特許 7126605 タンパク質またはペプチド濃度を判定する方法およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-08-18

(45)【発行日】2022-08-26

(54)【発明の名称】タンパク質またはペプチド濃度を判定する方法およびその使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 24/08 20060101AFI20220819BHJP

【ＦＩ】

G01N24/08 510Q

G01N24/08 510L

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021508301

(86)(22)【出願日】2019-08-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-12-16

(86)【国際出願番号】 US2019046437

(87)【国際公開番号】W WO2020041053

(87)【国際公開日】2020-02-27

【審査請求日】2021-02-17

(31)【優先権主張番号】62/720,607

(32)【優先日】2018-08-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/727,708

(32)【優先日】2018-09-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100139310

【弁理士】

【氏名又は名称】吉光 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ブラッドリー，スコット アラン

(72)【発明者】

【氏名】ジャクソン，ウェスリー クリントン，ジュニア．

(72)【発明者】

【氏名】ワイズ，ウィリアム エフ．アイブイ

【審査官】嶋田 行志

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１７９５３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００２－５３１０６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５０２４５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５１０４６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２５３２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】Profiling Formulated Monoclonal Antibodies by 1H NMR Spectroscopy，Analytical Chemistry，米国，American Chemical Society，2013年09月05日，Vol. 85，pp. 9623-9629，doi: 10.1021/ac401867f

【文献】Reduction of Guanosyl Radicals in Reactions with Proteins Studied by TR-CIDNP，Applied Magnetic Resonance，Springer，2012年10月12日，Vol. 44，pp. 233-245，doi: 10.1007/s00723-012-0403-0

【文献】Quantitative 1H NMR spectroscopy，Trends in Analytical Chemistry，Elsevier Ltd.，2012年05月01日，Vol. 35，pp. 5-26，doi: 10.1016/j.trac.2012.02.007

【文献】Simple NMR methods for evaluating higher order structures of monoclonal antibody therapeutics with quinary structure，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，Elsevier B. V.，2016年06月07日，Vol. 128，pp. 398-407，doi: 10.1016/j.jpba.2016.06.007

【文献】Optimizationod Diffusion-Filtered NMR Experiments for Selective Suppression of Residual Nondeuterated Solvent and Water Signals from 1H NMR Spectra of Organic Compounds，Journal of Organic Chemistry，Vol. 71，米国，Americal Chemical Society，2006年04月21日，pp. 4103-4110，doi: 10.1021/jo060229i

【文献】Characterizing monoclonal antibody formulations in arginine glutamate solutions using 1H NMR spectroscopy，MABS，Taylor & Francis，2016年09月02日，Vol. 8, No. 7，pp. 1245-1258，doi: 10.1080/19420862.2016.1214786

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２４／００－Ｇ０１Ｎ ２４／１４

Ｇ０１Ｒ ３３／２８－Ｇ０１Ｒ ３３／６４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

Ｏｘｆｏｒｄ Ｊｏｕｒｎａｌｓ

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌｉｎｋ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

溶液中のタンパク質の絶対タンパク質濃度を判定する方法であって、
ａ．前記タンパク質を変性させるステップと、
ｂ．前記変性されたタンパク質に対してｑＮＭＲ分光法を実行するステップであって、ｑＮＭＲ分光法を実施する前記ステップが、拡散フィルタの使用を含む、実行するステップと、
ｃ．参照標準および参照技術を使用して、前記タンパク質の前記絶対タンパク質濃度を計算するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

さらに、
ｄ．前記タンパク質の前記計算された濃度から前記タンパク質の前記分子パラメータを判定するステップと、を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記タンパク質の前記分子パラメータが、吸光係数、屈折率、または部分比容積を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記吸光係数がランベルトベールの法則によって判定される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記タンパク質が、カオトロピック剤を用いて変性される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記カオトロピック剤が、塩化グアニジニウム－ｄ６または尿素－ｄ_４である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記参照標準が、外部参照標準である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記外部参照標準が、小分子一次標準である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記外部参照標準が、マレイン酸である、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記溶液が、Ｄ_２Ｏを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記参照技術が、ＰＵＬＣＯＮである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ｄ．において判定されたタンパク質のパラメータを使用して、後続の試験バッチにおけるタンパク質またはペプチドの濃度を決定するステップをさらに含む、請求項２、７～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ロットリリース時試験が、ＵＶ試験を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記タンパク質が、抗体である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記抗体が、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記タンパク質が、融合タンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記タンパク質が、ペプチドである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質またはペプチドの濃度および／または吸光係数などの分子特異的パラメータを判定する方法、およびそれらの使用法に関する。

【背景技術】

【0002】

溶液中のペプチドまたはタンパク質、例えば抗体の濃度は、生物学的治療薬の開発および商業化、ならびに他の多くの研究分野において重要な特性である。例えば、薬剤の有効性を判定し、規制当局への申請のためにデータをまとまったパッケージに統合するためには、正確かつ精密な濃度が必要である。

【0003】

現在、溶液中のタンパク質の濃度を判定するためのいくつかのアプローチが存在している。１つのかかるアプローチは、ＵＶ吸光係数（ε）または微分屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）などの分子固有のパラメータを判定することを含む。他のアプローチとして、（ｉ）重量分析（Ｎｏｚａｋｉ Ｙ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９（２），４３７－４４６（１９８６））、（ｉｉ）発色法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２（１－２），２４８－２５４（１９７６））、（ｉｉｉ）ケルダール窒素判定（Ｊａｅｎｉｃｋｅ Ｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１（２），６２３－６２７（１９７４））、および（ｉｖ）アミノ酸分析（「ＡＡＡ」）（Ｓｐａｃｋｍａｎ Ｄ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３０（７）：１１９０－１２０６（１９５８））が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、タンパク質の固有の特性とは対照的に、リガンド結合、分解、誘導体化などの実験的に得られたタンパク質の特性に依存しており、不正確で不精密な結果につながる可能性がある。

【0004】

例えば、ＵＶ吸光係数（ε）法では、εは実験計算から予測されるが、結果は推定値であり、実際の値ではない（例えば、Ｅｄｅｌｈｏｃｈ Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６（７），１９４８－１９５４（１９６７）を参照）。さらに、例えば、凍結乾燥タンパク質の重量分析は、かなりの量の結合水、塩、および／または他の製剤成分を含み得、これは、不正確な濃度計算につながり得る。発色法は、タンパク質の組成に依存し、絶対濃度を提供するために検量線が必要である。ＡＡＡによって実行される濃度判定での過酷な条件の使用からも、課題および制限が生じる。例えば、加水分解および誘導体化ステップ中に、一部の重要なアミノ酸の分解、長い実行時間、および高い変動性を引き起こす可能性がある。（Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ Ｇ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｓｓｏｃ．ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｓ ７１（４）， ８３３－８３８ （１９８８））．上記の課題は全て、タンパク質またはペプチドの濃度および分子固有のパラメータを計算する際の正確度と精度の低下につながり、これは、分子の有効性、開発可能性、および商品化に影響を与え得る。

【0005】

このように、タンパク質の構造および製剤成分に関係なく、分子相互作用または検量線に依存せずに絶対濃度を提供し、より正確かつ精密であり、過酷なサンプル調製を回避する、新たな正確な絶対タンパク質濃度法が所望されている。かかる方法は、例えば、治療的使用を目的とするタンパク質またはペプチドの調製におけるタンパク質またはペプチドの濃度を判定するのに有用である。

