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特許7125175リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-16
(45)【発行日】2022-08-24
(54)【発明の名称】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/438 20060101AFI20220817BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/08 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/14 20060101ALI20220817BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220817BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20220817BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220817BHJP
【ＦＩ】
A61K31/438
A61K47/32
A61K47/38
A61K47/20
A61K47/26
A61K47/22
A61K47/10
A61K47/08
A61K47/14
A61K47/34
A61K9/14
A61P31/04
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021521050
(86)(22)【出願日】2019-09-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-14
(86)【国際出願番号】 CN2019105617
(87)【国際公開番号】W WO2020078154
(87)【国際公開日】2020-04-23
【審査請求日】2021-04-30
(31)【優先権主張番号】201811200947.1
(32)【優先日】2018-10-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】519304240
【氏名又は名称】丹諾医薬（蘇州）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】劉 宇
(72)【発明者】
【氏名】徐 向毅
(72)【発明者】
【氏名】馬 振坤
【審査官】松本 淳
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０６８６０４５１（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３２６３３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料と、溶媒とを含む、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体であって、前記高分子担体は、ポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドンＶＡ６４、ヒドロキシプロピルセルロースＬ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＥ３、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフト共重合体、ポリメタクリレートの内の１種または複数種の組み合わせを含み、
前記機能性補助材料は、ラウリル硫酸ナトリウム、メグルミン、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステル、ツイーン８０の内の１種または複数種の組み合わせを含み、
【化1】
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体。
【請求項2】
図８に示される１つまたは複数のＸＲＰＤ（ただし、前記図８中の「ＡＰＩ噴霧乾燥対照」のＸＲＰＤを除く。）によって特徴付けられる、請求項１に記載の固体分散体。
【請求項3】
図１４～図１９に示される１つまたは複数の熱分析図によって特徴付けられる、請求項１に記載の固体分散体。
【請求項4】
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料との合計質量を１００％とした場合に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の使用量が２３．８％～７１．２％、高分子担体の使用量が２３．８％～７１．２％、機能性補助材料の使用量が３％～７％であることを特徴とし、好ましくは、前記高分子担体は、ヒドロキシプロピルセルロースＬおよび／またはオイドラギットＥＰＯを含み、
好ましくは、前記機能性補助材料は、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステルおよび／またはツイーン８０である、請求項１に記載の固体分散体。
【請求項5】
前記溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレンの内の１種または複数種の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載の固体分散体。
【請求項6】
４０℃／７５％ＲＨまたは６０℃／解放の条件下で４週間放置したときに、ＸＲＰＤに準拠した非晶質状態を保っていることを特徴とする、請求項１に記載の固体分散体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む、微粒子剤。
【請求項8】
請求項７に記載の微粒子剤を含む、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１～６のいずれか１項に記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む、医薬組成物。
【請求項10】
ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１～６のいずれか１項に記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体の使用。
【請求項11】
ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項７に記載の微粒子剤の使用。
【請求項12】
ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体およびその使用に関するものであり、医薬技術分野に属する。
【背景技術】
【0002】
嫌気性菌および微好気性菌感染症は、多くの一般的または重大な疾患に関連している。現在、嫌気性菌／微好気性菌に特化して開発された独特な作用メカニズムを有する新規抗菌薬は世界的に不足しており、臨床ではまだニトロイミダゾールなど６０年以上発売されている抗菌薬に依存している。これらの薬物に対する耐性問題は日増しに深刻化し、一部の一般的または重大な疾患は再発率が上昇し、治癒率が低下する傾向が現れている。そのため、嫌気性菌／微好気性菌感染に特化する新規抗菌薬の開発は、満たされていない重要な臨床上の需要である。
【0003】
本明細書の式Ｉに示されるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子は、リファマイシンとニトロイミダゾールの２つのファーマコフォアが安定な共有結合を介してカップリングして形成された新規多標的抗菌薬である。２つの母体抗菌薬の組み合わせよりも強い抗菌活性を有する。嫌気性菌と微好気性菌に対して比較的に強い体外、体内抗菌活性があり、特に薬剤耐性菌に対する活性が顕著である。薬剤耐性の発生の低減、殺菌速度、抗生物質投与後の効果およびファーマコフォア協同性などの多方面で、現在の治療薬物と比べて明らかな優位性がある。安全性薬理と毒性の研究により、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子は良好な安全性許容範囲を有することが示された。そのため、ピロリ菌関連消化管疾患、細菌性膣症、ディフィシル菌関連下痢症などの嫌気性菌／微好気性菌感染症の治療に応用できる可能性がある。しかし、従来の技術では、治療効果の信頼できるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の製剤が不足している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
前記の従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、微生物感染症を治療するための医薬品の製剤として使用できるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体、およびその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の目的は、以下の技術的解決策を通じて達成される。
【0006】
式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料と、溶媒とを含む、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体である。
【0007】
