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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-09
(45)【発行日】2022-08-18
(54)【発明の名称】バリアントフラビウイルスエンベロープ配列およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/40 20060101AFI20220810BHJP
C07K 14/08 20060101ALI20220810BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220810BHJP
C12N 7/04 20060101ALI20220810BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220810BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220810BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220810BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220810BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20220810BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20220810BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20220810BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20220810BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220810BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20220810BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220810BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20220810BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220810BHJP
【ＦＩ】
C12N15/40 ZNA
C07K14/08
C12N15/85 Z
C12N7/04
C12N1/19
C12N1/15
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/10
C12N15/115 Z
C12Q1/70
C12Q1/6888 Z
C12P21/02 C
A61K39/12
A61P31/14
G01N33/569 L
G01N33/53 D
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2018561062
(86)(22)【出願日】2017-05-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-07-18
(86)【国際出願番号】 US2017033882
(87)【国際公開番号】W WO2017201543
(87)【国際公開日】2017-11-23
【審査請求日】2020-05-22
(31)【優先権主張番号】1608896.5
(32)【優先日】2016-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】518407489
【氏名又は名称】エクシヴィオン リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｅｘｃｉｖｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】ラング，ペーター
【審査官】玉井 真人
(56)【参考文献】
【文献】ウイルス, 2011, 第61巻, 第2号，pp.221-238
【文献】Journal of Virology, 2013, Vol.87, pp.52-66
【文献】JOURNAL OF VIROLOGY, 2011, Vol.85, pp.11800-11808
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
単離組換え改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループであって、配列番号１の天然フラビウイルスＥタンパク質融合ループ配列中に存在しないＮ連結グリカンのための少なくとも１つのグリコシル化部位を含み、
前記少なくとも１つのグリコシル化部位は、Ａｓｎ（Ｎ）残基が天然フラビウイルスＥタンパク質融合ループアミノ酸配列の９８～１１０位ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫの何れかに対応するアミノ酸位置を占めるように置換されたＮ連結グリコシル化シークオンＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒであり、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒは、セリン残基又はトレオニン残基を示す
ことを特徴とする単離組換え改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ。
【請求項2】
請求項１に記載の単離組換え改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループにおいて、天然フラビウイルスＥタンパク質融合ループ配列（配列番号１）中に存在しない２つのグリコシル化部位を含むことを特徴とする単離組換え改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ。
【請求項3】
単離組換え改変フラビウイルスＥタンパク質であって、請求項１又は２に記載のフラビウイルスＥタンパク質融合ループを含むことを特徴とする単離組換え改変フラビウイルスＥタンパク質。
【請求項4】
請求項１若しくは２に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又は請求項３に記載のフラビウイルスＥタンパク質において、それに付着された少なくとも１つのＮ連結グリカンを有することを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はフラビウイルスＥタンパク質。
【請求項5】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質において、組換えＤＮＡ又は組換えＲＮＡの発現産物であることを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質。
【請求項6】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質において、Ｎ連結グリコシル化シークオンＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒを含み、それにより、前記シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、９８～１０１位及び／又は１０６～１１０位の何れかを占めることを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質。
【請求項7】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質において、Ｘは、以下の１３種のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ又はＳｅｒの何れかであることを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質。
【請求項8】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質において、前記フラビウイルスＥタンパク質は、デングウイルスＥタンパク質であり、シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、前記フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列の１０１位、１０８位若しくは１０１位及び１０８位の両方を占めるか、又は、前記フラビウイルスＥタンパク質は、ジカＥタンパク質であり、シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、前記フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列の１００位を占めることを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質。
【請求項9】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質において、前記フラビウイルスは、デングウイルスであり、前記フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列９８～１１０は、
から選択され、又は
前記フラビウイルスは、ジカウイルスであり、前記フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列９８～１１０は、
であることを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質。
【請求項10】
単離組換えＤＮＡ又は単離組換えＲＮＡであって、（ａ）請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、
（ｂ）プラスミド若しくは線形ＤＮＡをベースとするワクチンである、前記（ａ）の単離組換えＤＮＡ、又は
（ｃ）哺乳類のプロモーターの制御下において、請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質をコードする、前記（ａ）若しくは前記（ｂ）の単離組換えＤＮＡ
を含むことを特徴とする単離組換えＤＮＡ又は単離組換えＲＮＡ。
【請求項11】
宿主細胞であって、（ａ）請求項１０に記載のＤＮＡ又はＲＮＡを含む、
（ｂ）請求項１０（ａ）に記載のＤＮＡ、請求項１０（ｂ）に記載のプラスミド若しくは線形ＤＮＡをベースとするワクチン免疫原、若しくは請求項１０（ｃ）に記載の単離組換えＤＮＡを含む真核宿主細胞である、又は
（ｃ）（ｉ）請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質を発現し得る、若しくは（ｉｉ）請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質を発現及びグリコシル化し得る、前記（ａ）若しくは前記（ｂ）の宿主細胞である
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項12】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質を作製する方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を前記改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質の発現に適した条件で培養するステップと、前記改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質を単離するステップとを備えることを特徴とする方法。
【請求項13】
組成物であって、（ａ）請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質と希釈剤とを含む、又は
（ｂ）前記組成物を接種された対象中で免疫反応を誘発し得、請求項１乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質を薬学的に許容される希釈剤、アジュバント及び／又は担体と一緒に含む免疫原性（ワクチン）組成物である
ことを特徴とする組成物。
【請求項14】
請求項１３に記載の組成物において、（ｉ）ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、ＤＥＮ－４、及びジカの改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質から選択される、請求項１乃至９の何れか１項に記載の１種若しくは複数の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ又はＥタンパク質、
（ｉｉ）４種のデングウイルス血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４のそれぞれを表す、請求項１乃至９の何れか１項に記載の４種のデング改変Ｅタンパク質融合ループ又はＥタンパク質、
（ｉｉｉ）請求項１乃至９の何れか１項に記載のジカウイルス改変Ｅタンパク質融合ループ又はＥタンパク質、又は
（ｉｖ）４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３、及びＤＥＮ－４のそれぞれを表す、請求項１乃至９の何れか１項に記載の４種のデング改変Ｅタンパク質融合ループ又はＥタンパク質、並びに請求項１乃至９の何れか１項に記載のジカウイルス改変Ｅタンパク質融合ループ又はＥタンパク質
を含むことを特徴とする組成物。
【請求項15】
請求項１、２、４乃至９の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループに特異的に結合し得る結合分子であって、前記結合分子が、抗体又はその断片、ドメイン抗体、タンパク質足場、及びアプタマーから選択されることを特徴とする結合分子。
【請求項16】
請求項１乃至９、１３、１４又は１５の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ、改変フラビウイルスＥタンパク質、組成物又は結合分子において、（ａ）薬剤としての使用のためのもの
（ｂ）ワクチンとしての使用のためのもの
（ｃ）フラビウイルス感染の予防的処置若しくは治療的処置における使用のためのもの
（ｄ）フラビウイルス感染の予防的処置若しくは治療的処置のための薬剤の製造のためのもの
（ｅ）フラビウイルスによる感染から対象を防御するためのもの
（ｆ）診断薬としての使用のためのもの
であることを特徴とする改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ、改変フラビウイルスＥタンパク質、組成物又は結合分子。
【請求項17】
診断キットであって、請求項１乃至９、１３、１４又は１５の何れか１項に記載の改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ、改変Ｅタンパク質、組成物又は結合分子と、前記改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ、改変Ｅタンパク質、組成物、又は結合分子を含有する免疫学的（抗原－抗体）複合体を検出し得る試薬とを含むことを特徴とする診断キット。
【請求項18】
請求項１７に記載の診断キットにおいて、１種若しくは複数のコントロール標準物質、及び／又は検体希釈剤、及び／又は洗浄緩衝液を含むことを特徴とする診断キット。
【請求項19】
請求項１７又は１８に記載の診断キットにおいて、前記改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ若しくは改変Ｅタンパク質及び／又は結合分子は、固体支持体上に固定されていることを特徴とする診断キット。
【請求項20】
請求項１７乃至１９の何れか１項に記載の診断キットにおいて、前記改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ若しくは改変Ｅタンパク質及び／又は結合分子は、マイクロプレートウェル上に固定されていることを特徴とする診断キット。
【請求項21】
請求項１７乃至２０の何れか１項に記載の診断キットにおいて、前記改変フラビウイルスＥタンパク質融合ループ若しくは改変Ｅタンパク質又は結合分子を含有する免疫学的複合体は、ＥＬＩＳＡによって又はラテラルフローによって検出されることを特徴とする診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、フラビウイルス（例えば、デングウイルスまたはジカウイルス）の野生型Ｅタンパク質の核酸およびタンパク質のバリアント、ならびにこれらに特異的な結合分子、例えば相補的核酸または抗原結合分子、例えば抗体、ならびに組成物、例えば治療用組成物、予防用組成物または診断用組成物、キット、パーツキット（ｋｉｔ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）、方法、ならびに特にフラビウイルス感染の診断のためのおよびフラビウイルス感染に対して免疫付与するワクチンのためのこれらに関する使用に関する。
【背景技術】
【0002】
フラビウイルスは、陽性で一本鎖のエンベロープＲＮＡウイルスのファミリである。フラビウイルスは、節足動物（主にマダニおよび蚊）で見出され、ヒトに感染する可能性がある。このファミリのメンバーは、単一属フラビウイルスに属し、世界中で広範な罹患率および死亡率をもたらす。蚊により伝播されるウイルスの一部として、デング熱ウイルス、ジカウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルスが挙げられる。他のフラビウイルスは、マダニにより伝播され、下記の脳炎および出血性疾患の原因となる：ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、キャサヌル森林病（ＫＦＤ）およびＡｌｋｈｕｒｍａ病、ならびにオムスク出血熱。
【0003】
フラビウイルスは、下記の１０種のウイルスタンパク質をコードする小さい球状ビリオンである：３種の構造タンパク質（カプシド、前駆体膜／膜およびエンベロープ（Ｅ））ならびに７種の非構造タンパク質。Ｅタンパク質は、細胞へのウイルス付着、エンドソームコンパートメントとの融合および宿主免疫反応の調節で重要な役割を果たす。ウイルスＥタンパク質の外部ドメインは、ビリオンの表面上でヘッドトゥーテールホモ二量体を形成する３種の構造的に異なるドメイン（ＤＩ、ＤＩＩおよびＤＩＩＩ）へと折り重なる。ＤＩは、Ｅタンパク質の構造全体を構築する中心ドメインである。ＤＩＩは、ＤＩから突出する２つの延長ループから形成され、この二量体中の隣接Ｅタンパク質のＤＩおよびＤＩＩＩの界面でのポケット内に位置する。ＤＩＩの遠位末端では、残基９８～１１０を包含するグリシンリッチの疎水性配列（融合ループと呼ばれている）が存在し、フラビウイルス間で高度に保存されている。この領域は、ｐＨ依存性のＩＩ型融合事象に関与しており、このプロセス中、この領域は、露出して外方へ再配向されるようになり、この領域が膜接触に利用可能になる。ＤＩＩＩは、７本鎖Ｉｇ様折り畳みを形成し、成熟ビリオン中で最も膜遠位のドメインであり、レセプター結合に関与することが示唆されている。基部領域は、この外部ドメインを、ビリオンの集合および融合に重要な２ヘリックスＣ末端膜貫通アンカーと連結する。
【0004】
デング熱疾患は、世界中で最も重要なヒト病原体の１つであるデングウイルス（ＤＥＮＶ）により引き起こされる蚊媒介性ウイルス感染である。この感染症は、広範囲の結果（非症候性／軽度の熱性疾患（デング熱、ＤＦ）から重度の血漿漏出、および潜在的に致命的な状態（デングショック症候群、ＤＳＳ）へとさらに発展する可能性がある出血性症状（デング出血熱、ＤＨＦ）まで）を伴う全身性疾患を引き起こす。ＤＥＮＶは、アエデス（Ａｄｅｄｅｓ）種の蚊により伝播され、世界中の熱帯および亜熱帯の全体にわたって広く分布している。１００カ国以上で約３０億人が感染のリスクがあると推定されており、毎年、３億超例の感染、ＤＨＦ症状の５００，０００例のエピソードおよび２０，０００例の死亡が報告されている。デング熱疾患の蔓延および影響により、デング熱疾患は、世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）により「世界で最も重要な蚊媒介性ウイルス疾患」と分類されるに至った。
【0005】
デングウイルスの４種の異なる血清型（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３およびＤＥＮＶ４）がこれまで同定されており、各血清型は、ヒトにおいて病原性である。何れか１つの血清型による感染は、その特定の血清型に対する生涯の免疫を誘発し、３種の他の血清型に対して一時的な交差防御のみを誘発する。デング感染の重度の症状は、異なるウイルス血清型を伴う二次感染と関連し、これは、感染の抗体依存性増強（ＡＤＥ）として知られている機序により起こる。ＡＤＥでは、交差反応性ではあるが弱中和または非中和の抗体によるウイルス粒子の認識は、単球、マクロファージおよび樹枝状細胞（ヒトでのデングウイルス感染の一次標的）による未熟または不完全に中和されたウイルスのＦｃレセプター媒介性取り込みの増加に至り、感染力および患者の臨床状態の悪化の増加をもたらす。ＡＤＥは、デングワクチンの開発において重要な考慮すべき事項であり、なぜなら、４種の全ての血清型に対して完全中和抗体を誘発しない免疫原は、感染を予防するよりもむしろ疾患に寄与する場合があるからである。感染に対する効率的な処置の欠如およびヒトの健康へのリスクを考慮して、抗体依存性増強を引き起こす可能性がない防御反応を生じる効率的なワクチンを開発することが必要とされている。
【0006】
Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒにより開発された１種のデングワクチンＤｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）（ＣＹＤ－ＴＤＶ）が認可されている。約５種の追加のデングワクチン候補が臨床開発中であり、２種の候補（ＢｕｔａｎｔａｎおよびＴａｋｅｄａにより開発された）は、２０１６年初頭に第３相臨床試験を開始することが期待されている。
【0007】
臨床試験では、Ｄｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）ワクチンは、幼児（５歳未満）でのデング出血熱（まさに予防することが意図されている疾患）に起因して入院のリスクを増加させることが分かった。結果として、Ｄｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）ワクチンは、認可が限定されており、即ち９歳以上の人にのみ限定されている。ジカとデングとの抗原交差反応性を考慮すると、Ｄｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）ワクチンおよび開発中の他のデングワクチンによるワクチン接種は、ジカウイルスのＡＤＥを促進する場合があり、成人におけるギラン・バレー症候群の発生率および幼児における小頭症の発生率が増加するという懸念と、ジカに対する開発中のワクチンが、一部の対象でＤｅｎｇｖａｘｉａが行うようにデング出血熱のリスクが同様に増加する場合があるという懸念とがある。
【0008】
ジカウイルスは、サルにおいて１９４７年にウガンダで最初に同定された蚊媒介性フラビウイルスであり、後にウガンダおよびタンザニア連合共和国で１９５２年にヒトにおいて同定された。アフリカ、アメリカ、アジアおよび太平洋ではジカウイルス疾患の大流行が記録されている。１９６０年代から１９８０年代にかけて、アフリカおよびアジアの全域でヒト感染が見出され、通常、軽度の病気を伴った。症状は、デング熱等の感染症と類似しており、発熱、皮膚発疹、結膜炎、筋肉および関節痛、倦怠感および頭痛が挙げられる。これらの症状は、通常、軽度であり、２～７日にわたり持続する。しかしながら、ジカウイルス感染は、一部の対象で合併症を引き起こす場合がある。妊娠期間中でのジカウイルス感染は、小頭症等の先天性脳異常の原因として認識されている。ジカウイルスは、ギラン・バレー症候群の引き金である。ジカウイルスと一連の神経障害との間の関連が研究されている。
【0009】
Ｓａｎｏｆｉは、米国のＷａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＲＡＩＲ）およびブラジルのＦｉｏｃｒｕｚ公衆衛生センターとの共同研究でジカワクチンを開発したことを２０１６年に報告し、２０１６年、プラスミドＤＮＡワクチンまたは精製済の不活性化ウイルスワクチンによる免疫付与により、ブラジル北東部でのアウトブレイクに関与するジカウイルスの株によるチャレンジに対する感受性マウスでの完全な防御がもたらされることを報告した（Ｌａｒｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｎａｔｕｒｅ ５３６，４７４－４７８（２５ Ａｕｇｕｓｔ ２０１６）。
【0010】
しかしながら、ヒトでのプラスミドＤＮＡワクチン接種は、送達するための「遺伝子銃」または類似の技術（例えば、エレクトロポレーション）を必要とし、このアプローチは、デングおよびジカの問題に対する世界的規模の解決策を提供すると考えられていない。同様に、開発中のＤＮＡワクチンアプローチおよび不活性化ウイルスワクチンアプローチの両方は、ＡＤＥの原因に関与するデング－ジカ交差反応性エピトープを含む。
【0011】