【0006】

核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は、化合物の濃度を測定するために使用されている定量的手法である。しかしながら、治療用抗体製剤のような複雑なマトリックス中の大きなタンパク質の絶対濃度を測定するためにＮＭＲ分光法を使用することは困難であり、上記と同様の課題を抱えている。例えば、課題の１つに、ＮＭＲスペクトルが、様々な塩、緩衝液、界面活性剤、張性剤、さらには治療用製剤に存在する水からの強いピークによって左右されることがある。別のかかる課題は、多くのタンパク質と抗体の高次構造が水素原子の周りに固有の磁気環境を作り出し、それが特定のアミノ酸に対してより大きな^１Ｈ化学シフトウィンドウを引き起こすことである。これらの問題は、ＮＭＲの使用によってもたらされる他の固有の課題（例えば、タンパク質共鳴の本質的に広い線幅）とともに、濃度および分子固有のパラメータまたはタンパク質を計算する際の正確度と精度の低下につながる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、絶対タンパク質またはペプチド濃度を測定するための新規の定量的核磁気共鳴分光法を提供するものである。本発明のｑＮＭＲ分光法は、複雑な溶液であっても高分解能の共鳴を伴うタンパク質またはペプチドのクリーンなスペクトルを生成する。第１のステップは、タンパク質を変性させて（小さなペプチドの場合、このステップは任意であるが、推奨される）、２次、３次、および４次構造によって引き起こされるタンパク質共鳴の線幅を減らし、積分を可能にする。第２のステップは、拡散フィルタを用いてｑＮＭＲスペクトルを取得し、水およびその他の製剤成分の共鳴を排除する。最後に、データは正確な濃度判定のために参照標準と比較される。この方法は、本明細書では方法Ａと称される。方法Ａから判定された濃度を使用して、次に、タンパク質またはペプチドの吸光係数などの分子パラメータを判定することができる。

【0008】

このように、本発明は、溶液中のタンパク質の濃度を取得する方法を提供し、本方法は、タンパク質を変性させることと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してタンパク質の濃度を計算することと、を含む。本発明はまた、溶液中のペプチドの濃度を取得する方法を提供し、本方法は、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してペプチドの濃度の計算することと、を含む。一部の実施形態では、本方法は、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実施する前にペプチドを変性させることをさらに含む。

【0009】

本発明は、溶液中のタンパク質の吸光係数を取得する方法を提供し、ここで、吸光係数は、ランベルトベールの法則によって判定され、ランベルトベールの法則で使用されるタンパク質濃度は、タンパク質を変性させることと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してタンパク質の濃度を計算することと、を含む、方法において判定される。

【0010】

本発明はまた、溶液中のペプチドの吸光係数を取得する方法を提供し、ここで、吸光係数は、ランベルトベールの法則によって判定され、ランベルトベールの法則で使用されるペプチド濃度は、ペプチドを変性させる任意のステップと、続いて拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行するステップと、参照標準を使用してタンパク質の濃度を計算するステップと、を含む、方法において判定される。一部の実施形態では、本方法は、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実施する前にペプチドを変性させることを含む。

【0011】

本発明は、薬剤物質または薬剤製品の調製においてタンパク質の濃度を判定する方法を提供し、ここで、物質は、溶液中のタンパク質を含み、本方法は、タンパク質の分子パラメータを取得することを含む。一部の実施形態では、分子パラメータは、吸光係数であり、吸光係数は、ランベルトベールの法則によって判定され、ランベルトベールの法則で使用されるタンパク質濃度は、タンパク質を変性させることと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してタンパク質の濃度を計算することと、を含む、方法において判定される。

【0012】

本発明は、薬剤物質または薬剤製品の調製においてペプチドの濃度を判定する方法を提供し、ここで、物質は、溶液中のペプチドを含み、本方法は、ペプチドの分子パラメータを取得することを含む。一部の実施形態では、分子パラメータは吸光係数であり、吸光係数はランベルトベールの法則によって判定され、ランベルトベールの法則で使用されるペプチド濃度は、ペプチドを変性させてもよいことと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してペプチドの濃度を計算することと、を含む、方法において判定される。一部の実施形態では、本方法は、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実施する前にペプチドを変性させることを含む。

【0013】

本発明はさらに、溶液中のタンパク質の分子パラメータを取得する方法を提供し、本方法は、タンパク質を変性させることと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してタンパク質の濃度を計算することと、計算された濃度からタンパク質の分子パラメータを判定することと、を含む。一実施形態では、タンパク質の計算された濃度および判定された系特性は、タンパク質の分子パラメータを判定するための対応する数式で使用される。一部の実施形態では、分子パラメータは吸光係数であり、対応する数式はランベルトベールの法則である。

【0014】

本発明はまた、溶液中のペプチドの分子パラメータを取得する方法を提供し、本方法は、ペプチドを変性させてもよいことと、次いで拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してペプチドの濃度を計算することと、計算された濃度からタンパク質の分子パラメータを判定することと、を含む。一実施形態では、ペプチドの計算された濃度および判定された系特性は、ペプチドの分子パラメータを判定するための対応する数式で使用される。一部の実施形態では、分子パラメータは吸光係数であり、対応する数式はランベルトベールの法則である。

【0015】

本発明は、薬剤物質または薬剤製品の調製において用量を判定する方法を提供し、ここで、物質は、溶液中のタンパク質を含み、本方法は、参照バッチからタンパク質の分子パラメータを取得することを含み、分子パラメータは、タンパク質を変性させることと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してタンパク質の濃度を計算することと、計算された濃度からタンパク質の分子パラメータの判定することと、を含む、方法において判定される。さらなる実施形態では、本方法は、薬剤物質または薬剤製品の試験バッチを調製することを含み、試験バッチ中のタンパク質の当該濃度は、分子パラメータから判定される。一部のかかる実施形態において、タンパク質濃度は、対応する数式において、分子パラメータおよび対応する系特性を使用して判定される。

【0016】

本発明は、薬剤物質または薬剤製品の調製において用量を判定する方法を提供し、ここで、物質は、溶液中のペプチドを含み、本方法は、参照バッチからペプチドの分子パラメータを取得することを含み、分子パラメータは、ペプチドを変性させてもよいことと、拡散フィルタを用いてＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準を使用してペプチドの濃度を計算することと、計算された濃度からペプチドの分子パラメータの判定することと、を含む、方法において判定される。さらなる実施形態では、本方法は、薬剤物質または薬剤製品の試験バッチを調製することを含み、試験バッチ中のペプチドの当該濃度は、分子パラメータから判定される。一部のかかる実施形態において、ペプチド濃度は、対応する数式において、分子パラメータおよび対応する系特性を使用して判定される。

【0017】

本発明はまた、参照バッチの調製におけるタンパク質またはペプチドの濃度を判定する方法を提供し、ここで、参照バッチは、溶液中のタンパク質またはペプチドを含み、本方法は、タンパク質を変性させるか、またはペプチドを変性させてもよいことと、拡散フィルタを用いてｑＮＭＲ分光法を実行することと、参照標準および参照技術を使用してタンパク質またはペプチドの濃度を計算することと、計算された濃度からタンパク質またはペプチドの分子パラメータを判定することと、を含む。さらなる実施形態では、本方法は、試験バッチの調製物中のタンパク質またはペプチドの濃度を判定することをさらに含み、試験バッチ中のペプチドまたはタンパク質の当該濃度は、分子パラメータから判定される。

【0018】

本発明は、本明細書に記載の方法に適用可能な実施形態を提供する。かかる一実施形態は、タンパク質またはペプチドがカオトロピック剤を用いて変性される方法を含む。一部のかかる実施形態において、カオトロピック剤は尿素－ｄ_４である。他のかかる実施形態において、カオトロピック剤は塩化グアニジン－ｄ_６である。一部の実施形態では、参照標準は内部参照標準である。好ましい実施形態では、参照標準は外部参照標準である。一部のかかる実施形態では、外部参照標準は、小分子一次標準である。特定の実施形態では、外部参照標準はマレイン酸である。一部のかかる実施形態では、外部参照技術はＰＵＬＣＯＮである。一部の実施形態では、タンパク質は抗体である。一部のかかる実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。他のかかる実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。一部の実施形態では、測定されるタンパク質またはペプチドを含む溶液は、Ｄ_２Ｏを含む。