前記高分子担体は、ポリビニルピロリドンＫ３０（ＰＶＰ Ｋ３０）、ポリビニルピロリドンＶＡ６４（ＰＶＰ－ＶＡ６４）、ヒドロキシプロピルセルロースＬ（ＨＰＣ－Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＥ３（ＨＰＭＣ Ｅ３）、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフト共重合体（Ｓｏｌｕｐｌｕｓ）、ポリメタクリレート（オイドラギットＥＰＯ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＥＰＯ）の内の１種または複数種の組み合わせを含む。
【0008】
前記機能性補助材料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、メグルミン、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステル（ＶＥ－ＴＰＧＳまたはＴＰＧＳ）およびツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ－８０）の内の１種または複数種の組み合わせを含む。
【0009】
【化1】
【0010】
前記固体分散体において、好ましくは、前記ポリメタクリレートは、オイドラギットＥＰＯを含むが、これに限定されない。
【0011】
前記固体分散体において、前記固体分散体は、好ましくは、実質的に図８と類似した１つまたは複数のＸＲＰＤによって特徴付けられる。
【0012】
【0013】
前記固体分散体において、好ましくは、前記高分子担体は、ヒドロキシプロピルセルロースＬおよび／またはオイドラギットＥＰＯを含む。
【0014】
前記固体分散体において、好ましくは、前記機能性補助材料は、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステルおよび／またはツイーン８０である。
【0015】
前記固体分散体において、好ましくは、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料との合計質量を１００％とした場合に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の使用量が２３．８％～７１．２％、高分子担体の使用量が２３．８％～７１．２％、機能性補助材料の使用量が３％～７％（好ましくは４～６％）である。
【0016】
前記固体分散体において、前記溶媒は、当該分野で一般的に使用される試薬であってもよく、好ましくは、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレンの内の１種または複数種の組み合わせを含む。
【0017】
前記固体分散体において、好ましくは、前記固体分散体は、４０℃／７５％ＲＨまたは６０℃／解放の条件下で４週間放置したときに、ＸＲＰＤに準拠した非晶質状態を保っている。
【0018】
本発明はまた、前記リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む微粒子剤を提供する。
【0019】
本発明はまた、前記微粒子剤を含む医薬組成物を提供する。
【0020】
本発明はまた、前記リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む医薬組成物を提供する。
【0021】
本発明はまた、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における前記リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体の使用を提供する。
【0022】
本発明はまた、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における前記微粒子剤の使用を提供する。
【0023】
本発明はまた、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における前記医薬組成物の使用を提供する。
【発明の効果】
【0024】
本発明が提供するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体は、微生物感染を治療するための医薬品の製剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】実施例におけるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の溶出試験の含有量分析の標準溶液クロマトグラム。
【図2】実施例におけるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の安定性試験の不純物分析の標準溶液クロマトグラム。
【図3】実施例におけるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の紫外吸収スペクトル。
【図4】固体分散体薄膜のｐＨ１．２人工胃液中の溶出挙動（２５℃）図。
【図5】固体分散体薄膜のｐＨ４．５酢酸塩緩衝液中の溶出挙動（２５℃）図。
【図6】４種類の処方噴霧乾燥法により得られた固体分散体粉末の偏光顕微鏡の比較図。
【図7】噴霧乾燥法により得られた固体分散体粉末と原薬リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子との走査電子顕微鏡の比較図。
【図8】４種類の処方噴霧乾燥法により得られた固体分散体粉末のＸ線回折図。
【図9】噴霧乾燥法により得られた固体分散体粉末のｐＨ４．５酢酸塩緩衝液中の溶出挙動図。
【図10】処方５～８の異なる担持量の固体分散体の偏光顕微鏡の比較図。
【図11】処方５～８の異なる担持量の固体分散体粉末の走査電子顕微鏡の比較図。
【図12】処方５～８の異なる担持量の固体分散体粉末のＸ線回折の比較図。
【図13】原薬リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子粉末のＭＤＳＣ特性曲線。
【図14】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（担持量２３．８％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの固体分散体粉末のＭＤＳＣ曲線。
【図15】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（担持量２３．８％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の固体分散体粉末のＭＤＳＣ曲線。
【図16】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（担持量４７．６％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの固体分散体粉末のＭＤＳＣ曲線。
【図17】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（担持量４７．６％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の固体分散体粉末のＭＤＳＣ曲線。
【図18】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（担持量７１．４％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの固体分散体粉末のＭＤＳＣ曲線。
【図19】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（担持量７１．４％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の固体分散体粉末のＭＤＳＣ曲線。
【図20】異なる担持量の固体分散体粉末のｐＨ４．５酢酸塩緩衝液中の溶出挙動図。
【図21】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（２３．８％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの５０℃／オープンの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図22】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（２３．８％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の５０℃／オープンの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図23】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（４７．６％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの５０℃／オープンの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図24】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（４７．６％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の５０℃／オープンの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図25】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（７１．４％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの５０℃／オープンの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図26】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（７１．