感染またはワクチン接種後、身体の免疫系は、ウイルスの表面タンパク質に結合して感染を遮断する中和抗体を産生する。抗体依存性増強（ＡＤＥ）は、あるウイルスにより誘発された抗体が類似のウイルスに結合し得るが、このウイルスの感染を遮断しない（中和しない）場合に起こる。
【0012】
ＡＤＥは、デングウイルスで最も一般的に観察される。デングウイルスの４種の既知の血清型は、異なるが関連する表面タンパク質を有する。第１のデングウイルス血清型による感染は、概して、感染した個体において軽度のまたは全くない症状をもたらす。対象が第２のデング血清型に続いて感染する場合、免疫系は、ウイルスの第２の血清型に結合するが、必ずしも感染を遮断するとは限らず、かつＡＤＥを引き起こす可能性を有する、第１の血清型に対する抗体を産生する。結果として、デングウイルスが通常感染しない細胞（即ち抗体の「テイル」またはＦｃ領域のレセプターを有する細胞）へのウイルスの抗体媒介性取り込みが存在する。これにより、デング出血熱またはデングショック症候群等のより重症な疾患がもたらされ得る。若い幼児のみが、胎盤を通して伝播した母親の抗デング抗体の結果としてデングへの最初の暴露時にデング出血熱を発症する。従って、抗体は、成人でも幼児でも（重度の）疾患原因においてウイルスと同等のパートナーである。
【0013】
デングウイルス抗体は、他のデングウイルス血清型のＡＤＥを促進するだけでなくジカウイルス感染も増強する。Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７，１１０２－１１０８．“Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏ－ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｒｉｖｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ”。Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉらは、デング中和抗体またはデングウイルス患者からの血清の、細胞培養物中のジカウイルスへの効果を試験した。抗体の非存在下において、ジカウイルスは、細胞に十分に感染しないが、ジカウイルスをデング血清または中和抗体と共にインキュベートした場合、ジカウイルスは、この細胞に頑強に感染し、これは、ＡＤＥの作用を示す。この発見の生理学的関連性は、疫学研究での確認を必要とするが、これらの発見は、現在のワクチンアプローチの明らかなリスクを提起する。これまで、この問題に対する満足な解決策は、考えられていないかまたは提唱されていない。
【0014】
本分野でのワクチンは、人口ベースで純便益を有することが判明し得るが、個人ベースでは実態が異なる。一部の対象では、悲惨なことに、ある疾患を予防することにより、別のものからの重症度または死亡率のリスクが増加する場合がある。Ｐａｕｌ ＬＭ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１６）５，ｅ１１７“Ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”は、下記のように報告している。
「数十年にわたり、蚊伝播性フラビウイルスであるジカウイルス（ＺＩＫＶ）によるヒト感染は、軽度の疾患と関連して散発的であり、症状が他の急性発熱疾患と類似していたことから過小報告されていた。ＺＩＫＶと関連する重症疾患の近年の報告は、認識を大幅に高めている。コンピテントなアエデス（Ａｅｄｅｓ）蚊ベクターが発見された場合、ＺＩＫＶがアメリカおよび世界規模で蔓延し続けているであろうと予測される。最も一般的な蚊伝播性ヒトフラビウイルスであるデングウイルス（ＤＥＮＶ）は、十分に確立されており、近年のＺＩＫＶ導入の分野では大流行の原因でもある。ＤＥＮＶおよびＺＩＫＶは、密接に関連しており、結果として実質的な抗原重複が生じる。抗体依存性増強（ＡＤＥ）を介して、抗ＤＥＮＶ抗体は、特定のクラスの免疫細胞に関してＤＥＮＶの感染力を増強し得、重症疾患の結果と相関するウイルス産生が増加する。同様に、ＺＩＫＶは、他のフラビウイルスにより産生された抗体に反応してＡＤＥを受けることが分かっている。著者らは、中和アッセイおよびＡＤＥアッセイを使用して、ＺＩＫＶに対する、十分に特徴付けられた広範な中和ヒト抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体（ＨＭＡｂ）およびヒトＤＥＮＶ免疫血清の中和能力および増強能力を試験した。著者らは、抗ＤＥＮＶ ＨＭＡｂが交差反応し、中和せず、インビトロでＺＩＫＶ感染を大きく増強することを示す。ＤＥＮＶ免疫血清は、ＺＩＫＶに対する中和の様々な程度を有し、ＺＩＫＶ感染を同様に増強した。著者らの結果は、既存のＤＥＮＶ免疫がインビボでＺＩＫＶ感染を増強する場合があり、疾患の重症度を高めるようになる場合があることを示唆する。ＺＩＫＶとＤＥＮＶとの間の相互作用を理解することは、公衆衛生の対応の報告で重要であり、特にＺＩＫＶおよびＤＥＮＶのワクチン設計および実施戦略にとって有益であろう。」
「数十年にわたり、蚊伝播性フラビウイルスであるジカウイルス（ＺＩＫＶ）によるヒト感染は、軽度の疾患と関連して散発的であり、症状が他の急性発熱疾患と類似していたことから過小報告されていた。ＺＩＫＶと関連する重症疾患の近年の報告は、認識を大幅に高めている。コンピテントなアエデス（Ａｅｄｅｓ）蚊ベクターが発見された場合、ＺＩＫＶがアメリカおよび世界規模で蔓延し続けているであろうと予測される。最も一般的な蚊伝播性ヒトフラビウイルスであるデングウイルス（ＤＥＮＶ）は、十分に確立されており、近年のＺＩＫＶ導入の分野では大流行の原因でもある。ＤＥＮＶおよびＺＩＫＶは、密接に関連しており、結果として実質的な抗原重複が生じる。抗体依存性増強（ＡＤＥ）を介して、抗ＤＥＮＶ抗体は、特定のクラスの免疫細胞に関してＤＥＮＶの感染力を増強し得、重症疾患の結果と相関するウイルス産生が増加する。同様に、ＺＩＫＶは、他のフラビウイルスにより産生された抗体に反応してＡＤＥを受けることが分かっている。著者らは、中和アッセイおよびＡＤＥアッセイを使用して、ＺＩＫＶに対する、十分に特徴付けられた広範な中和ヒト抗ＤＥＮＶモノクローナル抗体（ＨＭＡｂ）およびヒトＤＥＮＶ免疫血清の中和能力および増強能力を試験した。著者らは、抗ＤＥＮＶ ＨＭＡｂが交差反応し、中和せず、インビトロでＺＩＫＶ感染を大きく増強することを示す。ＤＥＮＶ免疫血清は、ＺＩＫＶに対する中和の様々な程度を有し、ＺＩＫＶ感染を同様に増強した。著者らの結果は、既存のＤＥＮＶ免疫がインビボでＺＩＫＶ感染を増強する場合があり、疾患の重症度を高めるようになる場合があることを示唆する。ＺＩＫＶとＤＥＮＶとの間の相互作用を理解することは、公衆衛生の対応の報告で重要であり、特にＺＩＫＶおよびＤＥＮＶのワクチン設計および実施戦略にとって有益であろう。」
【0015】
デングウイルス抗体は、ジカウイルスのＡＤＥを促進し得る。ジカウイルス抗体は、デングウイルスのＡＤＥを促進し得る。そのため、ジカウイルスに対する免疫付与は、デング出血熱もしくはデングショック症候群の発生率を増加させる可能性があるか、または免疫付与がなければ発症しなかったであろう個体でのこれらの状態の発症を促進する可能性がある。数年であり得る感染の間隔を考慮すると、市販流通後の調査研究が、新規のワクチンが重度のデング熱疾患（出血熱、ショック症候群）または重度のジカ後遺症（例えば、ギラン・バレー症候群または小頭症）に罹りやすくするかどうか、およびどの程度まで罹りやすいかについて通知し得るまで数年かかるであろう。
【0016】
従って、抗体依存性増強の問題を回避するために意図的に設計されているワクチンアプローチが明らかに必要とされている。
【0017】
現在の血清学的試験を使用するフラビウイルス感染の特定の診断は、他の臨床的に関連するフラビウイルスに対する抗体間の交差反応により複雑になる。交差反応性は、異なるフラビウイルスが共循環する領域またはフラビウイルスに対するワクチンにより免疫付与されている集団で特に問題である。交差反応性抗体の大部分は、ドメインＩＩの遠位末端の融合ループ中の保存されたエピトープを標的とする免疫優性フラビウイルスエンベロープ（Ｅ）タンパク質に対して産生される。
【0018】
個体が血清陰性であり、そのため、デングもしくはジカに暴露されていないかどうかを評価するために、または個体が血清陽性であり、ジカおよび／またはデングに暴露されているかどうかを評価するために、かつ血清陽性である個体に関してジカおよび／または４種のデング血清型の何れに個体が暴露されているかを区別するために、密接に関連するフラビウイルス間を区別し得る診断アプローチが必要とされている。免疫付与の対象を選択するために使用され得るか、または免疫付与によりデングおよびジカに対する防御免疫反応が生じているかどうかを判定するために血清陽転を評価するために使用され得る診断アプローチが必要とされている。そのため、デングウイルス血清型に対する抗体およびジカウイルスに対する抗体を区別するために免疫反応の調査を可能にする診断アプローチが必要とされている。
【0019】
国際公開第２０１６０１２８００号パンフレットは、デングウイルスに感染した患者から得られた交差反応性中和抗体の同定およびキャラクタリゼーションを開示する。急性ヒト抗体反応は、下記の２つの重要なエピトープに焦点を合わせていることが見出された：融合ループ上の既知のエピトープ（ＦＬ ＦＬＥ）、ならびにインタクトなビリオンまたはエンベロープタンパク質の二量体で見出されかつドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩの領域を包含する、新規であると言われている第２のエピトープ。第２のエピトープ、エンベロープ二量体エピトープまたはＥＤＥと反応する抗体は、低ピコモル範囲において、昆虫および初代ヒト細胞の両方において作製されたウイルスを完全に中和することが報告されれた。従って、安定化された可溶性タンパク質Ｅ二量体を含むサブユニットワクチンがデングワクチンとして提案された。国際公開第２０１６０１２８００号パンフレットでは、デングウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｅ外部ドメイン（ｓＥ；可溶性エンベロープポリペプチド／糖タンパク質）は、デングウイルス血清型１、２および４のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１～３９５アミノ酸断片ならびにデングウイルス血清型３のエンベロープ糖タンパク質Ｅの１～３９３アミノ酸断片を意味することが開示されている。国際公開第２０１６０１２８００号パンフレットでは、ｓＥの安定化二量体としてのＥＤＥは、ＤＥＮＶ－１ ｓＥ、ＤＥＮＶ－２ ｓＥ、ＤＥＮＶ－３ ｓＥ、ＤＥＮＶ－４ ｓＥ、ならびにこれらのＨ２７Ｆ、Ｈ２７Ｗ、Ｌ１０７Ｃ、Ｆ１０８Ｃ、Ｈ２４４Ｆ、Ｈ２４４Ｗ、Ｓ２５５Ｃ、Ａ２５９Ｃ、Ｔ／Ｓ２６２Ｃ、Ｔ／Ａ２６５Ｃ、Ｌ２７８Ｆ、Ｌ２９２Ｆ、Ｌ２９４Ｎ、Ａ３１３Ｃ（ＤＥＮ３中のＳ３１３Ｃ）およびＴ３１５Ｃの中から選択される少なくとも１つの変異（置換）を有する変異体ｓＥから選択され、この変異は、二量体の立体配置の安定性の増加に寄与すると考えられることが説明されている。その変異体ｓＥは、Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４ＮおよびＤ３２９Ｎから選択される少なくとも１つの変異（置換）をさらに含み得、好ましくは３つの全ての変異Ｑ２２７Ｎ、Ｅ１７４ＮおよびＤ３２９をさらに含み得ることが開示されており、この変異により、適切でない免疫原性領域がマスクされ、この発明の安定化された組換えｓＥ二量体が、４種の全てのデングウイルス血清型を対象とする中和抗体を優先的に誘発することが可能になると言われている。
【0020】
説明されているｓＥ二量体変異は、免疫原性を妨げるのではなく、架橋により安定化をもたらすために二量体接触面でシステイン変異を含むことにより、および／またはクリック化学による二量体上の隣接する糖間で化学的架橋を可能にする新規のグリコシル化部位の導入により、および／または二量体界面でもしくは各モノマーのドメイン１（Ｄ１）／ドメイン３（Ｄ３）リンカー中で空洞の形成を可能にするための少なくとも１つの嵩高い側鎖アミノ酸による少なくとも１つのｓＥモノマーのアミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換により、より高い二量体親和性を提供すると言われている。
【0021】
国際公開第２０１６０１２８００号パンフレットでは、改善されたＥＤＥが産生されるようにエンベロープタンパク質が操作され得、認識され得ないかまたは抗融合ループ（抗ＦＬ）抗体を生じさせ得ないＥＤＥが改善されたＥＤＥであると考えられていたことが開示されている。そのような改善は、エンベロープタンパク質中での１つまたは複数の変異、欠失または挿入により、特定のエピトープ（抗ＦＬ抗体を生じることになるあらゆる抗原を含まない）が足場タンパク質に融合しているハイブリッドタンパク質を生成することにより、またはＮ連結グリカン配列もしくはＯ連結グリカン配列を追加することにより免疫原性を低下させるために二量体（ウイルスの内部へと突出している）の内表面を糖で修飾することによってエンベロープタンパク質を操作することにより達成され得ることが開示されている。
【0022】
Ｒｏｂｙら（２０１３、２０１４）は、フラビウイルスゲノムのカプシド（Ｃ）遺伝子内に大きい内部欠失を導入して、ビリオンへのパッケージ化が不能であり、感染性ウイルスが生成されることなく、高度に免疫原性のサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の分泌が依然として維持される複製可能なＲＮＡを生成することによる、西ナイルウイルスのワクチン候補の開発へのアプローチを説明している。そのような偽感染性のＣ欠失ワクチンは、トランスフェクト細胞からの大量の非感染性免疫原性サブウイルス粒子（ＳＶＰ）の複製および分泌が可能であり、そのため、生ワクチンの複製により生じた頑強な免疫反応を有する非感染性の不活性化ワクチンまたはサブユニットワクチンの安全性の複合利益を提供すると言われている。
【0023】
Ｒｏｂｙら（２０１３）は、アルファヘリックス１、２および４が２つの別々のセグメントで除去されており、かつ親水性アルファヘリックス３が維持されている西ナイルウイルスＫｕｎｊｉｎ（ＫＵＮＶ）の、Ｃ欠失ＣＭＶプロモーター駆動されるｃＤＮＡを有する構築物ｐＫＵＮｄＣ／Ｃ（ＫＵＮｄＣ１８－１００／ＣＭＶ－Ｃ）を作製した。ｐＫＵＮｄＣ／Ｃ Ｃ－欠失ＷＮＶでは、ｃＤＮＡは、あるコピーのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下に置かれ、Ｃ遺伝子は、同一のプラスミドＤＮＡ中の別のコピーのＣＭＶプロモーターの制御下に置かれていた。より大きい細胞質部分（アルファヘリックス３）の保存により、ＣおよびｄＣ４４～５９の全てのアルファヘリックスが欠失している構築物の場合と比較して、ＳＶＰ分泌が有意に改善されるに至った。ＳＶＰ分泌のさらなる改善を、ＷＮＶの多くの循環株およびＫＵＮＶの近年の単離物の特徴であるＥタンパク質のＮ１５４でのＡｓｎ連結グリコシル化モチーフ（Ｅタンパク質のアミノ酸１５４～１５６でのＮＹＳモチーフに対応する）の組込み時にも観測した。ｐＫＵＮｄＣ／Ｃは、ＳＶＰを産生する自己複製Ｃ欠失ＲＮＡを周囲の細胞に送達し得る単一ラウンドの感染性粒子（ＳＲＩＰ）を生成することが分かった。しかしながら、ｐＫＵＮｄＣ／Ｃ ＤＮＡから産生されたＳＲＩＰおよびＳＶＰの両方の量は比較的低かった。
【0024】
Ｒｏｂｙら（２０１４）は、ＣＭＶプロモーターがより強力な伸長因子ＥＦ１ａプロモーターに置き換えられており、かつｔｒａｎｓ－Ｃ発現を最適化することによりＳＲＩＰ産生を増加させるために異なる形態のＣが使用される、西ナイルウイルスＫｕｎｊｉｎ（ＫＵＮＶ）のＣ欠失ｃＤＮＡを有する第二世代構築物の作製を報告した。拡張形態のＣをコードする伸長因子ＥＦ１ａプロモーターを含む構築物は、最高力価のＳＲＩＰを産生することが実証されており、マウスでは、免疫原性であった。ＳＲＩＰおよびＳＶＰの力価は、ＳＶＰの分泌を増強するエンベロープタンパク質（Ｅタンパク質のアミノ酸１５４～１５６でのＮＹＳモチーフに対応する）中でのＮ１５４グリコシル化モチーフの組込みによりさらに改善された。
【0025】
Ｄａｖｉｓら（２０１４）は、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）の、ＣＤ２０９発現細胞に感染する能力を調べた。哺乳類細胞由来の西ナイルウイルスは、Ｃ型レクチンＣＤ２０９Ｌを発現する細胞に優先的に感染するが、ＣＤ２０９を発現する細胞には感染せず、これに対して、デングウイルス（ＤＥＮＶ）感染は、何れかの付着因子を発現する細胞中で増強される。ＤＥＮＶビリオンおよびＷＮＶビリオンは、非常に類似した構造を有する。これらの表面は、正２０面体格子（３６）で配列された１８０個のエンベロープ（Ｅ）タンパク質サブユニットの規則的なアレイからなる。前膜タンパク質（ｐｒＭ）のフリン介在性プロセシング後に生成される小膜（Ｍ）タンパク質もビリオン表面上に存在するが、大部分がウイルス膜に埋没している。ＤＥＮＶビリオンとＷＮＶビリオンとの間の主な構造的相違は、ＤＥＮＶウイルスＥタンパク質中でのＮ連結グリコシル化部位の数および位置に由来する。ほとんどのＤＥＮＶ単離物は、残基６７および１５３でグリコシル化部位を含むが、１５３での部位は、必ずしも利用されるとは限らない場合があり、ＷＮＶ Ｅタンパク質は、アスパラギン１５４でＮ連結グリカンのみを含むが、これは、多くのウイルス株で存在しない。ＷＮＶ Ｅタンパク質上のＮ－グリコシル化の存在は、いくつかの研究において、マウスでの神経侵襲性の増加およびインビトロでの細胞指向性の変更と関連している。Ｄａｖｉｓらは、西ナイルウイルスＥに６７位置でのグリコシル化部位でグリコシル化を導入した。このＥタンパク質でシュードタイプ化されたレポーターウイルス粒子を、ＣＤ２０９またはＣＤ２０９Ｌの何れかを使用して細胞に感染させた。いくつかの他の位置でグリコシル化部位を導入した。ＷＮＶ株ＮＹ９９ ｐｒＭ－Ｅ発現プラスミドｐＣＢＷＮおよびＥタンパク質残基１５４でＮ連結グリコシル化部位を欠く、このプラスミドの誘導体（ＮＹ９９－Ｎ１５４Ｑ）を、部位特異的変異誘発によるＷＮＶ Ｅタンパク質への新規のＮ連結グリコシル化部位の導入用のテンプレートとして使用した。下記のアミノ酸変更をＮＹ９９－Ｎ１５４Ｑに導入した：（ｉ）Ａｌａ－５４からＴｈｒへ（Ａ５４Ｔ）は、Ａｓｎ－５２でＮ連結グリコシル化部位を付加する；（ｉｉ）Ｄ６７Ｎは、Ａｓｎ－６７で部位を付加する；（ｉｉｉ）Ｋ８４Ｔは、Ａｓｎ－８２で部位を付加する；（ｉｖ）Ａ１７３ＮおよびＰ１７４Ｇ（ＡＰ１７３ＮＧ）は、Ａｓｎ－１７３で部位を付加する；（ｖ）Ｇｌｕ－１８２からＮＧＳへ（Ｅ１８２ＮＧＳ）は、Ｇｌｕ－１８２をＡｓｎに変異させ、かつ２つのアミノ酸（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）を挿入してシークオンを完成させることにより、Ａｓｎ－１８２で部位を付加する；（ｖｉ）Ｓ２３０ＮおよびＶ２３２Ｔ（ＳＴＶ２３０ＮＴＴ）は、Ａｓｎ－２３０で部位を付加する；（ｖｉｉ）Ｖ２７９Ｔは、Ａｓｎ－２７７で部位を付加する；（ｖｉｉｉ）Ｔ３０１ＮおよびＧ３０３Ｓ（ＴＹＧ３０１ＮＹＳ）は、Ａｓｎ－３０１で部位を付加する；（ｉｘ）Ｔ３３０Ｎは、Ａｓｎ－３３０で部位を付加する；（ｘ）Ｋ３７０Ｔは、Ａｓｎ－３６８で部位を付加する；（ｘｉ）Ｇ３８９ＮおよびＱ３９１（ＧＥＱ３８９ＮＥＴ）は、Ａｓｎ－３８９で部位を付加する。全ての部位でＣＤ２０９Ｌ媒介性感染が認められたが、サブセットのみがＣＤ２０９の使用を促進した。他のウイルスに見られるように、西ナイルウイルスとＣＤ２０９との相互作用には西ナイルウイルスに対してマンノースリッチグリカンが必要であったが、マンノースリッチグリカンは、ＣＤ２０９Ｌ媒介性感染に必要とされなかった。複雑なグリカン（特にＮ－アセチルグリコサミン末端構造）は、レポーターウイルス粒子とＣＤ２０９Ｌとの相互作用を媒介し得た。Ｄａｖｉｓらは、ＣＤ２０９Ｌは、広い特異性を有するグリコシル化フラビウイルスを認識するが、ＣＤ２０９は、マンノースリッチグリカンを有するフラビウイルスに対して選択的であり、そのため、ビリオン上でのＮ連結グリコシル化部位の位置が、組み込まれたグリカンのタイプを決定し、そのため、ＣＤ２０９発現細胞のウイルス指向性を制御することを提案した。
【発明の概要】
【0026】
本発明は、天然フラビウイルスＥタンパク質融合ループ配列中に存在しないＮ連結グリカンのための少なくとも１つのグリコシル化部位を含むフラビウイルスＥタンパク質融合ループの単離組換え類似体であって、この少なくとも１つのグリコシル化部位は、Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）であり、およびこのシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、天然フラビウイルスＥタンパク質融合ループアミノ酸配列の９８～１１０位（配列番号１：ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫ）の何れかを占め得、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、およびＳｅｒ／Ｔｈｒは、セリン残基またはトレオニン残基を示す、フラビウイルスＥタンパク質融合ループの単離組換え類似体を提供する。
【0027】
本発明に係るフラビウイルスＥタンパク質融合ループの単離組換え類似体は、天然フラビウイルスＥタンパク質融合ループ配列中に存在しない２つのグリコシル化部位を含み得る。
【0028】
本発明は、本発明のフラビウイルスＥタンパク質融合ループの類似体を含むフラビウイルスＥタンパク質の単離組換え類似体を提供する。一部の実施形態では、フラビウイルスＥタンパク質の単離組換え類似体の配列への唯一の改変は、Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を導入するためのこの融合ループ中での本発明の改変であり、他の実施形態では、この融合ループ外の残基においてフラビウイルスＥタンパク質中で１種または複数のさらなる改変を導入し得る。
【0029】
本発明の類似体であって、それに付着された少なくとも１つの追加のグリカンを有する類似体が提供される。好ましくは、この少なくとも１つの追加のグリカンは、Ｎ連結グリカンである。好ましくは、本発明の類似体は、組換えＤＮＡ配列または組換えＲＮＡ配列の発現産物である。この少なくとも１つの追加のグリカンは、フラビウイルスＥタンパク質融合ループ外のフラビウイルスＥタンパク質中の１つまたは複数の天然グリコシル化部位に存在し得る。
【0030】
本発明の類似体は、Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含み得、それにより、このシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、９８～１０１位および／または１０６～１１０位の何れかを占める。
【0031】
好ましくは、本発明の類似体において、Ｘは、以下の１３種のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＴｈｒまたはＳｅｒの何れかである。
【0032】
本発明の好ましい類似体において、このフラビウイルスＥタンパク質は、デングウイルスＥタンパク質であり、およびシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列の１０１位、１０８位もしくは１０１位および１０８位の両方を占めるか、またはこのフラビウイルスＥタンパク質は、ジカＥタンパク質であり、およびシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列の１００位を占める。
【0033】
本発明の好ましい類似体では、フラビウイルスは、デングウイルスであり、およびこの類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列９８～１１０は、
から選択される。
【0034】
本発明の別の好ましい類似体では、このフラビウイルスは、ジカウイルスであり、およびこの類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列９８～１１０は、
である。
【0035】
本発明は、本発明に係るフラビウイルスＥタンパク質融合ループの類似体をコードする配列を含む単離組換えＤＮＡ配列または単離組換えＲＮＡ配列をさらに提供する。
【0036】
単離組換えＤＮＡ配列は、プラスミドまたは線形ＤＮＡをベースとするワクチンであり得る。本発明の単離組換えＤＮＡ配列は、哺乳類のプロモーターの制御下において、本発明に係るフラビウイルスＥタンパク質の類似体をコードし得る。
【0037】
本発明は、本発明に係るＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含む宿主細胞をさらに提供する。この宿主細胞は、本発明に係るＤＮＡ配列または本発明に係るプラスミドもしくは線形ＤＮＡをベースとするワクチン免疫原を含む真核宿主細胞であり得る。
【0038】
好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の類似体を発現し得る。さらに好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の類似体を発現およびグリコシル化し得る。
【0039】
本発明は、本発明の類似体を作製する方法であって、本発明に係る宿主細胞をこの類似体の発現に適した条件下で培養するステップと、この類似体を単離するステップとを含む方法を提供する。
【0040】
さらに提供されるのは、本発明の類似体と希釈剤とを含む組成物である。
【0041】
本発明の組成物は、免疫原性（ワクチン）組成物であって、前記組成物を接種された対象中で免疫反応を誘発し得、本発明に係る類似体を薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に含む組成物であり得る。
