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特許7126172肝の線維化を伴い得るＮＡＦＬＤモデル動物、その作製方法、及びそれを作製するための飼料
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-18
(45)【発行日】2022-08-26
(54)【発明の名称】肝の線維化を伴い得るＮＡＦＬＤモデル動物、その作製方法、及びそれを作製するための飼料
(51)【国際特許分類】
A23K 20/168 20160101AFI20220819BHJP
A23K 50/50 20160101ALI20220819BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20220819BHJP
【ＦＩ】
A23K20/168
A23K50/50
A01K67/027
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2019547013
(86)(22)【出願日】2018-10-04
(86)【国際出願番号】 JP2018037197
(87)【国際公開番号】W WO2019070024
(87)【国際公開日】2019-04-11
【審査請求日】2020-02-07
(31)【優先権主張番号】P 2017194603
(32)【優先日】2017-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504105737
【氏名又は名称】林化成株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】505195384
【氏名又は名称】国立大学法人奈良国立大学機構
(73)【特許権者】
【識別番号】505225197
【氏名又は名称】長崎県公立大学法人
(73)【特許権者】
【識別番号】304020292
【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
(72)【発明者】
【氏名】市村 真祐子
(72)【発明者】
【氏名】大曲 勝久
(72)【発明者】
【氏名】常山 幸一
【審査官】竹中 靖典
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０８０８３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】大曲勝久ほか，非アルコール性脂肪肝炎発症モデルラットの肝組織所見に及ぼす食餌性コレステロールの影響，長崎県立大学看護栄養学部紀要，日本，2016年03月，１４巻，２３－３０，http://reposit.sun.ac.jp/dspace/bitstream/10561/1174/1/v14p23_Omagari.pdf，http://hdl.handle.net/10561/1174
【文献】堤一彦，リポ蛋白リパーゼと動脈硬化，動脈硬化，1998年，２６（３），１２９－１３２
【文献】吉松美佳，非アルコール性脂肪肝炎におけるMacrophage receptor with acollagenous structure(MARCO)の発現とエンドトキシンの関与，熊本大学大学院学位論文，2005年，１－２７
【文献】堤一彦，リポ蛋白リパーゼと動脈硬化，動脈硬化，1998年，２６（３），１２９－１３２
【文献】吉松美佳，非アルコール性脂肪肝炎におけるMacrophage receptor with acollagenous structure(MARCO)の発現とエンドトキシンの関与，熊本大学大学院学位論文，2005年，１－２７
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｋ １０／００ － ５０／９０
Ａ０１Ｋ ６７／０２７
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
コリン、コール酸又はその塩、及びコレステロールを含有し、コール酸又はその塩の含有量が、０．１質量％以上０．５質量％未満であることを特徴とする、肝の線維化を示す非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウス作製用飼料。
【請求項2】
コリンを含む標準飼料を含有することを特徴とする請求項１に記載の飼料。
【請求項3】
脂質エネルギー比率が３０％以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の飼料。
【請求項4】
マウスに請求項１～３のいずれかに記載の飼料を与えて飼育する工程を含むことを特徴とする、肝の線維化を示す非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウスの作製方法。
【請求項5】
請求項４に記載の方法により作製された肝の線維化を示す非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肝の線維化を伴い得るＮＡＦＬＤモデル動物、その作製方法、及びそれを作製するための飼料に関する。
【背景技術】
【0002】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＡＦＬＤ）は、飲酒歴がない患者の、ウィルス性肝炎などの原因が明らかなものを除外した脂肪沈着を伴う肝疾患の総称であり、病理組織学的に大滴性の肝脂肪変性を基本として、肝細胞障害（風船様の変化）や肝線維化がみられる非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）と、病態の進行がみられない非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ：ＮＡＦＬ）に大別される。ＮＡＦＬＤ患者の多くは、肥満や糖尿病、高インスリン血症、脂質異常症などを合併しており、食生活の欧米化や運動不足、肥満人口の増加に伴いわが国でもＮＡＦＬＤやＮＡＳＨ患者が増加してきている。
【0003】
これまでに、ＫＫ－Ａｙ２型糖尿病モデルマウスを用いたＮＡＳＨモデル動物が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１５－１８６４８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、遺伝子改変技術を使用しないで作製され、よりヒトに近く、利便性が高いＮＡＦＬＤモデル動物作成技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は以下の発明に関する。
［１］コール酸又はその塩、及びコレステロールを含有することを特徴とする非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウス作製用飼料。
［２］標準飼料を含有することを特徴とする前記［１］記載の飼料。
［３］脂質エネルギー比率が３０％以上であることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の飼料。
［４］マウスに前記［１］～［３］のいずれかに記載の飼料を与えて飼育する工程を含むことを特徴とする非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウスの作製方法。
［５］前記［４］に記載の方法により作製された非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウス。
［１］コール酸又はその塩、及びコレステロールを含有することを特徴とする非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウス作製用飼料。
［２］標準飼料を含有することを特徴とする前記［１］記載の飼料。
［３］脂質エネルギー比率が３０％以上であることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の飼料。
［４］マウスに前記［１］～［３］のいずれかに記載の飼料を与えて飼育する工程を含むことを特徴とする非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウスの作製方法。
［５］前記［４］に記載の方法により作製された非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウス。
【発明の効果】
【0007】
本発明の飼料を用いることにより、ＮＡＦＬＤモデルマウスを作製することができる。本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスは、遺伝子改変技術を使用しないで食餌投与のみで作製され、よりヒトに近く、利便性が高いＮＡＦＬＤモデル動物である点において、特に優れている。また、本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスは、ＮＡＳＨ病態又はＮＡＦＬ病態を示し、より好ましくはさらに肝の線維化を示し得る点でも優れている。肝の線維化は比較的短時間（例えば９週間）で発症し得る。また、本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスの好ましい利点として、例えば、体重又は体重当たりの内臓脂肪の重さの増加幅が大きい点、インスリン抵抗性を呈する点が挙げられる。本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスは、ＮＡＦＬＤの病態又はメカニズムの解明、ＮＡＦＬＤに対する新規予防又は治療薬の開発、特にかかる予防又は治療薬のスクリーニング等に有用である。
さらには、本発明の飼料は、メチオニン及びコリン無添加飼料（ＭＣＤ）のような栄養素を欠乏させていない飼料でなくてもよい点でも優れている。
さらには、本発明の飼料は、メチオニン及びコリン無添加飼料（ＭＣＤ）のような栄養素を欠乏させていない飼料でなくてもよい点でも優れている。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
１．飼料
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウス作製用飼料は、コール酸又はその塩、及びコレステロールを含有することを特徴とする。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウス作製用飼料は、コール酸又はその塩、及びコレステロールを含有することを特徴とする。
【0010】
〔飼料含有成分〕
コール酸又はその塩
コール酸は、代表的な胆汁酸である。コール酸はコレステロールの代謝によって肝臓で作られ、胆嚢に送られ、十二指腸に分泌されて、その一部が微生物によって代謝され、デオキシコール酸等の二次胆汁酸となる。コール酸は、通常アミノ酸と縮合して抱合胆汁酸となって存在している。アミノ酸として、グリシン又はタウリン等が挙げられる。コール酸は、コール酸とグリシンとの抱合胆汁酸であるグリココール酸、又はコール酸とタウリンとの抱合胆汁酸であるタウロコール酸であってもよい。
コール酸の塩は、コール酸の薬学的に許容される塩であることが好ましく、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩等の強塩基との塩、アンモニア等の弱塩基との塩等が挙げられる。コール酸又はその塩は、公知の化学合成法により製造することもでき、また市販品を購入して入手することもできる。これらは全て、本発明で使用されるコール酸の範疇に属する。
