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特許7120557Ｕ９－１ｉクラスター検出用プライマー、ならびに、当該プライマーを利用した検出方法、定量方法、および、マンガン酸化細菌の核酸抽出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-08
(45)【発行日】2022-08-17
(54)【発明の名称】Ｕ９－１ｉクラスター検出用プライマー、ならびに、当該プライマーを利用した検出方法、定量方法、および、マンガン酸化細菌の核酸抽出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220809BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20220809BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20220809BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20220809BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220809BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20220809BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12Q1/04
C12Q1/06
C12Q1/689 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2017143942
(22)【出願日】2017-07-25
(65)【公開番号】P2019024329
(43)【公開日】2019-02-21
【審査請求日】2020-06-30
(73)【特許権者】
【識別番号】000206211
【氏名又は名称】大成建設株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】306024148
【氏名又は名称】公立大学法人秋田県立大学
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100122954
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷部 善太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】宮田 直幸
(72)【発明者】
【氏名】岡野 邦宏
(72)【発明者】
【氏名】瀧 寛則
(72)【発明者】
【氏名】根岸 昌範
【審査官】市島 洋介
(56)【参考文献】
【文献】宮田直幸、他，微生物混合培養系で増殖するマンガン酸化細菌の分離と環境試料からの検出，環境バイオテクノロジー学会 2010年度大会 プログラム講演要旨集，p.22, O-04
【文献】Genome Announc.，2016年，Vol.6, Issue 6，e01309-16
【文献】J. Biosci. Bioeng.，2007年，Vol.103, No.5，pp.432-439
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３～６のいずれかに記載の配列、またはその相補配列からなるプライマーであって、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌のうち、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に配列番号３～６のいずれかに記載の配列を有する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用であり、
真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なユニバーサルプライマーとともに用いられることを特徴とするプライマー。
【請求項2】
配列番号３に記載の配列、またはその相補配列からなるプライマーであることを特徴とする、請求項１に記載のプライマー。
【請求項3】
請求項１または２に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅産物を検出することを特徴とするＵ９－１ｉクラスターに属する菌の検出方法。
【請求項4】
請求項１または２に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法により、試料中のＵ９－１ｉクラスターに属する菌を定量することを特徴とする定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マンガン酸化細菌であるＵ９－１ｉ株、および、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマーと、当該プライマーを利用したＵ９－１ｉクラスターに属する菌の検出方法、定量方法に関する。
【0002】
また、本発明は、マンガン酸化細菌の核酸抽出方法に関する。
【背景技術】
【0003】
廃棄物や自然土壌中には、鉛や水銀、カドミウムといった有害な重金属が含まれている場合がある。これらの有害な重金属は、雨水の浸透等による洗い出しに伴って浸出水中に溶出して環境を汚染する。このような環境汚染対策、すなわち重金属対策には、キレート剤、カルシウム化合物、硫化物、鉄粉等の薬剤を用いた不溶化、セメント固化による土壌からの溶出抑制など様々な方法が知られている。
重金属対策のなかでも、重金属吸着剤を利用する方法が知られている。ここで、微生物が産生する微結晶性のマンガン酸化物（以下、微生物産生マンガン酸化物という）は、カドミウム、亜鉛等の金属陽イオンの吸着能力が大きく、重金属吸着剤として機能する。一方で、微生物産生マンガン酸化物は、ヒ酸や亜ヒ酸のように陰イオンとして存在する金属に対する吸着能力は一般的に高くないが、酸化剤として機能するため、毒性の高い亜ヒ酸を毒性が低いヒ酸に速やかに酸化することができる。