【0042】
本発明の組成物は、ＤＥＮ－１の類似体、ＤＥＮ－２の類似体、ＤＥＮ－３の類似体、ＤＥＮ－４の類似体およびジカの類似体から選択される本発明の１種または複数のフラビウイルス類似体を含み得る。
【0043】
本発明の組成物は、４種のデングウイルス血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４のそれぞれを表す本発明の４種のデング類似体を含み得る。
【0044】
本発明の組成物は、本発明のジカウイルス類似体を含み得る。
【0045】
本発明の組成物は、４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４のそれぞれを表す本発明の４種のデング類似体と、本発明のジカウイルス類似体とを含み得る。
【0046】
本発明は、本発明の類似体に特異的に結合し得る結合分子も提供する。この結合分子は、抗体もしくはその断片、ドメイン抗体、タンパク質足場またはアプタマーであり得、但し、これらは、本発明の類似体に特異的に結合し得る。
【0047】
本発明は、薬剤としての使用のための本発明の類似体、組成物または結合分子を提供する。
【0048】
さらに、本発明は、ワクチンとしての使用のための本発明の類似体、組成物または結合分子を提供する。
【0049】
同様に提供されるのは、フラビウイルス感染の予防的処置もしくは治療的処置のための薬剤としての使用、またはフラビウイルス感染の予防的処置もしくは治療的処置のための薬剤の製造における使用のための本発明の類似体、組成物または結合分子である。
【0050】
本発明は、フラビウイルスによる感染から対象を防御する方法であって、本発明の類似体、組成物または結合分子を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0051】
好ましい実施形態では、このフラビウイルス感染は、デングウイルス感染またはジカウイルス感染である。
【0052】
本発明は、診断薬としての使用のための本発明の類似体、組成物または結合分子を提供する。
【0053】
本発明は、本発明の類似体、組成物または結合分子と、前記単離類似体または結合分子を含有する免疫学的（抗原－抗体）複合体を検出し得る試薬とを含む診断キットを提供する。
【0054】
本発明に従う診断試験キットは、１種または複数のコントロール標準物質、および／または検体希釈剤、および／または洗浄緩衝液をさらに含み得る。
【0055】
本発明の診断試験キットでは、本発明の類似体および／またはこの類似体に特異的な結合分子は、固体支持体上に固定され得る。この固体支持体は、マイクロプレートウェルであり得る。本発明に係る診断試験キットでは、前記単離類似体または結合分子を含有する免疫学的複合体は、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローによって検出され得る。
【0056】
本発明は、抗体依存性増強の問題を回避するように意図的に設計されているワクチンアプローチを提供する。
【0057】
本発明は、密接に関連するフラビウイルスを区別して、個体が血清陰性であり、そのため、デングもしくはジカに暴露されていないかどうかを評価し得、または個体が血清陽性であり、ジカおよび／もしくはデングに暴露されているかどうかを評価し得、かつ血清陽性である個体に関してこの個体が暴露されているのがジカおよび／もしくは４種のデング血清型の何れかであるかを区別し得る診断アプローチを提供する。本発明は、免疫付与の対象を選択するために、または免疫付与がデングもしくはジカに対する防御的免疫反応を生じさせているかどうかを判定するために抗体陽転を評価するために使用され得る診断アプローチを提供する。本発明は、デングウイルス血清型およびジカウイルスに対する抗体を識別するための免疫反応の調査を可能にする診断アプローチを提供する。
【0058】
ここで、添付の図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】図１は、交差反応性の融合ループ抗体の産生および感染増強抗体の誘発または刺激を回避するための、本発明のワクチン免疫原の設計である。図１「Ａ」は、４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４を含む、当技術分野で既知の生弱毒化ワクチン等のフラビウイルスワクチンによるワクチン接種の効果を示す。弱毒化ワクチンビリオンを、このビリオンから突出するＥタンパク質部分幹状部を有する丸い構造として示し、融合ループを、ビリオンＥタンパク質部分の幹状部上の小さい距状突起として描写し、抗体をＹ字型分子として描写し、感染増強抗体を黒塗りで示し、中和抗体を黒枠の白色で示し、「Ｂ」は、本発明のワクチン免疫原設計を示す。新規の免疫原は、感染増強抗体が産生されることなくワクチンのＥタンパク質に対して中和抗体が産生されるために、融合ループ配列がグリカン（融合ループ距状突起に付着した三日月形で描写するの付着用のグリコシル化部位を含むように置換されているＥタンパク質を含む。「Ｃ」は、Ｅタンパク質の融合ロープに対する感染増強抗体が、野生型フラビウイルスビリオンのＥタンパク質に結合した場合、Ｆｃ－ガンマ－レセプターＩＩａ（黒枠の白色長方形で描写する）にどのように高親和性で関与し得、Ｆｃ－ガンマレセプターＩＩａを担持する骨髄細胞の感染を促進するかを示す。「Ｄ」は、ワクチンの、一部の対象（例えば、免疫抑制されている）中での防御レベルの抗体反応の誘発の時折の失敗を表す。デングに対して防御されていないが、そのような免疫無防備状態の対象（本開示のワクチンで免疫付与されている）は、新規のワクチンにより少なくともデング熱に罹り難く、なぜなら、この対象は、融合ループに対する抗体反応を開始していないからである。これは、覆い隠されていない融合ループを含む従来の設計のワクチンと対照的であり得、この従来の設計のワクチンでは、対象は、中和濃度未満の融合－ループ抗体を誘発している従来のワクチンにより重度のデング感染に罹りやすい可能性がある。
【図2a】図２ａは、デング外部ドメインタンパク質およびジカ外部ドメインタンパク質の糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）形態の組換え発現である。ＨＥＫ２９３細胞中でのデング構築物およびジカ構築物の発現の評価を示すクマシー染色ゲル、示されるレーンは、下記の通りである：１：ｐＳＦ２３６トランスフェクト細胞ＷＴ、２：ｐＣＲＯ２１トランスフェクト細胞、３：ｐＳＦ２３７トランスフェクト細胞ＷＴ、４：ｐＣＲＯ２２トランスフェクト細胞、５：ｐＳＦ２３８トランスフェクト細胞ＷＴ、６：ｐＣＲＯ２３トランスフェクト細胞、７：ｐＳＦ２３９トランスフェクト細胞ＷＴ、８：ｐＣＲＯ２４トランスフェクト細胞、９：ｐＳＦ２３３トランスフェクト細胞ＷＴ、１０：ｐＣＲＯ２５トランスフェクト細胞、１１：ｐＳＦ２３６トランスフェクト細胞ＷＴ、１２：ｐＣＲＯ２１トランスフェクト細胞、１３：ｐＳＦ２３７トランスフェクト細胞ＷＴ、１４：ｐＣＲＯ２２トランスフェクト細胞、１５：ｐＳＦ２３８トランスフェクト細胞ＷＴ、１６：ｐＣＲＯ２３トランスフェクト細胞、１７：ｐＳＦ２３９トランスフェクト細胞ＷＴ、１８：ｐＣＲＯ２４トランスフェクト細胞、１９：ｐＳＦ２３３トランスフェクト細胞ＷＴ、２０：ｐＣＲＯ２５トランスフェクト細胞。レーン１～１０の場合、上清濃縮物は、１ｕｌ／１．１ｍｌであり、レーン１１～２０の場合、上清濃縮物Ｔａｌｏｎ溶出液濃縮物は、２６ｕｌ／４００ｕｌであった。
【図2b】図２ｂは、デング外部ドメインタンパク質およびジカ外部ドメインタンパク質の糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）形態の組換え発現である。デング－１構築物およびジカ構築物のさらなる発現評価を示す抗ｈｉｓ－タグウエスタンブロット。下記のように、レーン１～８は、細胞ペレットを示し、レーン９～１６は、未加工（ろ過済）上清を示し、レーン１７～２４は、Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液を示す：１：ｐＳＦ２３６細胞ペレット、２：ｐＣＲＯ２６細胞ペレット、３：ｐＣＲＯ２７細胞ペレット、４：ｐＳＦ２３３細胞ペレット、５：ｐＣＲＯ２８細胞ペレット、６：ｐＣＲＯ２９細胞ペレット、７：ｐＣＲＯ３０細胞ペレット、８：ｐＣＲＯ３１細胞ペレット、９：ｐＳＦ２３６ろ過上清、１０：ｐＣＲＯ２６ろ過上清、１１：ｐＣＲＯ２７ろ過上清、１２：ｐＳＦ２３３ろ過上清、１３：ｐＣＲＯ２８ろ過上清、１４：ｐＣＲＯ２９ろ過上清、１５：ｐＣＲＯ３０ろ過上清、１６：ｐＣＲＯ３１ろ過上清、１７：ｐＳＦ２３６ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液、１８：ｐＣＲＯ２６ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液、１９：ｐＣＲＯ２７ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液、２０：ｐＳＦ２３３ ＮＩ－ＮＴＡ溶出液、２１：ｐＣＲＯ２８ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液、２２：ｐＣＲＯ２９ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液、２３：ｐＣＲＯ３０ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液、２４：ｐＣＲＯ３１ Ｎｉ－ＮＴＡ溶出液。３つの矢印は、検出された高グリコシル化外部ドメイン形態を示す。
【図2c】図２ｃは、デング外部ドメインタンパク質およびジカ外部ドメインタンパク質の糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）形態の組換え発現である。デング血清型１～４（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４）のそれぞれに関する高グリコシル化形態ｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４およびジカに関するｐＣＲＯ２８のウエスタンブロットを示す。各対の左側のレーンは、野生型（ｗｔ）を示す一方、各対の右側のレーンは、デングまたはジカのＥタンパク質外部ドメインの高グリコシル化形態を示す。＋２は、２つの追加のグリコシル化部位／グリカンを示し、＋１は、１つの追加のグリコシル化部位／グリカンを示す。
【図2d】図２ｄは、デング外部ドメインタンパク質およびジカ外部ドメインタンパク質の糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）形態の組換え発現である。精製済の高グリコシル化Ｅ外部ドメインタンパク質Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびジカ（それぞれ配列表のプラスミドｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４およびｐＣＲＯ２８に対応する）のクマシーブルー染色ゲルを示す。左側のスケールは、‘０００での分子量マーカーの移動位置である。
【図3a】図３ａは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ＰＮＧアーゼ消化前後のデング試料およびジカ試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図3b】図３ｂは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤによる、参照標準と比較したデング－２およびジカから遊離されたグリカンの分析を示す。
【図3c】図３ｃは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。デング－２のトリプシン切断部位およびペプチド断片を示す。
【図3d】図３ｄは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ジカのトリプシン切断部位およびペプチド断片を示す。
【図3e】図３ｅは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ジカのエンド－Ｌｙｓ－Ｃ切断部位およびペプチド断片を示す。
【図3f】図３ｆは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ＰＮＧアーゼＦ消化を伴うおよび伴わないデング－２のトリプシン消化を示す。
【図3g】図３ｇは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ＰＮＧアーゼ消化を伴うおよび伴わないジカのトリプシン消化を示す。
【図3h】図３ｈは、糖操作されたデング２外部ドメインタンパク質上におよび糖操作されたジカ外部ドメインタンパク質上に存在するグリカンのキャラクタリゼーションならびに配列プログラムされたＮ連結グリコシル化部位の占有度である。ＰＮＧアーゼ消化を伴うおよび伴わないジカのエンド－Ｌｙｓ－Ｃ消化を示す。
【図4】図４は、直接ＥＬＩＳＡにより測定した、マウスにおける選択糖操作デングタンパク質１、２、３および４ならびにジカの免疫原性である。ｘ軸は、免疫付与後の日数を示し、ｙ軸は、ＩｇＧ抗体力価を示す。０日目、１４日目および２１日目に投与量を３回投与した。投与量を表９に示す。下記で示すように、ＥＬＩＳＡ固相上の野生型ＶＬＰとしての５種の全ての抗原に対して個々のマウスで抗体反応を測定した：上列の左側Ｄｅｎ１ ＶＬＰ抗原、上列の右側Ｄｅｎ２ ＶＬＰ抗原、中央列の左側Ｄｅｎ３ ＶＬＰ抗原、中央列の右側Ｄｅｎ４ ＶＬＰ抗原、下列の左側ジカＶＬＰ抗原。免疫原（上記のアッセイのために使用する抗原と異なる）は、白色円形で示すペンタ－ＤＮＡ（本発明のＤｅｎ１～４およびジカのＤＮＡのそれぞれの組み合わせ）であり、ペンタ－Ｐｒｏｔ（本発明のＤｅｎ１～４およびジカのタンパク質のそれぞれの組み合わせ）を黒色四角形で示し、一価のジカを黒色三角形で示し、ペンタＶＬＰ（本発明のＤｅｎ１～４およびジカのＶＬＰのそれぞれの組み合わせ）を黒色逆三角形で示す。ＰＢＳコントロールを白色逆三角形で示す。
【図5a】図５ａは、融合ループ抗体による糖操作タンパク質の認識の回避および中和エピトープの保持である。本開示の高グリコシル化抗原をさらにキャラクタライズする（この抗原を野生型の等価の抗原と比較する）ために、ＥＬＩＳＡアッセイを確立して多様な野生型外部ドメインおよび組換え外部ドメイン（図４のＶＬＰ抗原と異なる）に結合する抗体を測定した。図４で使用したＥＬＩＳＡ（抗原として野生型ＶＬＰのみを使用した）と異なり、このアッセイは、外部ドメイン型抗原（本発明の組換え野生型および組換え高グリコシル化形態「ＨＸ」）のみを使用した。これらの物質的に多様な（非グリコシル化細菌、昆虫－グリコシル化、およびヒト－グリコシル化）種のそれぞれの同一配向性を確保するために、これらの種をウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体（これらの種のＣ末端Ｈｉｓタグを認識する）で固相に固定する。コーティングしたプレートをブロックし、「コーティング後」ステップで様々なＨｉｓ－タグ付きタンパク質の一定濃度に暴露し、次いで様々な濃度（４Ｇ２に関する）においてモノクローナル抗体でプローブした。プローブ抗体に続いて、ウサギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（またはウサギ－抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート（必要に応じて）およびテトラメチルベンジジン基質と共にインキュベートした。マウスモノクローナル抗ヒト－ＣＤ４抗体は、マウスモノクローナル抗体のコントロールとして機能した。デング－２血清型に対して産生されたが、フラビウイルス間で高度に交差反応性であり、固相野生型デング血清型－２もしくはデング血清型－４野生型外部ドメイン抗原に結合する融合－ループ抗体４Ｇ２（ｘ軸、ｎｇ／ｍｌ）、または融合ループ中に２つの追加のプログラムされたシークオンを含む高グリコシル化カウンターパート（抗グリコシル化外部ドメインに関して「ＨＸ」）を表す。（アスタリスクは、ＥＬＩＳＡリーダーの読み取り能力と比べて高い吸光度値を示し）、Ｙ軸は、４５０ｎｍでの吸光度を示す。点は、２回の反復の測定の平均である。
【図5b】図５ｂは、融合ループ抗体による糖操作タンパク質の認識の回避および中和エピトープの保持である。本開示の高グリコシル化抗原をさらにキャラクタライズする（この抗原を野生型の等価の抗原と比較する）ために、ＥＬＩＳＡアッセイを確立して多様な野生型外部ドメインおよび組換え外部ドメイン（図４のＶＬＰ抗原と異なる）に結合する抗体を測定した。図４で使用したＥＬＩＳＡ（抗原として野生型ＶＬＰのみを使用した）と異なり、このアッセイは、外部ドメイン型抗原（本発明の組換え野生型および組換え高グリコシル化形態「ＨＸ」）のみを使用した。これらの物質的に多様な（非グリコシル化細菌、昆虫－グリコシル化、およびヒト－グリコシル化）種のそれぞれの同一配向性を確保するために、これらの種をウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体（これらの種のＣ末端Ｈｉｓタグを認識する）で固相に固定する。コーティングしたプレートをブロックし、「コーティング後」ステップで様々なＨｉｓ－タグ付きタンパク質の一定濃度に暴露し、次いで一定濃度においてモノクローナル抗体でプローブした。様々なデング抗原およびジカ抗原ならびにプローブ抗体を、ヒトポリクローナル抗ジカ回復期血清サンプルを含めて試験した。プローブ抗体に続いて、ウサギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（またはウサギ－抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート（必要に応じて）およびテトラメチルベンジジン基質と共にインキュベートした。マウスモノクローナル抗ヒト－ＣＤ４抗体は、マウスモノクローナル抗体のコントロールとして機能した。本アッセイ設計のＥＬＩＳＡプレート結果の写真であり、様々な外部ドメインを抗体への結合に関してスクリーニングした：例えば、一連のネズミモノクローナル抗体（左側から右側へ第１行および第２行：４Ｇ２（交差反応性融合－ループ抗体）、第３行および第４行：Ａａｌｔｏ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ抗ジカ抗体ＡＺ１１７６－０３０２１５６－Ｌｏｔ３８８９、第５行および第６行：Ｚ４８抗ジカ抗体、第７ウェルおよび第８ウェル：Ｚ６７抗ジカ抗体（これらは、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２０１６ではＺＶ４８およびＺＶ６７ジカ中和抗体と説明されており、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ＺＶ６７＝ＭＡＢ１２１２５およびＺＶ４８＝ＭＡＢ１２１２４から得た）、第９ウェルおよび第１０ウェル：抗ヒト－ＣＤ４コントロールＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ０２４－１０Ｄ６．Ｂ３ ２３２２５０１；第１１ウェルおよび第１２ウェル：ジカヒト回復期血清）。外部ドメイン（全てがＨｉｓ－６Ｃ末端タグを有する）は、下記の通り（上から下へ）であった：「Ａａｌｔｏ昆虫」＝Ａａｌｔｏ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，Ｉｒｅｌａｎｄからの、Ｓｆ９昆虫細胞により産生された野生型組換えジカ外部ドメイン；Ｐｒｏｓｐｅｃジカ＝Ｐｒｏｓｐｅｃ，Ｉｓｒａｅｌからの、細菌により産生された組換え野生型外部ドメイン；ＮＡＣ ＷＴ ｄｅｎ－２＝ＨＥＫ２９３により産生されたヒト野生型デング－２外部ドメイン（ＮＣＢＩ ＡＣＡ４８８５９．１の残基２８０～６７５、続いて７個または８個のアミノ酸長のグリシン－セリンリンカー、続いてＨｉｓ６タグに基づく）；「Ｅｘｃｉｖｉｏｎ ＨＸ ｄｅｎ－１（ヒト）覆い隠されている」は、融合ループにプログラムされた２つのＮ－グリコシル化シークオンを有する、ＨＥＫ２９３細胞からのプラスミドｐＣＲＯ２１の発現産物を表す；同様に、Ｅｘｃｉｖｉｏｎ ＨＸ ｄｅｎ－２からｄｅｎ－４の場合、それぞれプラスミドｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３およびｐＣＲＯ２４を表す。「Ｅｘｃｉｖｉｏｎ ＨＸ ジカヒト（覆い隠されている）」は、融合ループにプロブラムされた単一のグリコシル化を有する、ＨＥＫ２９３細胞中で発現されたプラスミドｐＣＲＯ２８のタンパク質産物を表す。
【図5c】図５ｃは、融合ループ抗体による糖操作タンパク質の認識の回避および中和エピトープの保持である。本開示の高グリコシル化抗原をさらにキャラクタライズする（この抗原を野生型の等価の抗原と比較する）ために、ＥＬＩＳＡアッセイを確立して多様な野生型外部ドメインおよび組換え外部ドメイン（図４のＶＬＰ抗原と異なる）に結合する抗体を測定した。図４で使用したＥＬＩＳＡ（抗原として野生型ＶＬＰのみを使用した）と異なり、このアッセイは、外部ドメイン型抗原（本発明の組換え野生型および組換え高グリコシル化形態「ＨＸ」）のみを使用した。これらの物質的に多様な（非グリコシル化細菌、昆虫－グリコシル化、およびヒト－グリコシル化）種のそれぞれの同一配向性を確保するために、これらの種をウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体（これらの種のＣ末端Ｈｉｓタグを認識する）で固相に固定する。コーティングしたプレートをブロックし、「コーティング後」ステップで様々なＨｉｓ－タグ付きタンパク質の一定濃度に暴露し、次いでまたは一定濃度においてモノクローナル抗体でプローブした。様々なデング抗原およびジカ抗原ならびにプローブ抗体を、ヒトポリクローナル抗ジカ回復期血清サンプルを含めて試験した。プローブ抗体に続いて、ウサギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（またはウサギ－抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート（必要に応じて）およびテトラメチルベンジジン基質と共にインキュベートした。マウスモノクローナル抗ヒト－ＣＤ４抗体は、マウスモノクローナル抗体のコントロールとして機能した。最大吸光度（３．０吸光度単位であった）の％値としてＥｘｃｅｌデータバーとして表された吸光度値を示し、反復（２回の反復）の品質を示す。図５ｂのデータのグラフ表示であり、図５ｂと同一のレイアウトを有する。
【図5d】図５ｄは、融合ループ抗体による糖操作タンパク質の認識の回避および中和エピトープの保持である。本開示の高グリコシル化抗原をさらにキャラクタライズする（この抗原を野生型の等価の抗原と比較する）ために、ＥＬＩＳＡアッセイを確立して多様な野生型外部ドメインおよび組換え外部ドメイン（図４のＶＬＰ抗原と異なる）に結合する抗体を測定した。図４で使用したＥＬＩＳＡ（抗原として野生型ＶＬＰのみを使用した）と異なり、このアッセイは、外部ドメイン型抗原（本発明の組換え野生型および組換え高グリコシル化形態「ＨＸ」）のみを使用した。これらの物質的に多様な（非グリコシル化細菌、昆虫－グリコシル化、およびヒト－グリコシル化）種のそれぞれの同一配向性を確保するために、これらの種をウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体（これらの種のＣ末端Ｈｉｓタグを認識する）で固相に固定する。コーティングしたプレートをブロックし、「コーティング後」ステップで様々なＨｉｓ－タグ付きタンパク質の一定濃度に暴露し、次いでまたは一定濃度においてモノクローナル抗体でプローブした。様々なデング抗原およびジカ抗原ならびにプローブ抗体を、ヒトポリクローナル抗ジカ回復期血清サンプルを含めて試験した。プローブ抗体に続いて、ウサギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（またはウサギ－抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート（必要に応じて）およびテトラメチルベンジジン基質と共にインキュベートした。マウスモノクローナル抗ヒト－ＣＤ４抗体は、マウスモノクローナル抗体のコントロールとして機能した。図５ｂに示すＥＬＩＳＡプレートをより詳細に示す。
【図6】図６は、糖操作タンパク質による融合－ループ抗体の産生の回避である。図４および図５で使用されるものと異なるさらなるＥＬＩＳＡアッセイを開発して、融合ループに対する、免疫付与マウスからのポリクローナル血清中の抗体を検出した。このアッセイは、ビオチン標識付与４Ｇ２を標識として使用し、かつ未標識４Ｇ２を標準として使用する競合結合アッセイであった。上列の左側、非コンジュゲート４Ｇ２、ｘ軸 ４Ｇ２の濃度ｎｇ／ｍＬ；上列の中央、ペンタＤＮＡ、群１、４２日目、ｘ軸 血清の希釈；上列の右側 ペンタＰｒｏｔ 群２、４２日目、ｘ軸 血清の希釈；下列の左側 モノジカ、群３ ４２日目、Ｘ軸 血清の希釈；下列の中央 ペンタＶＬＰ、群４ ４２日目、ｘ軸 血清の希釈；下列の右側 ＰＢＳ、群５ ４２日目、ｘ軸 血清の希釈。何れの場合でも、ｙ軸は、ビオチン化（Ｂｔ）－４Ｇ２結合％であった。
【図7a】図７ａは、糖操作タンパク質（ＰＲＮＴ）による中和抗体の産生である。プールした血清で測定した試料群１～５についてのデングＰＲＮＴ反応を示す：ＤＥＮＶに対する用量反応曲線、上列の左側 ペンタＤＮＡ（群１プールによるＤＥＮＶの中和）；上列の中央 ペンタＰｒｏｔ（群２プールによるＤＥＮＶの中和）；上列の右側 モノジカ（群３プールによるＤＥＮＶの中和）；下列の左側 ペンタＶＬＰ（群４プールによるＤＥＮＶの中和）；下列の中央 ＰＢＳ（群５プールによるＤＥＮＶの中和）。何れの場合でも、ｘ軸は、希釈係数であり、ｙ軸は、中和のパーセンテージを示す。