コール酸又はその塩
コール酸は、代表的な胆汁酸である。コール酸はコレステロールの代謝によって肝臓で作られ、胆嚢に送られ、十二指腸に分泌されて、その一部が微生物によって代謝され、デオキシコール酸等の二次胆汁酸となる。コール酸は、通常アミノ酸と縮合して抱合胆汁酸となって存在している。アミノ酸として、グリシン又はタウリン等が挙げられる。コール酸は、コール酸とグリシンとの抱合胆汁酸であるグリココール酸、又はコール酸とタウリンとの抱合胆汁酸であるタウロコール酸であってもよい。
コール酸の塩は、コール酸の薬学的に許容される塩であることが好ましく、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩等の強塩基との塩、アンモニア等の弱塩基との塩等が挙げられる。コール酸又はその塩は、公知の化学合成法により製造することもでき、また市販品を購入して入手することもできる。これらは全て、本発明で使用されるコール酸の範疇に属する。
【0011】
飼料中のコール酸又はその塩の含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常０．０１～２質量％であり、好ましくは０．１～１質量％であり、より好ましくは０．５質量％未満（例えば０．１～０．４５質量％）であり、特に好ましくは０．２～０．４質量％である。
飼料中のコール酸又はその塩の含有量が少ないことが好ましい（例えば、０質量％超２質量％未満）。コール酸量が少ないほど、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料中のコール酸又はその塩の含有量が少ない（例えば０．５質量％未満又は０．４質量％未満）ほど、飼料を摂取したマウスは、体重又は副睾丸脂肪等の内臓脂肪の重さ／体重が増加し、又はインスリン抵抗性を示す。飼料中のコール酸又はその塩の含有量は、具体的には、例えば０．００１質量％以上０．５質量％未満又は０．１質量％以上０．４質量％未満が好ましい。尚、飼料中のコール酸又はその塩の含有量が多い（例えば、０．５質量％超、中でも、０．５質量％超１質量％）ほど肝障害（肝線維化等）を誘導しやすい場合もある。
飼料中のコール酸又はその塩の含有量が少ないことが好ましい（例えば、０質量％超２質量％未満）。コール酸量が少ないほど、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料中のコール酸又はその塩の含有量が少ない（例えば０．５質量％未満又は０．４質量％未満）ほど、飼料を摂取したマウスは、体重又は副睾丸脂肪等の内臓脂肪の重さ／体重が増加し、又はインスリン抵抗性を示す。飼料中のコール酸又はその塩の含有量は、具体的には、例えば０．００１質量％以上０．５質量％未満又は０．１質量％以上０．４質量％未満が好ましい。尚、飼料中のコール酸又はその塩の含有量が多い（例えば、０．５質量％超、中でも、０．５質量％超１質量％）ほど肝障害（肝線維化等）を誘導しやすい場合もある。
【0012】
コレステロール
コレステロールは、公知の化学合成、微生物培養、酵素反応等により製造することもでき、また市販品を購入して入手することもできる。市販品としては、例えば、クローダジャパン株式会社製のＣＯＬＥＳＴＥＲＯＬ ＮＦ（商品名）、日本精化株式会社製のコレステロールＪＳＱＩ（商品名、日本薬局方コレステロール）、日本水産株式会社製のニッスイマリンコレステロール（商品名）等が挙げられる。飼料中のコレステロール含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常０．０１～５質量％であり、好ましくは０．１～３質量％であり、特に好ましくは１～１．５質量％である。飼料中のコレステロール含有量は高い（例えば、１質量％以上）ことが好ましい。飼料中のコレステロール含有量が高いほど、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料中のコレステロール含有量が高いほど、飼料を摂取したマウスは、高い血中ＡＬＴ値を示し、又は高度の肝線維化を示す。飼料中のコレステロール含有量は、具体的には、例えば０．０１～２．５質量％が好ましい。
コレステロールは、公知の化学合成、微生物培養、酵素反応等により製造することもでき、また市販品を購入して入手することもできる。市販品としては、例えば、クローダジャパン株式会社製のＣＯＬＥＳＴＥＲＯＬ ＮＦ（商品名）、日本精化株式会社製のコレステロールＪＳＱＩ（商品名、日本薬局方コレステロール）、日本水産株式会社製のニッスイマリンコレステロール（商品名）等が挙げられる。飼料中のコレステロール含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常０．０１～５質量％であり、好ましくは０．１～３質量％であり、特に好ましくは１～１．５質量％である。飼料中のコレステロール含有量は高い（例えば、１質量％以上）ことが好ましい。飼料中のコレステロール含有量が高いほど、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料中のコレステロール含有量が高いほど、飼料を摂取したマウスは、高い血中ＡＬＴ値を示し、又は高度の肝線維化を示す。飼料中のコレステロール含有量は、具体的には、例えば０．０１～２．５質量％が好ましい。
【0013】
標準飼料
標準飼料は、マウスの飼育に使用され得るものであればどのようなものでもよいが、通常、一般成分（例えば、水分、粗タンパク質、粗脂質、粗灰分、粗繊維、可溶性無窒素物又はこれらの２種以上（好ましくは全部））、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ３、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、イノシトール、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、コリン、葉酸、又はこれらの２種以上（好ましくは全部）の組合せ等）、ミネラル類（カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、アルミニウム、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、又はこれらの２種以上（好ましくは全部）の組合せ等）、アミノ酸（イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、ステオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、又はこれらの２種以上（好ましくは全部）の組合せ等）を含有する。
標準飼料として、オリエンタル酵母工業株式会社製のＭＦ、ＭＮＦ、ＣＭＦ、ＣＲ－ＬＰＦ、若しくはＣＲＦ－１等、又は日本クレア株式会社製のＣＥ－２等が挙げられるが、中でもＭＦが好ましい。
標準飼料は、当技術分野で通常用いられている実験動物用飼料と言い換えることができる。
標準飼料は、マウスの飼育に使用され得るものであればどのようなものでもよいが、通常、一般成分（例えば、水分、粗タンパク質、粗脂質、粗灰分、粗繊維、可溶性無窒素物又はこれらの２種以上（好ましくは全部））、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ３、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、イノシトール、ビオチン、パントテン酸、ナイアシン、コリン、葉酸、又はこれらの２種以上（好ましくは全部）の組合せ等）、ミネラル類（カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄、アルミニウム、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、又はこれらの２種以上（好ましくは全部）の組合せ等）、アミノ酸（イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、ステオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、又はこれらの２種以上（好ましくは全部）の組合せ等）を含有する。
標準飼料として、オリエンタル酵母工業株式会社製のＭＦ、ＭＮＦ、ＣＭＦ、ＣＲ－ＬＰＦ、若しくはＣＲＦ－１等、又は日本クレア株式会社製のＣＥ－２等が挙げられるが、中でもＭＦが好ましい。
標準飼料は、当技術分野で通常用いられている実験動物用飼料と言い換えることができる。
【0014】
飼料中の標準飼料含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常５０～９５質量％であり、好ましくは５５～９０質量％であり、特に好ましくは６０～８５質量％である。
【0015】
脂質エネルギー比率
脂質エネルギー比率は、次の式で求めることができる。
脂質エネルギー比率（％）＝{脂質量（グラム）×９キロカロリー／総エネルギー（キロカロリー）}×１００
飼料の脂質エネルギー比率は高い（例えば、３０％以上）ことが好ましい。飼料の脂質エネルギー比率が高いほど、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料の脂質エネルギー比率は高いほど、飼料を摂取したマウスは、体重が増加し、又は高度の肝線維化を示す。飼料の脂質エネルギー比率は具体的には、例えば３０～５０％が好ましい。それ以上であってもよいが、より大きな効果を得ることが困難である。
飼料の脂質エネルギー比率を増やすために、例えば、ヤシ油、パーム油、大豆油、綿実油、落花生油、米油等の植物油若しくはその油かす；ショートニング；マーガリン；硬化油；又は、動物性油等の油脂を飼料に含めてもよい。油脂は、その構成脂肪酸として、トランス脂肪酸、又は飽和脂肪酸を含有する油脂であることが好ましい。例えば、市販されている油脂を購入することで、油脂を入手できる。これらの油脂を含む飼料をマウスに与えることにより、優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られ得る。具体的には、これらの油脂を含む飼料をマウスに与えることにより、例えば、高度な線維化を示す又は体重若しくは体重当たりの内臓脂肪の重さが増加しているＮＡＦＬＤモデルマウスが短期間で得られる。
飼料中の油脂含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常１５～６５質量％であり、好ましくは２０～６０質量％であり、特に好ましくは２５～５０質量％である。
脂質エネルギー比率は、次の式で求めることができる。
脂質エネルギー比率（％）＝{脂質量（グラム）×９キロカロリー／総エネルギー（キロカロリー）}×１００
飼料の脂質エネルギー比率は高い（例えば、３０％以上）ことが好ましい。飼料の脂質エネルギー比率が高いほど、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料の脂質エネルギー比率は高いほど、飼料を摂取したマウスは、体重が増加し、又は高度の肝線維化を示す。飼料の脂質エネルギー比率は具体的には、例えば３０～５０％が好ましい。それ以上であってもよいが、より大きな効果を得ることが困難である。
