特許 7121969 培養液保護用液状物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-10

(45)【発行日】2022-08-19

(54)【発明の名称】培養液保護用液状物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20220812BHJP

   C12N 5/073 20100101ALI20220812BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 F

C12N1/00 Z

C12N5/073

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2018030754

(22)【出願日】2018-02-23

(65)【公開番号】P2019141009

(43)【公開日】2019-08-29

【審査請求日】2021-02-04

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ＡＳＲＭ ２０１７ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ＆ Ｅｘｐｏ 平成２９年１０月３１日

(73)【特許権者】

【識別番号】509038108

【氏名又は名称】株式会社北里コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】110003111

【氏名又は名称】あいそう特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100089060

【弁理士】

【氏名又は名称】向山 正一

(72)【発明者】

【氏名】井上 太

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１５４６６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J. Dairy Sci.，2003年，Vol.86，p.2343-2351

【文献】Fertility and Sterility，2007年，Vol.88, No.3，p.741-743

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ ５／０７３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体細胞培養時に培養液を被覆する培養液保護用液状物であって、前記培養液保護用液状物は、室温で液体であり、芳香族炭化水素および硫黄化合物を実質的に含まない流動パラフィンと、前記流動パラフィンの酸化を抑制する抗酸化物質との混合物であり、前記抗酸化物質の添加量は、前記流動パラフィン１００重量部に対して、０．００５～０．１重量部であり、さらに、
前記培養液保護用液状物は、生体細胞である胚を被包した培養液の露出面を被覆する胚培養液保護用液状物であり、かつ容器内に分注された培養液の表面を被覆する胚培養液保護用液状物であり、前記流動パラフィンは、平均分子量が、２７０～３３０、４０℃における動粘度が、５～１５ｍｍ ^２ ／ｓ、比重が、０．８２～０．８５であることを特徴とする培養液保護用液状物。

【請求項2】

生体細胞培養時に培養液を被覆する培養液保護用液状物であって、前記培養液保護用液状物は、室温で液体であり、芳香族炭化水素および硫黄化合物を実質的に含まない流動パラフィンと、前記流動パラフィンの酸化を抑制する抗酸化物質との混合物であり、前記抗酸化物質の添加量は、前記流動パラフィン１００重量部に対して、０．００５～０．１重量部であり、さらに、
前記培養液保護用液状物は、生体細胞である胚を被包した培養液滴の表面を被覆する胚培養液保護用液状物であり、前記流動パラフィンは、平均分子量が、４００～４５０、４０℃における動粘度が、３５～４５ｍｍ ^２ ／ｓ、比重が、０．８５～０．８８であることを特徴とする培養液保護用液状物。

【請求項3】

前記抗酸化物質は、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ、ビタミンＢ誘導体、フラボノイド類、グルタチオン、セレン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、ポリフェノールより選択された少なくとも１種である請求項１または２に記載の培養液保護用液状物。

【請求項4】

前記培養液保護用液状物は、前記流動パラフィンと、前記抗酸化物質のみの混合物である請求項１ないし３のいずれかに記載の培養液保護用液状物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体細胞培養時（具体的には、胚培養時）に培養液を被覆する培養液保護用液状物に関する。

