ホーム > 特許ランキング > ＮＥＵＲＯ－ＢＩＯ ＬＴＤ
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-16
(45)【発行日】2022-08-24
(54)【発明の名称】神経変性障害の治療に使用するための改変ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 5/08 20060101AFI20220817BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20220817BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220817BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220817BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220817BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20220817BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20220817BHJP
【ＦＩ】
C07K5/08 ZNA
A61K38/06
A61P25/00 101
A61P25/16
A61P25/28
A61P25/14
A61P25/18
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2019509482
(86)(22)【出願日】2017-08-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-11-07
(86)【国際出願番号】 GB2017052407
(87)【国際公開番号】W WO2018033724
(87)【国際公開日】2018-02-22
【審査請求日】2020-08-14
(31)【優先権主張番号】1613999.0
(32)【優先日】2016-08-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1701455.6
(32)【優先日】2017-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】516008992
【氏名又は名称】ニューロ－バイオ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＵＲＯ－ＢＩＯ ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｆ５，Ｃｕｌｈａｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ ＯＸ１４ ３ＤＢ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】八田国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】グリーンフィールド，スーザン
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア－ラテス，サラ
(72)【発明者】
【氏名】モラル，ジーザス
(72)【発明者】
【氏名】コサノ，ロージャー
【審査官】進士 千尋
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５３７６９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５０３３１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５１７３７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－３４７９５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５０８４０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００１－５００４９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００２／０９２５６６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０１５９３６２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第０２／０１６４０８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００３－５０６４１１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ５／０８
Ａ６１Ｋ ３８／０６
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｐ ２５／１６
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ａ６１Ｐ ２５／１４
Ａ６１Ｐ ２５／１８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経変性障害の治療、改善、または予防に使用するための薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、式（Ｉ）：【化1】
の化合物、
式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【化2】
であり、
Ｒ３が、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
【化3】
であり、
Ｒ５が、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
【化4】
であり、
Ｒ７が、－Ｈまたは直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【化5】
であり、
前記または各Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ１１が、アリール基であり、
各ｎが、独立して０～１０である、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは互変異性体を含む、薬学的組成物。
【請求項2】
前記化合物が、式（Ｉａ）：【化6】
を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
Ｒ１が、－ＮＨ２である；Ｒ３が、－Ｈである；
Ｒ７が、－Ｈである；および／または
Ｒ８が、
【化7】
である、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
Ｒ２が、【化8】
である、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
Ｒ４が、【化9】
である；および／または
Ｒ５が、－Ｈである、請求項１～４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
Ｒ６が、【化10】
である、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記化合物が、式（１０１）、（１０３）、（１０１ａ）、または（１０３ａ）：【化11】
【化12】
の化合物である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型、および３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、レビー小体型認知症、および前頭側頭型認知症からなる群から選択される、請求項１～７のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項9】
式（Ｉ）の化合物：【化13】
式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【化14】
であり、
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
【化15】
であり、
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
【化16】
であり、
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【化17】
であり、
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは互変異性体。
【請求項10】
式（Ｉ）の化合物：【化18】
式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【化19】
であり、
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
【化20】
であり、
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
【化21】
であり、
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【化22】
であり、
Ｒ９およびＲ１０が、独立して－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは互変異性体。
【請求項11】
請求項９または１０に記載の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは互変異性体と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経変性障害に関し、特に、かかる病態、例えばアルツハイマー病を治療するための新規ペプチド、ペプチド模倣薬、組成物、治療法、および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
本発明者らは、神経変性プロセスが異常に活性化された発生プロセスであることを以前に提案した。この仮説を支持して、脳幹「ハブ」ニューロンの肥大がアルツハイマー脳で実際に報告されている（Ｂｏｗｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．７：７２３－３０）。このハブの大部分が損傷を受けると、よくあるが今のところ説明がつかない、アルツハイマー病とパーキンソン病の共通病理の症例で見られるように、複数の神経変性疾患が存在することになる。興味深いことに、グローバルニューロンの脆弱なハブ内のすべてのニューロンは、伝達物質の不均一性にもかかわらず、よく知られた酵素アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を含む。したがって、ノルアドレナリン作動性青斑核、ドーパミン作動性黒質、またはセロトニン作動性縫線核などの細胞のサブグループは、通常の基質であるアセチルコリンを含まないため、ＡＣｈＥはその正常な機能を果たすことができないニューロンに存在する。その通常の酵素的役割からのさらなる予想外の逸脱は、ＡＣｈＥが実際には、おそらくそれ自体がある種の細胞間メッセンジャーとしてグローバルニューロンから放出されることである。一般に、ＡＣｈＥは、神経組織および非神経組織の両方において多様な状況において栄養活性を有するシグナル伝達分子として広く確立されている。
【0003】
本発明者らは、その酵素作用とは無関係に栄養剤として作用するＡＣｈＥが、確かにニューロンへのカルシウム流入を誘発することを以前に示した。したがって、グローバルニューロン内で、ＡＣｈＥは量、利用可能期間、最も重要なことには年齢に応じて、栄養－毒性の軸に沿った二重の非古典的作用を有することが可能である。脳卒中のように、成人期に標準ニューロンが損傷を受けた場合、他のニューロンが機能的に補うだろう。それとは対照的に、グローバルニューロンは再生するためにそれらの栄養資源を要求することによって反応するだろう。しかし、その後のカルシウム流入は、より古い成熟細胞では致命的になるため、結果として生じる損傷は、神経変性を特徴付ける有害サイクルを補うためのさらなる試みを引き起こすだろう。
【0004】
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は様々な形態で異なる発達段階で発現され、それらはすべて同一の酵素活性を有するが、非常に異なる分子構成を有する。「末端付加（ｔａｉｌｅｄ）」（Ｔ－ＡＣｈＥ）はシナプスで発現され、本発明者らはＣ末端から切断されうる２つのペプチドを以前特定し、一方は「Ｔ１４」と称され、他方は「Ｔ３０」として知られ、両者はβアミロイドの相当領域と強い配列相同性を有する。ＡＣｈＥのＣ末端ペプチド「Ｔ１４」は、非加水分解作用の領域を担うＡＣｈＥ分子の突出部として特定されている。合成１４アミノ酸ペプチド類似体（すなわち「Ｔ１４」）、続いて、それが埋め込まれたより大きく、より安定で、より強力なアミノ酸配列（すなわち「Ｔ３０」）は、Ｔ３０配列内の不活性残基（すなわち「Ｔ１５」）が効果を有しない、「非コリン作動性」ＡＣｈＥとして報告されているものに相当する作用を示す。
【0005】
Ｔ１４およびＴ３０の急性作用は、それらが（ｉ）数ミリ秒から数時間スケールにわたって脳切片におけるニューロンへのカルシウム流入を調節し、（ｉｉ）インビトロでのＰＣ１２細胞および神経器官型培養の細胞生存性を低下させ、（ｉｉｉ）ニューロンおよびＰＣ１２細胞からの「代償的」カルシウム誘導性ＡＣｈＥ放出を調節し、（ｉｖ）脳切片の卵母細胞およびニューロンにおけるカルシウムの流れを活性化させ、（ｖ）毒性作用においてアミロイドと相乗作用し、かつ（ｖｉ）アミロイド前駆体タンパク質の産出およびアミロイドベータ（Ａβ）ペプチド放出に関与することである。Ｔ１４およびＴ３０の慢性作用は、それらが（ｉ）ニューロンの成長を抑制し、（ｉｉ）アポトーシスを誘導し、（ｉｉｉ）ＡＣｈＥ放出を増加させ、（ｉｖ）α７ニコチン性受容体（α－７ｎＣｈＲ受容体）に結合して調節し、かつ（ｖ）２４時間にわたって細胞表面上のα７受容体の発現を増強し、それによりさらなる毒性に対するフィードフォワードメカニズムを提供することである。
【0006】
Ｔ１４およびＴ３０は、毒性の誘発においてβアミロイドよりも選択的であり、またアミロイド増悪毒性とも相乗的であるため、Ｔ１４またはＴ３０の毒性作用を遮断するいかなる薬剤も、アミロイドの低選択性および後続する毒性作用を低減させるであろうと仮定された。本発明者は、Ｔ３０およびＴ１４ペプチドがα７ニコチン受容体上のアロステリック部位に結合して一連の栄養－毒性作用を誘発することを以前に示した。この受容体は、脳の発達の重要な時期にＡＣｈＥと共発現しているだけでなく、成人の脳内でもほぼ平行分布を示しており、脳内で最も強力なカルシウムイオノフォアの１つである。コリン（食事由来）は代替の一次リガンドとして役立ち得るので、それはコリン作動性伝達とは無関係に機能することもできる。さらに、この受容体は既に、現在の治療法のガランタミン（Ｒｅｍｉｎｙｌ（ＲＴＭ））の標的の１つとしてアルツハイマー病に関係があるとされており、ならびにアミロイドの作用に関連している。
【0007】
しかしながら、ガランタミンの有効性は限られていることが証明されており、他のα７ニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬はまだ臨床試験中である。ガランタミンは他の受容体に非特異的作用を及ぼし、かつＡＣｈＥを阻害するだけでなく、α７ニコチン性受容体に対して遥かに高い親和性（すなわち５ｎＭ）を有するＴ３０およびＴ１４のそれと比較して、α７ニコチン性受容体に対して低い親和性（すなわちわずか１０μＭ）を有する。したがって、アルツハイマー病の脳において、Ｔ３０ペプチドの内因性等価物が既にそれぞれの受容体部位を占めている場合、ガランタミンを、副作用が不可避であり、かつ最も重要なことには有効性が疑わしい非生理学的な高用量で与えることが必要となる。
【0008】