飼料の脂質エネルギー比率を増やすために、例えば、ヤシ油、パーム油、大豆油、綿実油、落花生油、米油等の植物油若しくはその油かす；ショートニング；マーガリン；硬化油；又は、動物性油等の油脂を飼料に含めてもよい。油脂は、その構成脂肪酸として、トランス脂肪酸、又は飽和脂肪酸を含有する油脂であることが好ましい。例えば、市販されている油脂を購入することで、油脂を入手できる。これらの油脂を含む飼料をマウスに与えることにより、優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られ得る。具体的には、これらの油脂を含む飼料をマウスに与えることにより、例えば、高度な線維化を示す又は体重若しくは体重当たりの内臓脂肪の重さが増加しているＮＡＦＬＤモデルマウスが短期間で得られる。
飼料中の油脂含有量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されないが、通常１５～６５質量％であり、好ましくは２０～６０質量％であり、特に好ましくは２５～５０質量％である。
【0016】
また、本発明の飼料は、必要に応じて、一般飼料、精製飼料、滅菌飼料、特殊配合飼料等の上記標準飼料以外の実験動物用飼料；保存剤、抗酸化剤、安定化剤、酸化防止剤溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤等の飼料の分野において通常用いられる任意の公知の添加剤；及び／又は薬理学的に許容される添加剤を必要に応じて用いることもできる。これらを、目的とする飼料形態に応じて、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。これらは、市販品を使用することができる。
【0017】
保存剤としては、特に限定されないが、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤としては、特に限定されないが、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸等が挙げられる。安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、カゼイン、カゼインナトリウム塩等が挙げられる。酸化防止剤としては、例えばｔ－ブチルヒドロキノン、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、及びα－トコフェロール、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
【0018】
飼料は固形状、液体、乳化剤、ペースト、ゲル、粉末、錠剤、顆粒、ペレット、カプセル、シロップ、懸濁液又はスティック状に加工されていてもよい。固体状である場合は、略円柱状であってもよい。これらは公知方法で製造されてよい。
【0019】
本発明の飼料は、肝臓中のトリグリセリド蓄積作用、血中のＡＬＴ値を増加させる作用等を有する。また、飼料中にコレステロール等脂質を少量含むことで、飼料を摂取したマウスの体重を増加させることができる。
本発明の飼料は、これを摂取したマウスにＮＡＦＬＤの病態（特に、肝線維化）を引き起こすことができる。
本発明の飼料は、これを摂取したマウスにＮＡＦＬＤの病態（特に、肝線維化）を引き起こすことができる。
【0020】
〔飼料の製造方法〕
本発明の飼料は、上記含有成分を、適量添加し、公知又は自体公知の方法に従って、混練、撹拌及び／又は混合することにより製造することができる。
本発明の飼料は、上記含有成分を、適量添加し、公知又は自体公知の方法に従って、混練、撹拌及び／又は混合することにより製造することができる。
【0021】
２．ＮＡＦＬＤモデル動物の作製方法
本発明は、マウスに本発明の飼料を与えて飼育する工程を含むことを特徴とする非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウスの作製方法を提供する。
本発明は、マウスに本発明の飼料を与えて飼育する工程を含むことを特徴とする非アルコ－ル性脂肪肝疾患モデルマウスの作製方法を提供する。
【0022】
マウス
マウスは、遺伝子改変マウスでないことが好ましい。マウスの種類としては、例えば、Ａ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＴＳＮＯ（Ｔｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ）、 ＴＳＯＤ（Ｔｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＦＶＢ／Ｎ、１２９＋Ｔｅｒ／Ｓｖ、ＮＯＤ／Ｓｈｉ、ＮＣ、ＦＧＳ／Ｎｇａ、ＣＢＡ／ＪＮ、ＤＢＡ／１、ＤＢＡ／２、ＮＣ／Ｎｇａ、ＡＫＲ／Ｊ等の近交系又はＩＣＲ、ｄｄＹ等のクローズドコロニーが挙げられ、中でもＡ／Ｊ、又はＴＳＮＯが好ましい。
例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは標準モデルとして、Ａ／Ｊはアジア人モデル又は痩せ型モデルとして、ＴＳＮＯは強線維化モデルとして好適である。Ａ／Ｊに関して、より詳細には、アジア人は肥満型でなくてもＮＡＦＬＤになると報告されているため、肥満抵抗性を示すＡ／Ｊは、アジア人モデル又は痩せ型モデルとして好適である。ＴＳＮＯに関して、より詳細には、食餌のみで誘導できる肝線維化モデルとして好適であることが後述の試験例４によって裏付けられている。
マウスは、遺伝子改変マウスでないことが好ましい。マウスの種類としては、例えば、Ａ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＴＳＮＯ（Ｔｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ）、 ＴＳＯＤ（Ｔｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＦＶＢ／Ｎ、１２９＋Ｔｅｒ／Ｓｖ、ＮＯＤ／Ｓｈｉ、ＮＣ、ＦＧＳ／Ｎｇａ、ＣＢＡ／ＪＮ、ＤＢＡ／１、ＤＢＡ／２、ＮＣ／Ｎｇａ、ＡＫＲ／Ｊ等の近交系又はＩＣＲ、ｄｄＹ等のクローズドコロニーが挙げられ、中でもＡ／Ｊ、又はＴＳＮＯが好ましい。
例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは標準モデルとして、Ａ／Ｊはアジア人モデル又は痩せ型モデルとして、ＴＳＮＯは強線維化モデルとして好適である。Ａ／Ｊに関して、より詳細には、アジア人は肥満型でなくてもＮＡＦＬＤになると報告されているため、肥満抵抗性を示すＡ／Ｊは、アジア人モデル又は痩せ型モデルとして好適である。ＴＳＮＯに関して、より詳細には、食餌のみで誘導できる肝線維化モデルとして好適であることが後述の試験例４によって裏付けられている。
【0023】
摂餌量
通常、飼料をマウスケージ内又はケージのかぶせ蓋（網状）に、常法に従って、適量乗せることで、マウスは飼料を自由摂取する。１日当たりのマウスの摂餌量は、通常約３～５グラムであるが、これに限定されず、マウス個体が飼育条件下で実際に食べることができる量であってよい。
通常、飼料をマウスケージ内又はケージのかぶせ蓋（網状）に、常法に従って、適量乗せることで、マウスは飼料を自由摂取する。１日当たりのマウスの摂餌量は、通常約３～５グラムであるが、これに限定されず、マウス個体が飼育条件下で実際に食べることができる量であってよい。
【0024】
飼料を与える期間
飼料を与え始める時期は、離乳後であれば特に限定されないが、例えば４週齢以上であることが好ましく、５～１０週齢であることがより好ましい。飼料を与える期間は、例えば６週間以上であることが好ましく、９週間以上であることがより好ましく、１０週間以上であることがより好ましく、１１週間以上であることがより好ましい。飼料を与える期間が長いほど（例えば９週間以上）、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料を与える期間が長いほど、飼料を摂取したマウスは高度の肝線維化を示す。飼料を与える期間は、好ましくは６～５２週間であり、より好ましくは１０～２６週間又は２６～５２週間である。飼料を与える期間は、コール酸量が少ないほど長期間であることが好ましい。飼料を与える期間は、コレステロールが少ないほど長期間であることが好ましい。飼料を与える期間は、脂質エネルギー比率が低いほど長期間であることが好ましい。
マウスの飼育環境は、温度２０～２５℃、湿度５０～６０％、１２時間は明期、１２時間は暗期サイクルに設定された室内であることが好ましい。
飼料を与え始める時期は、離乳後であれば特に限定されないが、例えば４週齢以上であることが好ましく、５～１０週齢であることがより好ましい。飼料を与える期間は、例えば６週間以上であることが好ましく、９週間以上であることがより好ましく、１０週間以上であることがより好ましく、１１週間以上であることがより好ましい。飼料を与える期間が長いほど（例えば９週間以上）、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られる。具体的には、例えば、飼料を与える期間が長いほど、飼料を摂取したマウスは高度の肝線維化を示す。飼料を与える期間は、好ましくは６～５２週間であり、より好ましくは１０～２６週間又は２６～５２週間である。飼料を与える期間は、コール酸量が少ないほど長期間であることが好ましい。飼料を与える期間は、コレステロールが少ないほど長期間であることが好ましい。飼料を与える期間は、脂質エネルギー比率が低いほど長期間であることが好ましい。
マウスの飼育環境は、温度２０～２５℃、湿度５０～６０％、１２時間は明期、１２時間は暗期サイクルに設定された室内であることが好ましい。
【0025】
３．ＮＡＦＬＤモデル動物
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、病理組織学的に大滴性の肝脂肪変性を基本として、肝細胞障害（風船様変化）や肝線維化がみられる非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）と、病態の進行がみられない非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）に大別される。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスは、遺伝子改変技術を使用しないで作製され、よりヒトに近く、利便性が高いＮＡＦＬＤモデル動物である点において、特に優れている。
マウスは、他の実験動物（例えば、ラットなど）と比較し、異なる性質を有する。例えば、マウスは胆嚢を有する点でヒトに近い。また、マウスは、例えば個体の大きさが小さく、餌の量が少なくてすむ、取り扱いやすい等の点から利便性が高い。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスがＮＡＦＬＤ病態を示すことは、例えば、公知又は自体公知の生化学的測定手法により、血中トリグリセリド値、肝臓トリグリセリド値、血中コレステロール値、血中グルコース値、血中ＡＬＴ値、血中インスリン値、又は血中レプチン値等を測定し、ヒトのＮＡＦＬＤ病態と同じような挙動を示すか否かで簡単に確認することができる。同じような挙動とは、例えば、無疾患群（本発明の飼料を投与していない群）の血中トリグリセリド値、肝臓トリグリセリド値、血中コレステロール値、肝臓コレステロール値、血中グルコース値、血中ＡＬＴ値、血中インスリン値、インスリン抵抗性指標、又は血中レプチン値等と比較したこれら値の傾向（減少、又は増加）が同じであること等という。
例えば、血中インスリン値、血中グルコース値、血中コレステロール値、血中ＡＬＴ値及び肝臓トリグリセリド値のいずれか１以上について、本発明の飼料を投与していない群と比較して有意に増加している場合、本発明の飼料を投与した群は、ＮＡＦＬＤモデルマウスとして有用である。
