通りであった。より容易な蛍光検出を可能にするより多くのＰＣＲ産物を生成するということだけでなく、バンドパターンとは対照的なテロメア長分布「スメア」を生成するということも試みた。テロメア長分布スメアが有益である理由は多数ある：ＰＲＯＳｉｚｅ（商標）ソフトウェア内のデータ解析において人間が介入する必要がほとんどないため、平均テロメア長の解析をより迅速に行うことができる；試料当たりの反応物がより少量ですむ；それによって、産物の全量が増加し、存在する非特異的バックグラウンドバンドがサイジング解析に組み込まれないことが確実である。
サイクル数の増加およびテロメア隣接プライマーの変更に加えて、ＰＣＲ産物のシグナル強度を増加させるために行った別の手法は、各々のＳＴＥＬＡ－ＰＣＲ反応での投入ＤＮＡ量を増加させることであった。この手法の目標は２通りであった。より容易な蛍光検出を可能にするより多くのＰＣＲ産物を生成するということだけでなく、バンドパターンとは対照的なテロメア長分布「スメア」を生成するということも試みた。テロメア長分布スメアが有益である理由は多数ある：ＰＲＯＳｉｚｅ（商標）ソフトウェア内のデータ解析において人間が介入する必要がほとんどないため、平均テロメア長の解析をより迅速に行うことができる；試料当たりの反応物がより少量ですむ；それによって、産物の全量が増加し、存在する非特異的バックグラウンドバンドがサイジング解析に組み込まれないことが確実である。
【0081】
ＤＮＡ量滴定を使用し、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応に加えるＤＮＡの最適量を決定した。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法においては、濃縮ストックＤＮＡ試料から１０ｎｇ／μｌ希釈液が調製される。１μｌ（１０ｎｇ）をこの希釈液から取り出し、ｔｅｌ２リンカーオリゴヌクレオチドを含有する４０μｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）に加えた。次いで、このＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物の１μｌ（２５０ｐｇ）を各ＰＣＲ反応物に加えた。フラグメントアナライザー（商標）では、この手法によって、２８回のＰＣＲサイクル後にのみ、かすかなバンドパターンが得られた（図２ｂ）。フラグメントアナライザー（商標）を使用してスメアとしてテロメア長分布を検出できるようにするため、ＤＮＡ量を増加させてＤＮＡ ｔｅｌ２混合物に加えた。詳細に述べると、５０ｎｇ／μｌ稀釈液をストックＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡから調製した。この希釈液の１μｌ（５０ｎｇ）、５μｌ（２５０ｎｇ）または１０μｌ（５００ｎｇ）をＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物に加えた。これらのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物の１μｌを、複数の３０μｌ ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加え、最終濃度がそれぞれ１．２５、６．２５および１２．５ｎｇ／反応物となるようにした。生成されたＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物をフラグメントアナライザー（商標）によって展開、検出したところ、３つのすべての投入ＤＮＡ量が可視性テロメア長分布スメアを生じた（図４ａ）。
【0082】
ＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＸｐＹｐテロメア長分布は同質である。ＣＬＬ患者由来のＸｐＹｐテロメア長分布が同質であることもまた予想されるが、ＳＴＥＬＡによるＸｐＹｐテロメア長分布がＣＬＬ患者のパネルで研究された以前の研究では、テロメア長の異質性が患者間で多少変動することが明らかであった。したがって、ＨＴ１０８０ ｃｌ２などの同質のテロメア長分布に対しテロメア長分布スメアを作成する投入ＤＮＡの量は、より異質なＸｐＹｐテロメア長分布を示す試料でスメアを必ずしも生じさせるものではない。このことを試験するため、異質性ＸｐＹｐテロメア長分布を示すＣＬＬ患者（４４０８）由来のＤＮＡ試料を選択した。この患者由来のＤＮＡを、１．２５～４７．５ｎｇ／反応物の範囲の投入ＤＮＡ滴定に使用した（図４ｂ）。ＨＴ１０８０ ｃｌ２細胞群においてテロメア長分布スメアを生じた投入ＤＮＡ量は、患者４４０８に対して同様のスメアは生成せず、代わりに、明確なバンドパターンが確認された。反応物中のＤＮＡ量が２５ｎｇ以上のＤＮＡに増加された場合、テロメア長分布は、このＣＬＬ試料においてスメアとして展開された（図４ｂ）；このスメアはシグナルが強く頑健であり、再現可能であった。
【0083】
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物中のプライマー濃度の減少
多くの他の要因を、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物のシグナル強度を高めるため変更した。これらは、さらにＰＣＲ反応量を増加させること、ＰＣＲ反応物を希釈すること、ＭｇＣｌ２濃度を変化させること、およびＴａｑポリメラーゼを変更することを含んでいる（図１５）。これらの変更はいずれもフラグメントアナライザー（商標）でのＰＣＲ産物の相対蛍光を増加させなかったが、ＰＣＲ反応物中のプライマー濃度を減少させるとＰＣＲ産物の形成が増加した。オリジナルのＳＴＥＬＡ反応条件において、最終プライマー濃度は０．５μＭである。プライマー滴定は、０．２、０．５および０．８μＭのプライマー濃度を使用して実施した。各々の反応物セットによって得られた平均相対蛍光を比較した場合、０．２μＭのＸｐＹｐＥ５およびｔｅｌテイルを含有する反応物が０．５および０．８μＭプライマーを含有する反応物よりも多くのＰＣＲ産物を生成することが明らかであった（図５ａ）。プライマー濃度が減少した場合にＰＣＲ産物形成の増加が確認されたので、プライマー滴定をさらに拡大し、より低いプライマー濃度を組み入れた（０．０５～０．２μＭ）。しかし、プライマー濃度をさらに減少させた場合、ＰＣＲ産物の形成は増加しなかった。０．１μＭ ＸｐＹｐＥ５およびｔｅｌテイルを含有したＰＣＲ反応物は、０．２μＭのプライマーを含有する反応物と同様のレベルでＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物の形成は、プライマー濃度が０．１μＭ未満に減少するにつれて低下し始めた（図５ｂ）。したがって、その後のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応は、０．２μＭのＸｐＹｐＥ５濃度およびｔｅｌテイル濃度で実施した。
多くの他の要因を、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物のシグナル強度を高めるため変更した。これらは、さらにＰＣＲ反応量を増加させること、ＰＣＲ反応物を希釈すること、ＭｇＣｌ２濃度を変化させること、およびＴａｑポリメラーゼを変更することを含んでいる（図１５）。これらの変更はいずれもフラグメントアナライザー（商標）でのＰＣＲ産物の相対蛍光を増加させなかったが、ＰＣＲ反応物中のプライマー濃度を減少させるとＰＣＲ産物の形成が増加した。オリジナルのＳＴＥＬＡ反応条件において、最終プライマー濃度は０．５μＭである。プライマー滴定は、０．２、０．５および０．８μＭのプライマー濃度を使用して実施した。各々の反応物セットによって得られた平均相対蛍光を比較した場合、０．２μＭのＸｐＹｐＥ５およびｔｅｌテイルを含有する反応物が０．５および０．８μＭプライマーを含有する反応物よりも多くのＰＣＲ産物を生成することが明らかであった（図５ａ）。プライマー濃度が減少した場合にＰＣＲ産物形成の増加が確認されたので、プライマー滴定をさらに拡大し、より低いプライマー濃度を組み入れた（０．０５～０．２μＭ）。しかし、プライマー濃度をさらに減少させた場合、ＰＣＲ産物の形成は増加しなかった。０．１μＭ ＸｐＹｐＥ５およびｔｅｌテイルを含有したＰＣＲ反応物は、０．２μＭのプライマーを含有する反応物と同様のレベルでＰＣＲ産物を生成した。ＰＣＲ産物の形成は、プライマー濃度が０．１μＭ未満に減少するにつれて低下し始めた（図５ｂ）。したがって、その後のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応は、０．２μＭのＸｐＹｐＥ５濃度およびｔｅｌテイル濃度で実施した。
【0084】
フラグメントアナライザー（商標）を使用する平均テロメア長サイジング精度の最適化
フラグメントアナライザー（商標）で検出される頑健で再現可能なテロメア長分布スメアを得るための条件を最適化したら、次にＨＴ－ＳＴＥＬＡ技術のサイジング精度をオリジナルのＳＴＥＬＡ方法と比較した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡおよびＳＴＥＬＡは、ＣＬＬ試料のパネル、ならびに、ＨＴ１０８０（ｃｌ５）細胞株およびＭＲＣ５（ｃｌ５）細胞株のクローン個体群に対して実施した（図６）。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法は、平均テロメア長と、試料間のＸｐＹｐテロメア長分布の異質性のレベルの両方において、予想した高い変動性を示した（図６ａ）。ＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡの有用な特徴は、二頂性のＸｐＹｐテロメア長分布を示したことであり（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）、２つのアレルについてのテロメア長分布を個別に増幅し展開することが成功するかどうかの判定において、フラグメントアナライザー（商標）の展開試験を提供した（図６ａ）。
フラグメントアナライザー（商標）で検出される頑健で再現可能なテロメア長分布スメアを得るための条件を最適化したら、次にＨＴ－ＳＴＥＬＡ技術のサイジング精度をオリジナルのＳＴＥＬＡ方法と比較した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡおよびＳＴＥＬＡは、ＣＬＬ試料のパネル、ならびに、ＨＴ１０８０（ｃｌ５）細胞株およびＭＲＣ５（ｃｌ５）細胞株のクローン個体群に対して実施した（図６）。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法は、平均テロメア長と、試料間のＸｐＹｐテロメア長分布の異質性のレベルの両方において、予想した高い変動性を示した（図６ａ）。ＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡの有用な特徴は、二頂性のＸｐＹｐテロメア長分布を示したことであり（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）、２つのアレルについてのテロメア長分布を個別に増幅し展開することが成功するかどうかの判定において、フラグメントアナライザー（商標）の展開試験を提供した（図６ａ）。
【0085】
ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ産物の定量は、Ｐｈｏｒｅｔｉｘソフトウェアを使用して実施し（図６ｃ；ＮｏｎＬｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、平均テロメア長の計算により、１．２９ｋｂ（ＣＬＬ試料４０６５）から８．５９８ｋｂ（ＣＬＬ試料４５２１）まで変動したことが明らかになった（図６ｃ）。試料の同じパネルを、新たに最適化した条件を使用したＨＴ－ＳＴＥＬＡによって解析した場合、すべての試料についてテロメア長分布スメアが生成された。しかし、テロメア長分布スメアの強度は試料間で異なり、反応物セット間におけるＰＣＲ効率の差が示唆された（図６ｂ）。これに関する１つの解釈としては、ＰＣＲ産物形成におけるこの変動が各々の反応物セットに対する投入ＤＮＡ量の差に起因し得るという可能性があったことである。しかし、反応物当たりの投入ＤＮＡ量を比較した場合、これは、フラグメントアナライザー（商標）アウトプットゲル上で確認されたシグナル強度の差とは相関していない（図６ｂ）。別の解釈としては、パネルのＤＮＡ試料が、ＰＣＲ産物形成に影響を及ぼし得る異なるレベルのＰＣＲ阻害物質を含有し得る可能性があるということである。
【0086】
ＨＴ－ＳＴＥＬＡとオリジナルのＳＴＥＬＡ方法との相関は絶対ではなく、実際、最適な関係は線形ではなかった（Ｒ２＝０．８３；図６ｃ）。結果を図６ｃにまとめている。特にＣＬＬ試料４５２１の場合のような長いテロメアに関して、平均テロメア長測定における大きな不一致がＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡの間に存在することが明らかであった（図６）。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法では、ＨＴ１０８０ ｃｌ５ ＸｐＹｐテロメアは同質のテロメア長分布を示したが、この同じＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡによって解析した場合、弱いけれどもかなり異質な分布が存在することが明らかであった（図６ａ～図６ｂ）。さらに、ＭＲＣ５ ｃｌ５は、明瞭な二頂性のＸｐＹｐテロメア長分布を示す（図６ａ）。しかし、ＨＴ－ＳＴＥＬＡによる解析では、アウトプットゲルで低分子量アレルのテロメアアレルのみが検出される。したがって、この試料について平均テロメア長を測定した場合、低分子量アレルのみが示された。平均テロメア長は、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）内のスメア解析機能によって測定した。全体として、これらの不一致は、ＨＴ－ＳＴＥＬＡによって測定した場合、平均で８９２ｂｐまでテロメア長が小さく評価された。これは、予後判定の設定においてこの技術を使用する場合に問題となる。
【0087】
フラグメントアナライザー（商標）でＨＴ－ＳＴＥＬＡを使用してテロメア長分布を検出する能力は大幅に改良されたが、より長いテロメア長分布の喪失に対処する必要がある。正確に予後判定するためには、平均テロメア長を迅速に、しかし正確に決定する必要があり、したがって、ＨＴ－ＳＴＥＬＡの精度を改良するためのステップが取られた。
【0088】
サイクル滴定
１０．０６ｎｇ、２０．１２ｎｇまたは３０．１８ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．５ ＤＮＡを含有するＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物が２２～２８回のサイクルで繰り返されるサイクル滴定を実施した（図７ａ）。生成された産物サイズの異質性はＰＣＲサイクルの回数に依存することが明白であった。３セットすべてのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を２２回のＰＣＲサイクルに供した場合、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法によって測定された平均テロメア長に非常に類似した平均テロメア長（５．８２２ｋｂ）の同質テロメア長分布が確認された（図６ａ）。２４サイクルのＰＣＲでは、１０．０６ｎｇ、２０．１２ｎｇまたは３０．１８ｎｇの反応物セットに対して、それぞれ２６３ｂｐ、２６４ｂｐおよび３６５ｂｐの平均断片長の減少が生じた（図７ａ）。さらにＰＣＲサイクル数を増加させた場合、平均テロメア長にさらに大幅な減少が生じ、２８回のＰＣＲサイクル後、１μｌ、２μｌおよび３μｌの反応物セットは、ＰＣＲ反応が２２回繰り返された場合よりも小さい１．７４１ｋｂ １．６５９ｋｂおよび２．０７９ｋｂの平均テロメア長測定値を有していた。フラグメントアナライザー（商標）アウトプットゲルから、３つのすべての反応物セットにおいて、テロメア長分布スメアは、より小さなＰＣＲ産物の数が増加して生成されるにつれて下方に拡大され、これが平均テロメア長で著しく小さく評価されたことを引き起こしたことは明らかである。図７で確認された２８回のＰＣＲサイクル後の平均テロメア長測定値は、ＣＬＬ４パネルと共に測定した際のＨＴ１０８０ ｃｌ．５の平均テロメア長測定値（３．６１８ｋｂ）に非常に似ていた（図６ｃ）。これが、前に試験した試料のパネルＣＬＬで確認された平均テロメア長測定値の不正確であったことの原因であり得ることが、このことから示唆される（図６）。これらのデータは、サイクル数が多い非テロメア産物の増幅と一致している。
１０．０６ｎｇ、２０．１２ｎｇまたは３０．１８ｎｇのＨＴ１０８０ ｃｌ．５ ＤＮＡを含有するＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物が２２～２８回のサイクルで繰り返されるサイクル滴定を実施した（図７ａ）。生成された産物サイズの異質性はＰＣＲサイクルの回数に依存することが明白であった。３セットすべてのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を２２回のＰＣＲサイクルに供した場合、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法によって測定された平均テロメア長に非常に類似した平均テロメア長（５．８２２ｋｂ）の同質テロメア長分布が確認された（図６ａ）。２４サイクルのＰＣＲでは、１０．０６ｎｇ、２０．１２ｎｇまたは３０．１８ｎｇの反応物セットに対して、それぞれ２６３ｂｐ、２６４ｂｐおよび３６５ｂｐの平均断片長の減少が生じた（図７ａ）。さらにＰＣＲサイクル数を増加させた場合、平均テロメア長にさらに大幅な減少が生じ、２８回のＰＣＲサイクル後、１μｌ、２μｌおよび３μｌの反応物セットは、ＰＣＲ反応が２２回繰り返された場合よりも小さい１．７４１ｋｂ １．６５９ｋｂおよび２．０７９ｋｂの平均テロメア長測定値を有していた。フラグメントアナライザー（商標）アウトプットゲルから、３つのすべての反応物セットにおいて、テロメア長分布スメアは、より小さなＰＣＲ産物の数が増加して生成されるにつれて下方に拡大され、これが平均テロメア長で著しく小さく評価されたことを引き起こしたことは明らかである。図７で確認された２８回のＰＣＲサイクル後の平均テロメア長測定値は、ＣＬＬ４パネルと共に測定した際のＨＴ１０８０ ｃｌ．５の平均テロメア長測定値（３．６１８ｋｂ）に非常に似ていた（図６ｃ）。これが、前に試験した試料のパネルＣＬＬで確認された平均テロメア長測定値の不正確であったことの原因であり得ることが、このことから示唆される（図６）。これらのデータは、サイクル数が多い非テロメア産物の増幅と一致している。
【0089】
さらに、本発明者らは、異なるＤＮＡ量を含有する異なる反応物セット間の平均テロメア長における変動量が、反応が繰り返されるほど増加することに留意した。２２回のＰＣＲサイクル後、１０．０６ｎｇのＤＮＡ（図７ａのｉ）および３０．１８ｎｇのＤＮＡ（図７ａのｉｉｉ）を含有するＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物間の差は、２５４ｂｐである。しかし、２８回のサイクル後、この差は５９２ｂｐであった。この方法がＣＬＬ患者のＤＮＡに対して試験される場合、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物への投入ＤＮＡの濃度におけるこうした差は時々生じる可能性がある。２８回とは対照的に２２回のサイクルで使用する場合、システム内の変化は小さくなり、試料間の平均テロメア長の信頼性のより高い比較が得られた。
【0090】
また、ＭＲＣ５繊維芽細胞株のクローン個体群（クローン５）由来のＤＮＡを使用したサイクル滴定も試みたところ、このクローンは、二アレル性のテロメア長分布を示すが、ＨＴ－ＳＴＥＬＡを使用して解析した場合、単一のテロメア長分布が検出された（図６）。６．６ｎｇ、１３．２ｎｇまたは１９．８ｎｇのＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡを含有する３つの反応物セットを構築した。次いで、これらの反応物を２２、２４、２６または２８回のＰＣＲサイクルに供した（図７ｂ）。これらの実験から、サイクル数および投入ＤＮＡ量の両方が、得られた分布に影響を及ぼしたことが明らかであった。２μｌおよび３μｌの反応物セットでは、２８回から２２回にサイクル数が減少すると、高分子量テロメアアレル（ＵＡ）と低分子量テロメアアレル（ＬＡ）との間のピーク高さの比が改善され、結果として、２２回のサイクルでは予測した１：１のアレル比に近い比が得られたが、２８回のサイクルでは、比は１：１０であった。また、ＵＡ／ＬＡ比も、１μｌの反応物セットにおいてサイクル数を２８回から２２回まで減少させることにより改善された。２２回のサイクルでは、ＵＡ／ＬＡ比は１：１．２８２であった（図７ｂ（ｉ））。２８回のサイクル後、比は１：２．５２２であり、これは２μｌと３μｌの反応物セットほど高くはなく、このことは、アレル間の比も、投入ＤＮＡ量によって影響を受け、投入ＤＮＡ量が減少するとアレル増幅の比が改善されることが示唆される。これらのデータは、サイクル数およびＤＮＡ濃度の増加に伴って明白になる、より短いテロメアの優先的増幅と一致している。したがって、サイクル数および投入ＤＮＡの両方を減少させることによって、テロメア長分布がより良好に表わされる。
【0091】
２２回のサイクルによって頑健なテロメア長プロファイルが生じることは明らかであったが、総シグナルは比較的低く、テロメアサイジングが不正確になる下限に近かった（後で（図１１）において定義したとおりである）。したがって、サイクル数は、平均テロメア長測定に影響を及ぼすことなく生成されるＰＣＲ産物の量を増加させるので、２３回に増やした（図７ｃ）。
【0092】
総合すれば、これらのデータは、ＰＣＲサイクル数を減少させると、人工的増幅は少なくなり、異質性は少なくなり、テロメア長分布がより正確に表わされることを示している。また、これは、投入ＤＮＡ量を最適化することによって、よりさらに改良される可能性があることも示した。
【0093】
マーカー最適化
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ方法でのサイジングの不正確性をもたらし得るもう一つの原因は、キャピラリー間の正規化に使用されるＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡキット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）に付属の低分子量マーカー（７５ｂｐ）および高分子量マーカー（２０ｋｂ）である。ＳＴＥＬＡ－ＰＣＲ中に、サイズが２００ｂｐ未満の多くの断片が生成されるが、これらはプライマー複合体およびプライマー二量体から構成されている。フラグメントアナライザー（商標）に対するこれらの断片の強度は、低分子量の７５ｂｐマーカーの位置をマスクし、このマーカーの同定を困難にしている（図８ａ）。これが、ＳＴＥＬＡ産物の不正確な正規化、およびその後の不正確なテロメア長測定をもたらした。この問題を解決するために、多くの方策がとられた。まず、ＰＣＲ精製を、試みとして９６ウェルプレートＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施し、これらのより小さなＤＮＡ断片を除去した。この精製によって２００ｂｐ未満のかなりの量の断片が除去されたが、完全にそれらを除去するには不十分であり、同じ問題がそのままである（図８ｂ）。さらに、ＰＣＲ精製は試料間で一貫しておらず、ＰＣＲ産物由来の一部のテロメアも除去されるため、それらのシグナル強度が低下した。したがって、この低分子量マークの検出を妨げる断片を精製することは不可能であり、この方策はそれ以上追求されなかった。