【0019】

本発明はまた、様々な用途において、方法Ａ、または方法Ａで得られた濃度から判定される分子パラメータの使用を企図する。かかる用途には、毒物学、臨床的、および／または市販の薬剤製品の用量を判定する方法、企業または一次参照標準を判定する方法、製造中のタンパク質またはペプチドの濃度を判定する方法、タンパク質またはペプチドを分注する方法、分注されたタンパク質またはペプチドの濃度が所望の濃度に類似しているタンパク質またはペプチドを分注する方法、ロットリリース時試験を含む方法、または薬剤物質または薬剤製品を処方する方法が含まれる。

【0020】

本発明は、方法Ａが、治療薬または油の分野におけるタンパク質またはペプチドなどの任意のタンパク質またはペプチドに関する本明細書に記載の目的のために使用され得ることを企図する。例として（限定することを意図しない）、方法Ａは、そのかかる任意のバイオ類似体を含む、以下のいずれかまたは全てに関連する用途で実施され得、ここで、タンパク質またはペプチドは、以下のまたは任意のかかるバイオ類似体の活性成分である：デュラグルチド（Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ（登録商標）の名前で一部の国で販売）、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ（登録商標）の名前で一部の国で販売）、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）の名前で一部の国で販売）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の名前で一部の国で販売）、オララツマブ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ（登録商標）の名前で一部の国で販売）、ネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（登録商標）の名前で一部の国で販売）、ガルカネズマブ（ＬＹ２９５１７４２としても既知）などの抗ＣＧＲＰ抗体、ミリキズマブ（ＬＹ３０７４８２８としても既知）などの抗ＩＬ－２３抗体、ソラネズマブ（ＬＹ２０６２４３０としても既知）、タネズマブ、抗Ｎ３ｐＧ－Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗Ａβ４２抗体、抗ＢＡＦＦ／ＩＬ－１７二重特異性抗体、抗ＣＳＦ－１Ｒ抗体、抗ＣＸＣＲ１／２抗体、抗ＩＬ－２１抗体、抗ＩＬ－２３／ＣＧＲＰ二重特異性抗体、抗ＩＬ－３３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗ＴＩＭ－３抗体。

【0021】

本発明はまた、（ｉ）方法Ａがタンパク質またはペプチドの他の固有のパラメータを測定するための基礎として役立つか、または現在の相対濃度法のいずれかを絶対法に変換するための基礎として役立つように適していることと、（ｉｉ）方法Ａを使用して、発色性アミノ酸を欠き、ＵＶによるモニタリングが困難なペプチドを定量化することができることと、（ｉｉｉ）方法Ａにより、現在のＡＡＡ法よりも簡単、迅速、かつ安全なサンプル調製およびデータ取得が可能となることと、（ｉｖ）方法Ａにより、様々なタンパク質および製剤に好適である結果の濃度の直線性、精度、および正確度が提供されることと、（ｖ）方法Ａを使用して、小分子汚染物質の存在下で、他のタイプの高分子（ポリマー、界面活性剤など）を定量化することができることと、を企図している。

【0022】

本発明は、本明細書に記載の方法が、本明細書にも記載の数式を利用することができることを企図している。例えば、１リットルあたりのグラム数の単位でのタンパク質濃度ｃ_Ｐは、次の式を使用してｑＮＭＲスペクトルから計算することができる。

【数1】

【0023】

この数式の詳細な説明は、例えば、本明細書に記載されている。

【0024】

当業者は、特定のソフトウェアプログラムが本明細書に例示されているが、他のプログラムを使用して同等の結果を得ることができることを認識するであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】Ａｇｉｌｅｎｔ社の分光計のｂｐｐｓｔｅパルスシーケンス（別名、Ｄｂｐｐｓｔｅ）と様々な遅延の定義。

【図2】ＮＩＳＴ ｍＡｂの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。（Ａ）標準的なワンパルスシーケンスでネイティブの形態の、（Ｂ）垂直スケール５０００倍でＡと同じ、（Ｃ）拡散フィルタを用いたネイティブの、および（Ｄ）拡散フィルタを用いて変性させた、ＮＩＳＴのｍＡｂの^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。アスタリスクでマークされたピークは、ヒスチジンバッファ由来のピークである。スキャン数は、Ａ～Ｃで１０２４回、Ｄで６４回であった。

【図3A】ＮＩＳＴ ｍＡｂのＤ測定。図３ａ：ｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスで取得した変性ｍＡｂ標準のＮＭＲスペクトル。挿入図：Ｉ／Ｌ／Ｖ共鳴のピークの拡大。挿入図：表示されている領域の拡大画像。

【図3B】図３ｂ：左：ＤＥＣＲＡアルゴリズムによって判定された様々な拡散種の純粋なＮＭＲスペクトル。右：ＤＥＣＲＡアルゴリズムからのＳｔｅｊｋａｌ－Ｔａｎｎｅｒプロットと拡散係数。

【図4A】ＮＩＳＴ ｍＡｂ上でのＴ_１およびＴ_２測定。図４ａ：ｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスを使用したＴ_１とＴ_２の測定からの代表的なデータ。左：Ｔ_１を測定するためのｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスセットアップのためのＮＭＲスペクトルとパラメータ。右：Ｔ_２を測定するためのｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスセットアップのためのＮＭＲスペクトルとパラメータ。

【図4B】図４ｂ：Ｔ_１およびＴ_２の計算のためのプロット。

【図5】変性ＮＩＳＴ ＢＳＡの１４サンプルのＤＦ－ｑＮＭＲスペクトル。挿入図：表示されている領域の拡大画像。

【図6】ＮＩＳＴ ＢＳＡサンプル濃度：方法Ａと重量測定。

【図7】ＮＩＳＴ ＢＳＡ部分比容積：サンプル密度対ＢＳＡ濃度。

【図8】変性二重特異性抗体の１４サンプルのＤＦ－ｑＮＭＲスペクトル。変性二重特異性抗体の１４サンプルのＤＦ－ｑＮＭＲスペクトル。残留水のピークにはアスタリスクが付されている。挿入図：表示されている領域の拡大画像。

【図9】二重特異性抗体サンプル濃度：方法Ａと重量測定。

【0026】

定義
本明細書で使用される場合、「核磁気共鳴分光法」（「ＮＭＲ分光法」とも称される）は、当業者に既知の分光技術を指し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを使用して、有機分子の構造を研究することができる。本明細書で使用される場合、「定量的核磁気共鳴分光法」（「ｑＮＭＲ分光法」とも称される）は、１つ以上のＮＭＲスペクトルからサンプルの純度または濃度に関する定量的情報を取得することを指す。かかるスペクトルは、本明細書では、定量的核磁気共鳴（ｑＮＭＲ）スペクトルと称される。ＮＭＲ分光法は、「拡散フィルタ」の使用を組み込むことができ、これは、サイズに基づいて混合物中のより小さな分子の信号を選択的に減衰させるために使用することができる（例えば、Ｓｔｉｌｂｓ Ｐ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．１９（１）：１－４５（１９８７）を参照）。マトリックスピークとタンパク質ピークの減衰のバランスをとるために、拡散フィルタの強度は、各実験環境に基づいて当業者が判定することができる。例えば、バランスが弱すぎる場合、拡散フィルタの値は制限される。バランスが強すぎると、拡散フィルタがタンパク質信号の抑制を開始し、測定の信号対雑音比が低下する。この低下により、実験時間が長くなる可能性がある。別の例として、マトリックス成分の１つが完全に除去されておらず、干渉ピークを示している場合、タンパク質のピーク面積に寄与しているため、最も正確な結果を得るには、それを差し引く必要がある。これは、タンパク質を含まないマトリックスを含むブランクサンプルを調製し、ブランクサンプルを拡散フィルタを用いて実行し、残りのマトリックスピークの面積を判定し、タンパク質サンプルで得られた面積からこの数値を差し引くことによって実行することができる。