本発明者らは、ＷＯ２００５／００４４３０において、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）のＣ末端に由来するアミノ酸配列を含む環状ポリペプチドが、インビトロでのＡＣｈＥおよび／またはその末端ペプチドの非古典的作用（すなわち、その酵素活性とは無関係のＡＣｈＥの作用）を選択的に阻害し、したがって神経変性障害を治療するために使用することができることを以前に示している。例えば、「ＮＢＰ１４」と呼ばれる環状ペプチド（すなわち環状Ｔ１４ペプチド）は、ＡＣｈＥペプチドおよびアミロイドベータの作用に拮抗するα７ニコチン性受容体のアロステリックモジュレーターとして作用するので、特に活性であることが示されている。これは直鎖状Ｔ１４、Ｔ３０、およびβアミロイドの毒性から細胞を保護することが示され、直鎖状Ｔ１４およびＴ３０の毒性によって誘発される代償的ＡＣｈＥ放出を遮断する。さらに、単独で与えられた環状ＮＢＰ１４がラット脳切片中のＣａ２＋濃度に有意な影響を及ぼさないが、βアミロイドの作用を遮断することを観察した。しかしながら、環状ＮＢＰ１４によって示される活性にもかかわらず、そのサイズのために、治療薬としての使用のために血液脳関門を通過するその能力に関していくつかの懸念がある。
【0009】
したがって、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性障害の治療のための改善された薬剤を提供することに対する継続的な必要性がある。
【0010】
本発明者らは、環状ＮＢＰ－１４がＴ３０毒性作用およびβアミロイド産生に対して保護することを実証した、ＷＯ２００５／００４４３０に記載された以前の研究を続けた。α－７ｎＣｈＲ受容体に対する親和性を示し、したがって内因性の有毒なＴ３０ペプチドによるその活性部位への結合を遮断するであろう新規ペプチドおよびペプチド模倣薬を設計するためにインシリコ研究を行った。膨大な数の可能性のある候補化合物を分析した後、受容体と環状ＮＢＰ－１４との間の相互作用を見ることによりＴ３０毒性作用およびβアミロイド産生に対する保護に関連する化学的官能基を決定した。これらの実験に基づいて、本発明者らは、神経変性障害を治療するための驚くべき治療的有用性を有することが示されているいくつかの候補化合物を設計、合成、および試験した。
【0011】
本発明の第１の態様によれば、治療法に使用するための、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であって、
【0012】
【化1】
【0013】
式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【0014】
【化2】
【0015】
Ｒ３が、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0016】
【化3】
【0017】
Ｒ５が、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に－ＯＨまたは－ＮＨ２で置換された５員環を形成し、
Ｒ６が、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に－ＯＨまたは－ＮＨ２で置換された５員環を形成し、
Ｒ６が、
【0018】
【化4】
【0019】
Ｒ７が、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【0020】
【化5】
【0021】
Ｘ１が、－ＮＲ９Ｒ１０、－ＯＨ、または
【0022】
【化6】
【0023】
該または各Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ１１が、－ＮＨ２、－ＯＨ、またはアリール基であり、
該または各ｍが、独立して０～５であり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
Ｒ１１が、－ＮＨ２、－ＯＨ、またはアリール基であり、
該または各ｍが、独立して０～５であり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0024】
実施例に記載され、図９、１０および２６に示されるように、本発明による化合物は、カルシウム流入および／またはアセチルコリンエステラーゼ活性を低下させることによって、該化合物で治療される対象をＴ３０ペプチドの毒性作用から保護するように構成されることが好ましい。さらに、本発明による化合物は、βアミロイド産生に対して対象を保護するように構成されることが好ましい。したがって、本発明者らはまた、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、および（ＶＩ）の化合物が神経変性障害の治療に有用であることを見出した。
【0025】
したがって、第２の態様では、神経変性障害の治療、改善、または予防に使用するための、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0026】
さらに、第３の態様では、神経変性障害を治療、改善または予防する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相を投与することを含む方法が提供される。
【0027】
治療される神経変性障害は、好ましくは「グローバル」ニューロンの損傷または死を特徴とするものである。例えば、神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン疾患、脊髄小脳１型、２型、および３型、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、レビー小体型認知症、ならびに前頭側頭型認知症からなる群から選択されてもよい。
【0028】
好ましくは、治療される神経変性障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、または運動ニューロン疾患である。最も好ましくは、第１の態様によるペプチド、その誘導体または類似体で治療される神経変性障害はアルツハイマー病である。
【0029】
「塩」という用語は、その生物学的特性を保持し、毒性ではなく、または薬学的用途に望ましくないものではない、本明細書に提供される化合物の任意の塩を指すと理解され得る。そのような塩は、当技術分野において既知の様々な有機および無機対イオンから誘導してもよい。このような塩には、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンチルプロピオン酸、グリコール、グルタル酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ピクリン酸、桂皮酸、マンデル酸、フタル酸、ラウリン酸、メタン硫酸、エタンスルホン酸、１、２－エタン－ジスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４－クロロベンゼンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、樟脳酸、樟脳スルホン酸、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクト－２－エン－１－カルボン酸、グルコヘプトン酸、３－フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、安息香酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸、ムコン酸などの有機もしくは無機酸で形成される酸付加塩、あるいは（２）親化合物に存在する酸性プロトンが、（ａ）金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、もしくはアルミニウムイオン、または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化亜鉛、および水酸化バリウム、アンモニアなどのアルカリ金属水酸化物もしくはアルカリ土類金属水酸化物により置換されている場合、または（ｂ）アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレン－ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン、Ｎ－メチルグルカミンピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウムなどの脂肪族アミン、脂環式アミン、もしくは芳香族有機アミンなどの有機塩基を配位結合させる場合のいずれかに形成される塩基付加塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0030】
塩は、限定されるものではないが、例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどをさらに含むことができ、化合物が塩基性官能基を含む場合、ハロゲン化水素酸塩、例えば、塩酸塩および臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリクロロ酢酸塩、プロピオン酸塩、ヘキサン酸塩、シクロペンチルプロピオン酸塩、グリコール酸塩、グルタル酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、ソルビン酸塩、アスコルビン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、３－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸塩、ピクリン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、フタル酸塩、ラウリン酸塩、メタンスルホン酸塩（メシレート）、エタンスルホン酸塩、１、２－エタン－ジスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩（ベシル酸）、４－クロロベンゼンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホネート、４－トルエンスルホネート、カンホレート、カンファースルホネート、４－メチルビシクロ［２．２．２］－オクト－２－エン－１－カルボキシレート、グルコヘプトネート、３－フェニルプロピオネート、トリメチルアセテート、ｔｅｒｔ－ブチル酢酸塩、硫酸ラウリル、グルコン酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、キナ酸塩、ムコン酸塩などの無毒性の有機または無機酸の塩をさらに含むことができる。
【0031】
「溶媒和物」という用語は、非共有分子間力によって結合した化学量論量または非化学量論量の溶媒をさらに含む、本明細書に提供される化合物またはその塩を指すことが理解されよう。溶媒が水の場合、溶媒和物は水和物である。
【0032】
アリール基は芳香環由来の置換基を意味することが理解され得る。アリール基は、Ｃ６－Ｃ１２アリール基であり得る。好ましくは、アリール基はフェニル、ビフェニル、またはナフチルである。
【0033】
最も好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）、または（ＶＩａ）を有する。
【0034】
【化7】
【0035】
あるいは、化合物は、式（Ｉｂ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶｂ）、（Ｖｂ）または（ＶＩｂ）を有していてもよい。
【0036】
【化8】
【0037】
Ｒ１は、－ＯＨであり得る。しかしながら、好ましくは、Ｒ１は－ＮＲ９Ｒ１０であり、より好ましくはＲ１は－ＮＲ９Ｈであり、最も好ましくはＲ１は－ＮＨ２である。
【0038】
好ましくは、Ｒ２が
【0039】
【化9】
【0040】
である実施形態では、ｎは、好ましくは１～５である。したがって、ｎは１、２、３、４または５であり得、最も好ましくはｎは１である。
【0041】
好ましくは、Ｒ２が
【0042】
【化10】
【0043】
である実施形態では、ｎは１～７であり、より好ましくは２～６である。したがって、ｎは２、３、４、５または６であり得、好ましくはｎは３または４であり、最も好ましくは４である。
【0044】
好ましくは、Ｒ２は、
【0045】
【化11】
【0046】
より好ましくは、Ｒ２は、
【0047】
【化12】
【0048】
Ｒ２が
【0049】
【化13】
【0050】
である実施形態では、ｍは０、１、２、３、４または５であり得ることが理解されよう。好ましくは、ｍは１である。好ましくは、Ｘ１はパラ位にある。
【0051】
好ましい実施形態では、Ｒ２は、
【0052】
【化14】
【0053】
好ましくは、Ｒ２が
【0054】
【化15】
【0055】
である実施形態では、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも一方が－Ｈであり、最も好ましくはＲ９またはＲ１０の両方が－Ｈである。
【0056】
好ましくは、Ｒ２が
【0057】
【化16】
【0058】
である実施形態では、Ｒ１１がアリールであり、最も好ましくはフェニルである。
【0059】
好ましい実施形態では、Ｒ２が、
【0060】
【化17】
【0061】
最も好ましい実施形態では、Ｒ２が、
【0062】
【化18】
【0063】
Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、ブチルまたはペンチル基であり得ることが理解されよう。好ましくは、Ｒ３はメチルである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ３は－Ｈである。
【0064】
Ｒ４が
【0065】
【化19】
【0066】
である実施形態では、ｎは好ましくは１～５である。したがって、ｎは１、２、３、４または５であり得、好ましくは、ｎは１である。
【0067】
Ｒ４が
【0068】
【化20】
【0069】
である実施形態では、ｎは好ましくは１～７であり、より好ましくは２～６である。したがって、ｎは２、３、４、５または６であり得、好ましくはｎは３または４である。
【0070】
一実施形態では、Ｒ４は、好ましくは
【0071】
【化21】
【0072】
より好ましくは、Ｒ４は、
【0073】
【化22】
【0074】
Ｒ４が
【0075】
【化23】
【0076】
である実施形態では、ｍは０、１、２、３、４または５であり得ることが理解されよう。好ましくは、ｍは１である。好ましくは、Ｘ１はパラ位にある。
【0077】
好ましくは、Ｒ４は、
【0078】
【化24】
【0079】
である。
【0080】
より好ましくは、Ｒ４は、
【0081】
【化25】
【0082】
好ましくは、Ｒ４が
【0083】
【化26】
【0084】
である実施形態では、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも一方が－Ｈであり、最も好ましくはＲ９またはＲ１０の両方が－Ｈである。
【0085】
したがって、Ｒ４は、好ましくは
【0086】
【化27】
【0087】
より好ましくは、Ｒ４は、
【0088】
【化28】
【0089】
Ｒ５はメチル、エチル、プロピル、ブチルまたはペンチル基であり得ることが理解されよう。好ましくは、Ｒ５はメチルである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ５は－Ｈである。
【0090】
別の実施形態では、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に、－ＯＨまたは－ＮＨ２で置換された５員環を形成する。したがって、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に、以下の構造を定義することができ、
【0091】
【化29】
【0092】
式中、Ｘ２が－ＯＨまたは－ＮＨ２である。
【0093】
好ましくは、Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義することができる。
【0094】
【化30】
【0095】
好ましくは、Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義することができる。
【0096】
【化31】
【0097】
より好ましくは、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義することができる。
【0098】
【化32】
【0099】
好ましくは、Ｘ２は－ＮＨ２である。
【0100】
さらにより好ましくは、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義する。
【0101】
【化33】
【0102】
さらにより好ましくは、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義する。
【0103】
【化34】
【0104】
最も好ましくは、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義する。
【0105】
【化35】
【0106】
Ｒ６が
