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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-05
(45)【発行日】2022-08-16
(54)【発明の名称】安定性改良型免疫グロブリン結合性ペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20220808BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220808BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20220808BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220808BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220808BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220808BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220808BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20220808BHJP
B01D 15/38 20060101ALI20220808BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20220808BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/315
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
B01J20/22 D
B01D15/38
C07K1/22
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2019509058
(86)(22)【出願日】2018-03-02
(86)【国際出願番号】 JP2018008050
(87)【国際公開番号】W WO2018180204
(87)【国際公開日】2018-10-04
【審査請求日】2021-01-29
(31)【優先権主張番号】P 2017071908
(32)【優先日】2017-03-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」「国際基準に適合した次世代抗体医薬等の製造技術」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】特許業務法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】吉田 慎一
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－０７９１５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１３６９１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Biophysical Journal，2006年，Vol.90，p.2911-2921
【文献】Journal of Biotechnology，2008年，Vol.134，p.222-230
【文献】Protein Engineering，2002年，Vol.15, No.10，p.835-842
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／３１
Ｃ０７Ｋ １４／３１５
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（１）～（３）のいずれかの改変型免疫グロブリン結合性ペプチド。（１） 配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第８位のアミノ酸残基がＩｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第８位を除く領域中で１個または２個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第８位の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）；
上記（２）および（３）において、変異位置が、第６位、第７位、第１３位、第１５位、第１８位、第１９位、第２１位、第２４位、第２８位、第２９位、第３０位、第３１位、第３３位、第３５位、第３９位、第４０位、第４２位および第４７位から必須的になる群より選択される１以上の部位である。
【請求項2】
上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第８位がＩｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓに置換されている請求項１に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド。
【請求項3】
請求項１または２に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体。
【請求項4】
請求項１または２に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチドまたは請求項３に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体と水不溶性担体を含み、該改変型免疫グロブリン結合性ペプチドまたは該改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
【請求項5】
免疫グロブリンのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、請求項４に記載のアフィニティー分離マトリックスと、該タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合した該タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項6】
請求項１または２に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド、または請求項３に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項7】
請求項６に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項8】
請求項７に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アルカリ溶液に対する化学的安定性が改良された免疫グロブリン結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる抗体または抗体断片の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および、当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と省略する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。
【0003】
グループＧの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）も、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品もある（ＧＥヘルスケア社製，製品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ」，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、かつ、ＳｐＡよりも広い動物種のＩｇＧに強く結合するという特徴を示す。さらに、Ｆａｂ領域にも弱いながら結合することが分かっており（非特許文献３，４）、Ｆａｂ領域への結合力を向上する取組みもなされている（特許文献２～４，非特許文献５）。
【0004】
しかし、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスの方が、抗体医薬の精製に広く利用されており、その理由の１つとして、アルカリ溶液に対する安定性が、ＳｐＡの方がＳｐＧよりも高いことが挙げられる（非特許文献１）。アルカリに対する安定性が高いと、アフィニティ分離マトリックスを、洗浄・殺菌効果が高く安価な水酸化ナトリウム水溶液で洗浄することで再生し、繰り返し利用することができる。アフィニティ分離マトリックスのタンパク質性リガンドのアルカリに対する安定性を上げる方法としては、アミノ酸変異を導入するなどのタンパク質工学の手法などがある。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある（非特許文献１）。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異が向上効果を示すわけではない（非特許文献１，６）。同じように、ＳｐＧについても、アスパラギン残基に変異を導入する検討がなされてきたが（特許文献５、非特許文献７，８）、ＳｐＡの場合と同様に全ての変異に効果があるわけではなく、また、ＳｐＡに匹敵するようなアルカリに対する安定性には達していないため、改良の余地が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開昭６３－５０３０３２号公報