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ方法でのサイジングの不正確性をもたらし得るもう一つの原因は、キャピラリー間の正規化に使用されるＤＮＦ－９３０ ｄｓＤＮＡキット（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）に付属の低分子量マーカー（７５ｂｐ）および高分子量マーカー（２０ｋｂ）である。ＳＴＥＬＡ－ＰＣＲ中に、サイズが２００ｂｐ未満の多くの断片が生成されるが、これらはプライマー複合体およびプライマー二量体から構成されている。フラグメントアナライザー（商標）に対するこれらの断片の強度は、低分子量の７５ｂｐマーカーの位置をマスクし、このマーカーの同定を困難にしている（図８ａ）。これが、ＳＴＥＬＡ産物の不正確な正規化、およびその後の不正確なテロメア長測定をもたらした。この問題を解決するために、多くの方策がとられた。まず、ＰＣＲ精製を、試みとして９６ウェルプレートＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施し、これらのより小さなＤＮＡ断片を除去した。この精製によって２００ｂｐ未満のかなりの量の断片が除去されたが、完全にそれらを除去するには不十分であり、同じ問題がそのままである（図８ｂ）。さらに、ＰＣＲ精製は試料間で一貫しておらず、ＰＣＲ産物由来の一部のテロメアも除去されるため、それらのシグナル強度が低下した。したがって、この低分子量マークの検出を妨げる断片を精製することは不可能であり、この方策はそれ以上追求されなかった。
【0094】
代替手法は、フラグメントアナライザー（商標）でＨＴ－ＳＴＥＬＡに適するようにマーカーをカスタマイズすることであった。本発明者らは、大きなプライマー複合体および大きなプライマー二量体の２００ｂｐよりも大きなサイズであるが、ＸｐＹｐＥ５プライマー（４１５ｂｐ）またはＸｐＹｐＣプライマー（８８２ｂｐ）を使用するＳＴＥＬＡで生成されたテロメアの最小断片サイズよりも小さなサイズである低分子量マーカーを使用した。したがって、この目的のために、市販の４００ｂｐ ＤＮＡ断片（ＮｏＬｉｍｉｔｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取得した。また、高分子量マーカーもＳＴＥＬＡ用にカスタマイズした。本発明者らのＣＬＬコホートまたは結腸直腸がん腫瘍試料２４、２７で確認された最長の平均テロメア長よりも５ｋｂ以上大きい、１５ｋｂを選択した。この１５ｋｂマーカーは、ＤＮＦ－９３０キットに付属の２０ｋｂマーカーよりも小さいので、ゲルマトリックス中で良好に展開され、その結果、サイジングが改良される。これらのマーカーＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＦ－９３０キット内で供給されている７５ｂｐマーカーおよび２０ｋｂマーカーと同一濃度に希釈し（０．５ｎｇ／μｌ）、次いで、ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物と共にフラグメントアナライザー（商標）で展開した（図８ｃ）。電気泳動図によって、新しい４００ｂｐマーカーは、プライマー複合体およびプライマー二量体とは異なる明確な単一ピークとして表されることが明らかであった（図６ｃ）。１５ｋｂの断片の展開は、ＤＮＦ－９３０キットで提供される２０ｋｂマーカーと比べ、改良された。これらのカスタムマーカーと一緒に、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ産物の展開に使用する場合、フラグメントアナライザー（商標）でのキャピラリー間の正規化が可能になる。
【0095】
最適化されたＤＮＡ投入、サイクル数およびカスタムマーカーを使用する平均テロメア長の再解析
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ条件をこの方法のサイジング精度を改善するため変更したのち、ＣＬＬ試料ならびにＭＲＣ５（ｃｌ．５）およびＨＴ１０８０（ｃｌ．５）のクローン個体群の追加パネルの平均テロメア長を解析した（図９）。それらの試料に対し強く頑健なテロメア長分布スメアが得られた。ＭＲＣ５ ｃｌ．５は明瞭な二アレル性テロメア長分布を示し、ＨＴ１８０８０ ＸｐＹｐテロメアは、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法で見られたものと同様の同質分布を形成した（図９ａ）。ＨＴ－ＳＴＥＬＡで決定した平均テロメア長を、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法と比較した。これによって、ＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡとの間に非常に有意な線形相関があり、２つの方法の間の変動は非常に小さいことが明らかになった（ｐ＜０．０００１；Ｒ２＝０．９７；図９ｂ）。ＨＴ－ＳＴＥＬＡ条件を調整する前は、ＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡとの関係は直線的でなく（図６ｃ）、２．５ｋｂを超える平均テロメア長の正確な測定は不可能であった。しかし、条件の変更により、ＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡとの間の直線関係が得られ、解析したテロメア完全長範囲内のテロメア長を正確に決定することができた。
ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ条件をこの方法のサイジング精度を改善するため変更したのち、ＣＬＬ試料ならびにＭＲＣ５（ｃｌ．５）およびＨＴ１０８０（ｃｌ．５）のクローン個体群の追加パネルの平均テロメア長を解析した（図９）。それらの試料に対し強く頑健なテロメア長分布スメアが得られた。ＭＲＣ５ ｃｌ．５は明瞭な二アレル性テロメア長分布を示し、ＨＴ１８０８０ ＸｐＹｐテロメアは、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法で見られたものと同様の同質分布を形成した（図９ａ）。ＨＴ－ＳＴＥＬＡで決定した平均テロメア長を、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法と比較した。これによって、ＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡとの間に非常に有意な線形相関があり、２つの方法の間の変動は非常に小さいことが明らかになった（ｐ＜０．０００１；Ｒ２＝０．９７；図９ｂ）。ＨＴ－ＳＴＥＬＡ条件を調整する前は、ＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡとの関係は直線的でなく（図６ｃ）、２．５ｋｂを超える平均テロメア長の正確な測定は不可能であった。しかし、条件の変更により、ＳＴＥＬＡとＨＴ－ＳＴＥＬＡとの間の直線関係が得られ、解析したテロメア完全長範囲内のテロメア長を正確に決定することができた。
【0096】
変動係数
本発明者らは、アッセイ間およびアッセイ内の変動係数を計算することによって、ＨＴ－ＳＴＥＬＡシステム内の測定誤差を決定した。これを行うため、本発明者らは、同一のＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡ試料にＨＴ－ＳＴＥＬＡを適用した。各反応物は３０ｎｇのＤＮＡを含有し、９５の個別のＳＴＥＬＡ反応物および１つの分子量マーカーを含有する１枚の９６ウェルプレート全体にわたって、２２回のＰＣＲサイクルに供した。プレートは、フラグメントアナライザー（商標）を使用して３回解析した（図１０）。アッセイ内変動係数は、フラグメントアナライザー（商標）の３回のそれぞれの泳動について決定し、１．０４％から１．５１％の範囲であり、平均は１．２９％であった（図１０）。アッセイ間変動係数は、１．２３％と決定された（表２）。全体として、システム内の固有の変動は非常に少なく、この手法を使用して、頑健で再現可能なテロメア長測定を確実に行うことができることを意味する。
本発明者らは、アッセイ間およびアッセイ内の変動係数を計算することによって、ＨＴ－ＳＴＥＬＡシステム内の測定誤差を決定した。これを行うため、本発明者らは、同一のＭＲＣ５ ｃｌ．５ ＤＮＡ試料にＨＴ－ＳＴＥＬＡを適用した。各反応物は３０ｎｇのＤＮＡを含有し、９５の個別のＳＴＥＬＡ反応物および１つの分子量マーカーを含有する１枚の９６ウェルプレート全体にわたって、２２回のＰＣＲサイクルに供した。プレートは、フラグメントアナライザー（商標）を使用して３回解析した（図１０）。アッセイ内変動係数は、フラグメントアナライザー（商標）の３回のそれぞれの泳動について決定し、１．０４％から１．５１％の範囲であり、平均は１．２９％であった（図１０）。アッセイ間変動係数は、１．２３％と決定された（表２）。全体として、システム内の固有の変動は非常に少なく、この手法を使用して、頑健で再現可能なテロメア長測定を確実に行うことができることを意味する。
【0097】
品質管理
この技術がオリジナルのＳＴＥＬＡ方法で確認された高レベルのテロメア長測定精度を維持していることを保証するため、ＨＴ－ＳＴＥＬＡアッセイに品質管理手段を組み込むことが重要であった。この点に関して、ＨＴ－ＳＴＥＬＡによって生成されたアウトプットデータの重要な局面は、それぞれのテロメア長分布スメアに対して付与されるフラグメントアナライザー（商標）で検出可能な相対蛍光単位（ＲＦＵ）によって定義されるような、生成総シグナルであった。
この技術がオリジナルのＳＴＥＬＡ方法で確認された高レベルのテロメア長測定精度を維持していることを保証するため、ＨＴ－ＳＴＥＬＡアッセイに品質管理手段を組み込むことが重要であった。この点に関して、ＨＴ－ＳＴＥＬＡによって生成されたアウトプットデータの重要な局面は、それぞれのテロメア長分布スメアに対して付与されるフラグメントアナライザー（商標）で検出可能な相対蛍光単位（ＲＦＵ）によって定義されるような、生成総シグナルであった。
【0098】
平均テロメア長測定の信頼性が低くなる下限のＲＦＵ限界を決定するため、ＰＣＲサイクル滴定を実施した：ＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に添加し、次いで、これを１８～２３回のＰＣＲサイクルに供した。この実験の背後の論理的根拠は、ＰＣＲサイクル数が減少するにつれて、生成されたＰＣＲ産物の量が減少し、それによって、ＲＦＵ値も減少するということであった。それゆえ、テロメア長測定が不正確になる点をモニターすることができる。ＨＴ１０８０ ｃｌ．２テロメアスメアのシグナル強度は、サイクル数減少の関数として減少し、１８サイクル後にテロメアシグナルは検出することができなかった。サイクル数２１と２３の間で、頑健なシグナルが得られ（２７～６５ＲＦＵの間）、テロメア長の推定値は一致していた（図１１）。シグナルは、１９～２０サイクルでよりさらに減少し、８～１２ＲＦＵになった。テロメアスメアを検出することはできたが、スメアのピーク強度はバックグラウンドのピーク強度に類似しており、平均テロメア長推定値は没した（図１１）。したがって、本発明者らは、信頼性の高いテロメア長推定値を提供する最低のシグナルは２５ＲＦＵであると考えた。
【0099】