【0027】

本明細書で使用する場合、「参照標準」とは、その^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルが既知の数のプロトンを表す少なくとも１つの特徴的なピークを提供する化合物であって、その純度および濃度が高い確実性で既知である化合物を指す。参照標準は、内部参照標準であってもよく、この場合、参照標準は対象のタンパク質またはペプチドを含む溶液中に存在する。または、参照標準は、外部参照標準であってもよく、この場合、参照標準は対象のタンパク質またはペプチドを含む溶液から分離されている。参照標準は、小分子一次参照標準であってもよい。小分子一次参照標準は、別の標準に対して較正されておらず、代わりにその質量などの品質によって定義される材料である。^１Ｈ ｑＮＭＲ内部標準として一般的に使用される小分子認定参照材料は、容易に入手可能であり、外部標準としても使用することができる［例えば、Ｒｉｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍ．Ｊ．ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７，１００，１３６５－１３７５を参照］。

【0028】

参照技術は、参照標準のデータを使用する数学的アルゴリズムである。例えば、外部参照技術は、外部参照標準のデータを使用する数学的アルゴリズムである。かかる一例として、パルス長－塩基濃度判定（ＰＵＬＣＯＮ）技術がある（（Ｗｉｄｅｒ Ｇ．ａｎｄ Ｄｒｅｉｅｒ Ｌ．Ｊ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８（８），２５７１－２５７６（２００６））。

【0029】

本明細書で使用される場合、「ＤＦ－ｑＮＭＲ」スペクトルは、拡散フィルタが適用され、参照標準と比較した場合に目的のタンパク質またはペプチドの純度または濃度に関する定量的情報を得ることができるＮＭＲスペクトルを指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「分子パラメータ」は、他の系特性（例えば、温度、圧力、または組成）の変化に応答して、ある系特性（例えば、吸光度、密度、屈折率）が変化する方法に関連するスカラー値を意味する。分子パラメータを判定するために使用される数式（「対応する数式」）は、既知の系特性によって異なる場合がある。分子パラメータとは、タンパク質またはペプチドの固有の特性を指す。

【0031】

【数2】

【0032】

当業者は、濃度（方法Ａから判定される濃度）の関数としての吸光度／密度／屈折率の複数の測定値の線形回帰によって、対象の分子パラメータを判定することができる。吸光係数などの分子パラメータを使用して、ＵＶ吸光度などの対応する系特性を測定し、それらを相関させる対応する数式（例：ランベルトベールの法則）を解くことにより、薬剤の濃度を判定することができる。

【0033】

「モノクローナル抗体」の一般的な構造は、既知である。ＩｇＧ抗体は、鎖内および鎖間ジスルフィド結合を介して架橋された４つのポリペプチド鎖（２つの同一の「重」鎖および２つの同一の「軽」鎖）からなるヘテロ四量体である。各重鎖－軽鎖対の可変領域は、結合して結合部位を形成する。（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存性の高い領域に細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含有する。

【0034】

本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ形式（ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５８７１９で報告される）および二価ＩｇＧ形式（ＵＳ２０１８／０００９９０８で開示される）を含むがこれらに限定されない二価抗体構築物を指す。本発明はまた、三次または四次構造に関係なく、任意のヒト操作タンパク質または抗体が、本明細書に記載の方法で使用され得ることも企図する。かかるヒト操作タンパク質または抗体の例には、三重特異性または四重特異性抗体および融合タンパク質が含まれる。

【0035】

本明細書で使用される場合、ペプチドはアミノ酸のポリマー鎖を含む。これらのアミノ酸は、修飾アミノ酸を含む天然または合成アミノ酸であり得る。ペプチドは二次および三次構造が少ない場合があるが、溶液中で凝集する傾向がある。したがって、ペプチドはカオトロピック剤を用いて変性させることもできる。ペプチドの変性は、ＮＭＲ分光法における信号対雑音比の増加をもたらす可能性があり、それによって積分が容易になる。ペプチドを変性させると、より濃縮されたサンプルの検査が可能になり、実験時間が短縮される可能性がある。本明細書に記載の方法の目的のために、ペプチドが変性させると、ペプチド濃度の判定はより正確となり得る。カオトロピック剤を用いて変性する場合、好ましいカオトロピック剤は、各ペプチドの特定の要件に依存し、当業者によって実験的に判定することができる。

【0036】

当業者は、タンパク質がアミノ酸の１つ以上のポリマーペプチド鎖を含むことを認識するであろう。これらのアミノ酸は、修飾アミノ酸を含む天然または合成アミノ酸であり得る。タンパク質は組換えタンパク質であり得る。タンパク質の一次構造は、単量体のアミノ酸サブユニットの線形配列で構成されている。タンパク質の二次構造には、α－ヘリックスおよびβ－シートなど、アミノ酸鎖の局所セグメントの３次元構造的特徴を生み出す水素結合のパターンが含まれている。タンパク質の三次構造は、３次元の原子座標によって定義されるタンパク質の全体的な形状を表している。四次構造とは、複合体における２つ以上のタンパク質サブユニットの配置を指す。タンパク質は「変性」させることができ、外部応力またはカオトロピック剤がタンパク質を含む溶液に加えられ、タンパク質が折りたたまれる。したがって、変性タンパク質は、その二次、三次、および四次構造の特徴の大部分を失っている。カオトロピック剤の例としては、尿素－ｄ_４および塩化グアニジニウム－ｄ_６が挙げられる。

【0037】

本明細書でも使用される「溶液」は、水に加えて成分を含む、ヒト操作水性混合物中のペプチドまたはタンパク質を指す。「バッチ」とは、タンパク質またはペプチドであり、指定された範囲内で均一な特性および品質を有することが意図されており、同一の製造サイクル中に単一の製造指示に従って製造される、特定の量の薬剤または他の材料を指す。「ロット」とは、指定された制限内で均一な特性と品質を持つバッチ、またはバッチの特定の識別された部分を指す。または、連続プロセスによって製造された薬剤製品の場合、指定された制限内で均一な特性と品質を保証する方法で、時間または量の単位で製造された特定の識別された量である。「参照バッチ」は、確立され、適切に特徴付けられた内製の一次参照材料を指す。ここで、材料はタンパク質またはペプチドを含み、材料は、製造および臨床材料を代表するロットから調製される。方法Ａは、参照バッチの溶液中のタンパク質またはペプチドの濃度と分子パラメータ（吸光係数など）を判定するために使用される。次に、参照バッチから得られた吸光係数などの分子パラメータを使用して、後続のロット（本明細書では「試験バッチ」と称される）のタンパク質またはペプチドの濃度を判定する。

【0038】

本明細書で使用される場合、「薬剤製品」は、一般に、しかし必ずしもそうではないが、１つ以上の他の成分と関連して薬剤物質を含む、完成した剤形、例えば、錠剤、カプセル、または溶液である。「薬剤物質」とは、疾患の診断、治癒、緩和、治療、予防において薬理活性またはその他の直接的な効果をもたらすこと、あるいは人体の構造または機能に影響を与えることを目的とした有効成分であるが、かかる成分の合成に使用される中間体は含まれない。本明細書で使用される場合、薬剤物質はタンパク質またはペプチドを含む。方法Ａは、薬剤製品または薬剤物質の製造全体など、タンパク質またはペプチドを含む薬剤製品または薬剤物質に関連する様々な目的に使用することができる。