重金属対策のなかでも、重金属吸着剤を利用する方法が知られている。ここで、微生物が産生する微結晶性のマンガン酸化物（以下、微生物産生マンガン酸化物という）は、カドミウム、亜鉛等の金属陽イオンの吸着能力が大きく、重金属吸着剤として機能する。一方で、微生物産生マンガン酸化物は、ヒ酸や亜ヒ酸のように陰イオンとして存在する金属に対する吸着能力は一般的に高くないが、酸化剤として機能するため、毒性の高い亜ヒ酸を毒性が低いヒ酸に速やかに酸化することができる。
【0004】
本発明者らは、非特許文献１において、Ｕ９－１ｉ株が、α－プロテオバクテリア綱に属する新規のマンガン酸化細菌であり、液体培地や寒天培地を用いた単独での培養時には増殖は遅く難培養性であるが、種々の真菌や細菌類等を共存させると容易に増殖できることを報告している。非特許文献２においては、Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅できるプライマーセット６５５Ｆ－１４９２Ｒを用いることにより、河川床生物膜等の環境試料中にＵ９－１ｉクラスターに属する細菌類が広く分布すること報告している。また、本発明者らは、特許文献１、２において、Ｕ９－１ｉ株等の微生物産生酸化マンガンを利用した重金属吸着剤を提案している。
【0005】
マンガン酸化細菌が産生する微生物産生マンガン酸化物を重金属吸着剤として利用するためには、マンガン酸化細菌を大量に培養し、安定的に大量の微生物産生マンガン酸化物を得る必要がある。これまで、Ｕ９－１ｉ株およびその近縁種であるＵ９－１ｉクラスターに属するマンガン酸化細菌の検出、定量に適したプライマーは報告されていない。非特許文献２ではプライマー６５５Ｆを設計して用いたが、非特異的なＰＣＲ増幅が見られたため、精度よく検出、定量できるプライマーの設計が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１６－１８７７９５号公報
【文献】特開２０１６－１８７８０１号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】宮田直幸、齊藤和之、山口天聡、岡野邦宏、尾▲崎▼保夫：難培養性マンガン酸化細菌の分離とその増殖特性、日本水処理生物学会誌別巻第２９号、ｐ１４（２００９）
【文献】宮田直幸、山口天聡、岡野邦宏、尾▲崎▼保夫：微生物混合培養系で増殖するマンガン酸化細菌の分離と環境試料からの検出、環境バイオテクノロジー学会２０１０ 年度大会（仙台市）（２０１０年６月２１日）、
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に増幅することのできるプライマー、ならびにこのプライマーを利用したＵ９－１ｉクラスターに属する菌の検出方法、定量方法、およびマンガン酸化細菌の核酸検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の課題を解決するための手段は、以下のとおりである。
１．配列番号３に記載の配列、またはその相補配列からなる、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用であることを特徴とするプライマー。
２．配列番号４～６のいずれかに記載の配列、またはその相補配列からなる、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用であることを特徴とするプライマー。
３．１．または２．に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅産物を検出することを特徴とするＵ９－１ｉクラスターに属する菌の検出方法。
４．１．または２．に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法により、試料中のＵ９－１ｉクラスターに属する菌を定量することを特徴とする定量方法。
５．マンガン酸化物を還元可能な水溶液を用いて、マンガン酸化細菌が備える酸化マンガンを溶解した後に、ＤＮＡ、またはＲＮＡの抽出を行うことを特徴とする核酸抽出方法。
１．配列番号３に記載の配列、またはその相補配列からなる、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用であることを特徴とするプライマー。
２．配列番号４～６のいずれかに記載の配列、またはその相補配列からなる、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅用であることを特徴とするプライマー。
３．１．または２．に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅産物を検出することを特徴とするＵ９－１ｉクラスターに属する菌の検出方法。
４．１．または２．に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法により、試料中のＵ９－１ｉクラスターに属する菌を定量することを特徴とする定量方法。
５．マンガン酸化物を還元可能な水溶液を用いて、マンガン酸化細菌が備える酸化マンガンを溶解した後に、ＤＮＡ、またはＲＮＡの抽出を行うことを特徴とする核酸抽出方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明のプライマーは、Ｕ９－１ｉ株、およびＵ９－１ｉクラスターに属する菌に特異的な配列を増幅することができ、これらの菌を正確に検出することができる。本発明のプライマーを用いたＰＣＲ法により、Ｕ９－１ｉ株、およびＵ９－１ｉクラスターに属する菌を検出、定量することができる。
【0011】