【0107】
【化36】
【0108】
である実施形態では、ｎは好ましくは１～５である。したがって、ｎは１、２、３、４または５であり得、好ましくは、ｎは１である。
【0109】
Ｒ６が
【0110】
【化37】
【0111】
である実施形態では、ｎは好ましくは１～７であり、より好ましくは２～６である。したがって、ｎは２、３、４、５または６であり得、好ましくはｎは３または４であり、最も好ましくはｎは３である。
【0112】
好ましくは、Ｒ６は、
【0113】
【化38】
【0114】
より好ましくは、Ｒ６は、
【0115】
【化39】
【0116】
Ｒ６が
【0117】
【化40】
【0118】
である実施形態では、ｍは０、１、２、３、４または５であり得ることが理解されよう。好ましくは、ｍは０である。より好ましくは、ｍは１である。好ましくは、Ｘ１はパラ位にある。
【0119】
好ましい実施形態では、Ｒ６が、
【0120】
【化41】
【0121】
好ましくは、Ｒ６が
【0122】
【化42】
【0123】
である実施形態では、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも一方は－Ｈであり、最も好ましくはＲ９またはＲ１０の両方が－Ｈである。
【0124】
好ましくは、Ｒ６が
【0125】
【化43】
【0126】
である実施形態では、Ｒ１１はアリールであり、最も好ましくはフェニルである。
【0127】
好ましい実施形態では、Ｒ６は、
【0128】
【化44】
【0129】
最も好ましい実施形態では、Ｒ６は、
【0130】
【化45】
【0131】
Ｒ７はメチル、エチル、プロピル、ブチルまたはペンチル基であり得ることが理解されよう。好ましくは、Ｒ７はメチルである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ７は－Ｈである。
【0132】
好ましい一実施形態では、Ｒ８は－Ｈである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ８は
【0133】
【化46】
【0134】
好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0135】
【化47】
【0136】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0137】
【化48】
【0138】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0139】
【化49】
【0140】
Ｒ６が、
【0141】
【化50】
【0142】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物が提供される。
【0143】
好ましくは、Ｒ３がＨであり、Ｒ７がＨである。
【0144】
いくつかの実施形態では、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0145】
【化51】
【0146】
Ｒ７はＨである。
【0147】
いくつかの別の実施形態では、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0148】
より好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0149】
【化52】
【0150】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0151】
【化53】
【0152】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0153】
【化54】
【0154】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物が提供される。
【0155】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0156】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0157】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0158】
別のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0159】
【化55】
【0160】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0161】
【化56】
【0162】
Ｒ６が、
【0163】
【化57】
【0164】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物を提供する。
【0165】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0166】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0167】
好ましくは、Ｒ３がＨであり、Ｒ７がＨである。
【0168】
別のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0169】
【化58】
【0170】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0171】
【化59】
【0172】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0173】
【化60】
【0174】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物が提供される。
【0175】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0176】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0177】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0178】
さらにより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0179】
【化61】
【0180】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0181】
【化62】
【0182】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0183】
【化63】
【0184】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物が提供される。
【0185】
好ましくは、化合物は式（Ｉｂ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶｂ）、（Ｖｂ）または（ＶＩｂ）の化合物である。
【0186】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉｂ）の化合物である。
【0187】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0188】
さらにより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0189】
【化64】
【0190】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0191】
【化65】
【0192】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0193】
【化66】
【0194】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物が提供される。
【0195】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0196】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0197】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0198】
好ましくは、Ｒ１が－ＯＨであり、Ｒ８がＨである。より好ましくは、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ８は
【0199】
【化67】
【0200】
さらにより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0201】
【化68】
【0202】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0203】
【化69】
【0204】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、あるいは
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0205】
【化70】
【0206】
Ｒ６が、
【0207】
【化71】
【0208】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルである、化合物が提供される。
【0209】
好ましくは、Ｒ３がＨであり、Ｒ７がＨである。
【0210】
いくつかの実施形態では、Ｒ３はＨであり、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0211】
【化72】
【0212】
Ｒ７はＨである。
【0213】
いくつかの別の実施形態では、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0214】
より好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0215】
【化73】
【0216】
Ｒ３が、Ｈであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0217】
【化74】
【0218】
Ｒ５が、Ｈであり、または
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0219】
【化75】
【0220】
Ｒ７はＨである、化合物が提供される。
【0221】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0222】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0223】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0224】
別のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0225】
【化76】
【0226】
Ｒ３が、Ｈであり、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0227】
【化77】
【0228】
Ｒ６が、
【0229】
【化78】
【0230】
Ｒ７はＨである、化合物が提供される。
【0231】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0232】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0233】
好ましくは、Ｒ３がＨであり、Ｒ７がＨである。
【0234】
別のより好ましい実施形態では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0235】
【化79】
【0236】
Ｒ３が、Ｈであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0237】
【化80】
【0238】
Ｒ５が、Ｈであり、または
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0239】
【化81】
【0240】
Ｒ７はＨである、化合物が提供される。
【0241】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0242】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0243】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0244】
さらにより好ましい態様では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0245】
【化82】
【0246】
Ｒ３が、Ｈであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0247】
【化83】
【0248】
Ｒ５が、Ｈであり、または
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0249】
【化84】
【0250】
Ｒ７はＨである、化合物が提供される。
【0251】
好ましくは、化合物は式（Ｉｂ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＶｂ）、（Ｖｂ）または（ＶＩｂ）の化合物である。
【0252】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉｂ）の化合物である。
【0253】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0254】
さらにより好ましい態様では、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ２が、
Ｒ２が、
【0255】
【化85】
【0256】
Ｒ３が、Ｈであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0257】
【化86】
【0258】
Ｒ５が、Ｈであり、または
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0259】
【化87】
【0260】
Ｒ７はＨである、化合物が提供される。
【0261】
好ましくは、化合物は式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、（Ｖａ）または（ＶＩａ）の化合物である。
【0262】
好ましくは、化合物は式（Ｉ）の化合物、さらに好ましくは式（Ｉａ）の化合物である。
【0263】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【0264】
好ましくは、Ｒ１が－ＯＨであり、Ｒ８がＨである。より好ましくは、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ８は
【0265】
【化88】
【0266】
好ましくは、化合物は、式（１０１）、（１０２）、（１０３）、（１０４）または（１０５）の化合物である。
【0267】
【化89】
【0268】
【化90】
【0269】
より好ましくは、化合物は式（１０１ａ）、（１０２ａ）、（１０３ａ）、（１０４ｂ）または（１０５ａ）の化合物である。
【0270】
【化91】
【0271】
【化92】
【0272】
式（１０１ａ）、（１０２ａ）、（１０３ａ）、（１０４ｂ）および（１０５ａ）の化合物はそれぞれ、実施例に記載されている化合物Ｔｒｉ０２～０６に対応することが理解されよう。
【0273】
該化合物はそれ自体新規であると考えられている。
【0274】
したがって、第４の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（Ｖ）の化合物であって、式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【0275】
【化93】
【0276】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0277】
【化94】
【0278】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0279】
【化95】
【0280】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【0281】
【化96】
【0282】
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0283】