【文献】特開２００９－１９５１８４号公報
【文献】国際公開第２０１５／０３００９４号パンフレット
【文献】国際公開第２０１６／０６１４２７号パンフレット
【文献】特開２０１６－０７９１５３号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｈｏｂｅｒ Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００７，８４８巻，４０－４７頁
【文献】Ｓｈｕｋｌａ Ａ．Ａ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２８巻，２５３－２６１頁
【文献】Ｂｏｕｖｅｔ Ｐ．Ｊ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，１９９４，１６巻，４１９－４２４頁
【文献】Ｄｅｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５９巻，７５２－７５４頁
【文献】Ｂａｉｌｅｙ Ｌ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，４１５巻，２４－３０頁
【文献】Ｌｉｎｈｕｌｔ Ｍ．ら，ＰＲＯＴＥＩＮＳ，２００４，５５巻，４０７－４１６頁
【文献】Ｇｕｌｉｃｈ Ｓ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，２００２，１５巻，８３５－８４２頁
【文献】Ｐａｌｍｅｒ Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，１３４巻，２２２－２３０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
免疫グロブリンのＦｃ領域やＦａｂ領域に結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、新規な改変型プロテインＧ、および、当該改変型プロテインＧをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いた抗体または抗体断片の製造方法を提供することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決するために、ＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて該変異体を形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の物性を比較する検討を行った。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0009】
［１］ 下記（１）～（３）のいずれかの改変型免疫グロブリン結合性ペプチド。
（１） 配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第８位を除く領域中で１個または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第８位の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
（１） 配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第８位を除く領域中で１個または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第８位の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【0010】
［２］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第８位がＩｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓに置換されている上記［１］に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド。
【0011】
［３］ 上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されるアミノ酸の部位が、第６位、第７位、第１３位、第１５位、第１８位、第１９位、第２１位、第２４位、第２８位、第２９位、第３０位、第３１位、第３３位、第３５位、第３９位、第４０位、第４２位および第４７位から必須的になる群より選択される１以上の部位である上記［１］～［２］のいずれかに記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド。
【0012】
［４］ 上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されるアミノ酸の部位がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］～［３］のいずれかに記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド。
【0013】
［５］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体。
【0014】
［６］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチドまたは上記［５］に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体と水不溶性担体を含み、該改変型免疫グロブリン結合性ペプチドまたは該改変型免疫グロブリン結合性ペプチドがリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
【0015】
［７］ 免疫グロブリンのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［６］に記載のアフィニティー分離マトリックスと、該タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合した該タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
上記［６］に記載のアフィニティー分離マトリックスと、該タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合した該タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【0016】
［８］ 上記［１］～［４］のいずれかに記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド、または上記［５］に記載の改変型免疫グロブリン結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【0017】
［９］ 上記［８］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【0018】
［１０］ 上記［９］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
【発明の効果】
【0019】
本発明で得られた改変型ＳｐＧを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによる免疫グロブリン結合活性の低下が少ない。よって、繰返し使用に際して、高濃度または長時間での水酸化ナトリウム水溶液を用いた洗浄が可能である。
【0020】
特にＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインの第８位については、非特許文献７（文献中の第７位に相当）では、Ａｌａに変異したＳｐＧ変異体ではアルカリ耐性の向上はほとんど見られず、また、非特許文献８では、ＧｌｙおよびＴｈｒに変異したＳｐＧ変異体が高いアルカリ耐性を示すデータが報告されているが、本発明においてそれらを上回るアルカリ耐性向上が見られた。
【0021】