ピークＲＦＵ値は、生成および検出されたＰＣＲ産物の量を示すが、いくつかの理由により、これは必ずしも一致しているとは限らない：第１に、ＲＦＵは異なるフラグメントアナライザー装置間で変動が生じる。第２に、ＲＦＵ測定は電気泳動図のピークの最高点から行われる。テロメア長分布の異質性、したがって、電気泳動図上のテロメアスメアピークの幅は考慮されない。したがって、ＲＦＵシグナルがより分散されている頑健な異質性テロメア長分布は、それらのピークの高さが同質性分布の場合よりも低いので、廃棄され得る。この疾患のＸｐＹｐテロメア長は同質であることが示されているので、これはＣＬＬ患者において問題を過度に提起しないかもしれないが、テロメア長の異質性をより多く示す他のがんに同一判定基準を適用する場合に、いっそう関係してくる。
【0100】
異質性テロメア長分布を識別することなく、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ中に許容可能なＰＣＲ産物形成の下限値を決定するために使用することができ、異なるフラグメントアナライザー間で一致し得る単位を同定することが必要であった。テロメア長分布ピーク下の面積（Ｔｅｌピーク面積）は、フラグメントアナライザーによって検出されるＨＴ－ＳＴＥＬＡのＰＣＲ産物をすべて入れるので、より適切なＰＣＲ産物形成の手段を提供することができる。しかし、同一装置間の変動性の問題が依然として存在しており、正規化が必要であった。電気泳動工程および検出工程における不変物の１つはマーカーであった。任意のマーカーを選択し一貫して使用することができるが、低分子量マーカーピーク面積（ＬＭピーク面積）などのマーカーピーク面積値によってテロメアスメアピーク面積値を正規化すると、フラグメントアナライザー間の試料プレートのシグナル検出の差がマーカープレート上の低分子量マーカー間と同じ検出差によって反映されるので、こうしたあらゆる変動は無効にされる。さらに、同一アッセイ内でのわずかなキャピラリー間のＰＣＲ産物の検出変動も解決される。この手法はサイクル滴定実験に適用され（図１１）、前述のように、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物を２１～２３回のＰＣＲサイクルに供した場合、テロメア長の一定の推定値が得られた。また、これらのＰＣＲ反応に対して、Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積の割合が高かった（２５．８７～６１．０２％の間）。２０サイクル未満にサイクル数を減らすと、テロメア長推定値が低下し、Ｔｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積の割合も大幅に減少した（＜８％）（図１１）。したがって、品質管理手段として使用する場合、本発明者らは、システムにおいて使用される低分子量マーカーが０．５ｎｇ／μｌの濃度であり、１０秒間１ｋＶのマーカー注入であるときに、信頼性の高いテロメア長推定値を提供する最低のＴｅｌピーク面積／ＬＭピーク面積の割合が２５％であると推定されると考察した。
【0101】
Ｍａｘｗｅｌｌ ＤＮＡ ＩＱ － ＤＮＡ抽出
フラグメントアナライザー（商標）を使用し、多くのＣＬＬ患者において平均テロメア長を測定する高速のハイスループット方法を提供する。ＳＴＥＬＡの重要な１つの局面は、ＤＮＡの抽出および正確な定量である。フェノール／クロロホルム抽出に基づいた標準プロトコルは時間を要するが、これは、ＤＮＡが迅速に自動抽出されるように開発された様々な方法によって大部分は解消されている。しかし、制約要因の１つは、それぞれ抽出したＤＮＡの定量と、それに続く、この方法のＰＣＲ工程前の標準的の規定濃度への希釈に関する要件である。定量工程は、定められた量のＤＮＡを抽出するように設計された抽出システムによって解消することができる。本発明者らは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６自動ＤＮＡ抽出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で実行されるＤＮＡ ＩＱ Ｃａｓｅｗｏｒｋ Ｐｒｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を試験した。このシステムは、細胞調製物から１００ｎｇのＤＮＡを吸収するように較正される常磁性ビーズを利用する；したがって、このシステムが飽和される限り、等量のＤＮＡが各々の試料から抽出されるはずである。
フラグメントアナライザー（商標）を使用し、多くのＣＬＬ患者において平均テロメア長を測定する高速のハイスループット方法を提供する。ＳＴＥＬＡの重要な１つの局面は、ＤＮＡの抽出および正確な定量である。フェノール／クロロホルム抽出に基づいた標準プロトコルは時間を要するが、これは、ＤＮＡが迅速に自動抽出されるように開発された様々な方法によって大部分は解消されている。しかし、制約要因の１つは、それぞれ抽出したＤＮＡの定量と、それに続く、この方法のＰＣＲ工程前の標準的の規定濃度への希釈に関する要件である。定量工程は、定められた量のＤＮＡを抽出するように設計された抽出システムによって解消することができる。本発明者らは、Ｍａｘｗｅｌｌ １６自動ＤＮＡ抽出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で実行されるＤＮＡ ＩＱ Ｃａｓｅｗｏｒｋ Ｐｒｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を試験した。このシステムは、細胞調製物から１００ｎｇのＤＮＡを吸収するように較正される常磁性ビーズを利用する；したがって、このシステムが飽和される限り、等量のＤＮＡが各々の試料から抽出されるはずである。
【0102】
本発明者らは、最初に、１００ｎｇのＤＮＡが抽出することができ、一定のＨＴ－ＳＴＥＬＡプロファイルを提供することができるＣＬＬ Ｂ細胞の最低数を決定した。ＣＬＬ患者の血液試料から単離した様々な数のＣＬＬ Ｂ細胞（５×１０３、１×１０４、１．６×１０４、５×１０４、２×１０５、５×１０５、１×１０６および２×１０６）（図１２ａ）を回収し、１時間溶解させ、ＤＮＡ抽出用のＭａｘｗｅｌｌ装置のＤＮＡ ＩＱ Ｃａｓｅｗｏｒｋ Ｐｒｏキットにロードした。ＤＮＡを溶出バッファー８０μｌに溶出させ、ｔｅｌ２オリゴヌクレオチドを２５０ｐＭの最終濃度で溶出バッファーに直接添加した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡをＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物で実施し、ＰＣＲ産物を展開し、フラグメントアナライザー（商標）で検出した（図１２ｂ）。より多くの細胞数から抽出されたＤＮＡと比べ、１×１０４細胞および５×１０４細胞からの抽出ＤＮＡからはより少量のＰＣＲ産物が生成されたが、このことは、この細胞数がＤＮＡ ＩＱシステムを飽和するのに十分なＤＮＡ（１００ｎｇ）を含有していないことを示唆している。ＸｐＹｐ ＨＴ－ＳＴＥＬＡを２×１０５細胞～６×１０５細胞から抽出したＤＮＡで実施した場合、比較的一定のテロメア長プロファイルが得られたが（図１２ｂ）、バンドの数、したがって８×１０５個以上から抽出したＤＮＡの量は減少するようであり、この細胞数は、ＤＮＡ ＩＱシステムにとっては多すぎ、実際に、１００ｎｇのＤＮＡの抽出を阻害することを示唆している。ＤＮＡ ＩＱシステムは、４×１０５細胞で飽和しているようである。この細胞量から十分なＤＮＡが抽出され、頑健なＨＴ－ＳＴＥＬＡプロファイルが提供されるので、この細胞数をその後の使用のために選択した。さらに、この細胞数は比較的少ないため、少量の試料を確実に解析することができる。
【0103】
ＤＮＡ ＩＱシステムが飽和される細胞数が決定されたなら、この細胞数から抽出したＤＮＡを使用するＨＴ－ＳＴＥＬＡ方法の再現性を評価した。ＤＮＡは、４×１０５個のＣＬＬ細胞ペレットの８つの独立した複製物から抽出した。８つの複製物のうち、４つの複製物から得たＤＮＡを４０μｌの溶出バッファーに溶出させ、他の４つは８０μｌに溶出させ、ＤＮＡ濃度を１／２に低下させた。ＨＴ－ＳＴＥＬＡは、溶出したＤＮＡを使用して実施した（図１２ｃ）。比較的一定したテロメア長分布プロファイルが４０μｌの溶出複製物間で、および８０μｌの溶出複製物間で確認され、８０μｌの溶出物に比べて、４０μｌの溶出物において、より強いバンドパターンが確認された。Ｎａｎｏｄｒｏｐ ３３００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって得られた４０μｌ溶出複製物に関するＤＮＡ濃度は全体的に高かったが、８０μｌ溶出液の２倍の濃度ではなかった；このことから、ＤＮＡの溶出は、８０μｌと比べると、４０μｌでは効率がよくないことが示唆された。
【0104】
ＤＮＡ ＩＱシステムからの異なる溶出複製物から抽出したＤＮＡを使用して得た、比較的一定したテロメア長分布は有望であったが、これらは、所望のテロメア長分布スメアとは対照的なバンドパターンを含有してなっていた。このスメアを達成する試みにおいて、投入ＤＮＡ滴定は、複製物（８０－４）の１つに由来するＤＮＡを使用して実施した：１μｌ、３μｌまたは５μｌを複数のＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に添加した（図１２ｄ）。反応物当たり１μｌのＤＮＡを添加する場合、図１２ｃに示したものと同様のバンドパターンであることが明らかであったが、投入ＤＮＡが３μｌおよび５μｌに増加した場合、頑健なテロメア長分布スメアが確認された（図１２ｄ）。次いで、１μｌに対して３μｌのＤＮＡをＰＣＲ反応物に加える以外は、ＨＴ－ＳＴＥＬＡを４×１０５個の複製物のすべてについて繰り返した（図１２ｅ）。すべての複製物に関するすべてのＰＣＲ反応物にわたって、頑健なテロメア長スメアがバンドパターンの代わりに生成された。これらの実験によって、本発明者らは、ＤＮＡ ＩＱシステムを最適化し、頑健なＨＴ－ＳＴＥＬＡスメアを提供することができた。
【0105】
ＣＬＬ患者コホートにおけるＨＴ－ＳＴＥＬＡの検証
本発明者らは、１５のＣＬＬ試料のコホートにおいてＨＴ－ＳＴＥＬＡシステムを試験した。血液試料を取得し、ＭＡＣＳ全血ＣＤ１９マイクロビーズおよびＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＣＤ１９＋細胞を精製した。次いで、単離細胞を、ＶＩ－細胞装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントし、４×１０５個の細胞ペレットにアリコートした。細胞ペレットを１時間溶解させ、ＤＮＡを、ＤＮＡ ＩＱプロトコルＭａｘｗｅｌｌ １６装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して溶解産物から抽出し、４０μｌ溶出バッファーに溶出させた。この溶出ＤＮＡの一部をＳＴＥＬＡによって解析するために取り（図１３ｂ）、残りをＨＴ－ＳＴＥＬＡ解析に使用した。簡単に説明すると、ｔｅｌ２リンカーオリゴヌクレオチドを溶出ＤＮＡに２５０ｐＭの最終濃度で添加し、３μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物を、０．２ｕＭのＸｐＹｐＥ５を含有する３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２３回でサイクルを行った。ＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザー（商標）を使用して展開し検出した（図１３ａ）。それぞれの反応物について、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア内のスメア解析機能を使用して平均ＸｐＹｐテロメア長を測定し、それぞれの患者につき３つの複製物について得られた平均テロメア長を合計し、平均して最終的なＸｐＹｐ平均テロメア長を得た。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法については、Ｐｈｏｒｅｔｉｘソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してバンド定量を実施し、続いて、平均ＸｐＹｐテロメア長を計算した。次いで、両技術によって測定した平均テロメア長を比較した（図１３ｃ）。ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアからのアウトプットゲルは、ＸｐＹｐテロメア長分布スメアが、試験した１５の試料のうち１４について生成されたことを示す。重要なことには、ＲＦＵ値はすべて、本発明者らが正確で再現可能なテロメア長が測定され得る下限値として定義した、２５ＲＦＵ閾値よりも大きかった。ＨＴ－ＳＴＥＬＡとオリジナルのＳＴＥＬＡ方法により生成されたテロメア長分布は、非常に類似しており（図１３ａおよび図１３ｂ）、長さの推定値は有意に相関していた（Ｒ２＝０．９７；図１３ｃ）。