第５の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【0284】
【化97】
【0285】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
Ｒ４およびＲ５が、それらが結合する窒素および炭素と共に以下の構造を定義し、
【0286】
【化98】
【0287】
Ｒ６が、
【0288】
【化99】
【0289】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【0290】
【化100】
【0291】
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0292】
第６の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【0293】
【化101】
【0294】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0295】
【化102】
【0296】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0297】
【化103】
【0298】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【0299】
【化104】
【0300】
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0301】
第７の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【0302】
【化105】
【0303】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0304】
【化106】
【0305】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0306】
【化107】
【0307】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【0308】
【化108】
【0309】
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0310】
第８の態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であって、式中、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
Ｒ１が、－ＮＲ９Ｒ１０または－ＯＨであり、
Ｒ２が、
【0311】
【化109】
【0312】
Ｒ３が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ４が、
Ｒ４が、
【0313】
【化110】
【0314】
Ｒ５が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ６が、
Ｒ６が、
【0315】
【化111】
【0316】
Ｒ７が、Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
Ｒ８が、－Ｈ、直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニル、または
【0317】
【化112】
【0318】
Ｒ９およびＲ１０が、独立して、－Ｈ、または直鎖もしくは分岐のＣ１－５アルキルもしくはアルケニルであり、
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
各ｎが、独立して０～１０である、化合物、
またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相が提供される。
【0319】
第４、第５、第６、第７および第８の態様の化合物のＲ基および式の定義のいずれも、第１、第２および第３の態様に関して上述したようにさらに限定され得ることが理解されよう。
【0320】
さらなる態様では、治療に使用するための第４、５、６、７および８の態様による化合物が提供される。
【0321】
なおさらなる態様では、神経変性障害を治療、改善、または予防するのに使用するための、第４、５、６、７および８の態様による化合物が提供される。
【0322】
本発明による化合物は、アルツハイマー病などの神経変性障害を治療、改善、または予防するための、単剤療法（すなわち、第１の態様によって定義される化合物の使用）で使用され得る薬剤において使用され得ることが理解されよう。あるいは、本発明による化合物は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤などのアルツハイマー病を治療、改善、または予防するための既知の療法の補助として、またはそれと組み合わせて使用してよい。
【0323】
本発明による化合物は、特に組成物の使用方法に応じて、いくつかの異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液剤、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与できる他の任意の適切な形態であり得る。本発明による薬剤のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容され、好ましくは血液脳関門を通過してペプチドの送達を可能にするものであるべきことが理解されよう。
【0324】
脳障害に対する任意の治療の効率は、候補治療化合物が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力に依存することが理解されよう。しかしながら、アルツハイマー病の間、本発明の化合物が中枢神経系、理想では本発明の化合物が必要とされる変性部位のみに、すなわちＢＢＢが損なわれているところに到達することを可能にし得る透過性を血液脳関門が増大させることは周知である。
【0325】
本発明のペプチドとＢＢＢを通過するために、以下を含む、２つの主な戦略を適用することができる：（１）トランスポーターが特異的に脳を標的にし、活性化合物を送達するナノ粒子の使用（この方法は、ペプチド、タンパク質および抗癌剤を脳に送達するために首尾よく使用されてきた）；および（２）カーゴペプチドの使用（ＢＢＢを通過して特異的に輸送されるそのようなペプチドの添加は、促進された方法による本発明の化合物の移動を可能にする）。
【0326】
本発明による化合物を含む薬剤は、いくつかの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされる場合があり、その場合、化合物は、例えば錠剤、カプセル剤または液剤の形態で経口摂取され得る組成物内に含まれ得る。鼻腔スプレーによるペプチド投与は、経口または静脈内投与方法よりも速くかつより効率的に脳に到達するので、化合物を投与するための別の選択肢は、鼻腔スプレーを使用することであろう（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｏｒｙｚｉｎｅ．ｃｏｍ／２０１０／０７／２６／ｎｏｓｅ－ｓｐｒａｙｓ－ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ－ｂａｒｒｉｅｒ－ｆａｓｔｅｒ－ａｎｄ－ｓａｆｅｒ／参照）。したがって、本発明の化合物を含む組成物は、吸入によって（例えば鼻腔内に）投与することができる。組成物はまた、局所使用のためにも製剤化され得る。例えば、クリームまたは軟膏を例えば脳に隣接して皮膚に塗布することができる。
【0327】
本発明による化合物はまた、徐放型または遅延型放出デバイスに組み込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入されてもよく、薬剤は数週間または数ヶ月にわたって放出されてもよい。デバイスは、治療部位、例えば頭部に少なくとも隣接して配置することができる。そのようなデバイスは、本発明に従って使用される化合物による長期治療が必要で、通常頻繁な投与を必要とする（例えば、少なくとも毎日の注射）場合に、特に有利であり得る。
【0328】
好ましい実施形態では、本発明による薬剤は、血流中への注射または治療を必要とする部位への直接注射によって対象に投与することができる。例えば、薬剤は少なくとも脳に隣接して注射することができる。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）、または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）であり得る。
【0329】
必要とされる化合物の量は、投与方法、ポリペプチドの生理化学的性質、および単独療法または併用療法で使用されるかどうかに依存する、化合物の生物学的活性および生物学的利用能によって決定されることが理解されよう。投与頻度はまた、治療される対象内の化合物の半減期によっても影響されるだろう。投与される最適投与量は、当業者によって決定されてよく、使用中の特定の化合物、薬学的組成物の強度、投与方法、および神経変性疾患の進行によって変わる。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む、治療される特定の対象によるさらなる要因は、投与量を調整する必要性をもたらすであろう。
【0330】
一般に、どのポリペプチドを使用するかに応じて、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の一日量の本発明による化合物を、神経変性疾患の治療、改善、または予防に使用することができる。より好ましくは、１日量は０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約０．１μｇ／ｋｇ～１０μｇ／ｋｇ体重である。
【0331】
化合物は、神経変性疾患の発症前、発症中または発症後に投与することができる。一日量は、単回投与（例えば、一日一回の注射または鼻腔スプレーの吸入）として与えられてよい。あるいは、化合物は１日に２回以上の投与を必要とし得る。一例として、化合物は、０．０７μｇ～７００ｍｇの一日量（すなわち、体重７０ｋｇと仮定して）を２回（または治療される神経変性疾患の重症度に応じて２回以上）投与することができる。治療を受けている患者は、起床時に最初の用量を服用し、次に夕方に（２回投与計画の場合）またはその後３～４時間間隔に２回目の用量を服用することができる。あるいは、徐放放出デバイスを使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による化合物の最適用量を患者に提供することができる。
【0332】
製薬業界で慣用されているもの（例えば、インビボ実験、臨床試験など）のような既知の手順を用いて、本発明による化合物の具体的な製剤および正確な治療計画（例えば薬剤の一日量および投与頻度など）を形づくることができる。本発明者らは、本発明の化合物の使用に基づいて、抗神経変性疾患組成物を最初に示唆したと考える。
【0333】
したがって、本発明の第９の態様では、第１の態様による化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体もしくは多形相、および薬学的に許容されるビヒクルを含む薬学的組成物が提供される。
【0334】
薬学的組成物は、好ましくは抗神経変性疾患組成物、すなわち、アルツハイマー病などの対象における神経変性障害の治療的改善、予防または治療に使用される薬学的製剤である。
【0335】
本発明はまた、第１０の態様では、治療有効量の第１の態様の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体、もしくは多形相と、薬学的に許容されるビヒクルとを接触させることを含む、第９の態様による薬学的組成物の製造方法を提供する。
【0336】
好ましくは、化合物は、式（１０１）、（１０２）、（１０３）、（１０４）、または（１０５）の化合物である。
【0337】
より好ましくは、化合物は式（１０１ａ）、（１０２ａ）、（１０３ａ）、（１０４ｂ）、または（１０５ａ）の化合物である。
【0338】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による薬剤は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えばウマ）、ペットを治療するために使用することができ、または他の獣医学的用途に使用することができる。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。
【0339】
化合物の「治療有効量」は、対象に投与したときに、神経変性障害病態を治療するため、または所望の効果を生み出すために必要とされる活性剤の量である任意の量である。
【0340】
例えば、使用される化合物の治療有効量は、約０．００１ｍｇ～約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇであり得る。化合物の量は、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの量であることが好ましい。
【0341】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、薬学的組成物を製剤するのに有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【0342】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含んでもよい。ビヒクルは封入材料でもあり得る。粉末剤では、ビヒクルは、本発明による微粉化活性剤と混合されている微粉化固体である。錠剤では、活性剤を必要な圧縮特性を有するビヒクルと適切な割合で混合し、所望の形状およびサイズに圧縮することができる。粉末剤および錠剤は、好ましくは最大９９％の活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルはゲルであってよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【0343】
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、薬学的組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、および加圧組成物を調製するのに使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、その両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁することができる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤などの他の適切な薬学的添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例には、水（上記の添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）、およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば分別ヤシ油および落花生油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルでもあり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【0344】
滅菌溶液または懸濁剤である液体薬学的組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射によって利用することができる。化合物は、滅菌水、食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して投与時に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物として調製することができる。
【0345】
本発明の化合物および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノレート、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびそのエチレンオキシドと共重合した無水物）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明に従って使用される化合物は、液体または固体組成物形態のいずれかで経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および散剤などの固体形態、ならびに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、乳剤、および懸濁剤が挙げられる。