このように先行文献が多数出ている中で、さらにアルカリ耐性が顕著に向上するアミノ酸置換変異があると想定するのは、決して容易なことでは無い。本発明によって、分岐鎖アミノ酸、酸性アミノ酸、および、塩基性アミノ酸への置換が効果的であることが示されたが、このような傾向は一般的では無い。ＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインの第８位の立体構造上の位置、ＩｇＧ結合への関与、および、アルカリに対する感受性が複合的に係ったために想定しない効果が得られたと考えられる。芳香族アミノ酸やヒドロキシアミノ酸については、このような効果が得られないことも確かめており、この発明によって、単なる最適化の枠を超えた、アルカリに対する化学的安定性を向上するための新たな手法論が見出されたと言える。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】本発明の実施例２に係る、各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘの各濃度におけるＦｃ結合レスポンスをプロットしたグラフである。
【図2】本発明の実施例２に係る、各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘのアルカリ耐性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドは、下記（１）～（３）のいずれかのものである。
（１） 配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第８位を除く領域中で１個または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第８位の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
（１） 配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列において、第８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＶａｌに置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第８位を除く領域中で１個または数個のアミノ酸がさらに欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド；
（３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第８位の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
【0024】
「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、抗原と呼ばれる特定の分子に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、それぞれ２本ずつの軽鎖と重鎖のポリペプチドから構成されている４本鎖“Ｙ”字型構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【0025】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分のドメインは、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
【0026】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、第８位のＡｓｎをＡｌａに置換する変異は、Ｎ０８Ａと記載する。
【0027】
「プロテインＧ（ＳｐＧ）」は、グループＧの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）の細胞壁に由来するタンパク質である。ＳｐＧは、ほとんどの哺乳類の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）と結合する能力を有しており、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、ＩｇＧのＦａｂ領域にも弱く結合する。より詳細には、Ｆｃ領域に関しては、ＣＨ２とＣＨ３に跨る形で結合し、Ｆａｂ領域に関しては、ＣＨ１領域（ＣＨ１γ）を中心に結合し、一部はＣＬ領域にも結合する（非特許文献３，４）。例えば、Ｆａｂ領域に対する結合力が強化されたＳｐＧ変異体も開発されており（特許文献２～４，非特許文献５）、それらの変異体に対しても本発明は適用可能である。
【0028】
ＳｐＧのＩｇＧ結合性を示す機能ドメインは、βドメイン（ＳｐＧ－β）と呼ばれる。なお、β（Ｂ）ドメインと呼ぶ場合と、Ｃドメインと呼ぶ場合の２通りがあり（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２８，１３３８８－，Ｆｉｇ．５参照）、本明細書では、Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋらの定義に従ってβドメインと呼ぶ（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８６１６７，８７０－）。
【0029】
本発明に係る免疫グロブリン結合性ペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦａｂ領域に結合する。本発明ペプチドが結合すべき免疫グロブリンは、Ｆｃ領域またはＦａｂ領域を含むものであれば特に制限されず、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であってもよいし、ＩｇＧの誘導体であってもよい。例えば、免疫グロブリンＧのＦｃ領域またはＦａｂ領域のみに断片化されたフラグメント、ＩｇＧの一部のドメインを他生物種のＩｇＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型ＩｇＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えたＩｇＧ、薬剤を共有結合したＩｇＧ、およびＦｃ領域やＦａｂ領域をタグとして付加した融合タンパク質などを挙げることができる。
【0030】
上記免疫グロブリン結合性ペプチド（１）に規定されるアミノ酸配列は、基本的にＳｐＧ－βとしての構造・機能を有するアミノ酸配列である。本発明は、野生型ＳｐＧ－βに変異を導入した配列を有するペプチドに関するが、その変異導入前のアミノ酸配列は、野生型ＳｐＧ－β１（配列番号１）および野生型ＳｐＧ－β２（配列番号２）が挙げられる。なお、野生型ＳｐＧ－β１のＮ末端はＡｓｐだが、配列番号１のＮ末端は他のドメインと同様にＴｈｒとしている。文献によっては（例えば非特許文献７では）、このＮ末端はドメインに含めておらず、基本的にどのアミノ酸でも違いはない。最終的に得られるペプチドが本発明範囲に含まれるものであれば、それら以外のアミノ酸配列であっても適用可能である。例えば、グループＧの連鎖球菌であるＧ１４８株またはＧＸ７８０５株由来のＳｐＧに含まれる３個のＩｇＧ結合性ドメインのＮ末端側から２番目のドメインであっても、同様の効果が得られるのは自明である。当該ドメインは、野生型ＳｐＧβ－１（配列番号１）のアミノ酸配列に対し、第６位がＩｌｅからＶａｌに、第７位がＬｅｕからＩｌｅに置換された配列を有し、同等の機能を示し、本発明が適用できるのは明らかである。熱安定性に優れたプロテインＧの変異体も多数知られており、例えば、変異型ＳｐＧ－β２（配列番号３）のような、国際公開第９７／２６９３０号公報、特開２００３－８８３８１号公報などに記載のアミノ酸配列が挙げられる。また、特許文献２～４に記載の、Ｆａｂ結合力が向上したＳｐＧ－β変異体も本発明の適用対象として好ましく、例えば、配列番号４～５のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するＳｐＧ－β変異体のさらなる変異体が、Ｆａｂ結合性ペプチドとして好ましい。
【0031】
本発明における改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）は、上述の第８位のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。配列番号１～５のアミノ酸配列において、第８位はＡｓｎである。
【0032】
本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、－Ｓ－Ｓ－結合などの架橋構造などが挙げられる。
【0033】
例えばＮ末端にペプチドが付加されたような場合であっても、配列同一性を基準に、配列番号１～５のアミノ酸配列の第８位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。例えば、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）のアライメント機能を使って位置を特定することが可能である。
【0034】