【背景技術】

【0002】

生体細胞培養、具体的には、胚培養において、胚の発育段階に合わせて複数種類の培養液を１～数日置きに交換することが一般的であった。最近では、培養液を交換することなく、数日間継続して胚培養が行われるシングルステップカルチャーメディウム法が用いられるようになってきた。
上記のシングルステップカルチャーメディウム法では、胚培養は、容器内に平板状に培養液を分注し上面を培養液保護用液状物（具体的には、ミネラルオイル）で被覆し、胚をミネラルオイルで被覆された培養液内に入れて行われる。また、胚培養は、容器の底部に、液滴状に培養液を分注し、それをミネラルオイルで被覆し、ミネラルオイルにより被包された培養液の中に胚を入れ培養することも行われている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１４－９０６９１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ミネラルオイルにより内部に胚を有する培養液を被覆することにより、培養液の水分蒸発を避け、ｐＨと浸透圧、さらには、培養液の形状（具体的には、液滴形状）を安定させることができる。しかし、培養液またはミネラルオイルを交換することなく継続培養した時に、ミネラルオイルの品質維持が難しく、ミネラルオイルの品質低下は、胚の培養環境を低下させ、胚の死滅を招く可能性がある。
本発明の目的は、培養液保護用液状物（ミネラルオイル）の品質低下を抑制し、良好な生体細胞培養環境の維持を可能とする培養液保護用液状物を提供するものである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記目的を達成するものは、以下のものである。
（１） 生体細胞培養時に培養液を被覆する培養液保護用液状物であって、前記培養液保護用液状物は、室温で液体であり、芳香族炭化水素および硫黄化合物を実質的に含まない流動パラフィンと、前記流動パラフィンの酸化を抑制する抗酸化物質との混合物であり、前記抗酸化物質の添加量は、前記流動パラフィン１００重量部に対して、０．００５～０．１重量部であり、さらに、
前記培養液保護用液状物は、生体細胞である胚を被包した培養液の露出面を被覆する胚培養液保護用液状物であり、かつ容器内に分注された培養液の表面を被覆する胚培養液保護用液状物であり、前記流動パラフィンは、平均分子量が、２７０～３３０、４０℃における動粘度が、５～１５ｍｍ ^２ ／ｓ、比重が、０．８２～０．８５である培養液保護用液状物。
また、上記目的を達成するものは、以下のものである。
（２） 生体細胞培養時に培養液を被覆する培養液保護用液状物であって、前記培養液保護用液状物は、室温で液体であり、芳香族炭化水素および硫黄化合物を実質的に含まない流動パラフィンと、前記流動パラフィンの酸化を抑制する抗酸化物質との混合物であり、前記抗酸化物質の添加量は、前記流動パラフィン１００重量部に対して、０．００５～０．１重量部であり、さらに、
前記培養液保護用液状物は、生体細胞である胚を被包した培養液滴の表面を被覆する胚培養液保護用液状物であり、前記流動パラフィンは、平均分子量が、４００～４５０、４０℃における動粘度が、３５～４５ｍｍ ^２ ／ｓ、比重が、０．８５～０．８８であることを特徴とする培養液保護用液状物。

【0006】

（３） 前記抗酸化物質は、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、リコペン、ビタミンＡ、カロテノイド類、ビタミンＢ、ビタミンＢ誘導体、フラボノイド類、グルタチオン、セレン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、ポリフェノールより選択された少なくとも１種である上記（１）または（２）に記載の培養液保護用液状物。
（４） 前記培養液保護用液状物は、前記流動パラフィンと、前記抗酸化物質のみの混合物である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の培養液保護用液状物。

【発明の効果】

【0008】

本発明の生体細胞培養時に培養液を被覆する培養液保護用液状物は、室温で液体である流動パラフィンを主成分とし、さらに、流動パラフィンの酸化を抑制する抗酸化性物質を含有している。
生体細胞の培養時に培養液をこの培養液保護用液状物により被覆することにより、培養液の水分蒸発を抑制し、ｐＨと浸透圧を安定させ、さらに、継続培養中における流動パラフィンの劣化を防止し、流動パラフィンの変性に起因するミネラルオイルの品質低下を抑制する。これにより、本発明の培養液保護用液状物は、良好な生体細胞培養環境の維持を可能とする。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明の培養液保護用液状物を、実施例を用いて説明する。
本発明の培養液保護用液状物は、生体細胞培養時に培養液を被覆する培養液保護用液状物である。本発明の培養液保護用液状物は、室温で液体である流動パラフィンを主成分とし、さらに、流動パラフィンの酸化を抑制する抗酸化性物質を含有している。
本発明の培養液保護用液状物は、生体細胞培養時（具体的には、胚培養時）に培養液を被覆し、培養液の水分蒸発を抑制し、ｐＨと浸透圧を安定させ、液滴培地においてはその形状を維持する。

【0010】

流動パラフィンとしては、常温（２５℃）で液状の炭素数１２～３５の炭化水素化合物の混合物が好適に使用される。特に、炭化水素化合物は、飽和炭化水素化合物であることが好ましい。また、培養液保護用液状物として、言い換えれば、流動パラフィンとして、芳香族炭化水素および硫黄化合物を実質的に含まないものが好ましい。また、流動パラフィンとしては、軽質流動パラフィンおよび重質流動パラフィンのどちらも使用することができる。

【0011】

また、流動パラフィンは、平均分子量が、２００～５００のものが好ましく、特に、２５０～４５０が好ましい。また、流動パラフィンは、４０℃における動粘度が、７～４５ｍｍ^２／ｓであることが好ましく、特に、８～４２ｍｍ^２／ｓであることが好ましい。また、流動パラフィンは、比重が、０．８２～０．８９であることが好ましい。

【0012】

具体的には、軽質流動パラフィンとしては、平均分子量が、２７０～３３０、４０℃における動粘度が、５～１５ｍｍ^２／ｓ、比重が、０．８２０～０．８４５であるものが好ましい。また、重質流動パラフィンとしては、平均分子量が、４００～４５０、４０℃における動粘度が、３５～４５ｍｍ^２／ｓ、比重が、０．８５５～０．８９０であるものが好ましい。