【0346】
本明細書に記載のすべての特徴（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのすべてのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合せを除き、任意の組み合わせで上記態様のいずれかと組み合わせてよい。
【0347】
本発明をよりよく理解するために、また本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、添付の図面を例として参照する。
【図面の簡単な説明】
【0348】
【図1A】環状ペプチドＮＢＰ－１４に結合するα７ニコチン性受容体のアロステリック結合ポケット（すなわち活性部位）における４つの重要な領域（領域１、２、３および４）の表示、およびＮＢＰ－１４がＴ３０（図１ａ）またはアミロイド（図１ｂ）と競合するかどうかに応じて、これら４つの領域間のそれぞれの距離について異なる図を示す。
【図1B】環状ペプチドＮＢＰ－１４に結合するα７ニコチン性受容体のアロステリック結合ポケット（すなわち活性部位）における４つの重要な領域（領域１、２、３および４）の表示、およびＮＢＰ－１４がＴ３０（図１ａ）またはアミロイド（図１ｂ）と競合するかどうかに応じて、これら４つの領域間のそれぞれの距離について異なる図を示す。
【図2】極性に基づく色分けによるα７ニコチン性受容体結合ポケットの３Ｄ構造を示す。
【図3】領域１～４を示すα７ニコチン性受容体結合ポケットの棒モデル図を示す。
【図5A】α７ニコチン性受容体の各結合領域（領域１、２、３または４）での結合に関与するアミノ酸または化学機能の円グラフを示し、残基が不活性ペプチドを生じるかどうか、有毒なＴ３０に対して活性であるか、またはＡベータに対して活性であるかを示す。
【図5B】α７ニコチン性受容体の各結合領域（領域１、２、３または４）での結合に関与するアミノ酸または化学機能の円グラフを示し、残基が不活性ペプチドを生じるかどうか、有毒なＴ３０に対して活性であるか、またはＡベータに対して活性であるかを示す。
【図5C】α７ニコチン性受容体の各結合領域（領域１、２、３または４）での結合に関与するアミノ酸または化学機能の円グラフを示し、残基が不活性ペプチドを生じるかどうか、有毒なＴ３０に対して活性であるか、またはＡベータに対して活性であるかを示す。
【図5D】α７ニコチン性受容体の各結合領域（領域１、２、３または４）での結合に関与するアミノ酸または化学機能の円グラフを示し、残基が不活性ペプチドを生じるかどうか、有毒なＴ３０に対して活性であるか、またはＡベータに対して活性であるかを示す。
【図6A】異なる領域（領域１～４）で結合するアミノ酸間の距離を比較する。
【図6B】異なる領域（領域１～４）で結合するアミノ酸間の距離を比較する。
【図6C】異なる領域（領域１～４）で結合するアミノ酸間の距離を比較する。
【図6D】異なる領域（領域１～４）で結合するアミノ酸間の距離を比較する。
【図6E】異なる領域（領域１～４）で結合するアミノ酸間の距離を比較する。
【図6F】異なる領域（領域１～４）で結合するアミノ酸間の距離を比較する。
【図7】Ｔ３０毒性に対する保護を提供するのに特に関連性がある領域１、２、３および４のそれぞれに結合するための化学的官能基のリストである。
【図8】βアミロイド産生に対する保護を提供するのに特に関連性がある領域１、２、３および４のそれぞれに結合するための化学的官能基のリストである。
【図9】ペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）についての細胞培養データ（すなわち、アセチルコリンエステラーゼ活性）を示す。
【図10】ペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）についての細胞培養データ（すなわち、カルシウムイオン流入）を示す。
【図11】対照の環状ペプチドＮＢＰ－１４についての脳切片上の電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）の結果を示す。
【図12】ペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）についての脳切片上の電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）の結果を示す。
【図13A】脳切片に対する電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を使用した、それぞれのベースライン応答振幅に対するペプチドの添加によって誘発された変化の相関分析を示す。Ｔ３０によって誘発された応答振幅の変化は、それらのそれぞれのベースラインの振幅と負の相関があることがわかった（Ａ）。したがって、外因性ペプチドを灌流した各実験について次の相関分析を実施した。Ｂ）Ｔ１５、Ｃ）ＮＢＰ１４、Ｄ）Ｔｒｉ０２、Ｅ）ＮＢＰ１４の存在下でのＴ３０、およびＦ）Ｔｒｉ０２の存在下でのＴ３０。ｙ軸上の単位＝ΔＦ／Ｆ０、ｘ軸上の単位＝ΣδＦ／Ｆ０
【図13B】脳切片に対する電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を使用した、それぞれのベースライン応答振幅に対するペプチドの添加によって誘発された変化の相関分析を示す。Ｔ３０によって誘発された応答振幅の変化は、それらのそれぞれのベースラインの振幅と負の相関があることがわかった（Ａ）。したがって、外因性ペプチドを灌流した各実験について次の相関分析を実施した。Ｂ）Ｔ１５、Ｃ）ＮＢＰ１４、Ｄ）Ｔｒｉ０２、Ｅ）ＮＢＰ１４の存在下でのＴ３０、およびＦ）Ｔｒｉ０２の存在下でのＴ３０。ｙ軸上の単位＝ΔＦ／Ｆ０、ｘ軸上の単位＝ΣδＦ／Ｆ０
【図13C】脳切片に対する電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を使用した、それぞれのベースライン応答振幅に対するペプチドの添加によって誘発された変化の相関分析を示す。Ｔ３０によって誘発された応答振幅の変化は、それらのそれぞれのベースラインの振幅と負の相関があることがわかった（Ａ）。したがって、外因性ペプチドを灌流した各実験について次の相関分析を実施した。Ｂ）Ｔ１５、Ｃ）ＮＢＰ１４、Ｄ）Ｔｒｉ０２、Ｅ）ＮＢＰ１４の存在下でのＴ３０、およびＦ）Ｔｒｉ０２の存在下でのＴ３０。ｙ軸上の単位＝ΔＦ／Ｆ０、ｘ軸上の単位＝ΣδＦ／Ｆ０
【図14】Ｔｒｉ０２およびＴ３０の添加によって媒介される作用の定量化を示す。
【図15】基底前脳内の活性に対するＴ３０の作用を遮断する際に、Ｔ３０およびＮＢＰ１４の同時適用をＴｒｉ０２およびＴ３０のそれと比較したグラフを示す。ＮＢＰ１４の同時適用はＴ３０誘発作用を完全に遮断することができたが、Ｔｒｉ０２とＴ３０の同時適用は同様であるが弱められた調節応答を引き起こした。
【図16】ラット血液中の環状ＮＢＰ－１４についての薬物動態データを示す。
【図17】ヒト血液中の環状ＮＢＰ－１４についての薬物動態データを示す。
【図18】ラット血液中のペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）についての薬物動態データを示す。
【図19】ヒト血液中のペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）についての薬物動態データを示す。
【図20】ラット血液中のペプチド模倣化合物３（すなわちＴｒｉ０４）についての薬物動態データを示す。
【図21】ヒト血液中のペプチド模倣化合物３（すなわちＴｒｉ０４）についての薬物動態データを示す。
【図22】ラット血液中のプロカインについての薬物動態データを示す。
【図23】ヒト血液中のプロカインについての薬物動態データを示す。
【図24】ペプチド模倣化合物１（すなわちＴｒｉ０２）からの血液分解生成物を示す。
【図25】ペプチド模倣化合物３（すなわちＴｒｉ０４）からの血液分解生成物を示す。
【図26】ペプチド模倣化合物３（すなわちＴｒｉ０４）についての細胞培養データ（すなわち、カルシウムイオン流入）を示す。
【図27A】（Ａ）脳切片に対する電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いたベースライン応答振幅に対するペプチド（Ｔ３０およびＴｒｉ０４）の添加によって誘発された基底前脳の活性変化の時空マップを示す。（Ｂ）では、Ｔ３０およびＴｒｉ０４（２μＭ）を用いた記録についての基底前脳の誘発活性を、基底前脳におけるＴ３０単独の活性と比較したグラフを示す。
【図27B】（Ａ）脳切片に対する電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いたベースライン応答振幅に対するペプチド（Ｔ３０およびＴｒｉ０４）の添加によって誘発された基底前脳の活性変化の時空マップを示す。（Ｂ）では、Ｔ３０およびＴｒｉ０４（２μＭ）を用いた記録についての基底前脳の誘発活性を、基底前脳におけるＴ３０単独の活性と比較したグラフを示す。
【図28】ベースライン条件と比較した、Ｔ３０単独の存在下、またはＴ３０とその遮断剤であるＴｒｉ０４の同時適用後に行われた記録についての蛍光分数変化（応答時系列、ｎ＝２９）を示す。
【図29】４μＭの濃度で遮断剤Ｔｒｉ０４を用いた基底前脳の活性の棒グラフを示す。Ｔｒｉ０４の同時適用によって、ラットの基底前脳におけるＴ３０誘発作用を完全に遮断することができた。
【実施例】
【0349】
本発明者らは、α－７ｎＣｈＲ受容体に対する親和性を示し、そのため内因性の有毒なＴ３０ペプチド（ＫＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ－配列番号１）によるその活性部位への結合を遮断すると思われる新規ペプチドおよびペプチド模倣薬を設計するためにインシリコ研究を行った。インシリコ研究は、受容体と環状ＮＢＰ－１４（すなわちＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ－配列番号２）との間の相互作用を見ることによって、Ｔ３０毒性作用およびβアミロイド産生に対する保護に関連する化学的官能基を決定するのに役立ち、以前の研究（ＷＯ２００５／００４４３０参照）で証明されているように、それはこの保護を提供することが知られている。以下の実施例は、インシリコ研究、ならびにインビトロで同定および試験されている様々なペプチドおよびペプチド模倣物の構造を記載する。
【0350】
実施例１－α－７ｎＣｈＲ受容体を阻害する新規ペプチドを設計するためのインシリコ研究
薬物標的受容体に対するＮＢＰ－１４の親和性についてコンピューター分析を使用することにより、および構造に基づく研究により、本発明者らはＮＢＰ－１４と同様のインビトロ特性を有する一連のより小さな直鎖状ペプチド（配列番号２）を同定した。５９８個のこれらのより小さい直鎖状ペプチドと標的目的のα－７ｎＣｈＲ受容体との間の理論的相互作用が調べられている。ＮＢＰ－１４および前述のコンピューター分析から導かれた１６８個の直鎖状ペプチドを化学合成した。ＮＢＰ－１４および１６８個のペプチドのすべてをインビトロでＰＣ１２細胞においてスクリーニングした。これは神経分化および神経分泌研究のためのモデル系として日常的に使用されている。毒性および神経変性生物活性についてインビトロでスクリーニングを行い、後者はアセチルコリンエステラーゼ活性および細胞内カルシウムレベルをモニターすることによりスクリーニングを行った。これから、受容体への結合に関与する主要な化学的官能基を決定するためにＰＣ１２細胞上でインビトロで試験されたペプチドのインシリコ分析を用いて、Ｔ３０に対する神経変性保護特性を有する一連の新規分子の第二世代が同定された。
薬物標的受容体に対するＮＢＰ－１４の親和性についてコンピューター分析を使用することにより、および構造に基づく研究により、本発明者らはＮＢＰ－１４と同様のインビトロ特性を有する一連のより小さな直鎖状ペプチド（配列番号２）を同定した。５９８個のこれらのより小さい直鎖状ペプチドと標的目的のα－７ｎＣｈＲ受容体との間の理論的相互作用が調べられている。ＮＢＰ－１４および前述のコンピューター分析から導かれた１６８個の直鎖状ペプチドを化学合成した。ＮＢＰ－１４および１６８個のペプチドのすべてをインビトロでＰＣ１２細胞においてスクリーニングした。これは神経分化および神経分泌研究のためのモデル系として日常的に使用されている。毒性および神経変性生物活性についてインビトロでスクリーニングを行い、後者はアセチルコリンエステラーゼ活性および細胞内カルシウムレベルをモニターすることによりスクリーニングを行った。これから、受容体への結合に関与する主要な化学的官能基を決定するためにＰＣ１２細胞上でインビトロで試験されたペプチドのインシリコ分析を用いて、Ｔ３０に対する神経変性保護特性を有する一連の新規分子の第二世代が同定された。
【0351】
これらの化合物のドッキングは、α－７ｎＣｈＲ受容体のアロステリック部位で行われた。受容体中の結合ポケットは、図１～４に示されるように表すことができる４つの領域（領域１、２、３および４と示される）を含む。
【0352】
インシリコ分析は、ペプチド間の比較を含み、Ｔ３０毒性およびβアミロイド産生に対する保護に特異的な化学的特徴／官能基を決定し、不活性な化学的特徴から区別する。図２～４は、極性に基づく色分けを用いてα－７ｎＣｈＲの結合ポケットの３Ｄ構造について要約している。
【0353】
従った工程、ならびにその結果を以下にまとめる。
工程１：受容体の各特定領域に結合するアミノ酸の比較
この分析において、各領域は別々に考慮され、その領域に結合しているアミノ酸のみが考慮された。結合に関与するアミノ酸または化学的機能の円グラフを提示する、図５に示されるように、この工程は異なる領域で特異的に結合するアミノ酸を明らかにしなかった。
工程１：受容体の各特定領域に結合するアミノ酸の比較
この分析において、各領域は別々に考慮され、その領域に結合しているアミノ酸のみが考慮された。結合に関与するアミノ酸または化学的機能の円グラフを提示する、図５に示されるように、この工程は異なる領域で特異的に結合するアミノ酸を明らかにしなかった。
【0354】
工程２：異なる領域で結合するアミノ酸間の距離の比較
この分析において、アミノ酸間の距離は、結合に関与する化学的官能基を考慮に入れて測定される。図６に示されるこれらのデータは、不活性変異体と、Ｔ３０毒性に対する活性およびβアミロイド活性を有する変異体との間の距離の有意な変化を示さない。
この分析において、アミノ酸間の距離は、結合に関与する化学的官能基を考慮に入れて測定される。図６に示されるこれらのデータは、不活性変異体と、Ｔ３０毒性に対する活性およびβアミロイド活性を有する変異体との間の距離の有意な変化を示さない。
【0355】
工程３：結合に関与するアミノ酸の組み合わせの比較
この工程は、Ｔ３０毒性およびβアミロイド産生に対する保護に必要なアミノ酸の組み合わせとして、結合に関与するアミノ酸の分析を必要とする。
この工程は、Ｔ３０毒性およびβアミロイド産生に対する保護に必要なアミノ酸の組み合わせとして、結合に関与するアミノ酸の分析を必要とする。
【0356】
以下の表１および２に示す結果は、１８個のアミノ酸の組み合わせがＴ３０毒性に対する保護に必要であると思われ、３１個のアミノ酸の組み合わせがβアミロイド産生に対する保護に必要であると思われることを示す。
【0357】
【表1】
【0358】
【表2】
【0359】
これらの結果を考慮して、次に、本発明者らは、受容体の各領域（領域１～４）内の結合に関与するアミノ酸残基のランク付け、すなわちＴ３０毒性およびβアミロイド産生の両方に対する保護を提供するのに特に関連する化学的官能基を決定することができた。それぞれ図７および８を参照のこと。
【0360】
本発明者らは、各領域が表３にまとめられている特定の化学的官能基を必要とすると結論付けることができた。
【0361】
【表3】
【0362】
したがって、これらの知見を考慮して、本発明者らは、ニコチン性受容体の活性部位を優先的に遮断することによって内因性Ｔ３０の毒性作用を遮断すると思われる適切なペプチドを実証した。
【0363】
実施例２－ペプチド模倣薬の設計および製造
次いで、（実施例２に記載のペプチドと同様に）ニコチン性受容体のアロステリック活性部位についてＴ３０を上回る可能性がある新規のペプチド模倣化合物を設計および単離するために別のアプローチを使用した。そこで、α－７ｎＣｈＲ受容体のアロステリック部位の開始初期Ｘ線構造について溶媒マッピングを実施した計算において、さらなるインシリコ研究を行った。この分析は、結合部位における優先的な溶媒相互作用を解明すること、ならびにホットスポット（疎水性、芳香族、極性または荷電）の存在を突き止めることを目的とした。この方法によって、活性になるためにリガンドによって必要とされる予想される化学的特徴を同定した。