Ｕ９－１ｉ株等のマンガン酸化細菌は、その細胞表層が微生物産生マンガン酸化物で覆われている。そのため、通常の処理では核酸を抽出できない場合があるが、予めマンガン酸化物を還元可能な水溶液でマンガン酸化物を溶解することにより、容易に核酸を抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列。
【図2】Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて近隣結合法で作成した系統樹。
【図5】砕石バイオフィルム中のＵ９－１ｉ株と全細菌の、ＰＣＲ法による定量結果を示す図。
【図6】砕石バイオフィルム中の真正細菌叢解析結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0013】
「Ｕ９－１ｉ株」
Ｕ９－１ｉ株は、河川床生物膜から調製したマンガン酸化汚泥（集積培養系）から単離されたマンガン酸化細菌である（非特許文献１）。Ｕ９－１ｉ株は、微結晶性であるマンガン酸化物を産生し、この微生物産生マンガン酸化物は、Ｕ９－１ｉ株の細胞表層を覆うように蓄積される。微生物産生マンガン酸化物の生成と蓄積は、他のマンガン酸化細菌でも共通である。
Ｕ９－１ｉ株は、河川床生物膜から調製したマンガン酸化汚泥（集積培養系）から単離されたマンガン酸化細菌である（非特許文献１）。Ｕ９－１ｉ株は、微結晶性であるマンガン酸化物を産生し、この微生物産生マンガン酸化物は、Ｕ９－１ｉ株の細胞表層を覆うように蓄積される。微生物産生マンガン酸化物の生成と蓄積は、他のマンガン酸化細菌でも共通である。
【0014】
Ｕ９－１ｉ株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２４５９として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０１７年４月２１日付で寄託されている。
【0015】
Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（部分配列：配列番号１）を図１に示す。なお、Ｕ９－１ｉ株のゲノム中には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が１コピー存在する。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分子系統解析の結果、Ｕ９－１ｉ株は、α－プロテオバクテリア綱に属する新規な細菌である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて近隣結合法で作成した系統樹を図２に示す。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分子系統解析の結果、Ｕ９－１ｉ株は、α－プロテオバクテリア綱に属する新規な細菌である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて近隣結合法で作成した系統樹を図２に示す。
【0016】
「Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌」
本明細書において、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌とは、Ｕ９－１ｉ株と遺伝子的に近縁種である、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全長１４０６ｂｐとクエリーカバー率（Ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒ）９９％以上（１４０６ｂｐのうち１３９２ｂｐ以上）において相同性９７％以上を示し、かつ近隣結合法で作成した分子系統樹においてＵ９－１ｉ株、ＯＴＳｚ Ａ２７２株とともに１つのクレードを形成する細菌群を意味する。
本明細書において、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌とは、Ｕ９－１ｉ株と遺伝子的に近縁種である、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子全長１４０６ｂｐとクエリーカバー率（Ｑｕｅｒｙ ｃｏｖｅｒ）９９％以上（１４０６ｂｐのうち１３９２ｂｐ以上）において相同性９７％以上を示し、かつ近隣結合法で作成した分子系統樹においてＵ９－１ｉ株、ＯＴＳｚ Ａ２７２株とともに１つのクレードを形成する細菌群を意味する。
【0017】
「プライマー」
本発明のプライマーは、Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特異的な領域から設計された。すなわち、本発明のプライマーは、配列番号１に示される１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１１８７～１２０４位の領域、すなわち、配列番号３に示す塩基配列１２７０Ｆ（５’－ＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＡＡＴ－３’）、またはその相補配列を含む。
本発明のプライマーは、Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特異的な領域から設計された。すなわち、本発明のプライマーは、配列番号１に示される１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１１８７～１２０４位の領域、すなわち、配列番号３に示す塩基配列１２７０Ｆ（５’－ＣＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＴＡＡＴ－３’）、またはその相補配列を含む。
【0018】
ここで、Ｕ９－１ｉ株、および、図２に示す系統樹に記載されている細菌の一部について、Ｕ９－１ｉ株の配列１２７０Ｆに相当する領域の塩基配列を図３に示す。