【0013】

本発明の培養液保護用液状物が使用される培養法としては、シングルステップカルチャーメディウム法に限らず、ミネラルオイルを用いる他の培養法において用いることができる。また、使用する培地形態としては、液滴（マイクロドロップ）法、平板法（積層法、重層法）のいずれにも使用できる。

【0014】

マイクロドロップ法では、容器底面に培養液の液滴を作製し、露出する培養液の表面を本発明の培養液保護用液状物により被覆し、液滴状の培養液中に胚を保持して培養する。平板法では、容器の底部全体に平板状に培養液を分注し、露出する培養液の上面に本発明の培養液保護用液状物を積層して表面を被覆し、平板状の培養液中に胚を保持して培養する。

【0015】

本発明の培養液保護用液状物が、生体細胞を保持した液滴状培養液の表面を被覆する胚培養液保護用液状物、言い換えれば、マイクロドロップ法に使用する培養液保護用液状物の場合には、流動パラフィンとして、平均分子量が、２７０～３３０、４０℃における動粘度が、５～１５ｍｍ^２／ｓ、比重が、０．８２０～０．８４５のものを用いることが好ましい。

【0016】

また、本発明の培養液保護用液状物が、容器内に平板状に分注された培養液の表面を被覆する胚培養液保護用液状物、言い換えれば、平板法（積層法、重層法）に使用する培養液保護用液状物の場合には、流動パラフィンとして、平均分子量が、４００～４５０、４０℃における動粘度が、３５～４５ｍｍ^２／ｓ、比重が、０．８５５～０．８９０のものを用いることが好ましい。

【0017】

そして、本発明の培養液保護用液状物は、主成分である流動パラフィンに対する抗酸化作用を有する物質（抗酸化物質）が添加されている。抗酸化物質としては、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、ビタミンＣ、ビタミンＣ誘導体、リコペン、ビタミンＡ類、カロテノイド類、ビタミンＢ、ビタミンＢ誘導体、フラボノイド類、グルタチオン、セレン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、ポリフェノールより選択された少なくとも１種が好適である。また、抗酸化物質は、上記より選択した２種以上のものを添加してもよい。

【0018】

抗酸化物質としては、油溶性（脂溶性）、親油性のものが好ましい。油溶性ビタミンとしては、ビタミンＡ類、プロビタミンＡ類、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体、油溶性ビタミンＢ誘導体、油溶性ビタミンＣ誘導体が挙げられる。特に、抗酸化物質としては、ビタミンＥ、ビタミンＥ誘導体が好ましく、さらに、トコフェロールもしくは酢酸トコフェロールが好適である。

【0019】

ビタミンＥもしくはビタミンＥ誘導体としては、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、δ－トコフェロール、ＤＬ－α－トコフェロール、Ｄ－δ－トコフェロールなどのトコフェロール、酢酸ＤＬ－α－トコフェロール、コハク酸ＤＬ－α－トコフェロール、ＤＬ－α－トコフェロールカルシウム、ニコチン酸ＤＬ－α－トコフェロール、リノール酸ＤＬ－α－トコフェロールなどのビタミンＥ誘導体が好適である。

【0020】

ビタミンＣとしては、アスコルビン酸が、ビタミンＣ誘導体としては、テトラ2－へキシルデカン酸Ｌ－アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル、テトライソステアリン酸アスコルビルなどの油溶性ビタミンＣ誘導体が好適である。

【0021】

ビタミンＡ類としては、レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコペン（プロビタミンＡ）が挙げられる。また、カロテノイド類としては、カロテン、リコペン、フコキサンチン、アスタキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、β－クリプトキサンチン等が挙げられる。

【0022】

ビタミンＢもしくはビタミンＢ誘導体としては、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ナイアシン（ニコチン酸、ニコチン酸アミド）、パントテン酸、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）などが挙げられる。

【0023】

フラボノイド類としては、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノール、カテキン、オーロン、アントシアニジン、カルコン、ジヒドロカルコンなどが挙げられる。

【0024】

また、本発明の培養液保護用液状物における抗酸化物質の添加量（含有量）は、流動パラフィン１００重量部に対して、０．００１～０．１重量部であることが好ましく、特に、０．００５～０．０５重量部が好ましい。本発明の培養液保護用液状物は、流動パラフィンに所定量の抗酸化物質を添加し、十分撹拌することにより作成される。また、少量の流動パラフィンに、所定量の抗酸化物質を添加した抗酸化物質高濃度含有流動パラフィンを作成し、残量の流動パラフィンに、抗酸化物質高濃度含有流動パラフィンを添加し、撹拌することにより、作成することもできる。