次いで、（実施例２に記載のペプチドと同様に）ニコチン性受容体のアロステリック活性部位についてＴ３０を上回る可能性がある新規のペプチド模倣化合物を設計および単離するために別のアプローチを使用した。そこで、α－７ｎＣｈＲ受容体のアロステリック部位の開始初期Ｘ線構造について溶媒マッピングを実施した計算において、さらなるインシリコ研究を行った。この分析は、結合部位における優先的な溶媒相互作用を解明すること、ならびにホットスポット（疎水性、芳香族、極性または荷電）の存在を突き止めることを目的とした。この方法によって、活性になるためにリガンドによって必要とされる予想される化学的特徴を同定した。
【0364】
ＩＰＲＯ溶媒分析は、結合部位の高い疎水性を明らかにした。ＩＰＲＯ溶媒マッピング予測とＴ１４ペプチドドッキングとの間の完全な重複が観察された。
【0365】
溶媒マッピング分析に基づいて、Ｔ１４構造を用いてトリペプチドおよびテトラペプチドの直鎖状ライブラリーを生成した。この段階で、さらなる評価のために５０万を超えるペプチド模倣薬を生成した。次に、ペプチド模倣薬をＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａドッキングエンジンによって評価した。理論的親和性ならびにリガンドの混同性（すなわち、低いイントラＲＭＳＤによって示される、複数の結合部位または異なる結合様式で結合する傾向）を分析に考慮した。この分析の結果、以下に示す５つの候補ペプチド模倣化合物が得られた。ここで、スコアが高い（絶対値）ほど、親和性が良くなり、化合物が活性である可能性が高くなる。
【0366】
化合物１－Ｔｒｉ０２（スコア：－１０．２）
【0367】
【化113】
【0368】
化合物２－Ｔｒｉ０３（スコア：－９．８）
【0369】
【化114】
【0370】
化合物３－Ｔｒｉ０４（スコア：－９．４）
【0371】
【化115】
【0372】
化合物４－Ｔｒｉ０５（スコア：－９．６）
【0373】
【化116】
【0374】
化合物５－Ｔｒｉ０６（スコア：－８．９）
【0375】
【化117】
【0376】
実施例３－同定された化合物の合成
材料および方法
実施例２の化合物１および３をＧｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（＞９９％純度）を用いて純度について、および質量分析法によって質量について分析した（Ｔｒｉ０２の平均ＭＳ６０４．７９、およびＴｒｉ０４の平均ＭＳ６２８．８３）。
Ｔｒｉ０２の合成の簡単な段階的説明－配列：［アセチル］－［２Ｎａｌ］［４ｎｈ２－Ｆ］－Ｔｒｐ－［アミド］
１）Ｂｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨ＋ＣｌｏｏＥｔ＋ＮＨ３・Ｈ２Ｏ－－－－－－Ｂｏｃ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、ＴＨＦ中で反応させ、酢酸エチルで抽出した。
材料および方法
実施例２の化合物１および３をＧｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（＞９９％純度）を用いて純度について、および質量分析法によって質量について分析した（Ｔｒｉ０２の平均ＭＳ６０４．７９、およびＴｒｉ０４の平均ＭＳ６２８．８３）。
Ｔｒｉ０２の合成の簡単な段階的説明－配列：［アセチル］－［２Ｎａｌ］［４ｎｈ２－Ｆ］－Ｔｒｐ－［アミド］
１）Ｂｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨ＋ＣｌｏｏＥｔ＋ＮＨ３・Ｈ２Ｏ－－－－－－Ｂｏｃ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、ＴＨＦ中で反応させ、酢酸エチルで抽出した。
【0377】
２）Ｂｏｃ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、４ＮＨｃｌ、Ｂｏｃ－を除去し、Ｈ－Ｔｒｐ－ＮＨ２．Ｈｃｌを得て、ジエチルエーテルによって沈殿反応させた。
【0378】
３）（２－ナフチル）－Ａｌａ＋酢酸無水物－－－－Ａｃ－（２－ナフチル）－Ａｌａ－ＯＨ、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏで反応させ、酢酸エチルで抽出した。
【0379】
４）Ｂｏｃ－（４－ＮＨ２）－Ｐｈｅ－ＯＨ＋Ｈ－Ｔｒｐ－ＮＨ２．Ｈｃｌ－－－－Ｂｏｃ－（４－ＮＨ２）－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、ＤＭＦ中で反応させ、酢酸エチルで抽出した。
【0380】
５）Ｂｏｃ－（４－ＮＨ２）－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２、４ＮＨｃｌ、Ｂｏｃ－を除去し、Ｈ－（４－ＮＨ２）－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２．Ｈｃｌを得て、ジエチルエーテルによって沈殿反応させた。
【0381】
６）Ａｃ－（２－ナフチル）－Ａｌａ－ＯＨ＋Ｈ－（４－ＮＨ２）－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２．Ｈｃｌ－－Ａｃ－（２－ナフチル）－Ａｌａ－（４－ＮＨ２）－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２をＤＭＦ中で反応させ、酢酸エチルで抽出した。
【0382】
７）精製
Ｔｒｉ０４の合成の簡単な段階的説明－配列：［アセチル］－［ｂｐａ］Ｒ［４ＮＨ２－Ｆ］－［アミド］
１）Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンをＤＣＭ中に３０分間浸漬し、ポンプで乾かし、ＤＭＦで３回洗浄し、ポンプで乾かした。
Ｔｒｉ０４の合成の簡単な段階的説明－配列：［アセチル］－［ｂｐａ］Ｒ［４ＮＨ２－Ｆ］－［アミド］
１）Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンをＤＣＭ中に３０分間浸漬し、ポンプで乾かし、ＤＭＦで３回洗浄し、ポンプで乾かした。
【0383】
２）Ｆｍｏｃ－（４－ＮＨ２）Ｐｈｅ－ＯＨ、ＤＩＥＡ、ＨＢＴＵ、ＤＭＦ、Ｎ２を加え、３０分間反応させ、ポンプで乾かし、ＤＭＦで６回洗浄し、ポンプで乾かした。
【0384】
３）ピペリジン／ＤＭＦを添加してＦｍｏｃ－を除去し、２０分間反応させ、ポンプ乾燥させ、ＤＭＦで３回洗浄し、ポンプ乾燥させた。
【0385】
４）Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、ＤＩＥＡ、ＨＢＴＵ、ＤＭＦ、Ｎ２を加え、３０分間反応させ、ポンプで乾かし、ＤＭＦで６回洗浄し、ポンプで乾かした。
【0386】
５）工程３を繰り返す。
【0387】
６）Ｆｍｏｃ－Ｂｐａ－ＯＨ、ＤＩＥＡ、ＨＢＴＵ、ＤＭＦ、Ｎ２を添加し、３０分間反応させ、ポンプで乾燥させ、ＤＭＦで６回洗浄し、ポンプで乾燥させた。
【0388】
７）工程３を繰り返す。
【0389】
８）無水酢酸／ＤＭＦ、Ｎ２を加え、３０分間反応させ、ポンプ乾燥し、３回ＤＭＦで洗浄し、ポンプ乾燥し、ＤＣＭで３回洗浄し、ポンプ乾燥し、ＭｅＯＨで３回洗浄し、ポンプ乾燥する。
【0390】
９）ペプチドを樹脂から切断し、ポンプ乾燥し、ジエチルエーテルで沈殿反応させ、粗ペプチドを得て、遠心乾燥する。
【0391】
１０）精製
実施例４－細胞培養における化合物１（Ｔｒｉ０２）および化合物３（Ｔｒｉ０４）の評価
本発明者らは、細胞培養試験において、Ｔ３０、ＮＢＰ－１４、およびＴｒｉ０２を試験して、アセチルコリンエステラーゼ活性およびカルシウム流入に対するそれらの作用、ならびにカルシウム流入に対するＴｒｉ０４の作用を調べた。
実施例４－細胞培養における化合物１（Ｔｒｉ０２）および化合物３（Ｔｒｉ０４）の評価
本発明者らは、細胞培養試験において、Ｔ３０、ＮＢＰ－１４、およびＴｒｉ０２を試験して、アセチルコリンエステラーゼ活性およびカルシウム流入に対するそれらの作用、ならびにカルシウム流入に対するＴｒｉ０４の作用を調べた。
【0392】
材料および方法
１．ＡＣｈＥ活性アッセイ
ＡＣｈＥ活性は、ＡＣｈＥ活性の結果としてチオール基の存在を測定するエルマン試薬を用いて測定した。Ｇ４実験の場合、ＡＣｈＥ（Ｇ４）活性を単独で試験し、またＮＢＰ１４またはトリペプチドのいずれかと共に試験した。細胞生存アッセイに関しては、実験の前日にＰＣ１２細胞をプレーティングした。細胞をＴ３０（１μＭ）単独で、またはＮＢＰ１４もしくはトリペプチド（０．５μＭ）と組み合わせて処理した。処理後、各処理の上清（灌流液）を収集し、各条件の２５μＬを新しい平底９６ウェルプレートに添加し、続いて１７５μｌのエルマン試薬（溶液Ａ：１３９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および７９．６６ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０；溶液Ｂ（基質）：１１．５ｍＭのヨウ化アセチルチオコリン；溶液Ｃ（試薬）：８ｍＭの５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）および１５ｍＭのＮａＨＣＯ３）を添加した。エルマン試薬は、３３（Ａ）：３（Ｂ）：４（Ｃ）の比で３つの溶液の混合物として調製した。吸光度測定は、Ｖｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）において４０５ｎｍで実験の間、６０分の間隔で行った。
１．ＡＣｈＥ活性アッセイ
ＡＣｈＥ活性は、ＡＣｈＥ活性の結果としてチオール基の存在を測定するエルマン試薬を用いて測定した。Ｇ４実験の場合、ＡＣｈＥ（Ｇ４）活性を単独で試験し、またＮＢＰ１４またはトリペプチドのいずれかと共に試験した。細胞生存アッセイに関しては、実験の前日にＰＣ１２細胞をプレーティングした。細胞をＴ３０（１μＭ）単独で、またはＮＢＰ１４もしくはトリペプチド（０．５μＭ）と組み合わせて処理した。処理後、各処理の上清（灌流液）を収集し、各条件の２５μＬを新しい平底９６ウェルプレートに添加し、続いて１７５μｌのエルマン試薬（溶液Ａ：１３９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および７９．６６ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０；溶液Ｂ（基質）：１１．５ｍＭのヨウ化アセチルチオコリン；溶液Ｃ（試薬）：８ｍＭの５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）および１５ｍＭのＮａＨＣＯ３）を添加した。エルマン試薬は、３３（Ａ）：３（Ｂ）：４（Ｃ）の比で３つの溶液の混合物として調製した。吸光度測定は、Ｖｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）において４０５ｎｍで実験の間、６０分の間隔で行った。
【0393】
２．カルシウム蛍光測定
実験前日に、９６ウェルプレートにおいてＰＣ１２細胞を、２００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２ｍＭのＬ－グルタミン培地に入れた。実験の日に、９ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）および１ｍｌのプルロニックＦ１２７プラスを含むアッセイ緩衝液中に２０μｌのＦｌｕｏ－８を添加することによって、供給者によリ記載されるようにＦｌｕｏ－８溶液（Ａｂｃａｍ）を調製した。その後、１００μｌの増殖培地を除去し、１００μｌのＦｌｕｏ－８溶液を添加した。ＮＢＰ１４またはトリペプチドと組み合わせたＴ３０による処理を加え、インキュベーター内で３０分間および室温で３０分間インキュベートした。１時間後、プレートを蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ、Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れた。蛍光を読み取る前に、ニコチン性受容体のα７特異的アゴニストである１μＭのＰＮＵ２８２９８７を調製し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ注射器に入れた。各ウェルについて、基礎蛍光の読みによって、続いてニコチン受容体を介してカルシウムの増加を誘発するＰＮＵ２８２９８７注射によって読みを形成した。
実験前日に、９６ウェルプレートにおいてＰＣ１２細胞を、２００μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２ｍＭのＬ－グルタミン培地に入れた。実験の日に、９ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）および１ｍｌのプルロニックＦ１２７プラスを含むアッセイ緩衝液中に２０μｌのＦｌｕｏ－８を添加することによって、供給者によリ記載されるようにＦｌｕｏ－８溶液（Ａｂｃａｍ）を調製した。その後、１００μｌの増殖培地を除去し、１００μｌのＦｌｕｏ－８溶液を添加した。ＮＢＰ１４またはトリペプチドと組み合わせたＴ３０による処理を加え、インキュベーター内で３０分間および室温で３０分間インキュベートした。１時間後、プレートを蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｔａｒ、Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に入れた。蛍光を読み取る前に、ニコチン性受容体のα７特異的アゴニストである１μＭのＰＮＵ２８２９８７を調製し、Ｆｌｕｏｓｔａｒ注射器に入れた。各ウェルについて、基礎蛍光の読みによって、続いてニコチン受容体を介してカルシウムの増加を誘発するＰＮＵ２８２９８７注射によって読みを形成した。
【0394】
３．データ分析
異なる細胞技術のそれぞれにおいて、３回以上の実験の百分率値の平均を用いて統計分析を行った。ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰＡＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、複数の処置群と同じ対照との比較を行った。統計学的有意性は、ｐ値＜０．０５で得た。
結果
Ｔｒｉ０２についての結果を図９および１０に示し、後続のグラフに示すｎ値はいくつかの反復実験を指す。見てわかるように、１μＭのＴ３０はカルシウム流入およびＡＣｈＥ活性を増加させ、そして以前の研究（ＷＯ２００５／００４４３０参照）に示されるように、１μＭのＮＢＰ１４はこれらの毒性作用に対して保護する。
異なる細胞技術のそれぞれにおいて、３回以上の実験の百分率値の平均を用いて統計分析を行った。ＧｒａｐｈＰＡＤ Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰＡＤ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキーの事後検定により、複数の処置群と同じ対照との比較を行った。統計学的有意性は、ｐ値＜０．０５で得た。
結果
Ｔｒｉ０２についての結果を図９および１０に示し、後続のグラフに示すｎ値はいくつかの反復実験を指す。見てわかるように、１μＭのＴ３０はカルシウム流入およびＡＣｈＥ活性を増加させ、そして以前の研究（ＷＯ２００５／００４４３０参照）に示されるように、１μＭのＮＢＰ１４はこれらの毒性作用に対して保護する。
【0395】
さらに、図に見られるように、Ｔｒｉ０２はまた、カルシウム流入およびＡＣｈＥ活性の両方を低下させることによってＴ３０の毒性作用に対して明らかに保護する。このように、本発明者らは、Ｔｒｉ０２が神経保護的であり、そのＮＢＰ－１４よりも小さいサイズのために、血液脳関門を通過する可能性がはるかに高いと確信している。
【0396】
Ｔｒｉ０４の結果を図２６に示す。見てわかるように、Ｔｒｉ０４はカルシウム流入を減らすことによってＴ３０の毒性作用も保護する。
実施例５－脳切片中の化合物１の評価
本発明者らは、電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いて脳切片研究においてＮＢＰ－１４およびＴｒｉ０２を試験した。
実施例５－脳切片中の化合物１の評価