図３に示すように、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌は、Ｕ９－１ｉ株の配列１２７０Ｆに相当する領域において配列番号４～６に示す塩基配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙを有する。配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙは、配列１２７０Ｆの１８ｂｐの塩基配列に対して１７ｂｐ以上が一致しており、９４．４％以上（＝１７ｂｐ／１８ｂｐ）の非常に高い相同性を有する。それに対し、Ｕ９－１ｉクラスターに属さない菌の当該領域における配列１２７０Ｆとの相同性は低く、遺伝子データベースに登録されている全真正細菌の約３５０万の配列のうち、配列１２７０Ｆと一致するものは僅か２００配列程度である（表１）。同様に、配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙと一致するものも同程度と僅かである。さらに図３に示すように、Ｕ９－１ｉクラスターに属さない比較的近縁の菌では８３．４％以下（１８ｂｐに対して１５ｂｐ以下）の一致度であることがほとんどである。したがって、配列番号４～６に示される配列である１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙ、またはその相補配列からなるプライマーにより、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、特異的に増幅することができる。
図３に示すように、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌は、Ｕ９－１ｉ株の配列１２７０Ｆに相当する領域において配列番号４～６に示す塩基配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙを有する。配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙは、配列１２７０Ｆの１８ｂｐの塩基配列に対して１７ｂｐ以上が一致しており、９４．４％以上（＝１７ｂｐ／１８ｂｐ）の非常に高い相同性を有する。それに対し、Ｕ９－１ｉクラスターに属さない菌の当該領域における配列１２７０Ｆとの相同性は低く、遺伝子データベースに登録されている全真正細菌の約３５０万の配列のうち、配列１２７０Ｆと一致するものは僅か２００配列程度である（表１）。同様に、配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙと一致するものも同程度と僅かである。さらに図３に示すように、Ｕ９－１ｉクラスターに属さない比較的近縁の菌では８３．４％以下（１８ｂｐに対して１５ｂｐ以下）の一致度であることがほとんどである。したがって、配列番号４～６に示される配列である１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙ、またはその相補配列からなるプライマーにより、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、特異的に増幅することができる。
【0019】
「ＰＣＲ法」
配列番号３～６に示される配列、またはその相補配列からなるプライマーを用いたＰＣＲ法により、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な領域が増幅されるため、このＰＣＲ法により、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌を検出、定量することができる。
ＰＣＲ法の際には、上記した配列番号３～６に示される配列またはその相補配列からなるプライマーと、リバースプライマーまたはその相補配列からなるプライマーとを組み合わせて使用する。リバースプライマーとしては特に制限されず、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なユニバーサルプライマーを用いることができる。
配列番号３～６に示される配列、またはその相補配列からなるプライマーを用いたＰＣＲ法により、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な領域が増幅されるため、このＰＣＲ法により、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌を検出、定量することができる。
ＰＣＲ法の際には、上記した配列番号３～６に示される配列またはその相補配列からなるプライマーと、リバースプライマーまたはその相補配列からなるプライマーとを組み合わせて使用する。リバースプライマーとしては特に制限されず、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なユニバーサルプライマーを用いることができる。
【0020】
ＰＣＲ法としては、ＭＰＮ－ＰＣＲ法、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法のいずれを用いてもよいが、迅速に高精度な結果が得られることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法は、増幅産物を蛍光によって検出する。検出方法としては、蛍光を発する色素をインターカレートするインターカレーター法や蛍光色素を結合させる蛍光プローブ法等を特に制限することなく利用することができる。