【0039】

「用量」は、所望の生物学的または医学的応答を誘発するマトリックス中のタンパク質またはペプチドの量を指す。この物質は、凍結乾燥されていても、水溶液であってもよい。治療的使用を目的とした物質を調製するために、当業者は、タンパク質またはペプチドの正確かつ精密な濃度が必要であることを理解するであろう。本明細書に記載の方法は、参照バッチ中のタンパク質またはペプチドの吸光係数または他の分子パラメータを判定し、次にこの吸光係数または他の分子パラメータを使用して、後続の試験バッチ中のタンパク質またはペプチドの濃度を判定することによって、タンパク質またはペプチドの濃度を得る新規な手段を提供する。

【0040】

分注とは、１つの容器でより大きな容積の一部を取り除き、別の容器に加えることを意味する。容器は、凍結乾燥されているか、もしくは溶液中のタンパク質またはペプチドを保持するために好適である、容器、バイアル、フラスコ、またはデバイスなどの任意のアイテムであってもよい。

【0041】

ロットリリース時試験とは、リリース（製造者による市場へのリリース）に先立ち、各有効成分の強度（濃度）を含め、薬剤製品（タンパク質またはペプチドからなる）の最終仕様に十分に適合しているかどうかを、試験室で適切に判定することを指す。ロットリリース時試験は、例えば、ロットリリース時のＵＶ試験であり得る。タンパク質またはペプチドの濃度は、タンパク質またはペプチドの吸光係数から判定することができ、ここで、吸光係数は、参照バッチにおいて方法Ａから判定される。

【0042】

次の実施例は、本発明をさらに例解し、本発明の種々の具体的な実施形態を実施するための典型的な方法および手順を提供する。しかしながら、実施例は例解として記載されていること、および種々の修正が当業者によってなされてもよいことが理解される。

【実施例】

【0043】

サンプルの調製
参照標準：既知の数のプロトン、既知の純度と濃度を高い確実性で表す少なくとも１つの特徴的なピーク、および溶液中での化学的および物理的安定性を提供する^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを持つ任意の化合物を使用して、ＤＦ－ｑＮＭＲスペクトルからの絶対濃度の計算を容易にすることができる。例えば、マレイン酸を外部定量参照標準として使用することができる。外部参照標準としてのマレイン酸を調製するために、認証マレイン酸（１１．１８３ｍｇ、０．０９６３４７ｍｍｏｌ）を５ｍＬのメスフラスコに入れ、Ｄ_２Ｏに溶解する。サンプルの高さが４０ｍｍになるように、アリコートをＷｉｌｍａｄ４３５精密４ｍｍ ＮＭＲチューブなどのチューブに移す。

【0044】

タンパク質サンプル：塩化グアニジン－ｄ_６（０．６ｇ、６ｍｍｏｌ）を１ｍＬメスフラスコに入れる。フラスコを天びんに置き、４００μＬのタンパク質溶液を加える。次に、溶液を穏やかに超音波処理し、全ての固体が溶解するまでボルテックスする。Ｄ_２Ｏを加えて、最終容積を実現する。チューブ内のサンプルの高さが４０ｍｍになるように、アリコートをＷｉｌｍａｄ４３５精密４ｍｍ ＮＭＲチューブなどのチューブに移す。

【0045】

ペプチドサンプル：尿素－ｄ_４（０．１３ｇ、２ｍｍｏｌ）を１ｍＬメスフラスコに入れる。フラスコを天びんに置き、約１ｍＬのタンパク質溶液を加える。次に、溶液を穏やかに超音波処理し、全ての固体が溶解するまでボルテックスする。Ｄ_２Ｏを加えて、最終容積を実現する。チューブ内のサンプルの高さが４０ｍｍになるように、アリコートをＷｉｌｍａｄ４３５精密４ｍｍ ＮＭＲチューブなどのチューブに移す。

【0046】

計算
１リットル当たりのグラム単位でのタンパク質濃度、ｃ_Ｐは、次の式を使用してＤＦ－ＱＮＭＲスペクトルから計算される。

【数3】

式中、ｃ_Ｓは参照標準の濃度、Ａ_ＰはＤＦ－ｑＮＭＲスペクトルで選択されたタンパク質ピークの面積である（通常、バリン、イソロイシンおよびロイシンのメチル基の１．０～１．４ｐｐｍのピークであるが、任意の分解能のピークである可能性がある）Ｈ_Ｓは参照標準ピークに寄与するプロトンの数、Ａ_Ｓは参照標準ピークの面積、Ｈ_Ｐはタンパク質ピークに寄与するプロトンの数、様々なｆは特定の実験条件に依存する関数である。ｆ_ＤＦは、拡散フィルタによるタンパク質のピーク面積の減衰を説明し、Ｓｔｅｊｓｋａｌ－Ｔａｎｎｅｒの式から導き出される（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｐａｒｔ Ａ ２０１２，４０Ａ，３９－６５）。本明細書で使用されるｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスの場合（Ｐｅｌｔａ，Ｍ．Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．１９９８，３６，７０６－７１４）、以下によって与えられる。

【数4】

式中、γは、^１Ｈの磁気回転比であり、ｇは、パルス磁場勾配強度であり、δは、パルス磁場勾配長であり、Δは、拡散遅延であり、Ｔ_１は、対象のタンパク質のプロトンのスピン－格子核緩和時間であり、Ｔ_２は、対象のタンパク質のプロトンのスピン－スピン核の緩和時間であり、Ｄは、タンパク質の並進拡散係数であり、τ_１は、ｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスの第２の９０°パルスと第３の９０°パルスとの間の時間（図１参照）であり、τ_２は、第１の９０°パルスと第２の９０°パルスとの間（および第３の９０°パルスと取得との間）の合計時間であり、τ_３は、バイポーラパルス対のパルス磁場勾配パルス間の合計時間である。Ａｇｉｌｅｎｔ社の機器で提供されるパルスシーケンスの場合、これらの項は次の機器パラメータによって定義される。

【数5】

式中、ｔ_ｇｓは勾配安定化遅延、ｔ_ｒｇはパルスに先行するレシーバーのゲート時間、Θは９０°のパルス幅である。他の拡散パルスシーケンスでは、Ｆ_ＤＦの式は異なるであろう。ｆ_ＥＲには、外部参照に必要な機器パラメータが含まれている。最も基本的な形では、

【数6】

であり、式中、ＳとＧは、それぞれ、タンパク質と参照標準の個々のＮＭＲスペクトルを取得するために使用されるスキャン数とレシーバーゲインである。ＰＵＬＣＯＮ方法論を使用すると、次のようになる。

【数7】

式中、ＴはＮＭＲスペクトルの取得中のサンプル温度である。ｆ_ＤＩＬは、最初のタンパク質サンプルの最終ＮＭＲサンプルの希釈を説明する。最終容積が容積測定で取得され、最初のサンプルの分注が重量分析で行われる場合、この係数は次の式で与えられる。

【数8】

式中、ｖｏｌ_Ｆは、最終溶液（すなわち、ＮＭＲサンプル溶液）の容積であり、ｗｔ_Ｉおよびｄ_Ｉは、最初のタンパク質溶液のアリコートの重量および密度である。あるいは、最初のタンパク質溶液とＤ_２Ｏの両方を重量分析で希釈する場合は、

【数9】

式中、ｗｔ_Ｄ２Ｏとｄ_Ｄ２Ｏは、Ｄ_２Ｏの重量および密度である。最後に、ｆ_Ｕは、濃度単位を定量参照標準の濃度単位（通常はｍｍｏｌ）を、グラム／リットル（または同等にミリグラム／ミリリットル）の一般的な単位に変換する。この場合、