【図7b】図７ｂは、糖操作タンパク質（ＰＲＮＴ）による中和抗体の産生を示すグラフである。プールした血清で測定した試料群１～５についてのＰＲＮＴ反応を示す：ＺＩＫＶに対する用量反応曲線、上列の左側 ペンタＤＮＡ（群１プールによるＺＩＫＶの中和）；上列の中央 ペンタＰｒｏｔ（群２プールによるＺＩＫＶの中和）；上列の右側 モノジカ（群３プールによるＺＩＫＶの中和）；下列の左側 ペンタＶＬＰ（群４プールによるＺＩＫＶの中和）；下列の中央 ＰＢＳ（群５プールによるＺＩＫＶの中和）。何れの場合でも、ｘ軸は、希釈係数であり、ｙ軸は、中和のパーセンテージを示す。
【図8】図８は、回復期のデングおよびジカ血清と、固定されたジカ外部ドメインタンパク質およびデング野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との反応である。上方のパネルは、血清インキュベーション中に１０ｕｇ／ｍｌの濃度での、競合するマウスモノクローナルフラビウイルス融合ループ抗体４Ｇ２（抗デング血清型－２交差反応性モノクローナル抗体）の存在下（灰色のバー、各対の右側）および非存在下（黒色のバー、各対の左側）での、ウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体による補足によって固相上で配向された、固定されたジカ外部ドメインタンパク質およびデング野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との、デング熱回復期血清中の抗体のＥＬＩＳＡ反応性を示す。ヒト血清を１／１０００の一定濃度で試験した。下方のパネルは、競合するマウスモノクローナルフラビウイルス融合ループ抗体４Ｇ２の存在下（灰色のバー）および非存在下（黒色のバー）での、固定されたジカ外部ドメインタンパク質およびデング野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との、ジカ回復期血清中の抗体のＥＬＩＳＡ反応性を示す。条件および標識付けは、上方のパネルの場合と同一である。エラーバーは、２回の反復の測定の標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【0060】
本発明の異なる態様の様々な実施形態を参照して本発明を説明する。明確にするために、別個の実施形態に関連して説明されている本発明の特定の特徴は、１つもしくは複数の実施形態または単一の実施形態で組み合わされて提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関連して説明されている本発明の様々な特徴は、別々にまたは任意の適切な部分的組み合わせで提供され得る。本実施形態の全ての組み合わせは、本発明に具体的に包含され、各組み合わせおよび全ての組み合わせが個々にかつ明示的に開示されたかのように本明細書で開示される。加えて、全ての部分的組み合わせも本発明に具体的に包含され、そのような各部分的組み合わせおよび全ての部分的組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書で開示されたかのように本明細書で開示される。
【0061】
本発明は、改変フラビウイルス核酸配列および改変フラビウイルスタンパク質配列において、フラビウイルス交差反応性の感染増強抗体の産生に関連していることが知られている天然の（天然型の、野生型の）Ｅタンパク質融合ループエピトープが、この天然融合ループエピトープ上に通常存在しないＮ連結グリカンによるこのタンパク質のグリコシル化用の１つまたは複数の（例えば、２つの）グリコシル化部位を含むように改変されている、改変フラビウイルス核酸配列および改変フラビウイルスタンパク質配列を提供する。そのような改変により融合ループのアミノ酸配列が変化し、グリカンの存在によりエピトープがさらに隠れる。そのため、本発明の改変フラビウイルス核酸配列および改変フラビウイルスタンパク質配列は、フラビウイルス交差反応性の感染増強抗体が同時に産生されることなく防御的反応を生じさせるように設計されており、それにより、既存のワクチンアプローチで観察される抗体依存性の増強の問題を回避することを意図している。本発明の改変フラビウイルス核酸配列および改変フラビウイルスタンパク質配列は、特定のフラビウイルスの検出のための抗原としての診断用途または特定のフラビウイルスの検出のための抗体等の結合分子を産生するための診断用途の何れかのためにも設計されている。
【0062】
抗体は、実質的にインタクトな抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体（少なくとも１つのアミノ酸が非ヒト抗体（例えば、天然に存在する非ヒト抗体、または非ヒト抗体配列から構築された抗体）と比較して変異されている）、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモ二量体またはヘテロ二量体、ならびにこられの抗原結合部分および誘導体の意味を含む。この化合物がタンパク質である場合、例えば抗体またはこの断片をヒト対象に投与し、この抗体がヒト抗体またはこの断片ではない場合、この抗体をヒト化させてヒト中での免疫原性を低減させ得る。ヒト化抗体またはこの断片を作製する方法は、当技術分野で既知である。
【0063】
本発明の結合分子は、好ましくは、抗体またはこの抗原結合部分である。この抗原結合部分は、Ｆｖ断片；Ｆａｂ様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片もしくはｓｃＦｖ断片）；またはドメイン抗体であり得る。この抗体の結合部分は、インタクトな抗体中に存在する線形アミノ酸配列に由来し得るが、または任意選択で他のアミノ酸が散在している非連続アミノ酸のセットを含み得るが（例えば、エピトープとの接触に必要とされる特定のアミノ酸を含み得るが）、例えば、天然抗体のフレームワークに必要なアミノ酸を含み得ず、このアミノ酸は、場合により例えば異種足場タンパク質に置き換えられ得る。当業者に公知であるように、本発明に係る抗体を、哺乳類（例えば、ヒト、サル、ウサギもしくはマウス）に免疫付与するステップを含む方法によりおよび／またはインビトロでの方法（例えば、ファージディスプレイ選択ステップを含む方法）により得ることができる。
【0064】
用語抗体は、全てのクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｄＤおよびＩｇＥ）も含む。用語抗体は、任意の定義された抗体およびこの抗原結合部分のバリアント、融合体および誘導体も含む。
【0065】
中和するは、ウイルスの、これまで感染していない細胞を感染させる能力を低減することを意味する。当業者は、ウイルス中和能力をモニタリングするための適切な技術を十分に認識しているであろう。
【0066】
本明細書で説明されている配列変化を導入するための核酸配列の操作方法は、当技術分野で公知である。
【0067】
野生型配列（第１～９列）中の融合ループＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫ（残基９８～１１０と定義される、配列番号１）を太字で示す。第１０～２０列において、改変類似体ＨＸ配列中にＮ連結グリコシル化シークオンを作るために変更した残基を太字で示す。構築物ｐＣＲＯ２１～２４、２６および２８は、十分に発現し、さらなる研究のためにこれらを選択した。デングＥタンパク質の場合、２つのグリコシル化部位を作るために４個の残基を変更した（ｐＣＲＯ２１～２４）。ジカＥタンパク質の場合、１つのグリコシル化部位を作るために３個の残基を変更した（ｐＣＲＯ２８）。
【0068】
構築物ｐＣＲＯ２５、２９、３０および３１は、選択した発現系では十分に発現せず、そのため、いくつかの状況では、本発明の組換え類似体配列は、下記の配列を含まない：
ｐＣＲＯ２５ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＮＧＳＧＣＧＬＮＧＳＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号７）
ｐＣＲＯ２９ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＮＨＴＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号８）
ｐＣＲＯ３０ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＮＧＳＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号９）
ｐＣＲＯ３１ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＮＧＳＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号１０）。
ｐＣＲＯ２５ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＮＧＳＧＣＧＬＮＧＳＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号７）
ｐＣＲＯ２９ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＮＨＴＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号８）
ｐＣＲＯ３０ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＮＧＳＧＣＧＬＦＧＫＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号９）
ｐＣＲＯ３１ ＣＫＲＴＬＶＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＮＧＳＧＳＬＶＴＣＡＫＦＡ（配列番号１０）。
【0069】
本発明の類似体では、Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、このシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基が９８～１０１位および／または１０６～１１０位の何れかを占めるように存在し得る。即ち、このＮ残基は、９８，９９、１００および１０１から選択される位置ならびに／または１０６、１０７、１０８、１０９および１１０から選択される位置を占め得る。
【0070】
好ましくは、本発明の類似体では、Ｘは、下記の１３種のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＴｈｒまたはＳｅｒの何れかであり、ＧｌｙまたはＨｉｓが特に好ましい。デングウイルスに関して本明細書で説明されている本発明の具体的な実施形態では、Ｘは、Ｇｌｙであることが好ましく、ジカの場合、Ｘは、Ｈｉｓであることが好ましい。
【0071】
本発明の好ましい類似体では、このフラビウイルスＥタンパク質は、デングウイルスＥタンパク質であり、およびシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列の１０１位、１０８位もしくは１０１位および１０８位の両方を占めるか、またはこのフラビウイルスＥタンパク質は、ジカＥタンパク質であり、およびシークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列の１００位を占める。
【0072】
本発明の好ましい類似体では、このフラビウイルスは、デングウイルスであり、およびこの類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ酸配列９８～１１０は、
から選択される。
【0073】
本発明の別の好ましい類似体では、このフラビウイルスは、ジカウイルスであり、およびこの類似体フラビウイルスＥタンパク質融合ループのアミノ鎖配列９８～１１０は、
である。
【0074】
組換え類似体Ｅタンパク質融合ループタンパク質をコードする核酸配列またはそのような融合ループタンパク質を含む組換え類似体Ｅタンパク質をコードする核酸配列は、通常、制御配列および分泌シグナル配列を含む発現ベクターへのこのＤＮＡ配列の機能的なかつ作動可能な挿入後に発現され得る。
【0075】
本発明の核酸配列の発現に適したプロモーターは、ＣＭＶである。
【0076】
本発明に従って利用され得る宿主細胞として、ＨＥＫ細胞株およびＣＨＯ細胞株が挙げられる。この宿主を、ヒト様Ｎ連結グリカンを有する治療用糖タンパク質を産生するように遺伝子操作し得る。
【0077】
本発明の免疫原性組成物をアジュバントと共にまたはアジュバントなしで投与し得る。アジュバントをこの免疫原性組成物に直接添加し得るか、またはワクチンの投与と同時もしくはこの投与の直後の何れかで別々に投与し得る。そのようなアジュバントとして、アルミニウム塩（水酸化アルミニウム）、特定の刺激剤（例えば、ムラミルペプチド、サポニンアジュバント、サイトカイン、細菌毒素（例えば、コレラ毒素、百日咳毒素または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素）の解毒変異体）を含むかまたは含まない水中油型乳濁液製剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
本発明の免疫原性組成物を他の免疫原または免疫調節剤（例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカインおよびケモカイン）と共に投与し得る。
【0079】
本明細書で説明されている具体的な実施形態では、使用されるアジュバントは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）であり、このＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）は、ヒトでの使用および獣医学的使用に許容されているアジュバントである。しかしながら、他の適切なアジュバントならびにアジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ）戦略および製剤化戦略が抗原の核酸形態およびタンパク質形態の何れか（または両方）に利用可能であることが当業者に明らかなはずである。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌは、最大限有効であるためにタンパク質が中性または中性付近のｐＨ値（例えば、ｐＨ７．４）で負に帯電していることを必要とする。これは、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌがそのようなｐＨ条件下で正味の正電荷を有するからである。逆に、リン酸アルミニウムは、正味の負電荷を有し、ワクチン製剤に使用されるｐＨの生理学的条件下で正に帯電するタンパク質に概して良好である。タンパク質が中性付近の等電点を有する場合、このタンパク質は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはリン酸アルミニウムアジュバントに十分に結合し得ず、このアジュバントの効果が制限され、他のアジュバント化戦略から利益を得るであろう。
【0080】
例えば、水中油型乳濁液またはリポソーム懸濁液をベースとするワクチンアジュバントは、近年、認可されたワクチン製品および臨床試験で相当に進歩している（Ａｌｖｉｎｇ，Ｂｅｃｋ，Ｍａｔｙａｓ，＆Ｒａｏ，２０１６）。これらのアジュバント材料は、他のアジュバント材料（例えば、ＱＳ２１サポニンおよびＣｐＧアジュバント）と共にまたはこれらのアジュバント材料なしでモノホスホリル脂質－Ａの天然バージョンまたは合成バージョンの何れかを利用する。そのような戦略は、帯状疱疹に対する非常に効果的なワクチンおよび早期に認可されることが期待される有望なマラリアワクチン候補（研究から３０年後）の開発を可能としている。
【0081】
他の有望な送達戦略およびアジュバント化戦略（例えば、ビロソーム）が開発されており、このビロソームは、本開示のグリコシル化外部ドメインタンパク質との使用に適し得る。同様に、開発の初期段階である有望なアジュバント材料およびアジュバント戦略（例えば、独立型のワクチン成分、コンジュゲートワクチン成分またはリポソームワクチン成分としてのＣＤ４０アゴニスト抗体）も存在する（Ｈａｔｚｉｆｏｔｉ Ｃ，Ｂａｃｏｎ Ａ，Ｍａｒｒｉｏｔｔ Ｈ，Ｌａｉｎｇ Ｐ，Ｈｅａｔｈ ＡＷ（２００８）Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｃｏ－Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ４０ｍＡｂ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＩｇＧ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ ３（６）：ｅ２３６８）。本発明の組成物を例えばリポソーム製剤によるタンパク質ワクチンおよびＤＮＡワクチンの投与のための共送達戦略で使用し得る（Ｌａｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【0082】
本発明の実施では、別途示さない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術が利用される。そのような技術は、文献で詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ Ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｈｅｙ，Ｅｄ．，１９８７）、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，ｅｄｓ．，１９８７）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）を参照されたい。本明細書の上記および下記で言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0083】
アミノ酸残基に関して、標準的な３文字用語および１文字用語を使用する。
【0084】
本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、類似体または結合分子（例えば、本発明の抗体または抗体断片）を産生するための遺伝子操作方法（クローニング、増幅）の使用を意味する。
【0085】
デングワクチン開発の主な問題（ワクチンの使用により、デング感染の「抗体依存性増強」が引き起こされるという（有限の数の場合での）リスクがある）により、病気が予防されるよりもむしろ病気が悪化する。本出願は、非常に広範にはフラビウイルスワクチンに関し、なぜなら、このフラビウイルスワクチンは、このファミリのウイルスのエンベロープタンパク質「Ｅ」の高度に保存された配列に適用されるからである。増強は、自然感染の特徴（このウイルスを中和するために送られた抗体が破壊されてヒト骨髄細胞へのアクセスを獲得する）であり、通常、ウイルスの別の「血清型」との遭遇時により重度の症状を引き起こす（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｒｏｊａｎａｓｕｐｈｏｔ，＆Ｓａｎｇｋａｗｉｂｈａ，１９８３）。ワクチン接種は、大部分が防御を付与するが、野生デングウイルスへの最初の暴露時にレシピエントが重度のデング熱（例えば、デング出血熱（ＤＨＦ））に罹りやすい場合もある（即ち、このワクチンの場合でなければ発生していないはずの重度のデング熱またはＤＨＦの「医原性」症例）。さらに、既存のワクチンアプローチは、このワクチン（またはワクチンコース）を投与した後にある間隔を置いて（例えば、１０年）、重度の医原性デング熱を発症するワクチン接種個体の集団ができる可能性も有する。これは、デングに対する免疫が衰えるにつれて、防御抗体が感染を予防するよりもむしろ「増強する」濃度に達するからである。同様に、「免疫学的記憶」（免疫系が野生ウイルスまたはワクチン用量との遭遇を思い出す）の減衰速度は、ワクチンの４種の血清型に関して同期しておらず、その結果、デングの（抗体および記録のレベルでの）各血清型に対する免疫性が異なる時点で失われ、重度の疾患のリスクが連続的に増加する。同様に、この免疫記憶の漸進的な欠如により、以前のワクチン接種の結果として、防御されているのではなく（感染した蚊に刺された場合に）重度のデング熱に現在罹りやすくなる個体の新たな集団ができる。解決策は、現在存在する様々なワクチンフォーマット（生ベクター、ＤＮＡワクチン、経口ワクチン、サブユニットワクチン、ウイルス様粒子等）のいくつかへの組込みを受けやすい方法で、効力を保持しつつ「抗体依存性増強」を生じる傾向がゼロまたは最小のワクチンを作製することである。本出願の発明は、感染を促進する抗体を産生しない新規の免疫原を作製することにより、デングワクチンおよび／またはジカワクチンによる疾患のワクチン誘発性増強の症例を回避する。これは、感染増強抗体の産生に特に関連するデングウイルスおよびジカウイルスの組換え発現Ｅタンパク質の特定の部位への１つまたは複数の追加のグリコシル化部位（例えば、Ｎ連結グリコシル化部位）の導入により達成され、それにより、そのような部位が覆い隠され、ワクチン接種後の抗体の産生が防止される。
【0086】
デングに対する現在のワクチン（認可済および開発中）は、公衆衛生に実質的に「正味」の利益を一方でもたらし得るが、ワクチン誘発性のデング熱（即ち医原的に引き起こされる重度のデング熱）の症例を回避するために安全性の改善が依然として望ましい。ジカ感染のパンデミックへの道を開く上での自然界でのデング感染の可能性のある役割が、Ｓａｂｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｈｉｌｉｐ Ｋ Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１６）により近年詳述されている。ジカウイルス感染に罹りやすくするデングワクチン接種のリスクまたは重症度が高いジカ感染を引き起こすデングワクチン接種のリスクを決定することになる体系的調査は行われていないが、そのような症例を予想することは、Ｒｕｓｓｅｌｌの観察の論理的延長である。同様に、重度のデング熱に対するデングワクチン誘発性の傾向は、依然として報告されていないかまたはそれ自体調査されていないが、Ｓａｎｏｆｉ－Ｐａｓｔｅｕｒワクチンの最近３年間のフォローアップ研究では、重度のデング熱に対する感受性のワクチン誘発性増強により説明され得る９歳未満の子供での入院率の増加が見られた（Ｈａｄｉｎｅｇｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。これらの新たな疫学的進展および実験室データ（下記）は、（増強を避けるように設計さいれていない限り）ワクチンが場合により疾患の増強を引き起こすであろう有意なリスクが存在する（即ち、デングワクチン接種は、このデングワクチン接種がなければ起こらなかったはずの重度のデング熱の症例をもたらす）ことを示す。全人口ベースで使用される場合、デングワクチンがジカウイルス感染の蔓延を促進する可能性もある。この懸念の妥当性は、デングウイルス抗体がジカウイルスによるヒト骨髄細胞の感染を増強することを実証するインビトロでの実験データによりさらに支持される（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに、独立型のジカワクチンは、デングウイルスと交差反応する抗ジカ抗体が産生されることにより重度の医原性デング熱の症例を生じるデング感染を（逆に）増強することになり、かつデング感染を促進する同様の抗体を生じる可能性があることになる。本出願の目的のために、任意の特定の仮説に拘束されることを望まないが、ジカウイルスに「第５のデング血清型」の地位を付与する。これは、デング感染（およびデングワクチン）が、ジカウイルスとも反応して体細胞のジカウイルス感染を促進する感染増強抗体の産生によりジカの蔓延を促進する可能性を有するからである。新規の免疫原に加えて、本開示は、これらのワクチンを、デングの４種の血清型およびジカウイルスを表す五価のワクチンの形態でワクチン接種の単回用量または経過において組み合わせることにより、ワクチンが（感染した蚊に刺された場合に）デング感染またはジカ感染を増強するあらゆる傾向を最小限に抑えるさらなる安全性の特徴を有する。
【0087】
本発明は、フラビウイルス感染を予防するためのワクチンに関し、特にデング感染およびジカ感染を予防するためのワクチンに関する。パンデミック事象としてのジカの出現から、ジカの迅速で世界規模の蔓延は、デング感染により明らかに促進されており（Ｒｕｓｓｅｌｌ，２０１６）、ワクチン接種の問題（即ち、場合により疾患を悪化させないワクチンをどのように作製するか）がより複雑になってきている。相同的な増強（この増強により、デングワクチンが場合によりデング感染を促進することになる）および交差増強（この増強により、デングワクチンが場合によりジカ感染を促進することになる）を回避するために新規のワクチン設計が必要とされており、さらに、交差増強により、ジカワクチンが場合によりデング感染を促進することになる。単一ワクチン（Ｓａｎｏｆｉ－Ｐａｓｔｅｕｒ）中でデングの４種の全ての血清型を組み合わせるような戦略を伴う、抗体増強問題に対する従来のアプローチ、または例えばデングのＥタンパク質のＮ末端領域を使用するサブユニットアプローチ（Ｍｅｒｃｋ）は、抗体増強問題を認識しているが、ジカのパンデミック状況に適した包括的な解決策を提供していない。最も進歩したデングワクチン（認可されたＳａｎｏｆｉ－Ｐａｓｔｅｕｒ生弱毒化四価デングワクチン）は、ジカに対処することができず、上記の疫学的なおよびインビトロでの観察から、（集団免疫によってコミュニティ全体で純便益を有していても）交差増強によりジカウイルス感染の症例を促進し得る場合がある。