また、例えば、体重又は体重当たりの内臓脂肪の重さの増加幅について、本発明の飼料を投与していない群と比較して有意に少なくない場合、本発明の飼料を投与した群は、ＮＡＦＬＤモデルマウスとして有用であり、本発明の飼料を投与していない群と比較して大きい場合、本発明の飼料を投与した群は、ＮＡＦＬＤモデルマウスとしてより優れている。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスがＮＡＳＨ病態を示すことは、例えば、ヘマトキシリン・エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染色、又はアザン（Ａｚａｎ）染色等により肝組織を染色し、「ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」の診断基準に従い病理観察することにより確認することができる。具体的には、肝組織を病理観察して、下記表１に示すＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）の合計点数８点中、０～２点はＮＡＳＨではない、３～４点は判定保留、５点以上はＮＡＳＨと判断することができる。
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、病理組織学的に大滴性の肝脂肪変性を基本として、肝細胞障害（風船様変化）や肝線維化がみられる非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）と、病態の進行がみられない非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）に大別される。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスは、遺伝子改変技術を使用しないで作製され、よりヒトに近く、利便性が高いＮＡＦＬＤモデル動物である点において、特に優れている。
マウスは、他の実験動物（例えば、ラットなど）と比較し、異なる性質を有する。例えば、マウスは胆嚢を有する点でヒトに近い。また、マウスは、例えば個体の大きさが小さく、餌の量が少なくてすむ、取り扱いやすい等の点から利便性が高い。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスがＮＡＦＬＤ病態を示すことは、例えば、公知又は自体公知の生化学的測定手法により、血中トリグリセリド値、肝臓トリグリセリド値、血中コレステロール値、血中グルコース値、血中ＡＬＴ値、血中インスリン値、又は血中レプチン値等を測定し、ヒトのＮＡＦＬＤ病態と同じような挙動を示すか否かで簡単に確認することができる。同じような挙動とは、例えば、無疾患群（本発明の飼料を投与していない群）の血中トリグリセリド値、肝臓トリグリセリド値、血中コレステロール値、肝臓コレステロール値、血中グルコース値、血中ＡＬＴ値、血中インスリン値、インスリン抵抗性指標、又は血中レプチン値等と比較したこれら値の傾向（減少、又は増加）が同じであること等という。
例えば、血中インスリン値、血中グルコース値、血中コレステロール値、血中ＡＬＴ値及び肝臓トリグリセリド値のいずれか１以上について、本発明の飼料を投与していない群と比較して有意に増加している場合、本発明の飼料を投与した群は、ＮＡＦＬＤモデルマウスとして有用である。
また、例えば、体重又は体重当たりの内臓脂肪の重さの増加幅について、本発明の飼料を投与していない群と比較して有意に少なくない場合、本発明の飼料を投与した群は、ＮＡＦＬＤモデルマウスとして有用であり、本発明の飼料を投与していない群と比較して大きい場合、本発明の飼料を投与した群は、ＮＡＦＬＤモデルマウスとしてより優れている。
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスがＮＡＳＨ病態を示すことは、例えば、ヘマトキシリン・エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染色、又はアザン（Ａｚａｎ）染色等により肝組織を染色し、「ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」の診断基準に従い病理観察することにより確認することができる。具体的には、肝組織を病理観察して、下記表１に示すＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）の合計点数８点中、０～２点はＮＡＳＨではない、３～４点は判定保留、５点以上はＮＡＳＨと判断することができる。
【0026】
【表1】
【0027】
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスは、より好ましくはＮＡＳＨ病態の１つとしての肝の線維化を示し得る。中でもマウスとしてＴＳＮＯマウスを採用することは、肝の線維化が示され得る点で好ましい。肝の線維化の評価は、例えば、肝組織を病理観察して、下記表２に示す判断基準に従って行い得る。
【0028】
【表2】
【0029】
本発明のＮＡＦＬＤモデルマウスがＮＡＦＬ病態を示すことは、例えば、組織診断で脂肪肝を認め、かつ肝細胞障害（風船様変性）や線維化を認めないことにより確認することができる。
【0030】
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
【実施例】
【0031】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。
【0032】
１．試験例１
（１）動物モデル及び実験デザイン
８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ６マウス）１５匹及び８週齢雄性Ａ／Ｊマウス１５匹（いずれも日本ＳＬＣ、静岡）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母、東京）を摂取させ飼育環境に順化させた。Ｂ６マウス及びＡ／Ｊマウスは順化後の９週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させたＮｏｒｍａｌ群（Ｎ群）、ＭＦに粉末パーム油２８．７５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．５質量％を添加した高脂肪飼料を摂取させた低コレステロール群（ＬＣ群）、ＭＦにパーム油２７．５質量％、コレステロール２．５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．５質量％を添加した高脂肪飼料を摂取させた高コレステロール群（ＨＣ群）の３群各４～６匹ずつに分け、１８週齢まで飼育した。飼料はオリエンタル酵母に作製を依頼し、購入した。それぞれの飼料組成及びエネルギーは下記表３に示す。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に２回、摂食量測定を２日に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
（１）動物モデル及び実験デザイン
８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ６マウス）１５匹及び８週齢雄性Ａ／Ｊマウス１５匹（いずれも日本ＳＬＣ、静岡）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母、東京）を摂取させ飼育環境に順化させた。Ｂ６マウス及びＡ／Ｊマウスは順化後の９週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させたＮｏｒｍａｌ群（Ｎ群）、ＭＦに粉末パーム油２８．７５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．５質量％を添加した高脂肪飼料を摂取させた低コレステロール群（ＬＣ群）、ＭＦにパーム油２７．５質量％、コレステロール２．５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．５質量％を添加した高脂肪飼料を摂取させた高コレステロール群（ＨＣ群）の３群各４～６匹ずつに分け、１８週齢まで飼育した。飼料はオリエンタル酵母に作製を依頼し、購入した。それぞれの飼料組成及びエネルギーは下記表３に示す。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に２回、摂食量測定を２日に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
【0033】
【表3】
【0034】
（２）動物処理
Ｂ６マウス及びＡ／Ｊマウスは１８週齢時の屠殺前に８時間絶食させたのち、ソムノペンチル（商品名、共立製薬株式会社、一般名はペントバルビタールナトリウム）麻酔下で開腹処置を行い、シリンジを用いて腹部大静脈又は心臓から採血した。直ちに肝臓を摘出し、０．９％(ｗ／ｖ)食塩水で洗浄後重量を測定した。肝臓の一部を切除し、１０％(ｗ／ｖ)中性ホルマリン液で固定した。また、肝臓の一部（０．５ｇ）を凍結保存して、後述するように脂質の抽出を行った。
Ｂ６マウス及びＡ／Ｊマウスは１８週齢時の屠殺前に８時間絶食させたのち、ソムノペンチル（商品名、共立製薬株式会社、一般名はペントバルビタールナトリウム）麻酔下で開腹処置を行い、シリンジを用いて腹部大静脈又は心臓から採血した。直ちに肝臓を摘出し、０．９％(ｗ／ｖ)食塩水で洗浄後重量を測定した。肝臓の一部を切除し、１０％(ｗ／ｖ)中性ホルマリン液で固定した。また、肝臓の一部（０．５ｇ）を凍結保存して、後述するように脂質の抽出を行った。
【0035】
（３）血清・肝臓生化学的測定
卓上遠心機（テーブルトップマイクロ冷却遠心機３５００、久保田商事、東京）で４℃、３０００ｒｐｍで１０～１５分間、上記採取した血液を遠心分離し、上清（血清）を凍結保存した。血清中の、総コレステロール、ALTを測定した。各項目の吸光度の測定にはライフサイエンス用紫外可視分光光度計 Ｖ－６３０ＢＩＯ（日本分光株式会社 ＪＡＳＣＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京）を使用した。各項目の測定原理及び方法を以下に示す。
卓上遠心機（テーブルトップマイクロ冷却遠心機３５００、久保田商事、東京）で４℃、３０００ｒｐｍで１０～１５分間、上記採取した血液を遠心分離し、上清（血清）を凍結保存した。血清中の、総コレステロール、ALTを測定した。各項目の吸光度の測定にはライフサイエンス用紫外可視分光光度計 Ｖ－６３０ＢＩＯ（日本分光株式会社 ＪＡＳＣＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京）を使用した。各項目の測定原理及び方法を以下に示す。
【0036】
〔血清中の総コレステロール〕
コレステロールオキシターゼ・ＤＡＯＳ法を用いた測定キットであるコレステロールＥ－テストワコー（和光純薬工業）を使用し、説明書通りの方法で血清中の総コレステロールの測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定した。
コレステロールオキシターゼ・ＤＡＯＳ法を用いた測定キットであるコレステロールＥ－テストワコー（和光純薬工業）を使用し、説明書通りの方法で血清中の総コレステロールの測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定した。