４％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の５０℃／オープンの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図27】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（２３．８％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの４０℃／７５％ＲＨの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図28】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（２３．８％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の４０℃／７５％ＲＨの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図29】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（４７．６％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの４０℃／７５％ＲＨの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図30】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（４７．６％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の４０℃／７５％ＲＨの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図31】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（７１．４％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳの４０℃／７５％ＲＨの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図32】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（７１．４％）／ＥＰＯ／ツイーン８０の４０℃／７５％ＲＨの条件下で５日間の安定性実験のＭＤＳＣ曲線図。
【図33】処方３により得られた固体分散体の異なる安定性条件下で２週間のＸＲＰＤ図。
【図34】処方３により得られた固体分散体の異なる安定性条件下で４週間のＸＲＰＤ図。
【図35】処方３により得られた固体分散体の２５℃／６０％ＲＨの条件下で２週間のＭＤＳＣ曲線。
【図36】処方３により得られた固体分散体の４０℃／７５％ＲＨの条件下で２週間のＭＤＳＣ曲線。
【図37】処方３により得られた固体分散体の６０℃の条件下で２週間のＭＤＳＣ曲線。
【図38】処方３により得られた固体分散体の２５℃／６０％ＲＨの条件下で４週間のＭＤＳＣ曲線。
【図39】処方３により得られた固体分散体の４０℃／７５％の条件下で４週間のＭＤＳＣ曲線。
【図40】処方３により得られた固体分散体の６０℃の条件下で４週間のＭＤＳＣ曲線。
【図41】リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子カプセル（１００ｍｇ規格）のｐＨ４．５の条件下での溶出曲線（３７℃）。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本発明の技術的特徴、目的および有益な効果をより明確に理解するために、ここで本発明の技術案について以下に詳細に説明するが、本発明の実施可能範囲に対する限定として解釈されるべきではない。特段の記載がない限り、下記の実施例に記載された実験方法はいずれも従来の方法である。特段の記載がない限り、下記の実施例に記載された試薬および材料は、商業的経路から入手することができる。
【0027】
本明細書において使用される「類似、相似」とは、例えばＸＲＰＤ、ＩＲ、ラマンスペクトル、ＤＳＣ、ＴＧＡ、ＮＭＲ、ＳＳＮＭＲなどと類似した特性を示す形態を指し、結晶多形体または共結晶体は、前記方法によって、類似からほぼ類似の範囲内で識別できることを指す。ただし、材料が前記方法によって（例えば、使用された計器、時刻、湿度、季節、圧力、室温などを含む実験的変化に基づいて）当業者が予測した変化性を有することが識別される場合に限る。
【0028】
本明細書において使用される「多形現象」とは、異なる水和状態（例えば、いくつかの化合物および複合体の性質）で存在する単一化合物の異なる結晶形が出現することを指す。したがって、結晶多形体は同じ分子式を共有する異なる固体であるが、それぞれの結晶多形体は独特の物理的性質を有することができる。したがって、単一化合物は、溶解度曲線、融点温度、吸湿性、粒子形状、密度、流動性、圧縮性、および／またはＸ線回折ピークなどが異なり、かつ独特な物理的性質を有する複数の結晶多形体を生成することができる。各結晶多形体の溶解度は変化する可能性があるので、予測可能な溶解度曲線を有する薬物を提供するためには、医薬用結晶多形体の存在を特定することが必要である。必要なのは、すべての結晶多形体を含む薬物のすべての固体形態を調査・研究し、各結晶多形体の安定性、溶出度と流動性を測定することである。化合物の結晶多形体は、Ｘ線回折分光法、赤外分光法などの他の方法により実験室で区別することができる。
【0029】
本明細書の実施例において使用される材料、機器の条件、および関連するいくつかの方法は、以下のとおりである。
【0030】
【表1】
【0031】
【表2】
【0032】
【表3】
【0033】
機器パラメータ：
偏光顕微鏡（ＰＬＭ）
ニコンＬＶ１００ＰＯＬ
対物レンズ倍率：１０倍／２０倍／５０倍
粉末Ｘ線回折計（ＸＲＰＤ）
約５ｍｇの試料をシリコン単結晶基板にタイリングし、実行試験方法は以下の通りである：
Ｘ線管：Ｃｕ：Ｋ－Ａｌｐｈａ（λ＝１．５４１７９Å）、
発生器：電圧：４０ｋＶ、電流：４０ｍＡ、
スキャン角度：３から４０度、
サンプル回転速度：０ｒｐｍ、
スキャン速度：１０度／分。
偏光顕微鏡（ＰＬＭ）
ニコンＬＶ１００ＰＯＬ
対物レンズ倍率：１０倍／２０倍／５０倍
粉末Ｘ線回折計（ＸＲＰＤ）
約５ｍｇの試料をシリコン単結晶基板にタイリングし、実行試験方法は以下の通りである：
Ｘ線管：Ｃｕ：Ｋ－Ａｌｐｈａ（λ＝１．５４１７９Å）、
発生器：電圧：４０ｋＶ、電流：４０ｍＡ、
スキャン角度：３から４０度、
サンプル回転速度：０ｒｐｍ、
スキャン速度：１０度／分。
【0034】
示差走査熱量計（ＤＳＣ）
標准方法：加熱範囲３０℃～３００℃、加熱速度１０℃／分、
変調示差熱量法：加熱範囲０℃／３０℃～２００℃、加熱速度２℃／分、調整幅±１℃、調整サイクル６０秒。
標准方法：加熱範囲３０℃～３００℃、加熱速度１０℃／分、
変調示差熱量法：加熱範囲０℃／３０℃～２００℃、加熱速度２℃／分、調整幅±１℃、調整サイクル６０秒。
【0035】
熱重量分析計（ＴＧＡ）
加熱範囲：周囲温度～３００℃、加熱速度１０℃／分。
加熱範囲：周囲温度～３００℃、加熱速度１０℃／分。
【0036】
動的水分吸着測定装置（ＤＶＳ）
１０～２０ｍｇの試料をＤＶＳ試料皿に入れ、試験温度は２５℃とする。
湿度サイクルパラメータを次のように設定する。平衡条件：重量％／分＜０．０１％（１回の平衡時間は最低１０分、最高１８０分）、予備乾燥：０％ＲＨ平衡２時間、湿度平衡設定：０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、０。
１０～２０ｍｇの試料をＤＶＳ試料皿に入れ、試験温度は２５℃とする。
湿度サイクルパラメータを次のように設定する。平衡条件：重量％／分＜０．０１％（１回の平衡時間は最低１０分、最高１８０分）、予備乾燥：０％ＲＨ平衡２時間、湿度平衡設定：０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、０。
【0037】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）
電圧：１０ＫＶ、電流：Ｐｏｉｎｔ、モード：ＢＳＣ Ｆｕｌｌ。
電圧：１０ＫＶ、電流：Ｐｏｉｎｔ、モード：ＢＳＣ Ｆｕｌｌ。
【0038】
かさ／タップ密度測定
器具：１０ｍＬメスシリンダー、
振動の高さ：１４ｍｍ、
振動数：３００回／分。
試料をふるい（１．０ｍｍ、Ｎｏ．１８スクリーン）に通し、１０ｍＬメスシリンダーに入れる。初期体積を記録し、ＵＳＰにより、以下のようにタップ密度の測定を行う。メスシリンダーを５００回振動させ、体積Ｖａを測定する。メスシリンダーを再度７５０回振動させ、体積Ｖｂを測定する。二つの体積差が２％未満であれば、Ｖｂを最終タップ体積とする。体積差が２％を超える場合には、連続した体積測定値間の差が２％未満となるまで、１２５０回ずつ振動を繰り返し、最後の体積を最終タップ体積とする。
器具：１０ｍＬメスシリンダー、
振動の高さ：１４ｍｍ、
振動数：３００回／分。
試料をふるい（１．０ｍｍ、Ｎｏ．１８スクリーン）に通し、１０ｍＬメスシリンダーに入れる。初期体積を記録し、ＵＳＰにより、以下のようにタップ密度の測定を行う。メスシリンダーを５００回振動させ、体積Ｖａを測定する。メスシリンダーを再度７５０回振動させ、体積Ｖｂを測定する。二つの体積差が２％未満であれば、Ｖｂを最終タップ体積とする。体積差が２％を超える場合には、連続した体積測定値間の差が２％未満となるまで、１２５０回ずつ振動を繰り返し、最後の体積を最終タップ体積とする。
【0039】
ｐＨ１．２人工胃液の調製：
ピペットガンで４００μＬの１２Ｎ濃塩酸を１００ｍＬのｐＨ１．８人工胃液に入れる。ｐＨ計で測定した溶液のｐＨは１．２１である。