【数10】

であり、式中、Ｍ_Ｐは、タンパク質の分子量である。

【0047】

式２の第１の指数項は、Ｔ_１核緩和による信号減衰、第２はＴ_２核緩和による、第３は分子拡散による信号減衰を表す。数式の全ての項のうち、これらの３つの量（Ｔ_１、Ｔ_２、およびＤ）が唯一の未知数である。他の全ては、パルスシーケンス／機器パラメータまたは物理定数（γ）である。Ｔ_１、Ｔ_２、およびＤは、分子と溶液の条件によって異なり、固有のサンプルごとに測定する必要がある。これは、拡散フィルタと同じパルスシーケンスを使用した３つの別々の実験で行うことができる。Ｄの測定は、公知の実験であり、勾配強度を増加させながら複数のスペクトルを取得する（Ｓｔｅｊｓｋａｌ，Ｅ．Ｏ．ａｎｄ Ｔａｎｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１９６５，４２，２８８－２９２）。これにより、式２のＴ_１項およびＴ_２項が一定に保たれ、信号の減衰がＤのみによって制御されるようになる。次に、ＤＥＣＲＡ（Ｗｉｎｄｉｇ，Ｗ．；Ａｎｔａｌｅｋ，Ｂ．Ｃｈｅｍｏｍ．Ｉｎｔｅｌｌ．Ｌａｂ．Ｓｙｓｔ．，１９９７，３７，２４１－２５４）などの好適なアルゴリズムを適用してＤを計算する。Ａｇｉｌｅｎｔ社のｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスを用いてＴ_１を測定するために、複数のスペクトルは、以下のような拡散遅延および勾配強度（ｇｚｌｖｌ１）の組み合わせを使用して取得される。

【数11】

式中、Δ’は次の式で与えられる正しい拡散遅延である。

【数12】

これにより、式２のＴ_２およびＤの項が一定に保たれ、信号の減衰がＴ_１緩和によってのみ制御されるようになる。選択されたタンパク質ピークのプロトンの有効なＴ_１は、その後、Ａ_Ｐとτ_１の単指数関数適合から計算される。

【0048】

Ａｇｉｌｅｎｔ社のｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスを用いてＴ_２を測定するために、複数のスペクトルは、以下のような勾配安定化遅延、拡散遅延および勾配強度の組み合わせを使用して取得される。

【数13】

ｇｚｌｖｌ１_ｎは、上記に示すように判定される。これにより、式のＴ_１とＤの部分が一定に保たれ、信号の減衰はＴ_２緩和のみに制御されるようになる。選択されたタンパク質ピークのプロトンの有効なＴ_２は、その後、Ａ_Ｐとτ_２の単指数関数適合から計算することができる。

【0049】

方法Ａのデータ取得
Ａｇｉｌｅｎｔ社ＤＤ２ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計には、Ａｇｉｌｅｎｔ社^１Ｈ－^１９Ｆ／^１５Ｎ－^３１Ｐ ＰＦＧワンプローブが装備されている。プローブ温度およびパルス磁場勾配は、それぞれ、エチレングリコールのサンプルおよびＤ_２Ｏ中１％Ｈ_２Ｏを用いて較正される。ＮＭＲスペクトルは、バイポーラパルス対刺激エコー（ｂｐｐｓｔｅ）パルスシーケンスを使用して３０．０℃で取得される。スキャン回数は６４回である。取得パラメータには、２０ｐｐｍのスペクトル幅、１．３６３秒の取得時間、３０秒の緩和遅延、１５０ミリ秒の拡散遅延、０．５６９Ｔ／ｍの強度（最大の９２％）の１．４ミリ秒の勾配パルス、および１ミリ秒の勾配安定化遅延が含まれる。

【0050】

並進拡散係数（Ｄ）を測定するために、取得パラメータには、１秒の緩和遅延、２００ミリ秒の拡散遅延、２．０ミリ秒の拡散勾配長、０．５ミリ秒の勾配安定化遅延、および対数間隔で０．２２８～０．５６９Ｔ／ｍ（最大の約３７～９２％）の範囲の勾配強度の７つの値が含まれる。スピン－格子核緩和時間（Ｔ_１）は、２０ｐｐｍのスペクトル幅、１．３６３秒の取得時間、３．６３７秒の緩和遅延、２．０ミリ秒の拡散勾配長、および０．５ミリ秒の勾配安定化遅延を使用してｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスで測定される。拡散遅延と勾配強度の５つのペアとして、（１００ミリ秒、０．５６９Ｔ／ｍ）、（２０３ミリ秒、０．４００Ｔ／ｍ）、（４０８ミリ秒、０．２８１Ｔ／ｍ）、（８０４ミリ秒、０．２００ Ｔ／ｍ）、および（１２０２ミリ秒、０．１６４Ｔ／ｍ）が使用される。

【0051】

スピン－スピン核緩和時間（Ｔ_２）も、２０ｐｐｍのスペクトル幅、１．３６３秒の取得時間、１秒の緩和遅延、１．４ミリ秒の拡散勾配長を使用してｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスで測定される。勾配安定化遅延、拡散遅延、および勾配強度の６つのセットとして、（１ミリ秒、１５０．００１ミリ秒、０．５７０）、（２ミリ秒、１５０．００２ミリ秒、０．５７１Ｔ／ｍ）、（４ミリ秒、１５０．００４ミリ秒、０．５７３Ｔ／ｍ）、（８ミリ秒、１５０．００８ミリ秒、０．５７７Ｔ／ｍ）、（１２ミリ秒、１５０．０１２ミリ秒、０．５８１Ｔ／ｍ）、および（１６ミリ秒、１５０．０１６ミリ秒、０．５７５Ｔ／ｍ）が使用される。

【0052】

データ分析
ＤＦ－ＱＮＭＲ、Ｔ_１、およびＴ_２のデータがＭＮｏｖａ Ｖ １１．０（Ｍｅｓｔｒｅｌａｂ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓ．Ｌ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ ｄｅ Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌａ，Ｓｐａｉｎ）で処理され、拡散データはＤＯＳＹＴｏｏｌｂｏｘ ｖ２．５（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．２００９，２００，２９６－３０２）で処理、解析されている。ＦＩＤは一度ゼロで埋められ、フーリエ変換の前に２．９３Ｈｚの指数ウィンドウ関数で乗算される。拡散係数は、ＤＯＳＹＴｏｏｌｂｏｘで利用可能なＤＥＣＲＡアルゴリズムを使用して取得される。Ｔ_１およびＴ_２の値は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）２０１６ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａ）を用いて回帰分析によってｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスから計算される。ロイシン、イソロイシン、および／またはバリンメチルのピーク面積は、ＭＮｏｖａまたはＣＲＡＦＴのラインフィッティングルーチンを使用したデコンボリューションによって取得される。

【0053】

ＮＩＳＴ抗体ＲＭ８７６１での方法Ａの使用
ＮＭＲによって大規模な製剤化タンパク質を定量化する際の課題を例解するために、ＮＩＳＴ ＲＭ ８７６１（１０ｇ／Ｌ抗体、１２．５ｍＭ Ｌ－ヒスチジンＨＣｌ、ｐＨ６．０、米国国立標準技術研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＩＳＴ）から市販。例えば、Ｓｃｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，４１０（８）：２１２７－２１３９（２０１８）を参照）のサンプルを１０％Ｄ_２Ｏで処理し、^１Ｈ １Ｄ ＮＭＲスペクトルを取得する（図２）。水の信号は非常に強くて広範囲にわたるので、抗体の信号を覆い隠す。ヒスチジン添加剤のピークもスペクトルで観察される。タンパク質の実行可能なスペクトルを取得するには、これらの主要なピークを排除する必要がある。このアプリケーションに理想的なＮＭＲ技術の１つは、「拡散フィルタ」である。このフィルタでは、対応する分子の拡散係数、つまりサイズに基づいて、スペクトルからピークが除去される。バイポーラパルスペア刺激エコー（ｂｐｐｓｔｅ）拡散パルスシーケンスを拡散フィルタとして用いて、同じＮＩＳＴ ｍＡｂサンプルで取得した^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルも図２に示す。拡散フィルタは、ベースラインアーチファクトまたは位相歪みを導入することなく、製剤の不要な信号を除去するのに効果的である。