変異後のアミノ酸、即ち配列番号１～５のアミノ酸配列における第８位のＡｓｎに置き換わるアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができ、アルカリ耐性向上の観点から、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＶａｌが好ましい。さらにＶａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓがより好ましく、さらにＬｙｓがより好ましい。また、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａの小型アミノ酸；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸に分類することもできる。これらの観点から、本発明で置換するアミノ酸は、分岐アミノ酸、酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸が好ましく、さらに、分岐アミノ酸または塩基性アミノ酸がより好ましい。
【0035】
本発明における改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（２）は、上記（１）のアミノ酸配列において、上記第８位を除く領域中で、１個または数個のアミノ酸残基が、欠失、置換および付加から選択される１以上の変異を付与されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチドである。
【0036】
本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（２）に関し、「１個から数個」の範囲とは、欠失などを有する改変型免疫グロブリン結合性ペプチドが免疫グロブリンへの高い結合力を有する限り特に限定されるものではない。上記「１個から数個」の範囲は、例えば３０個以下とすることができ、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは７個以下、一層好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下、１個以上または２個以下、１個程度であることができる。
【0037】
１個または数個の変異位置は、第８位以外であれば、どの部位でも問題ない。例えば、配列番号１～５の第６位、第７位、第１９位、第２４位、第２８位、第２９位、第３１位、第３５位、第４０位、第４２位および第４７位から必須的になる群より選択される１以上の部位が変異位置として好ましい。これら部位は、配列番号１～３の間でアミノ酸の種類が異なる部位である。また、配列番号１～５の第１３位、第１５位、第１８位、第１９位、第２１位、第２８位、第３０位、第３３位および第３９位から必須的になる群より選択される１以上の部位が変異位置として好ましい。これら部位は、配列番号１、４および５の間でアミノ酸の種類が異なる部位である。
【0038】
さらに、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。付加するアミノ酸配列の実施形態としては、該ペプチドをマトリックスに固定化する際に有用な、ＬｙｓやＣｙｓを含むアミノ酸配列をＣ末端側に付加することが挙げられる。
【0039】
なお、上記の欠失や付加が加わってアミノ酸数が変化した場合であっても、変異導入前におけるアミノ酸残基の位置に対応する変異導入後におけるアミノ酸残基の位置は、変異導入前後のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば容易に検索可能である。このようなアライメント解析の手法は、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）に関して説明したとおり、当業者に広く知られている。
【0040】
本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（３）に関し、配列同一性としては、８０％以上または８５％以上が好ましく、９０％以上、９５％以上または９８％以上がより好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がよりさらに好ましい。上記配列同一性は、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）に関して説明したとおり、アミノ酸配列多重アライメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。
【0041】
但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第８位の置換アミノ酸残基は、（３）においてさらに変異しないものとする。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が８０％以上ある場合に、配列番号１の第８位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。
【0042】
本発明は、アミノ酸置換変異を導入することによって、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、変異導入前に比べて向上していることを特徴とする変異体を創製する技術である。改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）は、後記の実施例において確かめられている通り、アルカリ性水溶液で処理してもアルカリによるダメージがより少なく、免疫グロブリン結合性能を高いレベルで維持している。また、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（２），（３）も、化学的安定性に優れる。具体的には、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（２），（３）のアルカリ性水溶液に対する化学的安定性は、配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチドの化学的安定性より優れていることが好ましく、また、配列番号１～５の第８位における同様の変異を有する改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）の化学的安定性と同等またはより優れていることがより好ましい。また、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（２），（３）のＦｃ領域および／またはＦａｂ領域に対する結合活性も、配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチドの結合性より優れていることが好ましく、また、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）の結合性と同等またはより優れていることがより好ましい。
【0043】
「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下または０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、１０ｍＭが好ましく、１５ｍＭがより好ましく、２０ｍＭがより好ましく、２５ｍＭがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、１２．０以上が好ましく、１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、１４以下が好ましく、１３．５以下がさらにより好ましく、１３．０以下がさらにより好ましい。
【0044】
「化学的安定性」とは、ペプチドがアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、ペプチドの機能を保持する性質を指す。本発明においては、ペプチドの機能保持とは、免疫グロブリンへの結合活性を指す。本発明において「免疫グロブリンへの結合活性」とは、化学変性を受けずに抗体またはその断片に対する親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、免疫グロブリンへの結合活性が低下する度合いが小さい。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
【0045】
ペプチドをアルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が１５ｍＭで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、３０分が好ましく、１時間がより好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。
【0046】
抗体またはその断片に対する結合活性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドが抗体またはその断片に結合した時の結合シグナルが検出できればよい。測定条件としては、温度は２０℃以上４０℃以下の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨは５以上８以下程度の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０Ｍ以上０．１５Ｍ以下程度が好ましい。