【0021】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。リアルタイムＰＣＲ法により、サンプルに含まれる特定の塩基配列を有するＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法により、特定のＤＮＡが増幅され、蛍光検出可能な量に達すると、急激な蛍光強度の増加が観察される。このときのサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（以下、Ｃｔ値という。）という。ＰＣＲ法では１サイクルごとにＤＮＡが２倍となり、ＤＮＡは指数関数的に増幅する。サンプル中に含まれる当初ＤＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光検出可能な量に達するため、Ｃｔ値は小さくなる。
リアルタイムＰＣＲ法により、特定のＤＮＡが増幅され、蛍光検出可能な量に達すると、急激な蛍光強度の増加が観察される。このときのサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ（以下、Ｃｔ値という。）という。ＰＣＲ法では１サイクルごとにＤＮＡが２倍となり、ＤＮＡは指数関数的に増幅する。サンプル中に含まれる当初ＤＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光検出可能な量に達するため、Ｃｔ値は小さくなる。
【0022】
Ｃｔ値と当初ＤＮＡ量の常用対数との間には直線関係があり、これを基に検量線を作成することができる。すなわち、異なるＤＮＡ濃度を有する複数個のサンプルのリアルタイムＰＣＲ法でＣｔ値を測定し、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の当初ＤＮＡ量を横軸にプロットすることで、検量線を作成できる。この検量線は、試料のＤＮＡ濃度とＣｔ値との関係を表し、濃度未知のサンプルのＣｔ値をリアルタイムＰＣＲ法により測定することにより、サンプルに含まれるＤＮＡ量を定量することができる。
そして、定量された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子量とＵ９－１ｉクラスターに属する菌の菌体量との間には直線関係がある。そのため、リアルタイムＰＣＲ法で定量された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子量から、サンプル中のＵ９－１ｉクラスターの菌体量を定量することができる。例えば、Ｕ９－１ｉ株のゲノム中には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が１コピー存在するため、Ｕ９－１ｉ株の菌体数は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子数と略等しい。
そして、定量された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子量とＵ９－１ｉクラスターに属する菌の菌体量との間には直線関係がある。そのため、リアルタイムＰＣＲ法で定量された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子量から、サンプル中のＵ９－１ｉクラスターの菌体量を定量することができる。例えば、Ｕ９－１ｉ株のゲノム中には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が１コピー存在するため、Ｕ９－１ｉ株の菌体数は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子数と略等しい。
【0023】
・核酸抽出方法
Ｕ９－１ｉ株は、マンガン酸化細菌であり、二価マンガンイオン存在下で微生物産生マンガン酸化物を細胞表面に蓄積する。そのため、微生物産生マンガン酸化物を蓄積したＵ９－１ｉ株から、ＰＣＲ用の核酸を抽出するには、マンガン酸化物を還元可能な水溶液を用いて、酸化マンガンを溶解した後に行うことが好ましい。マンガン酸化物を還元可能な水溶液としては、アスコルビン酸、クエン酸、シュウ酸、ヒドロキシアルキルアミン等が挙げられ、アスコルビン酸、クエン酸、シュウ酸、ヒドロキシアルキルアミンが、核酸への影響が少ないため好ましい。なお、このマンガン酸化物を還元可能な水溶液による前処理は、他のマンガン酸化細菌の核酸を抽出する際にも適用できる。
Ｕ９－１ｉ株は、マンガン酸化細菌であり、二価マンガンイオン存在下で微生物産生マンガン酸化物を細胞表面に蓄積する。そのため、微生物産生マンガン酸化物を蓄積したＵ９－１ｉ株から、ＰＣＲ用の核酸を抽出するには、マンガン酸化物を還元可能な水溶液を用いて、酸化マンガンを溶解した後に行うことが好ましい。マンガン酸化物を還元可能な水溶液としては、アスコルビン酸、クエン酸、シュウ酸、ヒドロキシアルキルアミン等が挙げられ、アスコルビン酸、クエン酸、シュウ酸、ヒドロキシアルキルアミンが、核酸への影響が少ないため好ましい。なお、このマンガン酸化物を還元可能な水溶液による前処理は、他のマンガン酸化細菌の核酸を抽出する際にも適用できる。
【実施例】
【0024】
「プライマーの選定」
Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列の中から、Ｕ９－１ｉ株に特異的な配列、即ち、既知の菌株の配列と相同性が低い配列を探索した。具体的には遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋでのＢＬＡＳＴ検索で近縁種の配列と相同性の低い領域を抽出し、さらにＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）のＰｒｏｂｅ Ｍａｔｃｈプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐｒｏｂｅｍａｔｃｈ／ｓｅａｒｃｈ．ｊｓｐ）で抽出配列の特異性を調べた。
Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列の中から、Ｕ９－１ｉ株に特異的な配列、即ち、既知の菌株の配列と相同性が低い配列を探索した。具体的には遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋでのＢＬＡＳＴ検索で近縁種の配列と相同性の低い領域を抽出し、さらにＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）のＰｒｏｂｅ Ｍａｔｃｈプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐｒｏｂｅｍａｔｃｈ／ｓｅａｒｃｈ．ｊｓｐ）で抽出配列の特異性を調べた。
【0025】
ＧｅｎＢａｎｋでのＢＬＡＳＴ検索により、特異性が高い２つの領域を、配列６５５Ｆ（配列番号２、５７６～５９２位）、配列１２７０Ｆ（配列番号３、１１８７～１２０４位）として抽出した。さらに、ＲＤＰにて、登録されている全真正細菌の配列（単離株、環境クローンを含む）を対象として、それぞれの配列とマッチする配列数（細菌数）を調査した。その結果を表１に示す。また、配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙについても、調査結果を示す。
【0026】
【表1】
【0027】
配列６５５Ｆと同一の配列は、登録されている全真正細菌の配列である約３５０万の内、僅か８５であった。このうち７８配列は、Ｕ９－１ｉ株と関連性のあるα－プロテオバクテリア綱であったが、この内、分離された既知の株はＷｏｏｄｓｈｏｌｅａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＯＴＳｚ＿Ａ＿２７２株の１株のみであり、残りは未分離のクローン配列であった。このことから、Ｕ９－１ｉ株の近縁種は、ほとんど単離されていないことが確認できた。また、配列６５５Ｆをオリゴヌクレオチドプローブとして用いることにより、Ｕ９－１ｉ株とその近縁種を特異的に検出できる可能性が示された。
【0028】
配列１２７０Ｆについても配列６５５Ｆと同様、マッチする配列は非常に少なく、約３５０万の配列数のうち２２４配列のみであった。また、これらの配列のほとんどはα－プロテオバクテリア綱であったが、やはり分離された既知の株は、Ｍａｒｉｎｉｃａｕｄａ ｐａｃｉｆｉｃａ ｐ－１ｋｍ－３株の僅か１株のみであった。
【0029】
配列１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙについても、マッチする配列は、約３５０万の配列数のうち２７４配列のみであり、そのほとんど（２６４配列）が、α－プロテオバクテリア綱であった。
【0030】
以上の結果から、配列６５５Ｆ、１２７０Ｆ、１２７０Ｆ ｆａｍｉｌｙ、またはその相補配列をオリゴヌクレオチドプローブとしたＰＣＲ法を適用することにより、Ｕ９－１ｉクラスターに属する菌を特異的かつ高感度で検出できることが示唆された。
【0031】
「Ｕ９－１ｉ株のろ床培養」
・Ｕ９－１ｉ株
Ｕ９－１ｉ株は、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ培地（表２）を用いて室温で約１週間振とう培養し、フルグロースさせた菌株を用いた。
・Ｕ９－１ｉ株
Ｕ９－１ｉ株は、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ培地（表２）を用いて室温で約１週間振とう培養し、フルグロースさせた菌株を用いた。
【0032】
【表2】
【0033】
・培養方法
プラスチック製コンテナに、容積が計６０Ｌとなるように砕石（７号砕石）を投入し、循環液２０Ｌ、循環速度０．２５Ｌ／分にて、培地をコンテナ上部から散水し、下部から回収して循環させた。培地は、表３で示した組成の培地を適宜濃縮、希釈し、さらに硫酸マンガン（５～４５０ｍｇ－Ｍｎ／Ｌ）を添加したものを用いた。培地は、２４時間循環させる毎に新たな培地に交換し、実験初期より徐々にマンガン濃度（ｍｇ－Ｍｎ／Ｌ）を上昇させた。これに、上記で培養しておいたＵ９－１ｉ株の培養液を、培養０日目に２５０ｍＬ、培養２１日目に２００ｍＬ植菌した。なお、コンテナ、及び、砕石は滅菌処理を行っていない。
プラスチック製コンテナに、容積が計６０Ｌとなるように砕石（７号砕石）を投入し、循環液２０Ｌ、循環速度０．２５Ｌ／分にて、培地をコンテナ上部から散水し、下部から回収して循環させた。培地は、表３で示した組成の培地を適宜濃縮、希釈し、さらに硫酸マンガン（５～４５０ｍｇ－Ｍｎ／Ｌ）を添加したものを用いた。培地は、２４時間循環させる毎に新たな培地に交換し、実験初期より徐々にマンガン濃度（ｍｇ－Ｍｎ／Ｌ）を上昇させた。これに、上記で培養しておいたＵ９－１ｉ株の培養液を、培養０日目に２５０ｍＬ、培養２１日目に２００ｍＬ植菌した。なお、コンテナ、及び、砕石は滅菌処理を行っていない。
【0034】
【表3】
【0035】
「リアルタイムＰＣＲ」
配列６５５Ｆ、または配列１２７０Ｆからなるオリゴヌクレオチドプローブと、真正細菌特異的なユニバーサルプライマー（８０６Ｒ、１４９２Ｒ）とのプライマーセットを用いて、下記表４に示す条件でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法によるリアルタイムＰＣＲを行った。
配列６５５Ｆ、または配列１２７０Ｆからなるオリゴヌクレオチドプローブと、真正細菌特異的なユニバーサルプライマー（８０６Ｒ、１４９２Ｒ）とのプライマーセットを用いて、下記表４に示す条件でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法によるリアルタイムＰＣＲを行った。
【0036】
【表4】
【0037】
サンプルには、上記ろ床培養の砕石から採取した試料のＤＮＡ、スタンダード（Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ）と同じコピー数に調製したネガティブコントロール（βプロテオバクテリアＧＪ－Ｅ１０株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を組み込んだプラスミドＤＮＡ）を用いた。なお、砕石から採取した試料は、アスコルビン酸でマンガン酸化物を溶解してから、核酸を抽出した。リアルタイムＰＣＲの結果を図４に示す。