【0037】
〔血清中のＡＬＴ〕
（ＰＯＰ・ＴＯＯＳ）法を用いた測定キットであるトランスアミナーゼＣ－ＩＩテストワコー（和光純薬工業）を使用して、説明書通りの方法で血清ＡＬＴ濃度の測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定値とした。
（ＰＯＰ・ＴＯＯＳ）法を用いた測定キットであるトランスアミナーゼＣ－ＩＩテストワコー（和光純薬工業）を使用して、説明書通りの方法で血清ＡＬＴ濃度の測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定値とした。
【0038】
〔肝臓トリグリセリド〕
凍結保存した肝臓０．５ｇを用いて肝臓脂質を抽出し、ＴＧ濃度を測定した。抽出はＦｏｌｃｈらの方法により行った。
肝組織０．５ｇをホモジナイズし、メタノール・クロロホルム混合液（容量比１：２）約５０ｍＬでメスフラスコに洗いながら移し入れ、４０℃で３０分間振盪反応後、室温に戻してからメタノール・クロロホルム混合液を加えて５０ｍＬとした。濾過後、蒸留水約９ｍＬを加えて静かに混合し水層は捨てた。
凍結保存した肝臓０．５ｇを用いて肝臓脂質を抽出し、ＴＧ濃度を測定した。抽出はＦｏｌｃｈらの方法により行った。
肝組織０．５ｇをホモジナイズし、メタノール・クロロホルム混合液（容量比１：２）約５０ｍＬでメスフラスコに洗いながら移し入れ、４０℃で３０分間振盪反応後、室温に戻してからメタノール・クロロホルム混合液を加えて５０ｍＬとした。濾過後、蒸留水約９ｍＬを加えて静かに混合し水層は捨てた。
【0039】
＜測定方法＞
室温に戻した後、サンプルを試験管に取り、ヘキサンで希釈したサンプルからさらにサンプルを試験管に取り窒素乾固後、イソプロパノール１００μＬを加えてよく混合した。これを測定に用いた。測定にはトリグリセリドＥ－テストワコー（和光純薬工業）を用いた。
室温に戻した後、サンプルを試験管に取り、ヘキサンで希釈したサンプルからさらにサンプルを試験管に取り窒素乾固後、イソプロパノール１００μＬを加えてよく混合した。これを測定に用いた。測定にはトリグリセリドＥ－テストワコー（和光純薬工業）を用いた。
【0040】
（４）病理組織学検討
病理組織学的所見は群分けを伏せて行うブラインドにより、すべて病理医が評価した。
病理組織学的所見は群分けを伏せて行うブラインドにより、すべて病理医が評価した。
【0041】
〔ヘマトキシリン・エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）染色〕
肝組織が包理されたパラフィンブロックをミクロソームで４μｍの厚さに薄切りし、脱パラフィン処理し水洗した後、マイヤーのヘマトキシリン液にて５分間染色した。水洗後、エオジン液にて２～３分染色し、アルコールで分別した後、脱水・透徹・封入した。
肝組織が包理されたパラフィンブロックをミクロソームで４μｍの厚さに薄切りし、脱パラフィン処理し水洗した後、マイヤーのヘマトキシリン液にて５分間染色した。水洗後、エオジン液にて２～３分染色し、アルコールで分別した後、脱水・透徹・封入した。
【0042】
〔アザン（Ａｚａｎ）染色〕
肝臓組織が包理されたパラフィンブロックをミクロトームで４μｍの厚さに薄切し、脱パラフィン処理し水洗した後、１０％(ｗ／ｖ)重クロム酸カリウム水溶液と１０％(ｗ／ｖ)トリクロール酢酸水溶液を等量混合した媒染剤に１０～２０分浸した。再び水洗した後、アゾカルミンＧ液に室温で３０分以上浸した。蒸留水で水洗し、アニリン・アルコールで数秒間分別し、酢酸・アルコールで分別を停止し、水洗後、鏡検して染色状態を確認した。その後、５％(ｗ／ｖ)リンタングステン酸水溶液に１時間～１晩浸した。水洗後、アニリン青・オレンジＧ混合液に３０～６０分浸し、１００質量％アルコールで分別脱水し、３槽以上のキシロールで透徹、封入した。
肝臓組織が包理されたパラフィンブロックをミクロトームで４μｍの厚さに薄切し、脱パラフィン処理し水洗した後、１０％(ｗ／ｖ)重クロム酸カリウム水溶液と１０％(ｗ／ｖ)トリクロール酢酸水溶液を等量混合した媒染剤に１０～２０分浸した。再び水洗した後、アゾカルミンＧ液に室温で３０分以上浸した。蒸留水で水洗し、アニリン・アルコールで数秒間分別し、酢酸・アルコールで分別を停止し、水洗後、鏡検して染色状態を確認した。その後、５％(ｗ／ｖ)リンタングステン酸水溶液に１時間～１晩浸した。水洗後、アニリン青・オレンジＧ混合液に３０～６０分浸し、１００質量％アルコールで分別脱水し、３槽以上のキシロールで透徹、封入した。
【0043】
〔肝病変の評価〕
群分けを伏せて行うブラインドにより、すべて病理医が評価した。診断基準はＫｌｅｉｎｅｒらが提唱した「ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」の診断基準に従った。これはｓｔｅａｔｏｓｉｓ（脂肪沈着）、ｌｏｂｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（小葉内炎症）、ｈｅｐａｔｏｃｉｔｅｓ ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ（肝細胞の風船様変化）を上記表１に示す分類に従ってスコア化し、ＮＡＳＨの程度を評価する方法である。さらに、脂肪沈着、小葉内炎症、肝細胞の風船様変化の３カテゴリーを合わせてＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）とし、合計点数８点中、０～２点はＮＡＳＨではない、３～４点は判定保留、５点以上はＮＡＳＨと判断した。また、ｆｉｂｒｏｓｉｓ（線維化）の評価も行った。
群分けを伏せて行うブラインドにより、すべて病理医が評価した。診断基準はＫｌｅｉｎｅｒらが提唱した「ＮＡＳＨ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」の診断基準に従った。これはｓｔｅａｔｏｓｉｓ（脂肪沈着）、ｌｏｂｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（小葉内炎症）、ｈｅｐａｔｏｃｉｔｅｓ ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ（肝細胞の風船様変化）を上記表１に示す分類に従ってスコア化し、ＮＡＳＨの程度を評価する方法である。さらに、脂肪沈着、小葉内炎症、肝細胞の風船様変化の３カテゴリーを合わせてＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）とし、合計点数８点中、０～２点はＮＡＳＨではない、３～４点は判定保留、５点以上はＮＡＳＨと判断した。また、ｆｉｂｒｏｓｉｓ（線維化）の評価も行った。
【0044】
（５）肝線維化マーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）
凍結保存していた肝臓組織からＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ，滋賀）を用いて説明書通りの方法で、総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡、大阪）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成し、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに用いた。ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス、東京、日本）あるいはＳＴＥＰ Ｏｎｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、ＰＣＲの反応液の調製には、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）を用いた。プライマーの合成はＦＡＳＭＡＣ（神奈川）に依頼し、購入した。ＰＣＲ反応は説明書通りの標準的なプログラムで実施した。各目的遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量の相対比はβ－ａｃｔｉｎ遺伝子を内部標準として、比較Ｃｔ法で解析した。
凍結保存していた肝臓組織からＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ，滋賀）を用いて説明書通りの方法で、総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡、大阪）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成し、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに用いた。ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｎａｎｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス、東京、日本）あるいはＳＴＥＰ Ｏｎｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、ＰＣＲの反応液の調製には、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡）を用いた。プライマーの合成はＦＡＳＭＡＣ（神奈川）に依頼し、購入した。ＰＣＲ反応は説明書通りの標準的なプログラムで実施した。各目的遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量の相対比はβ－ａｃｔｉｎ遺伝子を内部標準として、比較Ｃｔ法で解析した。
【0045】
（６）統計処理
各項目の分析結果は、平均値±標準誤差（ＳＥ）で示し、統計解析にはＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２１（日本アイ・ビー・エム株式会社）を用いた。６群間の有意差の検定には一元配置分散分析およびＳｃｈｅｆｆｅ法（多重比較）、クロス集計はＦｉｓｈｅｒの直接確率の有意性検定にて行った。すべての検定で有意確率Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差があると判断した。
各項目の分析結果は、平均値±標準誤差（ＳＥ）で示し、統計解析にはＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２１（日本アイ・ビー・エム株式会社）を用いた。６群間の有意差の検定には一元配置分散分析およびＳｃｈｅｆｆｅ法（多重比較）、クロス集計はＦｉｓｈｅｒの直接確率の有意性検定にて行った。すべての検定で有意確率Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差があると判断した。
【0046】
〔実験結果〕
Ｂ６マウスのうちＮｏｒｍａｌ食を摂取した群をＢ６Ｎ群、コレステロール１．２５質量％添加高脂肪飼料を摂取した群をＢ６ＬＣ群、コレステロール２．５質量％添加高脂肪飼料を摂取した群をＢ６ＨＣ群と表記する。同様にＡ／ＪマウスもＡ／ＪＮ群、Ａ／ＪＬＣ群、Ａ／ＪＨＣ群と表記する。
Ｂ６マウスのうちＮｏｒｍａｌ食を摂取した群をＢ６Ｎ群、コレステロール１．２５質量％添加高脂肪飼料を摂取した群をＢ６ＬＣ群、コレステロール２．５質量％添加高脂肪飼料を摂取した群をＢ６ＨＣ群と表記する。同様にＡ／ＪマウスもＡ／ＪＮ群、Ａ／ＪＬＣ群、Ａ／ＪＨＣ群と表記する。