【0047】
抗体またはその断片に結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他 著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明のペプチドの抗体またはその断片に対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧまたはその断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒト免疫グロブリンへの親和定数（ＫA）が１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であることが好ましい。しかし、親和定数は、免疫グロブリンの種類や、免疫グロブリン結合ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
【0048】
ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、抗体またはその断片に結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子の抗体またはその断片に対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、抗体またはその断片をセンサーチップに固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度の抗体またはその断片を添加したときの、結合シグナルの大きさ、または、理論的最大結合容量（Ｒmax）という、結合レスポンスの大きさを示すレゾナンスユニット（ＲＵ）を単位とする結合パラメータを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。例えば、ペプチドを固定化し、固定化したチップをアルカリ処理する前と後で同じ濃度の抗体またはその断片を添加して結合シグナルの大きさを比較してもよい。
【0049】
残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。
【0050】
この際に重要なことは、比較対照とするサンプルは、本発明の変異が含まれていないという点だけが異なり、それ以外のアミノ酸配列は同じであり、かつ、アルカリ処理および残存結合活性の測定の条件を全て一緒にすることである。また、本発明のペプチドは、アルカリ性水溶液中では免疫グロブリン結合性は示さないので、アルカリ処理の後で酸による中和によってｐＨを中性にするなどの適切な処理が必要である。
【0051】
プロテインＧは、免疫グロブリン結合性ドメインを２個または３個タンデムに並んだ形で含むタンパク質である。本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該改変型免疫グロブリン結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限は、例えば１０個、好ましくは８個、より好ましくは６個である。これらの多量体は、単一の改変型免疫グロブリン結合性ペプチドの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類の改変型免疫グロブリン結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【0052】
本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドの連結のされ方としては、１個または複数個のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは１残基以上２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。好ましくは、野生型ＳｐＧのβ１とβ２の間、または、β２とβ３の間を連結している配列を利用するのがよい。また、別の観点からは、単量体改変型免疫グロブリン結合性ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【0053】
また、本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドは、改変型免疫グロブリン結合性ペプチド（１）～（３）で規定するアミノ酸配列を有するものであればよく、他のペプチドや化合物などが結合していてもよいものとする。例えば、本発明の実施形態の１つとして、本発明により得られる改変型免疫グロブリン結合性ペプチド、または、当該ペプチドが２個以上連結された多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
【0054】
本発明は、上記の本発明ペプチドを、免疫グロブリンや、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片などその断片に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンおよびその断片に対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同義である。
【0055】
本発明で用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子担体や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類担体を挙げることができる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【0056】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【0057】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【0058】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与した免疫グロブリン結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【0059】
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィー精製法により分離精製することが可能となる。これらのタンパク質精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィー精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、上記タンパク質を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させるなどして接触させ、上記タンパク質を選択的に吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の上記タンパク質は、カラム内の本発明に係るアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明ペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする上記タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の上記タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。なお、上記タンパク質は、免疫グロブリン自体であってもよいし、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片などの抗体断片であってもよい。
【0060】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。本発明のアフィニティ分離マトリックスは、特にアルカリ性水溶液に対する化学的安定性に優れるので、強アルカリの純粋な緩衝液を通過させて洗浄することで再利用することが好ましい。しかし、強アルカリの純粋な緩衝液で再生する操作をするタイミングは、使用後に毎回である必要は無く、例えば、５回に１回や１０回に１回でも構わない。
【0061】
本発明は、本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が本発明ペプチドを構成するものであればいかなるものでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含むプラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、および、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【0062】