ピペットガンで４００μＬの１２Ｎ濃塩酸を１００ｍＬのｐＨ１．８人工胃液に入れる。ｐＨ計で測定した溶液のｐＨは１．２１である。
【0040】
人工胃液（ｐＨ１．８）：９５０ｍＬの超純水を１Ｌメスフラスコに入れ、１．４ｍＬの１２Ｎ濃塩酸と２ｇの塩化ナトリウムを加え、均一に攪拌し、超純水で定容する。
【0041】
ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液の調製：
８６９．０５ｍｇの水酸化ナトリウム固体粒子をとり、１Ｌの超純水を１Ｌのガラス瓶に入れ、ピペットガンで３．１５ｍＬの氷酢酸を瓶に入れる。ｐＨ計で測定した溶液のｐＨは４．５３である。
８６９．０５ｍｇの水酸化ナトリウム固体粒子をとり、１Ｌの超純水を１Ｌのガラス瓶に入れ、ピペットガンで３．１５ｍＬの氷酢酸を瓶に入れる。ｐＨ計で測定した溶液のｐＨは４．５３である。
【0042】
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の高速液体クロマトグラフィーによる測定方法：
高速液体クロマトグラフィーの含有量と不純物の検出方法を表４と表５に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の紫外吸収スペクトルを図３に、その標準溶液クロマトグラフィーを図１と図２に示す。２つの高速液体クロマトグラフィーによる測定方法において、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の保持時間はそれぞれ２．９０分と１６．７７分であり、システム適応性検証と線形区間の結果を表６と表７に示す。この２種類の方法はそれぞれ溶出実験中の含有量の測定と安定性試験中の回収率・関連不純物の測定に用いられる。
高速液体クロマトグラフィーの含有量と不純物の検出方法を表４と表５に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の紫外吸収スペクトルを図３に、その標準溶液クロマトグラフィーを図１と図２に示す。２つの高速液体クロマトグラフィーによる測定方法において、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の保持時間はそれぞれ２．９０分と１６．７７分であり、システム適応性検証と線形区間の結果を表６と表７に示す。この２種類の方法はそれぞれ溶出実験中の含有量の測定と安定性試験中の回収率・関連不純物の測定に用いられる。
【0043】
【表4】
【0044】
【表5】
【0045】
【表6】
【0046】
【表7】
【0047】
（実施例）
本実施例は、式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を提供し、その成分は、式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料と、溶媒とを含む。
本実施例は、式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を提供し、その成分は、式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料と、溶媒とを含む。
【0048】
【化2】
【0049】
本実施例におけるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子（式Ｉに示すもの、以下、「ＡＰＩ」または「原薬」という）は、丹諾医薬（蘇州）有限公司により製造されたものである。
【0050】
本実施例では、まず、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレンの内の１種または複数種の組み合わせを含む溶媒のスクリーニング測定が行われる。リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子約１０ｍｇを１．５ｍＬオートサンプラー用バイアルに入れ、それぞれ適量の異なる溶媒を加え、完全に溶解しているか否かを観察し、その溶解度を大まかに判断する。
【0051】
結果を表８に示す。結果から、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子は各種の一般的噴霧乾燥用溶媒（＞１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解しやすいことがわかった。また、ＩＣＨが定める有機溶媒の１日あたりの許容曝露量レベル（ＰＤＥレベル）を参考として示した。
【0052】
【表8】
【0053】
本実施例において、高分子担体をスクリーニングする。
適切な速放性担体補助材料を決定するために、ポリビニルピロリドンＫ３０（ＰＶＰ Ｋ３０）、ポリビニルピロリドンＶＡ６４（ＰＶＰ－ＶＡ６４）、ヒドロキシプロピルセルロースＬ（ＨＰＣ－Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＥ３（ＨＰＭＣ Ｅ３）、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフト共重合体（Ｓｏｌｕｐｌｕｓ）、ポリメタクリレート（オイドラギットＥＰＯ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＥＰＯ）の６種類の高分子担体をそれぞれ担体補助材料として用い、溶媒揮発法により二成分固体分散体を調製し、バイアル溶出試験により溶出挙動を評価する。
適切な速放性担体補助材料を決定するために、ポリビニルピロリドンＫ３０（ＰＶＰ Ｋ３０）、ポリビニルピロリドンＶＡ６４（ＰＶＰ－ＶＡ６４）、ヒドロキシプロピルセルロースＬ（ＨＰＣ－Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＥ３（ＨＰＭＣ Ｅ３）、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフト共重合体（Ｓｏｌｕｐｌｕｓ）、ポリメタクリレート（オイドラギットＥＰＯ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ ＥＰＯ）の６種類の高分子担体をそれぞれ担体補助材料として用い、溶媒揮発法により二成分固体分散体を調製し、バイアル溶出試験により溶出挙動を評価する。
【0054】
二成分固体分散体（略称ＡＳＤ）の製造：リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子約２５ｍｇと担体および補助材料約２５ｍｇを秤量し、同じ４０ｍＬガラス瓶に入れ、溶媒を加えて振とうし、表９に示すように完全に溶解させる。開いた４０ｍＬのガラス瓶を穴あきアルミホイルで覆って相互汚染を防ぎ、３５℃の真空乾燥オーブンに入れて急速に揮発させる。４０時間の十分な真空乾燥の後、二成分分散体は瓶の底に紫色薄膜を形成し、二成分固体分散体薄膜が得られる。
【0055】
【表9】
【0056】
製造された二成分固体分散体薄膜に対して溶出実験を行う。
固体分散体の薄膜が入った４０ｍＬのガラス瓶の中で、それぞれ０．５ｍＬのｐＨ１．２人工胃液と１ｍＬのｐＨ４．５酢酸塩緩衝液を、溶出媒体（２５℃）（目標濃度５０ｍｇ／ｍＬ）として使用した。密閉して、５秒間ボルテックス処理し、１００μＬの液体を初期サンプリングポイント（０分）とし、その後揺動機で振とうして１０分、３０分、６０分後、それぞれ１００μＬの溶液を遠心管に取り、１４０００回転／分で５分間遠心し、上清をオートサンプラー用バイアルに取り、アセトニトリルで適切な倍数に希釈し、高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積で濃度を計算した。
固体分散体の薄膜が入った４０ｍＬのガラス瓶の中で、それぞれ０．５ｍＬのｐＨ１．２人工胃液と１ｍＬのｐＨ４．５酢酸塩緩衝液を、溶出媒体（２５℃）（目標濃度５０ｍｇ／ｍＬ）として使用した。密閉して、５秒間ボルテックス処理し、１００μＬの液体を初期サンプリングポイント（０分）とし、その後揺動機で振とうして１０分、３０分、６０分後、それぞれ１００μＬの溶液を遠心管に取り、１４０００回転／分で５分間遠心し、上清をオートサンプラー用バイアルに取り、アセトニトリルで適切な倍数に希釈し、高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積で濃度を計算した。
【0057】
異なる補助材料を担体としたリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体のｐＨ＝１．２人工胃液媒体中での溶出結果を表１０と図４に示す。その結果は、ＨＰＣ－Ｌを除くすべての固体分散体薄膜は、原薬薄膜対照を含め、５秒間のボルテックス後に５～１３ｍｇ／ｍＬの急速な薬物放出効果を示すことを示した。１０分から６０分では、ＰＶＰ Ｋ３０とＰＶＰ－ＶＡ６４を担体とした系のみが原薬薄膜対照と同等の放出速度と度合を示し、ＨＰＣ－Ｌ、ＨＰＭＣ Ｅ３、Ｓｏｌｕｐｌｕｓ、およびオイドラギットＥＰＯを担体とした系は原薬薄膜の半分か半分以下の放出度合しか示さなかった。これは、ＰＶＰ Ｋ３０とＰＶＰ－ＶＡ６４が濡れ性の強い担体補助材料であり、溶出媒体中で効果的かつ迅速に薬物を溶解して放出できるのに対し、ＨＰＣ－Ｌ、ＨＰＭＣ、Ｓｏｌｕｐｌｕｓは親水性が比較的劣るため、薬物放出に不利なためである。また、オイドラギットＥＰＯも初期点では１３ｍｇ／ｍＬと非常に強い急速放出能力を示したが、その後５ｍｇ／ｍＬまで低下した。オイドラギットＥＰＯ補助材料の特徴により、オイドラギットＥＰＯの持続的な溶出はｐＨ値を６．５（１時間）まで増加させたが、ソフトウェアの予測によると、薬物のｐＫａは約２．７であり、系のｐＨの変化は原薬の解離平衡の移動を招き、解離の度合が減少した。そこで、実験をより合理的に設計するために、後続実験ではオイドラギットＥＰＯ濃度が溶出媒体のｐＨに与える影響の度合についても検討した。
【0058】
ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液溶出実験：リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子はｐＫａが２．７付近であるため、ｐＨ＝４．５の酢酸塩緩衝液では解離が少なく、疎水性が強い。そのため、ｐＨ＝１．２人工胃液に対して溶出速度と度合が著しく低下した。溶出結果を表１１と図５に示す。その結果は、オイドラギットＥＰＯとＨＰＣ－Ｌを担体とする薄膜は薬物のｐＨ＝４．５系での溶出度を明らかに高めることができ、それぞれ原薬薄膜対照の６倍と３倍の放出度合を６０分間まで有効に維持することができることを示した。また、実験現象によれば、ＨＰＣ－Ｌを担体とした固体分散体薄膜溶出液が均一で安定な懸濁状態を示したので、オイドラギットＥＰＯとＨＰＣ－Ｌを担体マトリックスとして次の噴霧乾燥分散体の検討を行った。
【0059】
【表10】
【0060】
【表11】
【0061】
溶液のｐＨおよび溶解度に及ぼすオイドラギットＥＰＯの影響
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子のｐＨ＝１．２人工胃液中の溶出濃度が徐々に低下する挙動（表１０参照）をさらに検討するために、異なる濃度のオイドラギットＥＰＯを配置してオイドラギットＥＰＯ溶液のｐＨ－濃度依存性を測定した。その結果を表１２に示す。また、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＥＰＯ（１０／３）の固体分散体を製造して溶出実験を行い、ＥＰＯ含量が溶出結果に与える影響を検証した。その結果を表１３に示す。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子のｐＨ＝１．２人工胃液中の溶出濃度が徐々に低下する挙動（表１０参照）をさらに検討するために、異なる濃度のオイドラギットＥＰＯを配置してオイドラギットＥＰＯ溶液のｐＨ－濃度依存性を測定した。その結果を表１２に示す。また、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＥＰＯ（１０／３）の固体分散体を製造して溶出実験を行い、ＥＰＯ含量が溶出結果に与える影響を検証した。その結果を表１３に示す。
【0062】
その結果、オイドラギットＥＰＯの濃度が２５ｍｇ／ｍＬまで増加すると、溶液のｐＨ値は２．５７まで増加し、その後、オイドラギットＥＰＯの溶解に伴い、溶液のｐＨ値は次第に上昇し、同時に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子は溶解媒体のｐＨの増加に伴って溶解度が急速に低下することが確認された。その結果、溶出系におけるオイドラギットＥＰＯのｐＨへの影響は製剤の溶出挙動に重要な役割を果たしており、今後の処方設計において注意深く考慮すべきであることが明らかになった。
【0063】
【表12】
【0064】
【表13】
【0065】
本実施例において、機能性補助材料をスクリーニングする。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の溶出性をさらに向上させるために、ラウリル硫酸ナトリウム、メグルミン、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステルまたはツイーン８０をｐＨ＝１．２人工胃液またはｐＨ＝４．５酢酸緩衝液系にそれぞれ添加した。リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子を約１００ｍｇ（または２０ｍｇ）を秤量し、１．５ｍＬ高速オートサンプラー用バイアル中に置き、機能性補助材料を含むｐＨ１．２人工胃液（或いはｐＨ４．５酢酸塩緩衝液）１ｍＬを加え、３７℃の恒温混合器に入れて、回転速度を毎分７００回転とし、１２０分後に５００μＬの液体を遠心管に取り、１４０００回転／分で５分間遠心分離し、上清を同じ条件で再び遠心分離し、二次遠心上清をオートサンプラー用バイアルに取り、適量の倍数のアセトニトリルで希釈して被測定溶液とし、高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積で濃度を計算した。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の溶出性をさらに向上させるために、ラウリル硫酸ナトリウム、メグルミン、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステルまたはツイーン８０をｐＨ＝１．２人工胃液またはｐＨ＝４．５酢酸緩衝液系にそれぞれ添加した。リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子を約１００ｍｇ（または２０ｍｇ）を秤量し、１．５ｍＬ高速オートサンプラー用バイアル中に置き、機能性補助材料を含むｐＨ１．２人工胃液（或いはｐＨ４．５酢酸塩緩衝液）１ｍＬを加え、３７℃の恒温混合器に入れて、回転速度を毎分７００回転とし、１２０分後に５００μＬの液体を遠心管に取り、１４０００回転／分で５分間遠心分離し、上清を同じ条件で再び遠心分離し、二次遠心上清をオートサンプラー用バイアルに取り、適量の倍数のアセトニトリルで希釈して被測定溶液とし、高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積で濃度を計算した。
【0066】
その結果、ＶＥ－ＴＰＧＳとＴｗｅｅｎ－８０は、ｐＨ１．２人工胃液とｐＨ４．５酢酸塩緩衝液のいずれにおいてもリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の２時間溶出度を高めることができ、特にｐＨ４．５系においては、原薬粉末対照と比較して、ＶＥ－ＴＰＧＳとＴｗｅｅｎ－８０はそれぞれ２時間溶出度を６倍と４倍に高めることができることが明らかになった。
【0067】
【表14】
【0068】
本実施例において、固体分散体は、噴霧乾燥法を用いて製造される。
補助材料のスクリーニング実験では、ｐＨ４．５溶出媒体においての固体分散体の溶出挙動と懸濁状態から、オイドラギットＥＰＯとＨＰＣ－Ｌを噴霧乾燥用の担体として選択し、同時に製剤の溶出挙動をより高めるために、ＶＥ－ＴＰＧＳまたはＴｗｅｅｎ８０を、機能性補助材料としてそれぞれ異なる固体分散体に添加した。固体分散体成分を表１５に示し、噴霧乾燥溶媒としてアセトンを使用し、プロセスパラメータを表１６に示す。噴霧乾燥で製造した固体分散体を３５℃の真空乾燥炉で４０時間真空乾燥し、－２０℃の冷蔵庫に保存した。
補助材料のスクリーニング実験では、ｐＨ４．５溶出媒体においての固体分散体の溶出挙動と懸濁状態から、オイドラギットＥＰＯとＨＰＣ－Ｌを噴霧乾燥用の担体として選択し、同時に製剤の溶出挙動をより高めるために、ＶＥ－ＴＰＧＳまたはＴｗｅｅｎ８０を、機能性補助材料としてそれぞれ異なる固体分散体に添加した。固体分散体成分を表１５に示し、噴霧乾燥溶媒としてアセトンを使用し、プロセスパラメータを表１６に示す。噴霧乾燥で製造した固体分散体を３５℃の真空乾燥炉で４０時間真空乾燥し、－２０℃の冷蔵庫に保存した。
【0069】
【表15】
【0070】
【表16】
【0071】
製造されて得られる非晶質固体分散体粉末の物理的特性評価
製造された噴霧乾燥固体分散体の物理的特性評価の結果を表１７に、具体的な特性評価報告を図６～図８に示す。偏光顕微鏡写真（図６に示す）とＸ線回折図（図８に示す）の結果は、製造した噴霧乾燥分散体がすべて非晶質であることを示している。また、偏光顕微鏡写真（図７）では背景に微量結晶の存在が観察されたが、原因は不明であった。オイドラギットＥＰＯ系走査電子顕微鏡の結果を図１１に示す。機能性補助材としてＴＰＧＳを用いた固体分散体は直径０．５～３μｍ程度の球形であることが多く、機能性補助材としてＴｗｅｅｎ－８０を用いた固体分散体は直径０．５～４μｍ程度のくぼみを有する球形であることが多い。また、未処理リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子原薬の物理的形態を参考として図７に示す。
製造された噴霧乾燥固体分散体の物理的特性評価の結果を表１７に、具体的な特性評価報告を図６～図８に示す。偏光顕微鏡写真（図６に示す）とＸ線回折図（図８に示す）の結果は、製造した噴霧乾燥分散体がすべて非晶質であることを示している。また、偏光顕微鏡写真（図７）では背景に微量結晶の存在が観察されたが、原因は不明であった。オイドラギットＥＰＯ系走査電子顕微鏡の結果を図１１に示す。機能性補助材としてＴＰＧＳを用いた固体分散体は直径０．５～３μｍ程度の球形であることが多く、機能性補助材としてＴｗｅｅｎ－８０を用いた固体分散体は直径０．５～４μｍ程度のくぼみを有する球形であることが多い。また、未処理リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子原薬の物理的形態を参考として図７に示す。
【0072】
【表17】
【0073】
製造されて得られる非晶質固体分散体粉末の溶出実験
製造した固体分散体を約３４４ｍｇ秤量し、４０ｍＬのガラス瓶に入れて、ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液２０ｍＬ（３７℃に予熱）を溶出媒体（リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子目標濃度４ｍｇ／ｍＬ）とした。密閉し、５秒間ボルテックス処理し、攪拌子を加え、３７℃に加熱されたマグネチックスターラーの上に置いて、回転速度を毎分３００回転にし、１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分後、５００μＬの液体を遠心分離管に入れ、１４０００回転／分で３分間遠心分離し、上清をオートサンプラー用バイアルに入れ、アセトニトリルで１０倍に希釈して被測定溶液とし、高速液体クロマトグラフに注入してクロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積から濃度を算出した。