【0047】
（１）血清・肝臓生化学検査値
図１は血清コレステロール値を、図２は血清ＡＬＴ値を、図３は肝臓ＴＧ値を示す。
本発明の飼料の摂取により、肝臓中のトリグリセリド量が有意に増加した（図３）。また、本発明の飼料の摂取により、Ｂ６マウス及びＡ／Ｊマウスの血清コレステロール値およびＡＬＴ値が有意に増加した（図１及び２）。
図１は血清コレステロール値を、図２は血清ＡＬＴ値を、図３は肝臓ＴＧ値を示す。
本発明の飼料の摂取により、肝臓中のトリグリセリド量が有意に増加した（図３）。また、本発明の飼料の摂取により、Ｂ６マウス及びＡ／Ｊマウスの血清コレステロール値およびＡＬＴ値が有意に増加した（図１及び２）。
【0048】
〔肝組織学的所見（肝病変の評価）〕
結果を下記表４及び図４に示す。表４内の数値は個体数を示す。
結果を下記表４及び図４に示す。表４内の数値は個体数を示す。
【0049】
【表4】
【0050】
Ｂ６ＬＣ群、Ｂ６ＨＣ群、Ａ／ＪＬＣ群、及びＡ／ＪＨＣ群の肝組織所見で、ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅが５点以上の個体が認められ（表４及び図４）、ＮＡＳＨと診断される個体が得られた。Ｂ６マウスと比較してＡ／Ｊマウスの方がＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅが高いマウスが多く、Ａ／ＪマウスはＮＡＳＨ易発性を有する、又はＡ／Ｊマウスは本実験で用いた飼料成分に対する感受性が高いことが確認された。
【0051】
〔肝線維化〕
肝線維化所見がみられることはその予後の悪化の報告があることから注意すべき病変である。本実験において、ステージ２である中等度の線維化病変が確認された（図４）。線維化はＢ６及びＡ／Ｊマウスの双方において、コレステロール濃度依存的に悪化を示した。また、Ｂ６マウスと比較してＡ／Ｊマウスの方が高度な線維化病変を示した。Ａ／Ｊマウスにおいて肝臓におけるコレステロール蓄積はＢ６マウスに比べて高いレベルであり、これがＡ／Ｊマウスにおける高度な肝線維化に関与している可能性が考えられる。
肝線維化所見がみられることはその予後の悪化の報告があることから注意すべき病変である。本実験において、ステージ２である中等度の線維化病変が確認された（図４）。線維化はＢ６及びＡ／Ｊマウスの双方において、コレステロール濃度依存的に悪化を示した。また、Ｂ６マウスと比較してＡ／Ｊマウスの方が高度な線維化病変を示した。Ａ／Ｊマウスにおいて肝臓におけるコレステロール蓄積はＢ６マウスに比べて高いレベルであり、これがＡ／Ｊマウスにおける高度な肝線維化に関与している可能性が考えられる。
【0052】
〔肝線維化マーカー〕
肝線維化マーカーである各ｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量はＢ６マウス及びＡ／ＪマウスのＬＣ群及びＨＣ群において、各Ｎｏｒｍａｌ群と比較して有意に増加し又は増加傾向を示した（図５及び６）。
肝線維化マーカーである各ｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量はＢ６マウス及びＡ／ＪマウスのＬＣ群及びＨＣ群において、各Ｎｏｒｍａｌ群と比較して有意に増加し又は増加傾向を示した（図５及び６）。
【0053】
以上をまとめると、ＮＡＳＨ又は肝線維化を高度に誘導する点で、飼料中のコレステロール含量を増やし、又はＡ／Ｊマウスを用いることが好ましい。
【0054】
〔身体所見〕
全ての群の総摂取エネルギー量は同等で（図７）、各系統内においてＮｏｒｍａｌ群とコレステロール負荷群（ＬＣ，ＨＣ）の体重に有意な差はみられなかったが（図８）、Ｂ６マウス及びＡ／ＪマウスのＬＣ群及びＨＣ群において体重当たりの肝臓重量の有意な増加が確認された（図９）。
全ての群の総摂取エネルギー量は同等で（図７）、各系統内においてＮｏｒｍａｌ群とコレステロール負荷群（ＬＣ，ＨＣ）の体重に有意な差はみられなかったが（図８）、Ｂ６マウス及びＡ／ＪマウスのＬＣ群及びＨＣ群において体重当たりの肝臓重量の有意な増加が確認された（図９）。
【0055】
２．試験例２
（１）実験方法
８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス２２匹（日本ＳＬＣ）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させ飼育環境に順化させた。順化後の９週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させた普通食群、ＭＦに粉末パーム油（商品名粉末油脂P-80；ナガセサンバイオ製）２５質量％、コレステロール（商品名コレステロール；和光純薬工業製）１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩（商品名コール酸ナトリウム；和光純薬工業製）０．２質量％を添加した飼料を摂取させたコール酸０．２％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸塩０．４質量％を添加したコール酸０．４％添加食群の３群各３～１１匹ずつに分け、２０週齢まで飼育した。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
（１）実験方法
８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス２２匹（日本ＳＬＣ）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させ飼育環境に順化させた。順化後の９週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させた普通食群、ＭＦに粉末パーム油（商品名粉末油脂P-80；ナガセサンバイオ製）２５質量％、コレステロール（商品名コレステロール；和光純薬工業製）１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩（商品名コール酸ナトリウム；和光純薬工業製）０．２質量％を添加した飼料を摂取させたコール酸０．２％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸塩０．４質量％を添加したコール酸０．４％添加食群の３群各３～１１匹ずつに分け、２０週齢まで飼育した。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
【0056】
（２）実験結果
同週齢群間で有意差がなかったことから、マウスに与える飼料のコール酸の含有量がいずれであっても体重減少が見られず、ＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１０）。
さらに、マウスに与える飼料のコール酸の含有量が少ないほど、体重が増加したマウス、すなわち優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１０）。
同週齢群間で有意差がなかったことから、マウスに与える飼料のコール酸の含有量がいずれであっても体重減少が見られず、ＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１０）。
さらに、マウスに与える飼料のコール酸の含有量が少ないほど、体重が増加したマウス、すなわち優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１０）。
【0057】
３．試験例３
（１）実験方法
４週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス２２匹（日本ＳＬＣ）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させ飼育環境に順化させた。順化後の５週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させた普通食群、ＭＦに粉末パーム油（商品名粉末油脂P-80；ナガセサンバイオ製）２５質量％、コレステロール（商品名コレステロール；和光純薬工業製）１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩（商品名コール酸ナトリウム；和光純薬工業製）０．１質量％を添加した飼料を摂取させたコール酸０．１％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸塩０．４質量％を添加したコール酸０．４％添加食群の３群各３～１１匹ずつに分け、２０週齢まで飼育した。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
（１）実験方法
４週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス２２匹（日本ＳＬＣ）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させ飼育環境に順化させた。順化後の５週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させた普通食群、ＭＦに粉末パーム油（商品名粉末油脂P-80；ナガセサンバイオ製）２５質量％、コレステロール（商品名コレステロール；和光純薬工業製）１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩（商品名コール酸ナトリウム；和光純薬工業製）０．１質量％を添加した飼料を摂取させたコール酸０．１％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸塩０．４質量％を添加したコール酸０．４％添加食群の３群各３～１１匹ずつに分け、２０週齢まで飼育した。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
【0058】
（２）実験結果
同週齢群間で有意差がなかったことから、マウスに与える飼料のコール酸の含有量がいずれであっても体重減少が見られず、ＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１１）。
さらに、コール酸添加量が異なる飼料を５週齢時から１５週間摂取させると、すなわち、試験例２と比較して飼料投与開始時期を早めると、又は飼料投与期間を長くすると、より体重が増加したマウス、すなわちより優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１１）。
同週齢群間で有意差がなかったことから、マウスに与える飼料のコール酸の含有量がいずれであっても体重減少が見られず、ＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１１）。
さらに、コール酸添加量が異なる飼料を５週齢時から１５週間摂取させると、すなわち、試験例２と比較して飼料投与開始時期を早めると、又は飼料投与期間を長くすると、より体重が増加したマウス、すなわちより優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された（図１１）。
【0059】
４．試験例４
（１）実験方法