また、本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【0063】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法などを用いて行うことができる。即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成などによって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【0064】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法に関して、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【0065】
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【0066】
本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【0067】
本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドは、前記した形質転換体を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に、本発明ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
【0068】
本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【0069】
さらに、形質転換体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、即ち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【0070】
さらに、本発明に係る改変型免疫グロブリン結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現または融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える手法や低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【0071】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。また、培養温度は、例えば１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより、本発明ペプチドを培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）または培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【0072】
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【0073】
本願は、２０１７年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０１７－７１９０８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０１７－７１９０８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【0074】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0075】
以下の実施例で取得した改変型ペプチドは「ドメイン－導入した変異」の形で表記し、置換変異導入前のペプチドは、「ドメイン－Ｃｏｎｔ」の形で表記する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＳｐＧ－β１は「ＧＢ１－Ｃｏｎｔ」、配列番号１のアミノ酸配列に対し第８位のＡｓｎをＡｌａに置換した変異Ｎ０８Ａを導入したＳｐＧ－β１変異体は「ＧＢ１－Ｎ０８Ａ」と表記する。複数の変異を同時に導入した変異体の変異は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｎ０８ＡおよびＤ３６Ｖを導入したＳｐＧ－β１変異体は、「ＧＢ１－Ｎ０８Ａ／Ｄ３６Ｖ」と表記する。また、第８位が変異した変異体各種を総称して「Ｎ０８Ｘ」と表記する。なお、以下では「野生型ＳｐＧ－β１」を単に「ＳｐＧ－β１」と表記する場合がある。
【0076】
また、単ドメインを複数連結したペプチドについては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｎ０８Ａを導入したＳｐＧ－β１変異体を２連結したペプチドは、「ＧＢ１－Ｎ０８Ａ．２ｄ」と表記する。さらに、例えば、水不溶性基材にペプチドを固定化するために、Ｃ末端に固定化用官能基を有するＣｙｓ残基（Ｃ）を導入した場合、「ｄ」の後ろに導入したアミノ酸の１文字表記を付与する。例えば、変異Ｎ０８Ａを導入したＳｐＧ－β１変異体を２連結してＣ末端にＣｙｓを付与したＳｐＧ－β１変異体は、「ＧＢ１－Ｎ０８Ａ．２ｄＣ」と表記する。
【0077】
実施例１： 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘの調製
（１） 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘの発現プラスミド調製
各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘのアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計した。コードＤＮＡは、３種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ３１／ｆ３２／ｆ３３）を用いたＰＣＲを行い、その後制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化して、同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のマルチクローニングサイトに組み込んだ。コードＤＮＡ調製時のＰＣＲでは、まず少量のｆ３２（０．２μＭ、リーディング）とｆ３３（１０μＭ、ラギング）とがオーバーラップＰＣＲで伸張され、次に、ｆ３１（１０μＭ、リーディング）と先の反応で伸張したｆ３３（ラギング）とのオーバーラップＰＣＲによって形成される二本鎖ＤＮＡが、制限酵素サイトを両端に有したコードＤＮＡ配列となる。ｆ３１とｆ３２のオーバーラップＰＣＲが起点となる場合もあるが、最終産物は一緒である。各々のＧＢ１－Ｎ０８Ｘのｆ３１～ｆ３３に該当する各種オリゴＤＮＡ配列をこのような反応が進むよう設計し、ユーロフィン社への外注によって合成した。具体的な実験操作については、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄＴａｑ Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）も、同様にＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理し、次に脱リン酸化酵素ＣＩＡＰ（タカラバイオ社）による脱リン酸化処理を行った後で、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたライゲーション反応を行った。
（１） 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘの発現プラスミド調製
各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘのアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計した。コードＤＮＡは、３種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ３１／ｆ３２／ｆ３３）を用いたＰＣＲを行い、その後制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化して、同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のマルチクローニングサイトに組み込んだ。コードＤＮＡ調製時のＰＣＲでは、まず少量のｆ３２（０．２μＭ、リーディング）とｆ３３（１０μＭ、ラギング）とがオーバーラップＰＣＲで伸張され、次に、ｆ３１（１０μＭ、リーディング）と先の反応で伸張したｆ３３（ラギング）とのオーバーラップＰＣＲによって形成される二本鎖ＤＮＡが、制限酵素サイトを両端に有したコードＤＮＡ配列となる。ｆ３１とｆ３２のオーバーラップＰＣＲが起点となる場合もあるが、最終産物は一緒である。各々のＧＢ１－Ｎ０８Ｘのｆ３１～ｆ３３に該当する各種オリゴＤＮＡ配列をこのような反応が進むよう設計し、ユーロフィン社への外注によって合成した。具体的な実験操作については、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄＴａｑ Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）も、同様にＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理し、次に脱リン酸化酵素ＣＩＡＰ（タカラバイオ社）による脱リン酸化処理を行った後で、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたライゲーション反応を行った。