本発明者らは、電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いて脳切片研究においてＮＢＰ－１４およびＴｒｉ０２を試験した。
【0397】
材料および方法
１．脳切片の調製
オスのウィスターラット（１４日齢）をイソフルラン（約１５ｍｌ、１００％ｗ／ｗ）を用いて麻酔した。イソフルランを麻酔容器（ガラス箱２０×１５×１５ｃｍ）の底の綿床に適用し、次いでそこにラットを完全な麻酔に達するまで約４５秒間置いた。各麻酔ラットの後足をつまんで適切な麻酔深度を調べた。麻酔を確認した後、ラットを素早く断頭し、脳を素早く取り出し、氷冷酸素添加「スライス」人工脳脊髄液に浸漬した。（ａＣＳＦ、ｍｍｏｌ換算：１２０ ＮａＣｌ、５ ＫＣＬ、２０ ＮａＨＣＯ３、２．４ ＣａＣｌ２ ２ ＭｇＳＯ４、１．２ ＫＨ２ＰＯ４、１０グルコース、６．７ ＨＥＰＥＳ塩および３．３ ＨＥＰＥＳ酸；ｐＨ＝７．１）。次に冠状切片（厚さ４００μｍ）を、前脳基底核、すなわちＭＳ－ｄＢＢ複合体（両耳間＋９．２０～＋９．４８ｍｍからブレグマ＋０．４８～＋０．２ｍｍの間、図４Ａ）および体性感覚バレル野皮質（Ｓ１ＢＦ、両耳間＋８．０８～＋７．２０ｍｍからブレグマ－０．９２ｍｍ～－１．８０ｍｍの間）（Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，１９９８）を含む脳のブロックからＶｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ）を使用して採取した。次に、ＶＳＤＩ（電圧感受性色素イメージング）記録で使用したものと同一の切片を室温で酸素化ａＣＳＦを含有するバブラーポットに移した（ｍｍｏｌでａＣＳＦを記録：１２４ ＮａＣｌ、５ ＫＣＬ、２０ ＮａＨＣＯ３、２．４ ＣａＣｌ２ ２ ＭｇＳＯ４、１．３ ＫＨ２ＰＯ４、１０グルコース；ｐＨ＝７．４）。次に、切片をＶＳＤ染色用に調製する前に約１～１．５時間放置した。
１．脳切片の調製
オスのウィスターラット（１４日齢）をイソフルラン（約１５ｍｌ、１００％ｗ／ｗ）を用いて麻酔した。イソフルランを麻酔容器（ガラス箱２０×１５×１５ｃｍ）の底の綿床に適用し、次いでそこにラットを完全な麻酔に達するまで約４５秒間置いた。各麻酔ラットの後足をつまんで適切な麻酔深度を調べた。麻酔を確認した後、ラットを素早く断頭し、脳を素早く取り出し、氷冷酸素添加「スライス」人工脳脊髄液に浸漬した。（ａＣＳＦ、ｍｍｏｌ換算：１２０ ＮａＣｌ、５ ＫＣＬ、２０ ＮａＨＣＯ３、２．４ ＣａＣｌ２ ２ ＭｇＳＯ４、１．２ ＫＨ２ＰＯ４、１０グルコース、６．７ ＨＥＰＥＳ塩および３．３ ＨＥＰＥＳ酸；ｐＨ＝７．１）。次に冠状切片（厚さ４００μｍ）を、前脳基底核、すなわちＭＳ－ｄＢＢ複合体（両耳間＋９．２０～＋９．４８ｍｍからブレグマ＋０．４８～＋０．２ｍｍの間、図４Ａ）および体性感覚バレル野皮質（Ｓ１ＢＦ、両耳間＋８．０８～＋７．２０ｍｍからブレグマ－０．９２ｍｍ～－１．８０ｍｍの間）（Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，１９９８）を含む脳のブロックからＶｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ）を使用して採取した。次に、ＶＳＤＩ（電圧感受性色素イメージング）記録で使用したものと同一の切片を室温で酸素化ａＣＳＦを含有するバブラーポットに移した（ｍｍｏｌでａＣＳＦを記録：１２４ ＮａＣｌ、５ ＫＣＬ、２０ ＮａＨＣＯ３、２．４ ＣａＣｌ２ ２ ＭｇＳＯ４、１．３ ＫＨ２ＰＯ４、１０グルコース；ｐＨ＝７．４）。次に、切片をＶＳＤ染色用に調製する前に約１～１．５時間放置した。
【0398】
２．ＶＳＤセットアップ
切片を、９５％のＯ２、５％のＣＯ２でバブリングされたａＣＳＦで満たされた暗くて高湿度の容器に入れた。そこに入ったら、染料溶液（４８％ａＣＳＦ、４８％ウシ胎児血清、３．５％ＤＭＳＯ、および０．４％クレモフォアＥＬ中、４％の０．２ｍＭスチリル染料ピリジニウム４－［２－［６－（ジブチルアミノ）－２－ナフタレニル］－エテニル］－１－（３－スルホプロピル）水酸化物（ジ－４－ＮＥＰＰＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００）を酸素化したａＣＳＦを含むバブラーポットに戻す前に２０～２５分間切片に適用し、３０分間室温に保った。
切片を、９５％のＯ２、５％のＣＯ２でバブリングされたａＣＳＦで満たされた暗くて高湿度の容器に入れた。そこに入ったら、染料溶液（４８％ａＣＳＦ、４８％ウシ胎児血清、３．５％ＤＭＳＯ、および０．４％クレモフォアＥＬ中、４％の０．２ｍＭスチリル染料ピリジニウム４－［２－［６－（ジブチルアミノ）－２－ナフタレニル］－エテニル］－１－（３－スルホプロピル）水酸化物（ジ－４－ＮＥＰＰＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００）を酸素化したａＣＳＦを含むバブラーポットに戻す前に２０～２５分間切片に適用し、３０分間室温に保った。
【0399】
ＶＳＤＩ記録を開始するとき、切片の下側に酸素化したａＣＳＦの流れを可能にし、それを生かしておくために、切片を小片の濾紙上の記録槽内に置いた。次に、切片の上に置かれた自家製のプラスチックグリッドによってスライスの重さを量った。灌流浴溶液をステージヒーターで３０±１℃に加熱した。同心両極性刺激電極（ＦＨＣ、Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を刺激を３０Ｖに設定して基底前脳の腹側対角線帯に配置した。ＶＳＤデータの取得のために、８８×６０ピクセルに相当する２次元画像を、ＢＶ＿Ａｎａｌｙｚｅイメージングソフトウェアを有するＭｉＣａｍ０２高解像度カメラ（Ｂｒａｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を使用して記録した。Ｍｉｃｒｏ１４０１ＭｋＩＩ（ＣＥＤ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）により、画像キャプチャを刺激プロトコル（２８秒おきに３０回繰り返し）に合わせるために、画像の取得は、Ｓｐｉｋｅ２ Ｖ４．２３ソフトウェア（ＣＥＤ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に接続した。オスラムハロゲンキセノフォト６４６３４ＨＬＸ ＥＦＲディスプレイ／光学ランプを使用して光を発生させ、ＭｉＣａｍ０２高解像度画像システムに接続したＭＨＦ－Ｇ１５０ＬＲ（Ｍｏｒｉｔｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、緑色（５３０±１０ｎｍ）の光を放出するように濾過し、５９０ｎｍを超えるハイパスフィルターを通して放出された蛍光を濾過した。
【0400】
３．薬の調製と適用
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）Ｃ末端３０アミノ酸ペプチド（Ｔ３０、配列：‘Ｎ’－ＫＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ－配列番号１）、Ｔ３０の活性１４アミノ酸領域の環状バージョン（ＮＢＰ１４；配列：ｃ［ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ］－配列番号２：ｃ［］＝環状、Ｎ末端からＣ末端）、およびＴ３０配列内に含まれる不活性１５アミノ酸ペプチド（Ｔ１５、配列：‘Ｎ’－ＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ－配列番号３）を純度９９％以上で特注合成し、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。直鎖状ペプチド模倣薬である、Ｔｒｉ０２は、Ｉｐｒｏｔｅｏｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）によってインシリコで設計され、合成され、９９％以上の純度でＧｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。実験前に、すべての薬物およびペプチドストックを凍結アリコートで調製した。灌流溶液の製造のために、保存溶液を解凍し、必要に応じてａＣＳＦを記録するために加え、Ｍｉｎｉｐｕｌｓｅ３蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、Ｂｅｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して１．５ｍｌ／分の一定灌流でバス適用した。各実験試行は５２分続き、ベースライン記録（ａＣＳＦ記録のみを伴う灌流）を確立するために２０分、薬液を浴中に灌流させ、ならびに染料分子を細胞膜に再配置させるために１２分間、最後に、薬液の存在下での応答を測定する記録時間に２０分間かかった。
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）Ｃ末端３０アミノ酸ペプチド（Ｔ３０、配列：‘Ｎ’－ＫＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ－配列番号１）、Ｔ３０の活性１４アミノ酸領域の環状バージョン（ＮＢＰ１４；配列：ｃ［ＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ］－配列番号２：ｃ［］＝環状、Ｎ末端からＣ末端）、およびＴ３０配列内に含まれる不活性１５アミノ酸ペプチド（Ｔ１５、配列：‘Ｎ’－ＮＱＦＤＨＹＳＫＱＤＲＣＳＤＬ－配列番号３）を純度９９％以上で特注合成し、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。直鎖状ペプチド模倣薬である、Ｔｒｉ０２は、Ｉｐｒｏｔｅｏｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）によってインシリコで設計され、合成され、９９％以上の純度でＧｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。実験前に、すべての薬物およびペプチドストックを凍結アリコートで調製した。灌流溶液の製造のために、保存溶液を解凍し、必要に応じてａＣＳＦを記録するために加え、Ｍｉｎｉｐｕｌｓｅ３蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、Ｂｅｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して１．５ｍｌ／分の一定灌流でバス適用した。各実験試行は５２分続き、ベースライン記録（ａＣＳＦ記録のみを伴う灌流）を確立するために２０分、薬液を浴中に灌流させ、ならびに染料分子を細胞膜に再配置させるために１２分間、最後に、薬液の存在下での応答を測定する記録時間に２０分間かかった。
【0401】
４．データ分析と統計
各薬物条件で生成された２次元画像から、活性化の時間経過、強度および全体の蛍光シグナルの広がりなどの重要なデータを抽出した。これらのデータをカスタムスクリプトを使用して使用可能なＭａｔＬａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）ファイルに変換し、次いでＶＳＤＩデータ分析用に特別に作られたＭａｔＬａｂツールボックスを使用して分析した（Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。このツールボックスでは、各実験で使用されるすべてのスライスにわたって同一のＲＯＩからデータを抽出して照合するために、すべての切片に適用できる固定関心領域（ＲＯＩ）ジオメトリを選択できる。基底前脳切片については、使用されるＲＯＩはＭＳｄＢＢ複合体であり、それはＭＳ（内側中隔核）、ＶＤＢ（腹側対角帯）およびＨＤＢ（水平対角帯）を含むように選択される。さらに重要なことに、このＲＯＩは誘発反応全体を含めるために選択された。この反応は、データの定性的記述を提供するために、単一の平均化された時系列として、または「時空間マップ」の時空間にわたってプロットできる。しかしながら、定量化可能な値を生成するために、刺激の瞬間（ｔ＝０）とその後の１５６ｍｓとの間の時系列の下の面積を計算した（合計蛍光分数変化）。各個々の切片間に見られる反応の変動性のために、各実験から生成された生データをそれ自体のベースラインに関して正規化して正規化蛍光値を得た。この定量方法は、ＶＳＤＩによって生成されたシグナルの複数の成分（Ｃｈｅｍｌａ ａｎｄ Ｃｈａｖａｎｅ，２０１０）、すなわち即時ピークおよび長潜時反応を説明するために選択された（Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。統計は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ６で行った。
各薬物条件で生成された２次元画像から、活性化の時間経過、強度および全体の蛍光シグナルの広がりなどの重要なデータを抽出した。これらのデータをカスタムスクリプトを使用して使用可能なＭａｔＬａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）ファイルに変換し、次いでＶＳＤＩデータ分析用に特別に作られたＭａｔＬａｂツールボックスを使用して分析した（Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。このツールボックスでは、各実験で使用されるすべてのスライスにわたって同一のＲＯＩからデータを抽出して照合するために、すべての切片に適用できる固定関心領域（ＲＯＩ）ジオメトリを選択できる。基底前脳切片については、使用されるＲＯＩはＭＳｄＢＢ複合体であり、それはＭＳ（内側中隔核）、ＶＤＢ（腹側対角帯）およびＨＤＢ（水平対角帯）を含むように選択される。さらに重要なことに、このＲＯＩは誘発反応全体を含めるために選択された。この反応は、データの定性的記述を提供するために、単一の平均化された時系列として、または「時空間マップ」の時空間にわたってプロットできる。しかしながら、定量化可能な値を生成するために、刺激の瞬間（ｔ＝０）とその後の１５６ｍｓとの間の時系列の下の面積を計算した（合計蛍光分数変化）。各個々の切片間に見られる反応の変動性のために、各実験から生成された生データをそれ自体のベースラインに関して正規化して正規化蛍光値を得た。この定量方法は、ＶＳＤＩによって生成されたシグナルの複数の成分（Ｃｈｅｍｌａ ａｎｄ Ｃｈａｖａｎｅ，２０１０）、すなわち即時ピークおよび長潜時反応を説明するために選択された（Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。統計は、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈｐａｄ６で行った。
【0402】
５．調節ペプチドの分析
Ｔ３０を使用した実験を通して、シグナルの増加または減少が観察された。したがって、これらの結果を平均しても、変化は検出されなかった。過去に観察された様々な調製物におけるこのペプチドの調節作用（ＢｏｎおよびＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００３、Ｄａｙ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２００４、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、およびこの種の調製物におけるＴ３０の適用によって誘発された変化という事実が、ベースラインの反応振幅とやや負の相関（ｒ＝－０．４２８６、ｐ＝０．０２５７、スピアマンの順位相関、ｎ＝２７、図１３Ａ）があることを考慮して、これらの結果は、増加または減少が見られるかどうかで、二分されるべきであると決定された。
Ｔ３０を使用した実験を通して、シグナルの増加または減少が観察された。したがって、これらの結果を平均しても、変化は検出されなかった。過去に観察された様々な調製物におけるこのペプチドの調節作用（ＢｏｎおよびＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００３、Ｄａｙ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２００４、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、およびこの種の調製物におけるＴ３０の適用によって誘発された変化という事実が、ベースラインの反応振幅とやや負の相関（ｒ＝－０．４２８６、ｐ＝０．０２５７、スピアマンの順位相関、ｎ＝２７、図１３Ａ）があることを考慮して、これらの結果は、増加または減少が見られるかどうかで、二分されるべきであると決定された。