本発明者らは、１５のＣＬＬ試料のコホートにおいてＨＴ－ＳＴＥＬＡシステムを試験した。血液試料を取得し、ＭＡＣＳ全血ＣＤ１９マイクロビーズおよびＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＣＤ１９＋細胞を精製した。次いで、単離細胞を、ＶＩ－細胞装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントし、４×１０５個の細胞ペレットにアリコートした。細胞ペレットを１時間溶解させ、ＤＮＡを、ＤＮＡ ＩＱプロトコルＭａｘｗｅｌｌ １６装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して溶解産物から抽出し、４０μｌ溶出バッファーに溶出させた。この溶出ＤＮＡの一部をＳＴＥＬＡによって解析するために取り（図１３ｂ）、残りをＨＴ－ＳＴＥＬＡ解析に使用した。簡単に説明すると、ｔｅｌ２リンカーオリゴヌクレオチドを溶出ＤＮＡに２５０ｐＭの最終濃度で添加し、３μｌのＤＮＡ／ｔｅｌ２混合物を、０．２ｕＭのＸｐＹｐＥ５を含有する３０μｌのＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応物に加え、２３回でサイクルを行った。ＰＣＲ産物は、フラグメントアナライザー（商標）を使用して展開し検出した（図１３ａ）。それぞれの反応物について、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア内のスメア解析機能を使用して平均ＸｐＹｐテロメア長を測定し、それぞれの患者につき３つの複製物について得られた平均テロメア長を合計し、平均して最終的なＸｐＹｐ平均テロメア長を得た。オリジナルのＳＴＥＬＡ方法については、Ｐｈｏｒｅｔｉｘソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してバンド定量を実施し、続いて、平均ＸｐＹｐテロメア長を計算した。次いで、両技術によって測定した平均テロメア長を比較した（図１３ｃ）。ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアからのアウトプットゲルは、ＸｐＹｐテロメア長分布スメアが、試験した１５の試料のうち１４について生成されたことを示す。重要なことには、ＲＦＵ値はすべて、本発明者らが正確で再現可能なテロメア長が測定され得る下限値として定義した、２５ＲＦＵ閾値よりも大きかった。ＨＴ－ＳＴＥＬＡとオリジナルのＳＴＥＬＡ方法により生成されたテロメア長分布は、非常に類似しており（図１３ａおよび図１３ｂ）、長さの推定値は有意に相関していた（Ｒ２＝０．９７；図１３ｃ）。
【0106】
ＳＴＥＬＡをテロメア長融合性閾値と共に使用して決定されるＸｐＹｐテロメア長に基づく患者の階層化は、ＣＬＬ患者に対して高解像度の予後判定情報を提供する（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＬＬ患者の血液試料から頑健なテロメア長プロファイルの生成までのＨＴ－ＳＴＥＬＡ方法は、全体で、７．５時間以内に実施することができる。ＨＴ－ＳＴＥＬＡの開発によって、ＣＬＬ患者、ならびに予後判定閾値が有益である他の腫瘍タイプを有する患者の日常的な予後判定評価へのこの技術の適用が速やかに促進される。
【0107】
追加染色体末端でのＨＴ－ＳＴＥＬＡ
再現可能なＨＴ－ＳＴＥＬＡアッセイがＸｐＹｐ染色体末端に対して開発されると、この技術を追加染色体末端での平均テロメア長が測定できるように開発した。特定の染色体末端に対する特異性を得るために、テロメア隣接のプライマーは、３’末端にテロメア特異的ヌクレオチドを組み込むように設計した。プライマーが高レベルの配列相同性を示す他の染色体端の他のサブテロメア配列にアニールした場合には、ミスマッチが生じ、ＴａｑポリメラーゼのＰＣＲ反応におけるプライマーからの伸長ができなくなり、それ故、他のテロメアからＰＣＲ産物を産生することができないので、これは、１つの染色体末端に特異性を付与する設計パラメーターである。このプライマーの設計手法を使用し、７ｑ染色体末端および１２ｑ染色体末端のテロメア隣接領域に対して多数のプライマーを設計した。１７ｐテロメア隣接領域に特異的ないくつかのプライマーは、追加のＸｐＹｐ特異的プライマーのように既に利用可能であった。これらのプライマーをＸｐＹｐＥ５と同一条件下で試験し、それぞれの染色体末端に対してＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡを使用して、テロメア長分布スメアを生成することができるどうかを決定した（図１４）。
再現可能なＨＴ－ＳＴＥＬＡアッセイがＸｐＹｐ染色体末端に対して開発されると、この技術を追加染色体末端での平均テロメア長が測定できるように開発した。特定の染色体末端に対する特異性を得るために、テロメア隣接のプライマーは、３’末端にテロメア特異的ヌクレオチドを組み込むように設計した。プライマーが高レベルの配列相同性を示す他の染色体端の他のサブテロメア配列にアニールした場合には、ミスマッチが生じ、ＴａｑポリメラーゼのＰＣＲ反応におけるプライマーからの伸長ができなくなり、それ故、他のテロメアからＰＣＲ産物を産生することができないので、これは、１つの染色体末端に特異性を付与する設計パラメーターである。このプライマーの設計手法を使用し、７ｑ染色体末端および１２ｑ染色体末端のテロメア隣接領域に対して多数のプライマーを設計した。１７ｐテロメア隣接領域に特異的ないくつかのプライマーは、追加のＸｐＹｐ特異的プライマーのように既に利用可能であった。これらのプライマーをＸｐＹｐＥ５と同一条件下で試験し、それぞれの染色体末端に対してＨＴ１０８０ ｃｌ．２ ＤＮＡを使用して、テロメア長分布スメアを生成することができるどうかを決定した（図１４）。
【0108】
７ｑ染色体末端では、７ｑ特異的ヌクレオチドの１１１５Ｔ、５５１Ａ、１９５Ｇ、および程度は低いが２９Ｇの周辺で設計したプライマーは、頑健なテロメア長分布スメアを生成した（図１４ａ）。ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェアでスメア解析ツールを使用して計算した断片の平均分子量は、テロメア反復配列の開始位置から距離に依存した、想定される増加を示した。プライマーからテロメア反復配列の開始位置までの距離を差し引くことにより、これらのテロメア長分布スメアから平均テロメア長を計算した場合、テロメアの開始位置からの距離に関係なく、同様の平均テロメア長推定値が得られた。ＨＴ－ＳＴＥＬＡによる７ｑテロメア長の推定値は、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法により決定されたものと同程度であった（図１４ａ；図１６）。
【0109】
また、１２ｑ染色体末端のＨＴ－ＳＴＥＬＡの開発も、設計したプライマーの一部で成功した。プライマー３５０Ｇおよび５５０Ｔ（それぞれ、ＴＴＡＧＧＧ反復から３５０ヌクレオチドおよび５５０ヌクレオチド）は、同程度のＲＦＵ値を有するテロメア長分布スメアを生成した。７ｑと同様に、ＨＴ－ＳＴＥＬＡによって計算した１２ｑの平均テロメア長は、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法を使用し計算した平均テロメア長に非常に類似していた（図１４ｂ）。１３８８Ｇ １２ｑ特異的ヌクレオチドの周辺で設計したプライマーは、非常に弱いテロメア分布を生じた。これに関するＲＦＵ値は、信頼性をもって提供する平均テロメア長測定値としては低すぎるので、今後の実験においては使用しない。
【0110】
１７ｐ染色体末端のテロメア隣接領域に特異的であるプライマーは、既に設計されているが、さらなる８つのプライマーを、テロメア反復配列から６８７７ｂｐまで伸長して設計した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡで試験したテロメア反復から３８４３ｂｐまでのすべてのプライマーは、テロメア増幅と一致するスメアを生じた（図１４ｃ）。３８４３ｂｐ（１７ｐ８）を除き、ＨＴ－ＳＴＥＬＡスメアを定量することができた。１７ｐ８で生成されたスメアは、１５ｋｂの高分子量マーカーに近接しすぎていたので定量できなかった。再度、テロメア反復配列の開始位置からのプライマーの距離の関数として増幅産物の分子量に明らかな増加があり、これにテロメア－隣接配列の減算をした後、平均６．５ｋｂの５つの異なる１７ｐプライマーから１７ｐテロメア長の一定の推定値が得られた（図１４ｃ）。興味深いことに、この推定値は、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法で得られた値よりも大きかったが、５つの個別のプライマーは同じ長さをもたらすので、本発明者らは、ＨＴ－ＳＴＥＬＡは、プライマー１７ｐｓｅｑ１ｒｅｖを使用するオリジナルのＳＴＥＬＡ方法と比べ、より頑健なテロメア長の推定値を示すと考察した。本発明者らは、これが、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法でテロメアプロファイルを検出するのにサザンハイブリダイゼーションを使用することと、使用されるＴＴＡＧＧＧ反復配列またはハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズしないテロメア変異体反復が存在することに関係している可能性があると推測している。またこれらのデータは、頑健なＨＴ－ＳＴＥＬＡプロファイルが、テロメア反復配列の開始位置から少なくとも３．８４３ｋｂまでのプライマーを使用して生成されることを示している。すべての１７ｐ特異的プライマーは、テロメア反復路から１ヌクレオチドに位置した１７ｐｓｅｑ１Ｂを除き、頑健なテロメア長分布を生じた。このプライマーをＨＴ－ＳＴＥＬＡにおいて使用した場合、頑健なテロメアの増幅とは一致していない、ハシゴ状の分布が認められた（図１４ｃ）。興味深いことに、テロメア隣接プライマーの性能は、それがテロメア反復路から３０ヌクレオチド未満に位置している場合に低下するようである。７ｑ２９Ｇおよび１７ｐｓｅｑ１Ｂは両方とも、それらのそれぞれの染色体末端のテロメア反復路からさらに離して設計された他のプライマーと比べ、性能が不十分であった。
【0111】