【0078】
ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体をコードするＤＮＡは、ｆ３２（配列番号６）、ｆ３３（配列番号７）は共通であり、ｆ３１のみ配列が異なるオリゴＤＮＡを用いて調製した。用いたｆ３１、ｆ３２、ｆ３３のオリゴＤＮＡ配列、コードＤＮＡ配列、および、アミノ酸配列の配列番号を、変異体の種類ごとに表１にまとめた。
【0079】
【表1】
【0080】
また、Ｆａｂ結合力を強化したＧＢ１＃－Ｃｏｎｔ（配列番号４）に変異Ｎ０８Ｋを導入した変異体ＧＢ１＃－Ｎ０８Ｋも同じく調製した。この変異体は、一本鎖オリゴＤＮＡｆ３１（配列番号２９）、ｆ３２（配列番号３０）、ｆ３３（配列番号７）を用いて、上記と同様の手法で調製した。コードＤＮＡ配列を配列番号３１で、アミノ酸配列を配列番号３２として示す（表１に追記）。
【0081】
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いれば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＧＢ１－Ｎ０８Ｘ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「ＷｉｚａｒｄＰｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ．１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
【0082】
（２） 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘの調製
上記（１）で得られた、各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ遺伝子またはＧＢ１＃－Ｎ０８Ｘ遺伝子を導入した各形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約１時間、その後２５℃で約１時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２５℃にて約１８時間培養した。
上記（１）で得られた、各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ遺伝子またはＧＢ１＃－Ｎ０８Ｘ遺伝子を導入した各形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約１時間、その後２５℃で約１時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２５℃にて約１８時間培養した。
【0083】
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。なお、分子量はほぼ同様であるが、変異体の種類によってバンドの位置は違った。
【0084】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。後の実施例で、ＧＳＴを融合したままでアッセイに利用したサンプルとしては、この溶出液を遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて、濃縮しつつ溶出用緩衝液を標準緩衝液に置換したペプチド溶液を用いた。
【0085】
ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的ペプチドの間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドを精製した。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のペプチドは、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－ＳｅｒがＮ末端側に付加されたアミノ酸配列を有する。
【0086】
実施例２： 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘのアルカリ耐性評価
（１） Ｆａｂフラグメント／Ｆｃフラグメントの調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤をパパインによってＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、ＦｃフラグメントとＦａｂフラグメントを分離精製した（以下、各フラグメントを単にそれぞれ「Ｆｃ」および「Ｆａｂ」と略す）。具体的には、抗ヒトＴＮＦαモノクローナルＩｇＧ製剤（一般名「インフリキシマブ」，製品名「レミケード」，田辺三菱製薬）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ ｐａｐａｙａ ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂとＦｃが混在）から、ＫａｎＣａｐＡ（カネカ）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＦａｂを回収することでＦｃと分離精製した。カラムに吸着したＦｃは、０．０５Ｍ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、即座に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。Ｆａｂを含む溶液およびＦｃを含む溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）し、ＦａｂおよびＦｃの溶液を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるペプチド精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
（１） Ｆａｂフラグメント／Ｆｃフラグメントの調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤をパパインによってＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、ＦｃフラグメントとＦａｂフラグメントを分離精製した（以下、各フラグメントを単にそれぞれ「Ｆｃ」および「Ｆａｂ」と略す）。具体的には、抗ヒトＴＮＦαモノクローナルＩｇＧ製剤（一般名「インフリキシマブ」，製品名「レミケード」，田辺三菱製薬）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ ｐａｐａｙａ ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂとＦｃが混在）から、ＫａｎＣａｐＡ（カネカ）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＦａｂを回収することでＦｃと分離精製した。カラムに吸着したＦｃは、０．０５Ｍ 酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、即座に０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。Ｆａｂを含む溶液およびＦｃを含む溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）し、ＦａｂおよびＦｃの溶液を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるペプチド精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
【0087】
（２） 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘのアルカリ処理
超純水を用いて透析した各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘを濃度調整し、２０μＭ水溶液を得た。当該水溶液０．２ｍＬに半量の４５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃で２時間インキュベ―トした後、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）０．１ｍＬで中和した。中和されていることをｐＨ試験紙にて確認し、標準緩衝液で５倍希釈した。