製造した固体分散体を約３４４ｍｇ秤量し、４０ｍＬのガラス瓶に入れて、ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液２０ｍＬ（３７℃に予熱）を溶出媒体（リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子目標濃度４ｍｇ／ｍＬ）とした。密閉し、５秒間ボルテックス処理し、攪拌子を加え、３７℃に加熱されたマグネチックスターラーの上に置いて、回転速度を毎分３００回転にし、１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分後、５００μＬの液体を遠心分離管に入れ、１４０００回転／分で３分間遠心分離し、上清をオートサンプラー用バイアルに入れ、アセトニトリルで１０倍に希釈して被測定溶液とし、高速液体クロマトグラフに注入してクロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積から濃度を算出した。
【0074】
噴霧乾燥固体分散体の溶出結果を表１８と図９に示す。ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液中では、オイドラギットＥＰＯと、ＴＰＧＳまたはＴｗｅｅｎ－８０を補助材料とする固体分散体は明らかにリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の溶出速度と度合を上昇させることができた。逆に、噴霧乾燥したリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＨＰＣ－Ｌ／界面活性剤はリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の溶出を有意に上昇させなかった。機能性補助材料としてのＶＥ－ＴＰＧＳとＴｗｅｅｎ－８０の比較では、Ｔｗｅｅｎ８０はリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子を１０分以内に４ｍｇ／ｍＬまで迅速に放出することがより顕著であったが、ＶＥ－ＴＰＧＳは同様の放出効果を達成するのに４０分を要し、１０分濃度はわずか２．８ｍｇ／ｍＬであった。そのため、Ｔｗｅｅｎ８０は、急速放出効果がより強いと考えられている。また、噴霧乾燥したリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の２時間溶解度は、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子原薬の２時間溶解度（０．１５ｍｇ／ｍＬ、表１４）と類似しており、粒径が小さくなった噴霧乾燥原薬は平衡溶解度に有意な影響を及ぼさないことが示された。
【0075】
【表18】
【0076】
本実施例において、固体分散物の処方担持量をスクリーニングする
噴霧乾燥分散体溶出実験の結果から、固体分散剤に用いる担体としてオイドラギットＥＰＯを選択した。噴霧乾燥分散体への担持量の影響をさらに検討するために、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と担体の比率が１：１および１：３であり、ＶＥ－ＴＰＧＳまたはＴｗｅｅｎ８０を５％（ｗ／ｗ）含有する固体分散体を製造した。成分を表１９に示す。噴霧乾燥溶媒としてアセトンを使用し、プロセスパラメータを表２０に示す。噴霧乾燥で製造した固体分散体を３５℃の真空乾燥炉で４０時間真空乾燥し、－２０℃の冷蔵庫で保存した。
噴霧乾燥分散体溶出実験の結果から、固体分散剤に用いる担体としてオイドラギットＥＰＯを選択した。噴霧乾燥分散体への担持量の影響をさらに検討するために、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と担体の比率が１：１および１：３であり、ＶＥ－ＴＰＧＳまたはＴｗｅｅｎ８０を５％（ｗ／ｗ）含有する固体分散体を製造した。成分を表１９に示す。噴霧乾燥溶媒としてアセトンを使用し、プロセスパラメータを表２０に示す。噴霧乾燥で製造した固体分散体を３５℃の真空乾燥炉で４０時間真空乾燥し、－２０℃の冷蔵庫で保存した。
【0077】
【表19】
【0078】
【表20】
【0079】
処方５～８により得られた固体分散物の特性
異なる担持量の噴霧乾燥固体分散体の物理的特性評価の結果を表２１に示し、具体的な特性評価を図１０～図１９に示す。同時に、噴霧乾燥分散体中の薬物および関連物質の含有量を高速液相法により分析した。
異なる担持量の噴霧乾燥固体分散体の物理的特性評価の結果を表２１に示し、具体的な特性評価を図１０～図１９に示す。同時に、噴霧乾燥分散体中の薬物および関連物質の含有量を高速液相法により分析した。
【0080】
偏光顕微鏡写真（図１０に示す）とＸ線回折図（図１２に示す）の結果は、製造された異なる量の噴霧乾燥分散体がすべて非晶質であることを示している。走査電子顕微鏡写真の結果（図１１に示す）は、担持量が５０％を超えると噴霧乾燥粒子表面の陥没度が増加することを示しており、これは乾燥過程におけるリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子とオイドラギットＥＰＯの拡散速度の違いが原因と推測される。ＭＤＳＣの結果は、原薬リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子のガラス転化温度Ｔｇが約１４５．０℃であることを示している（図１３）。ＡＰＩ（２３．８％）／ＥＰＯ／ＴＰＧＳ噴霧乾燥分散体には２つのガラス転移温度が存在し、系が非単一相であることを示していることを除いて、残りの異なる担持量の噴霧乾燥分散体は単相固体分散体であり（図１４～図１９に示す）、Ｇｏｒｄｏｎ－Ｔａｙｌｏｒの法則にほぼ適合している。また、Ｔｗｅｅｎ－８０系の固体分散体のＴｇは、全体としてＶＥ－ＴＰＧＳ系の固体分散体より低い。高速液相含有量分析（表２１）では、固体分散体の実際の含有量は理論的な含有量をわずかに上回っており、また噴霧乾燥過程では関連物質の増加は見られなかった。
【0081】
【表21】
【0082】
得られた固体分散体に対する粉末溶出実験
それぞれ適量の固体分散体を取り、４０ｍＬのガラス瓶に置き、ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液２０ｍＬ（３７℃に予熱）を溶出媒体（リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子目標濃度１０ｍｇ／ｍＬ）として密閉し、５秒間ボルテックス処理し、攪拌子を入れ、３７℃に加熱したマグネチックスターラー上に置き、回転速度を毎分３００回転にした。１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分経過した後、５００μＬの液体を遠心分離管に取り、１４０００回転／分で３分間遠心分離し、上清をオートサンプラー用バイアルに取り、アセトニトリルで１０倍に希釈して被測定溶液とし、高速液体クロマトグラフに注入してクロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積から濃度を計算した。
それぞれ適量の固体分散体を取り、４０ｍＬのガラス瓶に置き、ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液２０ｍＬ（３７℃に予熱）を溶出媒体（リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子目標濃度１０ｍｇ／ｍＬ）として密閉し、５秒間ボルテックス処理し、攪拌子を入れ、３７℃に加熱したマグネチックスターラー上に置き、回転速度を毎分３００回転にした。１０分、２０分、４０分、６０分、９０分、１２０分、１８０分経過した後、５００μＬの液体を遠心分離管に取り、１４０００回転／分で３分間遠心分離し、上清をオートサンプラー用バイアルに取り、アセトニトリルで１０倍に希釈して被測定溶液とし、高速液体クロマトグラフに注入してクロマトグラムを記録し、外部標準法によりピーク面積から濃度を計算した。
【0083】
異なる担持量の噴霧乾燥固体分散体の溶出結果を表２２と図２０に示す。溶出試験の結果は、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／オイドラギットＥＰＯ／Ｔｗｅｅｎ－８０（４７．５％／４７．６％／４．８％）の噴霧乾燥分散体が最も優れた溶出挙動を示し、１０分後には３ｍｇ／ｍＬ、３時間後には７ｍｇ／ｍＬまで溶出した。リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／オイドラギットＥＰＯ／Ｔｗｅｅｎ－８０（２３．８％／７１．４％／４．８％）噴霧乾燥分散体は、すべての割合の処方において最も急速放出効果が高い。しかし、オイドラギットＥＰＯの持続的な溶出に伴い、溶液系のｐＨが上昇し、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の溶解度が抑制され、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子を安定した高濃度に維持することができなくなった。しかし、７１．４％の担持量の系は溶出挙動が悪く、補助材料の割合が低いため、濡れ性および過飽和維持性が悪い可能性がある。総合的に考慮し、４７．６％の担持量を最適な処方薬剤含有割合として選択した。
【0084】
【表22】
【0085】
処方１、３、５～８により得られた固体分散体の短期物理安定性の研究