【0054】

しかしながら、多くの場合、タンパク質共鳴の特徴的な広い線幅のために、正確なピークの同定と積分には分解能が不十分である。これは主に、タンパク質の高次構造（ＨＯＳ）によるものである。単一のタイプのアミノ酸は、他の場合には非常に類似した化学シフトを持ち、タンパク質の二次、三次、および四次構造に起因する固有の磁気環境のために、広い化学シフト分布を示す。したがって、ＨＯＳはタンパク質を変性させることによって除去される。タンパク質溶液に変性剤を加えると、サンプルの容積が膨張する。真に定量的であるために、より多くの溶媒が追加され、例えばメスフラスコを使用して精密な容積を達成する。これは、式１のｆ_ＤＩＬの基礎である。

【0055】

６ Ｍグアニジン塩化－ｄ_６で調製拡散濾過した^１Ｈ－ＮＭＲ ＮＩＳＴ ＲＭの８７６１サンプルを、図２に示されている。線幅の減少とそれに続く信号対雑音比の増加が観察される。イソロイシン、ロイシン、および／またはバリンのメチル基に対応する１．０～１．４ｐｐｍのピークのグループは、ベースラインに近い分解能を有しており、定量分析のために積分されることを可能にする。

【0056】

拡散フィルタは、マトリックスからタンパク質信号を分離するのに効果的である。しかしながら、拡散フィルタでは、測定されたＮＭＲピーク面積の固有の定量が行われない。ルーチンのｑＮＭＲ実験では、核緩和遅延、１つの無線周波数パルス、およびデータ取得期間という３つの基本要素で構成される単純なＮＭＲパルスシーケンスを使用する。十分に長い核緩和遅延を使用すると、結果として得られるＮＭＲピーク面積は、観測された核の数に正確かつ再現性よく比例する。したがって、実験は定量的である。ここで採用されている拡散シーケンスを含む他の全てのＮＭＲパルスシーケンスでは、様々な遅延で分離された複数の高周波パルスが必要である。その結果、平衡値からピークを減衰させる要因により、結果として得られるスペクトルは本質的に定量的ではなくなる。しかしながら、これらの要因が既知であり、減衰の程度を計算することができる場合は、拡散フィルタを定量的にすることができる。これは、式１のｆ_ＤＦの基礎である。

【0057】

内部参照標準よりも外部参照標準の方が好ましい。なぜなら、前者は、内部標準を使用することができるが、２つの分子間の潜在的な相互作用および／またはＮＭＲスペクトル中のピークの重複を回避することができるからである。ＰＵＬＣＯＮ技術（パルス長－塩基濃度判定など）を含む、一部の外部標準法が報告されている。この手法は、溶液条件と実験パラメータが異なっていても、１つは参照標準、もう１つは分析対象物の２つの個別スペクトルからの絶対面積を相関させる。したがって、外部参照標準は、対象化合物と同様の特性を有する必要はなく、タンパク質である必要もない。さらに、この方法は、ＡＡＡの場合のように全てのアミノ酸に標準を必要とするのではなく、単一の標準のみを必要とする。

【0058】

方法Ａの正確度と精度を実証するために、ＮＩＳＴ ＲＭ８７６１サンプルの３つの独立した複製を評価する。この１０ｇ／Ｌタンパク質製剤では、わずか６４回のスキャンと３７分の合計取得時間を使用して、十分な信号対雑音比が得られる。１，４７６個のプロトンに対応するタンパク質のＩ／Ｌ／Ｖのメチル基（１．０～１．４ｐｐｍ）の信号のグループは、ほぼベースラインの分解能を有している。これらの結果により、定量化のための正確な積分が可能になる。濃度計算を容易にするために、Ｔ_１、Ｔ_２、およびＤも、上記のｂｐｐｓｔｅパルスシーケンスを使用してこのピークグループに対して測定される。実行されたデータ取得と分析を図３と図４に示す。

【0059】

１個の複製での４つのＮＭＲ実験全ての合計実験時間は、１１０分である。次に、各複製の濃度は、無傷の非グリコシル化分子量（１４８，０４１Ｄａ）と、分注の重量および測定されたサンプル密度に基づく希釈係数と、を使用して、式９から計算される。平均濃度は、１０．０２ｇ／Ｌ、ＲＳＤは０．５５％と判定される。これは、ラベルの値である１０ｇ／Ｌと一致している。

【0060】

これらのデータは、方法Ａを使用して抗体の濃度を正確かつ精密に判定することができることを示している。

【0061】

ＮＩＳＴウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）での方法Ａの使用
ＮＩＳＴ（ＢＳＡ）標準参照材料９２７ｅ（６７．３８ｇ／Ｌ、２０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムでｐＨを６．５～６．８に調整、米国国立標準技術研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から市販）を重量測定でさらに４つのタンパク質濃度（表１、サンプルＢ１～Ｂ４）に希釈する。中間濃度（Ｂ３）での６個の複製、最高（Ｂ５）および最低（Ｂ１）濃度のそれぞれでの３個の複製、および中間濃度（Ｂ２およびＢ４）での１個の複製を含む、合計１４のサンプルが分析される。各複製のＮＭＲサンプルは、上記のように調製される。方法Ａのデータ取得および分析は、上記のように実行される。得られた１４個のＤＦ－ｑＮＭＲスペクトルを、図５に重ねて示す。

【0062】

これらのデータは、水からのピークがほぼ除去され、ベースラインが乱されておらず、タンパク質のＩ／Ｌ／Ｖのメチル基の信号グループの分解能がベースラインに近いことを示している。各サンプルの濃度は、６６，３９８Ｄａの分子量を使用して式１から計算され、表１に報告されている。５つの濃度全てについて、方法Ａで測定された値は、重量分析で計算された値と同様である。以下の表１に示すように、ＲＳＤは３セットの複製全てに対して１％未満である。

【表1】

【0063】

図６に示すように、方法Ａの濃度と重量分析の濃度をプロットすると、Ｒ^２＝０．９９９７の回帰直線が得られ、調べた濃度範囲全体で直線性が示された。

【0064】

これらのデータは、方法Ａを使用して、広い濃度範囲で中型タンパク質の濃度を正確かつ精密に判定することができることを示している。

【0065】

図７は、方法Ａで判定されたタンパク質濃度の関数としてのサンプル密度のプロットを示している。２つの量を関連付ける式は、上記で定義されているように、

【数14】

【0066】

二重特異性抗体での方法Ａの使用
５つの異なる濃度および１４の合計サンプルを有する二重特異性抗体のサンプル（米国特許第９，７１８，８８４号の表１の配列によって与えられる）は、上記のように調製される。方法データの取得と分析は、上記のように実行される。本質的に先に説明した手順に従って、次のデータを取得した。

【0067】

図８は、結果として得られたＤＦ－ｑＮＭＲスペクトルを示している。これは、全体的な外観および品質がＢＳＡ（上記）と類似している。濃度は、インタクトな非グリコシル化タンパク質の理論分子量（～２００，０００Ｄａ）を使用して、式１で計算され、以下の表２に要約されている。

【表2】

【0068】

図９に示すように、方法Ａの濃度と重量分析の濃度をプロットすると、Ｒ^２＝０．９９６の回帰直線が得られた。

【0069】

これらのデータは、方法Ａを使用して、非常に広い濃度範囲にわたる二重特異性抗体の濃度を判定することができることを示している。

【0070】

～５０００Ｄａペプチドでの方法Ａの使用
希釈された小さなペプチドのサンプル（約５，０００Ｄａ；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４１９２２の実施例４の配列によって与えられる）は、上記のようにカオトロピック剤の有無にかかわらず調製される。ペプチドはランダムコイルとしてネイティブに存在し、濃度が低いため、より低い濃度の変性剤（２Ｍ）が許容される。サンプルの安定性には基本的な条件が必要であるため、ｕｒｅａ－ｄ４が使用される。方法Ａのデータ取得と分析は、６４回のスキャンではなく、各取得に対して６２４回のスキャンがあったことを除いて、上記のように実行される。本質的に先に説明したとおりの手順に従って、次のデータを取得した。残留水信号にわずかな位相歪みが観察されたが、データ分析には支障はなかった。カオトロピック剤の添加により、より優れた水分抑制、より鋭いピーク、そしてその後のより高い分解能と感度が得られた。式１から各複製の濃度を計算した。平均総タンパク質濃度は０．６５ｇ／Ｌ、ＲＳＤは３．６％と判定された。これは、物質収支で得られた値（０．６３ｇ／Ｌ）と同様であった。これらのデータは、方法Ａが小さなペプチドの希釈サンプルに使用することができることを示している。