【0038】
６５５Ｆプライマーセットでは、サンプル（砕石試料ＤＮＡ）の増幅効率が低く、環境試料中に混在するＰＣＲ阻害物質の影響を受けやすいことが明らかとなった。さらに、サンプルよりもネガティブコントロールの増幅効率が高かったことから、Ｕ９－１ｉ株の特異的なＰＣＲに使用できないことが明らかとなった。
一方、１２７０Ｆプライマーセットでは、サンプル（砕石試料ＤＮＡ）のＰＣＲ増幅は良好であった。ネガティブコントロールの増幅が反応の後半で見られるものの、十分に小さい上、濃度非依存的に起こる非特異的な増幅であり、標的ＤＮＡの定量に影響を与えないことが確認された。
すなわち、配列１２７０Ｆ、またはその相補配列をプライマーとして用いることにより、Ｕ９－１ｉ株を特異的に検出できることが確認できた。
一方、１２７０Ｆプライマーセットでは、サンプル（砕石試料ＤＮＡ）のＰＣＲ増幅は良好であった。ネガティブコントロールの増幅が反応の後半で見られるものの、十分に小さい上、濃度非依存的に起こる非特異的な増幅であり、標的ＤＮＡの定量に影響を与えないことが確認された。
すなわち、配列１２７０Ｆ、またはその相補配列をプライマーとして用いることにより、Ｕ９－１ｉ株を特異的に検出できることが確認できた。
【0039】
・Ｕ９－１ｉ株の定量
ろ床培養の砕石表面からバイオフィルムを約０．５ｇ測り採った後、１００ｍＭアスコルビン酸溶液を２００μＬ添加し、ボルテックスで５分間撹拌してＭｎ酸化物を溶解した。Ｍｎ酸化物溶解後の試料全量を土壌ＤＮＡ抽出キット（株式会社ニッポン・ジーン製、商品名：ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ）を用いてＤＮＡを抽出した。なお、ＤＮＡ抽出は付属のマニュアルに従った。
抽出したＤＮＡを分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００）により定量後、１０～１００倍に希釈して定量ＰＣＲに用いた。
ろ床培養の砕石表面からバイオフィルムを約０．５ｇ測り採った後、１００ｍＭアスコルビン酸溶液を２００μＬ添加し、ボルテックスで５分間撹拌してＭｎ酸化物を溶解した。Ｍｎ酸化物溶解後の試料全量を土壌ＤＮＡ抽出キット（株式会社ニッポン・ジーン製、商品名：ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ）を用いてＤＮＡを抽出した。なお、ＤＮＡ抽出は付属のマニュアルに従った。
抽出したＤＮＡを分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００）により定量後、１０～１００倍に希釈して定量ＰＣＲに用いた。
【0040】
定量ＰＣＲは、上記表４に示す「１２７０Ｆ」を用いたプライマーセットを用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法で行った。反応にはＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、マニュアルで推奨された反応液組成およびプライマー濃度で反応させた。なお、ＤＮＡの定量はリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社製、装置名：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏシステム）により、上記表４のサーマルサイクル反応で解析した。また、Ｕ９－１ｉ株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を用いてスタンダードを作成し、絶対検量線法で定量した。
鋳型ＤＮＡを段階希釈して実験を行い、最も増幅効率の高かった結果をＤＮＡのコピー数とした。その結果を図５に示す。
鋳型ＤＮＡを段階希釈して実験を行い、最も増幅効率の高かった結果をＤＮＡのコピー数とした。その結果を図５に示す。
【0041】
４０日までは配列１２７０Ｆは検出されたがコピー数の増加は確認できなかった。しかし、全細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数がほぼ一定（１０８／ｇ担体）に達した５０日以後に配列１２７０Ｆのコピー数が増加し、その後培養１００日目からは１０６～１０７コピー／ｇ担体の範囲で安定的に維持されていることが確認できた。Ｕ９－１ｉ株のゲノム中には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が１コピー存在するため、１００日目以後は、担体１ｇ当たり１０６～１０７細胞のＵ９－１ｉ株が保持されていることになる。
一方、それぞれプライマーが異なるため、単純な割り算で存在比を求めることは難しいが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子数を目安として全細菌に占めるＵ９－１ｉ株の存在比（Ｕ９－１ｉ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数／全細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数×１００）を見積もった。その結果、培養開始直後から４０日後までの存在比は１％から０．１％程度と低かったが、その後増加し、配列１２７０Ｆのコピー数がほぼ一定に維持された１００日以後は数％～１０％程度で推移していた。
一方、それぞれプライマーが異なるため、単純な割り算で存在比を求めることは難しいが、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子数を目安として全細菌に占めるＵ９－１ｉ株の存在比（Ｕ９－１ｉ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数／全細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子コピー数×１００）を見積もった。その結果、培養開始直後から４０日後までの存在比は１％から０．１％程度と低かったが、その後増加し、配列１２７０Ｆのコピー数がほぼ一定に維持された１００日以後は数％～１０％程度で推移していた。