ＸｐＹｐテロメア隣接プライマーの成功は、１７ｐテロメアで確認されたものと比べ、より多様であった。ＸｐＹｐＭおよびＸｐＹｐＯ（それぞれＴＴＡＧＧＧから１６５３ｎｔおよび１６２５ｎｔ）、またはテロメアから４．８ｋｂよりも大きいプライマーＸｐＹｐＤ、ＸｐＹｐＦ、ＸｐＹｐＨおよびＸｐＹｐＩはすべて、ＰＣＲ産物を少しも生成しなかった（図１４ｄ）。予想通り、ＸｐＹｐＥ５は、オリジナルのＳＴＥＬＡ方法を使用して生成されたものと同様の平均テロメア長を有するテロメア長分布スメアを生じた。ＸｐＹｐＢ（テロメアから２５３９ｂｐ）は、予想されるサイズのスメアを生じる。また、ＸｐＹｐＣは同様のテロメア長分布を生じたが、ＲＦＵ値はＸｐＹｐＥ５よりも高く、ＸｐＹｐＣはＸｐＹｐテロメア産物の生成においてより効果的であり、したがって、ＸｐＹｐＣは、その後のＸｐＹｐ ＨＴ－ＳＴＥＬＡに、ＸｐＹｐＥ５の代わりとして使用可能であることを示唆している（図１４ｄ）。ＸｐＹｐＪもまたテロメア長分布スメアを生成したが、それは非常に弱かった。７ｑ２９Ｇおよび１７ｐｓｅｑ１Ｂと同様に、ＸｐＹｐＪはテロメア反復路から３０ｎｔ未満に位置し、頑健なテロメア長分布スメアは生成することができなかった。このことから、テロメアを十分に増幅することができるプライマーを設計することができないＴＴＡＧＧＧ反復路からの下限距離が存在することが示唆される。
【0112】
これらのデータは、ＨＴ－ＳＴＥＬＡをさらなる染色体末端に適用することができ、テロメア反復配列の開始位置から少なくとも３．８４３ｋｂ以下のプライマーが頑健なテロメアプロファイルを生じることを示している。しかしまた、テロメアの３０ｂｐ以内のプライマーでは、効果的増幅または特異的増幅が生じないことも明らかであった。
【0113】
標的増幅の簡素化
上記で詳述した正常個体の末梢血由来試料において確認されたテロメア長は、終了点から０～２５ｋｂまたはそれ以上の異なった範囲の長さであるという検討すべき異質性を示し得る。これは、時に、テロメアのＰＣＲに基づく増幅に対して特定の問題を示すことがあり、その結果、より短いテロメアはより長いテロメアよりも効率的に増幅して平均テロメア長が過小評価される可能性がある。
上記で詳述した正常個体の末梢血由来試料において確認されたテロメア長は、終了点から０～２５ｋｂまたはそれ以上の異なった範囲の長さであるという検討すべき異質性を示し得る。これは、時に、テロメアのＰＣＲに基づく増幅に対して特定の問題を示すことがあり、その結果、より短いテロメアはより長いテロメアよりも効率的に増幅して平均テロメア長が過小評価される可能性がある。
【0114】
こうした状況において、本発明者らは、ＨＴ－ＳＴＥＬＡの前に、制限酵素を用いてＤＮＡを予備消化するという概念を試験した。その考えは、非テロメアＤＮＡを消化することによって投入ＤＮＡの煩雑性を低減し、増幅用の簡素な標的を提供するというものである。
【0115】
ＤＮＡ試料を抽出し、材料および方法で詳述したように、制限酵素を用いて消化した。酵素の選択は、増幅しようとするテロメア反復配列の性質に依存し、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端と染色体テロメア末端との間をそれが切断しないことを保証する必要がある。原理の証明として、ＥｃｏＲ１は、ＨＴ－ＳＴＥＬＡに使用されるＸｐＹｐＣプライマーの５’末端とテロメア反復配列との間のＤＮＡを切断せず、それにより、非テロメア遺伝子座と他のテロメアは切断され得るが、ＸｐＹｐテロメアは切断されないまま維持されるので、これを選択した。また他の酵素も、この特異的要件に適合し得る。
【0116】
ＥｃｏＲ１消化ＤＮＡ試料、またはＥｃｏＲ１未消化ＤＮＡ試料をＨＴ－ＳＴＥＬＡに供し、フラグメントアナライザー（ＡＡＴＩ）で解析した（図１７）。ＨＴ－ＳＴＥＬＡの前のＥｃｏＲ１消化によって順調にバックグラウンドシグナルが減少し、テロメアスメアがより明確になることが明白であった。
【0117】
増幅に関する条件を試験するため、ＰＣＲサイクル数およびＥｃｏＲ１で消化した投入ＤＮＡ量を滴定することにより、さらなる実験を実施した（図１８）。これらの実験から、２５ｎｇの投入ＤＮＡ量および２１～２３回のＰＣＲサイクルが最適であることが明らかであった。
【0118】
予備精製したＤＮＡ試料に対するＨＴ－ＳＴＥＬＡの調節
上記の方法論は、血液学的腫瘍または固形腫瘍のいずれかから得られた、新鮮な細胞／凍結細胞および組織試料におけるテロメア長の解析のために確立された。本発明者らは、次に、代替のＤＮＡ試料プラットフォーム、特に予め抽出したＤＮＡ試料を使用して、この技術を探索する能力を探求した。予め抽出したＤＮＡ試料の解析能力によって、例えば、多くは入手可能な腫瘍ＤＮＡ試料のみを有する臨床治験からの患者コホートの解析が可能になることにより、または、実際には、任意の保管されているＤＮＡ試料の解析が可能になることにより、ＨＴ－ＳＴＥＬＡの有用性が拡大する。
上記の方法論は、血液学的腫瘍または固形腫瘍のいずれかから得られた、新鮮な細胞／凍結細胞および組織試料におけるテロメア長の解析のために確立された。本発明者らは、次に、代替のＤＮＡ試料プラットフォーム、特に予め抽出したＤＮＡ試料を使用して、この技術を探索する能力を探求した。予め抽出したＤＮＡ試料の解析能力によって、例えば、多くは入手可能な腫瘍ＤＮＡ試料のみを有する臨床治験からの患者コホートの解析が可能になることにより、または、実際には、任意の保管されているＤＮＡ試料の解析が可能になることにより、ＨＴ－ＳＴＥＬＡの有用性が拡大する。
【0119】
ＤＮＡ ＩＱシステムがＤＮＡによって飽和される条件を決定した。これを実施するため、漸増するＨＴ１０８０ ｃｌ２ ＤＮＡ量（２００、５００、１０００および２０００ｎｇ）をＤＮＡ ＩＱ溶解バッファーに添加し、Ｍａｘｗｅｌｌ装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）の標準プロトコルを使用してＤＮＡを抽出した。これを２回実施した：１回はＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキット（ＣＬＬ細胞ペレットからＤＮＡを抽出する際に使用）を使用し、また、ＤＮＡ ＩＱ標準キットを使用した（図１９）。この２つのキットは、低溶出量（ＬＥＶ）プロトコルがｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットと共に使用されるのに対し、標準溶出量（ＳＥＶ）プロトコルは標準試料キットと共に使用される点で異なる。ＤＮＡをｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットを使用して８０μｌに溶出させ、標準試料キットを使用して３００μｌに溶出させる。
【0120】
次いで、異なる量の溶出ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応で試験した。ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキット試料に関しては、３、６または９μｌのいずれかの溶出ＤＮＡを、ＤＮＡ ＩＱシステムに加えたそれぞれの投入ＤＮＡ量に対して加えた。標準試料キットに関しては、溶出量がより大きいため、３、１０および２０μｌの溶出されたＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた。再度、これをＤＮＡ ＩＱシステムに加えたそれぞれのＤＮＡ量について実施した。次いで、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物を前述の条件と同じ条件下でＰＣＲに供し、得られたＰＣＲ産物をフラグメントアナライザー（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ；図１９）を使用し、キャピラリー電気泳動によって展開した。
【0121】
ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットカートリッジに加えたＤＮＡの量は、得られるテロメア長の分布スメアにほとんど影響を及ぼさなかった。システムに２００、５００、１０００または２０００ｎｇを加えたかどうかにかかわらず、得られたテロメア長の分布スメアは、ＭＴＬおよび正規化ｔｅｌピーク面積％の両方の点で類似しているように思われた。このことは、２００ｎｇがシステムに加えられた時点で既に飽和点にあることを示唆している（図１９ａ）。最終的なテロメア長分布スメアに対してより影響した要因は、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた溶出ＤＮＡの量であった。ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えたＤＮＡ量の増加は、それぞれのＤＮＡ量セット、および両キットのタイプに関するテロメア長分布スメアのシグナル強度の増加によって反映される。ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットに関しては、投入ＤＮＡ量にかかわらず、６μｌ以下の量の溶出ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ ＰＣＲ反応に添加した場合、本発明者らが前に品質閾値として定義した下限２５％閾値よりも高い正規化ｔｅｌピーク面積％を有するテロメア長分布スメアを生成するのには、十分といえない。９μｌの溶出ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えることによって、より頑健なテロメア長分布スメアが生成されたが、これは、５００ｎｇの試料を除き、下限正規化ｔｅｌピーク面積％閾値を上回った。９μｌの複製物のすべてから得られたＭＴＬは、６．３６８ｋｂのＨＴ１０８０ ｃｌ２陽性対照ＭＴＬに匹敵する、６．０８４～６．３５７ｋｂの範囲であった。
【0122】
ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットとは異なり、ＤＮＡ ＩＱ標準試料カートリッジに加えた投入ＤＮＡ量は、ＨＴ－ＳＴＥＬＡアウトプットゲル上で確認されるテロメア長分布スメアに影響を及ぼした（図１９ｂ）。２００ｎｇの投入ＤＮＡから溶出させたＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた場合、どのくらいの量のＤＮＡを反応物に加えたかにかかわらず、かろうじて検出可能なテロメア長分布スメアが得られた。投入ＤＮＡ量が５００ｎｇ以上に増加した場合にのみ、テロメア長分布スメアが明瞭になった。しかし、これは、１０μｌ以上の溶出ＤＮＡがＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に含まれていた場合にのみ生じた。このことから、標準試料キットを使用するＤＮＡ ＩＱシステムはこれらのＤＮＡ量の使用で飽和されないことが示唆される。２５％の正規化ｔｅｌピーク面積下限閾値を超える十分なシグナルを生成した唯一のＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物は、２０００ｎｇのＤＮＡ投入から溶出されたＤＮＡの２０μｌをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた場合であった。これは、強度が十分で、正確なＭＴＬ（６．２２４ｋｂ）を有するＨＴ－ＳＴＥＬＡシグナルを生成したが、信頼性の高いシグナルの生成に非常に多量のＤＮＡ（２０００ｎｇ）を必要とするので、これらの条件は実用的ではない。したがって、ＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットで実施したＤＮＡの正規化が、ＤＮＡ ＩＱ標準試料キットに比べ好適であった。
【0123】