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＥＰＯ／ＴＰＧＳ（またはＴｗｅｅｎ－８０）の噴霧乾燥固体分散体を１．５ｍＬオートサンプラー用バイアルに適量とり、５０℃と４０℃／７５％ＲＨの安定性試験器に入れ、穴あきアルミホイルで光を避け、相互汚染を防止した。５日後、ＭＤＳＣの特性評価を行い、結果を表２３と図２１～図３２に示す。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＥＰＯ／ＴＰＧＳ（またはＴｗｅｅｎ－８０）の噴霧乾燥固体分散体を１．５ｍＬオートサンプラー用バイアルに適量とり、５０℃と４０℃／７５％ＲＨの安定性試験器に入れ、穴あきアルミホイルで光を避け、相互汚染を防止した。５日後、ＭＤＳＣの特性評価を行い、結果を表２３と図２１～図３２に示す。
【0086】
５０℃および４０℃／７５％ＲＨの条件下で、異なる担持量の非晶質固体分散体（ＡＳＤ）粉末のＴｇ値は多少変化したが、依然として１つのＴｇ、すなわち単一固体溶液相しかなく、しかも明らかな発熱転晶シグナルがなく、固体分散体系の短期加速条件の物理安定性が良好であることを示した。
【0087】
【表23】
【0088】
処方３に従って得られた固体分散体の長期物理安定性の研究
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＥＰＯ／Ｔｗｅｅｎ－８０噴霧乾燥固体分散体を４０ｍＬガラス瓶に適量とり、それぞれ２５℃／６０％ＲＨ、４０℃／７５％ＲＨ、６０℃の安定性試験器に入れ、穴あきアルミホイルで光を避け、相互汚染を防止する。それぞれ２週間後、４週間後にＸＲＰＤ、ＭＤＳＣの特性評価を行い、結果を図３３～図４０に示す。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／ＥＰＯ／Ｔｗｅｅｎ－８０噴霧乾燥固体分散体を４０ｍＬガラス瓶に適量とり、それぞれ２５℃／６０％ＲＨ、４０℃／７５％ＲＨ、６０℃の安定性試験器に入れ、穴あきアルミホイルで光を避け、相互汚染を防止する。それぞれ２週間後、４週間後にＸＲＰＤ、ＭＤＳＣの特性評価を行い、結果を図３３～図４０に示す。
【0089】
Ｘ線回折スペクトルは、４週間後も固体分散体は同じで均一分布非晶質系であることを示し、ＭＤＳＣは、ガラス転移温度（Ｔｇ）がわずかに低下していることを示している。実験結果によると、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子／オイドラギットＥＰＯ／Ｔｗｅｅｎ ８０（４７．６％／４７．６％／４．８％）のＡＳＤ粉末は、物理的安定性がより優れている。
【0090】
本実施例において、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体製剤と他の従来の剤形（例えばカプセル剤）との比較実験も提供される。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の通常のカプセルは、固体粒子を乾式造粒プロセスにより製造して得、対応するカプセルシェルに充填して含有量１００ｍｇ規格のカプセル（ロット番号Ｄ－１７０９ＦＰ２３００－０５－ＨＰＭＣおよびＤ－１７０９ＦＰ２３００－０５－ＨＧ）を得る。造粒プロセスは、混合、乾式造粒、潤滑を含む。使用される補助材料は、一般的に市販されている薬用補助材料であり、充填剤／希釈剤、崩壊剤、流動補助材料、界面活性剤、潤滑剤を含む。カプセルシェルとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセルシェル（ＨＰＭＣ）とゼラチンカプセルシェル（ＨＧ）を用いる。リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体カプセルは、前記の好ましい拡大ロットの噴霧乾燥固体分散体（ロット番号ＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０）を、対応するカプセルシェルに直接充填して、含有量１００ｍｇ規格のカプセル（ロット番号ＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０－ＨＰＭＣおよびＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０－ＨＧ）を得る。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の通常のカプセルは、固体粒子を乾式造粒プロセスにより製造して得、対応するカプセルシェルに充填して含有量１００ｍｇ規格のカプセル（ロット番号Ｄ－１７０９ＦＰ２３００－０５－ＨＰＭＣおよびＤ－１７０９ＦＰ２３００－０５－ＨＧ）を得る。造粒プロセスは、混合、乾式造粒、潤滑を含む。使用される補助材料は、一般的に市販されている薬用補助材料であり、充填剤／希釈剤、崩壊剤、流動補助材料、界面活性剤、潤滑剤を含む。カプセルシェルとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロースカプセルシェル（ＨＰＭＣ）とゼラチンカプセルシェル（ＨＧ）を用いる。リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体カプセルは、前記の好ましい拡大ロットの噴霧乾燥固体分散体（ロット番号ＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０）を、対応するカプセルシェルに直接充填して、含有量１００ｍｇ規格のカプセル（ロット番号ＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０－ＨＰＭＣおよびＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０－ＨＧ）を得る。
【0091】
得られたリフォマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子カプセル（１００ｍｇ規格）の溶出実験を行った。
中国薬局方の要求に適合する溶出度測定器（パドル法）を使用し、ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液（３７℃に予熱）を溶出媒体とし、回転速度は毎分７５回転とした。１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分でそれぞれサンプリングし、さらに毎分２５０回転で３０分間経過した後にサンプリングした。５ｍＬの液体を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過した。高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、ピーク面積から外部標準法により濃度を算出した。
中国薬局方の要求に適合する溶出度測定器（パドル法）を使用し、ｐＨ４．５酢酸塩緩衝液（３７℃に予熱）を溶出媒体とし、回転速度は毎分７５回転とした。１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、６０分でそれぞれサンプリングし、さらに毎分２５０回転で３０分間経過した後にサンプリングした。５ｍＬの液体を０．４５μｍのＰＴＦＥフィルターで濾過した。高速液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、ピーク面積から外部標準法により濃度を算出した。
【0092】
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子固体分散体カプセルと通常の乾式法顆粒カプセルの溶出結果を表２４と図４１に示す。溶出試験の結果は、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子固体分散体カプセルが最も優れた溶出挙動を示し、ロット番号ＦＲ０００５７－３－１８０２０３－ＳＤＤＥＰＯ－５０－ＨＧ固体分散体カプセルは１０分で７２％、１５分で９６％の溶出度を示した。通常の乾式造粒カプセル（ロット番号Ｄ－１７０９ＦＰ２３００－０５－ＨＧ、１０分溶出度３１％、１５分溶出度３９％）よりはるかに優れていた。
【0093】
【表24】
【0094】
本明細書の具体的な実施形態では、前記のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む微粒子剤も提供される。造粒機は、通常の造粒機であってもよく、粒子内放出制御剤であってもよく、これは、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を顆粒剤に製造する。いずれも微粒子剤の崩壊により有効成分リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子を放出する。
【0095】
本明細書の具体的な実施形態では、前記微粒子剤を含有する医薬組成物を提供する。
【0096】