【0403】
続いて、外因性化合物を添加した各実験について同様の相関分析を行った（図１３）。有意な相関関係が決定したら、データを増加または減少が見られるかどうかに基づいて分類した。
【0404】
結果
図２、１１および１２を参照すると、４μＭのＴｒｉ０２を添加すると、４μＭのＮＢＰ１４を適用した場合に見られる結果が再現される。
図２、１１および１２を参照すると、４μＭのＴｒｉ０２を添加すると、４μＭのＮＢＰ１４を適用した場合に見られる結果が再現される。
【0405】
図１１を参照すると、灌流液へのＮＢＰ１４（４μＭ）の添加は、誘発反応の大きさ（合計蛍光）への小さくて有意ではない変化を誘発した。重要ではないが、これらの小さな誘発変化はベースライン反応の大きさと逆相関することがわかった。その結果、データは、実際のデータ形式（上）と正規化されたデータ形式（下）の両方で、わずかな減少を引き起こした試験（左側のヒストグラム）と増加を引き起こした試験（右側のヒストグラム）に分けられた。一緒に考えれば、データセットはベースラインからの変化を示さないと思われるが（増加と減少は互いに打ち消し合うので）、それでも、蛍光変化を別々に考慮したとしても、ＮＢＰ１４によって有意な作用が引き起こされないことを確認することは重要だった。
【0406】
図１２に示すように、灌流液へのＴｒｉ０２（４μＭ）の添加は、誘発反応の大きさ（合計蛍光）に対する小さな変化を誘発し、誘発された減少（合計１１のうちｎ＝８）は正規化ベースラインレベル（左下のヒストグラム、ｐ＜０．０５）からの有意な偏差を示した。これらの変化はベースライン反応の大きさと逆相関することもわかった。その結果、データは、実際のデータ形式（上）と正規化されたデータ形式（下）の両方で、減少を引き起こした試験（左側のヒストグラム）と増加を引き起こした試験（右側のヒストグラム）に分けられた。一緒に考えれば、データセットはベースラインからの変化を示さないと思われるが（増加と減少は互いに打ち消し合うので）、それでも、蛍光変化を別々に考慮したとしても、ＮＢＰ１４によって有意な作用が引き起こされないことを確認することは重要だった。
【0407】
調節ペプチド模倣薬の分析
図１３を参照すると、Ｔｒｉ０２（４μＭ）およびＴ３０（２μＭ）のデータ（ｎ＝１５）についての相関分析が示されており、それらの共灌流は誘発反応の大きさにいくらかの変化を引き起こし、ほとんどがわずかな減少を示した（ｎ＝９）が、いくつかの切片では活性においてわずかに増加を示した（ｎ＝６）。この相関は有意であることが判明し（ｐ＝０．０４０５；ｒ２＝－０．５３４）、ＮＢＰ１４およびＴｒｉ０２の追加に対して行ったように（それぞれ図１１および１２）、データをＴｒｉ０２およびＴ３０適用の結果として誘発活性の増加および減少を示すものに分割する正当性を提供した。
図１３を参照すると、Ｔｒｉ０２（４μＭ）およびＴ３０（２μＭ）のデータ（ｎ＝１５）についての相関分析が示されており、それらの共灌流は誘発反応の大きさにいくらかの変化を引き起こし、ほとんどがわずかな減少を示した（ｎ＝９）が、いくつかの切片では活性においてわずかに増加を示した（ｎ＝６）。この相関は有意であることが判明し（ｐ＝０．０４０５；ｒ２＝－０．５３４）、ＮＢＰ１４およびＴｒｉ０２の追加に対して行ったように（それぞれ図１１および１２）、データをＴｒｉ０２およびＴ３０適用の結果として誘発活性の増加および減少を示すものに分割する正当性を提供した。
【0408】
図１４を参照すると、Ｔｒｉ０２およびＴ３０の添加によって媒介される作用の定量化が示されている。誘発された増加および減少の両方の場合において、Ｔｒｉ０２はベースラインからのＴ３０誘導偏差に対して保護することが見出されず、有意な減少（左パネル、ｐ＜０．０１、ｎ＝９）および増加（右パネル、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）が全体の効果において報告されている。
【0409】
図１５に示すように、正常ａＣＳＦ（黒色線）、２μＭのＴ３０（赤色線）、Ｔ３０（２μＭ）および４μＭのＮＢＰ１４（青色線）、Ｔ３０（２μＭ）および４μＭのＴｒｉ０２、対照ＮＢＰ１４（４μＭ）実験（図１１、オレンジ色の線）、対照Ｔｒｉ０２（４μＭ）実験（図１２、紫色の線）の作用を試験する実験についてのベースラインに対する正規化作用の全体的な線グラフ。このグラフは、ベースラインおよび互いに対する正規化減少を示し、Ｔ３０単独が最大の偏差を誘導し、Ｔｒｉ０２がそれらのＴ３０誘導偏差を遮断することにいくらかの有効性を示すが、それらの共灌流において有意な変化が依然としてある状態を示す。
【0410】
実施例６－薬物動態
本発明者らは、ラットおよびヒトの血液中のＮＢＰ－１４、Ｔｒｉ－０２、およびＴｒｉ－０４の分解生成物を調べた。
本発明者らは、ラットおよびヒトの血液中のＮＢＰ－１４、Ｔｒｉ－０２、およびＴｒｉ－０４の分解生成物を調べた。
【0411】
手順
試験化合物を、ＰＢＳまたはＰＢＳで希釈した血液（雄ウィスターラットまたはヒト）のいずれかに１０μｇ／ｍｌでスパイクし、一連のサンプルを以下のスキームに従って採取した。
試験化合物を、ＰＢＳまたはＰＢＳで希釈した血液（雄ウィスターラットまたはヒト）のいずれかに１０μｇ／ｍｌでスパイクし、一連のサンプルを以下のスキームに従って採取した。
【0412】
【表4】
【0413】
血中で不安定であることが知られている化合物、プロカインは、陽性対照として含まれていた（５倍希釈血液のみで実行）。サンプリング手順は、氷冷アセトニトリルにアリコートを加え、遠心分離し、分析まで上清をドライアイス上に保存することであった。インキュベーションが行われたのと同じ日に、エレクトロスプレーイオン化を使用するＵＨＰＬＣ－ＴＯＦ質量分析による分析を行った。
結果
プロカインは、５倍希釈のラットおよびヒトの血液においてそれぞれ６０％および１００％の代謝回転を示し、図２２および２３に示すように、使用した血液について許容可能な代謝能力を示した。
結果
プロカインは、５倍希釈のラットおよびヒトの血液においてそれぞれ６０％および１００％の代謝回転を示し、図２２および２３に示すように、使用した血液について許容可能な代謝能力を示した。
【0414】
ラットおよびヒトの血液中のＮＢＰ－１４、Ｔｒｉ－０２、およびＴｒｉ－０４についての安定性データを図１６～２１にプロットする。ＮＢＰ－１４は良好な安定性を示し、分解物は検出されなかった。Ｔｒｉ－０２は、５倍および２０倍希釈したラットおよびヒトの血液の両方においていくらかの不安定性を示し、図２４に示されるように様々な分解物が検出された。Ｔｒｉ－０４はＴｒｉ－０２よりも優れた安定性を示したが、それでもなお、図２５に示すように、５倍希釈のラット血液中に若干の分解物が検出された。したがって、Ｔｒｉ－０２およびＴｒｉ－０４は安定しており、優れた薬物候補である。
【0415】
実施例７－脳切片中の化合物３の評価
本発明者らは、電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いて脳切片研究においてＴｒｉ０４を試験した。
本発明者らは、電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いて脳切片研究においてＴｒｉ０４を試験した。
【0416】
材料および方法
１．脳切片の調製
実施例５と同様にして脳切片を調製した。
１．脳切片の調製
実施例５と同様にして脳切片を調製した。
【0417】
２．ＶＳＤセットアップ（設定）
切片を、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２をバブリングしたａＳＣＦで満たした暗くて高湿度の容器に入れた。入れた後、染料溶液（ａＣＳＦ４８％、ウシ胎児血清４８％、ＤＭＳＯ３．５％、およびクレモフォアＥＬ０．４％中、４％の０．２ｍＭスチリル染料ピリジニウム４－［２－［６－（ジブチルアミノ）－２－アフェレニル］－エテニル］－１－（３－スルホプロピル）水酸化物（ジ－４－ＡＮＥＰＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００））をａＣＳＦバブラーポット（室温、２２℃＋／－１．５℃）に１時間戻す前に、２０～２５分間切片に適用し、過剰の染料を洗い流して回収した。
切片を、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２をバブリングしたａＳＣＦで満たした暗くて高湿度の容器に入れた。入れた後、染料溶液（ａＣＳＦ４８％、ウシ胎児血清４８％、ＤＭＳＯ３．５％、およびクレモフォアＥＬ０．４％中、４％の０．２ｍＭスチリル染料ピリジニウム４－［２－［６－（ジブチルアミノ）－２－アフェレニル］－エテニル］－１－（３－スルホプロピル）水酸化物（ジ－４－ＡＮＥＰＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）（Ｔｏｍｉｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，２０００））をａＣＳＦバブラーポット（室温、２２℃＋／－１．５℃）に１時間戻す前に、２０～２５分間切片に適用し、過剰の染料を洗い流して回収した。
【0418】
ＶＳＤ記録を開始するとき、切片を生きたままに保つために切片を小さな濾紙上の記録槽内に置き、切片の上に置いた自家製プラスチックグリッドを用いて適切に秤量した。灌流浴溶液をステージヒーターで３０＋／－１℃に加熱した。同心両極性刺激電極（ＦＨＣ、Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を刺激を３０Ｖに設定して基底前脳の腹側対角線帯に配置した。ＶＳＤデータを取得するために、Ｓｐｉｋｅ２ Ｖ６．０（ＣＥＤ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と結合したＵｌｔｉｍａ２００４／０８画像ソフトウェア（Ｂｒａｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ）を備えたデジタルカメラ（Ｂｒａｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ＭｉＣＡＭ Ｕｌｔｉｍａ Ｒ３－Ｖ２０ Ｍａｓｔｅｒ）を用いて１ｍｓ解像度で１６ビット画像を記録し、適切なＩＳＩに関して刺激を引き起こすために使用された。オスラムハロゲンキセノフォト６４６３４ＨＬＸ ＥＦＲディスプレイ／光学ランプを使用して光を発生させ、ＭｉＣＡＭ Ｕｌｔｉｍａ超高速イメージングシステムに接続したＭＨＦ－Ｇ１５０ＬＲ（Ｍｏｒｉｔｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、緑色（５３０±１０ｎｍ）の光を放出するように濾光し、５９０ｎｍを超えるハイパスフィルターを通して放出された蛍光を濾光した。
【0419】
３．薬の調製と適用
直鎖状ペプチド模倣薬Ｔｒｉ０４は、Ｉｐｒｏｔｅｏｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によってインシリコで設計され、合成され、９９％以上の純度でＧｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。実験前に、すべての薬物およびペプチドストックを凍結アリコートで調製した。灌流溶液の製造のために、保存溶液を解凍し、必要に応じてａＣＳＦを記録するために加え、Ｍｉｎｉｐｕｌｓｅ３蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、Ｂｅｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して１．５ｍｌ／分の一定灌流でバス適用した。各実験試行は５２分続き、ベースライン記録（ａＣＳＦ記録のみを伴う灌流）を確立するために２０分、薬液を浴中に灌流させ、ならびに染料分子を細胞膜に再配置させるために１２分間、最後に、薬液の存在下での応答を測定する記録時間に１５分間かかった。
直鎖状ペプチド模倣薬Ｔｒｉ０４は、Ｉｐｒｏｔｅｏｓ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）によってインシリコで設計され、合成され、９９％以上の純度でＧｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された。実験前に、すべての薬物およびペプチドストックを凍結アリコートで調製した。灌流溶液の製造のために、保存溶液を解凍し、必要に応じてａＣＳＦを記録するために加え、Ｍｉｎｉｐｕｌｓｅ３蠕動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、Ｂｅｄｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して１．５ｍｌ／分の一定灌流でバス適用した。各実験試行は５２分続き、ベースライン記録（ａＣＳＦ記録のみを伴う灌流）を確立するために２０分、薬液を浴中に灌流させ、ならびに染料分子を細胞膜に再配置させるために１２分間、最後に、薬液の存在下での応答を測定する記録時間に１５分間かかった。
【0420】
５．調節ペプチドの分析
Ｔ３０が使用された実験の大部分を通して、シグナルの減少が観察された。Ｔ３０は、ｐ１４ラットの基底前脳において記録されたＶＳＤＩシグナルにおいて正味の阻害（ｎ＝２１）を誘発し、この値は実際にＴ３０灌流中にごくわずかまたはわずかにポジティブな効果が見られた少数の例を含む（Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１６）。
Ｔ３０が使用された実験の大部分を通して、シグナルの減少が観察された。Ｔ３０は、ｐ１４ラットの基底前脳において記録されたＶＳＤＩシグナルにおいて正味の阻害（ｎ＝２１）を誘発し、この値は実際にＴ３０灌流中にごくわずかまたはわずかにポジティブな効果が見られた少数の例を含む（Ｂａｄｉｎ ｅｔ ａｌ，２０１６）。
【0421】
結果および考察
図２７、２８および２９を参照すると、４μＭのＴｒｉ０４の添加は４μＭのＮＢＰ１４の適用で以前に見られた結果を再現しているが、灌流溶液中の２μＭのＴｒｉ０４は基底前脳の集団活性に対する有意な作用を決定する。
図２７、２８および２９を参照すると、４μＭのＴｒｉ０４の添加は４μＭのＮＢＰ１４の適用で以前に見られた結果を再現しているが、灌流溶液中の２μＭのＴｒｉ０４は基底前脳の集団活性に対する有意な作用を決定する。
【0422】
調節ペプチド模倣薬の分析
図２７Ａを参照すると、２μＭのＴ３０（ｎ＝２９）を含有する灌流液中に２μＭのＴｒｉ０４が存在するために、時空間マップが基底前脳の活性の回復を示すことが示される。より具体的には、２μＭのＴｒｉ０４は、ラット基底前脳の直接刺激によって測定された活性に対するＴ３０の阻害作用の逆転を決定する。
図２７Ａを参照すると、２μＭのＴ３０（ｎ＝２９）を含有する灌流液中に２μＭのＴｒｉ０４が存在するために、時空間マップが基底前脳の活性の回復を示すことが示される。より具体的には、２μＭのＴｒｉ０４は、ラット基底前脳の直接刺激によって測定された活性に対するＴ３０の阻害作用の逆転を決定する。
【0423】
図２７Ｂを参照すると、３つの記録エポックに対する棒グラフは、Ｔｒｉ０４適用後の誘発反応の変化を示し、２μＭのＴｒｉ０４共灌流が、Ｔ３０誘発作用の阻害によって引き起こされる、ネットワーク活性の増加を引き起こすことを確認する（ｎ＝２９、ｐ＝０．０６、両側対ｔ検定）。
【0424】
図２８を参照すると、３つの記録条件（ベースライン、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）へのＴ３０適用、およびａＣＳＦへのＴ３０およびＴｒｉ０４の同時適用）にわたる反応時系列が、最初の１００ミリ秒のＴ３０記録およびＴ３０＋Ｔｒｉ０４について、同様の活性化プロファイルを示し、一方、Ｔｒｉ０４存在下で記録されるより高い活性はその後検出可能であることが示され、Ｔ３０に対するＴｒｉ０４の保護的役割を確認する。
【0425】
図２９を参照すると、３つの記録条件に対する棒グラフが示されている。２μＭのＴ３０を含有する人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中の４μＭのＴｒｉ０４の共灌流は、Ｔ３０活性を逆転させる有意な作用を決定する。特に、Ｔｒｉ０４は、Ｔ３０単独の存在下での記録と比較して、基底前脳の活性の有意な増加（ｎ＝２０、ｐ＜０．０５、両側対ｔ検定）を伴うベースラインからのＴ３０誘導偏差に対して保護的であることが見出された。したがって、Ｔｒｉ０４は、中規模ネットワーク活動に対するＴ３０の毒性作用を遮断する若干の有効性を示す。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29】
【配列表】