本発明者らのデータは、２００ｎｇを超える投入ＤＮＡを含んだＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏキットからの溶出ＤＮＡ９μｌを加えたところ、正確なＭＴＬを生じ、２５％下限ｔｅｌピーク面積％閾値を上回るテロメア長分布が生じたことを示した。しかし、ｔｅｌピーク面積％は、下限２５％閾値をわずかにだけ上回っていた（平均２６％）。こうした理由から、またシステムの再現性を試験するため、２００ｎｇ、５００ｎｇまたは１０００ｎｇのＤＮＡのいずれかをＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ ｐｒｏシステムに加えたフォローアップ実験を実施した（図２０ａ）。それぞれのＤＮＡ量は４回繰り返した。ＨＴ－ＳＴＥＬＡアッセイのシグナル強度を高め、それにより頑健性を高める試みにおいて、以前に使用した９μｌの代わりに、１２μｌの溶出ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた。次いで、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物をＰＣＲにかけ、得られたＰＣＲ産物をキャピラリー電気泳動によって展開した。図２０ａは、ＤＮＡの増加が、ｔｅｌピーク面積％の増加とともに、アッセイをより頑健にしたことを示している。繰り返しのうちの２つ（２００－３および２００－４）については、この値は、下限２５％閾値よりわずかに下であるが、残りの繰り返しについては、その値は閾値を超えている。ｔｅｌピーク面積％の範囲は、２４．４４～４１．６３％の範囲で増加し、平均は３４％であったが、９μｌの溶出ＤＮＡを反応物ごとに加えた場合、範囲は１９．０４～２７．２％で、平均は２６％であった。
【0124】
正規化ＤＮＡ試料から生成されたＰＣＲ産物から測定したＸｐＹｐの平均テロメア長は、正確に５．８６８ｋｂ～６．１０６ｋｂの範囲であり、これは、陽性対照ＨＴ１０８０ ｃｌ２ ＤＮＡの５．９５６ｋｂ測定ＭＴＬにかかっている。このＭＴＬ範囲は、全体の変動係数が１．６５％であった（図２０ｂ）。投入ＤＮＡ量の繰り返し間のＣＶ％は同様に非常に低く、２００ｎｇでは１．３９７％、５００ｎｇでは２．１５２％、１０００ｎｇでは１．４７３％であった。
【0125】
これらの実験をまとめると、２００ｎｇ以上のＤＮＡを含有するＤＮＡ試料は、Ｍａｘｗｅｌｌ １６ ＤＮＡ抽出システムと併用のＤＮＡ ＩＱ ｃａｓｅｗｏｒｋ抽出キットを使用して正規化することができ、それにより、ＤＮＡ定量に要する時間の必要性がなくなることを示している。さらに、１２μｌのこの溶出ＤＮＡをＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えると、非常に正確な平均テロメア長が測定可能な、頑健で信頼性の高いテロメア長分布スメアを生成することができる。
【0126】
ＤＮＡ試料カードに向けてのＨＴ－ＳＴＥＬＡの調整
また本発明者らは、試料カード（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） ＦＴＡ／ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅカード）に保存された血液試料を解析することができるＨＴ－ＳＴＥＬＡの調整について検討した。ＦＴＡカードは、その後の下流でのＤＮＡ解析用の血液試料にとって都合のよいサンプリングと保存を行う、一般に用いられているフォーマットである。これは、テロメア検査を必要とし得る患者に、臨床医または採血者を必要とすることなく、自宅で試料を用意するための迅速な方法を提供する。少量の血液試料をＦＴＡカード上にスポットし、次いで、標準の郵便サービスによって検査施設に返送する。またこれは、ＦＴＡカードに保存されている試料を有するトライアルコホートの解析においても有用性がある。
また本発明者らは、試料カード（例えば、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標） ＦＴＡ／ＦＴＡ Ｅｌｕｔｅカード）に保存された血液試料を解析することができるＨＴ－ＳＴＥＬＡの調整について検討した。ＦＴＡカードは、その後の下流でのＤＮＡ解析用の血液試料にとって都合のよいサンプリングと保存を行う、一般に用いられているフォーマットである。これは、テロメア検査を必要とし得る患者に、臨床医または採血者を必要とすることなく、自宅で試料を用意するための迅速な方法を提供する。少量の血液試料をＦＴＡカード上にスポットし、次いで、標準の郵便サービスによって検査施設に返送する。またこれは、ＦＴＡカードに保存されている試料を有するトライアルコホートの解析においても有用性がある。
【0127】
システムを試験するため、３人のＣＬＬ患者由来の血液１２５μｌをＦＴＡカードにスポットし、一晩空気乾燥させた。３人の患者は、異なる白血球（ＷＢＣ）数を有していた；患者７１は、４５×１０６細胞／ｍｌのＷＢＣ数を有していたが、患者７４は、６×１０６細胞／ｍｌの数を有しており、患者７５は、１０１×１０６細胞／ｍｌのＷＢＣ数を有していた。異なるＷＢＣ数を有する患者でこの手順を試みる背景の論理的根拠は、十分な細胞、すなわち、信頼性が高く頑健なテロメア長分布スメアの生成に十分な抽出ＤＮＡを提供する、下限ＷＢＣ数に関する指標を提供することであった。
【0128】
ＤＮＡは、ｃａｓｅｗｏｒｋ抽出バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、乾燥させた血液スポットの２つの３ｍｍパンチから１４００ｒｐｍで振盪しながら、６５℃で１時間抽出した。次いで、溶出した血液細胞溶解産物を剥離パンチから分離し、ＬＥＶ血液キットを使用し、Ｍａｘｗｅｌｌ自動ＤＮＡ抽出システムでＤＮＡを抽出した。陰性対照のパンチも含んでいた（血液を含まないＦＴＡカード）。プロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に記載されているように、ＬＥＶ血液カートリッジをＤＮＡ抽出に使用し、ＤＮＡを５０μｌ溶出バッファーに溶出させた。３μｌの溶出ＤＮＡを前述と同様の方法で、それぞれのＨＴ－ＳＴＥＬＡ反応物に加えた。次いで、これらの反応物を２３回のＰＣＲ増幅に供し、フラグメントアナライザー（商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ；図２１ａ）でＤＮＡ断片を展開した。予想通りに、陰性対照はＰＣＲ産物を生成しなかった。しかし、テロメア長分布スメアが、患者７１および患者７５の乾燥血液から抽出したＤＮＡから生成された。このＦＴＡ－ＳＴＥＬＡ方法を使用したこれら患者の算出平均テロメア長（ＭＴＬ）は、ＳＴＥＬＡによって測定したＭＴＬに非常に類似していた：患者７１では、ＦＴＡ－ＳＴＥＬＡのＭＴＬは、ＳＴＥＬＡにより測定した４．１６９ｋｂと比べ、３．８８９ｋｂであった。同様に、患者７５では、ＦＴＡ－ＳＴＥＬＡで得られたＭＴＬの２．０３６ｋｂは、ＳＴＥＬＡ ＭＴＬの１．８５６ｋｂと非常に類似していた。患者７４では、テロメア長分布プロファイルを生成することができなかった。これは、頑健なテロメア長プロファイルの生成に必要とされる４×１０５細胞よりは少ないけれども、この乾燥血液スポットの２つの３ｍｍパンチ上の細胞数が７．５×１０４細胞を含有すると推測されるため、低ＷＢＣ数（６×１０６細胞／ｍｌ）によるものとは思われず、検出可能なプロファイルを生成するのに十分なＤＮＡが存在していたはずである（図１２ｂ）。あるいは、この否定的な結果は、実験内に生じた技術的な問題によるものかもしれない。患者７１および患者７５の乾燥血液スポットの２つの３ｍｍのパンチ上の細胞数は、５．６３×１０５細胞および１．５７５×１０６細胞であると推測された。細胞数のこの差は、溶出ＤＮＡの濃度における差（７１－８．７９３ｎｇ／μｌ、７５－７０．１１３ｎｇ／μｌ）だけでなく、２人の患者のテロメア長分布スメアのｔｅｌピーク面積％においても反映されている（７１－４４．７９％、７５－１３８．８９％）。
【0129】
溶出ＤＮＡの濃度、およびテロメア長分布スメアから生成されたｔｅｌピーク面積％の両方における大きな差は、解析した異なる試料間で確認された（図２１ａ）。したがって、本発明者らは、ＦＴＡカード抽出物からの溶出ＤＮＡを正規化する試みにおいて、ＤＮＡ ＩＱ Ｃａｓｅｗｏｒｋ Ｐｒｏキットを試験した。本発明者らは、以前に、ＤＮＡ ＩＱシステムを飽和し、したがって、ＤＮＡ濃度を正規化することがわかった細胞数は４×１０５であることを示した。本発明者らは、ＷＢＣ数が３２×１０６細胞／ｍｌである患者由来の乾燥血液スポットの２つの３ｍｍパンチ上にこの細胞数が存在するであろうと推測した。しかしまた、ＷＢＣ数が１６×１０６細胞／ｍｌのように低い患者からもテロメア長分布スメアを生成することができる可能性があると思われ、こうした患者から得た２つの３ｍｍＦＴＡカードパンチが、本発明者らが以前に示したＨＴ－ＳＴＥＬＡプロファイルを生成するための細胞数である２×１０５細胞を含有すると推測した（図１２ｂ）。これを試験するため、さらなる患者：ＷＢＣ数が２０×１０６細胞／ｍｌの患者８９を解析に入れた。ＤＮＡを、この患者の乾燥血液スポットから抽出するとともに、患者７１および患者７５と一緒に、患者９１（ＷＢＣ数－６９×１０６細胞／ｍｌ）のＦＴＡ試料から抽出した。患者７４は、テロメア長プロファイルがＳＴＥＬＡ、ＨＴ－ＳＴＥＬＡまたはＦＴＡ ＳＴＥＬＡで達成されなかったので、除外した。
【0130】
溶出ＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ ＩＱシステムがそれぞれの試料から溶出したＤＮＡが順調に正規化されたことを示している（図２１ｂ）。そのＤＮＡ濃度は４．５７６～６．０２７ｎｇ／μｌの範囲であり、ＬＥＶ血液キットを使用してＤＮＡを抽出した場合に確認された範囲よりも低い範囲であった。テロメア長分布スメアは、４つのすべての溶出ＤＮＡ試料から生成された（図２１ｂ）。これら４つのテロメア長分布スメアのうち、３つは頑健で、ｔｅｌピーク面積％については２５％下限閾値を超えていた。これらの頑健なテロメア長分布のうちの１つは、患者８９（ＷＢＣ数－２０）の乾燥血液から抽出されたＤＮＡから生成されており、このことは、ＷＢＣ数が３２×１０６未満の患者がＦＴＡ－ＳＴＥＬＡによって測定されるＸｐＹｐ ＭＴＬを有し得ることを示唆している。ＦＴＡ－ＳＴＥＬＡに関するＷＢＣ数の下限値は依然未知ではあるが、今後のアッセイで解明されることが期待される。患者８９に対してＦＴＡ－ＳＴＥＬＡによって測定したＭＴＬは２．９６２ｋｂであり、ＳＴＥＬＡによって測定したＭＴＬ（２．７５ｋｂ）と非常に類似していた。患者７１および患者７５のＦＴＡ－ＳＴＥＬＡ ＭＴＬも同様に正確であった：患者７１のＦＴＡ－ＳＴＥＬＡ ＭＴＬは、ＳＴＥＬＡによって測定した４．１６９に対し、３．８８９ｋｂであった。同様に、患者７５の２．０６８ｋｂのＦＴＡ－ＳＴＥＬＡ ＭＴＬは、１．８５６ｋｂのＳＴＥＬＡ ＭＴＬと非常に類似していた。
【0131】
患者９１の乾燥血液スポットから抽出されたＤＮＡからは、低いｔｅｌピーク面積％を反映して、それほど強くないテロメア長分布スメアが生成された（図２１ｂ）。シグナル強度の低下によって、平均ＸｐＹｐテロメア長を測定する際の精度が低下することと、生物学的な複製間の変動も大きくなることは前に示している（図１１）。６．２９３ｋｂのＦＴＡ－ＳＴＥＬＡ ＭＴＬは、５．００８ｋｂのＳＴＥＬＡ測定値と比べ著しい過大評価であるので、この試料では、実際、ＭＴＬ測定での精度の低下が見られた。
【0132】
ＦＴＡカードに保存されたＣＬＬ患者血液試料から頑健なテロメア長プロファイルを生成することに成功したので、本発明者らは、ＣＬＬ患者における平均ＸｐＹｐテロメア長を精度よく測定するＦＴＡ－ＳＴＥＬＡ能力を試験するため、より大がかりな研究に着手した。ＦＴＡ ＳＴＥＬＡをＳＴＥＬＡと並行してＣＬＬ患者のコホートで実施し、両技術によって測定した平均ＸｐＹｐテロメア長を比較した。合計で、ＤＮＡは２６名のＣＬＬ患者の乾燥血液から抽出した。ＦＴＡ－ＳＴＥＬＡを実施し、測定して得たＭＴＬを、ＨＴ－ＳＴＥＬＡで生成したＭＴＬと比較した（図２１ｃ）。両技術により決定したＭＴＬ間で明瞭な相関が確認され（Ｒ２＝０．９０８４）、ＦＴＡ－ＳＴＥＬＡを使用して、ＣＬＬ患者での平均ＸｐＹｐテロメア長を精度よく測定することができることが示唆された。
【0133】