【0042】
・砕石バイオフィルムの真正細菌叢解析
ろ床培養の砕石表面のバイオフィルムについて、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）用のアダプター配列を連結した真正細菌に特異的なプライマーセット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅａｒｔｈｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｏｒｇ）（５１５Ｆ：５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ－３’、８０６Ｒ：５’－ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ－３’）によりＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製、商品名：Ｅｘ Ｔａｑ）を用いてサーマルサイクラー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）により行った。反応液の総量は４０μＬとし、組成はＥｘ Ｔａｑ付属のマニュアルに従った。
ろ床培養の砕石表面のバイオフィルムについて、次世代シーケンサーＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）用のアダプター配列を連結した真正細菌に特異的なプライマーセット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅａｒｔｈｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ｏｒｇ）（５１５Ｆ：５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ－３’、８０６Ｒ：５’－ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ－３’）によりＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製、商品名：Ｅｘ Ｔａｑ）を用いてサーマルサイクラー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）により行った。反応液の総量は４０μＬとし、組成はＥｘ Ｔａｑ付属のマニュアルに従った。
【0043】
ＰＣＲ産物をＤＮＡ精製試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、商品名：ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ）で精製後、フルオロメーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、装置名：Ｑｕｂｉｔ）で定量後に各サンプルを同濃度で混合した。混合したＰＣＲ産物は、自動ＤＮＡ断片ゲル抽出装置（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、装置名：ＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ）で再度精製してアンプリコン解析用のライブラリーとした。
調製したライブラリーはシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、装置名：ＭｉＳｅｑ）により配列を決定した。得られた配列は、Ｃｌａｉｄｅｎｔ ｖ０．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌａｉｄｅｎｔ．ｏｒｇ）を用いて分子系統学的に分類した。結果を図６に示す。
調製したライブラリーはシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、装置名：ＭｉＳｅｑ）により配列を決定した。得られた配列は、Ｃｌａｉｄｅｎｔ ｖ０．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌａｉｄｅｎｔ．ｏｒｇ）を用いて分子系統学的に分類した。結果を図６に示す。
【0044】
運転開始直後にＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門および未同定細菌群の急激な増加が確認された。運転約６０日目、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門の増加とともにＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門は減少し、その後細菌叢は安定した。加えて、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門は運転期間中増減を繰り返しながら常に優占した。
Ｕ９－１ｉ株は、培養直後は１％以下に減少したが、培養６０日目以降でＵ９－１ｉ株の増加が確認され、定量ＰＣＲの結果と一致した。Ｕ９－１ｉ株の増加は試験終了時まで持続しており、他の細菌の存在下でもＵ９－１ｉ株を安定的に培養できることが確かめられた。
Ｕ９－１ｉ株は、培養直後は１％以下に減少したが、培養６０日目以降でＵ９－１ｉ株の増加が確認され、定量ＰＣＲの結果と一致した。Ｕ９－１ｉ株の増加は試験終了時まで持続しており、他の細菌の存在下でもＵ９－１ｉ株を安定的に培養できることが確かめられた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】