【0088】
エピトープを増強することと、フラビウイルスの防御エピトープを増強することとの間の区別は、特徴において「二元」でないことを認識することが重要である。一般的に言うと、ほとんど全ての抗デングＥ抗体は、（例えば）中和および感染増強の両方の可能性を有し、後者の特性は、例えば、ワクチンに対する免疫力または暴露の低下に伴って低い抗体濃度で出現する（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。さらに、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉらは、デングＥタンパク質の融合ループに対する抗体（回復期に産生された全ての抗体の約半分を構成する）は、感染の抗体依存性増強の傾向に関して、Ｅタンパク質上の他の部位に対する抗体と比べて著しく悪いことも見出した。
【0089】
本開示は、感染増強抗体を誘発または刺激する能力が低下している免疫原を提供することにより、抗体依存性増強および交差増強の問題に対処するワクチンを提供する。感染増強抗体が産生されないことを確実にするために、本開示は、組換えにより発現されるＥタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列への追加の新規のグリコシル化部位の操作により融合ループに植え付けられた追加のグリカンを有するＥタンパク質を使用する。グリカンの「覆い隠す」効果により、中和抗体を産生するためにより良好に位置する他の部位が保存されつつ、融合ループ部位に対して抗体が産生されることが防止される。このようにして、（例えば、宿主糖タンパク質のものと実質的に同一なグリカン構造を有するタンパク質表面の大部分が覆われるＨＩＶの場合には）中和抗体の産生を妨げると通常考えられているグリカンを有利な効果で使用し、即ち、本開示では、マスクされなければ問題のある抗体反応（この場合には感染増強抗体）を生じることになるワクチン免疫原上の部位をマスクするために使用する。
【0090】
デングの場合、４種のワクチン抗原が必要とされ、即ち、抗体依存性増強に関与するエピトープをマスクするために糖操作により適切に改変された４種の血清型のＥタンパク質が必要とされる。しかしながら、感染またはワクチン接種の結果としてのデングウイルス感染およびジカウイルス感染の相互の交差増強のリスクのために、ジカ成分も望ましいことが明らかであり、即ち、デングの４種の血清型「および」ジカをカバーする「五価」ワクチンが望ましいことが明らかである。
【0091】
幸いなことに、本ワクチンの設計の観点からすると、ジカウイルスのＥタンパク質は、そのアミノ酸配列および三次元構造に関してデングウイルスのＥタンパク質のものと高度に相同である。ジカビリオンＥタンパク質の近年の低温ＥＭ３．８オングストローム構造は、ジカＥタンパク質融合ループ位置を（類似性により）明確に同定する（Ｋｏｓｔｙｕｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｉｒｏｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。実際には、Ｓｉｒｏｈｉらは、融合ループ配列「ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫ」（残基９８～１１０）に関する多様なフラビウイルス間の顕著な相同性の程度を分類しており、この融合ループ配列は、ジカの多様なウイルス単離株、４種のデング血清型、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルスおよび黄熱病ウイルス間で完全に保存されている（Ｓｉｒｏｈｉの補足図Ｓ２を参照されたい）。
【0092】
デングＥタンパク質とジカＥタンパク質との間に顕著な相違（例えば、ジカＥタンパク質中での５個のアミノ酸挿入物、およびジカは、１つの単量体当たり２つではなくむしろ単一のＮ連結グリカンを有するという事実）が存在するが、これらの相違は、本ワクチン設計を強度に許容する。本開示では、ジカウイルスのＥタンパク質融合ループは、感染の同種および異種の増強が可能な感染増強抗体により特に認識される部位（即ち、部位において、感染またはワクチン接種中にこの部位に対する抗体産生が望ましくない部位）であろうことが予想される。
【0093】
部位特異的変異誘発によるタンパク質中への追加のグリコシル化部位の導入の方法は、当技術分野で公知である。特に、天然ホルモンエリスロポエチンの改変形態であるＡｒａｎｅｓｐ（ダルベポエチンアルファ）の作製は、良い例である（Ｅｌｌｉｏｔｔ（「欧州特許出願公開第０６４０６１９Ａ１号明細書」、２０１０）、（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。新生ポリペプチド鎖を宿主細胞の小胞体に導き、グリコシル化を可能にし、タンパク質の折り畳みを容易にするために、タンパク質のリーダー配列が組換えプラスミドまたは他のベクターＤＮＡ配列に確実に組み込まれるように適切な遺伝子構築物を作製することが重要である。様々な真核細胞系が組換え産生に適しており、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）および酵母（例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））および他のベクター系（例えば、バキュロウイルス（フラビウイルスの接種形態のようにウイルスタンパク質免疫原に昆虫グリカンを装備させるというさらなる利点を有する））が組換え産生に適している。しかしながら、原核生物系（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をベースとするもの）は適切ではなく、なぜなら、原核生物系は、タンパク質のグリコシル化を引き起こすのに必要な細胞装置を有していないからである。
【0094】
Ａｒａｎｅｓｐの場合、この分子は、糖操作された分子とエリスロポエチンレセプターとの相互作用の妨害を回避するように戦略的に配置された２つの追加のＮ連結グリコシル化部位を有する。このようにして初期のエリスロポエチンベースの生成物を糖操作する目的は、分子のサイズを増大させることにより循環中のこの分子の寿命を改善し、１週間に３回の代わりに１回で投与し得る生成物を生じさせることであった（Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００３）。糖操作は、この糖操作がなければ感染の抗体依存性増強という有害な結果を有することになるワクチン免疫原上の部位を覆い隠すために本開示で「再度提案される」。
【0095】
ウイルスは、中和抗体の産生を妨げるグリカンの免疫回避特性を利用することが実証されている。（例えば、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１６０／１２０に対する）ワクチン開発の分野では、グリカンは、概して（ワクチン開発への援助ではなくむしろ）問題と見なされており（宿主グリカンで構成される高密度の多糖外被を形成することにより糖タンパク質抗原のタンパク質表面への抗体のアクセスを制限する）、宿主の免疫系は、この問題に対して免疫学的に寛容であるようにプログラムされている。このルールの一般性を証明する下記の注目すべき例外が存在する：例えば、グリカン自体またはマイナーなバリアントが標的またはその一部である場合（これは、希な抗ＨＩＶ中和抗体の場合である）；およびアルボウイルス上の昆虫特異的グリカンエピトープの場合、グリカン自体が一部のワクチン設計の標的である（Ｄａｌｚｉｅｌ，Ｃｒｉｓｐｉｎ，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｚｉｔｚｍａｎｎ，＆Ｄｗｅｋ，２０１４）。本開示は、ワクチン免疫原における有利な効果のためのグリカンのステルス特性の利用において先行技術と異なる。新規な本出願では、グリカンを使用してワクチン免疫原上の厄介な部位を覆い隠し、天然ビリオン上の等価の覆い隠されていない部位を認識するはずである抗体が産生されることを防止する。糖操作（アミノ酸配列エレメントの欠失またはトランケーションと異なる）により、この覆い隠すことは、抗原のタンパク質部分の下部構造との干渉を最小限に抑えつつ達成され得る。欠失またはトランケーションではなくむしろ糖操作を用いることによるタンパク質構造の保存は、この保存がなければ有害な効果に変わる可能性がある遠隔の中和エピトープを保護する。
【0096】
本開示の糖操作フラビウイルスＥタンパク質は、ワクチン接種の目的のために様々な形態に組み込まれ易い。これらの形態は、特徴がタンパク質（即ち糖タンパク質）または核酸であり得る。これらの形態は、精製済タンパク質の混合物として（例えば、アジュバントとしての水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを含むサブユニットワクチンとして）、ウイルス様粒子として（Ｆｒｉｅｔｚｅ，Ｐｅａｂｏｄｙ，＆Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，２０１６）、またはサブユニットを使用するＤＮＡワクチンとしての投与（Ｔｒｅｇｏｎｉｎｇ＆Ｋｉｎｎｅａｒ，２０１４）もしくは黄熱病ウイルスのＹＦＤ株に関して例示されるような感染性弱毒化クローンアプローチ（Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）のために哺乳類が発現可能なＤＮＡ構築物（例えば、サイトメガロウイルスプロモーターを有するプラスミドＤＮＡ）としてワクチン製剤で表され得る。これらの形態はまた、Ｔｈｅｍｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ（Ｒａｍｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）によるＣｈｉｋｕｎｇｕｎｙａワクチン候補のように、麻疹ベクターワクチン等の生弱毒化ウイルスベクターに組み込まれ易い。同様に、本開示の糖操作フラビウイルスＥタンパク質は、同一の免疫原の哺乳類が発現可能なＤＮＡおよびタンパク質の表現が、単離で使用されるタンパク質またはＤＮＡ免疫原と比較して抗体反応の劇的な改善をもたらす同一粒子（例えば、リポソーム）中で共製剤化される「共送達」等の先進的なアジュバント戦略の適切な候補のはずである（Ｌａｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【0097】
本糖操作アプローチは、Ｅタンパク質の核酸配列中の複数の塩基位置で規定の変化を含むことから、本開示の生弱毒化ワクチンは野生型への変異による復帰（これは、生弱毒化アプローチでの既知の問題（例えば、この理由のために米国で非生存Ｓａｌｋバージョンに置き換えられたＳａｂｉｎポリオワクチン）である）に対する高レベルの耐性を有し、即ち、本開示の生弱毒化ワクチンは、より安全であり、野生型への復帰または増加した病原性へのデノボ変異により疾患の症例が生じる可能性がより低い（Ｈａｎｌｅｙ，２０１１）。Ｈａｎｌｅｙの推論から、および本開示を前提として、ウイルスタンパク質へのさらなるグリコシル化部位の導入（即ち感染増強エピトープを覆い隠すことを達成するのに必要とされるよりも多くの導入）は、生弱毒化ウイルスワクチン中での有害な変異を防ぐための、および蚊のベクター伝播により可能な病原性の増加への進化を可能にする「蚊の能力」（それにより生弱毒化フラビウイルスワクチンが蔓延する可能性がある）を防ぐための実行可能な戦略であることが現在では明白である。そのような追加のグリコシル化部位は、フラビウイルスＥタンパク質の非中和部位に位置するのが最良である。
【0098】
本開示のフラビウイルスサブユニットワクチン（生ベクターアプローチと異なる）の場合、別の追加のグリカンに好ましい部位は、ビリオンの下部Ｍタンパク質とのＥの接触面を構成する配列エレメントを含むはずである。これらの高度に可溶性の高グリコシル化Ｅタンパク質は、抗原特異的Ｂ細胞の一価の結合を可能にし、抗原特異的Ｂ細胞のクローン選択および体細胞変異中に抗原に関するより大きい競合を引き起こすことにより、より高い親和性の中和抗体を好む。
【0099】
本発明を下記の条項によりさらに説明する：
１．天然配列中に存在しないグリコシル化のため用の部位を含むアミノ酸配列を含む、フラビウイルスＥタンパク質の類似体
２．グリコシル化部位は、Ｎ連結グリカンのためのものである、第１項に記載の類似体
３．グリコシル化部位は、Ｏ連結グリカンのためのものである、第１項に記載の類似体
４．その類似体に付着された少なくとも１つの追加のグリカンを有する、第１項に記載の類似体
５．グリカンは、Ｎ連結グリカンである、第４項に記載の類似体
６．グリカンは、Ｏ連結グリカンである、第４項に記載の類似体
７．組換えＤＮＡ配列の発現産物である、第１～６項の何れか１項に記載の類似体
８．Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、置換されており、それにより、シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、フラビウイルスＥタンパク質のアミノ酸配列の下記の残基ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫの何れかである９８～１１０位の何れかを占め、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、およびＳｅｒ／Ｔｈｒは、セリン残基またはトレオニン残基を示す、第２項に記載の類似体
９．Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、置換されており、それにより、シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、９８～１０１位または１０６～１１０位の何れかを占める、第２項に記載の類似体
１０．Ｘは、下記の１３種のアミノ酸残基Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＨｉｓまたはＳｅｒの何れかである、第８項に記載の類似体
１１．置換シークオンは、ＮＴＴであり、Ｔ（Ｔｈｒ）は、シークオンの「Ｘ」位で明示的に置換されており、およびシークオンの任意選択のＳｅｒ／Ｔｈｒエレメントは、Ｔである、第８項に記載の類似体
１２．置換配列は、Ｎ連結グリコシル化シークオンの一部（Ｘ）として天然システイン残基（Ｃ）を利用するＤＲＧＷＧＮＮＣＴＬＦＧＫ（配列番号１１）を示す、第８項に記載の類似体
１３．置換配列は、Ｎ連結グリコシル化シークオンの一部として天然システイン残基（Ｃ）を利用し、かつ第１１項のトレオニンシークオン残基の代わりにセリン残基を有するＤＲＧＷＧＮＮＣＳＬＦＧＫ（配列番号１２）を示す、第８項に記載の類似体
１４．第１～１３項の何れか１項に記載のフラビウイルスＥタンパク質の類似体をコードする、ＤＮＡ配列
１５．哺乳類の発現可能なプロモーターを有する第１～１３項の何れか１項に記載のフラビウイルスＥタンパク質の類似体をコードする、プラスミドまたは線形ＤＮＡをベースとするワクチン免疫原
１６．真核宿主細胞であって、前記フラビウイルスＥタンパク質の類似体を発現することを可能にする方法で第１項に記載のＤＮＡ配列でトランスフェクトされている、真核宿主細胞
１７．第１～１６項の何れか１項に記載のフラビウイルスＥタンパク質類似体の治療上有効な量を薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と一緒に含むワクチン組成物
１８．４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４を表す４種のデングＥタンパク質の治療上有効な量を含む、第１７項に記載のワクチン組成物
１９．ジカウイルスＥタンパク質の治療上有効な量を含む、第１７項に記載のワクチン組成物
２０．ジカウイルスＥタンパク質の治療上有効な量をさらに含む、第１８項に記載のワクチン組成物。
１．天然配列中に存在しないグリコシル化のため用の部位を含むアミノ酸配列を含む、フラビウイルスＥタンパク質の類似体
２．グリコシル化部位は、Ｎ連結グリカンのためのものである、第１項に記載の類似体
３．グリコシル化部位は、Ｏ連結グリカンのためのものである、第１項に記載の類似体
４．その類似体に付着された少なくとも１つの追加のグリカンを有する、第１項に記載の類似体
５．グリカンは、Ｎ連結グリカンである、第４項に記載の類似体
６．グリカンは、Ｏ連結グリカンである、第４項に記載の類似体
７．組換えＤＮＡ配列の発現産物である、第１～６項の何れか１項に記載の類似体
８．Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、置換されており、それにより、シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、フラビウイルスＥタンパク質のアミノ酸配列の下記の残基ＤＲＧＷＧＮＧＣＧＬＦＧＫの何れかである９８～１１０位の何れかを占め、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、およびＳｅｒ／Ｔｈｒは、セリン残基またはトレオニン残基を示す、第２項に記載の類似体
９．Ｎ連結グリコシル化シークオン（Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、置換されており、それにより、シークオンのＡｓｎ（Ｎ）残基は、９８～１０１位または１０６～１１０位の何れかを占める、第２項に記載の類似体
１０．Ｘは、下記の１３種のアミノ酸残基Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＨｉｓまたはＳｅｒの何れかである、第８項に記載の類似体
１１．置換シークオンは、ＮＴＴであり、Ｔ（Ｔｈｒ）は、シークオンの「Ｘ」位で明示的に置換されており、およびシークオンの任意選択のＳｅｒ／Ｔｈｒエレメントは、Ｔである、第８項に記載の類似体
１２．置換配列は、Ｎ連結グリコシル化シークオンの一部（Ｘ）として天然システイン残基（Ｃ）を利用するＤＲＧＷＧＮＮＣＴＬＦＧＫ（配列番号１１）を示す、第８項に記載の類似体
１３．置換配列は、Ｎ連結グリコシル化シークオンの一部として天然システイン残基（Ｃ）を利用し、かつ第１１項のトレオニンシークオン残基の代わりにセリン残基を有するＤＲＧＷＧＮＮＣＳＬＦＧＫ（配列番号１２）を示す、第８項に記載の類似体
１４．第１～１３項の何れか１項に記載のフラビウイルスＥタンパク質の類似体をコードする、ＤＮＡ配列
１５．哺乳類の発現可能なプロモーターを有する第１～１３項の何れか１項に記載のフラビウイルスＥタンパク質の類似体をコードする、プラスミドまたは線形ＤＮＡをベースとするワクチン免疫原
１６．真核宿主細胞であって、前記フラビウイルスＥタンパク質の類似体を発現することを可能にする方法で第１項に記載のＤＮＡ配列でトランスフェクトされている、真核宿主細胞
１７．第１～１６項の何れか１項に記載のフラビウイルスＥタンパク質類似体の治療上有効な量を薬学的に許容される希釈剤、アジュバントまたは担体と一緒に含むワクチン組成物
１８．４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４を表す４種のデングＥタンパク質の治療上有効な量を含む、第１７項に記載のワクチン組成物
１９．ジカウイルスＥタンパク質の治療上有効な量を含む、第１７項に記載のワクチン組成物
２０．ジカウイルスＥタンパク質の治療上有効な量をさらに含む、第１８項に記載のワクチン組成物。
【実施例】
【0100】
実施例１ 感染増強抗体の誘発または刺激を回避するように設計されている新規のワクチン免疫原の設計
図１「Ａ」は、４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４を含む、当技術分野で既知の生弱毒化ワクチン等のフラビウイルスワクチンによるワクチン接種の効果を示す。このワクチンにより、ウイルス中和が可能な抗体と感染の抗体依存性増強が可能な他の抗体との混合物が産生される。ウイルス中和が可能な抗体として、ビリオンＥタンパク質のレセプター相互作用表面（即ちＤＣＳＩＧＮレクチン／レセプターに結合する表面）上の部位を認識するものが挙げられる。（説明を簡単にするためにＤＣＳＩＧＮレセプターのみを示しており、通常、デングおよびフラビウイルスの他のレセプターが存在することに留意されたい）。「Ｃ」は、このＥタンパク質の融合ループに対する感染増強抗体が、このビリオンのＥタンパク質に結合した場合、Ｆｃ－ガンマ－レセプター－ＩＩａにどのように高親和性で関与し得、骨髄細胞の感染を促進するかを示す。この現象では、いくつかのタイプのＦｃ－ガンマレセプター（通常、骨髄細胞およびＢ細胞に対して抑制性である低親和性レセプターＦｃ－ガンマ－レセプター－ＩＩｂさえも（逆説的に）含む）が関与している（Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ Ｓ，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．．．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７，３５：２８５－３１１）。生弱毒化ワクチン（当技術分野で既知のワクチンの一例）によるワクチン接種の結果は、抗体の２つの対立集団（デングビリオンを中和する１つのセットおよび感染増強が可能であるさらなるセット）の正味の効果である。ワクチン接種のほとんどの対象では、中和抗体は、感染増強抗体の影響を克服し、その結果、ワクチン接種の正味の効果は、４種のデング血清型に対する防御である。しかしながら、４種の血清型に対して釣り合いがとれた反応を開始しない対象または例えば麻疹もしくはＨＩＶ感染に起因して免疫抑制されている対象では、フラビウイルス感染増強抗体が優性であり、そのような対象を、デングによる重度の感染に対する防御よりもむしろデングによる重度の感染に罹りやすくし、かつ他のフラビウイルスにより感染しやすくする。さらに、一部の健康な（免疫抑制されていない）デングワクチン接種済対象での感染増強抗体は、ジカウイルスと交差反応する。これらのデング免疫付与済対象は、ジカ感染した蚊に最初に刺された際に現在はジカ感染に罹りやすい「Ｃ」。逆に、「Ｂ」は、本発明に従って設計されたワクチン免疫原を示す。Ｅタンパク質を含む新規の免疫原において、融合ループ配列が改変されておりかつ感染増強抗体を産生することなくこのワクチンのＥタンパク質に対して中和抗体を産生することを目的としてグリカンで置換されるように設計されている新規の免疫原。「Ｄ」は、本発明のワクチンの一部の対象（例えば、免疫抑制されいてる）中での防御レベルの抗体反応の誘発の時折の失敗を表すが、当技術分野で既知の他のワクチン設計と異なり、本発明のワクチンは、免疫抑制対象をデングウイルスまたはジカウイルスによる感染の増強に対して感受性にしないように設計されている。それにより、本設計の免疫原およびワクチンは、個々の対象基準でより安全であるように設計されており、さらに、中和抗体の非存在下でジカ感染増強抗体を有する対象の集団を作ることによりジカの流行的蔓延を促進する可能性を欠くように設計されている。（ＷＴ＝野生型）。
図１「Ａ」は、４種のデング血清型ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４を含む、当技術分野で既知の生弱毒化ワクチン等のフラビウイルスワクチンによるワクチン接種の効果を示す。このワクチンにより、ウイルス中和が可能な抗体と感染の抗体依存性増強が可能な他の抗体との混合物が産生される。ウイルス中和が可能な抗体として、ビリオンＥタンパク質のレセプター相互作用表面（即ちＤＣＳＩＧＮレクチン／レセプターに結合する表面）上の部位を認識するものが挙げられる。（説明を簡単にするためにＤＣＳＩＧＮレセプターのみを示しており、通常、デングおよびフラビウイルスの他のレセプターが存在することに留意されたい）。「Ｃ」は、このＥタンパク質の融合ループに対する感染増強抗体が、このビリオンのＥタンパク質に結合した場合、Ｆｃ－ガンマ－レセプター－ＩＩａにどのように高親和性で関与し得、骨髄細胞の感染を促進するかを示す。この現象では、いくつかのタイプのＦｃ－ガンマレセプター（通常、骨髄細胞およびＢ細胞に対して抑制性である低親和性レセプターＦｃ－ガンマ－レセプター－ＩＩｂさえも（逆説的に）含む）が関与している（Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ Ｓ，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．．．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７，３５：２８５－３１１）。生弱毒化ワクチン（当技術分野で既知のワクチンの一例）によるワクチン接種の結果は、抗体の２つの対立集団（デングビリオンを中和する１つのセットおよび感染増強が可能であるさらなるセット）の正味の効果である。ワクチン接種のほとんどの対象では、中和抗体は、感染増強抗体の影響を克服し、その結果、ワクチン接種の正味の効果は、４種のデング血清型に対する防御である。しかしながら、４種の血清型に対して釣り合いがとれた反応を開始しない対象または例えば麻疹もしくはＨＩＶ感染に起因して免疫抑制されている対象では、フラビウイルス感染増強抗体が優性であり、そのような対象を、デングによる重度の感染に対する防御よりもむしろデングによる重度の感染に罹りやすくし、かつ他のフラビウイルスにより感染しやすくする。さらに、一部の健康な（免疫抑制されていない）デングワクチン接種済対象での感染増強抗体は、ジカウイルスと交差反応する。これらのデング免疫付与済対象は、ジカ感染した蚊に最初に刺された際に現在はジカ感染に罹りやすい「Ｃ」。逆に、「Ｂ」は、本発明に従って設計されたワクチン免疫原を示す。Ｅタンパク質を含む新規の免疫原において、融合ループ配列が改変されておりかつ感染増強抗体を産生することなくこのワクチンのＥタンパク質に対して中和抗体を産生することを目的としてグリカンで置換されるように設計されている新規の免疫原。「Ｄ」は、本発明のワクチンの一部の対象（例えば、免疫抑制されいてる）中での防御レベルの抗体反応の誘発の時折の失敗を表すが、当技術分野で既知の他のワクチン設計と異なり、本発明のワクチンは、免疫抑制対象をデングウイルスまたはジカウイルスによる感染の増強に対して感受性にしないように設計されている。それにより、本設計の免疫原およびワクチンは、個々の対象基準でより安全であるように設計されており、さらに、中和抗体の非存在下でジカ感染増強抗体を有する対象の集団を作ることによりジカの流行的蔓延を促進する可能性を欠くように設計されている。（ＷＴ＝野生型）。