【0071】

例解的な実施形態
次のものは、本開示の種々の実施形態を表す本開示による例解的な実施形態のリストを含む。

【0072】

これらの例解的な実施形態は、網羅的であること、または本開示を、開示された正確な形態に限定することを意図するものではなく、むしろ、これらの例解的な実施形態は、当業者がこれらの教示を利用することができるように、本開示をさらに説明するのを助けるために提供される。

【0073】

１．溶液中のタンパク質またはペプチドの濃度を判定する方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記タンパク質を変性させるか、または前記ペプチドを変性させてもよいことと、
（ｉｉ）拡散フィルタを用いてｑＮＭＲ分光法を実行することと、
（ｉｉｉ）参照標準および参照技術を使用して前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を計算することと、を含む、方法。

【0074】

２．前記ペプチドが、変性される、実施形態１に記載の方法。

【0075】

３．前記タンパク質またはペプチドが、カオトロピック剤を用いて変性される、実施形態１または実施形態２の方法。

【0076】

４．前記カオトロピック剤が、塩化グアニジニウム－ｄ_６または尿素－ｄ_４である、実施形態３に記載の方法。

【0077】

５．前記参照標準が、外部参照標準である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0078】

６．前記外部参照標準が、小分子一次標準である、実施形態５に記載の方法。

【0079】

７．前記外部参照標準が、マレイン酸である、実施形態５に記載の方法。

【0080】

８．前記溶液が、Ｄ_２Ｏを含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

【0081】

９．前記参照技術が、ＰＵＬＣＯＮである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0082】

１０．前記タンパク質が、抗体である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0083】

１１．前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態１０に記載の方法。

【0084】

１２．前記抗体が、二重特異性抗体である、実施形態１０に記載の化合物。

【0085】

１３．溶液中のタンパク質またはペプチドの分子パラメータを判定する方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記タンパク質を変性させるか、または前記ペプチドを変性させてもよいことと、
（ｉｉ）拡散フィルタを用いてｑＮＭＲ分光法を実行することと、
（ｉｉｉ）参照標準および参照技術を使用して前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を計算することと、
（ｉｖ）前記計算された濃度から前記タンパク質またはペプチドの前記分子パラメータを判定することと、を含む、方法。

【0086】

１４．前記ペプチドが、変性される、実施形態１３に記載の方法。

【0087】

１５．前記分子パラメータが、吸光係数である、実施形態１３または実施形態１４に記載の方法。

【0088】

１６．前記吸光係数が、ランベルトベールの法則によって判定される、実施形態１５に記載の方法。

【0089】

１７．前記タンパク質またはペプチドが、カオトロピック剤を用いて変性される、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0090】

１８．前記カオトロピック剤が、塩化グアニジニウム－ｄ_６または尿素－ｄ_４である、実施形態１７に記載の方法。

【0091】

１９．前記参照標準が、外部参照標準である、実施形態１３～１８のいずれか１つに記載の方法。

【0092】

２０．前記外部参照標準が、小分子一次標準またはマレイン酸である、実施形態１９に記載の方法。

【0093】

２１．前記外部参照標準が、小分子一次標準である、実施形態２０に記載の方法。

【0094】

２２．前記外部参照標準が、マレイン酸である、実施形態２０に記載の方法。

【0095】

２３．前記溶液が、Ｄ_２Ｏを含む、実施形態１３～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0096】

２４．前記参照技術が、ＰＵＬＣＯＮである、実施形態１３～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0097】

２５．前記タンパク質が、抗体である、実施形態１３、１５～２４のいずれか１つに記載の方法。

【0098】

２６．前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態２５に記載の方法。

【0099】

２７．前記抗体が、二重特異性抗体である、実施形態２５に記載の化合物。

【0100】

２８．参照バッチ中のタンパク質またはペプチドの分子パラメータを判定する方法であって、前記方法が、
ａ．前記タンパク質を変性させるか、または前記ペプチドを変性させてもよいことと、
ｂ．拡散フィルタを用いてｑＮＭＲ分光法を実行することと、
ｃ．参照標準および参照技術を使用して前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を計算することと、
ｄ．前記計算された濃度から前記タンパク質またはペプチドの前記分子パラメータを判定することと、を含む、方法。

【0101】

２９．試験バッチ中の前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を判定することをさらに含み、前記試験バッチ中のペプチドまたはタンパク質の前記濃度が、前記分子パラメータから判定される、請求項２８に記載の方法。

【0102】

３０．前記分子パラメータが、吸光係数である、実施形態２８または実施形態２９に記載の方法。

【0103】

３１．前記吸光係数が、ランベルトベールの法則によって判定される、実施形態３０に記載の方法。

【0104】

３２．前記ペプチドが、変性される、実施形態２８～３１のいずれか１つに記載の方法。

【0105】

３３．前記タンパク質またはペプチドが、カオトロピック剤を用いて変性される、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の方法。

【0106】

３４．前記カオトロピック剤が、塩化グアニジニウム－ｄ_６または尿素－ｄ_４である、実施形態３３に記載の方法。

【0107】

３５．前記参照標準が、外部参照標準である、実施形態２８～３４のいずれか１つに記載の方法。

【0108】

３６．前記外部参照標準が、小分子一次標準である、実施形態３５に記載の方法。

【0109】

３７．前記外部参照標準が、マレイン酸である、実施形態３５に記載の方法。

【0110】

３８．前記溶液が、Ｄ_２Ｏを含む、実施形態２８～３７のいずれか１つに記載の方法。

【0111】

３９．前記参照技術が、ＰＵＬＣＯＮである、実施形態２８～３８のいずれか１つに記載の方法。

【0112】

４０．前記タンパク質が、抗体である、実施形態２８～３１、３３～３９のいずれか１つに記載の方法。

【0113】

４１．前記抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態４０に記載の方法。

【0114】

４２．前記抗体が、二重特異性抗体である、実施形態４０に記載の化合物。

【0115】

４３．前記方法が、前記分子パラメータを使用して、前記タンパク質またはペプチドを処方する際の前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を判定することをさらに含む、実施形態１３～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0116】

４４．前記方法が、前記分子パラメータを使用して、ロットリリース時試験における前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を判定することをさらに含む、実施形態１３～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0117】

４５．前記ロットリリース時試験が、ロットリリース時のＵＶ試験である、実施形態４４に記載の方法。

【0118】

４６．前記方法が、前記分子パラメータを使用して、ロットの調製における前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を判定することをさらに含む、実施形態１３～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0119】

４７．前記方法が、前記分子パラメータを使用して、前記タンパク質またはペプチドの用量を判定する際の前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を判定することをさらに含む、実施形態１３～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0120】

４８．前記方法が、前記分子パラメータを使用して、製造中の前記タンパク質またはペプチドの前記濃度を判定することをさらに含む、実施形態１３～４２のいずれか１つに記載の方法。

【0121】

４９．前記タンパク質またはペプチドが、デュラグルチド、イキセキズマブ、ラムシルマブ、セツキシマブ、オララツマブ、ネシツムマブ、ガルカネズマブ、またはミリキズマブの有効成分である、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】