６週齢雄性Ｔｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ（ＴＳＮＯ）マウス２４匹及びＴｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ（ＴＳＯＤ）マウス１２匹（いずれも動物繁殖研究所）を入手し、標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させた普通食（ＮＭ）群、ＭＦに粉末パーム油２８．７５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．５質量％を添加した飼料を摂取させた高脂肪・コレステロール食（ＨＦＣ）群に分けた。飼料摂取開始後、３ヶ月及び６ヶ月時に屠殺した。各群６匹ずつとし、食餌及び水は自由摂取とした。本実験は動物繁殖研究所に委託し、飼料はオリエンタル酵母に作成を依頼した。本試験を実施するに当たり、各法令および指針の遵守はもとより、一般財団法人動物繁殖研究所の実験動物福祉規程および標準操作手順書に従い、動物福祉の精神に則り実施した。
二酸化炭素吸入麻酔下で開腹処置を行い、シリンジを用いて腹部大静脈から採血した。直ちに肝臓を摘出し、０．９％(ｗ／ｖ)食塩水で洗浄後重量を測定した。肝臓の一部を切除し、１０％(ｗ／ｖ)中性ホルマリン液で固定した。
試験例１に記載の血清・肝臓生化学的測定、病理組織学検討、及び肝線維化マーカーの欄に記載の方法にて、血清中のＡＬＴ、肝組織学的所見、肝線維化マーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）を分析した。各目的遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量の相対比はｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）遺伝子を内部標準として、比較Ｃｔ法で解析した。また、体重測定を２又は４週間に１回行った。
各項目の分析結果は、平均値±標準誤差（ＳＥ）で示した。群間の有意差の検定は統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２を用いて、一元配置分散分析およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法（多重比較）にて行い、有意確率Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差があると判断した。
（１）実験方法
６週齢雄性Ｔｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｎｏｎ－ｏｂｅｓｅ（ＴＳＮＯ）マウス２４匹及びＴｓｕｍｕｒａ－Ｓｕｚｕｋｉ ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ（ＴＳＯＤ）マウス１２匹（いずれも動物繁殖研究所）を入手し、標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させた普通食（ＮＭ）群、ＭＦに粉末パーム油２８．７５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．５質量％を添加した飼料を摂取させた高脂肪・コレステロール食（ＨＦＣ）群に分けた。飼料摂取開始後、３ヶ月及び６ヶ月時に屠殺した。各群６匹ずつとし、食餌及び水は自由摂取とした。本実験は動物繁殖研究所に委託し、飼料はオリエンタル酵母に作成を依頼した。本試験を実施するに当たり、各法令および指針の遵守はもとより、一般財団法人動物繁殖研究所の実験動物福祉規程および標準操作手順書に従い、動物福祉の精神に則り実施した。
二酸化炭素吸入麻酔下で開腹処置を行い、シリンジを用いて腹部大静脈から採血した。直ちに肝臓を摘出し、０．９％(ｗ／ｖ)食塩水で洗浄後重量を測定した。肝臓の一部を切除し、１０％(ｗ／ｖ)中性ホルマリン液で固定した。
試験例１に記載の血清・肝臓生化学的測定、病理組織学検討、及び肝線維化マーカーの欄に記載の方法にて、血清中のＡＬＴ、肝組織学的所見、肝線維化マーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）を分析した。各目的遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量の相対比はｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）遺伝子を内部標準として、比較Ｃｔ法で解析した。また、体重測定を２又は４週間に１回行った。
各項目の分析結果は、平均値±標準誤差（ＳＥ）で示した。群間の有意差の検定は統計解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０２を用いて、一元配置分散分析およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法（多重比較）にて行い、有意確率Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差があると判断した。
【0060】
（２）実験結果
ＴＳＮＯマウスにおけるＮＭ群及びＨＦＣ群の３ヶ月時屠殺群、並びにＴＳＯＤマウスにおけるＨＦＣ群の３ヶ月時屠殺群をそれぞれＮＭ－ＴＳＮＯ－３ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－３ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＯＤ－３ｍと表記し、ＴＳＮＯマウスにおけるＮＭ群及びＨＦＣ群の６ヶ月時屠殺群、並びにＴＳＯＤマウスにおけるＨＦＣ群の６ヶ月時屠殺群をそれぞれＮＭ－ＴＳＮＯ－６ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－６ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＯＤ－６ｍと表記する。
ＴＳＮＯマウスにおけるＮＭ群及びＨＦＣ群の３ヶ月時屠殺群、並びにＴＳＯＤマウスにおけるＨＦＣ群の３ヶ月時屠殺群をそれぞれＮＭ－ＴＳＮＯ－３ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－３ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＯＤ－３ｍと表記し、ＴＳＮＯマウスにおけるＮＭ群及びＨＦＣ群の６ヶ月時屠殺群、並びにＴＳＯＤマウスにおけるＨＦＣ群の６ヶ月時屠殺群をそれぞれＮＭ－ＴＳＮＯ－６ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－６ｍ、ＨＦＣ－ＴＳＯＤ－６ｍと表記する。
【0061】
【0062】
〔肝組織学的所見（肝病変・肝線維化の評価）〕
図１３は肝組織学的所見の結果を示す。
図１３から明らかなように、本発明の飼料の３ヶ月間又は６ヶ月間の摂取による、ＴＳＮＯマウスのＮＡＳＨ発症、さらには線維化病変が確認された。
具体的には、ＨＦＣ群では軽度の脂肪変性、炎症及び風船様肝細胞がみられＮＡＳＨを発症していた。また、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－３ｍ群ではステージ１～２程度、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－６ｍ群ではステージ２～３程度の線維化病変がみられた。
その一方で、ＴＳＯＤマウスではＮＡＳＨ発症及び線維化病変がみられたものの、ＨＦＣ－ＴＳＯＤ－３ｍ群ではステージ０～１程度、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－６ｍ群ではステージ１～２程度の線維化病変であった。
以上をまとめると、肝線維化を高度に誘導する点で、ＴＳＯＤマウスよりＴＳＮＯマウスを用いることが好ましい。
食事誘導肝線維化モデル動物としては、本モデルは線維化の程度はかなり強く、進行したＮＡＦＬＤを発症する優れたモデル動物であると言える。
図１３は肝組織学的所見の結果を示す。
図１３から明らかなように、本発明の飼料の３ヶ月間又は６ヶ月間の摂取による、ＴＳＮＯマウスのＮＡＳＨ発症、さらには線維化病変が確認された。
具体的には、ＨＦＣ群では軽度の脂肪変性、炎症及び風船様肝細胞がみられＮＡＳＨを発症していた。また、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－３ｍ群ではステージ１～２程度、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－６ｍ群ではステージ２～３程度の線維化病変がみられた。
その一方で、ＴＳＯＤマウスではＮＡＳＨ発症及び線維化病変がみられたものの、ＨＦＣ－ＴＳＯＤ－３ｍ群ではステージ０～１程度、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ－６ｍ群ではステージ１～２程度の線維化病変であった。
以上をまとめると、肝線維化を高度に誘導する点で、ＴＳＯＤマウスよりＴＳＮＯマウスを用いることが好ましい。
食事誘導肝線維化モデル動物としては、本モデルは線維化の程度はかなり強く、進行したＮＡＦＬＤを発症する優れたモデル動物であると言える。
【0063】
〔肝線維化マーカー〕
図１４及び１５は肝線維化マーカーの結果を示す。
図１４及び１５から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＴＳＮＯマウスの肝線維化マーカーの有意な増加が確認された。
具体的には、肝臓における各ｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量はＴＳＮＯマウスのＨＦＣ群において、各ＮＭ群と比較して有意に増加した。
図１４及び１５は肝線維化マーカーの結果を示す。
図１４及び１５から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＴＳＮＯマウスの肝線維化マーカーの有意な増加が確認された。
具体的には、肝臓における各ｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量はＴＳＮＯマウスのＨＦＣ群において、各ＮＭ群と比較して有意に増加した。
【0064】
〔身体所見〕
図１６は肝臓重量／体重比の結果を、図１７は体重の推移をそれぞれ示す。
図１６から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＴＳＮＯ及びＴＳＯＤマウスの肝臓重量／体重比の有意な増加が確認された。
さらに具体的には、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ群では、同週齢ＮＭ－ＴＳＮＯ及びＨＦＣ－ＴＳＯＤ群に比較して、肝臓重量／体重比が高値を示した。
尚、体重はＮＭ－ＴＳＮＯ－３ｍ及びＨＦＣ－ＴＳＮＯ－３ｍ間に有意な差はみられなかった（図１７）。
図１６は肝臓重量／体重比の結果を、図１７は体重の推移をそれぞれ示す。
図１６から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＴＳＮＯ及びＴＳＯＤマウスの肝臓重量／体重比の有意な増加が確認された。
さらに具体的には、ＨＦＣ－ＴＳＮＯ群では、同週齢ＮＭ－ＴＳＮＯ及びＨＦＣ－ＴＳＯＤ群に比較して、肝臓重量／体重比が高値を示した。
尚、体重はＮＭ－ＴＳＮＯ－３ｍ及びＨＦＣ－ＴＳＮＯ－３ｍ間に有意な差はみられなかった（図１７）。
【0065】
５．試験例５
（１）実験方法