【0101】
実施例２（図２） デング外部ドメインタンパク質およびジカ外部ドメインタンパク質の糖操作（高グリコシル化）形態の組換え発現
４種のデング血清型およびジカを代表する天然野生型（ＷＴ）外部ドメイン配列の様々な新規の組換え形態をコードし、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターならびにヘキサヒスチジンＣ末端タグを含むプラスミド挿入物をデノボ遺伝子合成により作製した（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＧｅｎｅＡｒｔ）。２つのグリコシル化シークオンをこのＤＮＡ配列に挿入する場合、望ましくない相同組換え事象を許容し得る直接ＤＮＡ配列反復の生成を回避するために、この配列を「手動」で変更した。
４種のデング血清型およびジカを代表する天然野生型（ＷＴ）外部ドメイン配列の様々な新規の組換え形態をコードし、かつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターならびにヘキサヒスチジンＣ末端タグを含むプラスミド挿入物をデノボ遺伝子合成により作製した（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＧｅｎｅＡｒｔ）。２つのグリコシル化シークオンをこのＤＮＡ配列に挿入する場合、望ましくない相同組換え事象を許容し得る直接ＤＮＡ配列反復の生成を回避するために、この配列を「手動」で変更した。
【0102】
ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４およびＺＩＫＶのエンベロープタンパク質の変異外部ドメインをそれぞれコードするプラスミド発現ベクターｐＣＲＯ２１（配列番号１３）、ｐＣＲＯ２２（配列番号１４）、ｐＣＲＯ２３（配列番号１５）、ｐＣＲＯ２４（配列番号１６）およびｐＣＲＯ２８（配列番号１７）を最終的に選択し、下記のようにＴｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｏｘｆｏｒｄが作製した：発現カセットを、分泌シグナルとして作用するインフルエンザ－Ａウイルス赤血球凝集素タンパク質の最初の１７個のアミノ酸のコード配列が続くコンセンサスＫｏｚａｋ配列が続く５’ＮｏｔＩ部位を含むようにデノボで合成した。使用したエンベロープタンパク質コード配列（このポリタンパク質に対するナンバリング）は、それぞれ２８０－６７５（ＮＣＢＩ ＡＣＡ４８８５９．１）、２８１－６７６（ＮＣＢＩ ＡＤＫ３７４８４．１）、２８１－６７３（ＮＣＢＩ ＡＩＨ１３９２５．１）、２８０－６７５（ＮＣＢＩ ＡＮＫ３５８３５．１）および２９１－６９６（ＮＣＢＩ ＡＲＢ０７９５７．１）であった。［他の箇所では、参照を容易にするために、ナンバリングを、融合ループの１０１でのＷを参照点として、Ｅタンパク質の残基番号に従って表す］。各構築物は、６×Ｈｉｓ－タグおよび終止コドンが続く７～８個のアミノ酸長のグリシン－セリンリンカーのコード配列を含んだ。各発現カセットでは、この終止コドン後にＮｈｅＩ部位が続く。哺乳類発現ベクターｐＳＦ－ＣＭＶ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）をＮｏｔＩおよびＮｈｅＩで消化し、４．２ｋｂ断片を、維持ベクター（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＵＣ５７）を有する発現カセットの１．３ｋｂのＮｏｔＩおよびＮｈｅＩ断片に連結した。それぞれの場合、一般式（ＮＸＳ／Ｔ）の１つまたは２つの追加のシークオンを、機能性Ｎ連結グリコシル化部位を（理論的に）コードし得るＥタンパク質外部ドメインの融合ループに導入した。野生型デングタンパク質は、２つのグリコシル化部位を天然で既に有し、ジカでは１つである。融合ループ中に天然グリカンは見出されない。
【0103】
小規模調製の場合、３ｅ６／ｍｌでのＨＥＫ２９３ＦＴ細胞の１５ｍｌアリコートにｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４またはｐＣＲＯ２５（配列番号１８）を個々にトランスフェクトし、４種のコントロールトランスフェクションを、ｐＳＦ２３３、ｐＳＦ２３６、ｐＳＦ２３７、ｐＳＦ２３８またはｐＳＦ２３９を使用して実施した。１日後、各トランスフェクションにレスキュー培地１５ｍｌを添加した。トランスフェクションから３日後、１０種のトランスフェクションのそれぞれを下記と同じ方法で処理した：懸濁液３０ｍｌを７分にわたり４，０００ｇで回転させた。得られた上清を、０．２２ｕｍディスクフィルタを使用してろ過した。ペレットをＰＢＳ １ｍｌに再懸濁させた。次いで、ろ過した上清を、製造業者の指示に従ってＶｉｖａｓｐｉｎ２０（３０，０００Ｄａカットオフ）を使用して濃縮した。濃縮物体積は、０．６ｍｌ～１．２ｍｌの範囲であった。全ての濃縮物をＰＢＳで１．２ｍｌにした。濃縮した上清を、Ｔａｌｏｎ ＨｉＴｒａｐ Ｓｐｉｎ（ＧＥ）を使用して製造業者の指示に従ってＴａｌｏｎ精製にかけた。Ｔａｌｏｎ補足用の緩衝液は、下記であった：平衡緩衝液：５０ｍＭのリン酸塩ｐＨ７．８、３００ｍＭのＮａＣｌ；洗浄緩衝液：５０ｍＭのリン酸塩ｐＨ７８、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール；溶出緩衝液：５０ｍＭのリン酸塩ｐＨ７．８、３００ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのイミダゾール。
【0104】
【0105】
図２ｃは、高グリコシル化タンパク質が分泌される、選択した構築物ｐＣＲＯ２１（Ｄ１）、ｐＣＲＯ２２（Ｄ２）、ｐＣＲＯ２３（Ｄ３）、ｐＣＲＯ２４（Ｄ４）（それぞれデング血清型１～４に関する）およびジカに関するｐＣＲＯ２８の抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体によるウエスタンブロットを示す。グリコシル化に起因する分子量増加は、明らかであり（＋２グリカンデング構築物の場合、ジカ＋１グリカン構築物の場合と比べて高い）、これは、発現可能なタンパク質として選択理論的に設計された構築物の実際の達成を実証する。野生型の形態を各対の左側に示す。
【0106】
図２ｄは、コバルトキレートを使用するコバルトキレート（ＴＡＬＯＮ）クロマトグラフィー後の、４種のデングウイルス株Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびジカに由来する高グリコシル化Ｅタンパク質外部ドメインである精製済タンパク質のクマシーブルー染色ゲルを示す。高グリコシル化外部ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびジカは、それぞれプラスミドｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４およびｐＣＲＯ２８に対応する。
【0107】
スケールアップ産生の場合、ｐＣＲＯ２１をベースとするデング－１高グリコシル化構築物に関して下記の通り説明するように、新規の高グリコシル化タンパク質を、線形ポリエレンイミン（ＰＥＩ）による一過性のトランスフェクションによりヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）中で組換え発現させ、コバルトキレート（ＴＡＬＯＮ（登録商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ＧＥ）による金属キレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。２０×１ＬのＨＥＫ２９３細胞をＤＥＮＶ１＿Ｅｅｘｏ＿２ｘｇｌｙｃｏ発現ベクターｐＣＲＯ２１でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、遠心分離により上清を回収し、清澄化された上清を０．２ｕｍろ過し、接線流ろ過（ＴＦＦ）により約２００ｍｌまで濃縮した。固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．８をベースとする緩衝系を使用し、製造業者の指示に従って５ｍｌ ＨｉＴＲＡＰ Ｔａｌｏｎプレパックカラム（ＧＥ）を使用してＴＦＦ保持液に対して実施した。ＤＥＮＶ１＿Ｅｅｘｏ＿２ｘｇｌｙｃｏタンパク質含有画分をプールし、２０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ ｐＨ７．８ １０ｍＭのＮａＣｌに対して透析した。製造業者の指示に従って、予め充填した５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムを使用してイオン交換クロマトグラフィーを実施した。ＤＥＮＶ１＿Ｅｅｘｏ＿２ｘｇｌｙｃｏをプールし、ＤＰＢＳ ｐＨ７．４に対して透析した。透析した溶液を０．２２ｕｍろ過し、無菌条件下でガラス瓶に入れて保存した。ＢＣＡアッセイおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥを製造業者の指示に従って実施した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。
【0108】
高グリコシル化構築物の３種は、野生型と比べてはるかに高いレベルで発現することに留意されたい（これらは、プラスミドｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３およびｐＣＲＯ２４に対応する高グリコシル化デング血清型２、３および４である）。ジカプラスミドｐＣＲＯ２５は検出可能な分泌タンパク質を生じなかった（図２ａ、レーン２０）が、有意な量の細胞関連タンパク質を見出した（示さない）。
【0109】
従って、デング－１およびジカの高グリコシル化形態の発現レベルを改善しようとするさらなるラウンドの構築物を作製した（図２ｂを参照されたい）。この場合、ニッケルキレートクロマトグラフィーを精製に使用した。デングのさらなる構築物（ｐＣＲＯ２６（配列番号１９）およびｐＣＲＯ２７（配列番号２０））ならびにジカのさらなる構築物（ｐＣＲＯ２８（配列番号１７）、ｐＣＲＯ２９（配列番号２１）、ｐＣＲＯ３０（配列番号２２）およびｐＣＲＯ３１（配列番号２３））を発現させて精製した。抗Ｈｉｓ－タグウエスタンブロット（図２ｃ）およびクマシー染色（図２ｄ）により、プラスミド構築物ｐＣＲＯ２８の有利な発現が示された。
【0110】
選択した高グリコシル化形態は、ｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４（それぞれデング血清型１～４に関する）およびジカに関するｐＣＲＯ２８であった。高グリコシル化外部ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびジカは、それぞれプラスミドｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４およびｐＣＲＯ２８（それぞれ配列番号２４、２５、２６、２７および２８）に対応する。グリコシル化に起因する分子量増加は、明らかであり、＋２デング構築物の場合、ジカ＋１構築物の場合と比べて高い。
【0111】
１１種の全てのプラスミド構築物を作製してタンパク質発現に関して試験し、野生型と比較して同等のまたは（ほとんどの場合には）優れたレベルの発現に基づいて５種をさらなる研究のために選択した（デングの４種の血清型を表すｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３、ｐＣＲＯ２４およびジカを表すｐＣＲＯ２８）。
【0112】
驚くべきことに、デングの場合、融合ループ（３次元空間においてＥタンパク質の遠位端で密接に並ぶＥタンパク質の先端で露出した残基Ｗ、ＦおよびＬを特徴とする）の極端な疎水性を考慮すると、４種の全ての代表的な血清型は、発現レベルにペナルティを課すことなく、２つのグリカンの置換（親水性であり、タンパク質のこの部分のトポグラフィをアミノ酸置換が全く起こり得ない程度まで急激に変える）に耐容性を示す（即ち全てが野生型配列と同様に発現し、場合により著しく良好である）。プロテアソーム分解のためのＥＲＡＤチャネルを介して小胞体から根絶されているはずであるタンパク質が誤って折り畳まれないことを確実にするために、発現レベルが「野生型よりも低くない」ことを目標に設定した。融合ループ中に単一のグリカンを有するデング血清型－１配列の例も作製したが、この例は、野生型または２つのグリカンを有する種と比べて少しも良好に発現しなかった。ジカの場合、融合ループに２つのグリコシル化部位を有するバリアントを作製する試み（デングに関して確立された方法に従う）は、成功せず、野生型の場合と比べて組換えタンパク質の培養培地への分泌が少なかった。
【0113】
従って、ジカＥタンパク質外部ドメインの場合、本発明者らは、融合ループ中の様々な位置で単一のグリカンを有するバリアントの産生を調査した。デングシークオンの１つに関して、アスパラギンによるトリプトファン（Ｗ１０１）の置換（Ｗの代わりに１０１でのシークオンのＮ）により、この構築物の発現レベルが野生型の場合と比べて低くなった。同様に、Ｆ１０８でのグリカンの挿入（即ちＦの代わりに１０８でのシークオンのＮ）により、この構築物の発現レベルが野生型の場合と比べて低くなった。本発明者らは、ジカ融合ループがグリカン挿入に対する許容性が低いと結論付け、グリカン挿入を可能にするより保守的な方法を求めた。
【0114】
ジカの場合、融合ループのＷ１０１も後続のＦもＮ連結グリコシル化シークオンのＮで置き換えられ得なかったことが確立されていることから、代替戦略を開発し、この戦略は、デングのために用いられるアプローチをモデルにしなかった。本発明者らは、（３Ｄ構造ＰＤＢ ５ＩＲＥに基づいて）融合ループの終わりの可能な限り近くに単一のグリカンを配置しようとした。グリカンの挿入を可能にする可能性がある数百もの可能なバリアントを体系的に作製して試験するプロセスを経るよりもむしろ（遺伝子合成またはライブラリ技術により困難であった可能性がある）、本発明者らは、仮想上の解決策を考案して試験した。本発明者らは、Ｎ連結グリコシル化シークオンにより融合ループの頂点でＷをまたがるようにように工夫した。しかしながら、本発明者らは、ＷがシークオンのＸ位で許容されないことから、古典的なＮＸＳ／Ｔシークオンの挿入により実行不可能であった可能性があると推論した。しかしながら、Ｗは、シークオンの中心の「Ｘ」位で許容されないが、Ｈ（疎水性－芳香族／カチオン性の二重特性を有するヒスチジン（Ｗの比較的保存された置き換え））は、このＸ位で許容され得る。従って、本発明者らは、１００位をＮで置換し、Ｘ位にＷの代わりにＨを使用し、Ｔ（本発明者らは、Ｓと比べてＨと良好に作用することを発見している）を使用して、「ＮＨＴ」（即ち残基１００、１０１、１０２、ポリタンパク質ナンバリング規定ではなく、Ｅタンパク質ナンバリング規定を使用する）を示す単一シークオンを作製した。得られたタンパク質（プラスミドｐＣＲＯ２８から作られた）が野生型と同様に発現することおよび野生型と比べて精製率が高いことを発見しており、これは、発現の障害がないことを示す。本発明者らが調査したジカの他の変異体は、使用した発現系で低レベルの分泌タンパク質を生じるかまたは分泌タンパク質を生じなかった。
【0115】
実施例３（図３）糖操作されたデング血清型－２タンパク質上におよび糖操作されたジカタンパク上に存在するグリカンのキャラクタリゼーション
実施例２から選択したタンパク質の２つ（ＨＥＫ２９３のトランスフェクションから得られたｐＣＲＯ２２（融合ループ中に２つのグリカンを有するように全てが設計されている選択したデング構築物の代表）のデング－２血清型産物およびジカの産物（ｐＣＲＯ２８の産物、融合ループ中に１つのグリカンを有するように設計されている））に対してグリカン組成分析（ＧｌｙｃｏＴｈｅｒａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を実施した。
実施例２から選択したタンパク質の２つ（ＨＥＫ２９３のトランスフェクションから得られたｐＣＲＯ２２（融合ループ中に２つのグリカンを有するように全てが設計されている選択したデング構築物の代表）のデング－２血清型産物およびジカの産物（ｐＣＲＯ２８の産物、融合ループ中に１つのグリカンを有するように設計されている））に対してグリカン組成分析（ＧｌｙｃｏＴｈｅｒａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を実施した。
【0116】
ポリペプチドＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼ、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．）による消化の前後のデング試料およびジカ試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を図３ａに示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（クマシーブルー染色後の１５％ポリアクリルアミドゲル）前に、９５℃で５分にわたり５０ｍＭのＤＴＴ中で試料を還元した レーン１：ＰＮＧアーゼ消化前のＣＶ９４（ｐＣＲＯ２２タンパク質、デング－２）；レーン２：ＰＮＧアーゼ消化後のＣＶ９４；レーン３：ＰＮＧアーゼ消化前のＣＶ９５（ｐＣＲＯ２８タンパク質、ジカ）；レーン４：ＰＮＧアーゼ消化後のＣＶ９５；レーン５：分子量標準。この場合、見かけ上の分子量の減少の程度（ＷＴに対する図２ｃ中の増分と異なる）は、配列に導入された追加のグリカンの数に基づく理論的予想と一致し、即ち、デング－２は、この消化で４つのグリカンを喪失している（天然の２つおよび追加のシークオンの配列プログラミングにより導入された２つ）が、ジカは、２つのグリカン（天然の１つおよび１つの追加のシークオンの配列プログラミングにより導入された１つ）を喪失している。ＰＮＧアーゼによる酵素的消化をＴａｒｅｎｔｉｎｏ ａｎｄ Ｐｌｕｍｍｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９４；２３０；４４－５７に従って行った。
【0117】
高グリコシル化タンパク質産物からグリカンを遊離させ、特異的エキソグリコシダーゼ処理と一緒に、パルスドアンペロメトリ検出を伴う高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）および２－ＡＢ標識付与Ｎ－グリカンの蛍光検出を伴う順相ＨＰＬＣにより定量化した（図３ｂ）。この分析の結果を表２でまとめる。
【0118】
天然オリゴ糖の定量的ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ分析を、高分解能ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２００カラムを使用してＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ；ＧｌｙｃｏＴｈｅｒａ ｄｅｖｉｃｅ－ＩＤ：ＨＰＡＥＣ－７）のＩＣＳ５０００＋イオンクロマトグラフィーシステムで実施した。適切なオリゴ糖参照標準の注入を分析シークエンスに含めた。
【0119】
電気化学的検出によりＮ－グリカンを検出した。データを収集し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．８を使用することによりクロマトグラムを得た。天然Ｎ－グリカンを、ＧｌｙｃｏＴｈｅｒａの参照オリゴ糖標準に照らして両方の調製物中で中性オリゴ糖、モノシアリル化オリゴ糖、ジシアリル化オリゴ糖およびトリシアリル化オリゴ糖を主に明らかにするＨＰＡＥＣ－ＰＡＤにより分析した（図３ｂ、表３）。
【0120】
脱シアリル化Ｎ－グリカンを、ＧｌｙｃｏＴｈｅｒａの参照オリゴ糖標準に照らして両方の試料（ＣＶ９４＝デング－２およびＣＶ９５＝ジカ）中で近位のα１，６－連結フコースを有する、顕著な順列多様性を有する複合型Ｎ－グリカンを主に明らかにする２－ＡＢ標識付与後にＮＰ－ＨＰＬＣにより分析した。デング調製物およびジカ調製物ＣＶ９４（デング２ｐＣＲＯ２２タンパク質）およびＣＶ９５（ｐＣＲＯ２８タンパク質）ジカ（表２に示す）から遊離した天然Ｎ－グリカンのＨＰＡＥＣ－ＰＡＤマッピングにより、両方の試料中に主に中性オリゴ糖（それぞれ１６．９％および１７．０％）、モノシアリル化オリゴ糖（それぞれ３０．７％および３６．９％）、ジシアリル化オリゴ糖（それぞれ２６．６％および３２．０％）ならびにトリシアリル化オリゴ糖（それぞれ１５．０％および８．４％）の存在が明らかになった。デング試料およびジカ試料ＣＶ９４およびＣＶ９５中に顕著な量のテトラシアリル化Ｎ－グリカン（それぞれ９．５％および５．１％）ならびに低い割合のペンタシアリル化／硫酸化オリゴ糖（それぞれ１．３％および０．６％）を見出しており、分析した試料の何れにおいても、リン酸化Ｎ－グリカン構造（例えば、１つのリン酸残基を有するオリゴマンノシドＭａｎ５－６ＧｌｃＮＡｃ２グリカン鎖）を検出しなかった。
【0121】
グリカンの部位占有率分析：
部位占有率をトリプシンペプチドのＬＣ－ＭＳ測定により決定した。この分析は、ＰＮＧアーゼＦにより酵素的に脱Ｎ－グリコシル化されたタンパク質から遊離したトリプシン生成ペプチドまたはエンドＬｙｓ－Ｃ生成ペプチドのＬＣ－ＭＳ測定に基づいた。ＰＮＧアーゼＦは、グリコアミダーゼであることから、アスパラギン（Ｎ）は、アスパラギン酸残基（Ｄ）に変換される。抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の作成により定量化を行った。０．０１の＋／－ｍ／ｚの質量ウィンドウ内で異なる荷電標的ペプチドの理論ｍ／ｚ値を使用してＥＩＣを作成した。脱Ｎ－グリコシル化により生成された、特異的に改変されたカウンターパートとペプチド強度を比較するために、ＥＩＣのピーク面積を使用した。次いで、改変の比率／程度を下記のように算出した：改変の程度＝［改変ペプチドのＥＩＣ下の面積］／（［改変ペプチドのＥＩＣ下の面積］＋［非改変ペプチドのＥＩＣ下の面積］）。
部位占有率をトリプシンペプチドのＬＣ－ＭＳ測定により決定した。この分析は、ＰＮＧアーゼＦにより酵素的に脱Ｎ－グリコシル化されたタンパク質から遊離したトリプシン生成ペプチドまたはエンドＬｙｓ－Ｃ生成ペプチドのＬＣ－ＭＳ測定に基づいた。ＰＮＧアーゼＦは、グリコアミダーゼであることから、アスパラギン（Ｎ）は、アスパラギン酸残基（Ｄ）に変換される。抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の作成により定量化を行った。０．０１の＋／－ｍ／ｚの質量ウィンドウ内で異なる荷電標的ペプチドの理論ｍ／ｚ値を使用してＥＩＣを作成した。脱Ｎ－グリコシル化により生成された、特異的に改変されたカウンターパートとペプチド強度を比較するために、ＥＩＣのピーク面積を使用した。次いで、改変の比率／程度を下記のように算出した：改変の程度＝［改変ペプチドのＥＩＣ下の面積］／（［改変ペプチドのＥＩＣ下の面積］＋［非改変ペプチドのＥＩＣ下の面積］）。
【0122】
配列ナンバリングは、ポリタンパク質配列ナンバリング規定ではなく、有用な参照点として（融合ループの最先端での）Ｗ１０１によりタンパク質によるものである。部位を、デング（ｐＣＲＯ２２、ＧｌｙｃｏＴｈｅｒａ試料番号ＣＶ９４）において部位２および３を含む２つの追加のシークオンが存在したように、Ｎ末端で始まる線形配列中での出現に従ってナンバリングする。天然ＷＴ Ｎ－グリコシル化部位の占有率が部位１および部位４に関してそれぞれ１００％および９９％であることを確認した。追加されたＮ－グリコシル化部位２および３（融合ループ中）は、１つのトリプシンペプチド（Ｔ１５）上に位置しており、占有率は、３８％（両方の部位）およびさらに５１％であり、２つの部位の一方のみがＮ－グリコシル化されていた。全てにおいて、融合ループの８９％が少なくとも１つのグリカンを有した。
【0123】
ジカの場合、Ｎ－グリコシル化部位の占有率は、追加された「部位１」（残基１００、融合ループ）および部位２（残基１５４、天然に存在するグリカン）のそれぞれに関して９９．５％および１００％であることを確認した。プログラムされたグリコシル化シークオンの部位占有率を、ＰＮＧアーゼ消化およびトリプシンペプチド断片の質量に対するＰＮＧアーゼ消化の効果（それにより、アスパラギン側鎖のアミドＮＨ２基が失われてヒドロキシル基に変換される）から推定した。（下記の配列において、プログラムされたシークオンを太字で示す）。高グリコシル化デング２外部ドメインでは、関連するトリプシンペプチドはＴ１５であり、即ち１０１および１０８で置換されたＮ残基を含む１５番目のトリプシンペプチド
であった。高グリコシル化ジカ外部ドメイン（単一の導入されたグリコシル化シークオン「ＮＨＴ」を有する）では、関連するペプチドは、Ｔ１０
であった。
【0124】