【実施例】

【0025】

（実施例１）
流動パラフィン［比重０．８３８，動粘度９．９７６ｍｍ^２／ｓ（４０℃）、平均分子量３００、流動点－１２．５℃、日本薬局方に適合］１００重量部に、ビタミンＥを０．０１重量部添加し、よく撹拌することにより、本発明の培養液保護用液状物を作成した。

【0026】

（実施例２）
流動パラフィン［比重０．８６１，動粘度３９．３０ｍｍ^２／ｓ（４０℃）、平均分子量４３０、流動点－１２．５℃、日本薬局方に適合］１００重量部に、ビタミンＥを０．０１重量部添加し、よく撹拌することにより、本発明の培養液保護用液状物を作成した。

【0027】

（比較例１）
流動パラフィン［比重０．８３８，動粘度９．９７６ｍｍ^２／ｓ（４０℃）、平均分子量３００、流動点－１２．５℃、日本薬局方に適合］を培養液保護用液状物として用いた。

【0028】

（実験１）
培養液として、下記配合のHuman Tubal Fluid（HTF）を準備した。
ＨＴＦの内容（塩化カルシウム二水和物2.04mM、塩化カリウム5.06mM、リン酸二水素カリウム0.37mM、硫酸マグネシウム七水和物0.2mM、塩化ナトリウム110.37mM、炭酸水素ナトリウム148.33mM、デキストロース2.78mM、DL-乳酸ナトリウム21.4mM、ピルビン酸ナトリウム0.33mM、HEPES1.19mM）
実験用細胞としては、マウス初期胚（Ｂ６Ｃ３Ｆ１×Ｂ６Ｄ２Ｆ１）を準備した。

【0029】

シャーレに、培養液を、平板状に分注し、培地に、マウス初期胚（Ｂ６Ｃ３Ｆ１×Ｂ６Ｄ２Ｆ１）９３個を移動し、マウス胚を保持した平板状培地の露出面を実施例１の培養液保護用液状物により被覆したもの、比較例１の培養液保護用液状物により被覆したものを作成した。被覆した培養液保護用液状物より、被覆後、０時間（被覆直後）、２４時間、９６時間後に、それぞれの培養液保護用液状物を採取し、エンドトキシン試験、硫酸呈色反応、ＰＯＶ試験を行った。また、生物学的試験を行い、胚発生率を確認した。

【0030】

比較例１の培養液保護用液状物を用いた培養において、培養０時間、２４時間後に、培養液保護用液状物を採取し測定した結果、エンドトキシンは検出限界値の０．００１ＥＵ以下、硫酸呈色反応試験（－）、ＰＯＶは検出限界値０．１ｍｅｑ／ｋｇ以下であった。一方で、培養９６時間後に採取した比較例１の培養液保護用液状物のエンドトキシンは０．００１ＥＵ以下、硫酸呈色反応試験（－）で０、２４時間後と同様であったが、ＰＯＶは０．３ｍｅｑ／ｋｇと高かった。また、生物学的試験の結果マウス胚の分割率は、９３．５％（８７／９３）、胚盤胞発生率は、８７．０％（８１／９３）であった。

【0031】

実施例１の培養液保護用液状物を用いた培養において、培養０時間、２４時間後、９６時間後に、培養液保護用液状物を採取しエンドトキシン、硫酸呈色反応、ＰＯＶを測定したところ、エンドトキシンは、検出限界値の０．００１ＥＵ以下、硫酸呈色反応試験（－）、ＰＯＶは検出限界値０．１ｍｅｑ／ｋｇ以下であった。また、生物学的試験の結果マウス胚の分割率は、１００％（９３／９３）、胚盤胞発生率は、１００％（９３／９３）と比較例１よりも有意に分割率、胚盤胞発生率が高く（Ｐ＜０．０１）マウス胚発生率が良好であった。

【0032】

（実験２）
培養液および実験用細胞としては、実験１と同じものを用いた。

【0033】

シャーレの底面に、複数の液滴状培養液を形成し、その中に、総数５０個のマウス初期胚を入れ、各液滴状培地の露出面を実施例２の培養液保護用液状物で被覆し、培養した。実施例２の培養液保護用液状物を用いた培養において、培養０時間、２４時間後、９６時間後に、培養液保護用液状物を採取しエンドトキシン、硫酸呈色反応、ＰＯＶを測定したところ、エンドトキシンは、検出限界値の０．００１ＥＵ以下、硫酸呈色反応試験（－）、ＰＯＶは検出限界値０．１ｍｅｑ／ｋｇ以下であった。また、生物学的試験の結果マウス胚の分割率は、１００％（５０／５０）、胚盤胞発生率は、１００％（５０／５０）であった。