超純水を用いて透析した各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘを濃度調整し、２０μＭ水溶液を得た。当該水溶液０．２ｍＬに半量の４５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃で２時間インキュベ―トした後、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）０．１ｍＬで中和した。中和されていることをｐＨ試験紙にて確認し、標準緩衝液で５倍希釈した。
【0088】
（３） 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘの免疫グロブリン類結合レスポンスの観測
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体のＦｃに対する結合レスポンスを観測した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＦｃをセンサーチップに固定化し、各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＦｃのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた。センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のものを用いた。Ｆｃ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定化した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンのみを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。固定化されたＦｃの量は５０００ＲＵ程であった。なお、固定化量を５０００ＲＵ以上と高くし、流速を遅くすることで、検出感度およびアナライト濃度への依存度が向上する。すなわち、マストランスポート・リミテッドがかかっている環境下では、結合レスポンスの親和性への依存度が低下し、相対的に濃度への依存度が上がる。
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体のＦｃに対する結合レスポンスを観測した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＦｃをセンサーチップに固定化し、各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＦｃのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた。センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製のものを用いた。Ｆｃ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定化した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンのみを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。固定化されたＦｃの量は５０００ＲＵ程であった。なお、固定化量を５０００ＲＵ以上と高くし、流速を遅くすることで、検出感度およびアナライト濃度への依存度が向上する。すなわち、マストランスポート・リミテッドがかかっている環境下では、結合レスポンスの親和性への依存度が低下し、相対的に濃度への依存度が上がる。
【0089】
アルカリ処理前の各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘを、ランニング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｐ－２０，ｐＨ７．４）を用い、５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２００ｎＭに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速１０μＬ／ｍｉｎで２分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，２分間）および添加終了後（解離相，２分間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ ＮａＯＨを添加して洗浄した。添加１分後の結合レスポンス（結合反応曲線のレゾナンスユニット値）を縦軸に、そのときの添加アナライト濃度を横軸にプロットしたグラフを図１に示す。このように、この評価系では、この濃度範囲において、結合レスポンスはアナライト濃度にある程度比例する。図１の通り、このアナライト濃度に対する結合レスポンスの上がり方は、変異体によって異なる。この評価系では、単純にアルカリ処理前後のレスポンスの比で評価するのではなく、濃度に換算する補正を行った上で、結合残存活性を算出した。
【0090】
（４） 各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘのアルカリ処理後のＦｃ結合残存活性
アルカリ処理後の各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体も、ランニング緩衝液で１０倍希釈して濃度を２００ｎＭに調整し、同様に流速１０μＬ／ｍｉｎで２分間センサーチップに添加し、添加１分後のＦｃ結合レスポンスを求めた。先に求めたアルカリ処理前の２００ｎＭの結合レスポンス値と図１のプロットで求めた傾きから、アルカリ処理後の結合レスポンスに対応するアナライト濃度を算出した。そして、その濃度を、結合活性を維持した変異体濃度とし、処理前（１００％）に対する濃度比率を結合残存活性として算出し、その値をグラフとして図２（１）に示した。
アルカリ処理後の各種ＧＢ１－Ｎ０８Ｘ変異体も、ランニング緩衝液で１０倍希釈して濃度を２００ｎＭに調整し、同様に流速１０μＬ／ｍｉｎで２分間センサーチップに添加し、添加１分後のＦｃ結合レスポンスを求めた。先に求めたアルカリ処理前の２００ｎＭの結合レスポンス値と図１のプロットで求めた傾きから、アルカリ処理後の結合レスポンスに対応するアナライト濃度を算出した。そして、その濃度を、結合活性を維持した変異体濃度とし、処理前（１００％）に対する濃度比率を結合残存活性として算出し、その値をグラフとして図２（１）に示した。
【0091】
比較対象（比較例を参照）として、ＧＢ１－Ｎ０８Ａ（非特許文献７、文献では本発明の変異位置に相当する位置を第７位と定義）、および、ＧＢ１－Ｎ０８Ｇ（非特許文献８、文献中、最も効果があった単残基変異）を示したが、それらに比べて有意に高いアルカリ耐性を示す変異を複数見出すことができた。ＧＢ１－Ｎ０８Ｇのアルカリ耐性が高くなかった理由は不明であるが、Ｇｌｙへの変異は基本的に主鎖構造を不安定化するため、本実験の結果は妥当であると考える。
【0092】
次に、同様の方法にて、Ｎ＝４で再評価した際の結果も図２（２）に示した。数値にバラつきは見られるが、アルカリによる非特異的なダメージを評価しており、かつ、そのダメージに鋭敏な評価系である為、この程度のバラつきが生じるのは自然であり、平均値において明確な有意差があることは再現している点から、結果の信頼度は高いと考える。また、この評価系では、通常のアフィニティー精製が、リガンド（ＳｐＧ）と精製対象（免疫グロブリン）が濃度としてｍＭ前後であるのに対し、この評価系ではμＭ以下であるため、より過酷な条件での評価となる。そのような評価で、全ての変異体がＧＢ１－Ｎ０８Ａに対し１０％以上のアルカリ耐性の向上を示したことは、驚くべき結果と考える。
【0093】
（５） ＧＢ１＃－Ｎ０８Ｋのアルカリ処理後のＦａｂ結合残存活性
実施例２（２）～（４）と同様の手法にて、ＧＢ１＃－Ｎ０８ＫのＦａｂに対する結合残存活性を評価すると、ＧＢ１＃－Ｎ０８Ａが６８％（Ｎ＝４）であったのに対し、ＧＢ１＃－Ｎ０８Ｋは８０％（Ｎ＝４）であった。以上の結果より、ベースとなるＳｐＧの配列が異なる場合にも、同様の効果が期待できることが確認できた。
実施例２（２）～（４）と同様の手法にて、ＧＢ１＃－Ｎ０８ＫのＦａｂに対する結合残存活性を評価すると、ＧＢ１＃－Ｎ０８Ａが６８％（Ｎ＝４）であったのに対し、ＧＢ１＃－Ｎ０８Ｋは８０％（Ｎ＝４）であった。以上の結果より、ベースとなるＳｐＧの配列が異なる場合にも、同様の効果が期待できることが確認できた。
【0094】
比較例
本実施例の比較対照として用いたＧＢ１－Ｎ０８Ａ、ＧＢ１－Ｎ０８Ｇ、および、ＧＢ１＃－Ｎ０８Ａについては、表２に示す配列番号のオリゴＤＮＡｆ３１～ｆ３３を用いて、実施例１（１）と同様の方法で発現プラスミドを調製した。そして、実施例１（２）と同様の方法でタンパク質サンプルを調製し、実施例２（２）と同様の方法で、本発明で得られた変異体と同時にアルカリ耐性を評価した。
本実施例の比較対照として用いたＧＢ１－Ｎ０８Ａ、ＧＢ１－Ｎ０８Ｇ、および、ＧＢ１＃－Ｎ０８Ａについては、表２に示す配列番号のオリゴＤＮＡｆ３１～ｆ３３を用いて、実施例１（１）と同様の方法で発現プラスミドを調製した。そして、実施例１（２）と同様の方法でタンパク質サンプルを調製し、実施例２（２）と同様の方法で、本発明で得られた変異体と同時にアルカリ耐性を評価した。
【0095】
【表2】
【図1】
【図2】
【配列表】