デング外部ドメインタンパク質およびジカ外部ドメインタンパク質の融合ループへの大きくかつ複雑なグリカンの効率的な導入というこれらの発見は、これらのタンパク質が融合ループに結合せず融合－ループ抗体を誘発もしないはずであるという本発明者らの予想を強化し、融合ループの野生型バージョンを認識し得るＢ細胞または抗体が本発明のグリコシル化形態と結合しないはずであるという自信を付与する。このシナリオは、誘導ループへの変異の単なる導入と著しく異なり、なぜなら、融合ループに１つまたは複数の大きい追加のグリカン構造を課すことにより、得られたバリアント融合ループは、抗体またはＢ細胞レセプターに結合し得ないか、または融合ループの野生型バージョンと反応する融合ループ抗体を産生し得ないからである。これを後の実施例で完全に確認した。この戦略は、タンパク質の構造からドメインＩおよびＩＩを欠失させることと対照的でもあり得、なぜなら、これらのドメインは、天然ウイルス感染または他のワクチンに対する免疫反応での融合ループの危険な優位性を回避するような方法で免疫系をプレコンディショニングしつつ、野生のフラビウイルスとの遭遇時に既住の免疫反応に有用な中和エピトープおよびＴ細胞エピトープにも寄与するからである。
【0125】
実施例４（図４）直接ＥＬＩＳＡにおける選択糖操作デングタンパク質１、２、３および４ならびにジカの免疫原性。
雌のＢａｌｂ－ｃマウスを、ＰＢＳ（陰性コントロール）、ならびにＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上の、単独（ジカモノ）でのおよび組み合わせ（ペンタ－）での高グリコシル化外部ドメインタンパク質の様々なデング製剤およびジカ製剤、ならびに裸のＤＮＡ（ＤＮＡ）で免疫付与した。タンパク質のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ製剤を２００ｕｌの総体積で皮下（ｓ．ｃ．）注射し、五価ＤＮＡ（各プラスミド免疫原５マイクログラムを表す）の場合に裸のＤＮＡ（デングのプラスミドｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３およびｐＣＲＯ２４ならびにジカを表すｐＣＲＯ２８を含む）を５０ｕｌの総体積で筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。五価のタンパク質組み合わせは、各高グリコシル化外部ドメインの用量当たり５ｕｇの量を含み、一価（ジカ）は、用量当たり１０ｕｇを含んだ。マウスに３回（０日目、１４日目および２１日目のそれぞれで１回）投与した。図４の右下の凡例は各免疫原の組成を示す。各パネルの表題は、固相ＥＬＩＳＡプレート上で使用した抗原を示す。（野生型組換えＶＬＰを、免疫原（群４）としておよび図４での抗原としての両方で使用した）。示した間隔でマウスの後眼窩から採血し、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＰＲＮＴアッセイのために血清を採取した。
雌のＢａｌｂ－ｃマウスを、ＰＢＳ（陰性コントロール）、ならびにＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上の、単独（ジカモノ）でのおよび組み合わせ（ペンタ－）での高グリコシル化外部ドメインタンパク質の様々なデング製剤およびジカ製剤、ならびに裸のＤＮＡ（ＤＮＡ）で免疫付与した。タンパク質のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ製剤を２００ｕｌの総体積で皮下（ｓ．ｃ．）注射し、五価ＤＮＡ（各プラスミド免疫原５マイクログラムを表す）の場合に裸のＤＮＡ（デングのプラスミドｐＣＲＯ２１、ｐＣＲＯ２２、ｐＣＲＯ２３およびｐＣＲＯ２４ならびにジカを表すｐＣＲＯ２８を含む）を５０ｕｌの総体積で筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した。五価のタンパク質組み合わせは、各高グリコシル化外部ドメインの用量当たり５ｕｇの量を含み、一価（ジカ）は、用量当たり１０ｕｇを含んだ。マウスに３回（０日目、１４日目および２１日目のそれぞれで１回）投与した。図４の右下の凡例は各免疫原の組成を示す。各パネルの表題は、固相ＥＬＩＳＡプレート上で使用した抗原を示す。（野生型組換えＶＬＰを、免疫原（群４）としておよび図４での抗原としての両方で使用した）。示した間隔でマウスの後眼窩から採血し、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＰＲＮＴアッセイのために血清を採取した。
【0126】
Ｂａｌｂ－ｃマウスに糖操作外部ドメインのＤＮＡ表現およびタンパク質表現で免疫付与し、陽性コントロールとして、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫの対応するＶＬＰ（即ち野生型配列を表すＶＬＰ）（余分なグリカンなし、および融合ループは露出している）で免疫付与した。これらのＶＬＰ（表８を参照されたい、図４のＥＬＩＳＡ試験において免疫原として使用されかつ試験抗原としても使用される）は、外部ドメイン中に存在しない複数の追加のエピトープも含み、特にプレメンブランタンパク質ｐｒＭのエピトープも含む。
【0127】
リポソーム製剤、遺伝子銃またはエレクトロポレーション技術による送達補助がない場合に予想されるように、５種の外部ドメインを表す裸のＤＮＡに対する抗体反応はほとんどなかった。裸のＤＮＡに対する抗体反応は、デング１、２おび３の天然ＶＬＰに対して明らかであり、ジカおよびデング４のＶＬＰに対して明らかでなかった。しかしながら、これらの結果は、適切な送達システムによる、これらのＤＮＡにコードされた抗原（これらの全て）の潜在的有用性を実証するのに役立った。このアッセイは、当然のことながら、追加のエピトープ（上記）の存在に起因して、ＶＬＰに対する免疫反応の検出により敏感であり、その結果、予想されたように、ＶＬＰ抗原に対する抗体反応は、ＶＬＰで免疫付与された「群４」において均一でありかつ非常に強力であった。しかしながら、本発明の新規の糖操作外部ドメインタンパク質に対する反応もそうであり、五価免疫原製剤により５種の全ての成分（デング血清型１、２、３および４ならびにジカ）に対して強力でバランスのとれた免疫反応を付与した。反応は、外部ドメイン免疫原（五価タンパク質および一価ジカ）に対して一様に高く、非反応者はいなかった。同様に、一価ジカ高グリコシル化外部ドメイン免疫付与群（１０μｇ用量）でのジカに対する反応は、同一の外部ドメインを半分用量で使用した五価タンパク質群の場合と比べてやや高かった。この発見は、型特異的免疫反応の発生での血清型間の競合（これは、デング血清型２に対する免疫反応が問題になるほど低い生弱毒化フラビウイルスワクチンアプローチ（例えば、Ｄｅｎｇｖａｘｉａ）による既知の問題である）の好都合な欠如を示す。
【0128】
デングウイルスおよびジカウイルスに対するネズミ抗体を測定するための直接ＥＬＩＳＡ（図４）のために、Ｎｕｎｃ（商標）Ｆｌａｔ ９６－Ｗｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６９６２０を、室温で２時間にわたり１００μｌ／ウェルにおいて、４．４３ｇ／ｌで重炭酸ナトリウムを含み、１．５９ｇ／ｌで炭酸ナトリウムを含む重炭酸塩－炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４～９．６）中の０．５μｇ／ｍｌの濃度でＶＬＰ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）から）でコーティングした。プレートを吸引し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ－Ｇｉｂｃｏ １４１９０１３６）中の２％中性ＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ Ａ７９０６）（ＰＢＳ－ＢＳＡ）でブロックした。このブロッキング緩衝液を、１／１００および１／１０，０００の濃度で希釈したマウス血清の試験のための希釈剤として使用した（各濃度で２回の反復）。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで５回ウェルを満たして空にすることによる各インキュベーション（ブロッキング、希釈血清インキュベーション、コンジュゲートインキュベーション）後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０界面活性剤を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。血清のインキュベーションおよび洗浄後、二次抗体コンジュゲートをＰＢＳ－ＢＳＡ（ヤギ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲートＢｉｏＲａｄ １０３００５）中に１：４０００の希釈でアプライした。最後にプレートを洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の基質を添加し（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ００４４０）、室温での２０分のインキュベーション後に０．１６Ｍの硫酸で停止させた。インキュベーションをミキサー（Ｇｒａｎｔ Ｂｉｏ、約５００ｒｐｍでＰＭＳ－１０００）で行った。停止させた反応の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【0129】
抗体反応を、コーティング濃度１ｍｌ当たり０．５マイクログラムで固相上の血清型２を表すデングＶＬＰで融合ループ抗体４Ｇ２（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ）に対して較正した。抗体測定値「ＩｇＧ抗体価」の単位は、４成分多項式回帰適合（ＡｓｓａｙＦｉｔ、ＩＶＤ Ｔｏｏｌｓ）を用いた標準曲線の補間によって決定される、希釈されていない血清中の４Ｇ２相当物１ｍｌあたりのマイクログラムである。４２日目に、抗体反応は、高グリコシル化外部ドメイン免疫原に関して１０４～１０５（理論上、正味の血清中に１ｍｌ当たり１０ｍｇ～１ｍｌ当たり１００ｍｇ）に達した。これらの濃度（文字通り）は、達成不可能なほど高く、なぜなら、マウス血清のＩｇＧ濃度は、１ｍｌ当たりわずか２～５ｍｇであり、標準化に使用される抗体４Ｇ２と比較して産生される抗体の高い親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）または親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）をおそらく反映するかまたはより良好なエピトープ露出を反映し得る（４Ｇ２の融合ループエピトープは、ＶＬＰおよびビリオンの構造中では半分隠れている）。それにもかかわらず、４Ｇ２較正は、アッセイをときに実行することを可能にするという有用な目的を果たし、コンジュゲート（バッチ毎に異なるポリクローナル抗体から作製された抗ＩｇＧ－Ｆｃセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート）中のバッチ間の変動のような変数を制御する。これは、コンジュゲートバッチおよび抗原バッチに非常に依存し、かつ異なる製造業者により供給されるコンジュゲート間でさらに変動し得る閾値吸光度値に基づく抗体「力価」を引用することと比べて信頼性が高い。
【0130】
これらの観察のさらなる側面は、産生された抗体が、タンパク質免疫原の全てに関してＩｇＭからのクラススイッチング（１４日目であっても）を示すＩｇＧクラスであることである。これは、Ｂ細胞記憶反応の必須成分であり、ワクチンの開発にとって重要である。これらの発見のさらなる側面は、外部ドメインタンパク質免疫原（およびある程度まではＤＮＡ免疫原）により産生された抗体がＶＬＰ抗原の天然型（Ｈｉｓタグも欠く）を強く認識し、抗Ｈｉｓ－タグ反応に起因して偽陽性の可能性を除外することである。これは、デング外部ドメイン材料およびジカ外部ドメイン材料の両方が、抗ウイルス（ＶＬＰ）抗体の産生で免疫原性である外部ドメインタンパク質の天然エピトープを表すことを証明する。これらの結果は、高グリコシル化外部ドメイン種（例えば、リポソームＲＮＡまたはリポプレックスＲＮＡ）の、他の核酸でコードされる形態もビリオン（ＶＬＰ）およびウイルスに対する望ましい抗体反応を生じることになることを示唆する。
【0131】
ジカ一価高グリコシル化外部ドメインに対する免疫反応で特異性が存在しており、この特異性により、これらの様々なウイルスと抗体との既知の交差反応性にもかかわらず、相同ジカＶＬＰに対して他のＶＬＰに対するのと比べて高い抗体力価が生じた。これは、有利な結果であり、なぜなら、型特異的抗ジカ抗体が一般にデング交差反応性と比べて良好な中和活性を有することが分かっているからである。同様に、より後の時点（２回または３回の投与後）でのジカ一価高グリコシル化外部ドメインに対する抗体反応で見られるように、デング株に対してある程度の交差反応性が経時的に生じており、融合ループエピトープ（後の実施例に続くデータで示されるように、高グリコシル化外部ドメイン種により産生された抗体により認識されなかった）を除いて、有益な交差反応中和反応の発生の可能性が上昇した。
【0132】
実施例５（図５）融合ループ抗体による糖操作タンパク質の認識の回避および中和エピトープの保持。
固相上のＨｉｓ－６－タグ付与外部ドメインタンパク質の指向性補足を用いるＥＬＩＳＡ試験（図５）を考案した（図４のＶＬＰはＨｉｓ－タグを有しない）。別途明記しない限り、条件は、実施例４および図４のＥＬＩＳＡ試験の場合と同一であった。８ウェルストリップＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ）を室温で１時間にわたりウサギモノクローナル抗Ｈｉｓ－６タグ（Ａｎｔｉ－６Ｘ Ｈｉｓ ｔａｇ（登録商標）抗体［ＨＩＳ．Ｈ８］（ａｂ１８１８４）Ａｂｃａｍ）でコーティングし、次いで重炭酸塩－炭酸塩コーティング緩衝液中の１μｇ／ｍｌの濃度で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、次いで室温で３０分にわたりＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３７５３８）に暴露し、次いで３７度で２時間にわたり、次いで４度で一晩、０．５μｇ／ｍｌの濃度で様々な外部ドメインタンパク質（全てがＣ末端ヘキサ－ヒスチジンタグを有する）に暴露した。抗体をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の０．４％ＢＳＡ中の適切なウェルに添加し、３７度で２時間にわたりインキュベートした。次に、マウス抗体用の二次抗体コンジュゲート（ウサギ－抗マウスＨＲＰ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ、Ａｂｃａｍ ａｂ９７０４６）を１／１０，０００の希釈でＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の０．４％ＢＳＡでアプライした。ヒト血清の場合、希釈係数は、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．４％ＢＳＡで１／１０００であり、続いて予め吸着されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ ａｂ９８６２４）で１／２０，０００であった。二次抗体ＨＲＰコンジュゲートを３７度で２時間にわたりインキュベートした。連続した試薬への暴露中にプレートを洗浄した。最後に、ＴＭＢ基質を添加し、室温で１０分後に停止させた。
固相上のＨｉｓ－６－タグ付与外部ドメインタンパク質の指向性補足を用いるＥＬＩＳＡ試験（図５）を考案した（図４のＶＬＰはＨｉｓ－タグを有しない）。別途明記しない限り、条件は、実施例４および図４のＥＬＩＳＡ試験の場合と同一であった。８ウェルストリップＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ）を室温で１時間にわたりウサギモノクローナル抗Ｈｉｓ－６タグ（Ａｎｔｉ－６Ｘ Ｈｉｓ ｔａｇ（登録商標）抗体［ＨＩＳ．Ｈ８］（ａｂ１８１８４）Ａｂｃａｍ）でコーティングし、次いで重炭酸塩－炭酸塩コーティング緩衝液中の１μｇ／ｍｌの濃度で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、次いで室温で３０分にわたりＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３７５３８）に暴露し、次いで３７度で２時間にわたり、次いで４度で一晩、０．５μｇ／ｍｌの濃度で様々な外部ドメインタンパク質（全てがＣ末端ヘキサ－ヒスチジンタグを有する）に暴露した。抗体をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の０．４％ＢＳＡ中の適切なウェルに添加し、３７度で２時間にわたりインキュベートした。次に、マウス抗体用の二次抗体コンジュゲート（ウサギ－抗マウスＨＲＰ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ、Ａｂｃａｍ ａｂ９７０４６）を１／１０，０００の希釈でＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の０．４％ＢＳＡでアプライした。ヒト血清の場合、希釈係数は、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．４％ＢＳＡで１／１０００であり、続いて予め吸着されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ ａｂ９８６２４）で１／２０，０００であった。二次抗体ＨＲＰコンジュゲートを３７度で２時間にわたりインキュベートした。連続した試薬への暴露中にプレートを洗浄した。最後に、ＴＭＢ基質を添加し、室温で１０分後に停止させた。
【0133】
抗原は、下記の通りであった：デング血清型２および４を表す野生型デング外部ドメインは、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＤＥＮＶ２－ＥＮＶ、ＤＥＮＶ４－ＥＮＶ）由来であり；「ＨＸ」指定外部ドメイン（高グリコシル化外部ドメイン）は、本開示のＥｘｃｉｖｉｏｎ外部ドメインの選択されたセットであった（デングの場合にｐＣＲＯ２１～２４、ジカの場合にｐＣＲＯ２８）。Ｐｒｏｓｐｅｃジカは、Ｐｒｏｓｐｅｃ ｏｆ Ｉｓｒａｅｌ（ｚｋｖ－００７－ａ）由来の非グリコシル化細菌外部ドメインであり、Ａａｌｔｏジカは、昆虫（Ｓｆ９細胞）由来のジカ外部ドメイン（ＡＺ６３１２－Ｌｏｔ３９０９）であった。ジカウイルス外部ドメインに対するマウスモノクローナル抗体は、下記の通りであり：Ａａｌｔｏ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ ＡＺ１１７６－０３０２１５６－Ｌｏｔ３８８９；Ｚ４８およびＺ６７は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ２０１６により説明されている中和抗体であった（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ＺＶ６７ ＭＡＢ１２１２５およびＺＶ４８ ＭＡＢ１２１２４）。抗体４Ｇ２は、融合ループを認識する抗デング血清型２抗体である（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ＡｂＦＬＡＶＥＮＶ－４Ｇ２）。
【0134】
図５ａは、抗体４Ｇ２によるデング２および４の野生型外部ドメインの高感度検出を示し、非常に低い濃度（２５０ｐｇ／ｍｌ）でもバックグラウンドを有意に上回るシグナルを示す。対照的に、高グリコシル化外部ドメインは、試験した濃度の何れでも検出可能なシグナルを示さなかった（図５ａ）。野生型外部ドメインおよび融合－ループグリコシル化（ＨＸ）外部ドメインのこのサイドバイサイド比較により、使用したデング－２ＨＸ外部ドメイン中の非グリコシル化（たとえ変異していても）融合ループの１１％の存在にもかかわらず（グリコシル化部位占有率データについて実施例３を参照されたい）、後者がこの古典的な融合ループ抗体（ロイシン１０７に高度に依存する、Ｓｔｉａｓｎｙ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００６ ８０：１９ ９５５７－６８、この位置でのＤ、ＴまたはＦの不耐容）と反応しないことが実証されている。これにより、用いた変異は、たとえグリカンがなくても、この特定の融合ループ抗体（４Ｇ２）の結合を防止するのに十分であることが実証される。しかしながら、ヒト抗体のクローン多様性を前提として、最終的には、フラビウイルスの野生型融合ループを認識し得る融合ループ抗体が、ワクチンとして使用される場合にこの新規の免疫原によりヒト中で産生されないことの保証のさらなる積み重ねとしてグリコシル化形態を用いることが好ましい。
【0135】
図５ｂおよび図５ｃのデータから、ジカの場合、外部ドメインのＨＸバージョンが３種の全てのジカモノクローナル抗体（２種の中和エピトープＺＶ４８（Ｚ４８）およびＺＶ６７（Ｚ６７）を含む）と反応することも実証される。これにより、ジカＨＸ外部ドメインが、グリカン挿入により融合ループの構造が劇的に変化するにもかかわらず、これらの中和エピトープおよびＡａａｌｔｏエピトープを保持していることが実証される。さらに、このジカＨＸ外部ドメインは、４種のデングＨＸ外部ドメインと同様に４Ｇ２と反応せず、これにより、このエピトープは、５種の全てのＨＸタンパク質において効果的に覆い隠されていることが確認される。
【0136】
試験したジカヒト回復期血清に関する図５ｂおよび図５ｃのデータも診断上有益である。この血清は、ジカに対する高ＰＲＮＴ活性および高レベルのジカＮＳ１抗体に関して選択されたＮＩＢＳＣのＭａｒｋ Ｐａｇｅからの寄贈であった。図５ｂおよび図５ｃのデータから、このジカ回復期血清は、この試験において他の抗原よりもデング－２ｗｔ外部ドメインを強くに認識し、実際には好むことが実証される。この観測は、ＨＸシリーズのタンパク質の診断上の有用性を実証し、この患者がジカ以外の別のフラビウイルスにも以前に暴露されていたことを示す。実際には、他のフラビウイルスは、デングでなかったことが示唆されており、なぜなら、ジカ回復期血清は、（デング熱回復期血清と異なり）高グリコシル化外部ドメイン形態のデングと反応しないからである。従って、ジカ回復期血清中の融合ループ抗体は、第３のフラビウイルス（例えば、黄熱病（ワクチン接種もしくは感染による）または西ナイルウイルス）への暴露に由来していなければならず、これらは、両方ともこの血清が採取されたトリニダードで流行している。
【0137】
図５ｂおよび図５ｃのデータのさらなる側面は、ジカＨＸ抗原が中和抗体の存在を選択的に知らせる能力を有することであり、なぜなら、上記の中和エピトープが保持されつつ、４Ｇ２融合ループエピトープが効果的に覆い隠されているからである。従って、ＨＸジカ外部ドメインタンパク質およびおそらくデングＨＸ外部ドメインタンパク質は、ジカワクチンおよびデングワクチンの開発および展開を知らせる能力を有するであろう。後者の場合、試験のＨＸ抗原は、その後のデング出血熱への素因（これにより、ワクチンは、サイレントな一次デング感染として作用する）のリスクを低減するために、デングに対してナイーブである人と現在認可されているＤｅｎｇＶａｘｉａ（登録商標）抗デングワクチンによるワクチン接種を免れている可能性がある人とを特性するのに有用である。そのような試験は、ＤｅｎｇＶａｘｉａの有用性をより若い人々にまで拡大し得（現在は９歳兆の子供に対してのみ認可されている）、または（例えば、ＤｅｎｇＶａｘｉａワクチン接種が現在提唱されいない旅行者集団での使用のために）欧州および米国等の非風土地域中のナイーブな人々にまで拡大し得る。
【0138】
実施例６（図６）糖操作タンパク質による融合－ループ抗体の産生の回避。
ＥＬＩＳＡ試験を確立して、融合ループ（この実施例では、固相ＥＬＩＳＡプレート上のデング血清型－３ＶＬＰで表される）に対するポリクローナル抗体の結合を測定した。
ＥＬＩＳＡ試験を確立して、融合ループ（この実施例では、固相ＥＬＩＳＡプレート上のデング血清型－３ＶＬＰで表される）に対するポリクローナル抗体の結合を測定した。
【0139】
ストレプトアビジン－セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して検出したビオチン化４Ｇ２（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用して、競合ＥＬＩＳＡを設定した。免疫付与血清型デング－２ＶＬＰと比べてわずかに良好に４Ｇ２と反応するデング血清型３ＶＬＰ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を、固相上で１ｍｌ当たり０．５ｕｇでコーティングした抗原として使用した。（図４の群から）プールした血清または非標識４Ｇ２（標準として）を様々な希釈度（この血清プールの最高濃度の１／１０から）で滴定して、融合ループへの結合に関してビオチン化４Ｇ２と競合する能力を測定した。ジカＶＬＰおよびデング－２ＶＬＰの野生型組換え物質を抗原として使用して同様の標準曲線を作成し（図示せず）、目的のフラビウイルスにわたるこの現象（融合ループ抗体の交差反応性）の一般性を強調する。
【0140】
このアッセイ（図６）では、ビオチン化４Ｇ２およびストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲート（１／３０００でＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ ＫＰＬ ＫＰＬ １４－３０－００）を使用して、非標識４Ｇ２の固相抗原への結合に関して競合する能力を実証した。別途明記しない限り、条件は、実施例４の場合と同じであった。最初に、３０：１の反応物のモル比を使用してＢｉｏＲａｄ ＥＺ－ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４ビオチン化キット（２１４５５）を使用し、製造業者の指示に従って４Ｇ２の試料をビオチン化した。非標識抗体およびビオチン化抗体を、固相抗原への結合に関して一晩の室温でのインキュベーションで競合させた。抗原をコーティングしたプレートを標準抗体の希釈物（４Ｇ２の４倍または５倍の連続希釈、非標識）に同時に暴露した。ビオチン化抗体を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【0141】