４及び８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス２６匹（日本ＳＬＣ）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させ飼育環境に順化させた。順化後の５及び９週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させた普通食群、ＭＦに粉末パーム油（商品名粉末油脂Ｐ－８０；ナガセサンバイオ製）２５質量％、コレステロール（商品名コレステロール；和光純薬工業製）１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩（商品名コール酸ナトリウム；和光純薬工業製）０．１質量％を添加した飼料を摂取させたコール酸０．１％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．２質量％を添加したコール酸０．２％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．４質量％を添加したコール酸０．４％添加食群の４群各３～５匹ずつに分け、１６又は２４週間飼育した。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
（１）実験方法
４及び８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス２６匹（日本ＳＬＣ）を購入し、初めの１週間は標準飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母）を摂取させ飼育環境に順化させた。順化後の５及び９週齢時から、標準飼料であるＭＦを摂取させた普通食群、ＭＦに粉末パーム油（商品名粉末油脂Ｐ－８０；ナガセサンバイオ製）２５質量％、コレステロール（商品名コレステロール；和光純薬工業製）１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩（商品名コール酸ナトリウム；和光純薬工業製）０．１質量％を添加した飼料を摂取させたコール酸０．１％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．２質量％を添加したコール酸０．２％添加食群、ＭＦに粉末パーム油２５質量％、コレステロール１．２５質量％及びコール酸ナトリウム塩０．４質量％を添加したコール酸０．４％添加食群の４群各３～５匹ずつに分け、１６又は２４週間飼育した。食餌及び水は自由摂取とし、飼育期間中、体重測定を１週間に１回行った。
すべての動物は、温度２４℃、湿度５５％、７～１９時は明期、１９～７時は暗期サイクルに設定された室内で飼育した。なお、本動物実験は「奈良女子大学動物実験に関する指針」ならびに「実験動物の飼育及び保管等に関する基準（昭和５５年３月総理府告示第６号）」に則して実施した。
【0066】
屠殺前に８時間絶食させたのち、イソフルラン吸入麻酔下で開腹処置を行い、シリンジを用いて心臓から採血した。直ちに肝臓、睾丸周囲脂肪を摘出し、０．９％(ｗ／ｖ)食塩水で洗浄後重量を測定した。肝臓の一部を切除し、１０％(ｗ／ｖ)中性ホルマリン液で固定した。
【0067】
〔血清グルコース値〕
ムタロターゼ・ＧＯＤ法を用いた測定キットであるグルコースＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業）を使用し、説明書通りの方法で血清中のグルコースの測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定した。
〔血清インスリン値〕
ＥＬＩＳＡ法を用いた測定キットであるマウスインスリン測定キット（森永生科学研究所）を使用し、説明書通りの方法で血清中のインスリンの測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定した。
〔インスリン抵抗性指標〕
インスリン抵抗性指標は血清インスリン濃度および血清グルコース濃度を用い、次式により求めた。なお、本実験では国際単位の代わりに血清インスリン濃度（ng/mL）を用いて算出し、インスリン抵抗性の相対的な強弱を比較することで検討を行った。
インスリン抵抗性指標 ＝ 血清インスリン値 (ng/mL) × 血清グルコース値 (mg/dL) ÷ ４０５
ムタロターゼ・ＧＯＤ法を用いた測定キットであるグルコースＣＩＩ－テストワコー（和光純薬工業）を使用し、説明書通りの方法で血清中のグルコースの測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定した。
〔血清インスリン値〕
ＥＬＩＳＡ法を用いた測定キットであるマウスインスリン測定キット（森永生科学研究所）を使用し、説明書通りの方法で血清中のインスリンの測定を行った。
測定は１検体につき２回行い、その平均値を測定した。
〔インスリン抵抗性指標〕
インスリン抵抗性指標は血清インスリン濃度および血清グルコース濃度を用い、次式により求めた。なお、本実験では国際単位の代わりに血清インスリン濃度（ng/mL）を用いて算出し、インスリン抵抗性の相対的な強弱を比較することで検討を行った。
インスリン抵抗性指標 ＝ 血清インスリン値 (ng/mL) × 血清グルコース値 (mg/dL) ÷ ４０５
【0068】
〔血清中のＡＬＴ、肝臓トリグリセリド、肝組織学的所見、肝線維化マーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）〕
試験例１に記載の血清・肝臓生化学的測定、病理組織学検討、及び肝線維化マーカーの欄に記載の方法にて、血清中のＡＬＴ、肝臓トリグリセリド、肝組織学的所見、肝線維化マーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）を分析した。各目的遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量の相対比はＧａｐｄｈ遺伝子を内部標準として、比較Ｃｔ法で解析した。
試験例１に記載の血清・肝臓生化学的測定、病理組織学検討、及び肝線維化マーカーの欄に記載の方法にて、血清中のＡＬＴ、肝臓トリグリセリド、肝組織学的所見、肝線維化マーカー（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）を分析した。各目的遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｔｇｆ－β１）の発現量の相対比はＧａｐｄｈ遺伝子を内部標準として、比較Ｃｔ法で解析した。
【0069】
各項目の分析結果は、平均値±標準誤差（ＳＥ）で示した。同週齢３群間及び２群間の有意差の検定には一元配置分散分析及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法、並びに対応のないt検定を用い、有意確率Ｐ＜０．０５を統計学的に有意差があると判断した。
【0070】
（２）実験結果
〔血清・肝臓生化学検査値〕
表５は血清ＡＬＴ値、血清グルコース値、血清インスリン値及びインスリン抵抗指標の結果を示す。
〔血清・肝臓生化学検査値〕
表５は血清ＡＬＴ値、血清グルコース値、血清インスリン値及びインスリン抵抗指標の結果を示す。
【0071】
【表5】
【0072】
表５から明らかなように、本発明の飼料摂取により、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清ＡＬＴ値が有意に増加した。
特に、コール酸０．４％添加食群では、コール酸０．２％添加食群に比較して、血清ＡＬＴ値が高値を示した。
その一方で、コール酸０．２％添加食群では、コール酸０．４％添加食群に比較して、インスリン抵抗性指標が高値傾向を示した。インスリン抵抗性はヒトにおけるＮＡＳＨ病態で高頻度にみられることから、インスリン抵抗性指標が普通食摂取群より高値を示すことがより望ましく、コール酸添加濃度は０．４％より０．２％の方がより優れたＮＡＦＬＤモデル動物を作製できるといえる。
特に、コール酸０．４％添加食群では、コール酸０．２％添加食群に比較して、血清ＡＬＴ値が高値を示した。
その一方で、コール酸０．２％添加食群では、コール酸０．４％添加食群に比較して、インスリン抵抗性指標が高値傾向を示した。インスリン抵抗性はヒトにおけるＮＡＳＨ病態で高頻度にみられることから、インスリン抵抗性指標が普通食摂取群より高値を示すことがより望ましく、コール酸添加濃度は０．４％より０．２％の方がより優れたＮＡＦＬＤモデル動物を作製できるといえる。
【0073】
〔肝組織学的所見（肝病変・肝線維化の評価）〕
図１８は肝組織学的所見の結果を示す。
図１８から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝線維化が確認された。
特に、コール酸０．４％添加食群において、脂肪変性及び高度な炎症がみられた。また、線維化は中心静脈周囲に極軽度にみられた。コール酸０．２％及び０．１％添加食群において、軽度～中等度の脂肪変性及び炎症がみられ、ＮＡＳＨの特徴的な所見がみられた。線維化は中心静脈周囲及び肝細胞周囲に軽度な病変（ステージ１）がみられた。
図１８は肝組織学的所見の結果を示す。
図１８から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝線維化が確認された。
特に、コール酸０．４％添加食群において、脂肪変性及び高度な炎症がみられた。また、線維化は中心静脈周囲に極軽度にみられた。コール酸０．２％及び０．１％添加食群において、軽度～中等度の脂肪変性及び炎症がみられ、ＮＡＳＨの特徴的な所見がみられた。線維化は中心静脈周囲及び肝細胞周囲に軽度な病変（ステージ１）がみられた。
【0074】
〔肝線維化マーカー〕
図１９及び２０は肝線維化マーカーの結果を示す。
図１９及び２０から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝線維化マーカーの有意な増加又は増加傾向が確認された。
図１９及び２０は肝線維化マーカーの結果を示す。
図１９及び２０から明らかなように、本発明の飼料摂取によるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肝線維化マーカーの有意な増加又は増加傾向が確認された。
【0075】
〔身体所見〕
下記表６は体重及び睾丸周囲脂肪重量／体重比の結果を示す。
表６から明らかなように、特に、コール酸添加濃度が０．１又は０．２質量％である飼料摂取群において、同週齢普通食群に比較して、体重及び睾丸周囲脂肪重量／体重比の増加が確認された。すなわち、コール酸添加濃度が０．４質量％未満（例えば０．１又は０．２質量％）である飼料を摂取させることにより、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された。
下記表６は体重及び睾丸周囲脂肪重量／体重比の結果を示す。
表６から明らかなように、特に、コール酸添加濃度が０．１又は０．２質量％である飼料摂取群において、同週齢普通食群に比較して、体重及び睾丸周囲脂肪重量／体重比の増加が確認された。すなわち、コール酸添加濃度が０．４質量％未満（例えば０．１又は０．２質量％）である飼料を摂取させることにより、より優れたＮＡＦＬＤモデルマウスが得られることが確認された。
【0076】
【表6】
【産業上の利用可能性】
【0077】
本発明のモデル動物、その作製方法、及びそれを作製するための飼料は、ＮＡＦＬＤの病態又はメカニズムの解明、ＮＡＦＬＤに対する新規予防又は治療薬の開発等に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