本明細書の具体的な実施形態では、前記のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散物を含む医薬組成物も提供する。すなわち、同組成物は、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体および他の補助材料を含む組成物であり、薬学的に許容される担体を含むこともできる。さらに、補助材料は、希釈剤、接着剤、潤滑剤、粒子内放出制御剤、崩壊剤、着色剤、味料または甘味剤のうちの１つまたは複数の賦形剤を含む。これらの組成物は、コーティングされた錠剤とコーティングされていない錠剤、硬ゼラチンカプセルと軟ゼラチンカプセル、糖衣錠、トローチ剤、ウエハース、小丸薬、密封されたパック中の粉剤などの製造に配合することができる。前記組成物は、軟膏剤、ポマード、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤などの局所使用用製剤を製造するために配合することができる。「薬学的に許容される担体」には、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル材料のような薬学的に許容される材料、組成物または媒介物が含まれ、このような材料は、生体の１つの器官または部分から生体の別の器官または部分への本発明の化学物質の運搬または輸送に関与する。各担体は、製剤の他の成分と適合可能であり、被験体に無害であるという意味で、好ましくは「許容可能」である。薬学的に許容される担体として使用できる材料のいくつかの例には、（１）乳糖、ブドウ糖及蔗糖のような糖、（２）コーンスターチおよび馬鈴薯スターチ等のデンプン類、（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、（４）粉末状のトラガカンス、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバターおよびサポジトリーワックス等の賦形剤、（９）油類、例えば落花生油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油、（１０）プロピレングリコール等のジオール類、（１１）グリセロール、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルやラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェンフリー水、（１７）等張塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エタノール、（２０）リン酸塩緩衝液、（２１）医薬製剤用の他の非毒性で適合可能な物質、が含まれる。
【0097】
本明細書の具体的な実施形態では、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における前記微粒子剤の使用も提供する。
【0098】
本明細書の具体的な実施形態では、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における前記医薬組成物の使用も提供する。
【0099】
本明細書はまた、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における前記リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体またはその組成物の使用を提供する。
【0100】
（付記１）
式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料と、溶媒とを含む、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体であって、
前記高分子担体は、ポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドンＶＡ６４、ヒドロキシプロピルセルロースＬ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＥ３、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフト共重合体、ポリメタクリレートの内の１種または複数種の組み合わせを含み、
前記機能性補助材料は、ラウリル硫酸ナトリウム、メグルミン、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステル、ツイーン８０の内の１種または複数種の組み合わせを含み、
好ましくは、前記ポリメタクリレートは、オイドラギットＥＰＯを含む、
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体。
式Ｉで示される構造を有するリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料と、溶媒とを含む、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体であって、
前記高分子担体は、ポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドンＶＡ６４、ヒドロキシプロピルセルロースＬ、ヒドロキシプロピルメチルセルロースＥ３、ポリビニルカプロラクタム－ポリ酢酸ビニル－ポリエチレングリコールグラフト共重合体、ポリメタクリレートの内の１種または複数種の組み合わせを含み、
前記機能性補助材料は、ラウリル硫酸ナトリウム、メグルミン、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステル、ツイーン８０の内の１種または複数種の組み合わせを含み、
【化3】
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体。
【0101】
（付記２）
実質的に図８に類似した１つまたは複数のＸＲＰＤによって特徴付けられる、付記１に記載の固体分散体。
実質的に図８に類似した１つまたは複数のＸＲＰＤによって特徴付けられる、付記１に記載の固体分散体。
【0102】
【0103】
（付記４）
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料との合計質量を１００％とした場合に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の使用量が２３．８％～７１．２％、高分子担体の使用量が２３．８％～７１．２％、機能性補助材料の使用量が３％～７％であることを特徴とし、
好ましくは、前記高分子担体は、ヒドロキシプロピルセルロースＬおよび／またはオイドラギットＥＰＯを含み、
好ましくは、前記機能性補助材料は、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステルおよび／またはツイーン８０である、付記１に記載の固体分散体。
リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子と、高分子担体と、機能性補助材料との合計質量を１００％とした場合に、リファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の使用量が２３．８％～７１．２％、高分子担体の使用量が２３．８％～７１．２％、機能性補助材料の使用量が３％～７％であることを特徴とし、
好ましくは、前記高分子担体は、ヒドロキシプロピルセルロースＬおよび／またはオイドラギットＥＰＯを含み、
好ましくは、前記機能性補助材料は、ビタミンＥポリエチレングリコールコハク酸エステルおよび／またはツイーン８０である、付記１に記載の固体分散体。
【0104】
（付記５）
前記溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレンの内の１種または複数種の組み合わせを含むことを特徴とする、付記１に記載の固体分散体。
前記溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、塩化メチレンの内の１種または複数種の組み合わせを含むことを特徴とする、付記１に記載の固体分散体。
【0105】
（付記６）
４０℃／７５％ＲＨまたは６０℃／解放の条件下で４週間放置したときに、ＸＲＰＤに準拠した非晶質状態を保っていることを特徴とする、付記１に記載の固体分散体。
４０℃／７５％ＲＨまたは６０℃／解放の条件下で４週間放置したときに、ＸＲＰＤに準拠した非晶質状態を保っていることを特徴とする、付記１に記載の固体分散体。
【0106】
（付記７）
付記１～６のいずれか１つに記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む、微粒子剤。
付記１～６のいずれか１つに記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む、微粒子剤。
【0107】
（付記８）
付記７に記載の微粒子剤を含む、医薬組成物。
付記７に記載の微粒子剤を含む、医薬組成物。
【0108】
（付記９）
付記１～６のいずれか１つに記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む、医薬組成物。
付記１～６のいずれか１つに記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体を含む、医薬組成物。
【0109】
（付記１０）
ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、付記１～６のいずれか１項に記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体の使用、
好ましくは、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、付記７に記載の微粒子剤の使用、
好ましくは、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、付記９に記載の医薬組成物の使用。
ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、付記１～６のいずれか１項に記載のリファマイシン－ニトロイミダゾールカップリング分子の固体分散体の使用、
好ましくは、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、付記７に記載の微粒子剤の使用、
好ましくは、ヒトの微生物感染に起因する疾患を治療するための医薬品の製造における、付記９に記載の医薬組成物の使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