図６は、４種の全てのデング血清型およびジカのＶＬＰを含む、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ上の五価ＶＬＰに対して産生された抗体が豊富な融合ループ抗体を産生することを実証する。ＶＬＰ免疫付与血清は、融合ループ抗体１ｍｌ当たり約１００マイクログラムを含むことがこれらのデータ（４Ｇ２および産生された抗体の同様の親和性を仮定する）から算出され得、これは、ポリクローナル抗血清中のウイルス抗体に関して一般に最大量である。対照的に、他の群の何れにおいても、結合が４Ｇ２と相互に排他的である融合ループ抗体の有意な量が産生されない。特に、本開示の五価（ＨＸ）外部ドメインタンパク質は、この試験で評価されたように融合ループ抗体を産生せず、競合ＥＬＩＳＡ試験で使用されるＶＬＰ抗原に対する非常に実質的な抗体反応が生じているにもかかわらず、一価ジカ（ＨＸ）タンパク質も産生されない。ジカの場合、試験した最高濃度でのみ阻害を検出し、これは、１／１０血清希釈でのこの単一点が（議論のために）有意であると見なされる場合、ＶＬＰ免疫原と比較して融合ループ抗体の回避において＞１０００倍の利点を示した。
【0142】
図６のデータから、本発明のデングワクチン（またはジカワクチン）が、保存された融合ループに対する抗体反応を刺激しないことになることが実証される。これは、デングの別の血清型との遭遇時に後の出血熱を刺激する天然の原発性デング感染と対照的である。天然の原発性デング感染に対するそのような抗体反応は、抗体の生理学的濃度では中和が不十分であるかまたは中和せず、抗体複合化ビリオンがＦｃレセプターを介して骨髄細胞に侵入して感染させることを可能にすることにより、デング感染および疾患の抗体依存性増強の原因に特に関与し、さらに他の宿主細胞への感染の予防に失敗する。
【0143】
実施例７（図７）糖操作されたデングタンパク質およびジカタンパク質による中和抗体の産生
実施例４からの血清プールを、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）においてＶｅｒｏ細胞を使用して、デング血清型２ウイルスおよびジカウイルスを中和する能力に関して試験した。
実施例４からの血清プールを、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）においてＶｅｒｏ細胞を使用して、デング血清型２ウイルスおよびジカウイルスを中和する能力に関して試験した。
【0144】
デングの場合、Ｖｅｒｏ細胞（Ｄ２Ｙ９８Ｐ）を感染させるために使用されるデング血清型２株は、ＶＬＰおよび外部ドメインの免疫付与デング２株の配列と異なる血清型－２株（非相同）であった。デング中和抗体（即ち五価タンパク質および五価ＶＬＰ、群２および４）を産生することが（実施例４から）予想される群では、「オフターゲット」デング試験ウイルスの強力な中和が存在した。ジカの場合、天然ジカＶＬＰ（即ち五価タンパク質および五価ＶＬＰ、群２、３および４）を認識する抗体を含むことが分かった群において、実施例４の結果から予想されるように有意な（部分的ではあるが）中和が存在した。試料体積への制限に起因して、試験した血清の最大濃度は１／５０であり、その結果、これらの結果の解釈ではこの因子を考慮する必要がある（即ち免疫付与した動物の血液中でより高い中和能が存在するはずである）。
【0145】
ＰＲＮＴアッセイを下記の通りに実施した。５匹のマウスの血清試料を各群（次のスライドでの試料の説明）で等体積の個々の試料を採取することによりプールし、次いでＺＩＫＶおよびＤＥＮＶそれぞれに対して試験した。１：５０で開始する２回の反復での各血清試料の１２個の２倍連蔵希釈液を、ウイルスによる２時間接種のために調製した。次いで、血清－ウイルス混合物を、２４ウェル培養プレートに播種したＶｅｒｏ細胞に添加し、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃においてインキュベートした。Ｖｅｒｏ細胞をＺＩＫＶ ＰＲＮＴの場合にはインキュベーションから３日目（ｄｐｉ）で固定し、ＤＥＮＶ ＰＲＮＴの場合には４ｄｐｉで固定した。ウイルスプラークをクリスタルバイオレット染色により決定した。
【0146】
本開示の高グリコシル化外部ドメインタンパク質で免疫付与した群（ペンタ－ｐｒｏｔ）では、デングによる感染の強力な阻害を観測した。ジカ免疫付与動物は、Ｖｅｒｏ細胞のデング感染を予防しない抗体を産生しており、これは、この新規の免疫原により産生された抗体の型特異的性質を示す。これらのジカ抗体（ジカ一価群由来および五価タンパク質群由来）は、ジカウイルスによるＶｅｒｏ細胞の感染を有意に防御した。予想されるように、ＰＢＳシャム免疫付与動物は、防御抗体を産生せず、五価ＤＮＡも筋肉内投与しなかった。この後者の結果は、（遺伝子銃もしくはエレクトロポレーション戦略または分子アジュバントとしてコードされたタンパク質を組み込む戦略と異なり）筋肉内注射から予想されるように、裸のＤＮＡにより産生された低濃度の抗体に起因している可能性がある。
【0147】
本発明の高グリコシル化外部ドメインタンパク質による実施例５の結果（融合ループ抗体による認識または産生の欠如）と組み合わせた実施例６の結果（中和抗体の産生）は、これらのタンパク質が、感染の抗体依存性増強に特に関与する融合ループ抗体を産生することなく、デングウイルスまたはジカウイルスの防御ワクチン（または両方のウイルスの場合には組み合わせ）の基礎を形成し得ることを強く示唆する。
【0148】
実施例８（図８）回復期のデング血清またはジカ血清と、固定されたジカおよびデングの野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との反応
血清インキュベーション中に１０μｇ／ｍｌの濃度での、競合するマウスモノクローナルフラビウイルス融合ループ抗体４Ｇ２（抗デング血清型－２モノクローナル抗体）の存在下（灰色のバー、各対の右側）および非存在下（黒色のバー、各対の左側）での、ウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体による補足によって固相上で配向された、固定されたジカおよびデングの野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との、デング熱回復期血清中の抗体のＥＬＩＳＡ反応性である（図８、上方のパネル）。ヒト血清を１／１０００の一定濃度で試験した。
血清インキュベーション中に１０μｇ／ｍｌの濃度での、競合するマウスモノクローナルフラビウイルス融合ループ抗体４Ｇ２（抗デング血清型－２モノクローナル抗体）の存在下（灰色のバー、各対の右側）および非存在下（黒色のバー、各対の左側）での、ウサギ抗Ｈｉｓ－タグモノクローナル抗体による補足によって固相上で配向された、固定されたジカおよびデングの野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との、デング熱回復期血清中の抗体のＥＬＩＳＡ反応性である（図８、上方のパネル）。ヒト血清を１／１０００の一定濃度で試験した。
【0149】
競合するマウスモノクローナルフラビウイルス融合ループ抗体４Ｇ２の存在下（灰色のバー）および非存在下（黒色のバー）での、固定されたジカおよびデングの野生型（ＷＴ）外部ドメインタンパク質および高グリコシル化（ＨＸ）外部ドメインタンパク質との、ジカ回復期血清中の抗体のＥＬＩＳＡ反応性である（図８、下方のパネル）。条件および標識付けは、上方のパネルの場合と同一である。エラーバーは、標準誤差である。
【0150】
結果は、下記を示す：
１）本発明のＨＸジカ抗原は、回復期デング血清によるＷＴジカ外部ドメインのオフターゲット認識に対して感受性ではない。
２）デング血清によるＷＴジカ外部ドメイン（Ａａｌｔｏ）のオフターゲット認識は、ＶＬＰ（１ｍｌ当たり１０マイクログラム）に対して８０％阻害を引き起こす濃度において溶液相中で４Ｇ２（抗融合ループモノクローナル抗体）により無効になることから、融合ループ特異的現象である（この場合の固相上の抗原は、ＶＬＰではなく外部ドメインである）。
３）「ジカ」回復期血清は、３種のジカ外部ドメインを何れも認識しないが、ＷＴデング２およびＷＴデング４を強く認識する。実施例６では、本発明のＨＸジカ抗原およびＡａｌｔｏのジカ外部ドメインは、高次構造依存性の抗ジカ中和抗体と反応する）。これにより、この特定のジカ血清（ジカプラーク中和およびジカＮＳ１抗体に対して陽性）は、別のフラビウイルスにも暴露された対象由来であることが実証される。ジカ回復期血清（デング熱回復期血清と異なる）は、融合ループが覆い隠された外部ドメインを認識しないことから、この他のフラビウイルスは、デングではないと結論付けられ得る。
４）ヒトジカ回復期血清によるＷＴデング－２外部ドメインおよびＷＴデング－４外部ドメインのオフターゲット認識は、本発明のＨＸにより覆い隠されたデング外部ドメインでは見られない。これは、オフターゲット認識が融合ループ特異的であり、本発明に従ってグリカンにより覆い隠されたタンパク質を使用しない他のフラビウイルス診断試験において偽陽性を示すことになることを示唆する。
５）ヒトジカ回復期血清によるＷＴデング－２外部ドメインおよびＷＴデング－４外部ドメインのオフターゲット認識は、オフターゲット認識が融合ループ特異的現象であることを示す４Ｇ２により完全にブロックされる。
６）デング熱回復期血清は、ＷＴ２およびＷＴ４を無差別に認識するが、４の組のうちのｄ２外部ドメインを明らかに好む。これにより、本発明の融合ループ抗原は、この融合ループのグリカンによる覆い隠しに起因して、デング血清型を識別するのに（この野生型の等価の形態を比較して）優れた選択性を有することが実証される。
１）本発明のＨＸジカ抗原は、回復期デング血清によるＷＴジカ外部ドメインのオフターゲット認識に対して感受性ではない。
２）デング血清によるＷＴジカ外部ドメイン（Ａａｌｔｏ）のオフターゲット認識は、ＶＬＰ（１ｍｌ当たり１０マイクログラム）に対して８０％阻害を引き起こす濃度において溶液相中で４Ｇ２（抗融合ループモノクローナル抗体）により無効になることから、融合ループ特異的現象である（この場合の固相上の抗原は、ＶＬＰではなく外部ドメインである）。
３）「ジカ」回復期血清は、３種のジカ外部ドメインを何れも認識しないが、ＷＴデング２およびＷＴデング４を強く認識する。実施例６では、本発明のＨＸジカ抗原およびＡａｌｔｏのジカ外部ドメインは、高次構造依存性の抗ジカ中和抗体と反応する）。これにより、この特定のジカ血清（ジカプラーク中和およびジカＮＳ１抗体に対して陽性）は、別のフラビウイルスにも暴露された対象由来であることが実証される。ジカ回復期血清（デング熱回復期血清と異なる）は、融合ループが覆い隠された外部ドメインを認識しないことから、この他のフラビウイルスは、デングではないと結論付けられ得る。
４）ヒトジカ回復期血清によるＷＴデング－２外部ドメインおよびＷＴデング－４外部ドメインのオフターゲット認識は、本発明のＨＸにより覆い隠されたデング外部ドメインでは見られない。これは、オフターゲット認識が融合ループ特異的であり、本発明に従ってグリカンにより覆い隠されたタンパク質を使用しない他のフラビウイルス診断試験において偽陽性を示すことになることを示唆する。
５）ヒトジカ回復期血清によるＷＴデング－２外部ドメインおよびＷＴデング－４外部ドメインのオフターゲット認識は、オフターゲット認識が融合ループ特異的現象であることを示す４Ｇ２により完全にブロックされる。
６）デング熱回復期血清は、ＷＴ２およびＷＴ４を無差別に認識するが、４の組のうちのｄ２外部ドメインを明らかに好む。これにより、本発明の融合ループ抗原は、この融合ループのグリカンによる覆い隠しに起因して、デング血清型を識別するのに（この野生型の等価の形態を比較して）優れた選択性を有することが実証される。
【0151】
配列表フリーテキスト
【0152】
参考文献
国際公開第２０１６０１２８００Ａ１号パンフレット
Ｄａｌｚｉｅｌ，Ｍ．，Ｃｒｉｓｐｉｎ，Ｍ．，Ｓｃａｎｌａｎ，Ｃ．Ｎ．，Ｚｉｔｚｍａｎｎ，Ｎ．，＆Ｄｗｅｋ，Ｒ．Ａ．（２０１４）．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３（６１６６），１２３５６８１－１２３５６８１．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３５６８１
Ｄａｖｉｓ Ｃ Ｗ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｖｏｌ ２８１“Ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ－ｌｉｎｋｅｄ．．．．”ｐ３７１８３－３７１９４
Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗ．，Ｗｏｎｇｗｉｗａｔ，Ｗ．，Ｓｕｐａｓａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｄａｉ，Ｘ．，Ｒｏｕｖｉｎｓｋｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ，ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｒｅｍｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６（２），１７０－１７７．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｉ．３０５８
Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．，Ｌｏｒｅｎｚｉｎｉ，Ｔ．，Ａｓｈｅｒ，Ｓ．，Ａｏｋｉ，Ｋ．，Ｂｒａｎｋｏｗ，Ｄ．，Ｂｕｃｋ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（４），４１４－４２１．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｂｔ７９９
欧州特許出願公開第０６４０６１９Ａ１号明細書．（２０１０）．欧州特許出願公開第０６４０６１９Ａ１号明細書，１－６５．
Ｆｒｉｅｔｚｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｐｅａｂｏｄｙ，Ｄ．Ｓ．，＆Ｃｈａｃｋｅｒｉａｎ，Ｂ．（２０１６）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８，４４－４９．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｏｖｉｒｏ．２０１６．０３．００１
Ｈａｄｉｎｅｇｏｒｏ，Ｓ．Ｒ．，Ａｒｒｅｄｏｎｄｏ－Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｌ．，Ｃａｐｅｄｉｎｇ，Ｍ．Ｒ．，Ｄｅｓｅｄａ，Ｃ．，Ｃｈｏｔｐｉｔａｙａｓｕｎｏｎｄｈ，Ｔ．，Ｄｉｅｔｚｅ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ Ｄｅｎｇｕｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｎｄｅｍｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７３（１３），１１９５－１２０６．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１５０６２２３
Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．，Ｒｏｊａｎａｓｕｐｈｏｔ，Ｓ．，＆Ｓａｎｇｋａｗｉｂｈａ，Ｎ．（１９８３）．Ｏｒｉｇｉｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｎ ｉｎ ｄｅｎｇｕｅ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ，３２（１），１５４－１５６．
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Ｋｏｓｔｙｕｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．，Ｌｉｍ，Ｅ．Ｘ．Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｆｉｂｒｉａｎｓａｈ，Ｇ．，Ｎｇ，Ｔ．－Ｓ．，Ｏｏｉ，Ｊ．Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９９４
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Ｐａｕｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｃａｒｌｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｔａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂａｒｃｅｌｌｏｎａ，Ｃ．Ｍ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｃ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｐ．０５０１１２）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｊｏｕｒｎａｌｓ．
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Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａ，Ｉ．，Ｎｉｃｋｏｌｓ，Ｂ．，Ｈｉｄａｊａｔ，Ｒ．，Ｊｏｋｉｎｅｎ，Ｊ．，Ｌｕｋａｓｈｅｖｉｃｈ，Ｉ．Ｓ．，＆Ｐｕｓｈｋｏ，Ｐ．（２０１４）．Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４６８－４７０，２８－３５．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０７．０５０
国際公開第２０１６０１２８００Ａ１号パンフレット
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欧州特許出願公開第０６４０６１９Ａ１号明細書．（２０１０）．欧州特許出願公開第０６４０６１９Ａ１号明細書，１－６５．
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Ｋｏｓｔｙｕｃｈｅｎｋｏ，Ｖ．Ａ．，Ｌｉｍ，Ｅ．Ｘ．Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｆｉｂｒｉａｎｓａｈ，Ｇ．，Ｎｇ，Ｔ．－Ｓ．，Ｏｏｉ，Ｊ．Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔｕｒｅ．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１７９９４
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Ｐａｕｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｃａｒｌｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｔａｎ，Ａ．Ｌ．，Ｂａｒｃｅｌｌｏｎａ，Ｃ．Ｍ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｃ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｄｅｎｇｕｅ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｚｉｋａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｐ．０５０１１２）．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｊｏｕｒｎａｌｓ．
Ｒａｍｓａｕｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｗａｍｅｉｓ，Ｍ．，Ｆｉｒｂａｓ，Ｃ．，Ｍｕｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．，Ｐｕｔｎａｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｓａｆｅｔｙ，ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｅａｓｌｅｓ－ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖａｃｃｉｎｅ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ａｃｔｉｖｅ－ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ，ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－ｍａｎ ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１５（５），５１９－５２７．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ１４７３－３０９９（１５）７００４３－５
Ｒｏｂｙ Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｔｈ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｐｈａ Ｈｅｌｉｃｅｓ １，２，ａｎｄ ４ ｉｎ ｔｈｅ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓ Ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｓｅｃｒｅｔｅｓ Ｓｕｂｖｉｒａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．．．”Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｖｏｌ ８７（２３），１３０６３－１６０６９
Ｒｏｂｙ Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｒａｎｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｒｏｕｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，９５，２１７６－２０１９．
Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．Ｋ．（２０１６）．Ｔｈｅ Ｚｉｋａ Ｐａｎｄｅｍｉｃ－Ａ Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｓｔｏｒｍ？ ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１０（３）．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００４５８９
Ｓｉｒｏｈｉ，Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｓｕｎ，Ｌ．，Ｋｌｏｓｅ，Ｔ．，Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．，Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．，＆Ｋｕｈｎ，Ｒ．Ｊ．（２０１６）．Ｔｈｅ ３．８ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２（６２８４），４６７－４７０．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ５３１６
Ｔｒｅｇｏｎｉｎｇ，Ｊ．Ｓ．，＆Ｋｉｎｎｅａｒ，Ｅ．（２０１４）．Ｕｓｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｓ ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，２（６）．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｓｐｅｃ．ＰＬＡＳ－００２８－２０１４
Ｔｒｅｔｙａｋｏｖａ，Ｉ．，Ｎｉｃｋｏｌｓ，Ｂ．，Ｈｉｄａｊａｔ，Ｒ．，Ｊｏｋｉｎｅｎ，Ｊ．，Ｌｕｋａｓｈｅｖｉｃｈ，Ｉ．Ｓ．，＆Ｐｕｓｈｋｏ，Ｐ．（２０１４）．Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４６８－４７０，２８－３５．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０７．０５０
【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c-2d】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図3e】
【図3f】
【図3g】
【図3h】
【図4】
【図5a-5b】
【図5c】
【図5d】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【配列表】