本発明者らは、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ方法がＦＴＡカードに保存された血液試料の解析に適用でき、この方法が他のカード系の試料保存システムにも適用可能であることを明らかにした。この適応は、患者が標準の自己サンプリングキットを使用し、解析のための検査施設にこれらを直接に送ることができることにより、ＨＴ－ＳＴＥＬＡ方法にさらなる著しい有用性を提供する。これは、血液試料の取得および上流での処理の点において、大幅なコスト削減を提供する。
【0134】
要約
テロメア機能障害を表すテロメア長解析は、ヒト疾患における高度な予後判定ツールを提供し、処置後の臨床転帰についての重要な識別を可能にする。さらに、予後判定能力によって、臨床医は、これらの疾患の臨床経過を確信して予測し、それに応じて処置を調整することができるはずである。
テロメア機能障害を表すテロメア長解析は、ヒト疾患における高度な予後判定ツールを提供し、処置後の臨床転帰についての重要な識別を可能にする。さらに、予後判定能力によって、臨床医は、これらの疾患の臨床経過を確信して予測し、それに応じて処置を調整することができるはずである。
【0135】
したがって、ハイスループット状況においてテロメア長を測定するための信頼性の高い方法は、臨床医がテロメア短縮疾患を決定、管理および処置する能力に大きく寄与するものである。
【0136】
参考文献
１６． Ｃａｐｐｅｒ Ｒ，Ｂｒｉｔｔ－Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｂ，Ｔａｎｋｉｍａｎｏｖａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００７；２１：２４９５－５０８。
１７． Ｌｅｔｓｏｌｏ ＢＴ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０；３８：１８４１－５２。
１８． Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０；ｅ４７．
１９． Ｓｈｅｎ，Ｊ．，Ｔｅｒｒｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｇｕｒｖｉｃｈ，Ｉ．，Ｌｉａｏ，Ｙ．，Ｓｅｎｉｅ，Ｒ．Ｔ．ａｎｄ Ｓａｎｔｅｌｌａ，Ｒ．Ｍ．Ｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ： ａ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｓｉｓｔｅｒ ｓｅｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７： ５５３８－５５４４．Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ａｖｉｖ，Ａ．Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ： ｆａｕｌｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅｓ．Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２００８；６３： ９７９－９８３。
２０． Ｂａｉｒｄ ＤＭ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｗｙｎｆｏｒｄ－Ｔｈｏｍａｓ Ｄ，Ｋｉｐｌｉｎｇ Ｄ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ｉｎ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００３；３３：２０３－７。
２１． Ｂｒｉｔｔ－Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｂ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｌｏｃｋｅ Ｍ，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｉ，Ｋｉｐｌｉｎｇ Ｄ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｓ ｇｏｖｅｒｎｅｄ ｂｙ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００６；１５：７２５－３３。
２２． Ｃａｐｐｅｒ Ｒ，Ｂｒｉｔｔ－Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｂ，Ｔａｎｋｉｍａｎｏｖａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００７；２１：２４９５－５０８。
２３． Ｌｅｔｓｏｌｏ ＢＴ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０；３８：１８４１－５２。
２４． Ｌｉｎ ＴＴ，Ｎｏｒｒｉｓ Ｋ，Ｈｅｐｐｅｌ ＮＨ，Ｐｒａｔｔ Ｇ，Ａｌｌａｎ ＪＭ，Ａｌｌｓｕｐ ＤＪ，Ｂａｉｌｅｙ Ｊ，Ｃａｗｋｗｅｌｌ Ｌ，Ｈｉｌｌｓ Ｒ，Ｇｒｉｍｓｔｅａｄ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ，ｅｖｅｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２０１４．１０．１１１１／ｂｊｈ．１３０２３
２５． 国際公開第２０１３／０２４２６４号パンフレット
２６． （Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０－８４４，１９９６）
２７． Ｒｏｇｅｒ Ｌ，Ｊｏｎｅｓ ＲＥ，Ｈｅｐｐｅｌ ＮＨ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＴ，Ｓａｍｐｓｏｎ ＪＲ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｅｒｏｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｍａｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２０１３；１０５：１２０２－１１。
１６． Ｃａｐｐｅｒ Ｒ，Ｂｒｉｔｔ－Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｂ，Ｔａｎｋｉｍａｎｏｖａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００７；２１：２４９５－５０８。
１７． Ｌｅｔｓｏｌｏ ＢＴ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０；３８：１８４１－５２。
１８． Ｃａｗｔｈｏｎ，Ｒ．Ｍ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０；ｅ４７．
１９． Ｓｈｅｎ，Ｊ．，Ｔｅｒｒｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｇｕｒｖｉｃｈ，Ｉ．，Ｌｉａｏ，Ｙ．，Ｓｅｎｉｅ，Ｒ．Ｔ．ａｎｄ Ｓａｎｔｅｌｌａ，Ｒ．Ｍ．Ｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ： ａ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｓｉｓｔｅｒ ｓｅｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７： ５５３８－５５４４．Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ａｖｉｖ，Ａ．Ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ： ｆａｕｌｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅｓ．Ｊ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ，２００８；６３： ９７９－９８３。
２０． Ｂａｉｒｄ ＤＭ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｗｙｎｆｏｒｄ－Ｔｈｏｍａｓ Ｄ，Ｋｉｐｌｉｎｇ Ｄ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ｉｎ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００３；３３：２０３－７。
２１． Ｂｒｉｔｔ－Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｂ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｌｏｃｋｅ Ｍ，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ Ｉ，Ｋｉｐｌｉｎｇ Ｄ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｓ ｇｏｖｅｒｎｅｄ ｂｙ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００６；１５：７２５－３３。
２２． Ｃａｐｐｅｒ Ｒ，Ｂｒｉｔｔ－Ｃｏｍｐｔｏｎ Ｂ，Ｔａｎｋｉｍａｎｏｖａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ ａ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００７；２１：２４９５－５０８。
２３． Ｌｅｔｓｏｌｏ ＢＴ，Ｒｏｗｓｏｎ Ｊ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｓｈｏｒｔ ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅｄ ｂｙ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃａｎ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０；３８：１８４１－５２。
２４． Ｌｉｎ ＴＴ，Ｎｏｒｒｉｓ Ｋ，Ｈｅｐｐｅｌ ＮＨ，Ｐｒａｔｔ Ｇ，Ａｌｌａｎ ＪＭ，Ａｌｌｓｕｐ ＤＪ，Ｂａｉｌｅｙ Ｊ，Ｃａｗｋｗｅｌｌ Ｌ，Ｈｉｌｌｓ Ｒ，Ｇｒｉｍｓｔｅａｄ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋａｅｍｉａ，ｅｖｅｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２０１４．１０．１１１１／ｂｊｈ．１３０２３
２５． 国際公開第２０１３／０２４２６４号パンフレット
２６． （Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４０－８４４，１９９６）
２７． Ｒｏｇｅｒ Ｌ，Ｊｏｎｅｓ ＲＥ，Ｈｅｐｐｅｌ ＮＨ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＴ，Ｓａｍｐｓｏｎ ＪＲ，Ｂａｉｒｄ ＤＭ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｅｒｏｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｄｅｎｏｍａｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２０１３；１０５：１２０２－１１。
【0137】
【表1-1】
【0138】
【表1-2】
【0139】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【配列表】